PT724642E - Vector nucleotídico, composição que o contém e vacina para a imunização contra uma hepatite - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
VECTOR NUCLEOTÍDICO, COMPOSIÇÃO QUE O CONTÉM E VACINA PARA A IMUNIZAÇÃO CONTRA UMA HEPATITE O presente pedido tem por objecto um vector para a imunização contra uma hepatite.
Além disso, está relacionada com uma composição que contém este vector. A imunização por injecção de ADN livre nos tecidos musculares tem sido objecto de vários trabalhos desde o inicio dos anos 1990 .
Assim, ULMER et al. (Science, 259, 1745-1749, 1993) obtiveram uma protecção contra o virus Influenza por indução dos linfócitos T citotóxicos injectando, nos quadríceps de ratos, um plasmideo que codifica a nucleoproteina Influenza A. O plasmideo utilizado possui quer o promotor do virus do sarcoma de Rous quer o promotor do citomeqalovirus. RAZ et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 4523-4527, 1993) injectaram os vectores que compreendem o promotor do virus do sarcoma de Rous e um gene que codifica a interleucina-2, a interleucina-4 ou o factor de crescimento transformante do tipo βΐ(TGF- βΐ) . As respostas imunitárias humoral e celular dos ratos aos quais foram administrados estes plasmideos por via intramuscular, melhoraram.
WANG et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 4156-4160, 1993) injectaram, nos músculos de rato, um plasmideo que possui um gene que codifica a proteína de envelope do vírus HIV-1. A 1 injecção dos plasmídeos foi precedida por um tratamento com a bupivacaina no mesmo local do músculo. Os autores colocam em evidencia a presença de anticorpos capazes de neutralizar a infecção pelo virus HIV-1. Contudo deve notar-se que o ADN foi injectado duas vezes por semana num número total de 4 inj ecções. DAVIS et al. (Apreciação critica do 28° Congresso Europeu sobre o músculo, Bielefeld, Alemanha, 21-25 Setembro de 1992) injectaram plasmídeos que possuem um gene que codifica a luciferase ou a β-galactosidase pré-tratando os músculos através da sacarose ou da cardiotoxina. Os autores observaram a expressão da luciferase ou da β-galactosidase.
Mais recentemente, um artigo publicado em Science et Avenir (Setembro de 1993, pp 22-25) indica que WHALEN e DAVIS foram bem sucedidos a imunizar os ratos contra o vírus da hepatite B injectando-lhes, nos músculos, ADN puro do vírus. É citada de modo geral, a injecção prévia de toxina de veneno de serpente seguida de injecção de ADN 5 a 10 dias mais tarde. Determina que este método não é prático.
Estes trabalhos têm sido precedidos por outras experiências nas quais foram injectados diferentes ADN, em particular nos tecidos musculares. Assim, o pedido PCT/US 90/01 515 (publicado sob o número W0-90/11 092) divulga diversas construções plasmídicas que podem ser injectadas, em particular nos tecidos musculares para o tratamento da distrofia muscular. Contudo, este documento determina que o ADN é, de preferência, injectado nos liposomas. A patente canadiana CA 362.966, que trata do mesmo assunto, (publicada com o número 1.169.793) descreve a injecção 2 intramuscular de liposomas que contêm ADN que codifica, em particular, os antigenes HBs e HBc. Os resultados descritos nesta patente mencionam a expressão de antigenes HBs. A presença de anticorpos anti-HBs não foi investigada. 0 pedido Internacional PCT/FR 92/00 898 (publicada com o número W0-93/06 223) descreve os vectores virais que podem ser conduzidos pela via sanguínea até às células alvo. Estes vectores são, assim, reconhecidos pelos receptores de células, tal como as células musculares, e podem ser usados no tratamento da distrofia muscular ou da trombose.
Este pedido não está relacionado com a imunização contra o vírus, tal como por exemplo o da hepatite B.
Recorrendo-se então ao estado da técnica citada, se já se conhecem as técnicas de imunização contra a hepatite através da injecção de ADN livre, que apresentam um grande número de inconvenientes não as tornando práticas a utilizar.
Por outro lado, o ADN livre utilizado para vacinar os ratos foi o ADN puro do vírus. Este tipo de tratamento não é possível para a vacinação humana, devido aos riscos para os pacientes.
Resumidamente, as experiências mais antigas nas quais o ADN injectado está contido nos liposomas não demonstraram resposta imunitária. O requerente está, deste modo, dedicado a encontrar novas construções de vectores que permitam imunizar contra a hepatite sem que hajam consequências negativas para a saúde humana. 3
Por outro lado está empenhado em encontrar um aditivo, das composições que contêm estas construções, que permita uma degenerescência eficaz do tecido muscular antes da injecção de ADN, e compatível com os imperativos de saúde humana. 0 requerente mostrou, de forma surpreendente, que se pode obter um nível de anticorpos eficaz e durável largamente superior ao nível permitido, que se pode obter com o homem, uma protecção imunitária eficaz e durável contra a infecção pelo vírus de hepatite, administrando por injecção intramuscular um vector que possui uma construção definida, e uma substância capaz de induzir uma necrose coaguladora das fibras musculares. 0 presente pedido tem, deste modo, por objecto um vector nucleotídico que compreende pelo menos: - um gene ou um ADN complementar que codifica pelo menos uma parte de uma proteína do vírus; - a sequência de terminação não traduzida do referido gene ou do referido ADN complementar, incluindo o sinal de poli- adenilação; e - um promotor que permite a expressão deste gene nas células musculares. 0 referido vector não se pode replicar nessas células.
Pode também ser replicativo o que permite obter um número elevado de cópias por célula e melhorar a resposta imunitária.
Além disso, o vector é escolhido de modo a evitar a sua integração no seio do ADN celular, estas integrações são conhecidas por activarem os oncogenes e por induzirem a cancerização das células. 4 0 vector de acordo com a presente invenção é, de forma vantajosa, um plasmídeo em parte de origem bacteriana e possuindo, em especial, uma origem de replicação bacteriana e um gene que permita a sua selecção, tal como um gene de resistência a um antibiótico.
Este vector pode, assim, provir de uma origem de replicação que lhe permite replicar-se nas células musculares do seu hospedeiro, tal como uma origem de replicação do virus do papiloma bovino. 0 gene ou o ADN complementar compreendido neste vector codifica, de forma vantajosa, uma proteína de estrutura de um vírus mas pode também codificar uma proteína de regulação. 0 gene ou o ADN complementar possuído por este vector pode codificar por pelo menos uma parte de uma proteína do vírus de uma hepatite em particular da hepatite B e, de preferência, a proteína HBs, sob uma das suas formas S, S-pré-S2 ou S-pré-S2-pré-Sl, no caso do gene ser o gene S. 0 vírus também pode ser responsável por uma outra hepatite tal como uma hepatite A ou como uma hepatite não-A, não-B, tal como uma hepatite C, E ou delta.
As sequências dos genes ou das proteínas dos vírus destas hepatites estão descritas ou podem ser deduzidas através dos seguintes documentos: patente FR-79 21 811, patente FR 80.09.039, patente EP-81.400.634, patente FR 84.03.564, patente EP 91.830.479 e o artigo de Najarian et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1985, 82, 2627-2631) . 5 0 vector também pode compreender genes que codifica pelo menos em parte a proteína gpl60 do vírus HIV1 associada à proteína p25, e/ou à proteína p55, e/ou à proteína pl8 ou pelo menos um gene que codifica a proteína Rev do vírus HIV1. 0 vector também pode compreender no lugar de uma proteína de um vírus, uma proteína de um microorganismo patogénico tal como uma proteína da bactéria responsável da difteria, da tosse convulsa, de uma listeriose, a toxina do tétano, etc... 0 promotor transportado por este vector é, de forma vantajosa, o promotor do citomegalovírus (CMV). Contudo, pode ser qualquer outro promotor que permita uma expressão eficaz do gene nas células musculares.
Deste modo, pode ser: - um promotor interno ou endógeno, o que quer dizer um promotor do vírus de onde é procedente o gene; este promotor pode ser completado por um elemento de regulação do músculo ou de outro tecido, em particular um elemento activador, - um promotor de um gene de uma proteína do citoesqueleto, em particular da desmina, tal como descrito por BOLMONT et al. (Journal of submicroscopic cytology and pathology, 1990, 22, 117-122) e por ZHENLIN et al. (Gene, 1989, 78, 243-254). - o promotor dos genes de superfície do vírus HBV.
De forma geral, o promotor pode ser heterologo do hospedeiro, o que quer dizer que não se encontra no hospedeiro de forma natural, mas é, de forma vantajosa homologo, sendo inteiramente activo na origem de um tecido que não seja o tecido muscular. 6
Além do promotor, o vector pode compreender uma sequência de terminação da transcrição, situada a jusante do gene.
Este vector pode ser o plasmídeo pCMV/HBS, ou pRCCMV-HBS, possuindo a sequência SEQ ID N° 1, depositada sob o número I-1370 da Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de 1'Institut Pasteur (CNCM) a 21 de Outubro de 1993.
Também pode ser o plasmídeo pRSV/HBS depositado sob o número 1-1371 da CNCM a 21 de Outubro de 1993.
Este plasmídeo é de estrutura semelhante ao pCMV/HBS mas compreende o promotor do vírus do Sarcoma de Rous (RSV) em vez do promotor do citomegalovírus (CMV).
Outros plasmídeos podem ser: o pCMVHB-Sl.S2.S que foi construído pela inserção do fragmento Bgl II-Bgl II do gene S, obtido a partir do pCPlO, num vector pBlueScript modificado para conter locais de clonagem suplementares na parte "poliligante". O fragmento que contém o gene S foi, de seguida, realizado pela digestão Kpnl-BssH II depois clonado nos locais correspondentes do pcDNA 3 (In vitrogen, Rad Systems Europe Ltd, Abingdon UK) a fim de se obter o pCMSIHB-Sl.S2.S. Este plasmídeo foi depositado sob o número 1-1411 da CNCM. - o pCMVHB-S2.S que foi obtido eliminando a parte pré-Sl do gene HBS do pCMVHB-Sl.S2.S por digestão Kpnl/MstI, ligando depois, após tratamento pela nuclease Sl, as duas extremidades. O pCMVHB-S2.S foi depositado sob o número I-1410da CNCM. - o pHBV-Sl.SZ.S, depositado sob o número I-1409da CNCM, foi obtido através da inserção do fragmento Bgl II- Bgl II do gene S, obtido a partir do pCPlO, num vector pBlueScript 7 modificado para conter locais suplementares de clonagem na parte "poliligante" , - o pBS-SKT-Sl.SL.S codifica as três proteínas de envelope S, S-préSi e S-préSi-préS2 do vírus HBV.
Além disso, a presente invenção está relacionada com os vectores nucleotidícos, tal como descrito precedentemente, que compreendem um promotor homólogo ao hospedeiro e uma outra sequência de regulação para a expressão de um gene ou de um ADN complementar que codifica uma das proteínas citadas acima. A presente invenção tem também por objecto uma vacina ou um medicamento que contém pelo menos um vector, ou uma sequência nucleotidica, tal como definido acima.
Tem ainda por objecto uma composição capaz de induzir uma resposta citotóxica constituída por pelo menos uma sequência nucleotidica expressa nas células musculares e possuindo um promotor tal como definido acima.
Está ainda relacionada com uma farmacêutica não lipídica, destinada à imunização contra uma infecção virai tal como uma hepatite, que compreende pelo menos por um lado uma substância capaz de induzir uma necrose coaguladora das fibras musculares e por outro lado um vector tal como descrito acima ou que possui uma das sequências nucleotídicas, tal como descritas acima, completas ou parciais. Entende-se por sequência parcial ou sequência que codifica pelo menos 6 aminoácidos.
De forma vantajosa a referida substancia é a bupivacaina. 8
De uma maneira vantajosa, a referida composição é caracterizada pelo vector ser administrado no músculo do indivíduo a imunizar, no minimo 5 dias após a administração da bupivacaina, e sensivelmente no mesmo local.
Esta pré-administração de bupivacaina permite, de forma surpreendente, aumentar a eficácia da administração do vector bem como a imunização do indivíduo.
De forma vantajosa, o vector é administrado dez dias após a administração da bupivacaina, e sensivelmente no mesmo local no músculo do indivíduo. A presente composição pode conter, além disso, adjuvantes compatíveis e farmacologicamente aceitáveis.
Esta composição é administrada, de preferência, por injecção intramuscular. A injecção pode ser realizada com o auxílio de uma seringa afectada a esta utilização mas também com o auxílio de uma pistola a jacto líquido tal como a descrita por FURTH et al. (1992, Anal. Biochem.205, 365-368).
As quantidades de bupivacaina necessárias para obter uma degenerescência suficiente do tecido muscular de modo a obter uma imunização óptima na ordem de 0,10 mg a 10 mg por dose da composição injectável.
As quantidades de vectores a injectar de modo a obter imunização óptima do indivíduo contra uma hepatite variam em função da proteína codificada pelo gene transportado pelo vector. A título indicativo injectam-se entre 0,1 e 1000 yg de vectores por indivíduo. 9
Os vectores poderão ser obtidos pelos métodos conhecidos dos peritos, em particular através da síntese ou pelos métodos de engenharia genética.
Estes métodos são os descritos, em particular, no manual técnico:
Maniatis T. et al. 1982 - Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor - Ed. New York. A presente invenção é ilustrada, sem estar de modo nenhum, limitada pelos exemplos que se seguem, nos quais: A figura 1 é uma representação esquemática do plasmídeo pRC/CMV-HBs. - As figuras 2A a 2D são representações esquemáticas dos pCMVHB-s, pCMVHB-S2.S, pCMVHB-Sl.S2.S e pHBV-Sl.S2.S, respectivamente.
As figuras 3, 4 e 5 são os mapas de restrição esquemáticos dos plasmídeos pCMVHB-S2.S, pCMVHB-Sl.S2.S e pRSV-HBS. A figura 6 ilustra a secreção de partículas antigénicas HBs (HBs Ag) em ng/ml (em ordenada) em função do número de dias (em abcissa) pelas células que possuem os 5 plasmídeos pCMVHB-S, pCMVHB- S1.S2.S, pHBV-Sl.S2.S, pSVS ou pCMVHB-S2.S. As figuras 7A e 7B ilustram a colocação em evidencia de certas partículas da figura 6 dos 8 antigenes pré-Sl e Pré-S2 por, respectivamente, anticorpos anti-pré-Sl e anti-pré-S2. A formação dos complexos anticorpos-antigene é colocada em evidência pela densidade óptica (em ordenada) , em função da concentração em antigene.
As figuras 8A a 8D representam as respostas anti-HBS (HBs Ab em ordenada, expressa em mUI/ml) e anti-pré-S2 (pré-S2 Ab em ordenada, expressa em D.O.) de ratos vacinados por, 10 respectivamente, o pCMVHB-S (8A), o pCMVHB-S2.S (SB), ο pCMVHB-Sl.S2.S (8C) e o pHBV-Sl.SZ.S (8D). A figura 9 ilustra a resposta de anticorpos, imunoglobulinas Ig G e IgM (títulos em ordenada) , de um rato vacinado pelo pCMVHB-S2.S em função do número de semanas (em abcissa).
As figuras 10A a 10C representam as respostas anti-grupo e anti-subtipo ay induzidas pelo ADN de pCMV-S (ADN) ou pelo antigene HBS (prot), respectivamente, nos ratos ΒΙΟ (10A), BIOS (10B) e B10M (10C).
As figuras 10D a 10F representam as respostas anti-grupo induzidas pelo ADN de pCMV-S (ADN) ou pelo antigene HBS (prot), respectivamente, nos ratos B10 (10D), BIOS (10E) e BlOM (10F). A figura 11 representa um mapa linear de restrição do plasmídeo pBS-SKT-Sl.S2.S. EXEMPLO 1:
Indução de anticorpos contra um antigene de superfície da hepatite B por injecção sequencial de bupivacaina e de um plasmídeo que possui um gene que codifica o antigene. 1) Materiais e métodos 1.1 Pré-tratamento pela bupivacaina.
Todas as experiências foram efectuadas sobre os músculos da tíbia anterior (TA) de ratos C57BL/6J com idades de 5 a 7 semanas. 11
Um ciclo único de degeneração e de regeneração das fibras musculares é induzido nos músculos da tibia anterior de ratos não anestesiados, através de injecção intramuscular de 50 μΐ de marcaina (bupivacaina 0,5 %, DMSO 1%) comercializada pelos Laboratoires Astra, France. A solução é injectada utilizando uma seringa de tuberculose e uma agulha inserida num tubo de ligação de polietileno, de modo a limitar a penetração a uma profundidade de 2 mm. A marcaina é um anestésico, as injecções nas pernas direita e esquerda são espaçadas de 10 a 30 minutos de modo a evitar uma sobredosagem.
1.2. Preparação do ADN O plasmideo utilizado foi construído por clonagem num vector pBluescript modificado do fragmento de restrição Xho 1-Bgl II do plasmideo pCPlO que contém o gene que codifica o antigene de superfície HBS a as sequências não traduzidas a montante e a jusante incluindo o sinal de poli-adenilação. O gene S foi, de seguida, recuperado por digestão com o auxílio das enzimas Kpnl-BssHII e o fragmento foi clonado no local do vector pRC/CMV comercializado por In Vitrogen. A construção plasmídica final foi denominada pCMV-HBS e foi depositada sob o número 1-1370 da CNCM.
Este plasmideo é representado esquematicamente na figura 1. O promotor CMV está situado entre o nucleótido 228 que é o local de corte de MluI e o nucleotido 896, que é o local de corte de Kpnl. O fragmento de ADN que compreende o gene de estrutura do antigene HBs foi clonado entre os nucleotidos 896 e 2852 (local de BssH III) . 12 0 gene HBs estende-se entre os nucleotidos 911 (local Xhol) e 2768 (local Bgl II). A seguência completa deste plasmideo é a sequência SEQ ID N° 1. 0 ADN plasmídico purificado foi preparado pelos métodos padrão, redissolvido num tampão PBS e armazenado a -20 °C até à injecção.
1.3 Injecção do ADN
Um a cinco dias após a injecção de marcaina injectou-se o ADN no mesmo local, os ratos foram anestesiados com o auxilio de pentobarbital de sódio (75mg/kg via intraperitoneal). A solução de ADN, que contém 50 yg de ADN plasmidico e 50 μΐ de tampão PBS, foi injectada através da pele nos músculos durante a regeneração da tibia anterior por uma única injecção intramuscular.
As injecções foram realizadas de maneira bilateral, nas duas patas dos ratos, cada animal recebeu assim no total 100 yg de ADN plasmidico recombinante. Como para a injecção de marcaina, injecta-se a solução de ADN utilizando a seringa de tuberculose e a agulha precedentemente descrita.
Em cada pata realizou-se uma só injecção intramuscular de ADN. 13 2. Resultados
Os resultados obtidos estão resumidos na tabela 1 a seguir indicada.
Mostram de modo muito claro que a injecção de ADN após o tratamento pela marcaina permite obter taxas importantes de anticorpos séricos contra o antigene de superfície da hepatite B.
Estes resultados são surpreendentes, a análise do estado da técnica não permite supor que um plasmídeo permitirá a indução de anticorpos- anti-HBs que possam ser reencontrados no soro e permitam assim uma vacinação eficaz. A facilidade de aplicação da vacinação pelos plasmídeos, e o facto de não ser necessário fazer novas doses, permite encarar uma vacinação a grande escala. EXEMPLO 2:
Comparação da eficácia da injecção de um plasmídeo em presença e na ausência de lípidos.
Uma dose de 10 pg de ADN plasmidico do vector SV40-Luciferase disponível comercialmente ("pGL2-Control Vector" de Promega, referencia EI 11) em 50 μΐ de solução fisiológica é injectada num músculo pré-tratado com sacarose de acordo com o método de Davis et al. (Hum. Gene Ther. 4:151-159 (1993)). O ADN injectado é previamente misturado com os lipidos tal como o dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) ou as misturas seguintes: DOGS + espermidina, e DOGS + polietilenoglicol (PEG) . A actividade da luciferase é medida 5 dias após a inj ecção. 14
Estes resultados figuram na tabela II a seguir indicada. Mostram que a presença de lipidos (DOGS) diminui de maneira muito importante a eficácia da injecção do plasmideo em relação a uma composição sem lipidos (controlo). EXEMPLO 3:
Comparação das respostas dos ratos e dos coelhos contra plasmídeos que possuem diversos genes de envelope do vírus HBV.
Quatro plasmídeos foram construídos permitindo a expressão de uma, duas ou três proteínas de envelope do vírus HBV. Em três das construcções (pCMvHB-S, pCMVHB-S2.S, pCMVHB-Sl.S2.S) os genes que codifica as proteínas de envelope do vírus HBV foram colocados sob o controlo transcripcional do promotor dos genes precoces do vírus CMV (figura 1, figura 2A a 2C, figuras 3 e 4). 0 quarto plasmideo (pHBV-Sl.S2.S) utiliza como elemento de controlo transcripcional o promotor dos genes de superfície do vírus HBV contido na região pré-Sl deste vírus (Cattaneo et al. (1983) Nature, 305, 336) (figura 2D) . Nas quatro construcções, o sinal de poliadenilação utilizado está contido nas sequências HBV presentes em 3' do gene S. 1. Controlo in vitro de eficácia dos vectores.
Para controlar a eficácia destes vectores in vitro nas células eucariotas, os fibroblastos ou os mioblastos dos ratos foram transfectados. Foi utilizado como controlo, um plasmideo que exprime as três proteínas de envelope sob controlo do promotor SV40 (pSVS) (Michel et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81, 7708-7712)). A figura 6 monstra a cinética de secreção das partículas HBs nos sobrenadantes da 15 cultura. As fracas taxas de antigene produzidas pelas transfecção do vector pCMVHB-Sl.S2.S são compatíveis com uma forte síntese da grande proteína de envelope a partir do promotor CMV. Esta proteína foi miristilada na sua parte amino-terminal, retida no retículo endoplasmico (Ganem, (1991), Current Topics in Microbiology and
Immunology, 168, 61-83). A retenção na célula das proteínas que possuem os determinantes pré-Sl foi confirmada por imunofluorescência. A composição das partículas segregadas foi analisada num sistema ELISA sandwich utilizando como anticorpos de captura um anticorpo monoclonal de rato especifico dos determinantes pré-Sl (figura 7A) ou pré-S2 (figura 7B) e como segundo anticorpo um soro policlonal de coelho anti-HBs. Estas experiências mostram que as partículas de AgHBs produzidas a partir do vector pCMVHB-Sl.S2.S possuem os determinantes pré-Sl e pré-S2 assinalando a presença da grande e da média proteína de envelope do vírus HBV. As partículas segregadas após a transfecção do vector pCMVHB-S2.S e pHBV-S1.52.S possuem, além dos determinantes Hbs, os determinantes pré-S2 característicos da proteína média de envelope.
2) Inoculação do ADN 0 ADN purificado sobre a colónia é Quiagen foi injectado por via intramuscular numa única injecção de 100 pg (50 pg/pata) no músculo anterior da dos ratos C57/BL6 (8 ratos por grupo). Cinco dias antes da injecção, o músculo foi pré-tratado pela cardiotoxina de modo a induzir uma degeneração seguida de uma regeneração das células musculares favorecendo, assim, a captura do ADN pelas células. 16
Foram também realizadas com coelhos as experiências de injecção de ADN. Neste caso o ADN pCMVHB-S foi administrado no músculo normal sem degeneração, seja através de uma pistola de injecção sem agulha Biojector®, seja através de seringas convencionais munidas de agulhas.
3) Respostas anti-HBs dos ratos vacinados com ADN
Foi induzida uma resposta anticorpos anti-HBs através de uma única injecção de um ou outro dos quatro plasmídeos utilizados. A resposta dos anticorpos foi analisada através de um kit comercial de detecção de anticorpos anti-HBs (Monolisa anti-HBs, Diagnostic Pasteur). Os anticorpos anti-pré-S2 são detectados com um sistema ELISA utilizando sobre a fase sólida, um péptido da região pré-S2 (RA 120-145) correspondente ao epitopo B principal transportado por este domínio (Neurath et al., (1985), Nature, 315, 154).
As figuras BA a 8D mostram a cinética da resposta anti-HBs (HBS-Ab) expressa em mili-unidades internacionais/ml e a resposta anti-pré-S2 (pré-S2Ab) medida em densidade óptica (492 nm) para 9 soros diluídos em 1/100. A revelação é efectuada com o auxílio de um anticorpo anti-imunoglobulina (IgG) de ratos marcados com peroxidase. A injecção do plasmídeo pCMVHB-S (figura 8A) induz uma síntese constante dos anticorpos anti-HBs. A seroconversão é obtida em 100% dos ratos desde uma semana após a injecção com uma taxa de anticorpos de 48 mUI/ml (de 12 a 84 mUI/ml, desvio- tipo (SD) = 28), que é 4 a 5 vezes superior ao limite requerido no homem para conferir a protecção (10 mUI/ml). 17 A resposta induzida por uma única injecção do plasmídeo pCMVHB-S2.S (figura 8B) caracteriza-se pelo aparecimento muito precoce de anticorpos anti-HBs. Estes anticorpos atingem uma taxa média de 439 mUI/ml (de 104 a 835 mUI/ml; SD = 227) uma semana depois diminuem para reaumentar e atingir às 13 semanas a taxa inicial. O significado deste pico de anticorpos será discutido mais tarde. Um pico de anticorpos IgG anti-pré-S2 é observado às duas semanas. O aparecimento dos anticorpos anti-HBs induzidos pela injecção dos plasmideos pCMVHB-Sl.S2. S (figura 8C) e pHBV-S1.S2.S (figura 8D) é ligeiramente retardado visto que os ratos não sofreram seroconversão a 100 % a partir das duas semanas. O perfil da seroconversão é idêntico, é caracterizado por uma resposta inicial especifica do antigene pré-S2 seguida de uma resposta anti-HBs que aumenta gradualmente para atingir as taxas de 488 mUI/ml (de 91 a 1034 mUI/ml; SD = 552) (pCMVHB-Sl.S2.S) e 1725 mUI/ml (de 143 a 6037 mUI/ml; SD = 1808) (pHBV-Sl.S2.S) a 13 semanas. 4) Respostas anti-HBs dos coelhos vacinados com ADN.
Os resultados apresentados nas tabelas III e IV mostram que as taxas de anticorpos detectados nas 8 semanas com os coelhos imunizados com o Biojector são significativamente aos obtidos pela injecção do ADN com a agulha. 5. Análise qualitativa da resposta humoral.
Os sistemas ELISA possuem sobre a fase sólida dos antigenes HBs de composições variadas em relação aos presentes determinantes e utilizam como segundo anticorpo os anticorpos 18 específicos das IgM ou das IgG de ratos permitem analisar qualitativamente a resposta de anticorpos obtida.
Em todos os casos, a única injecção de ADN nos ratos caracteriza-se pelo aparecimento precoce de IgM específicos de AgHBs seguido imediatamente pela conversão em anticorpos de isotipos IgG característicos da resposta memória induzida como auxílio das células T auxiliares. A resposta dos anticorpos à injecção de ADN caracteriza-se pela sua precocidade. Com efeito, a seroconversão é obtida 8 a 15 dias após a injecção de acordo com o tipo de ADN utilizado e em todos os casos o é atingido em quatro semanas e mantido de forma surpreendente durante 12 semanas. A utilização do antigene HBs de subtipo heterologo (ad) fixado sobre as placas ELISA permitem colocar em evidencia a presença, no soro dos ratos imunizados, de anticorpos específicos de grupo anti-a, e pela diferença de reactividade frente a AgHBs do mesmo subtipo (ay), de anticorpos específicos de subtipo anti-γ. A presença dos anticorpos específicos dos determinantes do grupo de AgHBs é muito importante uma vez que estes são capazes de conferir a protecção contra os vírus de subtipo heterologos na época de testes virulentos no chimpanzé (Szmuness et al. (1982) N.
Engl. J. Med. 307, 1481-1486).
A análise da resposta induzida pelo vector PCMV-S2.S mostra que esta apresenta uma semelhança considerável com a que se pode observar no homem ao longo da infecção. É caracterizado por um pico de IgM especifico da região pré-S2 extremamente precoce (8 dias) imediatamente seguido por uma conversão em IgG anti-pré-S2 (figura 9) . Esta resposta é seguida pelo aparecimento dos anticorpos anti-HBs IgM depois IgG. A 19 produção dos anticorpos anti-HBs é constante e atinge um máximo nas 4 semanas. Na 13a semana as IgG anti-HBs e anti-pré-S2 persistem a um nivel constante. A resposta anti-sub-tipo (γ) precede a resposta anti-grupo (a) da mesma maneira que a que foi descrita quando da vacinação com a vacina recombinante (Tron et al., (1989) (J.
Infect. Dis.160, 199-204). A resposta obtida com as três outras vacinas de ADN mostra a comutação de classe IgM -> IgG caracteristica da resposta secundária. A resposta tem uma abordagem dirigida contra o subtipo antes de ser contra os determinantes do grupo de
AgHBs. A resposta a longo termo, estudada para o ADN pCMVHB-S, mostra que o pico de anticorpos é atingido em 3 meses e que persiste a uma taxa igual 6 meses mais tarde (Tabela V). 6) Vacina genética e não resposta
Um problema principal da vacinação contra a hepatite B permanece no número elevado de não-responderores à vacinação clássica (2,5 a 5%). A não resposta no homem pode ser correlacionada com certos tipos HLA (Krustall et al., (1992) J. Exp. Med. 175, 495-502) e com um defeito da apresentação do antigene ou do estimulo das células T auxiliares.
Para estudar o impacto possível da vacinação genética sobre a não resposta a AgHBs, foi usado um painel de origens de ratos cuja resposta às diferentes proteínas de envelope do vírus HBV é regulado geneticamente e está bem caracterizada por 20
Millich et Coll. (1986 J. Immunol. 137, 315). A construção pCMVHB-S descrita precedentemente foi injectada nos músculos dos ratos BI 0 (H-2b) BI 0 . S (H-2S) e B10.M (H-2f) . A origem B10 responde às três proteínas de envelope do vírus, a origem B10.S não responde à AgHBs mas a não-resposta pode ser contornada pela imunização com os antigenes HBsAg gue possuem os determinantes pré-S2. A origem B10M é totalmente não respondedora ao antigene HBs e ao antigene pré-S2. Pode ser obtida uma resposta desta origem através da imunização com AgHBs que possuem os determinantes pré-Sl.
Os ratos imunizados através do ADN receberam uma única injecção (100 gg) no músculo em regeneração. Os ratos de controlo receberam a proteína em duas injecções intraperitoneais com um mês de intervalo, a primeira de 2 gg AgHBs adjuvada em adjuvante completo de Freund (CFA) e a segunda de 2 gg AgHBs adjuvada em adjuvante incompleto de Freund (IFA).
Os resultados obtidos com o ADN pCMVHB-S são ilustrados pelas figuras 10A a 10F. - Com a origem B10 (boa respondedora) a resposta induzida pelo ADN é mais precoce que a resposta induzida pela proteína após uma única injecção. - Com a origem BIOS (não respondedora a AgHBs em ausência de pré-S2) observa-se o aparecimento de anticorpos anti-HBs específicos de subtipo depois específicos do grupo após a imunização pelo ADN pCMVHB-S. Os anticorpos anti-HBs específicos do grupo não são obtidos com os ratos imunizados com a proteína HBs após a 2a injecção. - Com a origem B10M (não respondedora a AgHBs na ausência de pré-Sl) a imunização pelo ADN permite obter uma resposta 21 anti HBs específica do grupo e de subtipo enquanto que a proteína induz uma resposta apenas de subtipo e necessita de duas injecções. A resposta induzida pelos três tipos de vectores é comparada entre as três origens de ratos.
CONCLUSÃO
Em geral, admite-se que a resposta humoral ao antigene HBs é suficiente por ela própria para conferir a protecção. A presença de anticorpos dirigidos contra outros determinantes (pré-Sl e pré-S2) transportados pelas proteínas de envelope do vírus, elas mesmas de protecção, poderá melhorar a qualidade desta resposta. 0 conjunto de experiências aqui referidas mostra que a resposta humoral induzida pela vacinação genética anti-hepatite B é em vários domínios superior à que pode ser obtido através da vacinação clássica.
Em termos de taxa de seroconversão: a taxa de 100% é obtida desde os 8 dias, para os ratos imunizados com os ADN pCMV-HBs e pCMVHB-S2.S, após uma única injecção.
Em termos do nível de resposta: o limite de 10 mUI/ML considerado suficiente no homem para conferir a protecção está contudo largamente ultrapassado.
Em termos da precocidade da resposta: o vector pCMVHB-S2.S permite obter em 8 dias um nível muito elevado de anticorpos anti-pré-S2 e sabe-se que estes são capazes, sozinhos, de conferir a protecção (Itoh et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 9174-9178) . 22
Em termos da persistência da resposta: os anticorpos anti-HBs persistem a um nivel elevado durante mais de 6 meses.
Em termos da qualidade da resposta: os anticorpos obtidos são do tipo IgG característicos de uma resposta dependente das células T auxiliares e assim de uma resposta memória.
Em termos da actividade anti-viral: os anticorpos são específicos do subtipo virai mas sobretudo específicos do grupo e assim susceptíveis de conferir uma protecção cruzada.
Em termos do significado biológico: o perfil da resposta obtida pela imunização com pCMVHB-S2.S imita completamente o que se pode observar, no homem, no momento de uma infecção virai resolvida. 23
TABELA I
Indução de anticorpos contra o antigene de superfície da hepatite B, t
Descrição Número de ratos Taxa de anticorpos contra o antigene de superfície da hepatite B no soro (mUI/ml) Antes da injecção de ADN 15 dias após a injecção de ADN 35 dias após a injecção de ADN ADN injectado 1 dia após do tratamento com marcaina 5 0 Média: 56 de 5 a mais de 140 Média: 59 ADN injectado 5 dia após do tratamento com marcaina 5 0 Média: 71 de 21 a mais de 108 Média: 47
TABELA II
Grupo RLU/seg/ músculo de Luciferase (Média ± SEM) RLU = unidade de Luz Relativa Percentagem em relação à amostra de controlo Amostra de controlo 43 082 í 5 149 100¾ 4X DOGS 23 í 7 0,06¾ DOGS - espermidina 50 í 23 0,12¾ PEG - DOGS 0 í 0 0,00¾
TABELA III
Imunização com o Biojector® pCMV-HB,S N° 0 semanas 2 semanas 8 semanas 2.1 0 517 380 2.2 0 374 322 3.1 0 258 418 4.1 0 400 4045 4.2 0 88 86 4.3 0 314 420 6.1 0 415 1001 6.2 0 1543 3517 6.3 0 1181 141 Média 0 566 mUI/ml 114 mUI/ml SD 0 476 1521 SEM 0 159 507 N 9 9 9 cv 841 1331
TABELA IV
Imunização por injecção com o auxílio de uma agulha υζ. pCMV-HB,S N° 0 semanas 2 semanas 8 semanas 1.1 1 0 1 5.1 0 GO 0\] LO oo 5.2 0 162 oo 5.3 0 305 203 7.1 0 oo 175 7.2 0 1108 Morte Média 0 325 mUI/ml 273 raUI/ml SD 0 401 305 SEM 0 164 136 N 6 6 6 cv 245¾ 124¾ 112¾
TABELA V
Resposta a longo prazo de um rato vacinado com pCMVHB-S 83 1 mês 2 meses 3 meses 6 meses * Titulo a-HBS em mlJI/ml 227 662 1299 1082 * Titulo a-HBS ELISA 3,5xl0"4 5xl0'1 8,5xl0"4 9xl0'í (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:
(A) NOME: INSTITUT PASTEUR (B) RUA: 28, rue du Docteur Roux
(C) CIDADE: PARIS
(D) PAÍS: FRANÇA (E) CÓDIGO POSTAL: 75724
(ii) TITULO DA INVENÇÃO: VECTOR NUCLEOTÍDICO, COMPOSIÇÃO QUE O CONTÉM E VACINA PARA A IMUNIZAÇÃO CONTRA UMA HEPATITE (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 1 (v) FORMA DE LEITURA NO COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: Diskette (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (OEB) (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5618 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleíco (C) NÚMERO DE CADEIAS: dupla (D) CONFIGURAÇÃO: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO 29 (vi) ORIGEM:
(B) FONTE: pRCCMV-HBS (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GACGGATCGG GAGATCTCCC GATCCCCTAT GGTCGACTCT 40 CAGTACAATC TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT 80 CTGCTCCCTG CTTGTGTGTT GGAGGTCGCT GAGTAGTGCG 120 CGAGCAAAAT TTAAGCTACA ACAAGGCAAG GCTTGACCGA 160 CAATTGCATG AAGAATCTGC TTAGGGTTAG GCGTTTTGCG 200 CTGCTTCGCG ATGTACGGGC C AG AT AT AC G CGTTGACATT 240 GATTATTGAC TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACGGGGTC 280 ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCG CGTTACATAA 320 CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCTGACCG CCCAACGACC 360 CCCGCCCATT GACGTCAATA ATGACGTATG TTCCCATAGT 400 AACGCCAATA GGGACTTTCC ATTGACGTCA ATGGGTGGAC 440 TATTTACGGT AAACTGCCCA CTTGGCAGTA CATCAAGTGT 480 ATCATATGCC AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG 520 TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA CATGACCTTA 560 TGGGACTTTC CTACTTGGCA GTACATCTAC GTATTAGTCA 600 TCGCTATTAC CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA 640 TGGGCGTGGA TAGCGGTTTG ACTCACGGGG ATTTCCAAGT 680 CTCCACCCCA TTGACGTCAA TGGGAGTTTG TTTTGGCACC 720 AAAATCAACG GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC 760 CCCATTGACG CAAATGGGCG GTAGGCGTGT ACGGTGGGAG 800 GTCTATATAA GCAGAGCTCT CTGGCTAACT AGAGAACCCA 840 CTGCTTAACT GGCTTATCGA AATTAATACG ACTCACTATA 880 GGGAGACCCA AGCTTGGTAC CGGGCCCCCC CTCGAGGATT 920 GGGGACCCTG CGCTGAACAT GGAGAACATC ACATCAGGAT 960 TCCTAGGACC CCTTCTCGTG TTACAGGCGG GGTTTTTCTT 1000 30 GTTGACAAGA ATCCTCACAA TACCGCAGAG TCTAGACTCG 1040 TGGTGGACTT CTCTCAATTT TCTAGGGGGA ACTACCGTGT 1080 GTCTTGGCCA AAATTCGCAG TCCCCAACCT CCAATCACTC 1120 ACCAACCTCT TGTCCTCCAA CTTGTCCTGG TTATCGCTGG 1160 ATGTGTCTGC GGCGTTTTAT CATCTTCCTC TTCATCCTGC 1200 TGCTATGCCT CATCTTCTTG TTGGTTCTTC TGGACTATCA 1240 AGGTATGTTG CCCGTTTGTC CTCTAATTCC AGGATCCTCA 1280 ACAACCAGCA CGGGACCATG CCGGACCTGC ATGACTACTG 1320 CTCAAGGAAC CTCTATGTAT CCCTCCTGTT GCTGTACCAA 1360 ACCTTCGGAC GGAAATTGCA CCTGTATTCC CATCCCATCA 1400 TCCTGGGCTT TCGGAAAATT CCTATGGGAG TGGGCCTCAG 1440 CCCGTTTCTC CTGGCTCAGT TTACTAGTGC CATTTGTTCA 1480 GTGGTTCGTA GGGCTTTCCC CCACTGTTTG GCTTTCAGTT 1520 ATATGGATGA TGTGGTATTG GGGGCCAAGT CTGTACAGCA 1560 TCTTGAGTCC CTTTTTACCG CTGTTACCAA TTTTCTTTTG 1600 TCTTTGGGTA TACATTTAAA CCCTAACAAA ACAAAGAGAT 1640 GGGGTTACTC TCTAAATTTT ATGGGTTATG TCATTGGATG 1680 TTATGGGTCC TTGCCACAAG AACACATCAT ACAAAAAATC 1720 AAAGAATGTT TTAGAAAACT TCCTATTAAC AGGCCTATTG 1760 ATTGGAAAGT ATGTCAACGA ATTGTGGGTC TTTTGGGTTT 1800 TGCTGCCCCT TTTACACAAT GTGGTTATCC TGCGTTGATG 1840 CCTTTGTATG CATGTATTCA ATCTAAGCAG GCTTTCACTT 1880 TCTCGCCAAC TTACAAGGCC TTTCTGTGTA AACAATACCT 1920 GAACCTTTAC CCCGTTGCCC GGCAACGGCC AGGTCTGTGC 1960 CAAGTGTTTG CTGACGCAAC CCCCACTGGC TGGGGCTTGG 2000 TCATGGGCCA TCAGCGCATG CGTGGAACCT TTTCGGCTCC 2040 TCTGCCGATC CATACTGCGG AACTCCTAGC CGCTTGTTTT 2080 GCTCGCAGCA GGTCTGGAGC AAACATTATC GGGACTGATA 2120 ACTCTGTTGT CCTATCCCGC AAATATACAT CGTTTCCATG 2160 GCTGCTAGGC TGTGCTGCCA ACTGGATCCT GCGCGGGACG 2200 31 TCCTTTGTTT ACGTCCCGTC GGCGCTGAAT CCTGCGGACG 2240 ACCCTTCTCG GGGTCGCTTG GGACTCTCTC GTCCCCTTCT 2280 CCGTCTGCCG TTCCGACCGA CCACGGGGCG CACCTCTCTT 2320 TACGCGGACT CCCCGTCTGT GCCTTCTCAT CTGCCGGACC 2360 GTGTGCACTT CGCTTCACCT CTGCACGTCG CATGGAGACC 2400 ACCGTGAACG CCCACCAAAT ATTGCCCAAG GTCTTACATA 2440 AGAGGACTCT TGGACTCTCA GCAATGTCAA CGACCGACCT 2480 TGAGGCATAC TTCAAAGACT GTTTGTTTAA AGACTGGGAG 2520 GAGTTGGGGG AGGAGATTAG GTTAAAGGTC TTTGTACTAG 2560 GAGGCTGTAG GCATAAATTG GTCTGCGCAC CAGCACCATG 2600 CAACTTTTTC ACCTCTGCCT AATCATCTCT TGTTCATGTC 2640 CTACTGTTCA AGCCTCCAAG CTGTGCCTTG GGTGGCTTTG 2680 GGGCATGGAC ATCGACCCTT ATAAAGAATT TGGAGCTACT 2720 GTGGAGTTAC TCTCGTTTTT GCCTTCTGAC TTCTTTCCTT 2760 CAGTACGAGA TCTGGCCAGG ATCCACTAGT TCTAGAGCGG 2800 CCGCCACCGC GGTGGAGCTC CAGCTTTTGT TCCCTTTAGT 2840 GAGGGTTAAT TGCGCGCATG CCCGACGGCG AGGATCTCGT 2880 CGTGACCCAT GGCGATGCCT GCTTGCCGAA TATCATGGTG 2920 GAAAATGGCC GCTTTTCTGG ATTCATCGAC TGTGGCCGGC 2960 TGGGTGTGGC GGACCGCTAT CAGGACATAG CGTTGGCTAC 3000 CCGTGATATT GCTGAAGAGC TTGGCGGCGA ATGGGCTGAC 3040 CGCTTCCTCG TGCTTTACGG TATCGCCGCT CCCGATTCGC 3080 AGCGCATCGC CTTCTATCGC CTTCTTGACG AGTTCTTCTG 3120 AGCGGGACTC TGGGGTTCGA AATGACCGAC CAAGCGACGC 3160 CCAACCTGCC ATCACGAGAT TTCGATTCCA CCGCCGCCTT 3200 CTATGAAAGG TTGGGCTTCG GAATCGTTTT CCGGGACGCC 3240 GGCTGGATGA TCCTCCAGCG CGGGGATCTC ATGCTGGAGT 3280 TCTTCGCCCA CCCCAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG 3320 TTACAAATAA AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA 3360 GCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC 3400 32 TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGGATCC CGTCGACCTC 3440 GAGAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT 3480 GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC 3520 CGGAAGCATA AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG 3560 AGCTAACTCA CATTAATTGC GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT 3600 TCCAGTCGGG AAACCTGTCG TGCCAGCTGC ATTAATGAAT 3640 CGGCCAACGC GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC 3680 TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC TGACTCGCTG CGCTCGGTCG 3720 TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT CAAAGGCGGT 3760 AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG 3800 AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA 3840 AAAAGGCCGC GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC 3880 CCCTGACGAG CATCACAAAA ATCGACGCTC AAGTCAGAGG 3920 TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC CAGGCGTTTC 3960 CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT 4000 GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA 4040 AGCGTGGCGC TTTCTCAATG CTCACGCTGT AGGTATCTCA 4080 GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA 4120 CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC CTTATCCGGT 4160 AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT 4200 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC 4240 GAGGTATGTA GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG 4280 CCTAACTACG GCTACACTAG AAGGACAGTA TTTGGTATCT 4320 GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA AAAGAGTTGG 4360 TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT 4400 GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA 4440 AAGGATCTCA AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC 4480 TGACGCTCAG TGGAACGAAA ACTCACGTTA AGGGATTTTG 4520 GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC TAGATCCTTT 4560 TAAATTAPAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA 4600 33 TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT 4640 GAGGCACCTA TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA 4680 TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC GTGTAGATAA CTACGATACG 4720 GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC AATGATACCG 4760 CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA 4800 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC 4840 AACTTTATCC GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG 4880 GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA 4920 ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG TGTCACGCTC 4960 GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA 5000 TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG 5040 CGGTTAGCTC CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA 5080 GTTGGCCGCA GTGTTATCAC TCATGGTTAT GGCAGCACTG 5120 CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA AGATGCTTTT 5160 CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA 5200 GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAATA 5240 CGGGATAATA CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC 5280 TCATCATTGG AAAACGTTCT TCGGGGCGAA AACTCTCAAG 5320 GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT GTAACCCACT 5360 CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA 5400 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC 5440 AAAAAAGGGA ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC 5480 ATACTCTTCC TTTTTCAATA TTATTGAAGC ATTTATCAGG 5520 GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG AATGTATTTA 5560 GAAAAATAhA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA 5600 ARAGTGCCAC CTGACGTC 5618 09-11-2006 34
Claims (30)
- REIVINDICAÇÕES 1. Vector nucleotídico que compreende pelo menos: - um gene ou um ADN complementar que codifica, por um lado, uma proteína de um vírus; - a sequência de terminação não traduzida do referido gene ou do referido ADN complementar, incluindo o sinal de poli-adenilação; e - um promotor que permite a expressão deste gene nas células musculares.
- 2. Vector de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo vírus ser o de uma hepatite.
- 3. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado por não se replicar nas células.
- 4. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo gene codificar pelo menos uma parte de uma proteína do vírus da hepatite B.
- 5. Vector de acordo a reivindicação 4, caracterizado pela proteína ser a proteína S, S-préS2 ou S-préS2-PréSi.
- 6. Vector de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo gene ser o gene o gene S.
- 7. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo vírus ser o de uma hepatite A ou de uma hepatite não-A, não-B, tal como uma hepatite C, E ou delta.
- 8. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo referido promotor ser o promotor do citomegalovírus. 1
- 9. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 6 e 8, caracterizado por ser o plasmídeo pCMV-HBS depositado sob o número 1-1370 da CNCM a 21 ode Outubro de 1993.
- 10. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 6 e 8, caracterizado por ser o plasmideo pCMV-Sl.S2.S depositado sob o número 1-1411 da CNCM.
- 11. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 6 e 8, caracterizado por ser o plasmideo pCMV-S2.S depositado sob o número 1-1410 da CNCM.
- 12. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser o plasmideo pRSV-HBS depositado sob o número I-137q da CNCM a 21 ode Outubro de 1993.
- 13. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo promotor ser dos genes de superfície do vírus HBV.
- 14. Vector de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser o plasmídeo pCMV-Sl.S2.S depositado sob o número I-1409 da CNCM.
- 15. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender um promotor interno.
- 16. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender um promotor de um gene de uma proteína do citoesqueleto.
- 17. Vector de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por compreender o promotor da desmina. 2
- 18. Vector de acordo com uma das reivindicações 16 e 17, caracterizado pelo promotor ser homologo ao hospedeiro ao qual deve ser administrado o vector.
- 19. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado, por compreender os genes que codificam pelo menos em parte a proteína gpl60 do vírus HIV1 associada à proteína p25, e/ou à proteína p55, e/ou à proteína pl8.
- 20. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado por compreender pelo menos um gene que codifica a proteína Rev do Vírus HIV1.
- 21. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, que compreende um promotor homologo ao hospedeiro e uma outra sequência de regulação para a expressão de um gene ou de um ADN complementar que codifica S, S-préS2 ou S-préSi- préS2.
- 22. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, que compreende um promotor homologo ao hospedeiro e uma outra sequência de regulação para a expressão de um gene ou de um ADN complementar que codifica a proteína gpl60 associada à p25 e/ou à p55 e/ou à pl8.
- 23. Vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, que compreende um promotor homologo ao hospedeiro e uma outra sequência de regulação para a expressão de um gene ou de um ADN complementar que codifica a proteína Rev.
- 24. Vacina, caracterizada por conter pelo menos um vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 20 ou uma sequência nucleotídica de acordo com uma das reivindicações 21 a 23. 3
- 25. Composição capaz de induzir uma resposta citotóxica constituída por pelo menos uma sequência nucleotídica expressa nas células musculares e que possui um promotor tal como definido uma das reivindicações 15 a 18.
- 26. Composição farmacêutica não lipidíca destinada à imunização contra uma infecção virai, tal como uma hepatite, que compreende um vector de acordo com uma das reivindicações 1 a 20 ou que compreende a sequência nucleotídica completa ou parcial de acordo com uma das reivindicações 21 a 23.
- 27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo referido vector ser administrado no músculo do indivíduo a imunizar, no mínimo cinco dias depois da administração da bupivacaina, sensivelmente no mesmo local.
- 28. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo vector ser administrado dez dias após a administração da bupivacaina.
- 29. Composição de acordo com uma das revendicações 27 e 28, caracterizada pela administração ser efectuada por injecção intramuscular.
- 30. Composição de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pela injecção intramuscular ser realizada com o auxilio de uma pistola de jacto líquido. 09-11-2006 4
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