PT2264055E - Clonagem, expressão em levedura, purificação e atividade biológica da região de extensão da subunidade alfa' da globulina 7s da soja implicada na homeostase do colesterol em células hep g2 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"CLONAGEM, EXPRESSÃO EM LEVEDURA, PURIFICAÇÃO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DA REGIÃO DE EXTENSÃO DA SUBUNIDADE ALFA' DA GLOBULINA 7S DA SOJA IMPLICADA NA HOMEOSTASE DO COLESTEROL EM CÉLULAS HEP G2"

A presente invenção refere-se a um fragmento a' recombinante da globulina 7S da soja, que corresponde ao fragmento hidrofílico N-terminal da subunidade a' natural que consiste em 142 resíduos de aminoácidos do dito lado N-terminal, a um processo para a sua preparação e a composições contendo-o como um ingrediente ativo útil para controlar a homeostase do colesterol e triglicéridos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 papel de proteínas alimentares da soja no controlo de níveis de lípidos de pacientes hipercolesterolémicos é uma questão amplamente aceite [1]. Em estudos anteriores [2-4], a implicação direta de uma subunidade da globulina 7S da soja, a subunidade a', na regulação positiva do recetor LDL foi demonstrada em sistemas in vitro e in vivo, sugerindo que (poli)péptidos biologicamente ativos, capazes de modular a homeostase do colesterol, são suscetíveis de serem produzidos por processamento enzimático celular. A globulina 7S nativa é composta de três cadeias polipeptídicas ordenadas aleatoriamente, as subunidades a', a e β [5], codificadas por diferentes genes. A a' matura (Adesão ao banco de dados N.° P11827 UniProtKB/Swiss-Prot) e cadeias α (Adesão ao banco de dados N.° P13916 UniProtKB/Swiss-Prot) partilham uma região N-terminal estendida de cerca de 145 resíduos de aminoácidos, os quais estão ausentes na subunidade β (Adesão ao banco de dados N.° P25974 UniProtKB/Swiss-Prot). Baseada na peculiar sequência de aminoácidos da região de extensão de a', esta subunidade foi purificada por cromatografia por afinidade 2 com metal e administrada oralmente a ratos hipercolesterolémicos, permitindo assim mostrar tanto as suas propriedades de redução de lípidos plasmáticas, como o aumento da regulação dos recetores β-VLDL do fígado [4]. Por outro lado, uma vez que o peso molecular da subunidade a' é de cerca de 71 kDa [6], parece improvável que possa cruzar, in vitro, a barreira intestinal sem modificação.

Por esta razão, a nossa pesquisa tem sido direcionada na busca da sequência(s) de aminoácidos da subunidade a' responsável pelo efeito farmacológico. Uma vez que as regiões centrais das três subunidades têm mais sequências de aminácidos semelhantes, é concebível que a atividade biológica deva residir em um ou mais (poli) péptidos da região de extensão. Em princípio, as localizadas mas significativas diferenças de aminoácidos entre as regiões de extensão das cadeias a' e α iriam limitar o número de péptidos responsáveis pela atividade biológica. A partir destas declarações anteriores, a primeira estratégia seguida foi testar o efeito de ambos os polipéptidos em células Hep G2, obtidos a partir da digestão in vitro (pepsina/tripsina) de CroksoyR70, um concentrado de soja livre de isoflavona rotineiramente utilizado no tratamento alimentar de pacientes hipercolesterolémicos [7-8] e péptidos sintéticos que correspondem a sequências de aminoácidos específicas que diferem entre as subunidades de globulina 7S da soja na modulação do recetor LDL (LDL-R). Os resultados obtidos nestes estudos apontaram que um aumento da regulação de um LDL-R marcado poderia ser induzido em células Hep G2 expostas a produtos da digestão enzimática de CroksoyR70 com MW variando de 3000 a 20000 Da, bem como a um péptido sintético pequeno (2271 Da) de globulina da soja 7S adicionada a células numa concentração de 10“4 M [9] . O estudo obtido com péptidos pequenos está ainda, atualmente, sob investigação e não tem sido conclusivo até ao momento. 3 A capacidade das proteínas da soja de reduzir o colesterol e triglicéridos é uma questão consolidada. A dieta de proteína de soja é atualmente a ferramenta alimentar mais potente para tratar pacientes hipercolesterolémicos, fornecendo assim uma oportunidade única para o cuidado de sujeitos adultos e muito jovens. Além disso, está claramente estabelecido que a redução de colesterol plasmático é maior em pacientes que têm um grau de base alto de colesterolémia [14]. A hipótese que as proteínas, por si, reduzem o colesterol sanguíneo surgiu de estudos experimentais que indicaram que uma mudança de proteína animal para a de plantas na dieta ativa o sistema do recetor LDL no fígado de animais de laboratório [15], bem como em linfomonócitos em circulação de pacientes hipercolesterolémicos [16]. Para identificar os componentes da proteína da soja responsáveis pelo efeito de redução do colesterol, estudos in vitro foram levados a cabo com uma linha de células de hepatoma humano que são altamente sensíveis a fatores de regulação da expressão do recetor LDL e da biossíntese/decomposição de colesterol. A subunidade purificada a' da globulina da soja 7S foi encontrada para sobrerregular os recetores LDL em células Hep G2 [3] e este achado foi confirmado em ratos alimentados com colesterol [4]. Embora estes dados apoiem a hipótese de que a fração proteica é responsável pelo efeito biológico observado, os argumentos podem ser elevados para o destino biológico in vivo da cadeia a', uma vez que péptidos e aminoácidos são normalmente produzidos pela ação de enzimas proteolíticas gástricas e/ou intestinais. No entanto, um crescente número de (poli)péptidos de animais e plantas está sendo reivindicado para desempenhar funções regulatórias relevantes, frequentemente atribuídas a efeitos antioxidante, anti-proliferativo e anti-inflamatório [17]. Tanto quanto a soja é entendida, a evidência experimental indica claramente a possibilidade 4 que péptidos, e mesmo proteínas compactas pequenas, tal como o inibidor Bowman-Birk, podem ser adsorvidos [18], provocando assim um número de efeitos, incluindo anticancerígenos, anti-inflamatório e radioprotecção [19]. Também os (poli)péptidos de soja geneticamente modificada têm mostrado desencadear respostas biológicas, tais como efeitos hipotensivos [20] . Recentemente, um péptido estimulador da transcrição do LDL-R (FVVNATSN), que deriva da cadeia β da globulina 7S, foi identificado de um preparado hidrolisado de soja por uma protease do Bacillus amyloliquefaciens e depois por síntese química [21]. Neste caso,

Uma transcrição do LDL-R aumentada (+ 148%) foi detetada em células Hep G2 expostas ao péptido numa concentração de 100 μΜ. Outros péptidos decorrentes da globulina 11S mostraram exercer atividade semelhante, mas mais baixa [21]. 0 documento WO 03/063608 [24] mostra uma subunidade alfa' de globulina 7S da soja truncada que compreende o lado N-terminal da subunidade alfa' natural que tem um peso molecular de 28000 Da, processos para a preparação destas e composições contendo o fragmento.

Lovati M. et al [25] referem-se à atividade biológica de uma forma truncada da subunidade alfa' da globulina 7S de soja (ta') na homeostase do colesterol celular.

Seria desejável tornar disponíveis polipéptidos mais pequenos que mantenham, ou mesmo melhorem, as propriedades biológicas da proteína completa.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Foi agora encontrado que a chamada Região de Extensão de a' do lado N-terminal da Globulina 7S da Soja, que corresponde ao lado N-terminal da mesma que consiste de 142 resíduos de aminoácidos da dita, tem vantajosa atividade biológica e provou ser ainda mais eficaz na captação e degradação de LDL que a cadeia a' completa. 5 A invenção fornece assim a dita Região de Extensão de a', a qual será depois aqui referida como ea', bem como um processo para a sua preparação por clonagem, expressão em levedura e purificação do polipéptido recombinante contendo a região de extensão N-terminal da subunidade a' da soja.

Para esta proposta a expressão heteróloga do fragmento N-terminal da cadeia a' foi empreendida. 0 objetivo foi alcançado em células de levedura secreção-competentes da levedura Pichia pastoris. 0 polipéptido recombinante foi purificado e a sua atividade biológica avaliada em células Hep G2. Através da utilização desta abordagem biotecnológica, quantidades adequadas do polipéptido recombinante podiam ser obtidas para serem testadas em ensaios in vitro e também em experiências in vivo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1 Visão geral da construção pPICZaB-ea'. A expressão de ea' é conduzida pela AOX (Álcool OXidase), promotor induzivel do metanol (5'AOXl); o Fator de Acasalamento α (α-MF) promove a secreção da proteína recombinante para o meio de cultura; A0X1 TT: região de terminação da transcrição da AOX. 0 gene Sh ble confere resistência a zeocina; pUC Ori: origem da replicação para número elevado de cópias de plasmídeo em E. coli. As outras abreviaturas referem-se às posições de clivagem de enzimas de restrição; bp: par de base.

Fig. 2 Sequência de alinhamento do polipéptido recombinante (ea') e subunidade a' da soja tipo selvagem. As estrelas indicam resíduos de aminoácido idênticos nas duas sequências.

Fig. 2A Sequência do polipéptido recombinante (ea) ' (SEQ ID1)

Fig. 2B Sequência da subunidade a' da soja tipo selvagem (SEQ ID2)

Fig. 3A. SDS-PAGE sob condições redutoras de cultura 6 de Pichia pastoris recombinante:

Linha M: Marcador de Peso Molecular Linha 1: Sobrenadante da cultura precipitado com TCA (livre de células) antes da indução com metanol.

Linha 2: Sobrenadante da cultura precipitado com TCA (livre de células) lh depois da indução com metanol.

Linha 3: Sobrenadante da cultura precipitado com TCA (livre de células) 8h depois da indução com metanol.

Linha 4: Sobrenadante da cultura precipitado com TCA (livre de células) 19h depois da indução com metanol.

Linha 5: Sobrenadante da cultura precipitado com TCA (livre de células) 25h depois da indução com metanol.

Fig. 3B. SDS-PAGE sob condições redutoras das etapas de purificação de ea1:

Linha M: Marcador do Peso Molecular Linha 1: pó liofilizado do caldo de fermentação Linha 2: fração de DEAE-celulose eluida em 150 mM de NaCl

Linha 3: fração de DEAE-celulose eluida em 250 mM de NaCl

DESCRIÇÃO DETALHA DA INVENÇÃO A invenção será agora descrita em detalhe na seguinte secção experimental.

Materiais e Métodos

Levedura, estirpes bacterianas e químicos. A estirpe Pichia pastoris X33 (WT) (Invitrogen, San Diego, CA) foi usada para expressão em leveduras. A estirpe bacteriana utilizada para manipulação genética foi E. coli XLl-Blue (Invitrogen, San Diego, CA). As enzimas de restrição Pst I e Xba I foram compradas a Roche (Indianapolis, IN), a Sac I 7 a Fermentas (Ontario, Canadá), a DNA polimerase Taq foi comprada a Invitrogen (San Diego, CA). A zeocina foi comprada a Invivogen (San Diego, CA) . Os oligonucleótidos para PCR foram obtidos de Primm (Milão, Itália). A peptona, triptona, extrato de levedura e ágar foram comprados a Becton Dickinson and Company (Sparks, MD) . A glucose e sorbitol foram comprados a Sigma (St. Loius, MO). As membranas de diálise foram compradas a Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). A resina DEAE foi comprada a Whatman (Maidstone, Inglaterra). A resina NiNTA foi comprada a Qiagen (Hilden, Alemanha). A Coluna Symmetry de HPLC tipo C4 foi comprada a Waters (Milford, MA).

Outros quimicos foram de qualidade reativa de Sigma (St. Louis, MO) ou de Merck (Darmstadt, Alemanha).

Meios e condições de crescimento. A estirpe P. pastoris X33 foi cultivada em meio completo de YPD (Levedura Peptona Dextrose) (2 % de peptona, 1 % de extrato de levedura, 2 % glucose) . Os transformantes Mut+ foram selecionados em placas que continham YPD, 1,5 % de ágar, 100 mg/mL de zeocina. Todas as culturas de leveduras foram mantidas a 30 °C. Para a deteção de proteínas heterólogas, os transformantes Zeor-Mut+ foram cultivados para uma densidade ótica de 5 a 600 nm em meio de YPS (Levedura Peptona Sorbitol) (2 % de peptona, 1 % extrato de levedura, 2 % de sorbitol) . Depois o metanol foi adicionado para concentração final a 1 %. Todos os transformantes bacterianos foram selecionados em placas de meio LB (Luria-

Bertani) pobre em sal que contem zeocina (1 % triptona, 0,5 o. "0 de extrato de levedura, 0,5 % de cloreto de sódio, 1,5 o. "0 de ágar, 25 mg/mL de zeocina! ) . Todas as culturas de bactérias foram mantidas a 37 °C.

Construção do vetor de expressão do gene ea ’. O gene ea' foi amplificado por PCR num modelo de expressão de ADN plasmídeo de Pichia pastoris (pPICZaB) que contem um inserto (ta') que compreende a sequência de interesse (ea'). 0 oligonucleótido 5'- GAAAAGATAGATTAAAGCTGCAGTGGAGGAAG-3' foi designado para gerar o local de restrição Pstl na extremidade 5' do gene ea'. Esta mutação resultou numa inserção de resíduo de alanina na posição N-terminal de ea' . Um segundo oligonucleótido 5'-

CCCTTCTTATTCTTTCTAGATCATGGTTCTCTTTGAGACTC-3' foi designado para gerar o local de restrição Xbal na extremidade 3' do gene ea'. Ambos os oligonucleótidos foram dissolvidos em água mQ estéril. A mistura de reação PCR consistiu de 0,5 mM de iniciadores, 0,8 mM de dNTPs (Eppendorf, Hamburg, Alemanha), 30 ng de modelo (pPCIZaB/ta') , 2,5 U de DNA polimerase Taq, tampão de PCR (composição final: 50 mM de KC1, 1,5 mM de MgCL2, 20 mM Tris-Cl, pH 8,4 e água mQ estéril para um volume final de 25 mL). A amplificação por PCR foi levada a cabo num termociclador modelo Perkin Elmer Geneamp PCR System 2400 (Perkin Elmer Corp., Wellesley, MA) usando as seguintes condições: início a 94 °C por 10 min; 30 ciclos a 94 °C por 40 s, 60 °C por 40 s, 72 °C por 20 s; extensão final a 72 °C por 10 min e mantido a 4 °C. O produto de PCR de 465 pb foi digerido enzimaticamente para uma construção de tamanho completo de 423 pb e foi clonado no vetor pPCIZaB resultando na construção pPCIZaB-ea' e células de E. coli XLl-Blue transformadas. Os clones positivos foram selecionados num meio LB semissólido contendo tetraciclina e zeocina. Um destes clones foi sequenciado por Primm (Milão, Itália) para garantir que não ocorreu nenhuma mutação na sequência de expressão pPCIZaB-ea'. Vinte pg da construção pPCIZaB-ea' e 30 pg do vetor de expressão pPCIZaB (controlo negativo) foram linearizados por digestão com a enzima de restrição Saci e depois purificados.

Transformação de pPCIZaB-ea' em genoma de P. pastoris.

As células de leveduras de tipo selvagem (wt) foram transformadas por eletroporação com 20 pg da construção 9 pPCIZaB-ea' linearizada e 30 pg de pPCIZaB linearizada num aparelho Eppendorf (Hamburg, Alemanha) electroporator 2510 regulado a 1,5 kV. Os transformantes foram primeiro selecionados por plagueamento em placas de YPD contendo 100 mg/mL de zeocina. No sentido de verificar a integração da nossa construção no genoma de P. pastoris transformado, o Kit Dneasy Plant Mini (QIAGEN, Hilden, Alemanha) foi usado para extrair ADN genómico. O ADN genómico foi usado como modelo para verificar a inserção da construção no local do promotor da álcool oxidase (AOX1) por PCR usando 5'AOX1 (5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3') e iniciadores 3ΆΟΧ1 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'). A mistura de reação de PCR consistiu em 0,5 mM de iniciadores, 0,25 mM de dNTPs, 100 ng de modelo genómico, 2,5 U de DNA polimerase Tag, tampão de PCR (composição final como acima) . A reação de PCR foi realizada usando as seguintes condições: inicio a 94 °C por 10 min; 30 ciclos a 94 °C por 40 s, 60 °C por 40 s, 72 °C por 20 s; extensão final a 72 °C por 10 min e mantido a 4 °C.

Seleção do clone transformante. Dezoito transformantes Zeo+ e um transformante contendo o vetor de expressão pPCIZaB (controlo negativo) foram cultivados em 50 mL de meio YPS a 30 °C numa incubadora agitadora (180 rpm) até uma D06oo=5. A fase de indução foi iniciada pela adição de metanol à concentração final a 1 % e prolongada por 24 horas. Aliquotas dos sobrenadantes foram examinadas para expressão de ea’ por SDS-PAGE. O clone transformante com a maior expressão de ea' foi selecionado para produção em escala num fermentador da proteína recombinante.

Expressão de ea': na escala do fermentador. Para a produção massiva, o clone selecionado foi cultivado em 14 L de fermentador (Chemap, Suíça) de acordo com as diretrizes Invitrogen's "Pichia Fermentation Process Guidelines" (Versão B, 053002) . A cultura inoculo é preparada no meio YNB (2,0 g de KH2P04; 10,0 g de (NH4)2S04; 1,0 g de 10

MgS04 7H20; 0,2 g de NaCl; 0,2 g de CaCl2; 10,0 g de

Glicerol a 100 %; KOH para pH 5,2; Água destilada para 1.0 L) num balão de agitação não deflectivel. Depois de incubação por aproximadamente 24 horas a 30 °C a 250 rpm, 1.0 L de cultura da semente é usado para inocular o fermentador, preparado com 8,5 L de Meio Salino Basal (227 mL de H3P04 a 85 %; 7, 9 g de CaS04 2H20; 155 g de K2S04; 127 g de MgS04 7H20; 35 g de KOH; 340 g de Glicerol a 100 %; Água destilada para 8,5 L; pH ajustado para 5,0 com NH4OH depois de esterilização) . Ambos os meios de cultura citados estão suplementados com biotina e inositol (1 mg/L cada) . O Meio Salino Basal também está suplementado com Solução de Sais Traço PTM4 modificada (2,5 mL de H2S04 a 96 %; 243 mg de CoC204°2H20; 3,0 g de CuS04°5H20; 44,5 mg de

Kl; 1,5 g de MnS04°H20; 100 mg de Na2Mo04°2H20; 10 mg de H3BO3; 32,5 g de FeS04°7H20; 10 g de ZnCl2; Água destilada para 500 mL). O crescimento dos microrganismos e a expressão de proteínas heterólogas são obtidos através de um processo de três etapas. Uma primeira fase de crescimento do lote (glicerol como fonte de C) de aproximadamente 24 horas é seguida por uma fase de alimentação do lote (glicerol como limitante da fonte de C) de aproximadamente 4 horas.

Durante estas duas primeiras fases, o pH é mantido a 5,0 pela adição de 20 % de NH4OH. Uma vez gue todo o glicerol é consumido, uma alimentação de metanol é iniciada para desencadear a expressão da proteína ea1 e o pH é mudado para 6,0 adicionando 20 % de NH40H. A fase de alimentação

do lote com metanol dura aproximadamente 24 horas. Durante estas duas fases de alimentação do lote, o Oxigénio Dissolvido (DO %) é mantido estável a 30 % pela regulação eletrónica precisa da velocidade do agitador (rpm), enquanto a taxa de arejamento (vvm) é progressivamente aumentada manualmente. A cada poucas horas, a condição de limitação de fonte de C é verificada seguindo o nível de DO 11 %: o seu valor deveria mostrar um forte aumento depois de uma súbita paragem da alimentação com metanol e, vice-versa, uma rápida descida depois do seu recomeço. A cada poucas horas, amostras são colhidas em condições asséticas do fermentador para as seguintes análises: Densidade Ótica (lambda 600 nm), % de biomassa celular (peso fresco), esterilidade, observação microscópica, SDS-PAGE.

Purificação de ea'; processamento posterior do caldo de fermentação. Cerca de 9,2 L de cultura são derramados do fermentador e arrefecidos em gelo. Todas as operações subsequentes são levadas a cabo a + 4 °C. Toda a cultura é separada por centrifugação (Centrikon T-124, Kontron Instruments) a 3000 x g por 30 min; biomassa (pélete) é descartada; cerca de 7,5 L de sobrenadante é clarificado por filtração profunda em Zetaplus 30SP (Cuno) e subsequentemente microfiltrado num filtro de 0,22 pm (Millipak 100, Millipore). O filtrado claro é concentrado através de ultrafiltração na membrana de polietersulfona, de 10 kDa de MWCO (Omega filter, Pall) . O concentrado, cerca de 300 mL, é diafiltrado comtra 3,0 L de Tris-HCl a 10 mM e pH 7,2 e finalmente liofilizado. Com este procedimento foram obtidos 34,5 g de pó liofilizado, mostrando mais baixo grau de proteínas contaminantes no SDS-PAGE e tendo um teor de proteína total de cerca de 25 % p/p (Bradford Protein Assay, Bovine Serum Albumin as calibration Standard).

Purificação de ea': purificação cromatográfica.

Para eletroforese em gel de maior desempenho, o NuPAGE® Pre-Cast Gel System (Invitrogen) foi usado de acordo com os procedimentos do fornecedor. Dois gramas de pó liofilizado foram dissolvidos em 150 mL a 50 mM de Tris-HCl, a pH 7,50 e carregados numa coluna de DEAD-celulose (6 x 10 cm, Whatman, Maidstone, UK) equilibrado com o mesmo tampão. A eluição das proteínas retidas foi levada a cabo com o mesmo tampão contendo, respetivamente, 150 e 250 mM 12 de NaCl. A fração eluída com 0,21 M de NaCl (300 mL) exibiu o maior teor de ea'. A solução foi concentrada a 100 mL por liofilização e depois dialisada com uma membrana de 6000-8000 Da a 4 °C por 24 horas com água milliQ ultrafiltrada e depois liofilizada. Cerca de 370 mg de proteína foram obtidos.

No sentido de verificar a homogeneidade da proteína, cerca de 1 mg de proteína foi carregada numa coluna de fase reversa Symmetry C4 (4,6 x 250 mm). O tampão A (água ultrafiltrada e Ácido Trifluoroacético a 0,1 %) e o tampão B (Acetonitrilo a 100 % + Ácido Trifluoroacético a 0,1 %) foram usados. Técnicas eletroforéticas. Um SDS-PAGE sob condições redutoras (2 % de β-mercaptoetanol) foi levado a cabo em géis de poliacrilamida a 12 % de acordo com a referência 11, usando um mini-Protean II cell (Bio-Rad). Os géis foram corados com Azul de Coomassie.

Culturas celulares. A linha de células de hepatoma humano estabelecida (HepG2) foi obtida a partir da American Type Culture Collection (Rockville, MD) . O meio essencial mínimo de Eagle (MEM), soro fetal de vitelo, tripsina-EDTA (1 x) , penicilina (105 U/L), estreptomicina (100 g/L), tampão tricina (1 mmol/L, pH 7,4) e soluções de aminoácidos não essenciais (100 x) foram obtidos de GIBCO (Madison, WI). As placas de Petri foram de COSTAR (Cambridge, MA). Os filtros foram de Millipore (Bedford, MA) . O kit Protein Coomassie Plus Protein Assay foi comprado a Pierce (Rockford, IL, EUA) . A 125Iodina, livre de transportador, em 100 mmol/L de NaOH foi a Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA). As colunas Sephadex G25 (PD10) foram a Pharmacia Biotech (Uppsala, Suécia). Os kit LDH e MTT foram a Sigma Diagnostics (Milão - Itália). Todos os outros químicos foram de qualidade analítica da Merck (Darmstadt, Alemanha). As células estiveram crescendo em monocamadas em placas de Petri de 90 mm de diâmetro e mantidas a 37 °C 13 numa atmosfera humidificada de 95 % de ar, 5 % de C02 em MEM suplementado com 10 % de soro fetal de vitelo (FCS) , solução de aminoácidos não essenciais (1 % v/v), penicilina (105 U/L), estreptomicina (0,1 g/L), tampão tiacina (20 mmol/L, pH 7,4), NaHCCt (24 mmol/L) e piruvato de sódio (0,11 g/L) . Para experiências designadas para avaliar a modulação do recetor de LDL, as células foram semeadas em placas plásticas de 35 mm (3-5 x 105 células) e usadas apenas antes de atingirem a confluência. Em todas as experiências de culturas celulares, o meio foi mudado a cada 2-3 dias. No sentido de avaliar a viabilidade celular, os meios de cultura de células expostas a ea' em diferentes concentrações foram testados pela análise de sais de metiltetrazólio (MTT), essencialmente como descrito na referência 9. A dispersão das enzimas celulares foi determinada medindo a atividade da lactato desidrogenase (LDH), usando um kit de diagnóstico cinético (LDH/LD) (Sigma Diagnostic) . As LDL (1,019 < d ^ 1, 063 g/L) foram isoladas por ultracentrifugação preparativa sequencial [12] a partir de plasma de voluntários normolipidémicos clinicamente saudáveis. As lipoproteinas foram marcadas de acordo com o método de McFarlane como modificado por BilHeimer et. al [13] e previamente descrito [3] . Os 125I-LDL foram esterilizados por filtração (filtros Millipore, tamanho do poro 0,45 pm) e armazenados a 4 °C até uso. O soro deficiente em lipoproteína humana (LPDS) foi preparado como previamente descrito [9].

Captação e degradação de 125I-LDL. As monocamadas de células foram pré-incubadas a 37 °C por 24 horas em MEM suplementado com 5 g/100 g de LPDS para sobrerregular os recetores LDL [2], na presença/ausência de ea' a diferentes concentrações listadas na Tabela ou 3,5 pmol/L de subunidade a' purificada ou 1,0 pmol/L de sinvastatina. Uma concentração fixada (7,5 mg/L) de 125I-LDL foi depois adicionada ao meio e a incubação continuou por mais 5 h a 14 37 °C. A captação específica (ligação + internalização) e degradação de 125I-LDL foram avaliadas como previamente reportado [2].

Análises estatísticas. As diferenças na captação celular e degradação de LDL após a incubação celular com ea' a diferentes concentrações foram determinadas por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett. Os valores são expressos como médias ± DP; valores de P < 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

Resultados

Expressão de ea' em Pichia pastoris. A estrutura do plasmídeo usado para transformar as células de Pichia pastoris é apresentada na Figura 1. A sequência do inserto e o seu alinhamento com a subunidade a' são apresentados na Figura 2. Como mencionado nos Materiais e Métodos, a única diferença entre o polipéptido recombinante e o tipo selvagem consistiu no resíduo do primeiro aminoácido N-terminal, o qual, por razões técnicas, foi uma alanina na cadeia recombinante. O clone mostrando a maior produção de polipéptido recombinante, tal como avaliado pela análise SDS-PAGE do meio de cultura (não apresentado) , foi selecionado para produção massiva. A Figura 3-A apresenta a análise eletroforética do sobrenadante da cultura de levedura antes (linha n.° 1) e depois de indução com metanol pra 1 - 8 - 19 e 25 horas (linha n.° 2, n.° 3, n.° 4, n.° 5). Como é apresentado, uma banda evidente num peso molecular aparente de cerca de 20 kDa surge como uma consequência da indução.

Purificação de ea'. A purificação de ea' foi alcançada por métodos cromatográficos. Amostras de cada etapa foram recolhidas e analisadas por SDS-PAGE. O efeito das etapas de purificação na homogeneidade do polipéptido identificado é apresentado na Fig. 3—B. Um muito baixo grau de contaminação por proteína da levedura foi já alcançado no meio de cultura, mas as outras etapas cromatográficas 15 removeram as proteínas contaminantes principais e permitiram a recuperação do polipéptido recombinante numa forma quase homogénea. A análise da sequência N-terminal desta banda confirmou que este polipéptido de 20 kDa correspondeu à cadeia ea' . A pureza desta amostra foi avaliada para ser adequada para as análises celulares.

Atividade biológica de ea'. A adição da subunidade a' purificada, como um controlo positivo, e a sua forma a' truncada às células HepG2 produziu um aumento significativo na captação mediada pelo recetor LDL e degradação, se comparado às células não tratadas, como reportado no quadro seguinte.

Quadro. Efeito de a' e da sua forma truncada (ea') na _captação e degradação de LDL pelas células HepG2 1,2

Tipo de amostra Concentração 3 Captação Degradação pmol/L 125I-LDL ng/ Proteína celular mg O. 0 125I-LDL ng/ Proteína celular mg O, o LPDS 4 - 94 ± 5,1 100 80 ± 4,3 100 Subunidade a' 7S 3, 5 154 ± 9,1* 164 128 ± 4,8* 160 ea' 0,5 113 ± 7,1* 120 100 ± 10* 125 O \—1 138 ± 9,2* 146 118 ± 9,3* 148 2, 0 169 ± 6,7 179 157 ± 8,7** 196 Sinvastatina O \—1 188 ± 10** 200 143 ± 7,9** 179 1 Os dados são médias ± DP de 3 experiências independentes, cada uma realizado em quadruplicado. *P < 0,05 vs. LPDS e **P < 0,01 vs. LPDS. 2 Monocamadas confluentes de células HepG2 foram pré-incubadas por 24 h a 37 °C em meio essencial mínimo com 5 % de LPDS, na presença ou ausência de diferentes concentrações de polipéptido recombinante (sa') ou subunidade a' purificada (7S a’) ou sinvastatina. Depois da adição de 125I-LDL (7,5 mg/L de meio), as células foram incubadas por umas 5 horas adicionais. 4 LPDS, soro deficiente em lipoproteínas. 16

Os resultados mostraram que a modulação de LDL foi dependente da dose com ea' e que a maior concentração foi semelhante à do controlo positivo, sinvastatina. Em nenhuma concentração de ea' houve qualquer evidência de toxicidade celular, como determinado pelas análises MTT e LDH (não apresentado).

Por conseguinte, foi encontrado, de acordo com a invenção, que a sequência de aminoácidos capaz de induzir a resposta biológica repousa no domínio da extensão N-terminal da cadeia a'. Além disso, encontrámos que o fragmento hidrofílico N-terminal exerce os seus efeitos em concentrações na ordem de grandeza daquelas da sinvastatina, um potente fármaco hipolipidémico. Este efeito pode, pelo menos parcialmente, ser devido à interação in vitro entre o fragmento acima e a tioredoxina, uma pequena proteína multifuncional com um dissulfido-ditiol redox ativo no local ativo conservado da sequência Cys-Gly-Pro-Cys, como reportado pelos presentes inventores [3] . Este achado pode explicar a fase de latência mais longa da oxidação de LDL induzida pelo óxido cúprico observada em coelhos alimentados com dietas ricas em colesterol contendo proteína de soja, contra à encontrada em coelhos alimentados com a mesma dieta mas contendo caseína como fonte proteica [22].

Os dados obtidos são particularmente interessantes porque mostram pela primeira vez que o fragmento hidrofílico N-terminal da cadeia a' da globulina 7S da soja é ativo em modelo in vitro em concentrações menores que 10 μΜ, que são semelhantes àquelas reportadas para sinvastatina. Além disso, o uso de uma proteína recombinante exclui qualquer envolvimento de outra proteína e componentes da soja não proteicos, incluindo isoflavonas, para as quais uma falta de claros benefícios e potencial toxicidade têm sido reportados [23]. A invenção fornece alimentos funcionais e composições 17 com efeitos benéficos em várias doenças, incluindo hiperlipidémia e doença cardiovascular, para serem usados isolados ou em combinação com fármacos em terapias de redução de lipidos, isto é, estatinas como a sinvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, lovastatina.

As composições da invenção são preparadas usando excipientes e métodos convencionais. A dosagem do polipéptido recombinante da invenção dependerá de vários fatores, tais como o peso do paciente, idade e sexo e será facilmente determinada pelo médico com base nas caracteristicas farmacodinâmicas, farmacocinéticas e toxicológicas do polipéptido. Em geral, no entanto, a dita dosagem variará de cerca de 50 a cerca de 500 mg, uma a três vezes ao dia.

REFERÊNCIAS 1. Sirtori CR. et al., Curr Atheroscler Rep. 2001; 3: 47-53. 2. Lovati MR. et al., J Nutr. 1992; 122: 1971-8. 3. Manzoni C. et al., J Nutr. 2003; 133: 2149-55. 4. Duranti M. et al., J Nutr. 2004; 134: 1334-39. 5. Thanh, VH. et al., Biochim Biophys Acta. 1976; 439: 326-38. 6. Maruyama N. et al., J Agric Food Chem. 1999; 47: 5278-84. 7. Sirtori CR. et al., Nutr Metab Cardiovasc Dis. 1998; 8: 334-40. 8. Lovati MR. et al., J Agric Food Chem. 1998; 46: 2474-80. 9. Lovati MR. et al., J Nutr. 2000; 130: 2543-2549. 10. Lovati MR. et al., Faseb J. 2006; LB 391: 86. 11. Laemmli UK. Nature. 1970; 227: 660-5. 12. Havei RY. et al., J Clin Invest. 1955; 34: 1345-53. 13. Bilheimer DW. et al., . Biochim. Biophys. Acta 1972; 260: 212-21. 14. Sirtori CR. et al., Brit J Nutr. 2007; 97: 816-22. 18 15. Lovati MR. et al., Nutr Metab Cardiovasc Dis. 1991; 1: 18-24 . 16. Lovati MR. et al., J Clin Invest. 1987; 80: 1498-502. 17. Kitts DD. et al., Curr Pharm Des. 2003; 9: 1309-23. 18. Wan XS. et al., Nutrition and Câncer. 2002; 43:167-73. 19. Clemente A. et al., Recent Progress in Medicinal Plants. 2008; 20:397-417. 20. Matoba N. et al., FEBS Lett. 2001; 497: 50-4. 21. Cho SJ. et al., J Agric Food Chem. 2008; 56: 4372-6. 22. Castiglioni S. et al., Atherosclerosis. 2003; 171: 163-70 . 23. Sirtori CR. et al., Drug Safety 2001; 24: 665-82 19

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. Não constitui uma parte integrante do documento de patente europeu. Embora a compilação das referências tenha sido feita com grande cuidado, não são de excluir erros ou omissões e o IEP não aceita qualquer responsabilidade a esse respeito.

Documentos de patentes citados na descrição • WO 03063608 [0009]

Literatura não relacionada com patentes citada na descrição • SIRTORI CR. et al. Curr Atheroscler Rep., 2001, vol. 3, 47-53 [0040] • LOVATI MR. et al. J Nutr., 1992 , vol. 122, 1971- 8 [0040] • MANZONI C. et al. J Nutr., 2003, vol. 133, 2149-55 [0040] • DURANTI M. et al. J Nutr., 2004, vol. 134, 1334-39 [0040] • THANH, VH. et al. Biochim Biophys Acta, 1976, vol. 439, 326-38 [0040] • MARUYAMA N. et al. J Agric Food Chem., 1999, vol. 47, 5278-84 [0040] • SIRTORI CR. et al. Nutr Metab Cardiovasc Dis., 1998, vol. 8, 334-40 [0040] • LOVATI MR. et al. J Agric Food Chem., 1998, vol. 46, 2474-80 [0040] • LOVATI MR. et al. J Nutr., 2000, vol. 130, 2543-2549 [0040] • LOVATI MR. et al. Faseb J., 2006, vol. LB 391, 86 [0040] • LAEMMLI UK. Nature., 1970, vol. 227, 660-5 [0040] • HAVEL RY. et al. J Clin Invest., 1955, vol. 34, 1345-53 [0040] • BILHEIMER DW. et al. Biochim. Biophys. Acta, 1972, vol. 20 260, 212-21 [0040] • SIRTORI CR. et al. Brit J Nutr., 2007, vol. 97, 816-22 [0040] • LOVATI MR. et al. Nutr Metab Cardiovasc Dis., 1991, vol. 1, 18-24 [0040] • LOVATI MR. et al. J Clin Invest., 1987, vol. 80, 1498- 502 [0040] • KITTS DD. et al. Curr Pharm Des., 2003, vol. 9, 1309-23 [0040] • WAN XS. et al. Nutrition and Câncer., 2002, vol. 43, 167-73 [0040] • CLEMENTE A. et al. Recent Progress in Medicinal Plants, 2008, vol. 20, 397-417 [0040] • MATOBA N. et al. FEBS Lett., 2001, vol. 497, 50-4 [0040] • CHO SJ. et al. J Agric Food Chem., 2008, vol. 56, 4372-6 [0040] • CASTIGLIONI S. et al. Atherosclerosis, 2003, vol. 171, 163-70 [0040] • SIRTORI CR. et al. Drug Safety, 2001, vol. 24, 665-82 [0040]

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Fragmento hidrofílico N-terminal da Subunidade a’ da Globulina 7S da Soja que consiste em 142 resíduos de aminoácidos do referido lado N-terminal.

2. 0 fragmento hidrofílico N-terminal de acordo com a reivindicação 1, que tem a SEQ ID 1.

3. Um processo para a preparação do fragmento hidrofílico N-terminal de Globulina 7S da Soja das reivindicações 1 ou 2, que compreende clonagem, expressão em Pichia pastoris e purificação do polipéptido recombinante.

4. Composições que compreendem como ingrediente ativo o fragmento hidrofílico N-terminal da globulina 7S da soja das reivindicações 1 ou 2 em mistura com um veículo adequado.