PT656000E

PT656000E - Processo para a conversao de taxanos em bacatina iii e 10-desacetilbacatina iii

Info

Publication number: PT656000E
Application number: PT93920109T
Authority: PT
Inventors: David R Carver; Timothy R Prout; Hernita A Ewald; Donia L Henderson
Original assignee: Napro Biotherapeutics Inc
Priority date: 1992-08-14
Filing date: 1993-08-16
Publication date: 2000-07-31
Also published as: DK0656000T3; US5256801A; CA2142354C; WO1994004519A1; EP0656000B1; NZ255790A; DE69327789D1; ES2142877T3; ATE189454T1; EP0656000A4; AU5015693A; DE69327789T2; JPH08503452A; GR3033069T3; KR0177588B1; EP0656000A1; KR950702975A; CA2142354A1; JP2958119B2

Description

DESCRICÂO “Processo para a conversão de taxanos em Bacatina III e 10-desacetilbacatina III”

Campo da invenção A presente invenção refere-se a um processo para converter misturas de taxano parcialmente purificadas em bacatina III ou 10-desacetilbacatina III. Especificamente, a presente invenção refere-se a um processo usando sais redutores de boro-hidreto, na presença de ácidos de Lewis, para converter 10-desacetiltaxol, cefalomanina, taxol e outros taxanos em bacatinas relacionadas.

Antecedentes da invenção O taxol (1)

3 OCOCçHj

OCOCHj 1 ,9 OH é um diterpenóide encontrado no teixo ocidental ÍTaxus brevifolial. O taxol demonstrou excelente actividade anti-cancerosa em ensaios clínicos. No entanto, o teste exaustivo do taxol tem sido difícil porque é extraído de uma vegetação natural cujo fornecimento é reduzido. Para evitar a extinção da planta que contém taxanos, tem sido tentada a síntese total de taxol, mas até aqui estas tentativas não têm sido bem sucedidas. No entanto, foram feitos avanços significativos na semi-síntese de taxol a partir de outros taxanos de ocorrência natural, tais como a bacatina III e a 10-desacetilbacatina III. Foram referidos pelo menos três métodos diferentes para a conversão de bacatina III e 10-desacetilbacatina III em taxol. 2 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ

A estrutura da Bacatina III

tem a estrutura diterpenóide básica do taxol sem a cadeia lateral na posição C-13 e com R-, = COCH3. A estrutura da 10-desacetilbacatina III é similar à estrutura acima, com a excepção de que na posição C-10 R-, = H. Assim, devido à estrutura diterpeno básica, a bacatina III e as outras bacatinas relacionadas, tais como a 10-desacetilbacatina III são materiais de partida importantes na semi-síntese de taxol. Espera-se que a importância da bacatina III e da 10-desacetilbacatina III aumente à medida que se efectuam mais testes sobre o cancro, com o taxol. Presentemente, parece já que os compostos do tipo taxol, solúveis em água, com cadeias laterais em C-13 ligeiramente modificadas, podem ser mais desejáveis como drogas para o cancro do que 0 taxol, menos solúvel, de ocorrência natural. Isto aumenta a necessidade não resolvida, de bacatina III e 10-desacetilbacatina III como material de partida para a síntese de taxol e compostos do tipo taxol, de segunda e terceira geração. A fonte actual de bacatina III e de 10-desacetilbacatina III é uma extracção a partir de vegetação natural contendo taxanos tais como o Teixo Inglês (Taxus baççatta). O produto fornecido por estas matérias-primas é a bacatina III. A conversão de 10-desacetiltaxol e de outros taxanos em 10-desacetilbacatina III é um método viável para aumentar 0 fornecimento de 10-desacetilbacatina III.

Miller relatou que a cefalomanina foi convertida, com um rendimento de 19%, em bacatina III, por metanólise na presença de bicarbonato de sódio. Veja-se Journal of Oraanic Chemistrv. Volume 46, pg 1469-1474 (1984). A preparação de Bacatina III com um rendimento de 97% a partir de taxol puro, foi relatada por Magris et ai. Veja-se, “Modified taxols, 3. Preparation and Acylation of Bacatin ΙΙΓ’, 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 3

Journal of Oraanic Chemistrv. Vol. 51, pg 3239-3242, 1986. A preparação de bacatina III de acordo com o processo de Magris et ai, foi efectuada como se segue: deixou-se reagir uma amostra de 100 mg de taxol puro em CH2CI2 seco, (2,0 ml) com Bu4NBH4 (50 mg) durante uma hora e a reacção foi terminada com 0,5 ml de AcOH. A mistura foi agitada durante 10 minutos, evaporada e o produto foi isolado por TLC preparativa. Este processo foi relatado como dando um rendimento de 97% de bacatina III a partir de taxol puro. O artigo de Magris et ai indicava também que quando esta mesma reacção foi levada a cabo com um material de partida constituído por uma mistura de taxol não purificado/cefalomanina, em vez de taxol puro, o resultado foi um rendimento reduzido em bacatina III. A conversão com um rendimento elevado de taxol puro em bacatina III é extremamente útil no laboratório, quando o taxol puro está disponível. No entanto, existe uma necessidade de um processo com rendimento elevado, para a conversão de misturas brutas de taxano (contendo taxol/cefalomanina e outros taxanos) em bacatina III e 10-desacetilbacatina III.

Na extracção comercial de taxol a partir de material da árvore teixo, geram-se quantidades significativas de taxanos, incluindo taxol, 10-desacetiltaxol e cefalomanina. Estas misturas contêm taxanos úteis (que são rejeitados como produtos secundários durante a purificação do taxol). O processo de Magris et ai não demonstrou que resulte um rendimento particularmente elevado, quando misturas parcialmente purificadas, contendo percentagens baixas de taxol, 10-desacetiltaxol e cefalomanina, são convertidas em bacatina III ou 10-desacetilbacatina III.

No processamento em larga escala de taxol para utilização comercial, o custo associado a atingir o rendimento de Magris et ai não é economicamente exequível. O processo de Magris et ai utiliza boro-hidreto de tetrabutilamónio, um sal redutor dispendioso. Além disso, este procedimento é levado a cabo a 0°C o que adiciona custos de refrigeração ao produto final. A maior parte dos processos de extracção de taxano resulta em subprodutos contendo algum taxol, 10-desacetiltaxol, cefalomanina e quantidades significativas de outras substâncias. Assim, persiste uma necessidade de um processo não dispendioso de rendimento elevado, para a conversão destas misturas parcialmente purificadas de taxanos, incluindo mas não se limitando a taxol, 10-desacetiltaxol e/ou cefalomanina em bacatina III e/ou 10-desacetilbacatina III.

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Sumário da invenção

Um objectivo da presente invenção é a conversão de subprodutos orgânicos parcialmente purificados, do processo de extracção do taxano, em 10-desacetilbacatina III.

Um objectivo da presente invenção é a conversão de subprodutos orgânicos parcialmente purificados, do processo de extracção do taxano, em Bacatina III.

Outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método para a conversão de taxanos seleccionados em Bacatina III.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método simples, com rendimento elevado, para a preparação de Bacatina III à temperatura ambiente.

Um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método simples para a preparação de 10-desacetilbacatina III à temperatura ambiente.

Ainda outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método não dispendioso para a conversão de uma mistura parcialmente purificada de taxol, cefalomanina, 10-desacetiltaxol e outras substâncias em Bacatina III ou 10-desacetilbacatina III.

Esta invenção proporciona um processo para a preparação de Bacatina III e/ou 10-desacetilbacatina III, por contacto de uma mistura contendo, pelo menos, um composto de taxano possuindo uma ligação éster na posição C-13, com pelo menos um sal boro-hidreto redutor num solvente reaccional na presença de um ácido de Lewis. Se se pretender a Bacatina III, então, se a mistura contiver 15%-50% de taxol em peso, o solvente reaccional preferido é o tetra-hidrofurano (um solvente doador, apoiar). Quando a mistura contém 50% de taxol em peso, o solvente reaccional preferido é o diclorometano. Se a mistura contiver menos do que 15% de taxol, em peso, o solvente reaccional é seleccionado de entre o grupo de glima, diglima, triglima ou, em alternativa, THF. O ácido de Lewis preferido é um halogeneto de metal, tal como cloreto de estanho(ll) ou o cloreto de cobalto(ll).

Esta invenção proporciona ainda um processo para a preparação de Bacatina III, por contacto de uma mistura contendo pelo menos um constituinte

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 5 composto de taxano, possuindo uma ligação éster na posição C-13, com um sal boro-hidreto redutor, usando um hidrocarboneto aromático, preferivelmente tolueno, como solvente. Além disso, esta invenção proporciona um processo para a preparação de Bacatina III, por contacto de uma mistura contendo taxol e, pelo menos, um outro composto de taxano possuindo uma ligação éster na posição ΟΙ 3 com um sal boro-hidreto redutor num solvente reaccional em que o taxol na mistura não é convertido em Bacatina III.

Como notado acima, a invenção proporciona um processo para a preparação não apenas de Bacatina III, mas também de 10-desacetilbacatina III por contacto de uma mistura contendo, pelo menos, um composto de taxano possuindo uma ligação éster na posição C-13 com, pelo menos, um sal boro-hidreto redutor num solvente reaccional, na presença de um ácido de Lewis. O solvente reaccional preferido para a produção de 10-desacetilbacatina III é o tetra-hidrofurano (um solvente doador, apoiar). A triglima converteu aproximadamente um terço do 10-desacetiltaxol em 10-desacetilbacatina III. A glima, na presença de cloreto de cobalto, deu um rendimento de 21% de 10-desacetilbacatina III. O cloreto de metileno na presença de cloreto de estanho resultou num rendimento de 24% de 10-desacetilbacatina III. Os ácidos de Lewis preferidos são os halogenetos de metal tais como o cloreto de estanho(ll) ou o cloreto de cobalto(ll).

Esta invenção proporciona ainda um processo para a preparação de 10-desacetilbacatina III, por contacto de uma mistura contendo, pelo menos, um constituinte de composto de taxano possuindo uma ligação éster na posição C-13, num solvente reaccional de triglima com um sal boro-hidreto redutor. Os membros da família da glima incluindo CH3(OCH2CH2)xOCH3 em que x é igual a inteiros de 1-5, podem ser substituídos na triglima. A glima e a diglima deverão converter menos material em 10-desacetilbacatina III do que a triglima.

Descrição da presente invenção A presente invenção refere-se a processos de rendimento elevado para a conversão de misturas, parcialmente purificadas, de taxanos contendo taxol, 10-desacetiltaxol e cefalomanina em Bacatina III e 10-desacetilbacatina III. O artigo de Magris et al., referia que o seu processo tinha sido levado a cabo sobre uma mistura de taxano parcialmente purificada, contendo taxol e cefalomanina mas, no entanto, o rendimento em Bacatina III a partir desta mistura foi apenas relatado como “bom”. O artigo de Magris et al. não relatou qualquer tentativa para utilizar o 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 6

processo de Magris et ai, numa mistura de taxano contendo 10-desacetiltaxol. Portanto, como linha de base para comparação da presente invenção, o processo de Magris et ai, foi efectuado sobre duas misturas separadas de taxanos. Um processo foi efectuado para recuperar Bacatina III, o segundo foi efectuado para recuperar 10-desacetilbacatina III. O primeiro processo de Magris et ai, para Bacatina III foi levado a cabo sobre uma mistura de taxanos que continha um nível elevado de taxol. Nesta experiência, o processo de Magris et ai, foi efectuado a 0°C sobre 51 mg de uma mistura de taxano seca, parcialmente purificada, contendo 47% de taxol e 1,0% de cefalomanina (como determinada por HPLC). O procedimento foi efectuado durante uma hora sobre este material em diclorometano, com boro-hidreto de tetrabutilamónio como sal redutor. O rendimento de Bacatina III a partir da mistura foi de 66,0%. Este é um rendimento significativo, apesar do rendimento ser substancialmente inferior ao rendimento de 97% de Bacatina III a partir de taxol puro. Este rendimento de 66,0% é portanto a linha de base com a qual os exemplos seguintes de Bacatina III podem ser comparados. O segundo processo de Magris et ai para 10-desacetilbacatina III foi levado a cabo sobre uma mistura de taxanos que continha 10-desacetiltaxol em conjunto com taxol, cefalomanina, bacatina III e 10-desacetilbacatina III. Nesta experiência, o processo de Magris et ai foi efectuado a 0°C sobre 51 mg de uma mistura de taxano seca, parcialmente purificada, contendo 3,5% de taxol, 2,3% de cefalomanina, 1,73% de 10-desacetiltaxol e 5,74% de 10-desacetilbacatina III (tal como determinado por HPLC). O procedimento foi seguido durante dezasseis horas sobre este material em diclorometano, com boro-hidreto de tetrabutilamónio como sal redutor. O rendimento de 10-desacetilbacatina III a partir desta mistura foi de -375,00%. O rendimento negativo indica não apenas a decomposição de 1,21 mg do 10-desacetiltaxol, como também a decomposição de 3 mg de 10-desacetilbacatina III no material de partida. Isto é uma perda significativa de material. Este rendimento de -375,00% é portanto a linha de base, com a qual os exemplos seguintes de 10-desacetilbacatina III podem ser comparados. A concretização preferida da presente invenção inclui o contacto de uma mistura contendo alguns taxanos com um sal boro-hidreto redutor, num solvente reaccional na presença de um ácido de Lewis, em menos do que, e até, quantidades estequiométricas. No processo preferido é empregue boro-hidreto de sódio, devido ao custo mais elevado associado à utilização de boro-hidreto de tetrabutilamónio. Os ácidos de Lewis preferidos são compostos tais como

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 7 halogenetos de metal. Ο teste para determinar a viabilidade de um ácido de Lewis é um teste de dois passos. Primeiro, o ácido de Lewis deve-se ligar covalentemente com nucleófilos fortes e, em segundo lugar, o ácido de Lewis não deve reagir com o boro-hidreto para formar boranos. O cloreto de magnésio (que não se espera que se ligue covalentemente com nucleófilos fortes) foi testado e não aumentou o rendimento de 10-desacetilbacatina III ou Bacatina III. Ácidos de Lewis mais covalentes, tais como SnCI2 e CoCI2 aumentaram os rendimentos em Bacatina III e 10-desacetilbacatina lll significativamente acima dos rendimentos da linha de base do procedimento de Magris et al.

Os tipos de sais boro-hidreto redutores, solventes reaccionais e ácidos de Lewis, utilizados nas concretizações alternativas da presente invenção, foram seleccionados para resultar num processo comercialmente viável de conversão de certos materiais em 10-desacetilbacatina lll enquanto outros taxanos são convertidos em Bacatina lll.

Os processos da presente invenção originam uma maior percentagem de 10-desacetilbacatina lll e de Bacatina lll, a partir de uma mistura de taxanos à temperatura ambiente, do que sucede com o processo de linha de base de Magris et al., a 0°C. Os processos da presente invenção empregam diferentes solventes de reacção e diferentes ácidos de Lewis para aumentar o rendimento de Bacatina lll e 10-desacetilbacatina lll a partir de um material de partida formado por taxanos parcialmente purificados.

Os solventes de reacção utilizados nas concretizações da presente invenção para a produção de Bacatina lll são seleccionados com base nos níveis de taxol no material de partida. A glima (CH3OCH2CH2OCH3) opera ligeiramente melhor em materiais de partida com menos do que 15% de taxol; apesar de o tetra-hidrofurano (THF) também ser útil nesta gama. O THF como solvente, é preferido em materiais de partida com 15% a 45-50% de pureza de taxol. Nos materiais de partida possuindo uma pureza de taxol de 45%-100%, o diclorometano como solvente reaccional origina Bacatina lll, em grandes quantidades. Apesar dos problemas de solubilidade, o tolueno como solvente reaccional resultou num rendimento de Bacatina lll substancialmente superior ao do diclorometano, em materiais de partida possuindo a mesma pureza de taxol de 45%-100%.

Na primeira concretização da presente invenção, preparou-se um rendimento de 76,7% de Bacatina lll, misturando o material de partida com o

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 8 solvente reaccional tolueno e o sal boro-hidreto redutor, boro-hidreto de tetrabutilamónio. O material de partida continha 47% de taxol, 1,0% de cefalomanina e outras substâncias. A Bacatina III foi convertida com um rendimento de 76,7% a 0°C, após um tempo de reacção de uma semana. Este rendimento de Bacatina III foi obtido apesar dos problemas de solubilidade, antecipados e concretizados, associados à utilização de tolueno nesta reacção.

Na segunda concretização da presente invenção, a Bacatina III foi preparada contactando boro-hidreto de sódio em diclorometano com um material de partida possuindo 15,0% de taxol e 3,2% de cefalomanina a 0°C. Após dezasseis horas de reacção, a Bacatina III foi produzida com um rendimento de 85,8%, por análise por HPLC. A vantagem de se utilizar boro-hidreto de sódio relativamente ao boro-hidreto de tetrabutilamónio é principalmente a despesa. O primeiro custa cerca de $0,11 por grama e o segundo custa $1,00 por grama. Apesar de a referência de Magris et al. descrever a utilização de boro-hidreto de sódio para a conversão de um taxol puro em Bacatina III, este sal boro-hidreto redutor foi utilizado com propanol e resultou na epimerização indesejada na posição C-7. Magris et al. abandonaram o boro-hidreto de sódio e utilizaram o boro-hidreto de tetrabutilamónio mais dispendioso, em associação com diclorometano, para obter o rendimento de 97% de Bacatina III a partir de taxol puro.

Na terceira concretização, a adição de 10% de cloreto de estanho (com base no taxol no material de partida) a boro-hidreto de tetrabutilamónio em diclorometano, a 0°C durante uma hora, resultou num rendimento de 121,7% de Bacatina III. Parece então que outro material que não só a cefalomanina e o taxol no material de partida, foi cindido para produzir Bacatina III. Aventa-se a hipótese de que certos compostos de taxol possam estar ligados a açucares e outro material biológico e de que estes possam ter sido convertidos em Bacatina III, neste processo.

Na quarta concretização da presente invenção, preparou-se um rendimento de 72% de Bacatina III, contactando um material de partida constituído por uma mistura de taxano contendo 3,5% de taxol e 2,3% de cefalomanina, utilizando o solvente reaccional glima, com peletes de boro-hidreto de sódio/cloreto de cobalto, que contêm 7% de peletes de cloreto de cobalto. A reacção foi conduzida à temperatura ambiente durante cento e quarenta e quatro horas.

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Na quinta concretização alternativa preferida da presente invenção, uma reacção similar, usando material de partida com a mesma percentagem de taxano, em glima com boro-hidreto de sódio na presença de cloreto de estanho (0,1%), resultou num rendimento de Bacatina III de 66%, após setenta e duas horas, à temperatura ambiente.

Numa sexta concretização alternativa da presente invenção, obteve-se um rendimento de 71% de Bacatina III, a partir do mesmo material de partida em THF com boro-hidreto de sódio, na presença de (0,1%) de cloreto de estanho (com base no teor total de taxol no material de partida). A sétima concretização resultou do processo de teste de vários solventes de reacção com o sal redutor boro-hidreto de sódio. Obteve-se um resultado surpreendente quando se utilizou etanol e a reacção foi conduzida a -30°C. O sal boro-hidreto redutor cinde selectivamente a cefalomanina e alguns outros taxanos, mas não o taxol. O rendimento em Bacatina III desta reacção foi de 58% e 100% do taxol permanecia após vinte e quatro horas. A capacidade da reacção para cindir selectivamente o material de partida em Bacatina III, na presença de uma mistura de taxanos, tem uma utilidade significativa em processos de purificação e de extracção de taxano.

Na oitava concretização da presente invenção, preparou-se um rendimento de 52% de 10-desacetilbacatina III, misturando o material de partida com o solvente reaccional (THF) e o sal boro-hidreto redutor boro-hidreto de sódio. O material de partida continha 3,5% de taxol, 2,3% de cefalomanina, 0,69% de 10-desacetilbacatina III, 1,3% de 10-desacetiltaxol e outras substâncias. Obteve-se um rendimento de 52% de 10-desacetilbacatina III à temperatura ambiente, após um tempo de reacção de 72 horas. Este mesmo processo converteu uma grande percentagem de taxol em Bacatina III.

Na nona concretização da presente invenção, preparou-se 10-desacetilbacatina III contactando um material de partida possuindo 0,69% de 10-desacetilbacatina III e 1,31% de 10-desacetiltaxol, em diclorometano e 0,1% de SnCI2, com boro-hidreto de sódio à temperatura ambiente. Após 120 horas de reacção, a 10-desacetilbacatina III foi produzida com um rendimento de 24%, por análise por HPLC.

Na décima concretização, adicionou-se 7% de cloreto de cobalto (com base

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no taxol no material de partida) ao solvente de reacção, CH3OCH2CH2OCH3 (glima) e contactou-se com boro-hidreto de sódio à temperatura ambiente durante 144 horas. Este processo resultou num rendimento de 21% de 10-desacetilbacatina III. Obteve-se também um rendimento positivo baixo de 10-desacetilbacatina III, numa experiência similar usando 0,1% de SnCI2.

Na décima-primeira concretização preferida da presente invenção, preparou-se 10-desacetilbacatina III, com um rendimento de 37%, contactando um material de partida constituído por uma mistura de taxano contendo 3,5% de taxol, 2,3% de cefalomanina, 0,69% de 10-desacetilbacatina III e 1,3% de desacetiltaxol no solvente reaccional (triglima) com boro-hidreto de sódio. A reacção foi conduzida à temperatura ambiente durante cento e quarenta e quatro horas. Esta reacção não requereu a adição de um ácido de Lewis para dar uma conversão positiva de 10-desacetiltaxol em 10-desacetilbacatina III. De facto, apenas 29% do 10-desacetiltaxol foi utilizado e houve um aumento de 37% na 10-desacetilbacatina III. Parece que outro material que não apenas o 10-desacetiltaxol, é cindido para produzir 10-desacetilbacatina III. A identidade específica destes outros compostos que estão a ser convertidos ainda não está estabelecida.

Tal como notado no artigo de Magris et al., os boro-hidretos utilizados na formação de bacatina III crê-se serem redutores de ésteres, por cedência de um ião hidreto ao grupo carbonilo do éster. Esta referência não apresenta uma solução para a diminuição da capacidade das reacções para cindir o éster quando o sal boro-hidreto redutor reactivo (especialmente se for empregue boro-hidreto de tetrabutilamónio) esteve em contacto com compostos práticos. Este é um problema substancial uma vez que uma variedade de compostos práticos, tais como água e álcoois, podem ser encontrados em materiais de partida de taxano parcialmente purificado. Algumas destas substâncias práticas são de ocorrência natural no material da planta (Taxus) e algumas são adicionadas nos vários passos de extracção e purificação. Adicionalmente, podem estar presentes iões básicos hidróxido e alcóxido. Estes materiais causam epimerização e cisão indesejadas e podem resultar em rendimentos substancialmente diminuídos de Bacatina III e, da mesma forma, parecem resultar na decomposição tanto de 10-desacetilbacatina III como de 10-desacetiltaxol.

Para contrariar os efeitos destes compostos indesejáveis no material de partida, as concretizações preferidas da presente invenção incluem a adição de i·. i·.

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EP 0 656 000 / PT ácidos de Lewis à reacção em menos do que, e até, quantidades estequiométricas. Os halogenetos de metal SnCI2 e CoCI2 provaram ser ácidos de Lewis especialmente úteis neste processo. Estes halogenetos de metal na presença de aniões de oxigénio reagem rapidamente para formar óxidos de metal com a libertação subsequente de aniões Cl' não reactivos com taxano. Assim, muitos componentes indesejáveis do material de partida são efectivamente neutralizados, permitindo ao boro-hidreto reagir mais especificamente com taxanos na mistura.

Os exemplos não limitativos que se seguem proporcionam processos específicos para a preparação de Bacatina III e de 10-desacetilbacatina III a partir de uma mistura de taxano purificado ou de amostras de taxano purificado. Todos os termos científicos e técnicos têm os significados compreensíveis para um perito na arte. A HPLC nos exemplos que se seguem foi efectuada num equipamento constituído por uma bomba ternária Spectra Physics 8800, um injector manual Rheodyne Spectra Physics SP8780 (amostrador automático), um integrador Chromjet SP4400 e um Spectra-100 (detector de comprimento de onda variável). Os espectros de 1H-RMN foram obtidos usando um espectrómetro Varian VXR 300S MHz. A análise elementar foi efectuada por Huffman Laboratories (Golden, Colorado). Vários métodos de purificação de Bacatina III e de 10-desacetilbacatina III produzidos pela presente invenção são conhecidos e compreensíveis para os peritos na arte e o método de purificação apresentado nos exemplos é listado como forma de exemplo e não se pretende que limite a invenção.

Exemplo I (Arte Anterioh Tabela la

As condições de reacção no Exemplo I são como segue:

Solvente reaccional Temperatura de reacção (graus C) Tempo de reacção Sal redutor Reagentes adicionais ch2ci2 0 1 hora boro-hidreto de tetrabutilamónio nenhum

Agitaram-se 51 mg de taxanos (material de partida) possuindo 47,04% de taxol e 1,04% de cefalomanina, em 2,0 ml de diclorometano, num balão de fundo redondo de 25 ml, sob uma atmosfera de azoto gasoso. Após se arrefecer a solução para 0°C num banho de gelo, adicionaram-se 25 mg de boro-hidreto de tetrabutilamónio. Deixou-se a mistura com agitação durante uma hora e a reacção

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 12 foi terminada por adição de 0,5 mi de AcOH. A solução orgânica contendo Bacatina III foi vertida em 25 ml/g de ácido acético a 50% em volume/água. A solução orgânica foi repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível. Neste caso foi usado diclorometano. A fase orgânica foi recolhida e seca sobre sulfato de sódio anidro. A fase orgânica foi removida in vacuo para formar um óleo viscoso. O resíduo foi purificado por cromatografia instantânea (“flash”) sobre sílica gel usando pressão de azoto, eluíndo com diclorometano/5% metanol. As fracções seleccionadas foram evaporadas até à secura sob pressão reduzida (20 mm Hg). O material orgânico seco foi recristalizado a partir de uma solução a 15% de metanol/H20 (80/20), para produzir 11,13 mg de Bacatina III com um rendimento de 66,03%

Tabela Ib

Material de partida (mg) 51,000 % de taxol 47,040 peso de taxol (mg) 23,990 % de cefalomanina 1,040 Peso de cefalomanina (mg) 0,530 Rendimento teórico em Bacatina III 16,481 (a partir de taxol, em mg) Rendimento teórico em Bacatina III 0,374 - (a partir de Ceph, em mg) Rendimento teórico total (mg) 16,855 Rendimento real em Bacatina III (mg) 11,130 % rendimento de Bacatina III 67,532 (em relação a taxol) % rendimento de Bacatina III 66,033 (em relação a taxol e Ceph) Taxol remanescente (mg) 11,710 % de taxol usado 51,189 Cefalomanina remanescente (mg) 0,000 % de cefalomanina usada 100,00 A Bacatina III resultante tinha as seguintes características, o ponto de fusão

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 13 e a análise elementar para ¢3-^33().,., (efectuada por Huffman Laboratories, Golden, Colorado), as especificações do produto condiziam com as reportadas previamente para a Bacatina III. O espectro de ressonância magnética do protão (300 Mhz, clorofórmio deuterado; desvio químico em ppm; constantes de acoplamento J em Hz): 1,11 (s, 6H), 2,06 (s, 3H), 2,25 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,31 (m, 3H), 2,57 (m, 1H), 3,88 (d, J = 6,8, 1H), 4,15 (d, J = 8,3, 1H), 4,31 (d, J = 8,3, 1H), 4,47 (m, 1H), 4,90 (t, J = 8,1, 1H), 4,98 (dd; J = 8,7, 1,2; 1H), 5,62 (d, J = 7,1, 1H), 6,32 (s, 1H), 7,49 (t, J = 7,3, 2H), 7,61 (td; J = 7,7, 1,2;, 1H), 8,11 (d, J = 7,7, 2H).

Exemplo II

As condições de reacção no Exemplo II foram como segue: Tabela lia

Solvente reaccional Tolueno

Temperatura de reacção (graus C) 0

Tempo de reacção 1 semana

Sal redutor boro-hidreto de tetrabutilamónio

Reagentes adicionais nenhum O material de partida era formado por taxanos parcialmente purificados, recolhidos durante o processo de extracção e purificação de taxol a partir da biomassa da planta Taxus brevifolia. Determinou-se que 0 material de partida continha 47,04% de taxol e 1,04% de cefalomanina, por HPLC. Combinou-se uma quantidade de 55 mg do material de partida com 2,0 ml de tolueno num balão de fundo redondo de 250 ml, equipado com um agitador magnético, sob uma atmosfera de azoto gasoso. Após a dissolução estar completa, a solução foi arrefecida a 0°C. Adicionou-se boro-hidreto de tetrabutilamónio (40 mg) e deixou-se agitar a mistura heterogénea. A reacção foi monitorizada por TLC e, devido à lentidão da reacção, deixou-se esta prosseguir durante uma semana. Empregou-se o procedimento de purificação da arte anterior que se segue. A reacção foi vertida sobre 1 Ml de 50% ácido acético/água e deixada em agitação até cessar a evolução de gás. A mistura foi então diluída com 10 ml de água e 10 ml de um solvente orgânico imiscível. A camada orgânica foi extractada três vezes, recolhida, reduzida in vacuo e purificada por cromatografia instantânea, eluíndo com 14 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ/ΡΤ diclorometano/5% metanol. As fracções contendo Bacatina III foram evaporadas até à secura e recristalizadas a partir de metanol/H20 (80:20). O rendimento de 13,95 mg representou um rendimento de 76,7% de Bacatina III. A RMN de Protão e o ponto de fusão da Bacatina III condiziam com os valores previamente reportados na literatura.

Tabela llb

Material de partida (mg) 51,000 % de taxol 47,040 peso de taxol (mg) 25,872 % de cefalomanina 1,040

Peso de cefalomanina (mg) 0,572

Rendimento teórico em Bacatina III 17,774 (a partir de taxol, em mg)

Rendimento teórico em Bacatina III 0,403 (a partir de Ceph, em mg)

Rendimento teórico total (mg) 18,177

Rendimento real em Bacatina III (mg) 13,950 % de rendimento de Bacatina III 78,487 (em relação a taxol) % de rendimento de Bacatina III 76,745 (em relação a taxol e Ceph)

Taxol remanescente (mg) 2,370 % de taxol usado 90,840

Cefalomanina remanescente (mg) 0,249 % de cefalomanina usada 56,469 O tolueno tem uma constante dieléctrica de aproximadamente 2,3 o que o torna num solvente apoiar. As misturas de taxanos parcialmente purificadas obtidas em processos de extracção de taxol, contêm frequentemente material polar devido à adição de H20 e de álcool durante o processo de extracção. Assim, um perito na arte hesitará em seleccionar tolueno devido aos problemas potenciais de solubilidade, associados à dissolução do material de partida parcialmente polar, em tolueno. Portanto, foi altamente surpreendente constatar que apesar dos problemas de solubilidade associados ao tolueno, a utilização de tolueno como solvente, resultou num rendimento de Bacatina III de 76,7% quando se deixou a reacção prosseguir até estar completa. O resultado indica um rendimento 10% superior ao

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 15 procedimento da linha de base. Da mesma forma, outros hidrocarbonetos aromáticos, tais como benzeno, 1, 3, 5 metilbenzeno, 1,2-dimetilbenzeno, 1,3-dimetilbenzeno, 1,4-dimetilbenzeno apresentam problemas potenciais de solubilidade mas podem substituir o tolueno neste processo.

Exemplo III

As condições de reacção no Exemplo III foram como se segue:

Tabela IIla

Solvente reaccionai CH2CI2

Temperatura de reacção (graus C) 0

Tempo de reacção 16 horas

Sal redutor NaBH4

Reagentes adicionais nenhum A utilização de boro-hidreto de tetrabutilamónio numa reacção de taxano, de um ponto de vista comercial, é altamente indesejável devido ao custo do boro-hidreto. Um substituto não dispendioso para o boro-hidreto de tetrabutilamónio é o boro-hidreto de sódio. No passado, o boro-hidreto de sódio foi evitado nas reacções com taxano porque, quando usado com álcool isopropílico numa reacção para converter taxol em Bacatina III, resultaram produtos indesejados tais como o diol 8 e reacções indesejadas tais como a epimerização do grupo hidroxilo C-7, para dar Bacatina V. De forma a evitar estes problemas, o boro-hidreto de sódio e o álcool isopropílico foram substituídos por boro-hidreto de tetrabutilamónio e diclorometano.

Uma solução formada por 50,2 mg da mistura seca de taxano (material de partida) com 2,0 ml de diclorometano, foi arrefecida a 0°C. A solução foi então combinada com 4,7 mg de boro-hidreto de sódio. A reacção foi agitada a 0°C durante dezasseis horas. A Bacatina III na reacção foi então purificada e recolhida pelo procedimento da arte anterior, tal como indicado nos Exemplos I e II. A RMN de Protão e o ponto de fusão do produto condiziam com os valores da Bacatina III previamente reportados na literatura.

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 16

Tabela lllb

Material de partida (mg) 50,200 % de taxol 15,100 Peso de taxol (mg) 7,701 % de cefalomanina 3,180 Peso de cefalomanina (mg) 1,622 Rendimento teórico em Baçatina III 5,290 (a partir de taxol, em mg) Rendimento teórico em Baçatina III 1,144 (a partir de Ceph, em mg) Rendimento teórico total (mg) 6,434 Rendimento real em Baçatina III (mg) 5,520 % de rendimento de Baçatina III 104,338 (em relação a taxol) % de rendimento de Baçatina III 85,792 (em relação a taxol e Ceph) Taxol remanescente (mg) 3,560 % de taxol usado 53,772 Cefalomanina remanescente (mg) 0,952 % de cefalomanina usada 41,300 Ο procedimento de Magris et aí. apresentado no Exemplo I foi efectuado com um material de partida altamente purificado (47% de taxol) e originou apenas 66% de Baçatina III. Em contraste, o material de partida dò Exemplo III continha apenas 15% de taxol e, no entanto, o rendimento de Baçatina III foi de 85%. Além disso, não se verificou uma produção substancial de produto indesejável.

Exemplo IV

As condições de reacção no Exemplo IV foram como se segue: (Segue Tabela IVa)

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ

Tabela IVa

Solvente reaccional Temperatura de reacção Tempo de reacção Sal redutor Reagentes adicionais

Combinou-se uma quantidade de 50 mg de material de partida (possuindo 47% de taxol) com 2,0 ml de diclorometano, sob uma atmosfera de azoto gasoso num balão de 25 ml equipado com um agitador magnético. Após a dissolução estar completa, a reacção foi arrefecida a 0°C num banho de gelo. Então, adicionaram-se à reacção, 2,5 mg de cloreto de estanho (uma percentagem de 10% molar com base no teor de taxol do material de partida) e 25 mg de boro-hidreto de tetrabutilamónio. A reacção foi deixada com agitação durante uma hora e em seguida foi vertida em 10-25 ml/g de uma solução a 50% em volume de ácido acético/água para interromper a reacção. A mistura foi repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível. O solvente usado neste exemplo foi o diclorometano. A fase orgânica foi recolhida e reduzida in vacuo. Este material foi purificado por cromatografia instantânea, eluíndo com uma mistura de diclorometano/5% de metanol. As fracções foram recolhidas e reduzidas in vacuo e recristalizadas a partir de metanol/água. O resultado foi um rendimento de 121,0% de Bacatina III. Os resultados de RMN do protão e de ponto de fusão, condiziam com os da Bacatina III.

Tabela IVb

Material de partida (mg) 50,000 % de taxol 47,040 Peso de taxol (mg) 23,520 % de cefalomanina 1,040 Peso de cefalomanina (mg) 0,520 Rendimento teórico em Bacatina III 16,158 (a partir de taxol, em mg) Rendimento teórico em Bacatina III 0,367 (a partir de Ceph, em mg) Rendimento teórico total (mg) 16,525 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 18

Rendimento real em Bacatina III (mg) 20,110 % de rendimento de Bacatina III 124,459 (em relação a taxol) % de rendimento de Bacatina III 121,697 7,450 68,325 0,000 100,000 (em relação a taxol e Ceph) Taxol remanescente (mg) % de taxol usado Cefalomanina remanescente (mg) % de cefalomanina usada

Está relatada na literatura uma variedade de taxanos possuindo a estrutura diterpenóide. Antecipa-se que taxanos possuindo cadeias laterais em C-13 diferentes da cadeia lateral em C-13 da cefalomanina ou do taxol, estejam presentes numa mistura obtida a partir de um processo de extracção de taxol. Um grupo de taxano possuindo cadeias laterais diferentes em C-13 são os “taxanos ligados”. Estes taxanos parecem estar ligados a outras moléculas biológicas tais como açucares; pelo menos um “taxano ligado” conhecido é o 7-xilosiltaxol. O rendimento de 121% resulta da cisão de taxanos que não aparecem como taxol ou cefalomanina na análise por HPLC do material de partida. A capacidade para cindir estes taxanos não identificados resulta num aumento muito desejado do rendimento em Bacatina III.

Exemplo V

As condições de reacção no Exemplo V foram como se segue:

Tabela Va 10 g 350 mg 3,5% 230 mg 2,3% NaBH4 10:1 SnCI2 (0,1%)

Material de partida (mp)

Taxol no material de partida % de taxol no material de partida Ceph no material de partida % de Ceph no material de partida Sal redutor Reagentes adicionais

Agitaram-se 10 g de taxano (material de partida) contendo taxol (3,5%) e cefalomanina (2,3%) em 200 ml de THF, num balão de fundo redondo de 500 ml, 19

I 84 686 ΕΡ Ο 656 000 / ΡΤ sob uma atmosfera de azoto gasoso. Adicionaram-se à mistura boro-hidreto de sódio numa razão estequiométrica de 10:1, com base no material de partida e 0,1% de cloreto de estanho (com base na % molar de taxol no material de partida). Deixou-se prosseguir a reacção à temperatura ambiente durante setenta e duas horas. Após este período a solução orgânica contendo a Bacatina III foi purificada pelo método seguinte. A solução orgânica foi vertida em 10 ml por grama de solução a 50% em volume de ácido acético/H20. A solução orgânica foi então repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível, neste caso, THF. A fase orgânica foi recolhida, seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada em vácuo a um óleo viscoso. Este óleo foi purificado por cromatografia instantânea, eluíndo com diclorometano/5% de metanol. As fracções seleccionadas foram então reduzidas à secura sob pressão reduzida (20 mm de mercúrio). O material orgânico seco foi então recristalizado a partir de uma solução a 15% de metanol/água (80:20). Recuperaram-se 171 mg de Bacatina III, resultando num rendimento de 71%. A análise por 1H-RMN e o ponto de fusão do produto condiziam com os previamente relatados para a Bacatina III.

Tabela Vb THF NaBH4 temperatura ambiente 72 horas 241 mg 171 mg 71% 28 mg 8% 42 mg 18%

Solvente reaccional com

Temperatura de reacção C Tempo de reacção Rendimento teórico em Bacatina III Rendimento real em Bacatina III (hplc) % de-rendimento de Bacatina III Taxol remanescente (hplc) % de taxol remanescente Cefalomanina remanescente % de cefalomanina remanescente

Em contraste, o mesmo procedimento, como descrito no Exemplo V, foi realizado com 30 gramas de material de partida possuindo as mesmas percentagens de taxol/cefalomanina. O solvente reaccional usado foi o diclorometano (tal como foi usado no procedimento de Magris et al.). O rendimento em bacatina III foi de apenas 36%, 260 mg (resultou um rendimento maior a partir de 10 mg de material), tal como analisado por TLC para determinar que a reacção estava completa. Com base na análise por TLC, a reacção em diclorometano foi

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 20

levada a cabo durante cento e vinte e duas horas, versus setenta e duas horas. Exemplo VI

As condições de reacção e o material de partida no Exemplo VI foram como se segue:

Tabela Via

Material de partida (mp) 10 g Taxol no material de partida 350 mg % de taxol no material de partida 3,5% Cefalomanina no material de partida 230 mg % de Cefalomanina no material 2,3% de partida Sal redutor NaBH4 10:1 Reagentes adicionais SnCI2 (0,1%)

Agitaram-se 10 g do material de partida taxano contendo taxol (3,5%) e cefalomanina (2,3%) em 200 ml de glima, num balão de fundo redondo sob uma atmosfera de azoto gasoso. Adicionaram-se à mistura boro-hidreto de sódio (razão estequiométrica 10:1, com base no material de partida) e (0,1%) cloreto de estanho (com base na % molar de taxol no material de partida). Deixou-se prosseguir a reacção à temperatura ambiente durante setenta e duas horas. Após este período a solução orgânica contendo a Bacatina III foi purificada pelo método seguinte. A solução orgânica foi vertida em 10-25 ml por grama de solução a 50% em volume de ácido acético/H20. A solução orgânica foi então repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível, neste caso, glima. A fase orgânica foi recolhida, seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada in vacuo a um óleo viscoso. O óleo foi purificado por cromatografia instantânea eluíndo com diclorometano/5% de metanol. As fracções seleccionadas foram então evaporadas até à secura, sob pressão reduzida (20 mm de mercúrio). O material orgânico seco foi então recristalizado numa solução a 15% de metanol/água (80:20). Recuperaram-se 159 mg de Bacatina III, resultando num rendimento de 66%. A análise por 1H-RMN e o ponto de fusão do produto condiziam com os previamente relatados na literatura para a Bacatina III.

glima NaBH4 temperatura ambiente 72 horas 241 mg 159 mg 66% 19 mg 5% 33 mg 14% 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 21

Tabela Vlb

Solvente reaccional com

Temperatura de reacção C Tempo de reacção Rendimento teórico em Bacatina III Rendimento real em Bacatina III (hplc) % de rendimento de Bacatina III Taxol remanescente (hplc) % de taxol remanescente Cefalomanina remanescente % de cefalomanina remanescente

Realizou-se a mesma reacção, descrita no Exemplo VI acima, usando diglima, um solvente de maior peso molecular, e obteve-se um rendimento de 52%. Em contraste, a mesma reacção foi realizada durante cento e quarenta e quatro horas não usando cloreto de estanho e com triglima. Aqui, o rendimento foi de 46%. Novamente, em contraste, o procedimento de linha de base de Magris et al. que é realizado a 0°C e que não é economicamente tão atractivo, resultou num rendimento de 66% quando a mistura tinha 47% de taxol. O rendimento no Exemplo VI é do material de partida que contém apenas 3,5% de taxol. Tal como notado quando a reacção foi realizada durante cento e vinte horas à temperatura ambiente, usando diclorometano como solvente reaccional, o resultado foi de apenas 53% de bacatina III. A utilização de solventes doadores apoiares, como a glima e o THF, na presença de um ácido de Lewis, parece resultar em rendimentos substancialmente melhores de Bacatina III, a partir de material de partida constituído por taxanos parcialmente purificados (com menos do que 50% de taxol), do que a utilização de CH2CI2 (um solvente apoiar, não doador) na presença de um ácido de Lewis.

Exemplo VII

As condições de reacção e o material de partida no Exemplo VII foram como se segue:

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 22

Tabela Vila

Material de partida (massa)

Taxol no material de partida % de taxol no material de partida Ceph no material de partida % de Ceph no material de partida Sal redutor

Reagentes adicionais

Agitaram-se 10 g do material de partida taxano contendo taxol (3,5%) e cefalomanina (2,3%) em 200 ml de glima, num balão de fundo redondo de 500 ml, sob uma atmosfera de azoto gasoso. Adicionaram-se à mistura boro-hidreto de sódio (razão estequiométrica 10:1, com base no material de partida) e 7% de cloreto de cobalto (com base na % molar de taxol no material de partida), sob a forma de peletes. Deixou-se prosseguir a reacção à temperatura ambiente durante cento e quarenta e quatro horas. Após o período de cento e quarenta e quatro horas, a solução orgânica contendo a Bacatina III foi então purificada pelo método seguinte. A mistura reaccional foi vertida em 10 ml por grama de solução a 50% em volume de ácido acético/H20. A solução orgânica foi então repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível, neste caso, glima. A fase orgânica foi recolhida e seca sobre sulfato de sódio anidro. A fase orgânica foi então evaporada sob vácuo a um óleo viscoso. O óleo foi purificado por cromatografia instantânea,-eluindo com diclorometano/5% de metanol. As fracções seleccionadas foram então evaporadas até à secura, sob pressão reduzida (20 mm de Hg). O material orgânico seco foi então recristalizado numa solução a 15% de metanol/água (80:20). Recuperaram-se 174 mg de Bacatina III, resultando num rendimento de 72%. A análise por 1H-RMN e o ponto de fusão do produto condiziam com os valores previamente relatados na literatura para a Bacatina III. (Segue Tabela Vllb) 23 84 686

ΕΡ Ο 656 000/PT

Tabela Vllb glima NaBH4/CoCI2 (peletes) temperatura ambiente 144 horas 241 mg 174 mg 72% 25 mg 7% 45 mg 20%

Solvente reaccional com

Exemplo VIII

Seleccionou-se etanol como solvente, apesar de Magris et ai referirem que o boro-hidreto de sódio e o álcool isopropílico resultam numa mistura indesejável de bacatina III, bacatina V e diol 8. Obteve-se um resultado surpreendente quando o procedimento, tal como mostrado abaixo, foi realizado sem um ácido de Lewis e com etanol como solvente reaccional. O resultado foi que a -30°C, o boro-hidreto de sódio numa quantidade estequiométrica de 10:1 cindiu selectivamente a cefalomanina e outros taxanos em vez do taxol. As condições de reacção e o material de partida no Exemplo VIII foram como se segue:

Tabela Vllla

Material de partida (massa) 10 g

Taxol no material de partida 350 mg % de taxol no material de partida 3,5%

Ceph no material de partida 230 mg % de Ceph no material de partida 2,3%

Solvente reaccional etanol com NaBH4

Temperatura de reacção C -30°C

Tempo de reacção 24 horas

Sal redutor NaBH4 10:1

Reagentes adicionais nenhum

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 24

Agitaram-se 10 g do material de partida taxano contendo 3,5% de taxol e 2,3% de cefalomanina em 200 ml de etanol, num baião de fundo redondo de 500 ml, sob uma atmosfera de azoto gasoso. A solução foi arrefecida até -30°C e adicionou-se à mistura uma quantidade estequiométrica 10:1 de boro-hidreto de sódio. Deixou-se a reacção ser agitada durante vinte e quatro horas. A mistura foi então vertida em 10-25 ml por grama de uma solução a 50% em volume de ácido acético/H20. A solução orgânica foi repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível, neste caso, diclorometano. A fase orgânica foi recolhida, seca sobre sulfato de sódio anidro e reduzida em vácuo a um óleo viscoso. O óleo foi purificado por cromatografia instantânea, eluíndo com diclorometano/5% de metanol. As fracções seleccionadas foram evaporadas até à secura sob pressão reduzida (20 mm de mercúrio). O material orgânico foi recristalizado a partir de uma solução a 15% de metanol/água numa razão de 80:20. Obteve-se um rendimento de 58% de Bacatina III de acordo com análise por HPLC. A análise por HPLC indicou também que permanecia ainda 100% do taxol. O rendimento de Bacatina III deriva assim da cefalomanina e dos outros taxanos não taxol. A 1H-RMN e o ponto de fusão do produto final condiziam com os valores previamente relatados para a Bacatina III.

Tabela Vlllb

Rendimento teórico em Bacatina III 241 mg Rendimento real em Bacatina III (hplc) 140 mg % de rendimento de Bacatina III 58%

Taxol remanescente (hplc) 350 mg % de taxol remanescente 100 %

Cefalomanina remanescente 193 mg % de cefalomanina remanescente 84%

Exemplo IX (Arte Anteriorl Tabela IXa

As condições de reacção no Exemplo IX são como se segue:

Solvente reaccional CH2CI2

Temperatura de reacção (graus C) 0

Tempo de reacção 16 horas

Sal redutor boro-hidreto de tetrabutilamónio

Reagentes adicionais nenhum

84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ 25

Agitou-se 69 mg de taxanos (material de partida) possuindo 47,04% de taxol, 1,04% de cefalomanina, 1,73% de 10-desacetiltaxol, 5,7% de 10-desacetilbacatina III em 2,0 ml de diclorometano num balão de fundo redondo de 25 ml, sob uma atmosfera de azoto gasoso. Após se arrefecer a solução a 0°C num banho de gelo, adicionaram-se 25 mg de boro-hidreto de tetrabutilamónio. A mistura foi deixada com agitação durante uma hora e a reacção foi interrompida por adição de 0,5 ml de AcOH. A solução orgânica presumivelmente contendo 10-desacetilbacatina III, foi vertida em 25 ml/g de solução a 50% em volume de ácido acético/H20. A solução orgânica foi repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível. Neste caso, foi usado diclorometano. A fase orgânica foi recolhida e seca sobre sulfato de sódio anidro. A fase orgânica foi removida in vacuo para formar um óleo viscoso. O resíduo foi purificado por cromatografia instantânea, sobre sílica gel usando pressão de azoto e eluíndo com diclorometano/5% de metanol. As fracções seleccionadas foram evaporadas até à secura sob pressão reduzida (20 mm Hg). O material orgânico seco foi recristalizado a partir de uma solução a 15% de metanol/água (80:20). Não foi produzida nenhuma 10-desacetilbacatina III. De facto, perderam-se 3 mg de 10-desacetilbacatina III tal como 0,6 mg de 10-desacetiltaxol. O rendimento foi negativo (-)375,00%. Este rendimento tem em conta o material perdido.

Tabela IXb

Material de partida (mg) 69,0 % de 10-desacetiltaxol 1,73 peso de 10-desacetiltaxol (mg) 1,19 % de 10-desacetilbacatina III 5,74 peso de 10-desacetilbacatina III (mg) 3,96 Rendimento teórico 0,800 10-desacetilbacatina III (a partir de 10-desacetiltaxol em mg) Rendimento real 0,96 (-3,00) 10-desacetilbacatina III (mg) % de rendimento 10-desacetilbacatina III -375,00 (em relação a 10-desacetiltaxol) 10-desacetiltaxol remanescente (mg) 0,520 % de 10-desacetiltaxol usado 56,300

Exemplo X

As condições de reacção no Exemplo X são como se segue: Tabela Xa

Material de partida (sm) 10 g

Taxol no material de partida 350 mg % de taxol no material de partida 3,5% 10-desacetiltaxol 131 mg no material de partida % de 10-desacetiltaxol 1,3% no material de partida

Sal redutor NaBH410:1

Reagentes adicionais SnCI2 (0,1%)

Agitaram-se 10 g de taxano (material de partida) contendo taxol (3,5%) e 10-desacetiltaxol (1,3%), 10-desacetilbacatina III (0,6%), em 200 ml de THF, num balão de fundo redondo de 500 ml, sob uma atmosfera de azoto gasoso. Adicionaram-se à mistura boro-hidreto de sódio numa razão estequiométrica de 10:1, com base no material de partida e 0,1% de cloreto de estanho (com base na % molar de taxol no material de partida). Deixou-se prosseguir a reacção à temperatura ambiente durante setenta e duas horas. Após este período a solução orgânica, contendo a bacatina III e a 10-desacetilbacatina III, foi purificada pelo método seguinte. A solução orgânica foi vertida em 10 ml por grama de solução a 50% em volume de ácido acético/H20. A solução orgânica foi então repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível, neste caso, THF. A fase orgânica foi recolhida, seca sobre sulfato de sódio anidro e evaporada in vacuo a um óleo viscoso. Este óleo foi purificado por cromatografia instantânea eluíndo com diclorometano/5% de metanol. As fracções seleccionadas foram então reduzidas à secura, sob pressão reduzida (20 mm de mercúrio). O material orgânico seco foi então recristalizado a partir de metanol. Recuperaram-se 115 mg de 10-desacetilbacatina III, resultando num rendimento de 52%. A análise por 1H-RMN e o ponto de fusão do produto condiziam com os previamente relatados para a 10-desacetilbacatina III.

THF NaBH4 temperatura ambiente 72 horas 88 mg 115 mg 52% 10 mg 92%

Solvente reaccional com

Temperatura de reacção C Tempo de reacção Rendimento teórico em 10-desacetilbacatina III Rendimento real 10-desacetilbacatina III (hplc) % de rendimento de 10-desacetilbacatina 10-desacetiltaxol remanescente (hplc) % de 10-desacetiltaxol convertido

Em contraste, realizou-se o mesmo procedimento que o descrito no Exemplo X sobre 10 gramas de material de partida possuindo as mesmas percentagens de taxol e de 10-desacetiltaxol. O solvente reaccional usado foi o diclorometano (tal como usado no procedimento de Magris et a!.). O rendimento em 10-desacetilbacatina III foi de apenas 24%, 90 mg (resultou um rendimento mais baixo de quantidades maiores de material) tal como analisado por TLC. Havia ainda 69 mg de 10-desacetiltaxol remanescentes; 47% do 10-desacetiltaxol foi convertido. Com base na análise por TLC a reacção em diclorometano foi realizada durante cento e vinte horas versus setenta e duas horas. A 10-desacetilbacatina III resultante tinha as características, ponto de fusão e análise elementar para C29H36O10 (efectuada por Huffman Laboratories, Golden Colorado). O produto condizia com as propriedades relatadas previamente para a 10-desacetilbacatina III. O espectro de ressonância magnética nuclear do protão (300 MHz; clorofórmio deuterado; desvio químico em ppm, constantes de acoplamento J em Hz): 1,10 (s, 6H), 1,74 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,57 (m, 1H), 4,00 (d, J = 7,0, 1H), 4,17 (d, J = 9,0, 1H), 4,20 (m, 1H), 4,32 (d, J = 9,0, 1H), 4,80 (t largo, 1H), 4,96 (dd; J = 8,7, 1,2; 1H), 5,24 (s, 1H), 5,63 (d, J = 7,0, 1H), 7,49 (t, J = 7,3, 2H), 7,62 (t, J = 7,57, 1H), 8,11 (d, J = 7,32, 2H).

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ΕΡ Ο 656 000/PT 28

Exemplo XI

As condições de reacção no Exemplo XI são como se segue: Tabela Xla

Material de partida (massa) 10 g Taxol no material de partida 350 mg % de taxol no material de partida 3,5% 10-desacetiltaxoi 131 mg no material de partida % de 10-desacetiltaxol 1,3% no material de partida Sal redutor NaBH4 (peletes) 10:1 Reagentes adicionais CoCI2 (7%)

Agitaram-se 10 g de material de partida taxano contendo taxol (3,5%) e cefalomanina (2,3%), em 200 ml de glima, num balão de fundo redondo de 500 ml, sob uma atmosfera de azoto gasoso. Adicionaram-se à mistura boro-hidreto de sódio (razão estequiométrica 10:1, com base no material de partida) e 7% de cloreto de cobalto (com base na % molar de taxol no material de partida), sob a forma de peletes. Deixou-se prosseguir a reacção à temperatura ambiente durante cento e quarenta e quatro horas. Após o período de cento e quarenta e quatro horas, a solução orgânica contendo a 10-desacetilbacatina III, foi então purificada pelo método seguinte. A mistura reaccional foi vertida em 10 ml por grama de solução a 50% em volume de ácido acético/H20. A solução orgânica foi então repetidamente extractada com um solvente orgânico imiscível, neste caso, glima. A fase orgânica foi recolhida e seca sobre sulfato de sódio anidro. A fase orgânica foi então evaporada sob vácuo a um óleo viscoso. O óleo foi purificado por cromatografia instantânea, eluíndo com diclorometano/5% de metanol. As fracções seleccionadas foram então evaporadas até à secura, sob pressão reduzida (20 mm de Hg). O material orgânico seco foi então recristalizado a partir de metanol. Recuperaram-se 87 mg de 10-desacetilbacatina III, resultando num rendimento de 21%. A análise por 1H-RMN e o ponto de fusão do produto condiziam com os valores previamente relatados na literatura para a 10-desacetilbacatina III. 29 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ

Tabela XI b

Temperatura de reacção (°C) Tempo de reacção Rendimento teórico em

Solvente reaccional com glima

NaBH4/CoCI2 peletes temperatura ambiente 144 horas 88 mg 87 mg 10-desacetilbacatina III Rendimento real 10-desacetilbacatina III (hplc) % de rendimento de 10-desacetilbacatina III 21% 10-desacetiltaxol remanescente (hplc) 41 mg 69% % de 10-desacetiltaxol convertido

Para determinar, sem experiências desnecessárias, quais os ácidos de Lewis que produzirão bons rendimentos de 10-desacetilbacatina III ou de bacatina III, a partir de uma mistura de taxanos parcialmente purificados, deve ser analisado o seguinte teste em dois passos. Primeiro, o ácido de Lewis deve ser capaz de se ligar covalentemente a espécies nucleófilas fortes incluindo, por exemplo, aniões de oxigénio. Assim, o cloreto de magnésio não será um ácido de Lewis preferido. Segundo, o ácido de Lewis não deve reagir com o sal boro-hidreto redutor para formar boranos, por exemplo B2H6. Os ácidos de Lewis que se podem ligar covalentemente com nucleófilos fortes e que não reagem para formar boranos podem ser utilizados na presente invenção. Por exemplo, ácidos de Lewis tais como SbCI5, ZnCI2, CuCI2, PbCI2, GeCI2, SnBr2, Snl2 e CoBr2 serão ácidos de Lewis seleccionados, de acordo com o teste em dois passos. Várias experiências indicam que a produção em larga escala de 10-desacetilbacatina III ou de Bacatina III pode requerer mais do que 0,1% de ácido de Lewis. Além disso, quando se utilizam grandes quantidades de material de partida é extremamente importante monitorizar de perto a reacção por TLC e estar certo de que a mistura está a ser bem agitada de forma a que a reacção de cisão possa ocorrer facilmente. A presente invenção revela novos processos de alto rendimento para a conversão de misturas de taxano parcialmente purificadas, tanto em bacatina III como em 10-desacetilbacatina III. Estes processos resultam em bons rendimentos 30 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ / ΡΤ de Bacatina III e 10-desacetilbacatina III, que são essencialmente puras após purificação adicional por métodos conhecidos dos peritos na arte. A caracterização das espécies resultantes confirma a estrutura do produto resultante como sendo Bacatina III ou 10-desacetilbacatina III. Em adição aos bons resultados de Bacatina lll e de 10-desacetilbacatina III, estes processos são comercialmente viáveis, não dispendiosos e realizados à temperatura ambiente. A utilização de sais boro-hidreto redutores que não o boro-hidreto de sódio e o boro-hidreto de tetrabutilamónio e a utilização de outros ácidos de Lewis estão contempladas por esta invenção.

Assim, a presente invenção foi descrita com algum grau de particularização dirigida aos processos da presente invenção. Deverá apreciar-se, no entanto, que a presente invenção é definida pelas reivindicações que se seguem, construídas à luz da arte anterior de forma que possam ser efectuadas modificações, ou variações, aos processos da presente invenção, sem sair dos conceitos inventivos aqui contidos. Entende-se que a invenção pode ser praticada de outra forma que não a aqui especificamente descrita.

Lisboa, 13. ABR. 2'óuU

Por NAPRO BIOTHERAPEUTICS, INC. - O AGENTE OFICIAL -

DA CUMHA FERREIRA A§. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74 - 4. ieoo LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1 - Processo para a preparação de um composto de fórmula I

em que R-) é seleccionado de entre um grupo constituído por H e COCH3f compreendendo o contacto de uma mistura contendo pelo menos um composto taxano possuindo uma ligação éster na posição C-13 com, pelo menos, um sal boro-hidreto redutor num solvente reaccional, na presença de um ácido de Lewis.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1 conduzido a uma temperatura na gama de entre -30°C e a temperatura ambiente.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o sal redutor boro-hidreto é seleccionado de entre um grupo constituído por boro-hidreto de sódio e boro-hidreto de tetrabutilamónio.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o solvente reaccional é seleccionado de entre o grupo constituído por. glimas; tetra-hidrofurano; diclorometano; hidrocarbonetos aromáticos; e etanol.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 4 em que as glimas são seleccionadas de entre um grupo constituído por: CH3(OCH2CH2)xOCH3 em que x é um inteiro de 1 a 3.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o referido solvente reaccional é tolueno.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o ácido de Lewis é um halogeneto de metal. 84 686 ΕΡ Ο 656 ΟΟΟ/ΡΤ 2/2 δ - Processo de acordo com a reivindicação 7 em que o referido halogeneto de metal é seleccionado de entre o grupo constituído por cloreto de estanho e cloreto de cobalto.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a mistura contém, pelo menos, 15%-50% de taxanos os quais são taxol e o solvente reaccional é tetra-hidrofurano.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a mistura contém mais do que 50% em peso de taxanos que são taxol e o solvente reaccional é diclorometano.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 1 em que a mistura contém menos do que 15% em peso de taxanos que são taxol e o solvente reaccional é seleccionado de entre o grupo constituído por ' CH3OCH2CH2OCH3, CH30(CH2CH20)2CH3, CH30(CH2CH20)3CH3.
12 - Processo para a preparação de um composto de fórmula I OCOCH3 O OH

OH ÒC0C6H5 I compreendendo o contacto de uma mistura contendo um composto taxano que é um taxol e, pelo menos, um outro composto taxano, possuindo uma ligação éster na posição C-13, que não é um taxol, com um sal redutor de boro-hidreto de sódio em etanol a -30°C , em que o composto taxano que é taxol na mistura não é convertido na fórmula I como definida acima. Lisboa· 13. fifll ZOOU Por NAPRO BIOTHERAPEUTICS, INC. - O AGENTE OFICIAL -