PT569132E

PT569132E - Melhoramentos na marcacao radioactiva

Info

Publication number: PT569132E
Application number: PT93302712T
Authority: PT
Inventors: Gary James Bridger; Pedro Emilio Hernandez; John David Higgins; Scott Kenneth Larsen
Original assignee: Anormed Inc
Priority date: 1992-05-02
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 2000-08-31
Also published as: NO306407B1; KR930023028A; GB9209641D0; FI931968A0; DE69327914D1; NO931585D0; GR3033379T3; JP3271259B2; CA2094380A1; HK1013828A1; ZA932844B; NZ247445A; ATE190063T1; DE69327914T2; KR100293777B1; AU3717393A; JPH0665169A; CA2094380C; US5350837A; FI931968A

Description

84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ DESCRICÃ0 "Melhoramentos na marcação radioactiva" O presente invento refere-se a melhoramentos na marcação radioactiva e mais especialmente a complexos de radioisótopos melhorados.

Devido à sua elevada especificidade biológica, têm-se utilizado algumas macromoléculas, como os anticorpos monoclonais, para direccionar radioisótopos a locais alvo específicos in vivo, para fins de diagnóstico por imageologia ou para terapia. A utilização do isótopo metastável de tecnécio 99mTc, na medicina nuclear de diagnóstico está bem estabelecida e os isótopos emissores beta de rénio Re, Re e Re, podem ser utilizados terapeuticamente.

Foram descritos vários métodos para a ligação de tecnécio a macromoléculas na literatura científica e de patentes. Faça-se referência à EPA 0 384 769 dos requerentes, que discute esta área e descreve métodos para a modificação de macromoléculas, a fim de permitir uma ligação mais rápida a complexos de radioisótopos. Por exemplo, o método actualmente preferido na arte para a preparação da macromolécula marcada com radioisótopos é reduzir o ião pertecnetato Tcvll04 na presença de um precursor quelante, para formar um complexo Tc-precursor lábil que é então feito reagir com um grupo ligante a metal numa proteína modificada, para formar um conjugado Tc-proteína. Foram descritos diversos precursores quelantes deste tipo para o tecnécio, que incluem gluco-heptonato de sódio, tartarato de sódio, gluconato de sódio, sacarato de sódio e 1,1,3,3-propilenotetrafosfonato de sódio. 0 precursor quelante actualmente preferido é o gluco-heptonato de sódio. A utilização de Tc-gluco-heptonato para marcar radioactivamente uma proteína, a qual foi modificada funcionalmente com grupos hidrazino-nicotinamida (SHNH), como descrito na EPA 0384 769 acima mencionada, requer uma incubação de 60 minutos, e embora se possam obter rendimentos de marcação radioactiva >95%, isso acontece com uma actividade específica bastante baixa, <10 mCi/mg de proteína. Constitui um objectivo do presente invento melhorar o tempo necessário para a incubação e/ou actividade específica. 84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ 2

proporcionando um novo complexo de Tc.

O presente invento proporciona um complexo de tecnécio com o ligando L

(R3)(R4)(R5)C-N(R)-C(R1)(R2)-(CH2)n-COOH L em que R é hidrogénio, hidroxilo, alquilo, hidroxialquilo, ou alquilcarboxi ou R e R1 em conjunto, podem formar um radical mono-, di-, tri- ou tetra-metileno, ou R e R2 em conjunto podem formar um radical mono-, di-, tri- ou tetra-metileno e R1 e R2 podem ser iguais ou diferentes e são seleccionados a partir de hidrogénio, hidroxi, alquilo substituído ou não substituído, hidroxialquilo, carboxi, carboxialquilo, aminoalquilo, tioalquilo, arilo, ou R1 e R2 em conjunto podem formar um radical tetra ou penta-metileno, e R3 e R4 e R5 podem ser iguais ou diferentes e são seleccionados a partir de hidrogénio, hidroxi, alquilo substituído ou não substituído, hidroxialquilo, carboxi, carboxialquilo, desde que pelo menos um de R3, R4 e R5 seja hidroxialquilo, e n é igual a 0, 1 ou 2.

De preferência, quando R é alquilo ou alquilo substituído, tem 1 a 3 átomos de carbono. De preferência, quando R1 e R2 são alquilo ou alquilo substituído, têm 1 a 4 átomos de carbono. De preferência, os grupos arilo são fenilo e benzilo. De preferência, quando R3 e R4 e R5 são grupos alquilo ou alquilo substituídos, têm 1 a 3 átomos.

De preferência, pelo menos um de R, R1 e R2 é hidrogénio e pelo menos

O A B um de R , R e R é hidroximetilo. Um ligando particularmente preferido é N-[tris(hidroximetil)metil]glicina, também conhecido por tricina, sendo esta a designação utilizada daqui para a frente. Outros ligandos L desejáveis são aqueles em que R, R e R são todos hidrogénio, R é hidrogénio, metilo ou etilo e R4 e R5 são hidroximetilo ou 2-hidroxietilo; R, R1 e R2 são todos hidrogénio, R3 e R4 são hidrogénio ou metilo e R5 é hidroximetilo ou 2-hidroxietilo. Também são desejáveis ligandos L em que R e R1 são ambos hidrogénio, R2 é metilo, hidroxi, hidroximetilo, carboxi, carboximetilo, 2-carboxietilo, fenilo, benzilo.

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EP 0 569 132/PT 3 1-hidroxietilo ou mercaptometilo e R3, R4 e R5 são todos hidroximetilo; R é hidrogénio, R1 e R2 são ambos metilo e R3 e R4 e R5 são todos hidroximetilo, R é hidroxi, hidroximetilo ou carboximetilo, R1 e R2 são ambos hidrogénio e R3, R4 e R5 são todos hidroximetilo. O invento proporciona ainda um método para a formação do complexo de acordo com o invento, que compreende a redução do ião pertecnetato na presença de um ligando de fórmula geral L. 0 método de acordo com o invento é realizado de forma desejável em solução aquosa, utilizando o ião estanoso, por exemplo cloreto estanoso. É possível utilizar outros sistemas redutores, desde que, no entanto, não haja nenhum efeito adverso significativo na pureza e estabilidade do produto complexo, mas a redução com o ião estanoso é actualmente considerada o melhor método praticável. O método desenvolve-se bem, sob condições geralmente conhecidas e à temperatura ambiente. O invento proporciona também macromoléculas marcadas produzidas a partir de uma macromolécula modificada e do complexo de acordo com o invento. É possível que o ligando L permaneça como co-ligando na macromolécula marcada, mas isso ainda não foi provado.

Exemplos de ligandos com a fórmula L acima incluem ligandos de fórmula

geral I

(HOCH2)2CH-N(R)-C(R1)(R2)-(CH2)n-COOH I em que R, R1, R2, R3 e n são como acima definido, bem como N-[bis(hidroximetil)metil]glicina, daqui para a frente designado por dicina.

Os ligandos de fórmula I podem ser preparados por métodos geralmente disponíveis ao perito na arte da química de síntese, adequadamente por reacção de bis(hidroximetil)metilamina com um derivado ácido funcionalizado, de fórmula geral II

X-C(R1)(R2)-(CH2)n-COOH II

84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ 4 em que R1, R2 e η são como acima definido e X é um grupo reactivo, por exemplo um halogéneo, metil- ou tolueno-sulfonato ou trifluorometilsulfonato, na presença de uma base. 0 invento é mais particularmente descrito nos exemplos a seguir e com referência às figuras anexas, em que A figura 1 é uma comparação da taxa de marcação radioactiva de IgG-SHNH com três complexos Tc-precursor diferentes, à temperatura ambiente, A figura 2 é uma comparação da marcação radioactiva de IgG por dois complexos Tc-precursor a diferentes níveis de actividade específica e A figura 3 é uma comparação da marcação radioactiva de diluições em série de IgG com dois complexos Tc-precursor, em função da actividade específica. A descrição do invento que se segue é de carácter ilustrativo e não limita o invento em nenhuma extensão. EXEMPLO 1 a) Preparação de um estojo de Tricina/SnCI2 liofilizado

Mediram-se 98 ml de água de qualidade cromatográfica (destilada em vidro e filtrada) que foi desoxigenada por fervura e arrefecimento sob árgon, para um frasco de Erlenmeyer de 1 50 ml lavado com ácido, enxaguado e seco, contendo 3,60 g de N-[tris(hidroximetil)metil]glicina (tricina). O pH da solução foi ajustado para 7,1 utilizando aproximadamente 2,3 ml de uma solução NaOH 1N. Selou-se o frasco com um septo estanque ao ar e purgou-se por mais 60 minutos com árgon, através de uma cânula. Preparou-se uma solução de SnCI2-2H20, 50 mg/ml em HCI 0,1 N desoxigenado, sob árgon, e adicionaram-se 80 μΙ à solução de tricina. Transferiu-se um mililitro de solução de tricina/SnCI2 por meio de uma seringa para um recipiente cheio com árgon, rolhado com um rolha septada, congelou-se e liofilizou-se em seguida. Os frascos liofilizados foram rolhados e a rolha comprimida, sob árgon, a fim de se 5 84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ obter uma composição final de 36 mg de tricina e 0,04 mg SnCI2 a pH 7,1. b) Reconstituição de um estojo liofilizado de tricina/SnCI2 QQ__

Formação de Tc-tricina

Insere-se por injecção 1ml de 99mTc04 (20 mCi/ml) num frasco rolhado com uma rolha septada, contendo uma composição liofilizada de tricina/Sncl2 e imediatamente a seguir agita-se vigorosamente até todo o material liofilizado estar dissolvido. Após a dissolução, a amostra de Tc-tricina é deixada durante 15 a 30 minutos à temperatura ambiente antes de análise. A análise para a formação do complexo precursor Tc-tricina é realizada em placas de cromatografia ITLC-SG. Utilizando uma placa de 8 x 1 cm aplicam-se pontualmente 2,5 μΙ de uma amostra da solução de Tc-tricina a 1 cm e faz-se a eluição com solução salina para se obter <1% de Tc-colóide na origem e >99% de Tc-tricina na frente de solvente. Utilizando uma placa de 10 x 1 cm, aplicam-se pontualmente 2,5 μΙ de uma amostra de solução de Tc-tricina a 1 cm e faz-se a eluição com, uma solução 2:1 de acetona:diclorometano para se obter >99% de 99mTc-tricina na origem e < 1 % Tc04' na frente de solvente.

Conjugou-se a imunoglobulina (IgG) (PM = aproximadamente 155 000) com SHNH, de acordo com o Exemplo 9 da EPA 0384 769 e utilizou-se nos testes a seguir descritos. EXEMPLO 2

Mediu-se a taxa de marcação radioactiva de IgG modificada com SHNH, relativamente a três complexos Tc-precursor: Tc-tricina, Tc-gluco-heptonato e Tc-sacarato. Misturaram-se 100 μΙ do Tc-precursor respectivo a 15 mCi/ml, com um volume igual de IgG-SHNH a 4,9 mg/ml e incubou-se durante uma hora à temperatura ambiente. Recolheu-se uma amostra de cada solução aos 1, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos e analisou-se por cromatografia ITLC-SG, utilizando técnicas Standard. Para além disso, misturou-se a Tc-tricina com um volume igual de IgG não modificada, para medir a sua marcação radioactiva não específica à proteína. Os resultados, apresentados na figurai, demonstram claramente que a Tc-tricina marca radioactivamente a proteína, em poucos minutos, a mais de 90%, enquanto que para o Tc-gluco-heptonato é necessária 6 84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ uma hora. Para além disso, a extensão da marcação radioactiva atinge um máximo em trinta minutos para a Tc-tricina versus a Tc-gluco-heptonato, que requer, mais uma vez, uma hora. O Tc-sacarato é claramente o precursor de marcação radioactiva para IgG-SHNH menos eficaz. A Tc-tricina, na ausência de ligantes hidrazino-nicotinamida na proteína, apenas marca radioactivamente a IgG não modificada a um máximo de 4%. Assim, a utilização de tricina na formação do complexo Tc-precursor melhora drasticamente a marcação da IgG modificada, relativamente à utilização de gluco-heptonato. EXEMPLO 3

Mediu-se o rendimento percentual da marcação radioactiva de IgG modificada com SHNH, como função da actividade específica (mCi de 99mTc por mg de proteína) das soluções, relativamente a dois Tc-precursores: Tc-gluco-heptonato, que era o melhor precursor da arte anterior, determinado de acordo com o exemplo 2 acima e Tc-tricina. Prepararam-se duas séries de frascos contendo 100, 50, 20, 10, 5 e 2 μΙ de uma solução de IgG-SHNH (4,9 mg/ml em proteína). Adicionaram-se a cada frasco de uma série 100 μΙ do Tc-precursor respectivo e incubaram-se os frascos a 27°C durante uma hora. Analisaram-se as soluções de teste por cromatografia ITLC-SG, utilizando técnicas Standard. Os resultados, apresentados na figura 2, demonstram >90% de marcação radioactiva da proteína para actividades específicas de Tc-tricina tão elevadas quanto 140 mCi/mg versus Tc-gluco-heptonato, que apresenta um decréscimo drástico na eficiência de marcação radioactiva, quando a actividade específica aumenta acima de 25 mCi/mg. Deste modo, a utilização de Tc-tricina melhora a eficiência de marcação radioactiva de baixas concentrações de proteína. EXEMPLO 4

Mediu-se o rendimento percentual da marcação radioactiva de IgG modificada com SHNH, como uma função da actividade específica (mCi de 99mTc por mg de proteína) de soluções de proteína diluídas, relativamente a dois Tc-precursores: Tc-tricina e Tc-gluco-heptonato. A partir de uma solução-mãe de IgG-SHNH, 4,9 mg/ml em tampão citrato pH 5,2, preparou-se uma solução 10x diluída e uma solução 20x diluída, com tampão citrato. Misturou-se uma 7 84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ amostra de 100 μΙ de cada solução de proteína (a 4,9, 0,49 e 0,25 mg de IgG-SHNH/ml) com um volume igual de solução de Tc-precursor e incubou-se durante uma hora a 37°C. As soluções de teste foram analisadas por cromatografia ITLC/SG utilizando técnicas convencionais. Os resultados, apresentados na figura 3, demonstram que a Tc-tricina, nas condições tampão, continua a marcar radioactivamente a proteína modificada com mais de 90% de eficiência, a actividades específicas mais elevadas do que o Tc-gluco-heptonato. EXEMPLO 5 Síntese de N-[bis(hidroximetil)metillglicina, Dicina

Dissolveram-se serinol (2,5 g, 26 mM), ácido cloroacético (2,41 g, 26 mM) e NaOH (3,2 ml 10N, 52 mM) em 25 ml de água e agitou-se à temperatura ambiente durante 16 h. Concentrou-se a solução num roto-evaporador e redissolveu-se o vidro resultante em metanol. Por adição de acetona obteve-se um sólido branco (2 g, 51 %) que foi recristalizado a partir de metanol/acetato de etilo. Espectro de massa calculado para C5H11N04: 149; encontrado 150 (M + 1); 1H RMN em D20 (75% TMS): 3,85 (m, 4H), 3,80 (s, 2H), 3,45 (m, 1H). EXEMPLO 6 Síntese de N-hidroxietilglicina, Monocina

Agitou-se 1,0 g de ácido glicólico (10,85 mmol), 0,83 ml de etanolamina (13,85 mmol) e 0,34 g de cianoboro-hidreto de sódio (5 mmol) em metanol à temperatura ambiente, durante 48 horas. Adicionou-se lentamente 1,0 ml de HCI 12N (10,85 mmol) à solução, que foi concentrada num roto-evaporador. Por adição de etanol absoluto com agitação rápida obteve-se um sólido branco que foi recolhido numa frita e seco sob vácuo. Espectro de massa FAB calculado para C4H9N03: 119; encontrado: 142 (m + Na), 164 (m + 2Na); 1H RMN em D20: 3,85 (t, 5, 2H), 3,67 (s, 2H), 3,23 (t, 5, 2H) EXEMPLO 7 Síntese de N-[tris(hidroximetil)metil]alanina, Metiltricina

Dissolveram-se 2,5 g de ácido 2-bromopropiónico (16,4 mmol) e 1,6 ml 8 84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ de NaOH 10Ν (16,4 mmol) em 25 ml de água e adicionaram-se 1,98 g de N-[tris(hidroximetil)metil]amina (16,4 mmol), com agitação. Agitou-se a solução a 80°C durante 6 horas e, durante esse tempo, adicionaram-se, gota a gota, 16 ml de NaOH 1N. Removeu-se o solvente por roto-evaporação e o vidro resultante foi seco durante a noite sob vácuo. Espectro de massa calculado para C7H15N05: 193; encontrado: 194 (m + 1), 216 (m + Na); ’H RMN em D20: 3,66 (q, 7, 1H), 3,21 (s, 6H), 1,13 (d, 7, 3H). EXEMPLO 8 Síntese de N-[tris(hidroximetil)metil]-p-alanina (β-Metiltricina)

Agitou-se 1,0 g de Tris (8,26 mM) e 1,0 ml de acrilonitrilo (16 mM) em metanol a 70°C durante 48 horas. Removeu-se o solvente num roto-evaporador e adicionou-se etanol absoluto ao vidro resultante. 0 Tris que não reagiu e que precipitou a partir da solução foi filtrado e as águas-mães foram filtradas através de uma rolha curta de sílica gel. Por concentração da solução obteve-se um sólido cristalino branco A (0,86 g, 60%). 1H RMN; 3,58 (s, 6H), 2,96 (t, 7, 2H), 2,65 (t, 7, 2H).

Manteve-se em refluxo 0,25 g de A (14 mM) em HCI concentrado durante 16 horas. Removeu-se o solvente num roto-evaporador e o resíduo resultante foi seco durante a noite sob vácuo a 80°C. A solução foi evaporada num roto-evaporador para originar um sólido esbranquiçado, cloreto de amónio de N-[tris(hidroximetil)metil]-p-alanina. EXEMPLO 9

Preparação da solução de Tc- L precursor

Preparou-se uma solução aquosa de ligando L precursor, e.g. tricina, a 72 mg/ml em água desoxigenada, isenta de metais. A solução-mãe de precursor foi ajustada para pH 7,1 com solução NaOH 1N. Preparou-se uma segunda solução-mãe de Sncl2-2H20, 10 mg/ml em HCI 0,1 Ne adicionou-se à solução-mãe de precursor, para perfazer 100 pg/ml em Sncl2-2H20. A solução de precursor/SnCI2 foi misturada em proporções iguais com 99mTc04' (30 mCi/ml). Após alguns minutos à temperatura ambiente, realizou-se uma

84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ 9 análise da formação do complexo de Tc-ligando precursor em placas de cromatografia ITLG-SG. Utilizando uma placa de 8x1 cm aplica-se pontualmente uma amostra de 2,5 μΙ da solução de Tc-precursor a 1 cm e faz-se a eluição com solução salina para se obter Tc-colóide na origem e complexo Tc-precursor na frente de solvente. Utilizando uma placa de 10x1 cm, aplica-se pontualmente uma amostra de 2,5 μΙ de solução de Tc-precursor a 1 cm e faz-se a eluição com metiletilcetona ou com uma solução de acetonardiclorometano 2:1, para se obter o Tc-precursor na origem e o "mTc04‘ na frente de solvente.

Os resultados apresentados na tabela 1 como rendimento em percentagem de espécies de tecnécio em solução mostram claramente que este método é geral para os complexos de tecnécio de ligandos L, exemplificados nos Exemplos 1, 5, 6 e 7. As substituições funcionais no grupo tris(hidroximetil)metilo, ou na glicina, originam ainda uma formação quantitativa do complexo Tc-precursor em poucos minutos, à temperatura ambiente. Estas soluções são adequadas para a marcação de proteínas sem posteriores modificações. EXEMPLO 10

Marcação radioactiva de IgG modificada com SHNH com Tc-L precursores A eficácia da marcação radioactiva de IgG modificada com SHNH (grupos hidrazino-nicotinamida, como descrito na EPA 0384769) foi medida relativamente aos complexos Tc-precursor, como no Exemplo 9 acima. Misturaram-se 100 μΙ do Tc-precursor respectivo a 15 mCi/ml, com um volume igual de IgG-SHNH, 4,9 mg/ml em tampão citrato 20 mM, NaCI 100 mM, pH 5,2 e incubou-se durante uma hora à temperatura ambiente. Recolheram-se amostras da solução a 60 minutos e analisou-se por cromatografia em camada fina utilizando placas ITLC-SG, 1 x 8 cm e solução salina como eluente. A IgG-SHNH marcada com Tc adere à origem da placa e os Tc-precursores, bem como o "mTc04 eluem na frente de solvente.

Os resultados, apresentados na tabela 1, como rendimento em percentagem de Tc-lgG-SHNH (e corrigidos para Tc-colóide), demonstram claramente que os Tc-precursores formulados a partir de análogos poli-hidroxi do ligando L marcam radioactivamente de forma quantitativa a IgG-SHNH. 10 84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ

Adicionalmente, a modificação com alquilo de glicina no ligando L para alanina, como exemplificado na metiltricina, ainda produz marcação radioactiva quantitativa de IgG-SHNH, embora a eficiência seja menor à temperatura ambiente. Demonstra-se, assim, a utilização geral de análogos poli-hidroxiaminoácidos do ligando L para a formação de complexos Tc-precursor e subsequente marcação radioactiva de proteínas modificadas com SHNH. TABELA 1

Formação de complexos Tc-precursor e marcação radioactiva de IgG-SHNH

Rendimento em % de Rendimento em % de

espécies de tecnécio em Tc-lgG-SHNH solução

Amostra Tc-precursor Tc-colóide TcCU 12,5 mCi/mg Tc-tricina 98,5 0,2 1,3 97,4 Tc-Metiltricina 94,9 0,8 4,3 90,1 Tc-dicina 99,3 0,1 0,6 98,9 Tc-Monocina 84,1 13,9 2 73,3 Tc-p-Metiltricina 57,6 18,2 24,2 75,4* * > 60min

Lisboa, 22. MÂI 20UU

Por AnorMED Inc. O AGENTE OFICIAL

6/ ANTÓNIO JOÂO CUNHA FERREIRA Ág. Of. Pr. Ind. das Flores, 74 - 4.® i LISBOA I

Claims

84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Complexo de 99mTc com o ligando L, (R3)(R4)(R5)C-N(R)-C(R1)(R2)-(CH2)n-COOH L em que R é hidrogénio, hidroxilo, alquilo, hidroxialquilo, ou alquilcarboxi ou R e R1 em conjunto, podem formar um radical mono-, di-, tri- ou tetra-metileno, ou R e R2 em conjunto podem formar um radical mono-, di-, tri- ou tetra-metileno, e R1 e R2 podem ser iguais ou diferentes e são seleccionados a partir de hidrogénio, hidroxi, alquilo substituído ou não substituído, hidroxialquilo, carboxi, carboxialquilo, aminoalquilo, tioalquilo, arilo ou R1 e R2 em conjunto podem formar um radical tetra ou penta-metileno e R3 e R4 e R5 podem ser iguais ou diferentes e são seleccionados a partir de hidrogénio, hidroxi, alquilo substituído ou não substituído, hidroxialquilo, carboxi, carboxialquilo, desde que pelo menos um de R3, R4 e R5 seja hidroxialquilo, e n é igual a 0, 1 ou 2.
2. Complexo de acordo com a reivindicação 1, em que no ligando, pelo menos um de R, R1 e R2 é hidrogénio.
3. Complexo de acordo com a reivindicação 2 em que no ligando pelo menos dois de R, R1 e R2 são hidrogénio.
4. Complexo de acordo com a reivindicação 1, em que no ligando pelo menos um de R3, R4 e R5 é hidroximetilo.
5. Complexo de acordo com a reivindicação 1 em que o ligando L é tricina.
6. Complexo de acordo com a reivindicação 1, em que o ligando L é monocina 84 084 ΕΡ 0 569 132/ΡΤ 2/2
7. Complexo de acordo com a reivindicação 1, em que o ligando L é dicina
8. Complexo de acordo com a reivindicação 1, em que o ligando L é metiltricina
9. Método para formar um complexo de acordo com a reivindicação 1, que compreende a redução do ião pertecnetato na presença de um ligando de fórmula geral L.
10. Macromolécula marcada radioactivamente que compreende o produto de uma macromolécula modificada com um complexo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8.
11. Macromolécula marcada radioactivamente de acordo com a reivindicação 10, em que a macromolécula modificada é um conjugado da macromolécula e um composto com pelo menos um grupo hidrazina ou hidrazida livres.
12. Utilização de um ligando de fórmula L como definido na reivindicação 1, para a formação de complexos com radioisótopos. Lisboa, 22. MÂI 2080 Por AnorMED Inc. - 0 AGENTE OFICIAL -

ENG.* ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Ru· das Flores, 74 - 4,f\ 1ΒΘΟ L I S B O.A l