PT660707E

PT660707E - Amantadina e compostos relacionados para utilizacao no tratamento da neuropatia periferica

Info

Publication number: PT660707E
Application number: PT93921355T
Authority: PT
Inventors: Stuart A Lipton
Original assignee: Childrens Medical Center
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 2001-11-30
Also published as: US5334618A; EP0660707A4; DE69330387D1; ATE202474T1; ES2159528T3; JP2006077034A; EP0660707A1; AU4847693A; EP0660707B1; DK0660707T3; CA2143752C; JPH08501297A; CA2143752A1; DE69330387T2; GR3036657T3; WO1994005275A1

Description

1

DESCRIÇÃO

AMANTADINA Ε COMPOSTOS RELACIONADOS PARA UTILIZAÇÃO NO TRATAMENTO DA NEUROPATIA PERIFÉRICA A presente invenção tem por objecto a utilização da substância amantadina e produtos com ela relacionados, particularmente a memantina e a rimantadina, na produção de um medicamento para uso no tratamento da neuropatia periférica dolorosa. A amantadina e/ou os compostos com ela relacionados têm sido propostos para várias terapias. Inicialmente propunham-se estes compostos para tratar o virus da gripe. Por exemplo, Mullis e outros descrevem, na patente de invenção norte-americana n° 3.391.142, adamantilaminas que se referem como agentes anti-virus. A patente de invenção norte-americana n° 4.351.847 de Griffin descreve que um derivado da amantadina é efectivo contra o virus simples do herpes. Na patente de invenção norte-americana n° 3.328.251 Smith descreve (em 13:24-31) que certos compostos relacionados com a amantadina são efectivos contra virus animais, particularmente contra a gripe dos porcos.

Também se observou, por acaso, que a amantadina e os compostos com ela relacionados são eficazes contra os sintomas da doença de Parkinson (Tominack e Hayden p. 460-461). Ver também a patente de invenção norte-americana n° 4.122.193 de Scherm em 6:54-60. Braunwald e outros (Principies of Internai Medicine, llth ed. P. 2017, New York, McGraw Hill, 1987) que refere que a amantadina tem sido utilizada para tratar a doença de Parkinson e que o seu efeito se alcança pela sua capacidade de libertar a dopamina armazenada nos terminais pré-sináticos. 7Sd

Ver também o Merck Index, p. 55, #373; p. 1188, #8116; e APP-2, #A7, que descreve a utilização de vários compostos na gripe A, no tratamento do Parkinsonismo e nas reacções extrapiramidais induzidas por drogas; um desses compostos é referido como tendo sido estudado no controlo da micturia e na mobilidade do músculo dos membros, assim como na qualidade de anti-espasmódico.

Também têm sido propostas outras utilizações para esses compostos. Por exemplo, Scherm 193 (em 6:56-60) descreve certos compostos que podem ser utilizados no tratamento de "outras espécies de hipercinésia [para além do parkinsonismo] incluindo tremores da cabeça, situações de tensão talâmica e condições espásticas e mesmo para a activação de situações cerebro-orgânicas acinéticas."

Bormann e outros descrevem, na patente de invenção norte-americana n° 5.061.703, certos derivados da amantadina que são úteis não só no tratamento das doenças parkinsonianas e parkinsonoides, por uma acção atribuída à influência da dopamina no sistema nervoso central (2:38-3:17), mas também por reduzirem os danos neurónicos associados à isquémia cerebral, mediada por um sub-tipo do N-metil-D-aspartato (NMDA) do receptor de amino ácido excitador. Bormann e outros descrevem que certos derivados da adamantina "...exibem propriedades anti-convulsivas e antagonistas do canal receptor de NMDA." (2:61-63). Também refere (3:10-16) que os derivados de adamantina "são especialmente adequados para a prevenção e tratamento da isquémia cerebral depois de apoplexia, cirurgia de coração aberto, paragem cardíaca, hemorragia subaracnoidana, ataques cerebro-isquémicos passageiros, asfixia perinatal, anoxia, hipoglicemia, apneia e doença de Alzheimer. [Realce adicionado.]" 3

Turski e outros (Nature 349:414, 1991), relatam certas experiências sobre a investigação do papel dos amino ácidos excitadores na toxicidade dopaminérgica causada pela ingestão de uma toxina conhecida como MFTP (l-metil-4-fenil-1,2,3,6,-tetra-hidropiridina). Co-administram-se os antagonistas dos aminoácidos excitadores com MPP+ (o metabolito activo da MFTP) e certos antagonistas de NMDA oferecem uma protecção temporária contra o MPP+.

Meldrum, na Trends Pharm. Sei. de Setembro, 1990, vol. 11, p. 379-387 revê literatura conhecida sobre a possibilidade dos antagonistas do receptor do aminoácido excitador de origem endógena ou ambiental contribuírem para a degeneração neurónica em estados de doença. Depois de rever os vários receptores conhecidos implicados na actividade do aminoácido excitador (particularmente a actividade do glutamato), a revisão dos autores (p. 386) sugere que os mecanismos de excitação da toxicidade podem desempenhar um papel na patogénese de vários distúrbios neurodegenerativos crónicos incluindo a doença de Huntington, atrofia do ponto de olivo do cerebelo, demência senil do tipo de Alzheimer, parkinsonismo e esclerose lateral amiotrófica (ELA), assim como dois sintomas crónicos ligados às toxinas das plantas.

Rothman e outros na Trends Neuroscience 10:299-302 (1987) também revêm a literatura respeitante à possibilidade de que a neurotoxicidade do glutamato possa ser responsável pela degeneração neurónica em vários distúrbios neurológicos.

Bormann, no Eur. J. Pharm. (1989) 166:591-592 relata que a memantina bloqueia os canais receptores de NMDA.

Kornhuber e outros no Eur. J. Pharm. 166:589-590 (1989) referem que a memantina inibe a ligação de um antagonista de

&S NMDA (ΜΚ-801) à substância homogénea do cérebro humano post-mortem.

Hahn e outros nos Proc. Nat'l Acad. Sei. (1988) 85:6556- 6560 referem que é bastante sustentável que uma toxina do tipo do glutamato que se parece com o NMDA possa ser responsável pela morte das células nervosas em situações observadas após acidentes neurológicos graves incluindo ataques apopléticos, ataques e distúrbios degenerativos, tais como a doença de

Huntington, a doença de Alzheimer e o complexo esclerose lateral-parkinsonismo-demência amiotrófica encontrada em Guam.

Eles referem verificações que sugerem que a entrada do ião Ca++ através de canais activados pelo NMDA é responsável por este tipo de morte neurónica e sugerem estratégias que podem ser úteis clinicamente no tratamento de vários distúrbios neurológicos.

Choi, em Neuron 1:623-634 refere que a neurotoxicidade devida aos aminoácidos excitadores pode estar envolvida nas doenças degenerativas de progressão lenta tal como a doença de Huntington. A presente invenção diz respeito ao tratamento da neuropatia periférica, especialmente a neuropatia periférica do tipo doloroso que pode ter origem no sistema nervoso central. De acordo com a presente invenção, há para o efeito, uma utilização do composto de fórmula geral indicado na Fig. 1 ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista fisiológico, na qual o símbolo Ri representa um grupo NH2 ou um grupo de fórmula geral

Xi - c - nh2 X2 5 />f na qual o símbolo Xi e o símbolo X2 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alifático de cadeia curta com 1 a 5 átomos de carbono [isto é, ou um grupo metilo ou entre 1-4 grupos (-CH2) e um grupo metilo terminal], os símbolos R2-R17 representam, cada um , independentemente uns dos outros, átomos de hidrogénio ou grupos alifáticos de cadeia curta contendo de 1 a 5 átomos de carbono e os símbolos R4 e Rio podem representar, independemente um do outro, um átomo de halogéneo (particularmente um átomo de fluor, cloro ou bromo) ou um grupo acilo, na produção de um medicamento para ser utilizado no tratamento da neuropatia periférica dolorosa nos mamíferos. Administra-se o composto* numa concentração efectiva para causar redução na degeneração neurónica.

Em situações preferidas , o símbolo Ri representa um grupo NH2 e o composto é preferencialmente a amantadina; o símbolo R4 representa um grupo metilo; o símbolo Rio representa um grupo metilo; os símbolos R4 e Rio representam ambos grupos metilo; os símbolos R4 e Rio representam ambos grupos metilo e o símbolo Ri representa um grupo NH2 e o composto é, preferencialmente memantina.

Alternativamente, o símbolo Ri pode representar um grupo de fórmula geral

Xi - c - nh2 X2

7íi Ο símbolo R4 representa um grupo metilo; o símbolo Rio representa um grupo metilo; os símbolos R4 e Rio representam ambos grupos metilo; os símbolos Xi e X2 representam, respectivamentemente, um átomo de hidrogénio e um grupo metilo ou os símbolos Xi e X2 representam, respectivamentemente, um grupo metilo e um átomo de hidrogénio; e o composto é, preferencialmente, rimantadina.

Os compostos úteis, no âmbito da presente invenção, incluem um anel tricíclico com 10 átomos de carbono que contem pelo menos um grupo amino na posição representada pelo símbolo Ri da fórmula geral mostrada na Fig. 1. O grupo amino pode estar ligado directamente a um anel de carbono (como no caso da amantadina; ver fig. 2a), ou pode estar ligado a um átomo de carbono ligado ao anel de carbono (como é o caso com a rimantadina; ver fig. 2b). Os símbolos R2-R17 (da fórmula geral da fig. 1) representam, cada um, átomos de hidrogénio, ou grupos metilo ou grupos alifáticos de cadeia curta contendo de 1 a 5 átomos de carbono saturados [isto é, grupos 1-4-(CH2) e um grupo metilo terminal], ou qualquer combinação destes. A potência neuroprotectora dos compostos pode ser aumentada por substituições dos átomos de hidrogénio do anel. Num dos exemplos, os substitutos dos grupos metilo nas posições representadas pelos símbolos R4 e Rio (da fórmula geral indicada na Fig. 1) aumentam consideravelmente a capacidade e a potência do composto, a memantina (mostrada na Fig. 2c) , para prevenir nos neurónios os danos induzidos pelo glutamato. A memantina é neuroprotectora in vitro a uma concentração de 2-12 μΜ (ver a seguir); a amantadina, com uma molécula insubstituída nestas posições, é eficaz numa concentração de aproximadamente 200 μΜ.

Pode aumentar-se a solubilidade em água dos compostos de fórmula geral mostrada na Fig.l, formulando o composto num sal aceitável sob o ponto de vista fisiológico, isto é, por reacção com ácido clorídrico. 7

Os compostos preferidos (como por exemplo a amantadina, a rimantadina e a memantina e os seus derivados similares) são solúveis em água e são capazes de passar rapidamente através da barreira do sangue no cérebro, facilitando uma terapia que é extremamente rápida e excepcionalmente potente. Os compostos preferidos também têm a vantagem de terem um registo provado de administração segura nas pessoas (isto é no tratamento de infecções a vírus ou no tratamento da doença de Parkinson mas não no caso da degeneração neurónica do Parkinsonismo). Por exemplo, a amantadina foi aprovada no tratamento de pessoas, pelo menos nos Estados Unidos.

Outros aspectos e vantagens tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada que se segue.

Descrevem-se, primeiramente e de uma forma breve os desenhos. A Fig. 1 representa a fórmula geral dos compostos uteis na prática da presente invenção. A Fig. 2 é uma representação esquemática de (a) amantadina, (b) rimantadina e (c) memantina. A Fig. 3 é uma representação gráfica que mostra que a memantina previne a neurotoxicidade, mediada pelo glutamato, das células ganglionares da retina.

As Figs. 4A-4B representam os resultados de experiências de fixação de emplastros que se descrevem a seguir. A presente invenção baseia-se na verificação de que o derivado da amantadina, a memantina (l-amino-3,5-dimetil-adamantina) reduz os danos dos neurónios (ver a seguir); e que

Μ essa redução dos danos se deve ao bloqueio da activação do canal operado pelo receptor de NMDA por meio dos aminoácidos excitadores (tais como os compostos relacionados com o glutamato) utilizando concentrações de memantina que se obtêm rapidamente nos doentes que tomam a droga (Wesemann et al.; J. Neural Transmission (Sup.) 16:143, 1980). Um elevado nivel de um ou mais compostos relacionados com o glutamato está associado a muitos distúrbios neurodegenerativos (como por exemplo os mencionados antes) e por isso os derivados de amantadina são úteis para o seu tratamento. Para além do próprio glutamato, os danos neurónicos podem resultar da estimulação do receptor de NMDA por outros aminoácidos excitadores ou compostos que sejam estruturalmente similares; são exemplos desses compostos o aspartato, o ácido homocistico, o ácido sulfinico-cisteina, o ácido cístico e o quinolinato. Os danos neurónicos podem também resultar da estimulação por meio de péptidos excitadores, como o glutamato de aspartilo-N-acetilo.

Outros compostos estruturalmente relacionados com a memantina são também compostos preferidos para serem usados na prática da presente invenção. Por "compostos estruturalmente relacionados" entende-se um composto constiuído por grupo amino comportando um anel tricíclico com 10 átomos de carbono. Esses compostos incluem, embora não se limitem a estes, a própria amantadina (hidrocloreto de 1-adamantadina) e a rimantadina (hidrocloreto de alfa-metil-l-adamantanometilamina).

Podem-se ensaiar compostos com interesse(isto é os compostos de fórmula geral indicada na Fig. 1 e que incluem compostos que comportam as substituições mencionadas para aumentar a potência) no que respeita à eficácia para reduzir os danos neurónicos, utilizando os ensaios descritos a seguir; uma quantidade efectiva causará uma diminuição na morte das células neurónicas. Os compostos preferidos são aqueles que produzem a maior

protecção dos neurónios contra os danos causados pelo receptor de NMDA, isto é, os danos resultantes da estimulação do receptor do NMDA por meio do glutamato (como se mostra a seguir) ou outros aminoácidos excitadores ou compostos estruturalmente similares ou da estimulação por meio de péptidos excitadores, tais como o glutamato de n-acetil-aspartilo.

Ensaio sobre a morte e a função das células neurónicas

Para ensaiar os derivados de amantadina no que respeita à sua capacidade de prevenir a neurotoxicidade, pode ensaiar-se a morte das células neurónicas, como se segue. Injecta-se, com anestesia geral, o corante granular azul fluorescente (Mackromolecular Chemin, Umstadt, Alemanha) sob a forma de uma suspensão salina numa concentração de aproximadamente 2% (p/v), na parte superior do pescoço de ratos Long Evans de 4 a 6 dias de idade (Laboratório de Charles River, Wilmington, MA) . Dois a 6 dias mais tarde, sacrificam-se os animais por decapitação e extirpação e removem-se rapidamente as retinas. Dissociam-se as retinas por meio de um tratamento ligeiro com enzima de papin e põe-se em cultura num meio essencial mínimo de Eagle (MEM, catálogo #1090, Gibco, Grand Island, NY) complementado com metilcelulose a 0,7% (p/v), glucose a 0,3% (p/v), glutamina 2mM, gentamicina Ιμιη/ml e soro de rato a 5% (v/v) , como descreveu Lipton e outros, J. Physiol.; 385:361; 1987. Colocam-se as células em lamelas de vidro de 75 mm2 e revestem-se com poli-L-lisina e colocam-se em pratos de cultura em tecido de 35 mm. Adiciona-se o derivado de adamantina candidato (por exemplo numa série de concentrações que variam de 1 nM a 1 mM) na presença ou na ausência de compostos que activam o complexo canal operado pelo receptor de NMDA, num meio com teor elevado de cálcio e baixo teor de magnésio (CaCl2 lOmM, Mg CI2 50 μΜ) para aumentar a 10 7% neurotoxicidade do receptor de NMDA nesta preparação (Hahn et al.; Proc. Natl. Acad. Sei.; EUA; 85:6556; 1988; Levy et al.;

Neurology 40:852; 1990; Levy et al.; Neurosci. Lett.; 110:291; 1990). Compara-se o grau de sobrevivência (nestas condições iónicas ou adicionando NMDA exógeno (200 μΜ) com o de um meio normal (CaCl2 1,8 mM, Mg CI2 0,8 mM), que minimiza os danos causados pelo receptor de NMDA nesta preparação (Hahn et al. da citação anterior). Deixam-se as preparações incubadas durante 16-24 horas a 37°C numa atmosfera de CO2 /ar nas proporções de 5%/95%. A capacidade das células ganglionares da retina para absorver e clivar o diacetato de fluoresceina em fluoresceina, usa-se como um índice da sua viabilidade tal como foi descrito em detalhe por Hahn et al. {Proc. Natl. Acad. Sei.; EUA; 8_5:6556; 1988) . A absorção do corante e a clivagem correlacionam-se bem com as propriedades electrofisiológicas normais ensaiadas com eléctrodos embutidos.

Para se realizar o ensaio de viabilidade, troca-se o meio de cultura das células por uma solução salina fisiológica contendo diacetato de fluoresceina a 0,0005% durante 15-45 s e depois lavam-se as células numa solução salina. Os neurónios das células ganglionares da retina que não contêm o corante de fluoresceina (e que portanto não estão vivos) muitas vezes tornam-se visíveis por meio de processos ópticos que por contraste das fases, quer por fluorescência UV, esta última devido à presença contínua do azul granular do corante marcador; outras células ganglionares da retina mortas, desintegram-se, deixando só resíduos de células. Em contraste, as células ganglionares da retina viáveis exibem não só uma cor azul na luz UV mas também uma fluorescência verde amarelada com filtros apropriados para a fluoresceina. Assim a utilização de dois conjuntos de filtros de fluorescência intermutável permite a determinação rápida das células ganglionares viáveis nas culturas. Muitas vezes essas células são encontradas como 11 neurónios solitários assim como neurónios entre outras células em pequenos grupos.

Pode-se ensaiar um derivado de amantadina para a sua utilização, usando qualquer tipo de células neurónicas do sistema nervoso central, desde que se consiga isolar a célula intacta por meio de técnicas convencionais. Para além das culturas da retina descritas antes, também se utilizou neurónios do hipocampo e corticais, mas pode-se utilizar qualquer neurónio que possua receptores de NMDA (por exemplo neurónios de outra zona do cérebro). Esses neurónios podem ser pré-natais ou post-natais e podem pertencer a pessoas, roedores ou outros mamíferos. Num dos exemplos, as culturas de retina podem produzir-se a partir de mamíferos post-natais; são bem caracterizadas e contêm um neurónio central, a célula ganglionar da retina que pode ser identificada inequivocamente com marcadores fluorescentes. Uma parte substancial das células ganglionares da retina na cultura exibe actividade sinática funcional e suportam muitos, se não todos, os receptores neuro-transmissores encontrados no sistema nervoso central intacto.

Segue-se um exemplo de um derivado de amantadina útil na prática da presente invenção e uma demonstração da sua eficácia na redução dos danos neurónicos. Este exemplo é dado a título ilustrativo da presente invenção e não deve ser considerado como limitativo da mesma. A memantina previne a neurotoxicidade mediada pelo receptor de

NMDA

Usando o ensaio descrito antes, ensaiou-se o derivado de amantadina, a memantina, no que respeita à sua capacidade para aumentar a sobrevivência das células ganglionares da retina tratadas com glutamato. Em oito experiências separadas, fizeram- se culturas de células ganglionares da retina quer em meios normais (por exemplo, MEM contendo CaCl2 1,8 mM, Mg CI2 0,8 mM), ou num meio rico em cálcio e pobre em magnésio (isto é, CaCl2 lOmM, Mg CI2 50 μΜ) . Este último meio é conhecido por melhorar a neurotoxicidade mediada pelo receptor de NMDA devido a um agonista do receptor de glutamato endógeno (Hahn et al.; Proc. Natl. Acad. Sei.; EUA; £5:6556; 1988; Levy et al.; Neurology £0:852; 1990; Levy et al.; Neurosci. Lett.; 110:291; 1990).

Diluiu-se a mistura de memantina com ácido clorídrico em água destilada duas vezes, filtrou-se e adicionou-se ao meio de cultura (até a uma concentração final compreendida entre ΙμΜ e 25 μΜ) . Incubaram-se as células da retina durante 16-20 horas a 37°C numa atmosfera húmida de CO2 a 5% e ar a 95%.

Como se mostra na Fig. 3, um agonista semelhante ao glutamato endógeno produz neurotoxicidade da célula da retina na presença de concentrações de cálcio extra celular elevadas (comparar na Fig. 3, colunas 1 e 2) . Para verificar que o agonista está relacionado com o glutamato, adicionou-se o enzima transaminase de glutamato-piruvato (TGP; 0,25 mg/ml; Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN); este enzima degrada especificamente o glutamato endógeno por meio da sua transaminação para um a-ceto-glutamato na presença de piruvato. Nestas condições, melhorou-se a sobrevivência das células ganglionares da retina; isto é, sobreviveu um número aproximadamente igual de neurónios num meio com teor elevado de cálcio, baixo teor de magnésio, mais TGP e piruvato (2 mM) aos que sobreviveram nas culturas de controlo em meio normal. Esta verificação mostra que a toxina endógena era o próprio glutamato. A análise HPLC verificou a diminuição do glutamato pelo TGP. O derivado de amantadina , a memantina, previne a morte das células ganglionares da retina causada pela toxina relacionada com o glutamato endógeno numa forma que depende da dose (Fig. 13

3) . 0 aumento da sobrevivência neurónica em memantina a 6μΜ (fig. 3, coluna 4) atingiu significdo estatístico comparado com o controlo (Fig. 3, coluna 1) . Todas as experiências descritas na Fig. 3 envolvendo tratamento com memantina foram repetidas em triplicado e normalizadas com culturas de controlo (isto é, meio normal sem memantina). Os valores representam meio + erro normalizado do meio (ENM). Utilizou-se a análise da variância para o teste de significância; depois das análises fez-se um ensaio de Scheffé para comparação múltipla dos meios (Hahn et al.; 1988, supra).

Estes dados indicam que a memantina bloqueia a morte das células neurónicas mediada pela estimulação excessiva do receptor de NMDA. Sem que isto esteja ligado a qualquer teoria relacionada com o mecanismo pelo qual a memantina exerce o seu efeito neuroprotector, é possível que a memantina bloqueie o aumento induzido de glutamato no Ca2+ no canal iónico associado ao receptor de NMDA. Por analogia com o MK-801 (dizocilpina; um antagonista específico do NMDA), o modo de acção da memantina pode ser uma inibição não competitiva do influxo de Ca2+ por meio do bloqueio dos canais operados pelo receptor de NMDA. Se assim for, a inibição por meio da memantina está condicionada a uma activação prévia do receptor pelo agonista. Isto tem consequências importantes a nivel terapêutico. A activação normal do receptor de NMDA (por exemplo, a que envolve a potenciação a longo prazo, de uma forma de aprendizagem e memória) pode não ser afectada pelos nossos compostos, enquanto os danos neurónicos resultantes de niveis crescentes de glutamato ou de outros compostos excitadores podem ser efectivamente bloqueados (Karschin et al.; J. Neurosci.; (3:2895, 1988; Levy e Lipton; Neurology £0:852; 1990). Submeteram-se os análogos da memantina a ensaios clínicos nos Estados Unidos e na

União Soviética, usando doses terapêuticas para a terapia da gripe A. Esses estudos revelaram apenas efeitos secundários 14 7% limitados e reversíveis no sistema nervoso central (Tominack et al.; Infect. Dis. Clin. N. Am.; 1: (2) : 4 5 9; 1987; Clover et al.;

Am. J. Dis. Child. 140:706; 1986; Hall et al.; Pediatrics 80(2):275; 1987; Zlydnikov et al.; Reviews of Infect Dis.; 3 (3) : 4 0 8; 1981; Dolin et al.; New Eng. J. Med. 302:580; 1982). Há um caso relatado de perda visual num doente adulto que tinha sido tratado, por sintomas de Parkinson, com amantadina durante várias semanas. Contudo, a acuidade visual voltou completamente depois de se descontinuar a droga (Perlman et al.; JAMA 237:1200; 1977) .

Quando se seleccionam outros bloqueadores complexos do canal de NMDA, é importante compreender as implicações dos dados sobre a memantina mencionados antes. Em primeiro lugar, é útil seleccionar um inibidor de NMDA que não seja competitivo, ou seja, um inibidor cuja actividade inibidora seja contingente na activação prévia do receptor por um agonista do receptor. Em segundo lugar, é útil seleccionar inibidores de NMDA que operam rapidamente e que sejam rapidamente reversíveis após cessar a administração da droga. Esta estratégia maximiza a função SNC normal e reduz os efeitos secundários.

Como se mostra nos exemplos seguintes, a cinética da memantina na resposta ao bloqueamento/desbloqueamento mediado pelo receptor de NMDA é relativamente rápida.

A Fig. 4 mostra as evidências, para um canal aberto, do bloqueio pela corrente em todas as células de que retirou o NMDA por meio da memantina (MEM), em células ganglionares da retina de ratos. A Fig. 4A mostra um efeito de bloqueio de memantina 12 μΜ numa corrente induzida por NMDA 200 μΜ a potenciais que variam entre -50 e +50 mV nos registos de todas as células. A Fig. 4B mostra a perda de efeito da memantina 12 μΜ na corrente induzida por NMDA 200 μΜ quando é administrada sozinha a -60 mV 7Sd (esquerda). Quando se aplica a memantina 12 μΜ em conjunto com o agonista, não afecta a corrente provocada pelo cainato (CA) 50 μΜ ou pelo quisqualato (QUIS) 5 μΜ, enquanto que a resposta ao NMDA 200 μΜ foi inibida em cerca de 90% a -60 mV (n = 17) (direita). Utilizou-se um sistema de aplicação rápida para administrar as drogas e usou-se um método de lavagem rápida nas experiências mostradas nas Figs. 4A e 4B.

As experiências anteriores realizaram-se da seguinte forma:

Cultura das células

Para a marcação das células ganglionares da retina, a sua dissociação e cultura, utilizaram-se técnicas que já foram descritas noutros documentos (Leifer et al.; Science; 224:303-306; 1984). Em resumo, fez-se a marcação retrógrada de células ganglionares da retina de ratos Long-Evans de 4-6 dias de idade com azul granular por injecção na parte superior do pescoço e fez-se o transporte retrógrado. Dois a seis dias mais tarde, mataram-se os animais por decapitação. Depois da extirpação, dissociaram-se as retinas com um tratamento médio com enzima de papain. Colocaram-se as células em lamelas de vidro, revestiram-se com poli-L-lisina em pratos de cultura com tecido de 35 mm. O meio de crescimento utilizado foi o meio essencial mínimo de Eagle complementado com metilcelulose a 0 ,7% (p/v), glucose a 0, 3% (p/v), glutamina 2 mM, soro de rato a 5% (v/v) e gentamicina 1 μg/ml. Identificaram-se as células ganglionares da retina pela presença do corante azul granular transportado retrogradamente.

Electrofisioloqia de fixação de emplastros

Trataram-se os registos dos canais individualizados e do conjunto das células ganglionares da retina dos ratos tal como 16 está descrito noutros documentos (Hamill et al.; 1981 Lipton e Tauck; 1987) . Fundiram-se continuamente e em profundidade os neurónios numa câmara a 27-2 9 °C com uma solução num banho composta por (em mM) NaCl, 137,6; KC1, 5,8; CaCl2 , 2,5; HEPES, 5; glucose, 22,2; com vermelho de fenol, a 0,001% (v/v); glicina, ΐμΜ; pH de 7,2; e sem adição de magnésio. Encheram-se as pipetas com uma solução intracelular contendo (em mM) CsCl, 120; cloreto de tetraetilamónio, 20: HEPES, 10; EGTA, 2,25; CaCl2 , 1; e MgCl2 , 2; e, algumas vezes com Mg-ATP 3 mM para minimizar o enfraquecimento em registos prolongados (pH 7,2). Prepararam-se os agonistas e os antagonistas num banho contendo tetrodotoxina (TTX) 1 μΜ e aplicaram-se através de um suporte de pipetas pneumáticas colocadas a 20-50 μπι dos neurónios. Conseguiam-se variações rápidas nas soluções, em 50-100 mseg, movendo o suporte das pipetas com as pontas constantemente em movimento, relativamente à célula, com um condutor micromanipulador. Utilizou-se uma pipeta de controle contendo a solução do banho e TTX 1 μΜ para lavar rapidamente a corrente induzida pelo NMDA.

Terapia

Para prevenir os danos nos neurónios, pode-se administrar adamantina e os seus derivados por uma de entre um certo número de vias numa quantidade suficiente para bloquear o efeito do glutamato no receptor de NMDA. Pode incluir-se o derivado de adamantina numa preparação farmacêutica, utilizando um portador farmacêutico (por exemplo uma solução salina fisiológica); a formulação exacta da mistura terapêutica depende da via de administração. De preferência administra-se o composto oralmente ou intravenosamente, mas também pode ser administrado intratecalmente ou intravitrealmente. Os compostos preferidos, amantadina, memantina e rimantadina administram-se a 100-500 μg/dia, 5-80 mg/dia e 50-300 mg/dia respectivamente, em doses 17 divididas. Qualquer outro composto que tenha sido determinado ser um agente neuroprotector efectivo através dos ensaios descritos na presente invenção, administram-se oralmente, intravenosamente, intratecalicamente ou intravitrealicamente a 100-500 pg/dia em doses divididas. Pode-se repetir o tratamento se necessário para prevenir ou aliviar os problemas neurológicos. Podem-se utilizar os compostos para proteger contra a neurodegeneração progressiva lenta associada a um certo número de distúrbios descritos antes neste pedido de patente de invenção.

Os medicamentos produzidos de acordo com a presente invenção podem ser úteis na redução de danos neurológicos em qualquer mamífero com receptores de NMDA. O tratamento de neuropatias periféricas dolorosas em seres humanos é a utilização preferida; mas a presente invenção também se pode aplicar com sucesso em fins veterinários.

Lisboa, 21 de Agosto de 2001 /

O Ag#>te Oficial da Propriedade Industrial

JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.l. Rua do Salitre, 195, r/c-Drt. 1269-063 LISBOA

Claims

1 1

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um composto de fórmula geral

na qual o símbolo Ri representa um grupo NH2 ou um grupo de fórmula geral Xi - c - nh2 X2 na qual os símbolos Xi e X2 representam, independentemente um do outro, um átomo de hidrogénio ou um grupo alifático de. cadeia curta contendo entre 1-5 átomos de carbono, os símbolos R2-R17 representam, independentemente uns dos outros, átomos de hidrogénio ou um grupo alifático de cadeia curta contendo entre 1 e 5 átomos de carbono, e os grupo representados pelos símbolos e Rio podem também representar (de forma independente) um átomo de halogéneo ou um grupo acilo; ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista fisiológico; na produção de um medicamento para ser usado no tratamento da neuropatia periférica dolorosa em mamíferos.

2 . Utilização, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto referido é amantadina ou memantina.

3 . Utilização, de acordo com a reivindicação 1, em que o símbolo Rá representa um grupo metilo.

4. Utilização, de acordo com as reivindicações 1 ou 3, em que o símbolo Rio representa um grupo metilo.

5. Utilização, de acordo com as reivindicações 1, 3 e 4 em que os símbolos Xi e X2 representam, um átomo de hidrogénio e um grupo metilo, respectivamente ou em que os símbolos Xi e X2 representam, um grupo metilo e um átomo de hidrogénio, respectivamente. Lisboa, 21 de Agosto de 2001

O Agdftte Oficial da Propriedade Industrial

JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.I. Rua do Salitre, 19S, r/c-DrL 1269-063 LISBOA