PT2841578T - Resumo - Google Patents

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PT2841578T
PT2841578T PT137206173T PT13720617T PT2841578T PT 2841578 T PT2841578 T PT 2841578T PT 137206173 T PT137206173 T PT 137206173T PT 13720617 T PT13720617 T PT 13720617T PT 2841578 T PT2841578 T PT 2841578T
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misc
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oligonucleotide
nucleotides
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PT137206173T
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Christian De Visser Peter
Allegonda Maria Mulders Susan
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Biomarin Tech Bv
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Description

DESCRIÇÃO
OLIGONUCLEÓTIDOS MODULADORES DE ARN COM CARACTERÍSTICAS MELHORADAS PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS NEUROMUSCULARES
Campo da invenção O invento refere-se ao campo da genética humana, mais especificamente distúrbios neuromusculares. A invenção, em particular, refere-se à utilização de oligonucleótidos anti-sentido (AONs) com caracteristicas melhoradas que aumentam a aplicabilidade clinica como aqui definido adicionalmente.
Antecedentes da invenção
As doenças neuromusculares são caracterizadas pelo comprometimento do funcionamento dos músculos devido à patologia muscular ou nervosa (miopatias e neuropatias). As neuropatias são caracterizadas por neurodegeneração e comprometimento do controlo nervoso levando a problemas de movimento, espasticidade ou paralisia. Exemplos incluem a doença de Huntington (HD), vários tipos de ataxia espinocerebelosa (SCA), ataxia de Friedreich (FA), esclerose lateral amiotrófica (ALS) e demência fronto temporal (FTD). Um subconjunto de neuropatias é causado por uma instabilidade repetida do elemento-cis. Por exemplo, o HD é causado por um triplete (CAG)n repete a expansão no exão 1 do gene HTT. A expansão dessas repetições resulta na expansão de um alongamento de glutamina na extremidade N-terminal da proteína citoplasmática de huntingta de 348 kDa. Huntingtin tem uma sequência característica de 6 a 29 resíduos de aminoácidos de glutamina na forma normal; o huntingtin mutante que causa a doença possui mais de 38 resíduos. A expressão contínua de moléculas de huntingtina mutante em células neuronais resulta na formação de grandes depósitos de proteínas que acabam por originar a morte celular, especialmente nos lobos frontais e nos gânglios basais (principalmente no núcleo caudado). A gravidade da doença é geralmente proporcional ao número de resíduos adicionais. AONs especificamente visando as repetições CAG expandidas (como PS57 (CUG)7 como um 2'-0-metil fosforotioato ARN; SEQ ID NO: 1 Evers et al. ) Podem ser aplicados para reduzir efetivamente a transcrição de ctintinas mutantes e os níveis de proteína (tóxicos) em células derivadas do paciente com HD. Para o tratamento de neuropatias, os AONs administrados sistemicamente precisam de passar pela barreira hematoencefálica. Assim, existe uma necessidade de otimização da oligoterquímica permitindo e/ou exibindo uma entrega cerebral melhorada.
As miopatias incluem distrofias musculares genéticas que são caracterizadas por fraqueza progressiva e degeneração do músculo esquelético, cardíaco e/ou liso.
Exemplos de miopatias são distrofia muscular de Duchenne (DMD), distrofia miotônica tipo 1 (DM1) e distrofia miotônica tipo 2 (DM2). DM1 e DM2 são também ambos causados pela instabilidade repetida do elemento-cis; DM1 por um trinucleótido (CTG)n expansão repetida na região 3' não traduzida do exão 15 no gene DMPK e DM2 por um tetranucleótido (CCTG)n repetir a expansão no gene DM2/ZNF9. Também aqui, os AONs direcionados especificamente às repetições expandidas, como PS58, (CAG)7, um 2'-O-metil de f osf orotioato de RNA para DM1 (Mulders et al.) demonstrou induzir de forma eficiente a degradação específica dos transcritos repetidos expandidos (tóxicos). Em contraste com a DMD, onde o defeito do gene está associado a uma maior permeabilidade das membranas de fibras musculares para compostos pequenos como AONs, para a maioria das outras miopatias, uma distribuição de AON aumentada e absorção pelo tecido muscular é essencial para obter um efeito terapêutico. Assim, também aqui há uma necessidade de otimização da oligoterquímica permitindo e/ou exibindo uma libertação muscular melhorada.
As caracteristicas particulares de uma química escolhida, pelo menos em parte, afetam a entrega de um AON para a transcrição alvo: via de administração, bioestabilidade, biodistribuição, distribuição intra-tecido e absorção celular e tráfico. Além disso, uma otimização adicional da química de oligonucleótidos é concebida para aumentar a afinidade e a estabilidade de ligação, aumentar a atividade, melhorar a segurança e/ou reduzir o custo dos bens, reduzindo o comprimento ou melhorando os procedimentos de síntese e/ou purificação. Múltiplas modificações químicas tornaram-se geralmente e/ou comercialmente disponíveis para a comunidade de pesquisa (como 2'-0-metilo ARN e pirimidinas 5-substituídas e 2,6-diaminopurinas) , enquanto a maioria dos outros ainda apresentam esforço sintético significativo para obter. Os resultados incentivadores especialmente preliminares foram obtidos usando 2'-0-metil fosforotioato contendo modificações nas bases de pirimidina e purina como aqui identificado.
Em conclusão, para melhorar a aplicabilidade terapêutica de AONs para o tratamento de distúrbios genéticos associados à instabilidade repetida dos elementos cis humanos, como aqui exemplificado, existe uma necessidade de AONs com outras caracteristicas melhoradas.
Descrição
Oligonucleótido
Num primeiro aspecto, a divulgação proporciona um oligonucleótido compreendendo 2'-O-metilo RNA de resíduos de nucleótidos, possuindo um esqueleto em que pelo menos uma porção de fosfato é substituída por uma porção de fosforotioato e que compreende uma ou mais 5- metilpirimidina e/ou uma ou mais bases de 2,6- diaminopurina; ou um oligonucleótido da invenção que consiste em 2'-0-metil RNA de resíduos de nucleótidos e tendo um esqueleto em que todas as porções de fosfato são substituídas por porções de fosforotioato e possuindo uma sequência de bases consistindo em (XYG)7 em que cada X é 5-metilcitosina e cada Y é uracilo (SEQ ID NO:70), de preferência para utilização como um medicamento para o tratamento de desordens genéticas associadas à instabilidade repetida do elemento-cis humano.
Neste contexto, o "esqueleto" é usado para identificar a cadeia de anéis da ribose alternada e as ligações internucleósidas, às quais as nucleobases estão ligadas. 0 termo "ligação" é utilizado para a ligação entre duas unidades de ribose (isto é, "ligação internucleósida") , que é geralmente uma fração de fosfato. Assim, um oligonucleótido com 10 nucleótidos pode conter 9 ligações, ligando as 10 unidades de ribose juntas. Além disso, podem haver uma ou mais ligação (ões) presentes num ou em ambos os lados do oligonucleótido, que está apenas conectado a um nucleótido. Os termos "ligação" e "ligação internucleosídica" também devem significar tal ligação pendente. Pelo menos uma das ligações na espinha dorsal do oligonucleótido de acordo com a descrição que consiste numa porção de fosforotioato, ligando duas unidades da ribose.
Assim, pelo menos uma das porções de fosfodiéster de 3' a 5' de ocorrência natural presentes no RNA é substituída por uma porção de fosforotioato. Dentro do contexto da divulgação e da invenção, "um" em cada uma das seguintes expressões significa "pelo menos um": a 2'-O-metilo de nucleótido de ARN residual, um 2'-O-metilo residual de ARN de uma fração de fosforotioato, um 2'-O-metilo residual de RNA de metilfosforoato, uma base de 5-metilpirimidina, uma base de 5-metilcitosina, uma base de 5-metiluracilo, uma base de timina, uma base de 2,6-diaminopurina.
De preferência, o oligonucleótido de acordo com a descrição é um oligonucleótido com menos de 37 nucleótidos. 0 referido oligonucleótido pode ter 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Cada oligonucleótido também pode ser identificado como um oligonucleótido com 12 a 36 nucleótidos. Consequentemente, um oligonucleótido da descrição, compreendendo um resíduo de nucleótido de ARN de 2'-O-metilo com um esqueleto em que pelo menos uma porção de fosfato é substituída por uma fração fosforotioato, compreende menos de 37 nucleótidos (isto é, compreende 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos) e uma base de 5-metilpirimidina e/ou 2,6-diaminopurina. Consequentemente, um oligonucleótido da invenção, consistindo em resíduos de nucleótidos de ARN de 2'-0-metilo e tendo um esqueleto em que todas as porções de fosfato são substituídas por fosforotioato e compreende menos de 34 nucleótidos (isto é, compreende 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos) e uma base de 5-metilpirimidina e/ou 2,6-diaminopurina.
Numa forma de realização preferida, o oligonucleótido da descrição compreende resíduo de nucleótido de ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo ou consiste em resíduos nucleotídeo de ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo. Tal oligonucleótido compreende um 2'-O-metilo de resíduo de ARN, que está ligado através de uma ligação de fosforotioato ao próximo nucleótido na sequência. Este próximo nucleotídeo pode ser, mas não necessariamente, outro 2'-O-metilo de resíduo de nucleótido de ARN de fosforotioato. Alternativamente, esse oligonucleótido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo de resíduos de nucleótidos de ARN, em que todos os nucleítidos compreendem um 2'-O-metilo e uma porção de fosforotioato. De preferência, esse oligonucleótido consiste em 2'-O-metilo de fosforotioato de ARN nucleotídeo de resíduos. Essa química é conhecida pelo especialista. Ao longo da aplicação, um oligonucleótido compreendendo um 2'0 resíduo de ARN de metilo e uma ligação de f osf orotioato podem ser substituídos por um oligonucleótido compreendendo um 2'-0-metilo de resíduo de nucleótido de ARN de metil fosforotioato ou um oligonucleótido compreendendo um resíduo de 2'-0-metil fosforotioato de resíduo de ARN. Ao longo da aplicação, um oligonucleótido constituído por 2'-O-metil ARN de resíduos ligados ou ligados através de ligações fosforotioato ou um oligonucleótido constituído por 2'-O-metilo fosforotioato de resíduos de nucleótidos de ARN podem ser substituídos por um oligonucleótido constituído por ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo.
Além disso, um oligonucleótido da invenção compreende pelo menos uma modificação de base que aumenta a afinidade da ligação às cadeias alvo, aumenta a temperatura de fusão do duplex resultante do referido oligonucleótido com o seu alvo, e/ou diminui os efeitos imunoestimuladores e/ou aumenta a bioestabilidade e/ou melhora a biodistribuição e/ou a distribuição intra-tecido, e/ou a absorção celular e o tráfico. Numa forma de realização, um oligonucleótido da invenção compreende uma base de 5-metilpirimidina e/ou 2,6-diaminopurina. Uma base de 5-metilpirimidina é seleccionada de uma 5-metilcitosina e/ou uma 5-metiluracilo e/ou uma timina, na qual a timina é idêntica ao 5-metiluracilo. Quando um oligonucleótido da descrição tem duas ou mais dessas modificações de base, as referidas modificações de base podem ser idênticas, por exemplo, todas as bases modificadas no oligonucleótido são a 5-metilcitosina, ou as referidas modificações de base podem ser combinações de diferentes modificações de base, por exemplo, o oligonucleótido pode ter uma ou mais 5-metilcitosinas e um ou mais 5-metiluracilos.
Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido da descrição (isto é, um oligonucleótido compreendendo 2'-0-metil de resíduos de nucleótidos de ARN, possuindo um esqueleto em que pelo menos uma porção de fosfato é substituída por uma porção de fosforotioato e que compreende uma ou mais 5-metilpirimidina e/ou uma ou mais bases de 2,6-diaminopurina; ou um oligonucleótido da invenção que consiste em 2'-0-metilo de resíduos de nucleótidos de ARN e possuindo um esqueleto em que todas as porções de fosfato são substituídas por porções de fosforotioato e compreendendo uma ou mais 5-metilpirimidina e/ou uma ou mais bases de 2,6-diaminopurina) é tal que não compreende um 2'-deoxi 2’-fluoro-nucleotídeo (isto é, 2'-desoxi 2'-fluoro-adenosina, -guanosina, - uridina e/ou -citidina). Esse oligonucleótido compreendendo um nucleótido 2'-flúor (2'-F) mostrou ser capaz de recrutar o fator 2 e 3 de ligação do intensificador de interleucina (ILF2/3) e é assim capaz de induzir saltos de exões no pré-ARNM (Rigo F, et al, W02011/097614) . Na presente invenção, o oligonucleótido utilizado de preferência não recruta tais factores e/ou o oligonucleótido da invenção não forma heterodúplex com ARN que são especificamente reconhecidos pela ILF2/3. O mecanismo de acção do oligonucleótido da presente invenção é considerado distinto do de um oligonucleótido com um nucleótido 2'-F: espera-se que o oligonucleótido da invenção induza principalmente a degradação especifica das transcrições da repetição expandida (tóxica). 'Timina' e '5-metiluracilo' podem ser trocados ao longo de todo o documento. Por analogia, a 2,6-diaminopurina é idêntica à 2-aminoadenina e estes termos podem ser trocados ao longo de todo o documento. O termo "modificação de base" ou "base modificada" como aqui identificado refere-se à modificação de uma base de ocorrência natural no ARN (isto é, pirimidina ou base de purina) ou à síntese de novo de uma base. Esta nova base sintetizada pode ser qualificada como "modificada" em comparação com uma base já existente.
Um oligonucleótido compreende uma base de 5-metilcitosina e/ou 5-metiluracilo e/ou 2,6-diaminopurina significa que pelo menos uma das nucleobases de citosina do referido oligonucleótido foi modificada por substituição do protão na posição-5 do anel de pirimidina com um grupo metilo (isto é, uma 5-metilcitosina) e/ou que pelo menos uma das nucleobases de uracilo do referido oligonucleótido foi modificada por substituição do protão na posição 5 do anel pirimidina com um grupo metilo (isto é, um 5-metiluracilo) e/ou que pelo menos uma das nucleobases de adenina do referido oligonucleótido foi modificada por substituição do protão na posição 2 com um grupo amino (isto é, uma 2,6-diaminopurina) , respectivamente. Neste contexto, a expressão "a substituição de um protão por um grupo metilo na posição 5 do anel de pirimidina" pode ser substituída pela expressão "a substituição de uma pirimidina por uma 5-metilpirimidina", com pirimidina referindo apenas uracilo, citosina ou ambos. Do mesmo modo, a expressão "a substituição de um protão por um grupo amino na posição 2 de adenina" pode ser substituída pela expressão "a substituição de uma adenina por uma 2,6-diaminopurina."Se o referido oligonucleótido compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais citosinas, uraciles e/ou adeninas, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais citosinas, uracimas e/ou adeninas, respectivamente, foram modificadas dessa maneira. De preferência, todas as citosinas, uraciles e/ou adeninas foram modificadas desta forma ou substituídas por 5-metilcitosina, 5-metiluracilo e/ou 2,6-diaminopurina, respectivamente. Não é necessário dizer que os AONs da divulgação e da invenção só podem ser aplicados a oligonucleótidos compreendendo pelo menos uma citosina, uracilo ou adenina, respectivamente, na sua sequência.
Descobrimos que a presença de uma 5-metilcitosina, 5-metiluracilo e/ou uma 2,6-diaminopurina num oligonucleótido da invenção tem um efeito positivo em pelo menos um dos parâmetros ou uma melhoria de pelo menos um dos parâmetros do referido oligonucleótidos. Neste contexto, os parâmetros podem incluir: afinidade e/ou cinética de ligação, actividade de silenciamento, biostabilidade, distribuição (intra-tecido), absorção e/ou tráfico celular e/ou imunogenicidade do referido oligonucleótido, como explicado abaixo. A afinidade e cinética de ligação dependem das propriedades termodinâmicas da AON. Estas são, pelo menos em parte, determinadas pela temperatura de fusão do referido oligonucleótido (Tm; calculado com, por exemplo, o calculador de propriedades de oligonucleótidos (http://www.une.edu/-cail/biotool/oligo/index.html ou http://eu .idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) para ARN de cadeia simples usando o Tm básico e o modelo vizinho mais próximo) e/ou a energia livre do complexo de exon de oligonucleótido-alvo (usando a estrutura de ARN versão 4.5 ou ARN mfold versão 3.5). Se um Tm for aumentado, a atividade de ignorar do exão geralmente aumenta, mas quando um Tm é muito alto, espera-se que o AON se torne menos especifico da sequência. Um Tm aceitável e energia livre dependem da sequência do oligonucleótido. Portanto, é difícil fornecer intervalos preferidos para cada um desses parâmetros.
Uma actividade de um oligonucleótido da divulgação e invenção é inibir a formação de uma proteína mutante e/ou silenciar ou reduzir ou diminuir a quantidade de um transtorno associado à doença ou causador de doença ou mutante contendo um número prolongado ou instável de repetições numa célula de um paciente, em um tecido de um paciente e/ou em um paciente como explicado mais adiante. Um oligonucleótido compreendendo ou consistindo num fosforotioato de 2'-0-metilo e uma base de 5-metilcitosina e/ou 5-metiluracilo e/ou 2,6-diaminopurina deverá poder silenciar ou reduzir ou diminuir a quantidade da referida transcrição da forma mais eficiente do que o que um oligonucleótido compreende ou consistindo de um fosforotioato de 2'-0-metilo, mas sem qualquer 5- metilcitosina, sem qualquer 5-metiluracilo e sem qualquer base de 2,6-diaminopurina. Esta diferença em termos de eficiência pode ser de pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%. A redução ou diminuição pode ser avaliada por Northern Blotting ou RT-PCR (semi-quantitativa) para níveis transcritos (de preferência, como realizada na parte experimental) ou por Western blotting para níveis de proteína. Um oligonucleótido pode primeiro ser testado no sistema celular como fibroblastos derivados do doente como descrito no Exemplo 1. A biodistribuição e a biossibilidade são de preferência, pelo menos em parte, determinadas por um ensaio de ligação de hibridação validado, adaptado de Yu et ai., 2002. Numa forma de realização, as amostras de tecido plasmático ou homogeneizadas são incubadas com uma sonda de oligonucleótido de captura específica. Após a separação, um oligonucleótido marcado com DIG é ligado ao complexo e a detecção seguida utilizando uma peroxidase ligada a anticorpos anti-DIG. A análise farmacocinética não compartimentai é realizada usando o pacote de software WINNONLIN (modelo 200, versão 5.2, Pharsight, Mountainview, CA). Os níveis de AON (ug) por mL de plasma ou mg de tecido são monitorizados ao longo do tempo para avaliar a área sob a curva (AUC) , a concentração máxima (Cmáx) , tempo até a concentração máxima (Tm^x) , semi-vida terminal e tempo de atraso de absorção (tAtraso) · Um tal ensaio preferido foi divulgado na parte experimental.
Os AONs podem estimular uma resposta imune inata ativando os receptores Toll-like (TLR), incluindo TLR9 e TLR7 (Krieg et ai., 1995) . A ativação do TLR9 geralmente ocorre devido à presença de sequências de CG não metiladas presentes em oligodesoxinucleótidos (ODNs), imitando ADN bacteriano que ativa o sistema imune inato através da liberação de citoquinas mediada por TLR9. No entanto a modificação de 2'-O-metilo, é sugerida para reduzir acentuadamente esse possível efeito. TLR7 foi descrito para reconhecer repetições de uracilo em ARN (Diebold et ai., 2006). A ativação de TLR9 e TLR7 resulta num conjunto de respostas imunes coordenadas que incluem imunidade inata (macrófagos, células dendríticas (DC) e células NK) (Krieg et ai., 1995; Krieg, 2000). Várias quimioterapias e citoquinas, como IP-10, TNFa, IL-6, MCP-1 e IFNa (Wagner, 1999; Popovic et ai., 2006) foram implicadas neste processo. As citoquinas inflamatórias atraem células defensivas adicionais do sangue, como células T e B. Os níveis dessas citoquinas podem ser investigados por teste in vitro. Em suma, ο sangue total humano é incubado com concentrações crescentes de AONs, após o que os níveis das citoquinas são determinados por kits ELISA comercialmente disponíveis. Uma diminuição da imunogenicidade corresponde de preferência a uma diminuição detectável da concentração de pelo menos uma das citoquinas mencionadas acima em comparação com a concentração de citoquina correspondente num ensaio numa célula tratada com um oligonucleótido compreendendo pelo menos uma 5-metilcitosina e/ou 5-metiluracilo e/ou 2,6-diaminopurina em comparação com uma célula tratada com um oligonucleótido correspondente que não possui 5-metilcitosinas, 5-metiluracilos ou 2,6-diaminopurinas.
Consequentemente, um oligonucleótido preferido da invenção tem um parâmetro melhorado, tal como uma imunogenicidade aceitável ou diminuída e/ou uma melhor biodistribuição e/ou uma cinética de ligação de ARN aceitável ou melhorada e/ou propriedades termodinâmicas em comparação com um oligonucleótido correspondente constituído por um 2'-0-metil f osf orotioato de ARN sem 5-metilcitosina, sem 5- metiluracilo e sem 2,6-diaminopurina. Cada um destes parâmetros poderia ser avaliado utilizando ensaios conhecidos do especialista na técnica ou de preferência como aqui divulgado.
Abaixo, outras químicas e modificações do oligonucleótido da divulgação são definidas. Estas químicas e modificações adicionais podem estar presentes em combinação com a química já definida para o referido oligonucleótido, i.e. a presença de uma 5-metilcitosina, um 5-metiluracilo e/ou uma 2,6-diaminopurina e o oligonucleótido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo.
Um oligonucleótido preferido da invenção compreende ou consiste numa molécula de ARN ou numa molécula de ARN modificada. Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido é de cadeia simples. 0 técnico especializado compreenderá que, no entanto, é possível que um único oligonucleótido troncocalizado possa formar uma estrutura interna de cadeia dupla. No entanto, este oligonucleótido ainda é chamado de um oligonucleótido de cadeia simples no contexto desta invenção. Um oligonucleótido de cadeia simples tem várias vantagens em comparação com um oligonucleótido de siARN de cadeia dupla: (i) espera-se que a sua síntese seja mais fácil do que duas cadeias complementares de siRNA; (ii) há uma gama mais ampla de modificações químicas possíveis para aumentar a absorção em células, uma melhor estabilidade (fisiológica) e para diminuir potenciais efeitos adversos genéricos; (iii) os siRNAs têm maior potencial para efeitos não específicos (incluindo genes fora do alvo) e farmacologia exagerada (por exemplo, menor controlo possível de eficácia e seletividade por esquema ou dose do tratamento) e (iv) siRNAs são menos propensos a atuar no núcleo e não podem ser direcionados contra intrões.
Além das modificações descritas acima, o oligonucleótido da descrição pode compreender modificações adicionais, tais como diferentes tipos de resíduos de nucleótidos de ácido nucleico ou nucleótidos como abaixo descrito. Diferentes tipos de resíduos de nucleótidos de ácido nucleico podem ser utilizados para gerar um oligonucleótido da divulgação. 0 referido oligonucleótido pode ter pelo menos uma modificação de estrutura principal (ligação de internucleósido e/ou modificação de açúcar) e/ou pelo menos uma modificação de base em comparação com um oligonucleótido baseado em ARN.
Uma modificação de base inclui uma versão modificada das bases naturais de purina e pirimidina (por exemplo, adenina, uracilo, guanina, citosina e timina), tais como hipoxantina (por exemplo, inosina), ácido orótico, agmatidina, lisidina, pseudouracilo, 2-tiopirimidina (exemplo 2-tiouracilo, 2tiotemaína), G-clamp e seus derivados, pirimidina 5-substituída (e.g. 5-halouracilo, 5-propiniluracilo, 5-propinilcitosina, 5-aminometiluracilo, 5-hidroximetiluracilo, 5-aminometilcitosina, 5-hidroximetilcitosina, Super T) , 7-deazaguanina, 7-desazaadenina, 7-aza-2,6-diaminopurina, 8-aza-7-deazaguanina, 8-aza-7-desazaadenina, 8-aza-7-deaza-2,6-Diaminopurina, Super G, Super A e N4-etil citosina, ou seus derivados; iú2-ciclopentilguanina (cPent-G) , N2-ciclopentil-2-aminopurina (cPent-AP) e iú2-propil-2-aminopurina (Pr-AP) , ou seus derivados; e bases degeneradas ou universais, como 2,6-difluorotolueno ou bases ausentes como sites abásicos (por exemplo. 1-desoxirribose, 1,2-didesoxirribose, 1-desoxi-2-O-metilribose; ou derivados de pirrolidina em que o oxigénio do anel foi substituído por nitrogénio (azaribose)). Exemplos de derivados de Super A, Super G e Super T podem ser encontrados patente 6,683,173 (Epoch Biosciences), que é incorporado aqui inteiramente por referência. CPent-G, cPent-AP e Pr-AP mostraram reduzir os efeitos imunoestimuladores quando incorporados no siRNA (Peacock H. Et al.) . Numa forma de realização, um oligonucleótido da descrição compreende um local abásico ou um monómero abásico. No contexto da divulgação, tal monómero pode ser chamado de um local abásico ou um monómero abásico. Um monómero abásico ou um local abássico é um resíduo de nucleótido ou bloco de construção que não possui uma nucleobase em comparação com um resíduo de nucleótido correspondente que compreende uma nucleobase. Dentro da realização, um monómero abásico é, portanto, um bloco de construção parte de um oligonucleótido mas que não possui uma nucleobase. Tal monómero abásico pode estar presente ou ligado ou conjugado a um terminal livre de um oligonucleótido.
Numa forma de realização mais preferida, um oligonucleótido da descrição compreende 1-10 ou mais monómeros abásicos. Por conseguinte, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais monómeros abásicos podem estar presentes num oligonucleótido. Um monómero abásico pode ser de qualquer tipo conhecido e concebível pelo especialista na matéria, exemplos não limitativos dos quais estão representados abaixo:
Aqui, Ri e R2 são independentemente H, um oligonucleótido ou outro/outros local/locais abásicos, desde que nem ambos Ri R2 são H e Ri e R2 não são ambos um oligonucleótido. Um/uns monómero(s) abásico(s) pode(m) ser anexado(s) a um ou a ambos os terminais do oligonucleótido conforme especificado anteriormente. Deve notar-se que um oligonucleótido ligado a um ou dois sitio(s) abásico(s) ou monómero(s) abásico(s) pode(m) compreender menos de 12 nucleótidos. A este respeito, o oligonucleótido de acordo com a descrição pode compreender pelo menos 12 nucleótidos, incluindo opcionalmente um ou mais locais abásicos ou monómeros abásicos em uma ou ambas as extremidades. Na lista de sequências, um oligonucleótido da descrição que compreende um monómero abásico pode ser representado pela sua sequência nucleotidica ou base; o monómero abásico não está representado, uma vez que pode ser considerado como ligado ou ligado ou conjugado a um terminal livre de um oligonucleótido. Este é o caso das sequências básicas SEQ ID NO: 107 e 108. Na tabela 2, é proporcionada a sequência completa de oligonucleótidos preferidos compreendendo SEQ ID NO: 107 ou 108: tal oligonucleótido compreende SEQ ID NO: 107 ou 108 e 4 monómeros abásicos no terminal 3' da SEQ ID NO: 107 ou 108. SEQ ID NO: 220 e 221 correspondem a SEQ ID NO: 107 e 108 compreendendo ainda 4 monómeros abásicos adicionais no terminal 3' do oligonucleótido.
Quando um monómero abásico está presente dentro de uma sequência de bases de um oligonucleótido, o referido monómero abásico é identificado na lista de sequências como parte da sequência do referido oligonucleótido como nas SEQ ID NO: 210 e 213. Nas tabelas 1 e 2, um monómero abásico é identificado usando a letra Q.
Dependendo do seu comprimento, um oligonucleótido da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 modificações de base. É também abrangida pela divulgação para introduzir mais de uma modificação de base distinta no referido oligonucleótido.
Uma "modificação do açúcar" indica a presença de uma versão modificada da fração ribossilo como ocorrendo naturalmente no ARN (isto é, a fração furanosilo), tal como açúcares biciclicos, tetrahidropiranos, morfolinos, açúcares 2'-modificados, açúcares 4'-modificados, 5 Açúcares modificados e açúcares substituídos 4' . Exemplos de modificações de açúcar adequados incluem, mas não estão limitados a, 2'-O-resíduos de nucleótidos de ARN modificados, tais como 2'-0-alquilo ou 2’-O- alquilo (substituído) e.g. 2'-0-metilo, 2’-O- (2-cianoetil), 2’-O- (2-metoxi) etilo (2'-M0E), 2'-0- (2-tiometil) etilo, 2'-0-butyryl, 2'-O-propargyl, 2'-0-allyl, 2'-0- (2-amino) propilo, 2'-0- (2- (dimetilamino) propilo), 2'-0- (2-amino) etilo, 2'-0- (2- (dimetilamino) etilo); 2'-desoxi (ADN); 2'-0- (haloalcoxi) metilo (Arai K. et al.) por exemplo. 2'-0- (2-cloroetoxi) metilo (MCEM), 2'-0- (2,2-dicloroetoxi) metilo (DCEM); 2'-O-alcoxicarbonilo por exemplo. 2'-0- [2-(metoxicarbonil) etil] (MOCE) , 2 '-0- [2-(N-metilcarbamoil) etilo] (MCE), 2'-0-[2-{N, N-dimetilcarbamoil) etilo] (DCME); 2'-halo por exemplo. 2'-F, FANA (ácido nucleico 2'-F arabinosil); modificações de carbaçúcar e azaçúcar; 3’-0-alquilo por exemplo. 3'-O-metilo, 3'-O-butyryl, 3 ’-0-propargilo, 5'-alquilo por exemplo. 5'-metilo; e seus derivados .
Outra modificação de açúcar inclui ácido nucleico "ligado a ponte" ou "biciclico" (BNA) por exemplo ácido nucleico bloqueado (LNA), Xylo-LANA, a-L-LNA, β-D-LNA, cEt (etilo limitado 2'-0,4'-C) LNA, cMOEt (2'-O, metoxietil) LNA isento de 4'-C, ácido nucleico com pontes de etileno (ENA), BNAnc [N-Me] (como descrito em Chem. Comum. 2007,3765, que é incorporado na sua totalidade por referência); ADN de triciclo (ADNc de tcc); Ácido nucleico desbloqueado (UNA); 5-metil-substituídos BNAs (como descrito em US patent application 13/530,218, que é incorporado na sua totalidade por referência); ácido nucleico de ciclohexenilo (CeNA), ácido nucleico de altriol (ANA), ácido nucleico de hexitol (HNA), HNA fluorado (F-HNA), pirano-ARN (p-ARN), ADN de 3'-deoxipiranosil (p-DNA); Morfolino (como, por exemplo, PMO, PMOPlus, PMO-X) e os seus derivados, preferencialmente ácido nucleico bloqueado (LNA) Xylo-LANA, a-L-LNA, β-D-LNA, cEt (2'-0,4'-C Etil limitado) LNA, cMOEt (2'-O, Metoxietil) LNA isento de 4'-C, ácido nucleico com pontes de etileno (ENA), ADN de triciclo (ADNc tc); ácido nucleico de ciclohexenilo (CeNA), ácido nucleico de altriol (ANA), ácido nucleico de hexitol (HNA), HNA fluorado (F-HNA), pirano-ARN (p-ARN), ADN de 3'-deoxipiranosil (p-DNA); Morfolino (como por exemplo em PMO, PMOPlus, PMO-X) e seus derivados. Um ADNc de tc preferido é ADNc de tc-PS (ADN de triciclo compreendendo ligação de internucleósido de fosforotioato). Dependendo do seu comprimento, urn oligonucleótido da descrição pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 modificações de açúcar. É também abrangido para introduzir mais de uma modificação de açúcar distinta no referido oligonucleótido. Numa forma de realização, um oligonucleótido como aqui definido compreende ou consiste num LNA ou um seu derivado. Os derivados de BNA são, por exemplo, descritos em WO 2011/097641. Numa forma de realização mais preferida, um oligonucleótido é totalmente 2'O-metilo modificado. Exemplos de PMO-X são descritos em W02011150408, que é incorporado aqui na sua totalidade por referência. Numa forma de realização preferida, o oligonucleótido de acordo com a descrição compreende, para além da ligação 2 '0- modificação de açúcar em metilo, pelo menos uma outra modificação de açúcar seleccionada de 2’-O-metilo, 2'-O- (2-metoxi) etilo, morfolino, um nucleótido em ponte ou BNA, ou o oligonucleótido compreende ambos os nucleótidos em ponte e os nucleótidos modificados com 2' -desoxi (BNA/misturadores de ADN). Mais preferencialmente, o oligonucleótido é modificado por todo o seu comprimento com uma modificação de açúcar seleccionada a partir de 2’-O-metilo, 2'-O-(2-metoxi) etilo, morfolino, ácido nucleico em ponte (BNA) ou BNA/DNA mixmer. Numa forma de realização mais preferida, o oligonucleótido de acordo com a invenção compreende é totalmente 2'-O-metilo modificado, de preferência totalmente fosforotioato de 2'-O-metilo modificado. Uma "modificação da estrutura principal" indica a presença de uma versão modificada da fração ribossilo ("modificação do açúcar"), como indicado acima, e/ou a presença de uma versão modificada do fosfodiéster como ocorrendo naturalmente no ARN ("modificação da ligação internucleósida") . Os exemplos de modificações da ligação internucleósido, que são compatíveis com o presente invento, são fosforotioato (PS) , fosforotioato quiralmente puro, fosforoditioato (PS2), fosfonoacetato (PACE), fosfonoacetamida (PACA), tiofosfonoacetato, tiofosfonoacetamida, pró-fármaco fosforotioato, H- fosfonato, Fosfato de metilo, fosforotioato de metilo, fosfato de metilo, fosforotioato de metilo, fosfato de etilo, fosforotioato de etilo, boranofosfato, boranofosforotioato, boranofosfato de metilo, boranofosforotioato de metilo, boranofosfonato de metilo, boranofosfato de metilo e seus derivados. Outra modificação inclui fosforamidite, fosforamidato, fosforamidato de N3 ' P5 ' , fosforendiamidato, fosforoiodiamidato, sulfamato, dimetileno sulfóxido, sulfonato, triazole, oxalilo, carbamato, metilenoimino (MMI) e ácido nucleico de tioacetamido (TANA); E seus derivados. Dependendo do seu comprimento, um oligonucleótido da descrição pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 modificações do esqueleto. É também abrangida pela divulgação para introduzir mais de uma modificação de estrutura principal distinta no referido oligonucleótido.
Um oligonucleótido da divulgação compreende pelo menos uma modificação de fosforotioato. Numa forma de realização mais preferida, um oligonucleótido da invenção é totalmente modificado com fosforotioato.
Outras modificações químicas de um oligonucleótido da divulgação incluem ácido nucleico de péptido-base (PNA), PNA modificado por átomo de boro, ácido nucleico de oxopéptido baseado em pirrolidina (POPNA), ácido nucleico com base em glicol ou glicerol (GNA), Threose Ácido nucleico à base de base (TNA) , ácido nucleico a base de treoninol acíclico (aTNA), oligonucleótido baseado em morfolino (PMO, PPMO, PMO-X), oligómeros catiônicos à base de morfolino (PMOPlus) , oligonucleótidos com bases integradas e esqueletos (ONIBs) Oligonucleótidos de pirrolidina-amida (POMs); e seus derivados. Noutra forma de realização, um oligonucleótido compreende um ácido nucleico peptídico e/ou um morfolinofosforodiamidato de morfolino ou um seu derivado.
Assim, o oligonucleótido preferido de acordo com um aspecto da divulgação compreende: (a) pelo menos uma modificação de base seleccionada de 5-metilpirimidina e 2,6-diaminopurina; e/ou (b) pelo menos uma modificação de açúcar, que é 2 ' -0-metilo e/ou (c) pelo menos uma modificação da estrutura principal, que é o fosforotioato.
Assim, um oligonucleótido preferido de acordo com este aspecto da divulgação compreende uma modificação de base (a) e nenhuma modificação de açúcar (b) e nenhuma modificação de coluna vertebral (c). Outro oligonucleótido preferido de acordo com este aspecto da divulgação compreende uma modificação de açúcar (b) e nenhuma modificação de base (a) e nenhuma modificação de coluna vertebral (c) . Outro oligonucleótido preferido de acordo com este aspecto da divulgação compreende uma modificação da estrutura (c) e nenhuma modificação de base (a) e nenhuma modificação de açúcar (b) . Também entendem-se que os oligonucleótidos que não possuem as modificações acima mencionadas são abrangidos pela presente descrição, bem como oligonucleótidos compreendendo dois, isto é (a) e (b) , (a) e (c) e/ou (b) e (C) , ou todas as três modificações (a), (b) e (c) como na presente invenção. Noutra forma de realização preferida, qualquer dos oligonucleótidos como descrito no parágrafo anterior pode compreender: (a) pelo menos uma (mais) modificação de base seleccionada de 2-tiouracilo, 2-tiotinina, 5-metilcitosina, 5-metiluracilo, timina, 2,6-diaminopurina; e/ou (b) pelo menos uma (adicional) modificação de açúcar seleccionada a partir de 2'-O-metilo, 2'-0-(2-metoxi) etilo, 2'-desoxi (ADN), morfolino, um nucleótido em ponte ou BNA, ou o oligonucleótido compreende ambos os nucleótidos em ponte e os nucleótidos modificados com 2'-desoxi (BNA / misturadores de ADN); e/ou (c) pelo menos uma (adicional) modificação da estrutura principal selecionada de (outro) fosforotioato ou fosforodiamidato.
Noutra forma de realização preferida, o oligonucleótido de acordo com a invenção é modificado por todo o seu comprimento com uma ou mais da mesma modificação, seleccionada de (a) uma das modificações de base; e/ou (b) uma das modificações do açúcar; e/ou (c) uma das modificações do esqueleto.
Com o advento da tecnologia de imitação de ácido nucleico, tornou-se possível gerar moléculas que tenham uma similaridade, de preferência as mesmas características de hibridação em espécie não necessariamente em quantidade como o próprio ácido nucleico. Tais equivalentes funcionais são, evidentemente, também adequados para utilização na invenção. A pessoa experiente entenderá que nem cada açúcar, base e/ou espinha dorsal podem ser modificados da mesma maneira. Diversos açúcares, bases e/ou estruturas metálicas modificados distintos podem ser combinados num único oligonucleótido da invenção.
Um técnico especializado também reconhecerá que existem muitos derivados sintéticos de oligonucleótidos. De preferência, o referido oligonucleótido compreende o ARN, uma vez que os antigenos ARN/ARN são muito estáveis. É preferido que um oligonucleótido de ARN compreenda uma modificação que proporciona ao ARN uma propriedade adicional, por exemplo resistência a endonucleases, exonucleases e RNaseH, resistência à hibridação adicional, estabilidade aumentada (por exemplo, num fluido corporal), aumento ou diminuição da flexibilidade, aumento atividade, toxicidade reduzida, aumento do transporte intracelular, especificidade do tecido, etc. Além disso, o mRNA complexado com o oligonucleótido do invento é de preferência não susceptível à clivagem com RNaseH. As modificações preferidas foram acima identificadas. Os oligonucleótidos contendo pelo menos parcialmente nucleotideos de DNA que ocorrem naturalmente são úteis para induzir a degradação de moléculas híbridas de DNA-RNA na célula pela atividade de RNase H (EC.3.1.26.4).
Naturalmente ocorre que os ribonucleótidos de ARN de ocorrência natural ou os ribonucleótidos sintéticos semelhantes a ARN que compreendem oligonucleótidos são abrangidos aqui para formar híbridos de RNA-ARN de cadeia dupla que atuam como antisentido dependente da enzima através das vias de interferência de ARN ou silenciamento (RNAi/siRNA), envolvendo reconhecimento de RNA alvo através de senso- Encadernamento de cadeia anti-sentido seguido de degradação de RNA alvo pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC).
Alternativamente ou adicionalmente, um oligonucleótido pode interferir com o processamento ou a expressão de ARN precursor ou ARN mensageiro (bloqueio estérico, processos independentes de RNaseH), em particular mas não limitado a união de ARN e saltos de exões, por ligação a uma sequência alvo de transcrição de RNA e ficando no caminho de processos como a tradução ou o bloqueio de doadores de amoldos ou sites de aceitadores de amolação. Além disso, o oligonucleótido pode inibir a ligação de proteínas, fatores nucleares e outros por impedimento estérico e/ou interferir com a dobragem espacial autêntica do ARN alvo e/ou se ligam a proteínas que se ligam originalmente ao ARN alvo e/ou possuem outros efeitos no ARN, contribuindo assim para a desestabilização do ARN alvo, de preferência pré-mRNA, e/ou para a diminuição da quantidade de transcrição e/ou proteína doente ou tóxica em doenças como HD, como a frente identificado.
Tal como aqui definido, um oligonucleótido pode compreender nucleótidos com substituições químicas resistentes a (RNaseH) pelo menos uma das suas extremidades 5' ou 3', para proporcionar estabilidade intracelular e compreende menos de 9, mais preferencialmente menos de 6 consecutivos (sensíveis a RNaseH) nucleótidos de desoxirribose no resto da sua sequência. 0 resto da sequência é de preferência o centro da sequência. Esse oligonucleótido é chamado de incubador. Gapmers foram amplamente descritos em WO 2007/089611. Os Gapmers são projetados para permitir ο recrutamento e/ou ativação do RNaseH. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que RNaseH é recrutado e/ou ativado por ligação à região central do escapador feito de desoxirriboses. Um oligonucleótido da invenção que é de preferência substancialmente independente ou independente de RNaseH é concebido para ter uma região central que é substancialmente não capaz ou não é capaz de recrutar e/ou activar RNaseH. Numa forma de realização preferida, o resto da sequência do referido oligonucleótido, mais preferencialmente a sua parte central compreende menos de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou não desoxirribose. Consequentemente, este oligonucleótido da invenção é de preferência parcialmente substituído completamente como anteriormente aqui definido. "Substituído parcialmente" significa que o oligonucleótido compreende pelo menos alguns dos nucleótidos que foram substituídos, de preferência pelo menos 50% dos seus nucleótidos foram substituídos, ou pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% foram substituídos. 100% de substituição de nucleótidos corresponde a "totalmente substituído".
Consequentemente, a invenção proporciona um oligonucleótido compreendendo um ARN fosforotioato de 2'-0-metilo ou consistindo em fosforotioato de 2'-0-metilo e que compreende uma base de 5-metilpirimidina e/ou 2,6-diaminopurina. Mais preferencialmente, este oligonucleótido consiste em 2'-O-metilo de ARN de resíduos ligados através de um esqueleto de fosforotioato e todas as suas citosinas e/ou todos os seus uraciles e/ou todas as suas adeninas, independentemente, foram substituídos por 5-metilcitosina, 5-metiluracilo e/ou 2,6-diaminopurina, respectivamente.
Assim, um oligonucleótido pode ter:
Pelo menos uma e de preferência todas as citosinas substituídas por 5-metilcitosinas como na presente invenção,
Pelo menos uma e, de preferência, todas as citosinas substituídas por 5-metilcitosinas e pelo menos um e, de preferência, todos os uracilos substituídos por 5-metiluracilos,
Pelo menos uma e de preferência todas as citosinas substituídas por 5-metilcitosinas e pelo menos uma e de preferência todas as adeninas substituídas por 2,6-diaminopurinas,
Pelo menos uma e de preferência todas as citosinas substituídas por 5-metilcitosinas e pelo menos um e de preferência todos os uracilos substituídos por 5-metiluracilos e pelo menos uma e de preferência todas as adeninas substituídas por 2,6-diaminopurinas,
Pelo menos um e, de preferência, todos os uracilos substituídos por 5-metiluracilos,
Pelo menos um e, de preferência, todos os uracilos substituídos por 5-metiluracilos e pelo menos um e, de preferência, todas as adeninas substituídas por 2,6-diaminopurinas, ou Pelo menos uma e de preferência todas as adeninas substituídas por 2,6-diaminopurinas.
Um oligonucleótido da invenção é para uso como um medicamento para prevenir o atraso e/ou o tratamento de distúrbios genéticos associados à instabilidade repetida do elemento-cis humano preferencialmente como aqui exemplificado. Um elemento-cis de transtorno genético associado à instabilidade repetida do elemento cis-humano, como aqui identificado, é de preferência um transtorno neuromuscular. De preferência, o referido oligonucleótido é para utilização na modulação do RNA terapêutico. Portanto, o oligonucleótido de acordo com a invenção pode ser descrito como um oligonucleótido anti-sentido (AON). Um oligonucleótido anti-sentido é um oligonucleótido que se liga (ou é capaz de se ligar), alvos, hibrida a (ou é capaz de se hibridar) e/ou é complementar e reverso a uma sequência especifica de uma transcrição de um gene que é conhecido por estar associado com ou envolvido em um cis-elemento humano repetido de instabilidade associada neuromuscular genética de desordem.
De acordo com a descrição, um oligonucleótido anti-sentido que compreende ou consiste em 2'-0- metilo de resíduos de nucleótidos de ARN, tendo um esqueleto em que pelo menos uma porção do fosfato é substituída por uma unidade de fosforotioato, e compreendendo ainda pelo menos uma de 5-metilcitosina e/ou uma 5-metiluracilo e/ou uma 2,6- diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo de uma sequência que se liga (ou é capaz de se ligar) , hibrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementar a um elemento repetitivo numa transcrição de ARN tendo como nucleotídeo repetitivo uma unidade de nucleótido repetitivo, que é selecionada a partir do (CAG)n, (GCG)n, (CGG)n, (GAA)n, (GCC)n, (CCG)n, (AUUCU)n, (GGGGCC)n, ou (CCUG)n. 0 referido oligonucleótido é de preferência um oligonucleótido de cadeia simples.
Embora seja entendido que um oligonucleótido da divulgação se liga (ou é capaz de se ligar) , hibrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementar a um elemento repetitivo presente num transcrito de ARN como acima identificado, não pode ser descartado que tal oligonucleótido também possa interferir ou ligar (ou é capaz de se ligar) ou hibridar com (ou é capaz de hibridar) um ADN correspondente, que é derivado deste ARN.
Um elemento refeito ou repetitivo ou uma sequência repetitiva ou um alongamento repetitivo é aqui definido como uma repetição de pelo menos 3, 4, 5, 10, 100, 1000 ou mais, de uma unidade repetitiva ou unidade de nucleótido repetitivo ou unidade de nucleótido de repetição (como (CAG)n, (GCG)n, (CGG)n, (GAA)n, (GCC)n, (CCG)n, (AUUCU)n, (GGGGCC)n ou (CCUG)n)/ compreendendo uma unidade repetitiva de trinucleótidos ou, alternativamente, uma unidade repetitiva de 4, 5 ou 6 nucleótidos, numa sequência de genes transcrita no genoma de um indivíduo, incluindo um indivíduo humano. Consequentemente, n é um número inteiro e pode ser pelo menos 3, 4, 5, 10, 100, 1000 ou mais. A divulgação não está limitada a unidades nucleotídicas repetitivas exemplificadas. Outra unidade de nucleótido repetitivo pode ser encontrada no seguinte site http://neuromuscular.wusti .edu/mother/dnarep.htm. Na maioria dos pacientes, uma repetição "pura" ou elemento repetitivo ou sequência repetitiva ou alongamento repetitivo como identificado acima (como (CAG)n, (GCG)n, (CGG)n, (GAA)n, (GCC)n, (CCG)n, (AUUCU)n, (GGGGCC)n ou (CCUG)n) está presente numa sequência de genes transcrita no genoma do dito paciente. No entanto, também é abrangido pela divulgação e invenção, que em alguns pacientes, o referido elemento repetitivo ou repetitivo ou sequência repetitiva ou alongamento repetitivo como identificado acima não é qualificado como "puro" ou é qualificado como uma "variante" quando, por exemplo, o referido elemento repetido ou repetitivo ou sequência repetitiva ou alongamento repetitivo como acima identificado é intercalado com pelo menos 1, 2 ou 3 nucleótidos que não se encaixam no (s) nucleótido (s) do referido elemento repetitivo ou repetitivo ou sequência repetitiva ou estiramento repetitivo (Braida C., et ai.).
Um oligonucleótido de acordo com a descrição e invenção, portanto, pode não precisar de ser 100% reversível e complementar a uma repetição específica. Usualmente, um oligonucleótido da invenção pode ser pelo menos 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% reverso e complementar a uma repetição específica.
Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido anti-sentido compreende ou consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo, que compreende uma 5-metilcitosina e/ou um 5-metiluracilo e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleótidos que compreendem ou consistem numa sequência que se liga (ou é capaz de se ligar), hibrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementar a (CAG)n extensível numa transcrição e é particularmente útil para o tratamento, atraso, melhoria e/ou prevenção das doenças genéticas humanas doença de Huntington (HD), ataxia espinocerebelar (SCA) tipo 1, 2, 3, 6, 7, 12 ou 17, a esclerose lateral amiotrófica (ALS), a demência frontotemporal (FTD), a atrofia muscular espinhal e bulbar ligada a X (SBMA) e/ou a atrofia dentatorregropallidoluisiana (DRPLA) causada por expansões de repetição CAG nas transcrições do HTT (SEQ ID NO:80), ATXNl (SEQ ID NO: 81) , ATXN2 (SEQ ID NO: 82) ATXN3 (SEQ ID NO:83), CACNAlA (SEQ ID NO:84), ATXN7 (SEQ ID NO:85), PPP2R2B (SEQ ID NO:86), TBP (SEQ ID NO:87), AR (SEQ ID NO: 88) ou ATNl (SEQ ID NO:89) genes. De preferência, esses genes são de origem humana. Nesta forma de realização, um oligonucleótido compreende ou consiste em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo, compreende uma 5-metilcitosina e/ou um 5-metiluracilo e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleótidos que compreendem ou consistem numa sequência que se liga (ou é capaz de se ligar) , híbrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementar à repetição(CAG)n como identificado acima e tem como unidade de nucleótido repetitivo (CUG)m. 0 m em (CUG)m é de preferência um número inteiro que é 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Numa forma de realização preferida, m é 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 10 ou 11 ou 12. É de notar que para ALS e FTD, sabe-se que pelo menos duas repetições distintas em pelo menos duas transcrições distintos podem estar envolvidas ou podem ser responsáveis ou ligados à doença. Um foi identificado no parágrafo anterior (ou seja, (CAG)n numa transcrição ATXN2). Outro foi identificado mais tarde como uma repetição ou trato (GGGGCC)n numa transcrição C90RF72. Significa que para cada uma destas duas doenças, pode-se considerar usar qualquer um desses dois oligonucleótidos distintos da invenção e divulgação, respectivamente, para induzir especificamente a degradação específica dos transcritos repetidos expandidos (tóxicos) correspondentes.
Ao longo da aplicação, um oligonucleótido definido como sendo reverso complementar, ligação (podendo ligar-se), hibridar (podendo hibridar) ou segmentar uma repetição como identificada acima e tem ou compreende uma unidade de nucleótido repetitivo pode ter qualquer comprimento compreendido entre 12 a 36 nucleótidos. Se tomarmos o exemplo de CUG como unidade de nucleótido repetitivo compreendido dentro do referido oligonucleótido, qualquer oligonucleótido que compreende UGC ou GCU como unidade de nucleótido repetitivo também é abrangido pela presente invenção. Dependendo do comprimento do referido oligonucleótido (por exemplo, de 12 a 36 nucleótidos), a unidade de nucleótido repetitivo dada pode não estar completa no 5' e/ou na 3' lado do referido oligonucleótido. Cada um dos referidos oligonucleótidos é abrangido no âmbito da referida invenção.
Alternativamente, se ainda tomarmos como exemplo o oligonucleótido com CUG como unidade de nucleótido repetitivo, ele pode ser representado por Η-(P) p-CUG) m- (Q)q-H, em que m é um número inteiro como acima definido. Cada ocorrência de P e Q é, individualmente, um monómero básico como acima definido ou um nucleótido, tal como A, C, G, U ou um análogo ou equivalente do mesmo e p e q são cada um individualmente um número inteiro, de preferência 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou superior até 100. Assim, p e q são cada um individualmente um número inteiro de 0 a 100, de preferência um número inteiro de 0 a 20, mais preferencialmente um número inteiro de 0 a 10, mais preferencialmente de 0 a 6, ainda mais preferencialmente de 0 a 3. Assim, quando p é 0, P está ausente e quando q é 0, Q está ausente. Um técnico especializado apreciará que um oligonucleótido sempre começará com e terminará com um átomo de hidrogénio (H), independentemente da quantidade e natureza dos nucleótidos presentes no oligonucleótido.
Será apreciado aqui que (CUG)m poderá ser substituído por qualquer unidade de nucleótido repetitivo no contexto da divulgação. Assim, um oligonucleótido preferido de acordo com a descrição pode ser representado por Η-(P) p-(R) r-(Q)q-H, em que (R) r é uma unidade de nucleótido de repetição dentro do contexto da divulgação e P, Q, p e q são como acima definidos.
No contexto da presente invenção, um "análogo" ou um "equivalente" de um nucleótido deve ser entendido como um nucleótido que compreende pelo menos uma modificação em relação aos nucleótidos que ocorrem naturalmente no ARN, tais como A, C, G E U. Tal modificação pode ser uma modificação de ligação internucleósida e/ou uma modificação de açúcar e/ou uma modificação de base, conforme explicado e exemplificado acima.
Mais uma vez, tomando o oligonucleótido que tem CUG como unidade de nucleótido repetitivo, deve entender-se que a sequência de repetição pode começar com um C, um U ou um G. Assim, numa forma de realização preferida, p não é 0 e (P)p é representado por (P')p-UG ou (P')p..G, em que cada ocorrência de P' é, individualmente, um sitio abásico ou um nucleótido, como A, C, G, U ou um análogo ou seu equivalente, e p' é p-2 e p" é p-1. Tais oligonucleótidos podem ser representados como: ou
Numa forma de realização igualmente preferida, q não é 0, e (Q) q é representado por CU (Q')q- ou C (Q')q" e cada ocorrência de Q' é, individualmente, um sitio básico ou um nucleótido, como A, C, G, U ou um análogo ou seu equivalente, e q' é q-2 e q" é q-1. Tais oligonucleótidos podem ser representados como:
Noutra forma de realização preferida, tanto p como q não são 0, e ambos (P) p e (Q)q são representados por (P')p-UG ou (P')P"G e CU (Q')q- ou C (Q')q" respectivamente, em que P', Q', p', p", q' e q" são como acima definidos. Tais oligonucleótidos podem ser representados como:
Deve ser entendido que p', p", q' e q" podem não ser números inteiros negativos. Assim, quando (P)p é representado por (P')p-UG ou (P')P"G, p é pelo menos 1 ou pelo menos 2, respectivamente, e quando (Q)q é representado por CU (Q')q- ou C (Q')q", Q é pelo menos 1 ou pelo menos 2, respectivamente. Deve ser entendido que tudo o que se diz aqui em relação à unidade de repetição CUG pode ser estendido para qualquer unidade de repetição no contexto da divulgação.
Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido definido como sendo reverso complementar, liga (ou é capaz de se ligar), híbrida (ou é capaz de hibridar) ou segmentar uma repetição (CAG)n compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XYG)m e tem um comprimento compreendido entre 12 e 36 nucleótidos em que cada X é C ou 5-metilcitosina e cada Y é U ou 5-metiluracilo tal que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Y é 5-methyluracil.m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Um valor preferido para m é 7.
Um oligonucleótido mais preferido, portanto, compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XYG)m em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Y é U ou 5-metiluracil tal que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Y é 5-metiluracilo e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:2 a 12).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XYG)m em que cada X é 5-metilcitosina, e/ou cada Y é 5-metiluracilo, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:2 a 12).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste em uma unidade de nucleótido repetitivo (XYG) 5, (XYG) 6 ou (XYG)7, (XYG)s, ou (XYG) 9 em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Y é U ou 5-metiluracilo tal que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Y é 5-metiluracilo. Mais preferido é um oligonucleótido compreendendo ou consistindo em (XYG) 7 em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Y é U ou 5-metiluracilo tal que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Y é 5-metiluracilo (SEQ ID NO:7).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XYG)7 em que cada X é 5-metilcitosina e cada Y é um uracilo (SEQ ID NO:2), ou cada X é uma citosina e cada Y é 5-metiluracilo (SEQ ID NO:3). Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende SEQ ID NO:2 ou 3 e tem um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 30 nucleótidos.
As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistem numa unidade de nucleótido repetitivo (XYG)m e foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:90-118.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato ARN compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 90-106 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 90-106 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato ARN, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 90-106 e tem um comprimento de 21 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato O ARN compreende uma das sequências básicas SEQ ID NO: 107 ou 108 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:107 ou 108 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 107 ou 108 e tem um comprimento de 21 nucleótidos. 0 oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, possui uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:107 ou 108, tem um comprimento de 21 nucleótidos e adicionalmente compreende 4 monómeros básicos numa das suas extremidades, de preferência no terminal 3'. O referido oligonucleótido mais preferido é representado por uma sequência de bases consistindo em SEQ ID NO:220 ou 221.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato O ARN compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 109 ou 110 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 109 ou 110 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato ARN, tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 109 ou 110 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato ARN compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 111 ou 112 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos.
Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 111 ou 112 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato ARN, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 111 ou 112 e tem um comprimento de 27 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato O ARN que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 113 ou 114 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato ARN e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 113 ou 114 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2,-0-metilo, tem uma sequência de bases que consiste em uma das sequências base SEQ ID NO: 113 ou 114 e tem um comprimento de 30 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 115 ou 116 e tem um comprimento de 33-36 nucleótidos, mais preferencialmente 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido que consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:115 ou 116 e tem um comprimento de 33-36 nucleótidos, mais preferivelmente 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 115 ou 116 e tem um comprimento de 33 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-O-metilo fosforotioato 0 ARN que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 117 ou 118 e tem um comprimento de 36 nucleótidos. 0 oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-O-metilo fosforotioato de ARN, tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 117 ou 118 e tem um comprimento de 36 nucleótidos.
Noutra forma de realização da divulgação, um oligonucleótido anti-sentido que compreende ou consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e que compreende uma 5-metilcitosina é representada por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo numa sequência que se liga a (ou é capaz de se ligar a) , híbrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementarmente à repetição (GCG)n numa transcrição que é particularmente útil para o tratamento, o atraso, a melhoria e/ou a prevenção das doenças genéticas humanas: síndrome do espasmo infantil, displasia desidocraniana, blefarfimosis, doença da mão-pé-genital, sinpolidactilia, distrofia muscular oculofaríngea e/ou holoprosencefalia, que são causadas por expansões repetidas nos genes ARX, CBFAl, F0XL2, H0XA13, H0XD13, 0PDM/PABP2, TCFBRl ou ZIC2. De preferência, esses genes são de origem humana.
Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido definido como sendo reverso complementar, liga (ou ser capaz de se ligar) , híbrida (ou ser capaz de hibridar) ou direcionar uma repetição(GCG)n compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGX)m e tem um comprimento composto de 12 a 36 nucleótidos em que cada X é C ou 5-metilcitosina, de tal modo que pelo menos um X é 5-metilcitosina.m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Um valor preferido para m é 7.
Portanto, um oligonucleótido mais preferido, compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGX)m, em que pelo menos um X é 5-metilcitosina, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID N0:13 a 21).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGX)m em que cada X é 5-metilcitosina, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:13 a 21).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGX)7 (SEQ ID NO: 16), em que pelo menos um X é 5-metilcitosina. Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGX)7 (SEQ ID NO: 16), em que cada X é 5-metilcitosina.
As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistindo numa unidade nucleotídica repetitiva (XGX)m foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:119-132.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metilo fosforotioato RNA que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 119 ou 120 e tem um comprimento de 12-36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 119 ou 120 e tem um comprimento de 16-36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-ARN de fosforotioato de metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências de bases SEQ ID NO:119 ou 120 e tem um comprimento de 12 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metilo de fosforotioato ARN que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 121 ou 122 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 90-106 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e possui uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 121 ou 122 e tem um comprimento de 15 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 123 ou 124 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO: 123 ou 124 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. 0 oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 123 ou 124 e possui um comprimento de 18 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 125 ou 126 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO: 125 ou 126 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 125 ou 126 e tem um comprimento de 21 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 127 ou 128 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 127 ou 128 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências de bases SEQ ID NO: 127 ou 128 e tem um comprimento de 24 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende uma das sequências básicas SEQ ID NO:129 ou 130 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO: 129 ou 130 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:129 ou 130 e tem um comprimento de 27 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO :131 ou 132 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 131 ou 132 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-O-metilo de fosforotioato, e possui uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 131 ou 132 e tem um comprimento de 30 nucleótidos.
Noutra forma de realização da descrição, um oligonucleótido compreendendo ou consistindo em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreendendo uma 5-metilcitosina, é representado por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo numa sequência que liga (ou é capaz de se ligar), alvos, híbrida (ou é capaz de hibridar) e/ou é reverso complementar a uma repetição (CGG)n numa transcrição e é particularmente útil para o tratamento, atraso, melhoria e/ou prevenção de sindromes X frágeis humanas, causada pela expansão repetida no gene FMRl. De preferência, esses genes são de origem humana. Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido definido como sendo complementar reverso, ligando (ou é capaz de se ligar) , hibridando (ou é capaz de hibridar) ou marcando uma repetição(CGG)n compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XXG)m e tem um comprimento composto de 12 a 36 nucleótidos em que cada X é C ou 5- metilcitosina, de tal modo que pelo menos um X é 5-metilcitosina. m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Um valor preferido para m é 7.
Um oligonucleótido mais preferido, portanto, compreende ou consiste numa unidade nucleotidica repetitiva (XXG)m em que cada X é C ou 5-metilcitosina, de tal modo que pelo menos um X é 5-metilcitosina, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:22 a 30). Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XXG)m em que cada X é 5-metilcitosina, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:22 a 30).
Um oligonucleótido ainda mais preferido, compreende ou consiste de uma unidade de nucleótido repetitivo (XXG)7 (SEQ ID NO:25), em que cada X é C ou 5-metilcitosina, de tal modo que pelo menos um X é 5-metilcitosina.
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XXG)7 (SEQ ID NO:25), em que cada X é 5-metilcitosina. As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistindo numa unidade de nucleótido repetitivo (XXG)m foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:133-146.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:133 ou 134 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 133 ou 134 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 133 ou 134 e tem um comprimento de 12 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:135 ou 136 e tem um comprimento de 15-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 135 ou 136 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 135 ou 136 e tem um comprimento de 15 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:137 ou 138 e tem um comprimento de 18-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO:137 ou 138 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste em uma das sequências de bases SEQ ID NO: 137 ou 138 e tem um comprimento de 18 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências básicas SEQ ID NO: 139 ou 140 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido que consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 139 ou 140 e tem um comprimento de 21-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 de nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metilo de fosforotioato de ARN, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 139 ou 140 e tem um comprimento de 21 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 141 ou 142 e tem um comprimento de 24-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido que consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 141 ou 142 e tem um comprimento de 24-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 de nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido que consiste em ARN fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 141 ou 142 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:143 ou 144 e tem um comprimento de 27-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 143 ou 144 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 143 ou 144 e tem um comprimento de 27 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:145 ou 146 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido que consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 145 ou 146 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 145 ou 146 e tem um comprimento de 30 nucleótidos.
Noutra forma de realização da descrição, um oligonucleótido compreendendo ou consistindo em fosforotioato 2'-0-metilo e que compreende uma 5-metilcitosina e/ou um 5-metiluracilo, é representado por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo numa sequência que liga a(ou é capaz de se ligar) , alvos, híbrida (ou é capaz de hibridar) e/ou é reverso complementar a (GAA)n repetida numa transcrição e é particularmente útil para o tratamento, atraso e/ou prevenção da doença genética humana ataxia de Friedreich.
Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido definido como sendo reverso complementar, ligando (ou sendo capaz de se ligar) , hibridar (ou ser capaz de hibridar) ou direcionar um (GAA)n a repetição compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (YYX)m e tem um comprimento compreendido entre 12 e 36 nucleótidos em que cada X é C ou 5-metilcitosina e cada Y é U ou 5-metiluracilo tal que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Y é 5- metiluracil. m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Um valor preferido para m é 7.
Um oligonucleótido mais preferido, portanto, compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (YYX)m em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Y é U ou 5-metiluracilo tal que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Y é 5-metiluracilo e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO: 31 a 39) . Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (YYX)m em que cada X é 5-metilcitosina, e/ou cada Y é 5-metiluracilo, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:31 a 39).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (YYX)7 (SEQ ID NO:34), em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Y é U ou 5-metiluracilo tal que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Y é 5-metiluracilo.
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (YYX)7 (SEQ ID NO:34), em que cada X é 5-metilcitosina, e/ou cada Y é 5-metiluracilo.
As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistindo numa unidade de nucleótido repetitivo (XYG)m foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:147-167.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 147 ou 148 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:147 ou 148 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-RNA de metil fosforotioato, tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências de bases SEQ ID NO: 147 ou 148 e possui um comprimento de 12 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato de ARN que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 149 ou 150 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 149 ou 150 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:149 ou 150 e tem um comprimento de 15 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:151 ou 152 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 151 ou 152 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 151 ou 152 e tem um comprimento de 18 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:153-157 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO:153-157 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato ARN, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:153-157 e tem um comprimento de 21 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato de ARN que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 158 ou 159 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO:158 ou 159 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato ARN, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:158 ou 159 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências básicas SEQ ID NO: 160 ou 161 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 160 ou 161 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências de bases SEQ ID NO:160 ou 161 e tem um comprimento de 27 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 162 ou 163 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e que compreende uma das sequências base SEQ ID NO :162 ou 163 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo, tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 162 ou 163 e tem um comprimento de 30 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 164 ou 165 e tem um comprimento de 33-36 nucleótidos, mais preferencialmente 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido que consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:164 ou 165 e tem um comprimento de 33-36 nucleótidos, mais preferencialmente 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. 0 oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato ARN, e tem uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 164 ou 165 e tem um comprimento de 33 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 166 ou 167 e tem um comprimento de 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e possui uma sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 166 ou 167 e tem um comprimento de 36 nucleótidos.
Noutra forma de realização da divulgação, um oligonucleótido anti-sentido que compreende ou consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e que compreende uma 5-metilcitosina, é representado por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo numa sequência que se liga a (ou é capaz de se ligar), híbrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementar para um (CCG)n ou (GCC)n repetir em uma transcrição e é particularmente útil para o tratamento, atraso, melhoria e/ou prevenção do transtorno genético humano atraso mental XE frágil, causado pela expansão repetida no gene FMR2. De preferência, esses genes são de origem humana. Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido definido como sendo reverso do complementar, ligar (ou ser capaz de se ligar), hibridar (ou ser capaz de hibridar) ou segmentar a (CCG)n a repetição compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGG)m ou (GGX)m e tem um comprimento composto de 12 a 36 nucleótidos e em que cada X é C ou 5-metilcitosina.m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. Um valor preferido para m é 7. Um oligonucleótido mais preferido, portanto, compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGG)m ou (GGX)m em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:49 a 57) ou (SEQ ID NO:40 a 48) . Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGG)m ou (GGX)m em que cada X é 5-metilcitosina, e m é um número inteiro de 4 a 12 (SEQ ID NO:49 a 57) ou (SEQ ID NO:40 a 48).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGG)7 (SEQ ID NO:52) ou (GGX)7 (SEQ ID NO:43), em que cada X é C ou 5-metilcitosina. Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XGG)7 (SEQ ID NO:52) ou (GGX)7 (SEQ ID NO:43), em que cada X é 5-metilcitosina.
As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistindo numa unidade de nucleótido repetitivo (GGX)m foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:168-177.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:168 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende sequências base SEQ ID NO:168 e tem um comprimento de 12-36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo, tem a sua sequência de bases que consiste em sequências base SEQ ID NO: 168 e tem um comprimento de 12 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo compreende a sequência de base SEQ ID NO:169 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 169 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2' -O-metil f osf orotioato ARN, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:169 e tem um comprimento de 15 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-O-metil de fosforotioato de ARN que compreende a sequência de base SEQ ID NO:170 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em 2'-0-0 RNA de fosforotioato de metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 17 0 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de bases SEQ ID NO:170 e tem um comprimento de 18 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato 2'-0-metilo compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 171-174 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:171-174 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil de fosforotioato de ARN, e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 171-174 e tem um comprimento de 21 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo compreende a sequência de base SEQ ID NO:175 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO:175 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleotídeos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato de RNA, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência base SEQ ID NO:175 e tem um comprimento de 24 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:176 e tem um comprimento de 27-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO:176 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil fosforotioato de ARN, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de bases SEQ ID NO:176 e tem um comprimento de 27 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:177 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 de nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 177 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:177 e tem um comprimento de 30 nucleótidos.
As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistindo numa unidade de nucleótido repetitivo (XGG)m foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:178-184 .
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:178 e tem um comprimento de 12-36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 17 8 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:178 e tem um comprimento de 12 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:179 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO:179 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:179 que possui um comprimento de 15 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende sequências de bases SEQ ID NO: 180 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido que consiste em 2'-0-RNA de fosforotioato de metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 180 e tem um comprimento de 18 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:180 e tem um comprimento de 18 nucleótidos. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2’-00 RNA do fosforotioato de metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:181 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 181 e tem um comprimento de 21-36 nucleótidos, mais preferencialmente 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato 2'-O-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na SEQ ID NO:181 de base e tem um comprimento de 21 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:182 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende a sequência de bases SEQ ID NO: 182 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleotídeos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo , e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de bases SEQ ID NO:182 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:183 e tem um comprimento de 27-36 nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 de nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO:183 e tem um comprimento de 27-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo, tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:183 e tem um comprimento de 27 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:184 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 184 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de f osf orotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:184 e tem um comprimento de 30 nucleótidos.
Noutra forma de realização da descrição, um oligonucleótido compreendendo ou consistindo em fosforotioato de 2'-0-metilo e que compreende uma 5-metilcitosina e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo numa sequência que se liga (ou é capaz de se ligar) , híbrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementar a um (CCUG)n repetir numa transcrição e é particularmente útil para o tratamento, atraso e/ou prevenção do distúrbio genético humano de distrofia miotônica tipo 2 (DM2), causada por expansões repetidas no gene DM2/ZNF9. De preferência, esses genes são de origem humana.
Numa forma preferida, um oligonucleótido definido como sendo reverso complementar, ligando (ou sendo capaz de se ligar), hibridar (ou ser capaz de hibridar) ou direcionar um (CCUG)n a repetição compreende ou consiste de uma unidade de nucleótido repetitivo (XZGG)m e tem um comprimento composto de 12 a 36 nucleótidos em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Z é A ou 2,6-diaminopurina de tal modo que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Z é 2, 6-diaminopurina.m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. Um valor preferido para m é 5.
Um oligonucleótido mais preferido, portanto, compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XZGG)m, em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Z é A ou 2,6-diaminopurina de tal modo que pelo menos um X é 5-metil-citosina e/ou pelo menos um A é 2,6-diaminopurina e m é um inteiro de 3 a 9 (SEQ ID NO:63 a 69).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XZGG)m em que cada X é 5-metilcitosina, e/ou cada Z é 2,6-diaminopurina e m é um número inteiro de 3 a 9 (SEQ ID NO: 63 a 69) . Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste de uma unidade de nucleótido repetitivo (XZGG) 5 (SEQ ID NO: 65), em que cada X é C ou 5-metilcitosina, e cada Z é A ou 2,6-diaminopurina de tal modo que pelo menos um X é 5-metilcitosina e/ou pelo menos um Z é 2,6-diaminopurina.
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (XZGG)5 (SEQ ID NO:65), em que cada X é 5-metil-citosina, e/ou cada Z é 2,6-diaminopurina.
As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistem numa unidade de nucleótido repetitivo (XZGG)m e foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:193-208.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 193 ou 194 e possui um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO: 193 ou 194 e tem um comprimento de 12 a 36 nucleótidos, mais preferencialmente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-RNA de metil fosforotioato, e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências de base SEQ ID NO:193 ou 194 e tem um comprimento de 12 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:195 ou 196 e tem um comprimento de 16-36 nucleótidos, mais preferencialmente 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:195 ou 196 e tem um comprimento de 16-36 nucleótidos, mais preferencialmente 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 195 ou 196 e possui um comprimento de 16 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:197-200 e tem um comprimento de 20-36 nucleótidos, mais preferencialmente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO:197-200 e tem um comprimento de 20-36 nucleótidos, mais preferencialmente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de f osf orotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:197-200 e tem um comprimento de 20 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende uma das sequências básicas SEQ ID NO:201 ou 202 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:201 ou 202 e tem um comprimento de 24-36 de nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil f osf orotioato de ARN, e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 201 ou 202 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil fosforotioato de ARN compreende uma das sequências base SEQ ID NO:203 ou 204 e tem um comprimento de 28-36 nucleótidos, mais preferencialmente 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO :203 ou 204 e tem um comprimento de 28-36 nucleótidos, mais preferencialmente 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de base que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:203 ou 204 e tem um comprimento de 28 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato 2'-0-metilo compreende uma das sequências base SEQ ID NO:205 ou 206 e tem um comprimento de 32-36 nucleótidos, mais preferencialmente 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:205 ou 206 e tem um comprimento de 32-36 nucleótidos, mais preferencialmente 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato 2'-O-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:205 ou 206 e tem um comprimento de 32 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:207 ou 208 e tem um comprimento de 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:207 ou 208 e tem um comprimento de 36 nucleótidos.
Noutra forma de realização da descrição, um oligonucleótido compreendendo ou consistindo em fosforotioato de 2'-0-metilo e que compreende um 5-metiluracilo e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo numa sequência que se liga (ou é capaz de se ligar) , híbrida (ou é capaz de hibridar), metas e/ou é reverso complementar a (AUUCU)n repetido num intrão e é particularmente útil para o tratamento, atraso, melhoria e/ou prevenção do transtorno genético humano, ataxia espinocerebelar tipo 10 (SCA10). De preferência, esse gene é de origem humana.
Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido definido como sendo inverso, complementar, ligar (ou ser capaz de se ligar) , hibridar (ou ser capaz de hibridar) ou segmentar um (AUUCU)n a repetição compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (ZGZZY)m e tem um comprimento compreendido entre 12 e 36 nucleótidos em que cada Y é U ou 5-metiluracilo, e cada Z é A ou 2,6-diaminopurina de tal forma que pelo menos um Y é 5-metiluracilo e/ou pelo menos um Z é 2,6-diaminopurina. m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 3, 4, 5, 6, 7. Um valor preferido para m é 4.
Um oligonucleótido mais preferido, portanto, compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (ZGZZY)m ,em que cada Y é U ou 5-metiluracilo, e cada Z é A ou 2,6-diaminopurina de tal modo que pelo menos um Y é 5-metiluracilo e/ou pelo menos um Z é 2,6-diaminopurina e m é um inteiro de 3 a 7 (SEQ ID NO:58 a 62).
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (ZGZZY)m em que cada Y é 5-metiluracilo, e/ou cada Z é 2,6-diaminopurina e m é um número inteiro de 3 a 7 (SEQ ID NO: 58 a 62) .
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (ZGZZY)4 (SEQ ID NO:59), em que cada Y é C ou 5-metiluracilo, e cada Z é A ou 2,6-diaminopurina de tal modo que pelo menos um Y é 5-metiluracilo e/ou pelo menos um Z é 2,6 -diaminopurina.
Um oligonucleótido ainda mais preferido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (ZGZZY)4 (SEQ ID NO:59), em que cada Y é 5-metiluracilo, e/ou cada Z é 2,6-diaminopurina.
As sequências de oligonucleótidos mais preferidas compreendendo ou consistindo numa unidade de nucleótido repetitivo (ZGZZY)m foram identificados na tabela 2 como SEQ ID NO:185-192.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:185 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO: 185 e tem um comprimento de 15-36 nucleótidos, mais preferencialmente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de f osf orotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:185 e tem um comprimento de 15 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metil que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:186-189 e tem um comprimento de 20-36 nucleótidos, mais preferencialmente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em ARN de fosforotioato 2'-0-metilo e compreende uma das sequências de bases SEQ ID NO: 186-189 e tem um comprimento de 20-36 nucleótidos, mais preferencialmente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de base que consiste numa das sequências base SEQ ID NO:186-189 e tem um comprimento de 20 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:190 e tem um comprimento de 25-36 nucleótidos, mais preferencialmente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de bases SEQ ID NO:190 e tem um comprimento de 25-36 nucleótidos, mais preferencialmente 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de f osf orotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:190 e tem um comprimento de 25 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO:191 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de bases SEQ ID NO: 191 e tem um comprimento de 30-36 nucleótidos, mais preferencialmente 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil de fosforotioato de ARN, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de bases SEQ ID NO:191 e tem um comprimento de 30 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a SEQ ID NO:192 da sequência de base e tem um comprimento de 35- 36 nucleótidos, mais preferivelmente 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em ARN de fosforotioato 2'-O-metilo e compreende a sequência de bases SEQ ID NO:192 e tem um comprimento de 35-36 nucleótidos, mais preferencialmente 35 ou 36 nucleótidos. 0 oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de bases SEQ ID NO:192 e tem um comprimento de 35 nucleótidos.
Noutra forma de realização da descrição, um oligonucleótido compreendendo ou consistindo em fosforotioato de 2'-0-metilo e que compreende uma 5-metilcitosina e/ou um monómero abásico e/ou uma inosina, é representada por uma sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo numa sequência que se liga (ou é capaz de se ligar), híbrida (ou é capaz para hibridar), metas e/ou é reverso complementar a (GGGGCC)n repetir o presente numa transcrição humana C90RF72 e é particularmente útil para o tratamento, atraso, melhoria e/ou prevenção da desordem genética humana esclerose lateral amilotrófica (ALS) ou demência frontotemporal (FTD). De preferência, esse gene é de origem humana.
Numa forma de realização preferida, um oligonucleótido definido como sendo reverso complementar, ligar (ou ser capaz de se ligar), hibridar (ou ser capaz de hibridar) ou segmentar um (GGGGCC)n a repetição compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo (GGXUXX) m, (GGXQXX)m, GGXIXX)m, ou (GGCCUC)m e tem um comprimento compreendido entre 17 e 36 nucleótidos em que cada X é C ou 5-metilcitosina de tal modo que pelo menos um X é 5-metilcitosina, em que cada Q é um monómero abásico, em que cada I é uma inosina e em que m é um número inteiro. No contexto desta forma de realização, m pode ser 3, 4, 5, 6, 7. Um valor preferido para m é 3 ou 4.
Mais preferencialmente, o referido oligonucleótido compreende ou consiste numa unidade de nucleótido repetitivo SEQ ID NO:216-219 como definido na tabela 1. Ainda mais preferidas sequências de oligonucleótidos compreendendo ou consistindo de uma unidade de nucleótido repetitivo (GGXUXX)m, (GGXQXX)m, (GGXIXX)m, ou (GGCCUC)m, foram identificadas na tabela 2 como SEQ ID NO:209-215. Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em 2'-0-metil de fosforotioato de ARN que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:209 ou 211 e tem um comprimento de 17-36 nucleótidos, mais preferencialmente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:209 ou 211 e tem um comprimento de 17-36 nucleótidos, mais preferencialmente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-0-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 209 ou 211 e tem um comprimento de 17 ou 18 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO :210 e tem um comprimento de 18- 36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-0-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO :210 e tem um comprimento de 18-36 nucleótidos, mais preferencialmente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo, e tem a sua sequência de bases que consiste na sequência de base SEQ ID NO:210 e tem um comprimento de 18 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende uma das sequências base SEQ ID NO:212 ou 215 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende uma das sequências base SEQ ID NO:212 ou 215 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O oligonucleótido mais preferido consiste em f osf orotioato de 2' -O-metilo , e tem a sua sequência de bases que consiste numa das sequências base SEQ ID NO: 212 ou 215 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO :213 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36
nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende a sequência de base SEQ ID NO :213 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleotideos. O oligonucleótido mais preferido consiste em 2'-0-metil de f osf orotioato de ARN, e tem a sua sequência de bases que consiste em sequências base SEQ ID NO:213 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Um oligonucleótido preferido compreendendo ou consistindo em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo que compreende a sequência de base SEQ ID NO :214 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. Um oligonucleótido ainda mais preferido consiste em fosforotioato de 2'-O-metilo e compreende a sequência de bases SEQ ID NO :214 e tem um comprimento de 24-36 nucleótidos, mais preferencialmente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleotideos. O oligonucleótido mais preferido consiste em ARN de fosforotioato de 2'-O-metilo, tem a sua sequência de bases que consiste em sequências base SEQ ID NO:214 e tem um comprimento de 24 nucleótidos.
Numa forma de realização, um oligonucleótido compreende ou consiste preferencialmente em fosforotioato de 2'-O-metilo, que compreende uma base de 5-metilcitosina e/ou 5-metiluracilo e/ou 2,6-diaminopurina, é representada por uma sequência de nucleótidos que compreende ou consiste em pelo menos 12 a 36 nucleótidos consecutivos, o referido alvo de oligonucleótidos, hibridação (ou é capaz de hibridar) , ligação (ou é capaz de se ligar) e/ou sendo reverso complementar a uma repetição como anteriormente aqui definido. Mais preferencialmente, a referida sequência de nucleótidos compreendendo ou consistindo em pelo menos 12 a 36 nucleótidos, ainda mais preferencialmente 15 a 24, e mais preferencialmente 20 ou 21 nucleótidos. O comprimento do referido oligonucleótido pode ser 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 nucleótidos. O referido oligonucleótido pode ser complementar reverso e/ou capaz de se hibridar e/ou capaz de direcionar e/ou capaz de se ligar a uma repetição numa região de codificação de uma transcrição, de preferência uma poliglutamina (CAG)n trato de codificação. 0 referido oligonucleótido também pode ser complementar reverso e/ou capaz de se hibridar com e/ou capaz de segmentar e/ou capaz de se ligar a uma região não codificante, por exemplo, regiões 5'ou 3' não traduzidas, ou sequências intrónicas presentes no ARN precursor de moléculas.
No contexto da invenção, a expressão "capaz de" pode ser substituída por "é capaz de".
Num segundo aspecto, a presente descrição refere-se a um oligonucleótido, que compreende um ou mais locais abásicos, conforme definido mais adiante, numa ou em ambas as extremidades. De preferência, 1 a 10, mais preferencialmente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 e mais preferencialmente 4 locais abásicos estão presentes num único terminal ou em ambos os terminais do oligonucleótido. Um ou mais locais abásicos podem estar presentes e ambos os terministas livres do oligonucleótido (5' e 3'), ou apenas um. O oligonucleótido de acordo com este aspecto da descrição preferencialmente é representado por um nucleótido ou uma sequência de bases compreendendo ou consistindo de uma sequência que se liga (ou é capaz de se ligar), híbrida (ou é capaz de hibridar), alvos e/ou é reverso complementar a um elemento repetitivo numa transcrição de ARN selecionada a partir do (CAG)n, (GCG)n, (CGG)n, (GAA)n, (GCC)n, (CCG)n, (AUUCU)n, (GGGGCC) n ou (CCUG)n, conforme acima indicado. O referido oligonucleótido é de preferência um oligonucleótido de cadeia simples e pode opcionalmente compreender qualquer uma das modificações aqui discutidas, tal como uma ou mais modificações de base, modificações de açúcar e/ou modificações de estrutura principal, tais como 5-metilo-C, 5-metilo-U, 2,6-diaminopurina, 2'-O-metilo, fosforotioato e suas combinações. Deve ser entendido que, neste aspecto da divulgação, estas modificações não são obrigatórias. 0 oligonucleótido de acordo com este aspecto da descrição, que compreende um ou mais sítios abásicos numa ou em ambas as extremidades e tem um parâmetro melhorado sobre os oligonucleótidos sem tais locais abásicos. Neste contexto, os parâmetros podem incluir: afinidade e/ou cinética de ligação, atividade de silenciamento, seletividade alélica, biostabilidade, distribuição (intra-tecido) , absorção e/ou tráfico celular e/ou imunogenicidade do referido oligonucleótido, como explicado anteriormente neste documento em ligação com o parâmetro melhorado de um oligonucleótido da invenção do primeiro aspecto. Cada um dos ensaios e definições aqui proporcionados em ligação com a melhoria de um parâmetro de um oligonucleótido do primeiro aspecto também possuem um oligonucleótido do segundo aspecto.
Abaixo, um oligonucleótido compreendendo ou consistindo em fosforotioato de 2'-O-metilo, compreendendo uma base de 5-metilcitosina e/ou 5-metiluracilo e sendo representado por um nucleótido ou uma sequência de base compreendendo (CUG)m e assim se vinculando (ou sendo capaz de se ligar), hibridando (ou sendo capaz de hibridar), segmentando e/ou sendo reverso complementar a (CAG)n é tomado como um exemplo para ilustrar melhor a invenção. Parâmetros semelhantes definidos no contexto de tal oligonucleótido podem ser definidos pelo especialista em outros oligonucleótidos que se enquadram no âmbito da invenção e que se ligam a (ou que são capazes de se ligar a), hibridando (ou sendo capaz de hidratar), direcionando e/ou sendo reverso complementar a outras repetições como aqui identificado. Outros sintomas ou sintomas semelhantes podem ser identificados pelo especialista sobre outras doenças como aqui identificado.
Numa forma de realização preferida, no contexto da invenção, um oligonucleótido como aqui concebido é capaz de retardar e/ou curar e/ou tratar e/ou prevenir e/ou melhorar uma desordem genética humana como doença de Huntington (HD), ataxia espinocerebelosa (SCA) tipo 1, 2, 3, 6, 7, 12 ou 17, esclerose lateral amiotrófica (ALS), demência frontotemporal (FTD), atrofia muscular espinhal e bulbar ligada ao X (SBMA) e/ou atrofia dentatorregropallidoluisian (DRPLA) causada por extensões de repetição CAG nos transcritos de um HTT (SEQ ID NO: 80), ATXNl (SEQ ID NO: 81), ATXN2 (SEQ ID NO:82) ATXN3 (SEQ ID NO:83), CACNAlA (SEQ ID NO:84), ATXN7 (SEQ ID NO:85), PPP2R2B (SEQ ID NO: 86), TBP (SEQ ID NO:87), AR (SEQ ID NO:88), ATNl (SEQ ID NO:89) genes quando este oligonucleótido é capaz de reduzir ou diminuir a quantidade de transcrição (tóxica) de um alelo doente de um gene HTT, ATXNl, ATXN2 ATXN3, CACNAlA, ATXN7, PPP2R2B, TBP, AR ou ATNl em uma célula de um paciente, em um tecido De um paciente e/ou de um paciente. Numa forma de realização, os genes HTT, ATXNl, ATXN2 ATXN3, CACNAlA, ATXN7, PPP2R2B, TBP, AR ou ATNl são genes humanos.
No caso de HD, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 1 do gene HTT no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 38 a 180 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG, numa sequência transcrita do gene HTT.
No caso de SCAl, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 8 do gene ATXNl no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 41 a 83 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG, numa sequência transcrita do gene ATXNl.
No caso de SCA2, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 1 do gene ATXN2 no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 32 a 200 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene ATXN2.
No caso de SCA3, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 8 do gene ATXN3 no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 52 a 86 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene ATXN3.
No caso de SCA6, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 47 do gene CACNAlA no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 20 a 33 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene CACNAlA.
No caso do SCA7, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 3 do gene ATXN7 no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 36 a pelo menos 460 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene ATXN7.
No caso de SCA12, uma região de repetição CAG expandida pode estar presente na região 5'não traduzida (UTR), num intrão ou dentro de um quadro de leitura aberto do gene PPP2R2B no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 66 a 78 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene PPP2R2B.
No caso de SCA17, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 3 do gene TBP no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 45 a 66 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene TBP.
No caso de ALS ou FTD, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 1 do gene ATXN2 no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 27 a 33 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene ATXN2.
No caso de ALS ou FTD, uma região de repetição GGGGCC expandida está presente no primeiro intrão do gene C90RF72 no genoma de um paciente. Uma região de repetição GGGGCC expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de>30 unidades repetitivas compreendendo um hexanucleótido GGGGCC numa sequência transcrita do gene C90RF72.
No caso do SBMA, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 1 do gene AR no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 40 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene AR.
No caso de DRPLA, uma região de repetição CAG expandida está presente no exão 5 do gene ATNl no genoma de um paciente. Uma região de repetição CAG expandida pode ser aqui definida como compreendendo uma repetição consecutiva de 49 a 88 unidades repetitivas compreendendo um trinucleótido CAG numa sequência transcrita do gene ATNl.
Ao longo da invenção, o termo repetição CAG pode ser substituído por (CAG)n, e vice-versa, em que n é um número inteiro que pode ser de 6 a 29 quando a repetição está presente no exão 1 da transcrição HTT de um indivíduo saudável, 6 a 39 quando a repetição está presente no exão 8 do gene ATXNl de um indivíduo saudável, menos de 31 quando a repetição está presente no exão 1 do gene ATXN2 de um indivíduo saudável, 12 a 40 quando a repetição está presente no exão 8 do gene ATXN3 de um indivíduo saudável, menor que 18 quando a repetição está presente no exão 47 do gene CACNAlA de um indivíduo saudável, 4 a 17 quando a repetição está presente no exão 3 do gene ATXN7 de um indivíduo saudável, 7 a 28 quando a repetição está presente no 5'UTR do gene PPP2R2B de um indivíduo saudável, 25 a 42 quando a repetição está presente no exão 3 do gene TBP de um indivíduo saudável, 13 a 31 quando a repetição está presente no exão 1 do gene AR de um indivíduo saudável, 12 a 40 quando a repetição está presente no exão 8 do gene ATXN3 de um indivíduo saudável, ou 6 a 35 quando a repetição está presente no exão 5 do gene ATNl de um indivíduo saudável.
De preferência, significa que um oligonucleótido da invenção reduz uma quantidade detectável de transtorno associado a doença ou causador de doença ou mutante contendo um número prolongado ou instável de repetições CAG numa célula do referido paciente, num tecido do referido paciente e/ou num paciente. Alternativamente ou em combinação com a frase anterior, o referido oligonucleótido pode reduzir a tradução do referido transcrito mutante e, assim, a quantidade de proteína mutante (tóxica). A redução ou diminuição da quantidade de transcritos repetidos CAG repetidos pode ser de pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% em comparação com a quantidade de transcritos repetidos CAG repetidos antes do tratamento. Outro parâmetro pode ser a diminuição (CAG)n transcrição ou da quantidade da referida transcrição mutante. Isso pode ser pelo menos. 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% em comparação com a quantidade da referida transcrição detectada no início do tratamento. A redução ou diminuição pode ser avaliada por Northern Blot ou Q-RT-PCR, de preferência como realizado na parte experimental. Um oligonucleótido da invenção pode primeiro ser testado no sistema celular como descrito no Exemplo 1 na parte experimental.
Alternativamente ou em combinação com a anterior forma de realização preferida, no contexto da invenção, um oligonucleótido como aqui concebido é capaz de retardar e/ou curar e/ou tratar e/ou prevenir e/ou melhorar uma desordem genética humana como doença de Huntington (HD ) , ataxia espinocerebelar (SCA) tipo 1, 2, 3, 6, 7, 12 ou 17, esclerose lateral amiotrófica (ALS), demência frontotemporal (FTD), atrofia muscular e espinhal ligada ao X (SBMA) e/ou dentatorubropallidoluisian atrofia (DRPLA) causada por expansões de repetição CAG nas transcrições dos genes HTT, ATXNl, ATXN2 ATXN3, CACNAlA, ATXN7, PPP2R2B, TBP, AR ou ATNl quando esse oligonucleótido é capaz de aliviar um ou mais sintomas e/ou caracteristica (s) e/ou para melhorar um parâmetro ligado ou associado à doença de Huntington (HD), ataxia espinocerebelar (SCA) tipo 1, 2, 3, 6, 7, 12 ou 17, esclerose lateral amiotrófica (ALS), frontotemporal demência (FTD), atrofia muscular e espinhal ligada ao X (SBMA) e/ou denta atrofia torubropalidoluisiana (DRPLA) em um indivíduo. Um oligonucleótido tal como aqui definido é capaz de melhorar um parâmetro ou reduzir um sintoma ou caracteristica se após pelo menos uma semana, um mês, seis meses, um ano ou mais de tratamento, utilizando uma dose do referido oligonucleótido da invenção como aqui identificado, o referido parâmetro é dito ter sido melhorado ou o dito sintoma ou caracteristica é dito ter sido reduzido. A melhoria neste contexto pode significar que o referido parâmetro foi significativamente alterado para um valor do referido parâmetro para uma pessoa saudável e/ou para um valor do referido parâmetro que corresponde ao valor desse parâmetro no mesmo indivíduo no início do tratamento. A redução ou alívio neste contexto pode significar que o referido sintoma ou caracteristica tenha sido significativamente alterado para a ausência desse sintoma ou caracteristica que é caracteristica para uma pessoa saudável e/ou para uma alteração desse sintoma ou caracteristica que corresponde ao estado do mesmo indivíduo no início do tratamento.
Neste contexto, os sintomas da doença de Huntington são movimentos coreiformes, demência progressiva e manifestações psiquiátricas (depressão, psicose, etc.)· Os movimentos coreiformes consistem em movimentos involuntários, rápidos, irregulares, incluindo espasmos faciais ou retorcidos e espasmos de extremidades distais, e formas mais tardias mais generalizadas que podem prejudicar a marcha (Ropper e Brown, 2005) . Cada um desses sintomas pode ser avaliado pelo médico usando métodos conhecidos e descritos. Um método preferido é o monitoramento da capacidade funcional total (TFC), uma escala valida ou progressão do sintoma em relação às três principais áreas sintomáticas de HD, medidas por escalas de classificação validadas. Essas áreas são especificamente a progressão dos sinais motores, a progressão dos sintomas neuropsiquiátricos e a progressão do declínio cognitivo. Outra escala preferida é, portanto, a Escala de Rating Unificada HD (UHDRS; Huntington Study Group (Kieburtz K. et ai., 1996; 11:136-142).
Doença de Huntington (HD), ataxia espinocerebelar (SCA) de tipo 1, 2, 3, 6, 7 ou 17, atrofia muscular espinhal e bulbar ligada a X (SBMA) e atrofia dentatorregropalidoluisiana (DRPLA) são todas causadas por expansões de repetição de triplete CAG na região de codificação do gene. Embora a doença que provoca proteínas nessas doenças seja diferente, em cada caso, o alongamento expandido resultante de glutaminas resulta numa função de ganho tóxico da proteína, o que leva à neurodegeneração. Os agregados de proteínas são encontrados no núcleo e no citoplasma das células, indicando que o desdobramento da proteína é uma característica comum desses distúrbios. Um parâmetro preferido comum é, portanto, níveis de proteína (mutantes) que podem ser determinados por análise Western
Blot (Evers et al.,), ou a presença de agregados proteicos no núcleo e/ou citoplasma que podem ser monitorados no local da Hibridação. Uma melhoria de um parâmetro de HD pode ser a diminuição na detecção da quantidade ou quantidade de agregado de proteínas. Essa diminuição pode ser de pelo menos 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% em comparação com a quantidade do agregado proteico antes do início do tratamento. No contexto da HD, várias outras proteínas foram encontradas para co-localizar com agregados htt, isto é, proteína de ligação da caixa de TATA (TBP), proteína de ligação de CREB (CBP) e várias chaperonas moleculares (Huang et al., Muchowski et al., Roon-Mom et al., Steffan et al.,). Também foram identificados muitos processos celulares afetados em HD, como a desregulação transcricional, a disfunção mitocondrial e o transporte de vesículas prejudicadas, o que pode fornecer parâmetros alternativos para HD (Bauer et al., 2009; Ross et al., ) . Uma melhoria de cada um desses possíveis parâmetros alternativos de HD (i.e., a proteína de ligação da caixa de TATA (TBP), a proteína de ligação de CREB (CBP) e várias chaperonas moleculares) podem ser definidas como para a melhoria do agregado de proteínas como acima definido.
Composição
Num segundo aspecto, é proporcionada uma composição compreendendo um oligonucleótido como descrito na secção anterior intitulada "Oligonucleótido". Esta composição compreende ou consiste preferencialmente ou consiste essencialmente num oligonucleótido como acima descrito.
Conforme explicado no primeiro aspecto da invenção para ALS e FTD, sabe-se que pelo menos duas repetições distintas em pelo menos dois distintos transcritos podem estar envolvidos, responsáveis por, ou ligados com a doença doença. Todas as caracteristicas preferidas relativas a cada um destes oligonucleótidos foram reveladas na secção intitulada "oligonucleótido". Numa forma de realização preferida, a referida composição é para utilização como um medicamento. A referida composição é, portanto, uma composição farmacêutica. Uma composição farmacêutica geralmente compreende um veiculo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização preferida, uma composição da presente invenção compreende um composto tal como aqui definido e, opcionalmente, compreende ainda uma formulação, enchimento, conservante, solubilizante, veiculo, diluente, excipiente, solvente, adjuvante e/ou solvente farmaceuticamente aceitável. Tal veiculo, enchimento, conservante, solvente, diluente, sal, adjuvante, solvente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis podem, por exemplo, ser encontrados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. O composto como descrito na invenção possui pelo menos um grupo ionizável. Um grupo ionizável pode ser uma base ou ácido e pode ser carregado ou neutro. Um grupo ionizável pode estar presente como um par iônico com um contra-ion apropriado que carrega carga (s) oposta (s) . Exemplos de contra-iões catiónicos são sódio, potássio, césio, tris, litio, cálcio, magnésio, trialquilamónio, trietilamónio e tetraalquilamónio. Exemplos de contra-iões aniónicos são cloreto, brometo, iodeto, lactato, mesilato, acetato, trifluoroacetato, dicloroacetato e citrato. Exemplos de contra-iões foram descritos [por exemplo Kumar L. et ai, 2008]. Uma composição farmacêutica pode ser ainda formulada para auxiliar ainda mais a aumentar a estabilidade, a solubilidade, a absorção, a biodisponibilidade, a farmacocinética e a absorção celular do referido composto, em formulações particulares que compreendem excipientes capazes de formar complexos, nanopartícuias, micropartícuias, nanotubos, nanogeles, hidrogéis, poloxâmeros ou plurônicos, polímeros, colóides, microbolhas, vesículas, micelas, lipoplexos e/ou lipossomas. Exemplos de nanopartícuias incluem nanopartícuias poliméricas, nanopartículas de ouro, nanopartícuias magnéticas, nanopartículas de sílica, nanopartículas lipídicas, partículas de açúcar, nanopartículas de proteínas e nanopartículas de peptídeos.
Uma composição preferida compreende pelo menos um excipiente que pode ajudar ainda mais a aumentar o direccionamento e/ou a entrega da referida composição e/ou o referido oligonucleótido para e/ou para dentro do tecido muscular e/ou cerebral e/ou para um tecido neuronal e/ou uma célula. Uma célula que pode ser uma célula muscular ou neuronal.
Muitos destes excipientes são conhecidos na técnica (por exemplo, ver Bruno, 2011) e podem ser categorizados como um primeiro tipo de excipiente. Exemplos do primeiro tipo de excipientes incluem polímeros (por exemplo, polietilenoimina (PEI), polipropilenoimina (PPI), derivados de dextrano, cianoacrilato de butilo (PBCA), hexilcianoacrilato (PHCA), poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), poliaminas (por exemplo, espermina (PAMAM), poli (éster amina), éter polivinílico, polivinil pirrolidona (PVP), polietileno glicol (PEG) ciclodextrinas, ácido hialurônico, ácido colómico e seus derivados (PAMAM), quitosano, poli (amidoaminas) ), dendrímeros (por exemplo, poli (amidoamina)), lípidos {por exemplo. 1,2-dioleoil-3- dimetilamónio propano (DODAP), cloreto de dioleoximetilamónio (DODAC), derivados de fosfatidilcolina [por exemplo 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)], derivadas de lisofosfatidilcolina [e.g. 1- estearoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (S-LysoPC)], esfingomielina, 2- {3- [bis- (3-amino-propil) -amino] propi lamino} IV-ditetracedil carbamoilmetilacetamida (RPR209120), derivados de fosfoglicerol [por exemplo. Sal de sódio 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG-Na), derivados de ácido fosfácido [ácido 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfácido, sal de sódio (DSPA), derivados de fosfatidiletanolamina [por exemplo. dioleoil- fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-destearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 2-dipiticoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DPhyPE)], N-[1-(2,3- dioleoiloxi ) propil ] -N, N, IV-Trimetilamónio (DOTAP) , Ai— [1— (2,3 — dioloiloxi) propil ] -N, N, IV-Trimetilamónio (DOTMA) , 1,3-di- oleoiloxi-2- (6-carboxi-espermetil) -propilamida (DOSPER), (1,2-dimidristol-3-dimetil-hidroxietilamónio (DMRIE) , (Nl-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonano-l,9-diamina (CDAN), brometo de dimetildioctadecilamónio (DDAB), l-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC), (bL-arginil-2,3-L-Ácido diaminopropiónico-iV-palmitil-iV-Trihidrocloreto de oleil-amida (AtuFECTO1), N, N-dimetil-3-aminopropano derivados [por exemplo. 1,2-distearoiloxi-I\/, N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleiloxi-N, N-dimetil-3- aminopropano (DoDMA) , 1,2-dilinoleiloxi-2\7, ΛΓ-3- dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4-
dimetilaminometil [1,3] -dioxolano (DLin-K-DMA), derivados de fosfatidilserina [1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfo-L serina, sal de sódio (DOPS)], colesterol] proteínas (por exemplo, albumina, gelatinas, atelocolageneo) e péptidos (por exemplo, protamina, PepFects, NickFects, poliarginina, polilisina, CADY, MPG).
Outra composição preferida pode compreender pelo menos um excipiente categorizado como um segundo tipo de excipiente. Um segundo tipo de excipiente pode compreender ou conter um grupo conjugado como agui descrito para aumentar a direcção e/ou a administração da composição e/ou do oligonucleótido da invenção a um tecido e/ou célula e/ou a um tecido e/ou célula, como por exemplo tecido muscular ou neuronal ou célula. Ambos os tipos de excipientes podem ser combinados em conjunto numa única composição como agui identificado. A pessoa habilitada pode selecionar, combinar e/ou adaptar um ou mais dos excipientes ou sistemas de distribuição acima ou outros para formular e administrar um composto para uso na presente invenção.
Uma tal composição farmacêutica da invenção pode ser administrada numa concentração eficaz em tempos fixos para um animal, de preferência um mamífero. 0 mamífero mais preferido é um ser humano. Um oligonucleótido ou uma composição tal como agui definido para utilização de acordo com a invenção pode ser adequado para administração directa a uma célula, tecido e/ou um órgão na Vivo dos indivíduos afetados ou em risco de desenvolver uma doença ou condição identificada aqui e podem ser administrados diretamente In vivo, ex vivo ou em vitro. A administração pode ser através de Rotas sistémicas e/ou parenterais, por exemplo via intravenosa, subcutânea, intraventricular, intratecal, intramuscular, intranasal, enteral, intravítrea, intracerebral, peridural ou oral.
De preferência, tal composição farmacêutica da invenção pode ser encapsulada sob a forma de uma emulsão, suspensão, comprimido, comprimido, cápsula ou gel mole para administração oral, ou sob a forma de aerossol ou pó seco para administração no tracto respiratório e pulmões. Numa forma de realização, um oligonucleótido da invenção pode ser utilizado em conjunto com outro composto já conhecido para ser utilizado para o tratamento da referida doença. Outros tais compostos podem ser usados para retardar a progressão da doença, para reduzir comportamentos ou movimentos anormais, para reduzir a inflamação do tecido muscular, para melhorar a fibra muscular e/ou função neuronal, integridade e/ou sobrevivência e/ou melhorar, aumentar ou restaurar a função da doença cardiaca. Os exemplos são, mas não limitados a, um esteróide, de preferência um (gluco) corticosteróide, um inibidor de ECA (de preferência perindopril), um bloqueador de receptor de tipo 1 de angiotensina II (preferencialmente losartan), um fator de necrose de tumor alfa (TNFa), um inibidor de TGFp (de preferência a decorina) , o biglicam recombinante humano, uma fonte de mIGF-1, um inibidor de miostatina, manose-6-fosfato, dantroleno, halofuginona, um antioxidante, um inibidor de canais iônicos, um inibidor de protease, um inibidor de fosfodiesterase (de preferência um inibidor de PDE5, tais como inibidores de sildenafil ou tadalafil e/ou PDE10A e/ou MP-10), L-arginina, bloqueadores de dopamina, amantadina, tetrabenzina, coenzima Q10, antidepressivos, antipsicóticos, antiepilépticos, estabilizadores de humor em geral, ácidos gordos omega-3, monohidrato de creatina, inibidores de KMO (mono oxigenase de Kynurenine) tais como inibidores de CHDI246 ou HDAC4 tais como PBT2. Esse uso combinado pode ser um uso sequencial: cada componente é administrado numa composição distinta. Alternativamente, cada composto pode ser utilizado em conjunto numa única composição.
Uso
Num aspecto adicional, é proporcionada a utilização de uma composição ou um oligonucleótido como descrito nas secções anteriores para utilização como um medicamento ou parte da terapia, ou aplicações nas quais o referido oligonucleótido exerce a sua actividade intracelularmente. De preferência, um oligonucleótido ou composição da invenção é para utilização como um medicamento ou parte de uma terapia para prevenir, retardar, curar, melhorar e/ou tratar uma desordem genética associada à instabilidade repetida do elemento-cis humano. Um transtorno genético associado a instabilidade de repetição do elemento-cis humano é de preferência um distúrbio genético neuromuscular, mais preferencialmente como identificado anteriormente neste documento. Método
Num aspecto adicional, é proporcionado um método para prevenir, tratar, curar, melhorar e/ou retardar uma condição ou doença como definido na secção anterior num indivíduo, numa célula, tecido ou órgão do referido indivíduo. 0 método compreende a administração de um oligonucleótido ou uma composição da invenção ao referido indivíduo ou a um sujeito na sua necessidade. 0 método de acordo com a invenção em que um oligonucleótido ou uma composição tal como aqui definido pode ser adequado para administração a uma célula, tecido e/ou um órgão na Vivo dos indivíduos afetados por qualquer das doenças aqui definidas ou em risco de desenvolver a referida doença e podem ser administrados in vivo, ex vivo ou in vitro. Um indivíduo ou um indivíduo em necessidade é de preferência um mamífero, mais preferencialmente um ser humano.
Num aspecto adicional, é proporcionado um método para o diagnóstico em que o oligonucleótido da invenção é fornecido com um marcador radioativo ou marcador fluorescente. Neste método, um oligonucleótido da invenção pode ser usado como um no local sonda para detectar focos (ARN/agregados de proteína resultantes da expansão da repetição) numa amostra de um assunto. A referida amostra compreende células do referido sujeito.
Numa forma de realização, num método do invento, uma concentração de um oligonucleótido ou composição varia entre 0,01 nM e 1 μΜ. Mais preferencialmente, a concentração utilizada é de 0,05 a 500 nM, ou de 0,1 a 500 nM, ou de 0,02 a 500 nM, ou de 0,05 a 500 nM, ainda mais preferencialmente de 1 a 200 nM.
As gamas de dose de um oligonucleótido ou composição de acordo com a invenção são preferencialmente concebidas com base em estudos de dose em aumento em ensaios clínicos (uso in vivo) para o qual existem rigorosos requisitos de protocolo. Um oligonucleótido como aqui definido pode ser utilizado numa dose que varia entre 0,01 e 200 mg/kg ou 0,05 a 100 mg/kg ou 0,1 a 50 mg/kg ou 0,1 a 20 mg/kg, de preferência entre 0,5 e 10 mg/kg.
As gamas de dose de um oligonucleótido ou composição de acordo com a invenção também podem ser utilizadas numa dose que está na faixa de 100 a 300 pg/semana, 8 a 12 injeções no total ou na faixa de 150 a 250 pg/semana, 9 a 11 injeções no total ou 200 pg/semana, 11 injeções no total ou na faixa de 10 a 350 pg/dia durante duas semanas ou na faixa de 50 a 250 pg/dia durante duas semanas ou na faixa de 100 a 200 pg/dia durante duas semanas ou na faixa de 20 a 80 μg/dia durante duas semanas ou na faixa de 200 a 320 gg/dia durante duas semanas ou 320 gg/dia, durante duas semanas ou 30 gg/dia, durante duas semanas.
As gamas de concentração ou dose de oligonucleótido ou composição como apresentadas acima são concentrações ou doses preferidas para uso in vitro ou ex vivo. A pessoa experiente compreenderá que, dependendo da identidade do oligonucleótido utilizado, a célula alvo a ser tratada, o alvo do gene e os seus niveis de expressão, o meio utilizado e as condições de transfecção e incubação, a concentração ou a dose de oligonucleótido utilizada podem variar ainda mais e pode necessitar de ser otimizado ainda mais.
Neste documento e nas suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações é usado no seu sentido não-limitativo para significar que os itens que seguem a palavra estão incluídos, mas itens não especificamente mencionados não estão excluídos. O verbo "compreender" é sinónimo do verbo "ter", salvo indicação em contrário. Além disso, o verbo "consistir" pode ser substituído por "para consistir essencialmente em" significar que um oligonucleótido ou uma composição como aqui definido aqui pode compreender componentes adicionais que os especificamente identificados, o (s) componente (s) adicional (is) não alterando a característica única da invenção. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um dos elementos. O artigo indefinido "um" ou "uma" geralmente significa "pelo menos um".
Cada forma de realização tal como aqui identificada pode ser combinada entre si, salvo indicação em contrário.
Definições
Ao longo do aplicativo, a palavra "vincular", "alvos", "híbrida" pode ser usada de forma intercambiável quando usada no contexto de um oligonucleótido antisentido que é reverso complementar a uma parte de um pré-mRNA como aqui identificado. No contexto da invenção, "hibrida" ou "vincular" são utilizados sob condições fisiológicas numa célula, de preferência uma célula humana, a menos que seja indicado de outra forma.
Tal como aqui utilizado, a "hibridação" refere-se ao emparelhamento de compostos oligoméricos complementares (por exemplo, um composto antisentido e o seu ácido nucleico alvo). Embora não se limita a um mecanismo particular, o mecanismo mais comum de emparelhamento que envolve a ligação de hidrogénio, que pode ser a ligação de hidrogénio Watson-Crick, Hoogsteen ou inversa, entre bases nucleósidas ou nucleotídicas complementares (nucleobases). Por exemplo, a adenina de base natural é nucleobase complementar às nucleobases naturais de timina, 5-metiluracilo e uracilo que par através da formação de ligações de hidrogénio. A base natural guanina é nucleobase complementar às bases naturais de citosina e 5-metil-citosina. A hibridação pode ocorrer em circunstâncias variadas. Em particular, a hibridação de um oligonucleótido da invenção com um pré-mRNA direcionado que pode ocorrer em circunstâncias variáveis. De modo semelhante, a ligação de um oligonucleótido da invenção a um pré-mRNA alvo pode ocorrer sob circunstâncias variáveis. De preferência, a referida hibridação ou a referida ligação é avaliada sob condições fisiológicas numa célula, mais preferencialmente numa célula humana. Um oligonucleótido da invenção é de preferência designado para poder ligar-se ou ser capaz de se ligar a híbrido ou capaz de se hibridar com ou quando é capaz de hibridar quando a referida ligação ou hibridação ocorre em condições fisiológicas numa célula, de preferência uma célula humana. Tal como aqui utilizado, "nucleótido" refere-se a um nucleósido compreendendo ainda um grupo de ligação de fosfato modificado ou não modificado ou uma ligação de internucleósido não fosfato.
Tal como aqui utilizado, "análogo de nucleótido" ou "equivalente de nucleótido" refere-se a um nucleótido que compreende pelo menos uma modificação em relação aos nucleótidos que ocorrem naturalmente no ARN, tais como A, C, G e U. Tal modificação pode ser uma modificação da ligação internucleósida e/ou uma modificação de açúcar e/ou uma modificação de base. Tal como aqui utilizado, "monómero" refere-se a um precursor na síntese de um composto oligomérico ou polimérico. Também a unidade monomérica ou o resíduo dentro de um tal composto oligomérico ou polimérico é englobado no termo "monómero". Assim, "monómero" e "resíduo de nucleótido" podem ser usados de forma intercambiável ao longo da descrição. No contexto da presente invenção, um monómero é de preferência um nucleótido. Os monómeros preferidos a serem incorporados nos oligonucleótidos de acordo com a invenção são nucleótidos compreendendo um 2 '0- substituinte metilo, uma ligação internucleósida de fosforotioato e uma 5-metilpirimidina e/ou uma nucleobase de 2,6-diaminopurina. Tal como aqui utilizado, "nucleobase" refere-se à porção de base heterocíclica de um nucleósido. As nucleobases podem ocorrer naturalmente ou podem ser modificadas e, por conseguinte, incluem, mas não estão limitadas a adenina, citosina, guanina, uracilo, timina e seus análogos, tais como a 5-metil-citosina. Em certas formas de realização, uma nucleobase pode compreender qualquer átomo ou grupo de átomos capazes de ligação de hidrogénio a uma base de outro ácido nucleico. Tal como aqui utilizado, "Tm" significa temperatura de fusão que é a temperatura à qual as duas cadeias de um ácido nucleico duplex se separam. Tm é frequentemente utilizado como uma medida de uma estabilidade duplex ou a afinidade de ligação de um composto anti-sentido em relação a uma molécula de ARN complementar.
Tal como aqui utilizado, "2'-modificado" ou "2' substituído" refere-se a um nucleósido compreendendo um açúcar de pentose compreendendo um substituinte na posição 2'diferente de H ou OH. Os nucleósidos 2'-modificados incluem, mas não estão limitados a, nucleósidos bicíclicos em que a ponte que conecta dois átomos de carbono do anel de açúcar conecta o carbono 2' e outro carbono do anel de açúcar; e nucleósidos com substituintes 2' sem pontes, tais como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-Ci-Cio alquilo, -OCF3, o-(CH2) 2-O-CH3, 2 ' -0 (CH2) 2SCH3, 0- (CH2) 2-0-N (Rm(Rn) , ouO-CH2-C (=0) -N (Rm) (Rn) , om que cada Rm e Rn é, independentemente, H ou substituído ou não substituído Ci-C10 alquilo. Os nucleósidos modificados em 2' podem ainda compreender outras modificações, por exemplo em outras posições do açúcar e/ou na nucleobase.
Tal como aqui utilizado, "2'-0-Me", "2'-0Me" ou "2'-OCH3" ou "2'-0-metilo" refere-se cada um a um nucleósido compreendendo um açúcar compreendendo um -OCH3 grupo na posição 2' do anel de açúcar.
Conforme aqui usado, "MOE" ou "2'-M0E" ou "2'-OCH2CH2OCH3 "ou" "2'-O-metoxietilo" refere-se cada um a um nucleósido compreendendo um açúcar compreendendo um -OCH2CH2OCH3 grupo na posição 2' do anel de açúcar.
Tal como aqui usado, o termo "análogo de adenina" significa uma nucleobase de purina quimicamente modificada que, quando incorporada num oligómero, é capaz de formar um par de bases com uma timina ou uracilo de uma cadeia complementar de ARN ou ADN. De preferência, esse par de bases é um par de bases Watson-Crick, mas análogos e pequenos desvios são também considerados admissíveis no contexto da presente invenção.
Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de uracilo" significa uma nucleobase de pirimidina quimicamente modificada que, quando incorporada num oligómero, é capaz de formar um par de bases com uma adenina de uma cadeia complementar de ARN ou ADN. De preferência, esse par de bases é um par de bases Watson-Crick, mas análogos e pequenos desvios são também considerados admissíveis no contexto da presente invenção.
Tal como aqui usado, o termo "análogo de timina" significa uma nucleobase de pirimidina quimicamente modificada que, quando incorporada num oligómero, é capaz de formar um par de bases com uma adenina de uma cadeia complementar de ARN ou ADN. De preferência, esse par de bases é um par de bases Watson-Crick, mas análogos e pequenos desvios são também considerados admissíveis no contexto da presente invenção.
Tal como aqui usado, o termo "análogo de citosina" significa uma nucleobase de pirimidina quimicamente modificada que, quando incorporada num oligómero, é capaz de formar um par de bases com uma guanina de uma cadeia complementar de ARN ou ADN. Por exemplo, o análogo de citosina pode ser uma 5-metilcitosina. De preferência, esse par de bases é um par de bases Watson-Crick, mas análogos e pequenos desvios são também considerados admissíveis no contexto da presente invenção. Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de guanina" significa uma nucleobase de purina quimicamente modificada que, quando incorporada num oligómero, é capaz de formar um par de bases com uma citosina de uma cadeia complementar de ARN ou ADN. De preferência, esse par de bases é um par de bases Watson-Crick, mas análogos e pequenos desvios são também considerados admissíveis no contexto da presente invenção.
Tal como aqui usado, o termo "guanosina" refere-se a um nucleósido ou a um nucleósido modificado com açúcar compreendendo uma nucleobase análoga ou análoga de guanina.
Tal como aqui utilizado, o termo "uridina" refere-se a um nucleósido ou a um nucleósido modificado com açúcar compreendendo uracilo ou uma nucleobase análoga de uracilo.
Tal como aqui utilizado, o termo "timidina" refere-se a um nucleósido ou a um nucleósido modificado com açúcar compreendendo uma nucleobase análoga de timina ou timina.
Tal como aqui utilizado, o termo "citidina" refere-se a um nucleósido ou a um nucleósido modificado com açúcar compreendendo uma nucleobase análoga de citosina ou citosina.
Tal como aqui utilizado, o termo "adenosina" refere-se a um nucleósido ou a um nucleósido modificado com açúcar compreendendo uma nucleobase análoga de adenina ou adenina.
Tal como aqui utilizado, "oligonucleótido" refere-se a um composto que compreende uma pluralidade de nucleósidos ligados. Em certas formas de realização, um ou mais da pluralidade de nucleósidos são modificados. Em certas formas de realização, um oligonucleótido compreende um ou mais ribonucleósidos (ARN) e/ou desoxirribonucleósidos (ADN).
Tal como aqui utilizado, a "ligação internucleósida" refere-se a uma ligação covalente entre nucleósidos adjacentes. Uma ligação internucleósida pode ser uma ligação internucleósida de ocorrência natural, isto é, uma ligação fosfodiéster 3' a 5', ou uma ligação internucleósido modificada.
Tal como aqui utilizado, "ligação de internucleósido modificada" refere-se a qualquer ligação de internucleósido diferente de uma ligação de internucleósido de ocorrência natural.
Tal como aqui utilizado, o "esqueleto" refere-se à cadeia de porções de açúcares alternadas e ligações internucleósidas, tal como ocorre num oligonucleótido. 0 oligonucleótido da invenção compreende pelo menos uma ligação de internucleósido de fosforoditioato, mas deve ser entendido que podem ocorrer mais modificações de estrutura principal, tais como modificações de açúcar e/ou modificações de ligação internucleósida no esqueleto.
Tal como aqui utilizado, "composto oligomérico" refere-se a uma estrutura polimérica que compreende duas ou mais subestruturas. Em certas formas de realização, um composto oligomérico é um oligonucleótido. Em certas formas de realização, um composto oligomérico é um oligonucleótido de cadeia simples. Em certas formas de realização, um composto oligomérico é um duplex de cadeia dupla que compreende dois oligonucleótidos. Em certas formas de realização, um composto oligomérico é um oligonucleótido de cadeia simples ou de cadeia dupla que compreende um ou mais grupos conjugados e/ou grupos terminais.
Tal como aqui utilizado, "conjugado" refere-se a um átomo ou grupo de átomos ligado a um oligonucleótido ou composto oligomérico. Em geral, os grupos conjugados modificam uma ou mais propriedades do composto ao qual estão ligados, incluindo, mas não se limitando a farmacodinâmica, farmacocinética, ligação, absorção, distribuição celular, absorção celular, carga e depuração. Os grupos conjugados são rotineiramente utilizados nas artes químicas e estão ligados directamente ou através de uma fracção de ligação opcional ou grupo de ligação ao composto original, tal como um composto oligomérico. Em certas formas de realização, os grupos conjugados incluem, sem limitação, intercaladores, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietilenoglicóis, tioéteres, poliéteres, colesteróis, tiocolesteróis, fragmentos de ácido eólico, folato, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes. Em certas formas de realização, os conjugados são grupos terminais. Em certas formas de realização, os conjugados estão ligados a um nucleósido terminal 3' ou 5' ou a um nucleósido interno de um oligonucleótido.
Tal como aqui utilizado, "grupo de ligação conjugada" refere-se a qualquer átomo ou grupo de átomos utilizado para ligar um conjugado a um oligonucleótido ou composto oligomérico. Grupos de ligação ou porções de ligação bifuncionais tais como os conhecidos na técnica são passíveis do presente invento.
Tal como aqui utilizado, "composto anti-sentido" refere-se a um composto oligomérico, pelo menos uma parte do qual é pelo menos parcialmente complementar ou, pelo menos parcialmente, dirigida a um ácido nucleico alvo ao qual híbrida e modula a actividade, processamento ou expressão do referido ácido nucleico alvo.
Tal como aqui utilizado, "expressão" refere-se ao processo pelo qual um gene resulta numa proteína. A expressão inclui, mas não está limitada a, transcrição, junção, modificação pós-transcrição e tradução.
Tal como aqui utilizado, "oligonucleótido anti-sentido" refere-se a um composto antisentido que é um oligonucleótido.
Tal como aqui utilizado, "actividade anti-sentido" refere-se a qualquer actividade detectável e/ou mensurável atribuível à hibridação de um composto anti-sentido com o seu ácido nucleico alvo. Em certas formas de realização, tal actividade pode ser um aumento ou diminuição numa quantidade de um ácido ou proteína nucleica. Em certas formas de realização, tal actividade pode ser uma alteração na proporção de variantes de emenda de um ácido ou proteína nucleica. A detecção e/ou a medição da atividade antisentido podem ser diretas ou indiretas. Em certas formas de realização, a atividade anti-sentido é avaliada observando uma alteração fenotípica numa célula ou animal.
Tal como aqui utilizado, "ácido nucleico alvo" refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico cuja expressão, quantidade ou actividade seja capaz de ser modulada por um composto antisentido. Em certas formas de realização, o ácido nucleico alvo é ADN ou ARN. Em certas formas de realização, o ARN alvo é miARN, mRNA, pré-mRNA, ARN não codificador ou transcritos antisentido naturais. Por exemplo, o ácido nucleico alvo pode ser um gene celular (ou mRNA transcrito a partir do gene) cuja expressão está associada a uma desordem particular ou estado patológico, tal como aqui utilizado, "mRNA alvo" refere-se a uma molécula de ARN pré-seleccionada que codifica uma proteina.
Tal como aqui utilizado, "direcionamento" ou "direcionado para" refere-se à associação de um composto anti-sentido a uma molécula de ácido nucleico alvo particular ou a uma região particular de nucleotideos dentro de uma molécula de ácido nucleico alvo. Um composto anti-sentido tem como alvo um ácido nucleico alvo se for suficientemente reverso para o ácido nucleico alvo para permitir a hibridação sob condições fisiológicas. Neste contexto, "complementar suficientemente reverso" pode ser pelo menos 90%, 95%, 97%, 99% ou 100% de complemento reverso com a referida molécula de ácido nucleico alvo.
Tal como aqui utilizado, "local alvo" refere-se a uma região de um ácido nucleico alvo que é ligado por um composto anti-sentido. Em certas formas de realização, um local alvo é pelo menos parcialmente dentro da região 3' não traduzida de uma molécula de ARN. Em certas formas de realização, um local alvo é pelo menos parcialmente dentro da região 5' não traduzida de uma molécula de ARN. Em certas formas de realização, um local alvo é pelo menos parcialmente dentro da região de codificação de uma molécula de ARN. Em certas formas de realização, um local alvo é pelo menos parcialmente dentro de um exão de uma molécula de ARN. Em certas formas de realização, um local alvo é pelo menos parcialmente dentro de um intrão de uma molécula de ARN. Em certas formas de realização, um local alvo é pelo menos parcialmente dentro de um local alvo de miARN de uma molécula de ARN. Em certas formas de realização, um local alvo é pelo menos parcialmente dentro de uma região de repetição de uma molécula de ARN.
Tal como aqui utilizado, a "proteína alvo" refere-se a uma proteína, cuja expressão é modulada por um composto antisentido. Em certas formas de realização, uma proteína alvo é codificada por um ácido nucleico alvo. Em certas formas de realização, a expressão de uma proteína alvo é de outra forma influenciada por um ácido nucleico alvo.
Tal como aqui utilizado, a "complementaridade" em referência a nucleobases refere-se a uma nucleobase que é capaz de emparelhar bases com outra nucleobase. Por exemplo, no DNA, a adenina (A) é complementar à timina (T). Por exemplo, no RNA, a adenina (A) é complementar ao uracile (U) . Em certas formas de realização, a nucleobase complementar refere-se a uma nucleobase de um composto antisentido que é capaz de emparelhar a base com uma nucleobase do seu ácido nucleico alvo. Por exemplo, se uma nucleobase numa determinada posição de um composto antisentido é capaz da ligação de hidrogénio com uma nucleobase numa determinada posição de um ácido nucleico alvo, então a posição de ligação de hidrogénio entre o oligonucleótido e o ácido nucleico alvo é considerada como sendo complementares nesse par de nucleobases. As nucleobases que compreendem certas modificações podem manter a capacidade de emparelhar com uma nucleobase de contrapartida e assim, ainda são capazes de complementaridade da nucleobase. Tal como aqui utilizado, "não complementares" em referência a nucleobases refere-se a um par de nucleobases que não formam ligações de hidrogénio entre si ou de outro modo suportam hibridação.
Tal como aqui utilizado, "complementar" em referência aos nucleósidos, oligonucleótidos ou ácidos nucleicos ligados refere-se à capacidade de um composto oligomérico para hibridar com outro composto oligomérico ou ácido nucleico através da complementaridade da nucleobase. Em certas formas de realização, um composto antisentido e o seu alvo são complementares entre si quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula são ocupadas por nucleobases que podem ligar-se umas às outras para permitir uma associação estável entre o composto anti-sentido e o alvo. Um especialista na técnica reconhece que a inclusão de desajustes é possível sem eliminar a capacidade dos compostos oligoméricos de permanecerem em associação. Portanto, aqui estão descritos os compostos anti-sentido que podem compreender até cerca de 20% de nucleótidos que são incompatíveis (isto é, não são nucleobase complementares aos nucleótidos correspondentes do alvo). De preferência, os compostos anti-sentido não contêm mais do que cerca de 15%, mais preferencialmente não mais do que cerca de 10%, mais preferencialmente não mais de 5% ou sem desajustes. Os nucleótidos restantes são nucleobases complementares ou, de outro modo, não perturbam a hibridação (por exemplo, bases universais). Um especialista na matéria reconheceria que os compostos aqui proporcionados são pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, a pelo menos 99% ou 100% complementares a um ácido nucleico alvo ou complementaridade reversa a um ácido nucleico alvo.
Tal como aqui utilizado, "modulação" refere-se a uma perturbação da quantidade ou qualidade de uma função ou actividade quando comparada à função ou actividade anterior à modulação. Por exemplo, a modulação inclui a mudança, seja um aumento (estimulação ou indução) ou uma diminuição (inibição ou redução) na expressão gênica. Como um exemplo adicional, a modulação da expressão pode incluir a seleção do site de amolação perturbadora do processamento pré-mRNA, resultando numa alteração na quantidade de um presente variante de emenda particular em comparação com condições que não foram perturbadas. Como outro exemplo, a modulação inclui tradução perturbadora de uma proteína.
Tal como aqui utilizado, "motivo" refere-se a um padrão de modificações num composto oligomérico ou uma sua região. Os motivos podem ser definidos por modificações em certos nucleósidos e/ou em certos grupos de ligação de um composto oligomérico.
Tal como aqui utilizado, "as mesmas modificações" referem-se a modificações relativas a moléculas de ocorrência natural que são iguais entre si, incluindo a ausência de modificações. Assim, por exemplo, dois nucleósidos de DNA não modificados têm "a mesma modificação", mesmo que o nucleósido de DNA não esteja modificado.
Tal como aqui utilizado, "tipo de modificação" em referência a um nucleósido ou um nucleósido de um "tipo" refere-se à modificação de um nucleósido e inclui nucleósidos modificados e não modificados. Consequentemente, a menos que seja indicado de outro modo, um "nucleósido com uma modificação de um primeiro tipo" pode ser um nucleósido não modificado.
Tal como aqui utilizado, "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais de compostos activos que retêm a actividade biológica desejada do composto activo e não conferem efeitos toxicológicos indesejáveis.
Tal como aqui utilizado, o termo "independentemente" significa que cada ocorrência de uma variável repetitiva dentro de um oligonucleótido reivindicado é seleccionada independentemente uma da outra. Por exemplo, cada variável repetitiva pode ser selecionada para que (i) cada uma das variáveis repetitivas sejam as mesmas, (ii) duas ou mais são as mesmas, ou (iii) cada uma das variáveis repetitivas pode ser diferente.
Definições de Química Geral
Tal como aqui utilizado, "alquilo" refere-se a um substituinte ou radical hidrocarboneto saturado linear ou ramificado, contendo tipicamente até vinte e quatro átomos de carbono. Exemplos de grupos alquilo incluem, mas não estão limitados a, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo e semelhantes. Os grupos alquilo incluem tipicamente de 1 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a 12 átomos de carbono (C1-C12 alquilo) com 1 a 6 átomos de carbono (0χ-06 alquilo mais preferido. 0 termo "alquilo inferior" tal como aqui utilizado inclui de 1 a 6 átomos de carbono (Ci-Cô alquilo). Os grupos alquilo tal como aqui utilizados podem opcionalmente conter um ou mais substituintes adicionais.
Tal como aqui utilizado, "alcenilo" refere-se a um radical ou substituinte de cadeia de hidrocarboneto linear ou ramificado, contendo tipicamente até vinte e quatro átomos de carbono, e tendo pelo menos uma ligação dupla carbono- carbono. Exemplos de grupos alcenilo incluem, mas não estão limitados a, etenilo, propenilo, butenilo, l-metil-2-buten-1-ilo, dienos tais como 1,3-butadienilo e semelhantes. Os grupos alcenilo tipicamente incluem de 2 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a 12 átomos de carbono com mais de 2 a 6 átomos de carbono. Os grupos alcenilo como aqui utilizados podem opcionalmente conter um ou mais substituintes adicionais.
Tal como aqui utilizado, "alcinilo" refere-se a um radical hidrocarboneto linear ou ramificado ou a um substituinte, contendo tipicamente até vinte e quatro átomos de carbono e possuindo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Exemplos de grupos alcinilo incluem, mas não estão limitados a, etinilo, 1-propinilo, 1-butinilo e semelhantes. Os grupos alquinilo tipicamente incluem de 2 a 24 átomos de carbono, sendo mais preferencialmente de preferência entre 2 a 12 átomos de carbono com 2 a 6 átomos de carbono. Os grupos alquinilo como aqui utilizados podem opcionalmente conter um ou mais substituintes adicionais. Tal como aqui utilizado, "aminoalquilo" refere-se a um radical alquilo ou substituinte amino substituído. Este termo deve incluir C1-C12 grupos alquilo com um substituinte amino em qualquer posição e em que o grupo aminoalquilo está ligado à molécula original através da sua porção alquilo. As porções de alquilo e/ou amino do grupo aminoalquilo podem opcionalmente ser adicionalmente substituídas por outros substituintes.
Tal como aqui utilizado, "alifático" refere-se a um radical ou substituinte de hidrocarboneto linear ou ramificado, tipicamente contendo até vinte e quatro átomos de carbono, em que a saturação entre quaisquer dois átomos de carbono é uma ligação simples, dupla ou tripla. Um grupo alifático contém preferencialmente de 1 a 24 átomos de carbono, sendo mais preferencialmente de 1 a 12 átomos de carbono com 1 a 6 átomos de carbono. A cadeia linear ou ramificada de um grupo alifático pode ser interrompida com um ou mais heteroátomos que incluem nitrogénio, oxigénio, enxofre e fósforo. Tais grupos alifáticos interrompidos por heteroátomos incluem, sem limitação, polialcoxis, tais como polialquilenoglicóis, poliaminas e poliiminas. Os grupos alifáticos tal como aqui utilizados podem opcionalmente conter outros substituintes .
Tal como aqui utilizado, "aliciclico" ou "aliciclil" refere-se a um radical cíclico ou substituinte, em que o sistema de anel é alifático. 0 sistema de anel pode compreender um ou mais anéis em que pelo menos um anel é alifático. As porções alicíclicas preferidas incluem anéis com 5 a 9 átomos de carbono no anel. Os grupos alicíclicos, tal como aqui utilizados, podem opcionalmente conter outros substituintes.
Tal como aqui utilizado, "alcoxi" refere-se a um radical ou substituinte que compreende um grupo alquilo e um átomo de oxigénio, em que o grupo alcoxi está ligado a uma molécula original através do seu átomo de oxigénio. Exemplos de grupos alcoxi incluem, mas não estão limitados a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi e semelhantes. Os grupos alcoxi como aqui utilizados podem opcionalmente conter outros substituintes.
Tal como aqui utilizado, "halo", "haleto" e "halogéneo" referem-se a um átomo, radical ou substituinte seleccionado de entre flúor, cloro, bromo e iodo.
Tal como aqui utilizado, "arilo" e "aromático" referem-se a um radical ou substituinte que compreende um sistema de anel carbocíclico mono-ou policíclico possuindo um ou mais anéis aromáticos. Exemplos de grupos arilo incluem, mas não estão limitados a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idílico e semelhantes. Os sistemas de anel de arilo preferidos têm de 5 a 20 átomos de carbono em um ou mais anéis. Os grupos arilo como aqui utilizados podem opcionalmente conter outros substituintes.
Tal como aqui utilizado, "aralquilo" e "arilalquilo" se referem a um radical ou substituinte que compreende um grupo alquilo e um grupo arilo, em que o grupo aralquilo ou arilalquilo está ligado a uma molécula original através da sua porção alquilo. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, benzilo, fenetilo e semelhantes. Os grupos aralquilo, tal como aqui utilizados, podem opcionalmente conter outros substituintes ligados ao alquilo, ao arilo ou a ambas as porções que formam o radical ou o substituinte.
Tal como aqui utilizado, "heterociclilo" refere-se a um radical ou substituinte que compreende um sistema de anel mono-ou policíclico que inclui pelo menos um heteroátomo e é insaturado, parcialmente saturado ou totalmente saturado, incluindo assim grupos heteroarilo. Heterociclilo também pretende incluir porções do sistema de anel fundido em que um ou mais dos anéis fundidos contêm pelo menos um heteroátomo e os outros anéis podem conter um ou mais heteroátomos ou, opcionalmente, não contêm heteroátomos. Um grupo heterocíclico tipicamente inclui pelo menos um átomo seleccionado de enxofre, nitrogénio ou oxigénio. Exemplos de grupos heterocíclicos incluem [1,3] dioxolano, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo e semelhantes. Os grupos heterociclicos tal como aqui utilizados podem opcionalmente conter outros substituintes. Tal como aqui utilizado, "heteroarilo" e "heteroaromático" referem-se a um radical ou substituinte que compreende um anel aromático mono-ou policíclico, um sistema de anel ou um sistema de anel condensado em que pelo menos um dos anéis é aromático e inclui um ou mais heteroátomos. Heteroaril também pretende incluir sistemas de anel fundido incluindo sistemas em que um ou mais dos anéis fundidos não contenham heteroátomos. Os grupos heteroarilo incluem tipicamente um átomo de anel seleccionado de enxofre, nitrogénio ou oxigénio. Exemplos de grupos heteroarilo incluem, mas não estão limitados a, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo e outros. Os radicais ou substituintes heteroarilo podem ser ligados a uma molécula original directamente ou através de uma unidade de ligação tal como um grupo alifático ou um heteroátomo. Os grupos heteroarilo tal como aqui utilizados podem opcionalmente conter outros substituintes.
Tal como aqui utilizado, "heteroarilalquilo" refere-se a um radical ou substituinte que compreende um grupo heteroarilo como anteriormente definido e uma porção alquilo, em que o grupo heteroarilalquilo é ligado a uma molécula original através da sua porção alquilo. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, piridinilmetilo, pirimidiniletilo, naptiridilpropilo e semelhantes. Os grupos heteroarilalquilo, tal como aqui utilizados, podem opcionalmente conter outros substituintes numa ou em ambas as porções heteroarilo ou alquilo.
Tal como aqui utilizado, "mono ou policíclico" refere-se a quaisquer sistemas de anel, tais como um único anel ou um sistema policíclico possuindo anéis que são fundidos ou ligados, e pretende incluir sistemas de anel único e misturado seleccionados individualmente a partir de alifáticos, alicíclicos, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático e heteroarilalquilo. Tais estruturas mono e policíclicas podem conter anéis que possuem um grau de saturação uniforme ou variável, incluindo anéis totalmente saturados, parcialmente saturados ou totalmente insaturados. Cada anel pode compreender átomos de anel seleccionados de C, N, 0 e S para dar origem a anéis heterocíclicos, bem como anéis que compreendem apenas átomos do anel C. Os anéis heterocíclicos e todos os carbonos podem estar presentes num motivo misturado, tal como, por exemplo, benzimidazol, em que um anel do sistema de anel condensado tem apenas átomos do anel de carbono e o outro anel possui dois átomos de azoto. As estruturas mono ou policíclicas podem ainda ser substituídas por substituintes tais como, por exemplo, ftalimida que tem dois grupos oxo (= 0) ligados a um dos anéis. Noutro aspecto, as estruturas mono ou policíclicas podem ser ligadas a uma molécula original directamente através de um átomo do anel, através de um substituinte ou de uma porção de ligação bifuncional.
Tal como aqui utilizado, "acilo" refere-se a um radical ou substituinte que compreende uma porção carbonilo (C=0 ou -C (0) -) e um outro substituinte X, em que o grupo acilo está ligado a uma molécula original através da sua porção carbonilo. Como tal, um grupo acilo é formalmente obtido por remoção de um grupo hidroxilo de um ácido orgânico e tem a fórmula geral -C (0) -X, em que X é tipicamente alifático, aliciclico ou aromático. 0 termo "acilo" também pretende incluir radicais heteroálicos ou substituintes com a fórmula geral -Y (0)n-X, em que X é como definido acima e Y (0) n é tipicamente sulfonilo, sulfinilo ou fosfato. Exemplos de grupos acilo incluem carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos e semelhantes. Os grupos acilo tal como aqui utilizados podem opcionalmente conter outros substituintes.
Tal como aqui utilizado, "substituinte" e "grupo substituinte" incluem grupos que são tipicamente adicionados a outros substituintes ou compostos parentais para melhorar as propriedades desejadas ou dar os efeitos desejados. Os grupos de substituição podem ser protegidos ou desprotegidos e podem ser anexados a um site disponível ou a muitos sites disponíveis num composto original. Os grupos de substituição podem também ser adicionalmente substituídos com outros grupos substituintes e podem ser ligados directamente ou através de um grupo de ligação tal como um grupo alquilo ou hidrocarbilo a um composto original. Aqui, "hidrocarbilo" refere-se a qualquer grupo que compreende C, 0 e H. Incluídos estão grupos heterossexuais, ramificados e cíclicos com qualquer grau de saturação. Tais grupos hidrocarbilo podem incluir um ou mais heteroátomos seleccionados de N, 0 e S e podem ainda ser substituídos com um ou mais substituintes.
Salvo indicação em contrário, o termo "substituído" ou "opcionalmente substituído" refere-se à presença (opcional) de qualquer dos seguintes substituintes: halogéneo, hidroxilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, acilo (-C (0) Raa), carboxilo (-C (0) 0-RAa) , grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxo substituído (-0-Raa), arilo,
aralquilo, heterociclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-NRbbRCc) , imino (= NRbb) , amido (-C (0) NRbbRCc ou -N
(Rbb) C (0) Raa) , azido (-N3) , nitro (-N02) , ciano (-CN) , carbamido (-0C (0) NRbbRcc ou -N (Rbb) C (0) 0Raa) , ureido (-N (Rbb) C (0) NRbbRcc) , tioureido (-N (Rbb) C (S) NRbbRcc) , guanidinil (-N (Rbb) C (= NRbb) NRbbRcc) , amidinil (-C ( = NRbb) NRbbRcc ou -N (Rbb) C (NRbb) Raa) , tiol (-SRbb), sulfinilo (-S (0)2 NRbb) , sulfonil (-S (O^Rbb)/· suitonamidilo (-S (0)2NRbbRcc e grupos conjugados. Aqui, cada Raa, Rbb e Rcc é, independentemente, H, um grupo funcional químico opcionalmente ligado ou um substituinte adicional, de preferência mas sem limitação escolhido do grupo que consiste em H, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterociclico e heteroarilalquilo. Os substituintes seleccionados nos compostos aqui descritos estão presentes num grau recursivo.
Neste contexto, "substituinte recursivo" significa que um substituinte pode recitar outra instância de si mesma. Devido à natureza recursiva de tais substituintes, teoricamente, um grande número pode estar presente em qualquer reivindicação dada. Um especialista na técnica de química medicinal e química orgânica entende que o número total de tais substituintes é razoavelmente limitado pelas propriedades desejadas do composto pretendido. Tais propriedades incluem, a título de exemplo e não de limitação, propriedades físicas tais como peso molecular, solubilidade ou log P, propriedades de aplicação tais como atividade contra o alvo pretendido e propriedades práticas, como facilidade de síntese.
Os substituintes recursivos são um aspecto pretendido da invenção. Um especialista na técnica da química medicinal e orgânica entende a versatilidade de tais substituintes. Na medida em que os substituintes recursivos estão presentes numa reivindicação da invenção, o número total será determinado conforme estabelecido acima.
Tal como aqui utilizado, um zero (0) num intervalo que indica o número de uma unidade particular significa que a unidade pode estar ausente. Por exemplo, um composto oligomérico compreendendo 0-2 regiões de um motivo particular significa que o composto oligomérico pode compreender uma ou duas dessas regiões com o motivo particular, ou o composto oligomérico pode não ter quaisquer regiões com o motivo particular. Nos casos em que uma porção interna de uma molécula está ausente, as porções que flanqueiam a porção ausente são ligadas diretamente uma à outra. Do mesmo modo, o termo "nenhum", tal como aqui utilizado, indica que uma determinada característica não está presente. Tal como aqui utilizado, "análogo" ou "derivado" significa um composto ou unidade semelhante em estrutura, mas diferente em relação à composição elementar do composto original, independentemente da forma como o composto é produzido. Por exemplo, um composto analógico ou derivado não precisa ser feito a partir do composto original como um material de partida químico.
Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o alcance da presente invenção de qualquer maneira.
Legendas para a figura
Figura 2. Em vitro ensaio de atividade para (XYG)7 em que X = 5-metilcitosina e Y = U (PS659 SEQ ID NO:90, derivado de SEQ ID NO:2) e (XYG) 7 em que X = C e Y é 5-metiluracilo (PS661 SEQ ID NO:97) derivado da SEQ ID NO:3). PS659 (la) e PS661 (lb) foram transfectados em fibroblastos HD (GM04022) em concentrações crescentes (0,5 - 200 nM). A eficácia e a seletividade foram determinadas com RT-PCR e análise de laboratório num chip. Silenciamento do expandido ((CAG)44) e saudável ((CAG)is) as transcrições de HTT foram comparadas com os niveis de transcrição de HTT relativos em amostras simuladas. Para todos os AONs n = 2, exceto para simulação (n = 3).
Figura 2. Dentro vivo eficácia de PS659 ((XYG)7 em que X = 5-metilcitosina e Y = U; SEQ ID NO:2) num modelo de rato HD transgênico. Ratos transgênicos HD ( (CAG)5i repetição) recebeu 15 vezes uma injecção intraventricular com PS659 (SEQ ID NO:90 derivado da SEQ ID NO:2), durante 18 semanas a uma dose final de 200 pg por injeção, os ratos de controle HD receberam apenas o veiculo. Os ratos foram sacrificados uma semana após a injeção final. De qualquer tecido de ratos foi isolado e os niveis de HTT foram determinados com análise Q-RT-PCR. Os niveis reduzidos de transcrição HTT foram encontrados em (A) córtex, (B) hipocampo, (C) bulbo olfatório e (D) thalamus após o tratamento com PS659 em comparação com o controlo. TABELA 1. Estruturas gerais de AONs.X = C ou 5-metilcitosina Y = U ou 5-metiluracilo, Z = A ou 2,6-diaminopurina, I = inosina e Q = monómero abásico.
TABELA 2. Estruturas gerais de AONs. Todos os AONs são 2'-0- AONs de metil fosforotioato em que C é 5-metilcitosina, U é 5-metiluracilo, A é 2,6-diaminopurina, I é inosina e Q é um monómero abásico.
Exemplos EXEMPLO 1.
Introdução
As características particulares de uma química de oligonucleótido anti-sentido escolhido (AON) podem, pelo menos em parte, melhorar a afinidade e estabilidade da ligação, aumentar a actividade, melhorar a segurança e/ou reduzir o custo das mercadorias, reduzindo o comprimento ou melhorando os procedimentos da síntese e/ou purificação. Este exemplo descreve a análise comparativa da atividade de AONs projetada para segmentar a expansão (CAG)n repetir em transcritos HTT em fibroblastos HD in vitro, e inclui AON com 5-metilcitosinas (XYG)7 em que X é 5-metilcitosina e Y = U sendo também identificado como SEQ ID NO:90 (e derivado de SEQ ID NO:2), ou 5-metiluracils (XYG)7 em que X = C e Y = 5-metiluracilo também são identificados como SEQ ID NO: 97 (e derivados de SEQ ID NO:3).
Materiais e métodos
Cultura de células. Os fibroblastos HD derivados do paciente (GM04022) (adquiridos de Coriell Cell Repositories, Camden, EUA) foram cultivados a 37°C e 5% de CO2 em Minimal Essential Medium (MEM) (Gibco Invitrogen,
Carlsbad, EUA) com 15% de soro fetal bovino inactivado por calor (FBS) (Clontech, Paio Alto EUA) , 1% de Glutamax (Gibco) e 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (P/S) (Gibco).
Oligonucleótidos. Os AONs estavam completamente 2'-0-metil fosforotioato modificado: PS659; (XYG)7 em que X é 5-metilcitosina e Y = U sendo também identificado como SEQ ID NO:90 (e derivado de SEQ ID NO:2) e PS661; (XYG)7 em que X = C e Y = 5-metiluracilo também são identificados como SEQ ID NO:97 (e derivados de SEQ ID NO:3).
Transfecção. As células foram transfectadas com AONs complexadas com PEI (2 pL por pg de AON, em NaCl 0,15 M). O complexo de AON-PEI foi adicionado em meio MEM com 5% de FBS a células até uma concentração de AON final variando de 0,5 a 200 nM. O meio fresco foi suplementado após quatro horas e após 24 horas o RNA foi isolado.
Isolamento de ARN. O ARN de células cultivadas foi isolado usando o Aurum Total RNA Mini Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.
Análise RT-PCR e Lab-on-a-chip. Aproximadamente 200 ng de ARN foi submetido a síntese de cDNA com hexâmeros aleatórios usando o sistema de síntese do subscrito de primeira linha (Invitrogen) num volume total de 20 pL. O PCR foi realizado com iniciadores para HTT (através da repetição CAG) e β-actina. O programa de PCR começou com uma desnaturação inicial de 4 min a 95°C, seguido de 35 ciclos de desnaturação de 30 segundos a 94°C, 30 segundos de recozimento a 60°C, alongamento de 45 segundos a 72°C, após o que um passo de alongamento final foi realizada a 72 °C durante 7 min. O Lab-on-a-Chip foi realizado no Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha), utilizando o Agilent DNA 1000 Kit. Os niveis de expressão foram normalizados para os niveis de β-actina e em relação aos niveis de transcrição sem transfecção. Foram utilizados os seguintes iniciadores: HTT para a frente; 5'-ATGGCGACCCTGGAAAAGCTGAT-3'(SEQ ID NO:70) HTT reverso: 5'-TGAGGCAGCAGCGGCTG-3'(SEQ ID NO:71) β-actina para a frente; 5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'(SEQ ID NO:72) β-actina reversa; 5'- AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'(SEQ ID NO:73)
Resultados
Tanto o PS659 (SEQ ID NO:90 derivado da SEQ ID NO:2) como o PS661 (SEQ ID NO:97 derivados da SEQ ID NO:3) foram altamente eficazes e reduziram os transcritos HTT em fibroblastos HD de uma maneira dependente da dose (Figura la, B). Ambos os AONs também mostraram uma preferência pelo alelo com as repetições CAG expandidas. O PS659 (SEQ ID NO: 90 derivado da SEQ ID NO:2) foi mais eficaz e mais especifico do alelo a concentrações mais baixas (efeito mais forte a 5 nM) (la) do que o PS661 (SEQ ID NO: 97 derivado da SEQ ID NO:3) (efeito mais forte a 20 nM) (lb). EXEMPLO 2.
Introdução PS659 (XYG)7, em que X é 5-metilcitosina e Y = U também identificado como SEQ ID NO:90 (derivado da SEQ ID NO:2), foi selecionado de em vitro estudos como candidatos mais eficientes e seguros. Este exemplo descreve a sua atividade num modelo de rato transgênico HD após uma série de injeções intraventriculares diretas.
Materiais e métodos
Animais. Os ratos Transgenic HD carregam um fragmento de cDNA de Huntington truncado com 51 repetições de CAG sob o controlo do promotor de Huntington de rato nativo. 0 produto do gene expresso é de aproximadamente 75 kDa, correspondendo a 22% do Huntington completo (posição de cDNA 324-2321, posição de aminoácido 1-709/825, correspondente ao exão 1-16), sob o controlo de 886 pb do promotor Hunting Hunting Huntington (von Hõrsten S. et al.). Todas as experiências com animais foram aprovadas pelos Comités Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Maastricht, Maastricht.
Oligonucleótidos. PS659 (XYG)7 em que X é 5-metilcitosina e Y = U também identificado como SEQ ID NO: 90 (derivado de SEQ ID NO:2), é um completamente 2'-0-metil fosforotioato modificado de AON.
Tratamento in vivo. Os ratos Transgenic HD receberam 15 vezes uma injecção intraventricular numa dose final de 200 pg de PS659 também identificada como SEQ ID NO:90 (derivada da SEQ ID NO:2) durante 18 semanas. Os ratos control HD recebidos apenas pelo veiculo. Os ratos foram sacrificados uma semana após a injeção final.
Isolamento de ARN. O RNA do tecido cerebral foi isolado usando reagente RNA-Bee (Tel Test, Inc) . Em resumo, as amostras do tecido foram homogeneizadas em tubos de grânulos verdes de MagNA Lyser (Roche) , adicionando RNA-Bee (50 mg de tecido/mL de RNA-Bee) e homogeneizados usando um instrumento MagNA Lyser (Roche). O lisado foi transferido para um novo tubo, foi adicionado clorofórmio (SIGMA) (0,2 mL por mL de RNA-Bee), misturado, incubado em gelo durante 5 minutos e centrifugado a 13,000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Recolheu-se a fase aquosa superior e adicionou-se um volume igual de isopropanol (SIGMA), seguido de um período de incubação de 1 hora a 4°C e centrifugação (13,000 rpm, 15 min, 4°C). O precipitado de ARN foi lavado com etanol a 70% (v/v) (BioSolve), seco ao ar e dissolvido em MilliQ.
Análise quantitativa de RT-PCR. Aproximadamente 200ng foram submetidos a síntese de cDNA com hexâmeros aleatórios usando o sistema de síntese de primeira cadeia sobrescrito (Invitrogen) num volume total de 20 pL. Adicionou-se 3 pL de preparação de diluição de cADN de 1/40 numa análise de PCR quantitativa de acordo com procedimentos padrão na presença de iQ™SYBR® Green Supermix (Bio-Rad). Os iniciadores de PCR quantitativos foram projetados com base na informação da sequência do banco de dados NCBI. A identidade do produto foi confirmada pela sequência de DNA. O sinal para Rab2 e YWHAZ foi utilizado para a normalização. Foram utilizados os seguintes iniciadores:
Rat Htt-F; 5'- CGCCGCCTCCTCAGCTTC -3'(SEQ ID NO:74)
Rat Htt-R; 5'- GAGAGTTCCTTCTTTGGTCGGTGC -3'(SEQ ID NO:75) Rab2-F; 5'- TGGGAAACAGATAAAACTCCAGA-3'(SEQ ID NO:76)
Rab2-R; 5'- AATATGACCTTGTGATAGAACGAAAG-3'(SEQ ID NO:77) YWHAZ-F; 5'- AAATGAGCTGGTGCAGAAGG-3'(SEQ ID NO:78) YWHAZ-R; 5'- GGCTGCCATGTCATCGTAT -3'(SEQ ID NO:79)
Resultados PS659 (também identificado como SEQ ID NO:90 ou derivado de SEQ ID NO:2) reduziu os níveis transcritos da transcrição de Htt no córtex (Figura 2a), Hipocampo (Figura 2b), bulbo olfativo (Figura 2c), bem como no tálamo (Figura 3d) quando comparado com ratos tratados com solução salina. Estes rpsul farins rlpmonsfram ππρ PS 65 9 (fambém identificado nnmn SEQ ID NO:90 ou derivado de SEQ ID NO:2) é eficaz em vivo após injeção intraventricular direta.
Lisboa, 02 de Agosto de 2017
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(13)..(13) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> η is U or 5-methyluracil <4 0 0> 5 nngnngnngn ngnng 15 <210> 6 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> η is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc feature <222> (7).7(7) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is U or 5-methyluracil <400> 6 nngnngnngn ngnngnng 18 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is U or 5-methyluracil <400> 7 nngnngnngn ngnngnngnn g 21 <210> 8 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> η is U or 5-methyluracil <4 0 0> 8 nngnngnngn ngnngnngnn gnng 24 <210> 9 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> 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(22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is U or 5-methyluracil <400> 9 nngnngnngn ngnngnngnn gnngnng 27 <210> 10 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17) . . (17) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is U or 5-methyluracil <400> 10 nngnngnngn ngnngnngnn gnngnngnng 30 <210> 11 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (32) . . 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<222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 16 ngnngnngnn gnngnngnng n 21 <210> 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(22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 18 ngnngnngnn gnngnngnng nngnngn 27 <210> 19 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> 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is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is C or 5-methylcytosine <4 Ο 0> 20 ngnngnngnn gnngnngnng nngnngnngn ngn 33 <210> 21 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> 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(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 25 nngnngnngn ngnngnngnn g 21 <210> 26 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> η is C or 5-methylcytosine <4 0 0> 26 nngnngnngn ngnngnngnn gnng 24 <210> 27 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 27 nngnngnngn ngnngnngnn gnngnng 27 <210> 28 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (19)7.(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 28 nngnngnngn ngnngnngnn gnngnngnng 30 <210> 29 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13) .. 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(32) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 29 nngnngnngn ngnngnngnn gnngnngnng nng 33 <210> 30 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (32) . . (32) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 30 nngnngnngn ngnngnngnn gnngnngnng nngnng 36 <210> 31 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 31 nnnnnnnnnn nn 12 <210> 32 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc feature <222> (5).7(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 32 nnnnnnnnnn nnnnn 15 <210> 33 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 33 nnnnnnnnnn nnnnnnnn 18 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> η is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc feature <222> (8).7(8) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13) .. (13) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 34 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21 <210> 35 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> η is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> η is C or 5-methylcytosine <4 0 0> 35 ηηηηηηηηηη ηηηηηηηηηη ηηηη 24 <210 > 36 <211> 27 <2 12> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10) . . 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(2)..(2) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> η is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is U or 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 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(33) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> η is C or 5-methylcytosine <4 0 0> 48 ggnggnggng gnggnggngg nggnggnggn ggnggn 36 <210> 49 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 49 nggnggnggn gg 12 <210> 50 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η is C or 5-methylcytosine <4 0 0> 50 nggnggnggn ggngg 15 <210> 51 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 51 nggnggnggn ggnggngg 18 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 52 nggnggnggn ggnggnggng g 21 <210> 53 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 53 nggnggnggn ggnggnggng gngg 24 <210> 54 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 54 nggnggnggn ggnggnggng gnggngg 27 <210 > 55 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (22)7.(22) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 55 nggnggnggn ggnggnggng gnggnggngg 30 <210> 56 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 56 nggnggnggn ggnggnggng gnggnggngg ngg 33 <210> 57 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 57 nggnggnggn ggnggnggng gnggnggngg nggngg 36 <210> 58 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is U or 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is A or 2,6-diaminopurine 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(22) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <4 0 0> 6 6 nnggnnggnn ggnnggnngg nngg 24 <210> 67 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (5) ..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <400> 67 nnggnnggnn ggnnggnngg nnggnngg 28 <210> 68 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <400> 68 nnggnnggnn ggnnggnngg nnggnnggnn gg 32 <210> 69 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (13) .. (13) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is A or 2,6-diaminopurine <4 0 0> 69 nnggnnggnn ggnnggnngg nnggnnggnn ggnngg 36 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> 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Homo sapiens <400> 80 gctgccggga cgggtccaag atggacggcc gctcaggttc tgcttttacc tgcggcccag 60 agccccattc attgccccgg tgctgagcgg cgccgcgagt cggcccgagg cctccgggga 120 ctgccgtgcc gggcgggaga ccgccatggc gaccctggaa aagctgatga aggccttcga 180 gtccctcaag tccttccagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcagca 240 gcagcagcag cagcagcagc aacagccgcc accgccgccg ccgccgccgc cgcctcctca 300 gcttcctcag ccgccgccgc aggcacagcc gctgctgcct cagccgcagc cgcccccgcc 360 gccgcccccg ccgccacccg gcccggctgt ggctgaggag ccgctgcacc gaccaaagaa 420 agaactttca gctaccaaga aagaccgtgt gaatcattgt ctgacaatat gtgaaaacat 480 agtggcacag tctgtcagaa attctccaga atttcagaaa cttctgggca tcgctatgga 540 actttttctg ctgtgcagtg atgacgcaga gtcagatgtc aggatggtgg ctgacgaatg 600 cctcaacaaa gttatcaaag ctttgatgga ttctaatctt ccaaggttac agctcgagct 660 ctataaggaa attaaaaaga atggtgcccc tcggagtttg cgtgctgccc tgtggaggtt 720 tgctgagctg gctcacctgg ttcggcctca gaaatgcagg ccttacctgg tgaaccttct 780 gccgtgcctg actcgaacaa gcaagagacc cgaagaatca gtccaggaga ccttggctgc 840 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ggatctggcc agctgtgact tgacaagctc tgccactgat ggggatgagg aggatatctt 1740 gagccacagc tccagccagg tcagcgccgt cccatctgac cctgccatgg acctgaatga 1800 tgggacccag gcctcgtcgc ccatcagcga cagctcccag accaccaccg aagggcctga 1860 ttcagctgtt accccttcag acagttctga aattgtgtta gacggtaccg acaaccagta 1920 tttgggcctg cagattggac agccccagga tgaagatgag gaagccacag gtattcttcc 1980 tgatgaagcc tcggaggcct tcaggaactc ttccatggcc cttcaacagg cacatttatt 2040 gaaaaacatg agtcactgca ggcagccttc tgacagcagt gttgataaat ttgtgttgag 2100 agatgaagct actgaaccgg gtgatcaaga aaacaagcct tgccgcatca aaggtgacat 2160 tggacagtcc actgatgatg actctgcacc tcttgtccat tgtgtccgcc ttttatctgc 2220 ttcgtttttg ctaacagggg gaaaaaatgt gctggttccg gacagggatg tgagggtcag 2280 cgtgaaggcc ctggccctca gctgtgtggg agcagctgtg gccctccacc cggaatcttt 2340 cttcagcaaa ctctataaag ttcctcttga caccacggaa taccctgagg aacagtatgt 2400 ctcagacatc ttgaactaca tcgatcatgg agacccacag gttcgaggag ccactgccat 2460 tctctgtggg accctcatct gctccatcct cagcaggtcc cgcttccacg tgggagattg 2520 gatgggcacc attagaaccc tcacaggaaa tacattttct ttggcggatt gcattccttt 2580 gctgcggaaa acactgaagg atgagtcttc tgttacttgc aagttagctt gtacagctgt 2640 gaggaactgt gtcatgagtc tctgcagcag cagctacagt gagttaggac tgcagctgat 2700 catcgatgtg ctgactctga ggaacagttc ctattggctg gtgaggacag agcttctgga 2760 aacccttgca gagattgact tcaggctggt gagctttttg gaggcaaaag cagaaaactt 2820 acacagaggg gctcatcatt atacagggct tttaaaactg caagaacgag tgctcaataa 2880 tgttgtcatc catttgcttg gagatgaaga ccccagggtg cgacatgttg ccgcagcatc 2940 actaattagg cttgtcccaa agctgtttta taaatgtgac caaggacaag ctgatccagt 3000 agtggccgtg gcaagagatc aaagcagtgt ttacctgaaa cttctcatgc atgagacgca 3060 gcctccatct catttctccg tcagcacaat aaccagaata tatagaggct ataacctact 3120 accaagcata acagacgtca ctatggaaaa taacctttca agagttattg cagcagtttc 3180 tcatgaacta atcacatcaa ccaccagagc actcacattt ggatgctgtg aagctttgtg 3240 tcttctttcc actgccttcc cagtttgcat ttggagttta ggttggcact gtggagtgcc 3300 tccactgagt gcctcagatg agtctaggaa gagctgtacc gttgggatgg ccacaatgat 3360 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<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 gagaggggca gggggcggag ctggaggggg tggttcggcg tgggggccgt tggctccaga 60 caaataaaca tggagtccat cttccacgag aaacaagaag gctcactttg tgctcaacat 120 tgcctgaata acttattgca aggagaatat tttagccctg tggaattatc ctcaattgca 180 catcagctgg atgaggagga gaggatgaga atggcagaag gaggagttac tagtgaagat 240 tatcgcacgt ttttacagca gccttctgga aatatggatg acagtggttt tttctctatt 300 caggttataa gcaatgcctt gaaagtttgg ggtttagaac taatcctgtt caacagtcca 360 gagtatcaga ggctcaggat cgatcctata aatgaaagat catttatatg caattataag 420 gaacactggt ttacagttag aaaattagga aaacagtggt ttaacttgaa ttctctcttg 480 aogggtooag aattaatatc agatacatat cttgcacttt tcttggctca attacaacag 540 gaaggttatt ctatatttgt cgttaagggt gatctgccag attgcgaagc tgaccaactc 600 ctgcagatga ttagggtcca acagatgcat cgaccaaaac ttattggaga agaattagca 660 caactaaaag agcaaagagt ccataaaaca gacctggaac gagtgttaga agcaaatgat 720 ggctcaggaa tgttagacga agatgaggag gatttgcaga gggctctggc actaagtcgc 780 caagaaattg acatggaaga tgaggaagca gatctccgca 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(13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <400> 108 nugcugnugc ugnugcugnu g 21 <210> 109 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1) ..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) .. (22) <223> n is 5-methylcytosine <400> 109 nugnugnugn ugnugnugnu gnug 24 <210> 110 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is 5-methyluracil <400> 110 cngcngcngc ngcngcngcn gcng 24 <210> 111 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13) .. (13) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <400> 111 nugnugnugn ugnugnugnu gnugnug 27 <210> 112 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc feature <222> (17)7.(17) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 5-methyluracil <400> 112 cngcngcngc ngcngcngcn gcngcng 27 <210> 113 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 5-methylcytosine <400> 113 nugnugnugn ugnugnugnu gnugnugnug 30 <210> 114 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc feature <222> (29)7.(29) <223> n is 5-methyluracil <400> 114 cngcngcngc ngcngcngcn gcngcngcng 30 <210> 115 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (4).7(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . 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(32) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n is 5-methyluracil <400> 118 cngcngcngc ngcngcngcn gcngcngcng cngcng 36 <210> 119 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonculeotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <400> 119 ngnngnngnn gn 12 <210> 120 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <400> 120 ngcngcngcn gc 12 <210> 121 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligoncleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (9).7(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15) . . (15) <223> n is 5-methylcytosine <4 Ο 0> 121 ngnngnngnn gnngn 15 <210> 122 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <4 0 0> 122 ngcngcngcn gcngc 15 <210> 123 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <400> 123 ngnngnngnn gnngnngn 18 <210> 124 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (7).7(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <400> 124 ngcngcngcn gcngcngc 18 <210> 125 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1) ..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 5-methylcytosine <400> 125 ngnngnngnn gnngnngnng n 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19) .. (19) <223> n is 5-methylcytosine < 4 Ο Ο > 126 ngcngcngcn gcngcngcng c 21 <210> 127 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 5-methylcytosine <400> 127 ngnngnngnn gnngnngnng nngn 24 <210> 128 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is 5-methylcytosine <400> 128 ngcngcngcn gcngcngcng cngc 24 <210> 129 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (3) ..(3) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18) .. (18) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19) . . (19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21) . . (21) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is 5-methylcytosine <400> 129 ngnngnngnn gnngnngnng nngnngn 27 <210> 130 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) .. (22) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> η is 5-methylcytosine <4 Ο 0> 130 ngcngcngcn gcngcngcng cngcngc 27 <210> 131 <211> 30 <2 12> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> η is 5-methylcytosine <220> <221> misc feature <222> (4).7(4) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24) . . (24) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 5-methylcytosine <400> 131 ngnngnngnn gnngnngnng nngnngnngn 30 <210> 132 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 5-methylcytosine <400> 132 ngcngcngcn gcngcngcng cngcngcngc 30 <210> 133 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methylcytosine <400> 133 nngnngnngn ng 12 <210> 134 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methylcytosine <400> 134 cngcngcngc ng 12 <210> 135 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 5-methylcytosine <400> 135 nngnngnngn ngnng 15 <210> 136 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 5-methylcytosine <400> 136 cngcngcngc ngcng 15 <210> 137 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13) .. 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(17) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . 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<2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 5-methylcytosine <400> 146 cngcngcngc ngcngcngcn gcngcngcng 30 <210> 147 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <400> 147 uunuunuunu un 12 <210> 148 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methyluracil <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5-methyluracil <2 2 0> <221> 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(3)..(3) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 186 ngnnungnnu ngnnungnnu 20 <210> 187 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucelotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 187 ngnnuagaau agaaungnnu 20 <210 > 188 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0 > <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> η is 2,6-diaminopurine <4 0 0> 188 ngnnuagaau ngnnuagaau 20 <210> 189 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is 2,6-diaminopurine <4 Ο 0> 189 ngaauagnnu ngaauagnnu 20 <210> 190 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 190 ngnnungnnu ngnnungnnu ngnnu 25 <210> 191 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 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2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 192 ngnnungnnu ngnnungnnu ngnnungnnu ngnnu 35 <210> 193 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <400> 193 naggnaggna gg 12 <210> 194 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 194 cnggcnggcn gg 12 <210> 195 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 195 cnggcnggcn ggcngg 16 <210> 196 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine < 4 Ο Ο > 196 naggnaggna ggnagg 16 <210> 197 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> η is 5-methylcytosine <4 0 0> 197 naggnaggna ggnaggnagg 20 <210> 198 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 198 cnggcnggcn ggcnggcngg 20 <210> 199 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5-methylcytosine <400> 199 naggcaggna ggcaggnagg 20 <210> 200 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 200 cnggcaggcn ggcaggcngg 20 <210> 201 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> η is 5-methylcytosine <4 Ο 0> 201 naggnaggna ggnaggnagg nagg 24 <210> 202 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> η is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> η is 2, 6-diaminopurine <400> 202 cnggcnggcn ggcnggcngg cngg 24 <210> 203
<211> 28 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (13)7.(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <400> 203 naggnaggna ggnaggnagg naggnagg 28 <210> 204 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 204 cnggcnggcn ggcnggcngg cnggcngg 28 <210> 205 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 5-methylcytosine <400> 205 naggnaggna ggnaggnagg naggnaggna gg 32 <210> 206 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) . . (22) <223> n is 2, 6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is 2,6-diaminopurine <400> 206 cnggcnggcn ggcnggcngg cnggcnggcn gg 32 <210> 207 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is 5-methylcytosine <400> 207 naggnaggna ggnaggnagg naggnaggna ggnagg 36 <210> 208 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 2,6-diaminopurine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n is 2,6-diaminopurine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) .. (22) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> η is 2,6-diaminopurine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> η is 2,6-diaminopurine <4 0 0> 208 cnggcnggcn ggcnggcngg cnggcnggcn ggcngg 36 <210> 209 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <400> 209 ggcucnggcu cnggcuc 17
<210> 210 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc feature <222> (12)7.(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <400> 210 ggcncnggcn cnggcncn 18 <210> 211 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18) . . (18) <223> n is 5-methylcytosine <400> 211 ggcucnggcu cnggcucn 18 <210> 212 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 5-methylcytosine <400> 212 ggcucnggcu cnggcucngg cucn 24 <210> 213 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc feature <222> (6).7(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is an abasic monomer <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is an abasic monomer <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 5-methylcytosine <4 0 0> 213 ggcncnggcn cnggcncngg cncn 24 <210> 214 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is inosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22) .. (22) <223> n is inosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 5-methylcytosine <400> 214 ggcncnggcn cnggcncngg cncn 24 <210> 215 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is 5-methylcytosine <400> 215 ggccunggcc unggccungg ccun 24 <210> 216 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (6).7(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 216 ggnunnggnu nnggnunn 18 <210> 217 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> η is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> η is C or 5-methylcytosine <4 0 0> 217 ggnunnggnu nnggnunngg nunn 24 <210> 218 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is inosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (9).7(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is inosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is inosine <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is inosine <2 2 0> <221> misc feature <222> (23)7.(23) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 218 ggnnnnggnn nnggnnnngg nnnn 24 <210> 219 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <2 2 0> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is C or 5-methylcytosine <220> <221> misc_feature <222> (22) .. (22) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is C or 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is C or 5-methylcytosine <400> 219 ggnnnnggnn nnggnnnngg nnnn 24 <210> 220 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial <2 2 0> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5-methylcytosine <2 2 Ο > <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> η is 5-methylcytosine <2 2 0> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> η is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n is an abasic monomer <2 2 0> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is an abasic monomer <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is an abasic monomer <400> 220 nugnugnugn ugnugnugnu gnnnn 25 <210> 221 <211> 25
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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.
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Claims (5)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Um oligonucleótido constituído por resíduos de nucleótido de ARN 2'-0-metilo, tendo uma espinha dorsal em que todas as fracções de fosfato são substituídas por fracções de fosforotioato, tendo o dito oligonucleótido uma sequência base constituída por (XYG) 7 em que cada X é 5-metilcitosina e cada Y é uracilo (SEQ ID NO:90).
  2. 2. Um oligonucleótido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito oligonucleótido ser um oligonucleótido de cadeia única.
  3. 3. Uma composição que compreende um oligonucleótido como definido nas reivindicações 1 ou 2.
  4. 4. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por esta compreender pelo menos um excipiente que pode ajudar ainda mais a melhorar o objetivo e/ou a administração da dita composição e/ou do dito oligonucleótido a um tecido e/ou célula e/ou num tecido e/ou célula.
  5. 5. Um oligonucleótido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, ou composição de com a reivindicação 3 ou 4, para o uso como um medicamento para prevenir, atrasar e/ou tratar uma instabilidade repetida do elemento-cis associado a um transtorno genético.
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