KR20120027355A - Ｈｅｐ ｇ２ 세포 콜레스테롤 항상성에 관련된 대두 ７ｓ 글로불린 알파´ 서브유닛의 연장 영역의 클로닝, 효모 발현, 정제 및 생물학적 활성 - Google Patents

Abstract

인비트로 및 인비보 모델에서 콜레스테롤 및 트리글리세리드 항상성을 조절하는데 활성인, α' 사슬(eα')의 절단된 형태, 대두 7S 글로불린이 클로닝되었고, 효모 피치아 파스토리스에서 발현되었다. 재조합 폴리펩티드는 N-말단 측으로부터 142개 아미노산 잔기로 되어있고, 대두 알파' 서브유닛의 N-말단 확장 영역을 포함한다. 상기 eα' 폴리펩티드는 종래의 생화학적 기술에 의해 정제되었고, LDL-수용체의 활성을 조절하는 가능성은 인간 간암 세포주(Hep G2)에서, 표지된 LDL의 흡수 및 분해를 모니터링함으로써 평가되었다.

Description

ＨＥＰ Ｇ２ 세포 콜레스테롤 항상성에 관련된 대두 ７Ｓ 글로불린 알파´ 서브유닛의 연장 영역의 클로닝, 효모 발현, 정제 및 생물학적 활성{Cloning, yeast expression, purification and biological activity of the extension region of the soybean ７S globulin alfa´ subunit involved in HEP G２ cell cholesterol homeostasis}

본 발명은 천연 α' 서브유닛의 N-말단 친수성 단편에 해당하는 대두 7S 글로불린의 재조합 α' 단편, 이의 제조 방법, 및 콜레스테롤 및 트리글리세리드 항상성을 조절하는데 유용한 활성 성분으로서 상기 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

고콜레스테롤혈증 환자의 고지혈증 정도를 조절하는데 있어서 식이 대두 단백질의 기능은 널리 받아들여진 사안이다[1]. 이전의 연구에서 [2-4], LDL-수용체의 상향 조절에서, 대두 7S 글로불린의 하나의 서브유닛인, α' 서브유닛이 직접적인 관련성이 있다는 것은 인비트로 및 인비보 시스템에서 입증되었고, 이것은 콜레스테롤 항상성을 조절할 수 있는 생물학적 활성 (폴리)펩티드가 세포 효소 처리에 의해 생산될 수 있다는 것을 제시하였다.

상기 천연 7S 글로불린은, 서로 다른 유전자에 의해 암호화된 α',α 및 β 서브유닛[5]인, 3개의 무작위로 분류된 폴리펩티드 사슬로 구성된다. 성숙된 α'(Accession N. P11827 UniProtKB/Swiss-Prot database) 및 α 사슬(Accession N. P13916 UniProtKB/Swiss-Prot database)은 β 서브유닛(Accession N. P25974 UniProtKB/Swiss-Prot database)에는 없는 약 145개 아미노산 잔기의 연장된 N-말단 영역을 공유한다. α' 연장 영역의 특이적인 아미노산 서열을 바탕으로, 이 서브유닛은 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 고콜레스테롤혈증 쥐에 경구 투여되어, 혈장 지질을 낮추는 특성 및 간 β-VLDL 수용체의 상향 조절됨을 보여줄 수 있었다[4]. 반면, α' 서브유닛의 분자량이 약 71 kDa이므로[6], α' 서브유닛은 변형없이는 인비보에서 장벽(intestinal barrier)을 통과할 수 없을 것으로 여겨진다.

이러한 이유로, 본 연구는 약리 효과를 나타내는 α' 서브유닛의 아미노산 서열을 찾는 것이다. 3개의 서브유닛의 가운데 영역(core region)은 보다 유사한 아미노산 서열을 가지고 있기 때문에, 생물학적 활성은 연장된 영역의 하나 이상의 (폴리)펩티드에 존재한다고 여겨졌다. 원칙적으로, α' 및 α 사슬의 연장 영역간에 편재되어 있으나, 중요한 아미노산의 차이는 생물학적 활성과 관련된 펩티드의 수를 제한할 것이다.

이전의 이러한 사실로부터, 첫번째로 추구된 전략은 고콜레스테롤혈증 환자의 식이 치료에 일반적으로 적용되는 Croksoy^R70, 이소프라본이 없는 대두 농축물을 인비트로 소화(펩신/트립신)시켜 얻은 폴리펩티드[7-8] 및 LDL-수용체(LDL-R) 조절에 대하여 7S 대두 글로불린 서브유닛간에 다르게 하는 특이적인 아미노산 서열에 해당하는 합성 펩티드의 Hep G2 세포에서의 효과를 검사하는 것이었다. 이러한 연구로부터 얻은 결과는 3,000 내지 20,000 Da의 범위의 분자량(MW)을 갖는 Croksoy^R70의 효소 소화 산물뿐 아니라, 10^-4 M의 농도로 세포에 첨가된 7S 대두 글로불린에서 유래한 작은 합성 펩티드(2,271 Da)[9]에 노출된 HepG2 세포에서 현저한 LDL-R 상향 조절이 유도됨을 지적하였다. 작은 펩티드로 얻은 연구는 현재까지 조사중에 있으며, 지금까지 결론이 나지 않고 있다[10].

대두 단백질의 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 낮추는 능력은 정리된 쟁점(consolidated issue)이다. 대두 단백질 식단은 고콜레스테롤혈증 환자를 치료하기 위한 현재 가장 가능성있는 식이 수단이며, 따라서 성인 및 매우 어린 대상을 다루기 위해 독특한 기회를 제공한다. 더욱이, 고콜레스테롤혈증의 높은 기준치를 갖는 환자에서 혈장 콜레스테롤의 감소가 보다 큰 것으로 확실히 인정받고 있다[14].

단백질 그 자체로 혈액 콜레스테롤을 낮춘다는 가설은, 식단에서 동물 단백질에서 식물 단백질로 바꾸는 것이 실험실 동물의 간 [15] 및 고콜레스테롤혈증 환자의 순환하는 림프단핵구 내의 LDL 수용체 시스템을 활성화시키는 것을 암시하는 실험 연구로부터 야기되었다. 콜레스테롤을 낮추는 효과와 관련된 대두 단백질 조성물을 알아내기 위하여, LDL-수용체 발현 및 콜레스테롤 합성/분해를 조절하는 인자에 매우 민감한 인간 간암 세포주를 이용하여 인비트로 연구를 수행하였다. 7S 대두 단백질 글로불린으로부터 정제한 α' 서브유닛은 Hep G2 세포에서 LDL-수용체를 상향 조절하는 것이 밝혀졌고, 이러한 발견은 콜레스테롤 식이 쥐에서 확인되었다[4]. 비록 이러한 데이터는 상기 단백질 모이어티가 관찰된 생물학적 효과의 원인이 된다는 가설을 뒷받침하고 있음에도, 펩티드 및 아미노산은 위 및/또는 장의 단백질 가수분해 효소의 작용에 의해서 일반적으로 생성될 수 있기 때문에 α' 사슬 인비보(in vivo) 생물학적 운명에서 대하여 많은 논의가 야기될 수 있다. 그러나, 동물 및 식물 (폴리)펩티드들의 증가되는 수가 주로 항산화, 항증식 및 항염증 효과에 기여하는 적절한 조절 기능 작용을 할 것이라고 주장되고 있다[17]. 대두에 관해서, 보우만-빌크 억제제(Bowman-Birk inhibitor)와 같은 펩티드 및 심지어 작은 조밀(compact) 단백질은 흡착될 수 있고 [18], 따라서, 항암효과, 항염증효과, 방사선 보호효과를 포함하는 많은 효과를 유도할 수 있다는 가능성이 실험 증거에 의해 명백히 드러났다. 또한 유전적으로 변형된 대두 (폴리)펩티들은 혈압 강하 효과(hypotensive effect)와 같은 생물학적 반응을 야기함이 밝혀졌다 [20]. 최근에, 바실러스 아미로리퀘파시엔(Bacillus amyloliquefaciens)에서 유래한 프로테아제 및 이후 화학 합성에 의해 제조된 대두 가수 분해산물에서, 7S 글로불린 β 사슬로부터 유래된, LDL-R 전사 자극 펩티드(FVVNATSN)가 밝혀졌다[21]. 이 경우, 100μM 농도의 펩티드에 노출된 Hep G2 세포에서, LDL-R 전사가 증가함(+148 %)이 밝혀졌다. 11 S 글로불린에서 유래된 다른 펩티드는 유사하지만 낮은 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다[21].

전장 단백질의 생물학적 특성을 유지하거나, 심지어 증가시키면서, 이용가능한 더 짧은 폴리펩티드를 만드는 것이 바람직할 것이다.

1. Sirtori CR. et al., Curr Atheroscler Rep. 2001; 3: 47-53. 2. Lovati MR. et al., J Nutr. 1992; 122: 1971-8. 3. Manzoni C. et al., J Nutr. 2003; 133: 2149-55. 4. Duranti M. et al., J Nutr. 2004;134: 1334-39. 5. Thanh, VH. et al., Biochim Biophys Acta. 1976; 439: 326-38. 6. Maruyama N. et al., J Agric Food Chem. 1999; 47: 5278-84. 7. Sirtori CR. et al., Nutr Metab Cardiovasc Dis. 1998; 8: 334-40. 8. Lovati MR. et al., J Agric Food Chem. 1998; 46: 2474-80. 9. Lovati MR. et al., J Nutr. 2000; 130: 2543-2549. 10. Lovati MR. et al., Faseb J. 2006; LB 391: 86. 11. Laemmli UK. Nature. 1970; 227: 660-5. 12. Havel RY. et al., J Clin Invest. 1955; 34: 1345-53. 13. Bilheimer DW. et al.,. Biochim. Biophys. Acta 1972; 260: 212-21. 14. Sirtori CR. et al., Brit J Nutr. 2007; 97: 816-22. 15. Lovati MR. et al., Nutr Metab Cardiovasc Dis. 1991; 1: 18-24. 16. Lovati MR. et al., J Clin Invest. 1987; 80: 1498-502. 17. Kitts DD. et al., Curr Pharm Des. 2003; 9: 1309-23. 18. Wan XS. et al., Nutrition and Cancer. 2002; 43:167-73. 19. Clemente A. et al., Recent Progress in Medicinal Plants. 2008; 20:397-417. 20. Matoba N. et al., FEBS Lett. 2001; 497: 50-4. 21. Cho SJ. et al., J Agric Food Chem. 2008; 56: 4372-6. 22. Castiglioni S. et al., Atherosclerosis. 2003; 171: 163-70. 23. Sirtori CR. et al., Drug Safety 2001; 24: 665-82.

현재, N-말단측에 상응하는 소위 대두 7S 글로불린의 α' 연장 영역가 유리한 생물학적 활성을 가지고 있다는 점이 밝혀졌고, LDL 흡수 및 분해에서 전장 크기의 α' 사슬에 비해 훨씬더 효과적이라는 점이 입증되었다.

그러므로, 본 발명은 이하 eα'로서 언급될 것인, α' 연장부위 뿐 아니라, 대두 α' 서브유닛의 N-말단 연장 영역를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 클로닝, 효모 발현 및 정제하여 제조하는 방법을 제공한다.

이러한 목적을 위하여, α' 사슬의 N-말단 단편의 이종 발현(heterologous expression)을 수행하였다. 상기 목적은 효모 피치아 파스토리스( P ichia pastoris)의 분비-형질전환성 효모 세포 (secretion-competent yeast cells)에서 달성되었다. 상기 재조합 폴리펩티드는 정제되었고, 이의 생물학적 활성은 Hep G2 세포에서 평가되었다. 이러한 생명 공학적 접근을 이용하여, 인비트로 시도(trial) 및 인비보 실험에서도 시험될 수 있는 적절한 양의 재조합 폴리펩티드를 얻을 수 있었다.

도 1 pPICZaB-eα' 구조체의 개요. eα'의 발현은 AOX(알코올 옥시다제(Alcohol OXidase)) 메탄올-유도 프로모터(5'AOX1)에 의하여 구동된다; α-접합 인자(Mating Factor)(α-MF)는 배지로 재조합 단백질의 분비를 촉진한다; AOX1 TT: AOX 전사 종결 영역. Sh ble 유전자는 제오신(zeocin)에 대한 저항성을 부여한다; pUC Ori: 대장균 내의 많은 수의 플라스미드 복제(high number plasmid copy)를 위한 복제 원점. 다른 약자는 제한 효소의 절단 위치를 나타낸다; bp: 염기쌍.
도 2 재조합 폴리펩티드(eα') 및 야생형 대두 α' 서브유닛의 서열 배열. 별모양은 두개 서열의 동일한 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 2A 재조합 폴리펩티드(eα')의 서열(서열번호 1)
도 2B 야생형 대두 α' 서브유닛의 서열(서열번호 2)
도 3A. 재조합 피치아 파스토리스 배양액의 환원 조건하의 SDS-PAGE:
레인 M : 분자량 마커
레인 1: 메탄올로 유도하기 전 TCA-침전 배양 상등액 (세포 없음)
레인 2: 메탄올 유도 1시간 후 TCA-침전 배양 상등액 (세포 없음)
레인 3: 메탄올 유도 8시간 후 TCA-침전 배양 상등액 (세포 없음)
레인 4: 메탄올 유도 19시간 후 TCA-침전 배양 상등액 (세포 없음)
레인 5: 메탄올 유도 25시간 후 TCA-침전 배양 상등액 (세포 없음)
도 3B. eα' 정제 단계의 환원 조건하에서 SDS-PAGE:
레인 M : 분자량 마커
레인 1: 발효 브로스의 동결건조된 파우더
레인 2: DEAE-셀루로오즈 150 mM NaCl 용출된 분획
레인 3: DEAE-셀루로오즈 250 mM NaCl 용출된 분획

본 발명은 하기 실험 부분에서 자세히 기술될 것이다.

재료 및 방법

효모, 박테리아 균주( strains ) 및 화학 물질. 피치아 파스토리스 X33(WT) 균주 (Invitrogen, San Diego, CA)를 효모 발현을 위하여 사용하였다. 상기 유전자 조작을 위해 사용한 박테리아 균주는 대장균 XL1-Blue(Invitrogen, San Diego, CA)였다. 제한 효소 Pst I 및 Xba I은 로쉬(Roche)(Indianapolis, IN), Sac I은 페르멘타스(Fermentas)(Ontario, Canada), Taq DNA 폴리머라제는 인비트로젠(San Diego, CA)으로부터 구입하였다. 제오신은 인비트로젠(San Diego, CA)로부터 구입하였다. PCR용 올리고뉴클레오티드는 프림(Primm)(Milano, Italy)에서 구입하였다. 펩톤, 트립톤, 효모 추출물 및 한천은 벡톤 딕킨슨 앤 컴퍼니(Becton Dickinson and Company)(Sparks, MD)에서 구입하였다. 글루코오즈 및 솔비톨은 시그마(St. Louis MO)에서 구입하였다. 투석막은 스펙트럼 레버러토리(spectrum laboratories)(Rancho Dominguez, CA)에서 구입하였다. DEAE 레진은 와트만(Whatman)(Maidstone, England)에서 구입하였다. NiNTA 레진은 큐아젠(Qiagen)(Hilden, Germany)에서 구입하였다. 대칭 C4 HPLC 컬럼은 워터(Waters)(Milford, MA)에서 구입하였다.

다른 화학 물질은 시그마(Sigma)(St. Luis, MO) 또는 머크(Merck)(Darmstadt, Germany)의 시약 등급이었다.

배지 및 성장 조건. P. 파스토리스 X33 균주를 YPD(Yeast Peptone Dextrose) 완전 배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코오즈)에서 배양하였다. Mut⁺ 형질전환체는 YPD, 한천 1.5%, 100 mg/ml 제오신을 포함하는 플레이트에서 선택하였다. 모든 효모 배양은 30 ℃로 유지하였다. 이종 단백질의 검출을 위하여, Zeo^r-Mut⁺ 형질전환체는 YPD(Yeast Peptone Sorbitol) 배지(2% 펩톤, 1% 효모 추출물, 2 % 솔비톨)에서 600 nm에서 광학 밀로 5로 배양하였다. 그 후, 메탄올을 최종 농도가 1%가 되도록 첨가하였다. 모든 박테리아 형질전환체는 제오신을 포함하는 저염 LB(Luria-Bertani) 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화 나트륨, 1.5% 한천, 25 mg/ml 제오신) 플레이트에서 선택되었다. 모든 박테리아 배양은 37 ℃로 유지하였다.

eα' 유전자 발현 벡터의 구축. eα' 유전자는 관심이 있는 서열(eα')을 포함하는 발현 피치아 파스토리스 플라스미드 DNA 주형(pPICZαB)에서 PCR에 의해 증폭되었다. 올리고뉴클레오티드 5'-GAAAAGATAGATTAAAG CTGCAG TGGAGGAAG -3'은 eα' 유전자의 5' 말단에 PstI 제한 부위를 생성하도록 고안되었다. 이 돌연변이로 eα' N-말단 위치에 알라닌 잔기가 삽입되었다. 두번째 올리고뉴클레오티드 5'- CCCTTCTTATTCTT TCTAGA TCATGGTTCTCTTTGAGACTC -3'는 eα' 유전자의 3' 말단의 XbaI 제한 부위를 생성하도록 고안되었다. 두개의 올리고뉴클레오티드는 mQ 살균수(mQ sterile water)에 용해되었다. PCR 반응 혼합물은 0.5 mM 프라이머, 0.8 mM dNTPs(Eppendorf, Hamburg, Germany), 30 ng 주형 (pPICZαB/tα'), 2.5 U Taq DNA 폴리머라제, PCR 버퍼(최종 조성: 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 20 mM Tris-Cl, pH 8.4 및 최종 부피가 25 mL 될때까지의 mQ 살균수)로 구성되었다. PCR 증폭은 하기의 조건을 이용하여 펄킨 엘머 제네암프 PCR 시스템 2400 써머사이클(Perkin Elmer Geneamp PCR System 2400 thermocycler) (Perkin Elmer Corp., Wellesley, MA)에서 수행하였다: 개시 94℃에서 10분간; 94℃에서 40 초간, 60 ℃에서 40 초간, 72 ℃에서 20 초간을 30 사이클 ; 72 ℃에서 10분간 최종 연장 및 4℃에서 유지. 465 bp의 PCR 산물은 423 bp의 전체 크기 구조로 효소적으로 소화되었고, 이것은 pPICZαB 벡터에 클로닝되어 pPICZαB-eα' 구조체가 되어 XL1-Blue Ecoli 세포로 형질전환되었다. 양성 클론은 테트라시클린 및 제오신을 포함한 세미솔리드 LB(semisolid LB) 배지에서 선택하였다. 이러한 클론 중 하나는 프림(Milano, Italy)에 의해 서열이 밝혀져서, pPICZαB-eα' 구조체 서열에는 돌연변이가 없음을 확인하였다. 20 ㎍ pPICZαB-eα' 구조체 및 30 ㎍ 발현 벡터 pPICZαB(음성 대조군)은 제한 효소 SacI으로 소화되어 직선화되었고, 그 후 정제되었다.

P. 파스토리스 게놈내로 pPICZ αB-eα' 의 형질 전환. 야생형 (wt) 효모 세포를 에펜도르프(Eppendorf (Hamburg, Germany)) 일렉트로포레이터 2510 장치 세트에서 1.5 kV 전압으로 20 ㎍ 선형 pPICZαB-eα' 구조체 및 30 ㎍ 선형 pPICZαB를 이용하여 일렉트로포레이션으로 형질전환시켰다. 형질전환체를 먼저 제오신 100 mg/mL를 포함하는 YPD 플레이트에 도말하여 선별하였다. 본 구조체가 형질전환된 P. 파스토리스 게놈에 삽입되었는지를 확인하기 위하여, Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 5'-AOX1 (5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3') 및 3' AOX1 프라이머 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')를 이용하는 PCR에 의해, 알코올 옥시다제 프로모터(AOX1) 부위에서 구조체의 삽입을 확인하였다. 상기 PCR 반응 혼합물은 0.5 mM 프라이머, 0.25 mM dNTPs, 게놈 주형 100 ng, 2.5 U Taq DNA 폴리머라제, PCR 버퍼(상기와 같은 최종 조성물)로 구성되었다. PCR 반응은 다음과 같은 조건에서 수행하였다: 개시 94℃에서 10분간; 94℃에서 40 초간 , 60 ℃에서 40 초간, 72℃에서 20 초간을 30 사이클 ; 72 ℃에서 10분간 최종 연장 및 4℃에서 유지.

형질전환체 클론의 선택. 18개 Zeo⁺ 형질전환체 및 pPICZαB 발현 벡터(음성 대조군)을 포함하는 한 형질전환체를, 진탕배양기(180rpm)에서, 30 ℃, YPS 배지 50 mL에서 OD₆₀₀이 5가 될때까지 배양하였다. 메탄올을 최종 농도 1 %가 될때까지 첨가하여 유도 단계(inducing phase)를 유발하였고, 24시간 동안 지속하였다. eα'의 발현여부에 대하여 SDS-PAGE로 상등액의 분액을 조사하였다. 가장 많이 eα'을 발현하는 클론 형질전환체를 재조합 단백질의 발효조 규모 생산을 위하여 선별하였다.

eα'의 발현: 발효조 규모. 대량 생산을 위해, 상기 선택된 클론을 인비트로젠의 "Pichia Fermentation Process Guidelines" (Version B, 053002)에 따라 14 L 발효조(Chemap, Switzerland)에서 배양하였다. 배플이 없는 진탕 플라스크(unbaffled shake flasks)에서 YBM 배지(KH₂PO₄ 2.0 g; (NH₄)₂SO₄ 10.0 g; MgSO₄ 7H₂O 1.0 g; NaCl 0.2 g; CaCl₂ 0.2 g; 글리세롤 100% 10.0 g; KOH to pH 5.2; 1.0 L가 될때까지 증류수)에서 접종 배양물을 준비하였다. 30 ℃, 250 rpm에서 약 24시간 동안 배양후에, 기본 염 배지(Basal Salt Medium )(H₃PO₄ 85% 227 mL; CaSO₄ 2H₂O 7.9 g; K₂SO₄ 155 g; MgSO₄ 7H₂O 127 g; KOH 35 g; 글리세롤 100% 340 g; 8.5 L까지 증류수; 멸균후에 NH₄OH를 이용하여 pH를 5.0까지 조정) 8.5 L로 준비된, 발효조에 종 배양물 1.0 L를 이용하여 접종하였다. 언급된 배양 배지 모두 비오틴 및 이노시톨(각 1 mg/L)을 보충하였다. 기본 염 배지에는 변경된 PTM₁ 미량 염 용액 (PTM₁ Trace Salt Solution) (H₂SO₄ 96 % 2.5 mL; CoC₂O_{4 °}H₂O 243 mg; CuSO_{4 ?}H₂O 3.0 g; KI 44.5 mg; MnSO_{4 °}2H₂O 1.5 g; Na₂MoO_{4 °}2H₂O 100 mg; H₃BO₃ 10 mg; FeSO_{4 °}7H₂O 32.5 g; ZnCl₂ 10 g; 500 mL까지 증류수)을 보충하였다.

미생물의 성장 및 이종 단백질의 발현은 세 단계 과정을 통하여 얻었다. 약 24시간의 첫번째 회분 성장 단계(batch growth phase)(탄소원은 글리세롤)후에 약 4시간의 유가배양 단계(fed-batch phase)로 하였다. 이러한 첫번째 두개의 단계 동안, NH₄OH 20 %를 첨가하여 pH를 5로 유지하였다. 일단 모든 글리세롤이 소모되면, 메탄올을 공급하여 eα' 단백질 발현 유발을 개시하였고, NH₄OH 20 %를 첨가하여 pH를 6.0으로 바꾸었다. 메탄올 유가 배양 단계는 약 24시간 동안 지속되었다. 이 두개의 유가배양 단계 동안, 에어레이션 비율(VVM)이 수동으로 점차적으로 증가하는 동안, 용존 산소(Dissolved Oxygen) (DO %)는 교반기 속도(rpm)를 정밀 전자적 조절에 의하여, 30 %로 안정적으로 유지하였다. 몇 시간마다, 탄소원 제한 조건을 DO % 수준에 따라서 체크하였다: 이 값은 메탄올 공급의 갑작스런 중단 이후에 급격한 증가를 나타내야 하며, 반대로, 메탄올 공급의 재개 이후에는 급격한 감소를 보여야 한다. 몇 시간마다, 다음 분석을 위하여, 무균 상태에서 발효기로부터 시료를 채취하였다: 광학 밀도 (lambda 600 nm), 세포 균체량(biomass) % (습윤 중량), 무균성, 현미경 관찰, SDS-PAGE.

eα'의 정제: 발효 브로스의 다운스트림 처리. 발효기로부터 배양물 약 9.2 L를 부은후에 얼음에서 냉각시켰다. 이후의 모든 작업은 +4℃에서 수행하였다. 3,000x g에서 30분동안 원심분리(Centrikon T-124, Kontron Instruments)에 의하여 모든 배양물을 분리하였다; 균체(펠렛)를 버렸다; 상등액 약 7.5 L를 제타플러스 30SP(Zetaplus 30SP) (Cuno)에서의 심층 여과에 의하여 깨끗하게(clarified)하였고, 이후 0.22 ㎛ 필터 (Millipak 100, Millipore)에서 마이크로여과하였다. 깨끗한 여과물을 폴리에테르술폰 막인, MWCO 10 kDa (Omega filter, Pall)에서 한외여과를 통하여 농축하였다. 상기 농축물, 약 300 mL는 10 mM pH 7.2의 Tris-HCl 3.0 L에 대하여 디아필터하고(diafiltered), 최종적으로 동결건조하였다. 이러한 과정을 이용하여, 동결결조된 파우더 34.5 g을 수득하였고, 이것은 SDS-PAGE에서 비교적 낮은 정도의 오염 단백질을 보였고, 전체 단백질 함량은 약 25 % p/p이었다(Bradford Protein Assay, 보정 표준으로 우혈청 알부민).

eα'의 정제: 크로마토그래피 정제

더 높은 성과의 겔 전기영동(performance gel electrophoresis)을 위하여, NuPAGE^？ Pre-Cast Gel System (Invitrogen)을 공급자의 절차에 따라 사용하였다. 동결건조된 분말 2 g을 pH 7.50, 50 mM 트리스-HCl의 150 mL에 용해하였고, 동일한 버퍼로 평형화된 DEAE-셀룰로즈 컬럼 (6 x 10 cm, Whatman, Maidstone, UK)에 적재하였다. 보류된 단백질의 용출액을 각각 150 및 250 mM NaCl를 포함하는 동일한 버퍼를 이용하여 수행하였다. 0.25 M NaCl (300 mL)로 용출된 분획에서 가장 많은 eα' 함량이 나타났다. 상기 용액을 동결-건조하여 100 ml까지 농축하였고, 그 후에 4 ℃에서 밀리Q 한외여과수(milliQ ultrafiltered water)및 6000-8000 Da 막을 사용하여 투석하였고, 그 후 동결건조하였다. 약 370 mg의 단백질을 수득하였다.

단백질의 균질성을 확인하기 위하여, 약 1 mg의 단백질을 대칭 C4(4.6 x 250 mm) 역상 컬럼에 적재하였다. 버퍼 A(한외여과수 및 트리플루오로아세트산 0.1%) 및 버퍼 B(아세토니트릴 100% + 트리플루오로아세트산 0.1%)을 사용하였다.

전기 영동 기술. 참조 11에 따라서, 미니-프로테안 II 세포(mini-Protean II cell) (Bio-Rad)를 이용하여, 환원 조건하(2% β-머캅토에탄올)에서 SDS-PAGE를 12% 폴리아크릴아미드 겔에서 수행하였다. 상기 겔은 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색하였다.

세포 배양. 확립된 인간 간암 세포주(HepG2)를 ATCC(American Type Culture Collection)(Rockville, MD)에서 얻었다. 이글 최소 영양 배지(Eagle's minimum essential medium) (MEM), 우태혈청(fetal calf serum), 트립신-EDTA (1x), 페니실린(10⁵ U/L), 스트렙토마이신 (100 g/L), 트리신 버퍼 (1 mmol/L, pH 7.4) 및 비-필수 아미노산 용액(100x)은 GIBCO(Madison, WI)에서 구입하였다. 페트리 디쉬는 COSTAR (Cambridge, MA)에서 구입하였다. 필터는 밀리포어(Millipore)(Bedford, MA)에서 구입하였다. 단백질 쿠마시 플러스 단백질 검출 키트는 피얼스(Pierce) (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다. 100 mmol/L NaOH중 무담체의 ¹²⁵요오드는, 펄킨 엘머 라이프 사이언스 (Perkin Elmer Life Sciences)(Boston, MA)에서 구입하였다. Sephadex G25 컬럼 (PD10)은 Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)에서 구입하였다. LDH 및 MTT 키트는 Sigma Diagnostics (Milano-Italy)에서 구입하였다. 다른 모든 화학 물질은 머크(Merck)(Darmstadt, Germany)에서 유래한 분석등급(analytical grade)이다. 세포는 90 mm-직경의 페트리 디쉬에서 단층으로 자랐고, 10 % 우태아혈청(FCS), 비 필수 아미노산 용액 (1 %, v/v), 페니실린 (10⁵ U/L), 스트렙토마이신 (0.1 g/L), 트리신 버퍼 (20 mmol/L, pH 7.4), NaHCO₃ (24 mmol/L) 및 소듐 피루베이트 (0.11 g/L)가 보충된 MEM내에서, 95 % 공기, 5 % CO₂ 인 습윤 대기하, 37 ℃에서 유지되었다. LDL 수용체의 조절을 평가하기 위하여 고안된 실험에 대하여, 세포는 35 mm 플라스틱 디쉬에 접종(seed)되었고(3-5 x 10⁵ cells), 컨플루언스에 도달하기 직전에 사용하였다. 모든 세포 배양 실험에서, 배지는 매 2-3일마다 교체되었다. 세포의 생존성을 평가하기 위하여, 다른 농도에서 eα'에 노출된 세포로부터 얻은 배양 배지는 기본적으로 참조 9에서 기술한 바와 같이, 메틸테트라졸리움 염(MTT) 검사로 시험하였다. 세포 효소의 누출은 키네틱 (LDH/LD) 진단 키트(Sigma Diagnostics)를 이용하여, 락테이트 탈수소효소(LDH) 활성을 측정하여 결정하였다. 임상적으로 건강한 정상지방혈증의 자원자의 혈장으로부터 순차적인 준비적초고속원심분리(sequential preparative ultracentrifugation)[12]에 의하여 LDL (1.019< d <1.063 g/L)을 분리하였다. 지질단백질은 Bilheimer et al. [13]에 의해 수정되고, 이전에 기술된 바[3]와 같이 McFarlane 방법에 따라 표지하였다. ¹²⁵I-LDL은 여과 (Millipore filters, 0.45 ㎛ 공극 크기)에 의해 멸균하였고, 사용할때까지 4 ℃에 보관하였다. 인간의 지질 단백질이 결여된 혈청(lipoprotein deficient serum)(LPDS)은 이전에 개시한 바와 같이 제조하였다[9].

¹²⁵ I- LDL 의 흡수 및 분해. 단층의 세포는 37 ℃에서 24시간 동안, LDL-수용체를 상향 조절하기 위한 5 g/100g LPDS [2]이 보충된 MEM에서, 표에 목록화된 다른 농도의 eα' 또는 α' 정제된 서브유닛 3.5 μmol/L 또는 심바스타틴 1.0 μmol/L의 존재/부존재하에서 사전배양하였다. 그 후, 고정된 농도 (7.5 mg/L) ¹²⁵I-LDL을 상기 배지에 첨가하였고, 37 ℃에서 추가적으로 5시간 동안 배양을 지속하였다. ¹²⁵I-LDL 특이적 흡수(결합 + 내재화) 및 분해는 이전에 보고된 바와 같이 평가되었다[2].

통계적 분석. 다른 농도로 eα'를 가지고 세포를 배양한 후에, LDL의 세포 흡수 및 분해의 차이는 ANOVA 및 이후 두네트 시험(Dunnett's test)에 의해 결정되었다. 값은 평균 ±SD로서 표현하였다; P 값 < 0.05은 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.

결과

피치아 파스토리스에서 eα'의 발현. 피치아 파스토리스 세포를 형질전환시키기 위해 사용된 플라스미드 구조는 도 1에 도시되어 있다. 삽입체의 서열과 α' 서브유닛과 배열(alignment)한 것은 도 2에 도시하였다. 재료 및 방법에서 언급한 바와 같이, 재조합 및 야생 폴리펩티드 사이의 유일한 차이는, N-말단의 첫번째 아미노산 잔기에 있는데, 기술적인 이유로, 상기 아미노산 잔기는 재조합 사슬에 알라닌이다. 배양 배지의 SDS-PAGE 분석에 의해 판단된 바와 같이(나타내지 않음), 재조합 폴리펩티드를 가장 많이 생산하는 클론을 대량 생산을 위하여 선택하였다. 도 3-A는 메탄올 유도 전(레인 no.1)과, 메탄올로 1-6-19 및 25시간 동안 유도한 후(레인 n.2, n.3, n.4, n.5)의 효모 배양액의 상등액을 전기영동 분석한 것을 나타낸다. 여기에서 나타난 바와 같이, 약 20 kDa의 외견상 분자량에서의 명확한 밴드는 유도 결과로서 생겨난다.

eα'의 정제. eα'의 정제는 크로마토그래피 방법으로 수행하였다. 각 단계로부터 샘플을 채취하여, SDS-PAGE로 분석하였다. 상기 확인된 폴리펩티드의 균질성에 대한 정제 단계의 효과는 도 3-B에 나타내었다. 효모 단백질에 의한 아주 낮은 정도의 오염은 이미 배양 배지에 달성되었으나, 추가적인 크로마토그래피 단계는 주요한 오염 단백질을 제거하여, 거의 균질한 형태의 상기 재조합 단백질을 회수하도록 하였다. 이 밴드의 N-말단의 서열 분석으로, 이 20 kDa 폴리펩티드가 eα' 사슬에 대응하는 것이 확인되었다. 이 샘플의 순도는 상기 세포 분석(cell assays)에 적절하다고 판단하였다.

eα'의 생물학적 활성. 이는 하기 표 1에 보고된 바와 같이, 양성 대조군으로서, 정제된 α' 서브유닛 및 그의 절단된 α' 형태를 Hep G2 세포에 추가함으로써, 처리되지 않은 세포에 비하여 LDL 수용체-매개된 흡수 및 분해의 유의한 증가각 이루어졌다.

HepG2 세포^{1 ,2}에 의한 LDL 흡수 및 분해에 대한 α' 및 이의 절단된 형태 (eα')의 효과

샘플 타입	농도3	흡수		분해
	μ mol /L	ng 125 I - LDL / mg 세포 단백질	%	ng 125 I - LDL / mg 세포 단백질	%
LPDS4	-	94 + 5.1	100	80 + 4.3	100
7Sα'서브유닛	3.5	154 + 9.1*	164	128 + 4.8*	160
eα'	0.5	113 + 7.1*	120	100 + 10*	125
	1.0	138 + 9.2*	146	118 + 9.3*	148
	2.0	169 + 6.7**	179	157 + 8.7**	196
심바스타틴	1.0	188 + 10**	200	143 + 7.9**	179

¹상기 자료는 3번의 독립적인 실험의 평균 + SD이며, 각각은 4번씩 수행한 것이다. *P < 0.05 vs LPDS 및 **P<0.001 vs LPDS.

²컨플루언트 HepG2 세포의 단층을 5 % LPDS를 갖는 최소 영양 배지내에서, 다른 농도의 재조합 폴리펩티드(eα') 또는 정제된 α' 서브유닛(7Sα') 또는 심바스타틴의 존재 또는 부존재하에서, 37 ℃에서 24시간 동안 사전배양하였다. ¹²⁵I-LDL(7.5 mg/L 배지) 첨가 후에, 세포는 추가 5시간 동안 배양하였다.

⁴LPDS, 지질단백질이 결핍된 혈청

상기 결과는 LDL 조절은 eα'에 용량-의존적이라는 것 및 가장 높은 농도는 양성 대조군인 심바스틴의 그것과 비슷하다는 것을 보인다. MTT 및 LDH 분석에 의해 결정된 바와 같이(나타내지 않음), eα'의 어떠한 농도에서도 세포 독성의 증거는 없었다.

그러므로, 본 발명에 따르면, 생물학적 반응을 유도할 수 있는 아미노산 서열은 α' 사슬의 N-말단 연장 도메인에서 있음이 밝혀졌다. 더욱이, 본 발명자는 N-말단의 친수성 단편이 강한 지방감소약물(hypolipidemic drug)인 심바스틴과 같은 정도의 농도에서 효과를 나타냄을 밝혔다. 이러한 효과는 적어도 부분적으로는 상기 단편과 본 발명자에 의해 보고된 것과 같이[3], 보존된 활성 부위 서열인 Cys-Gly-Pro-Cys의 산화환원-활성 디설파이드-디티올을 갖는 작은 다기능 단백질인 티오레독신간의 인비트로 상호작용으로 인한 것 때문이다. 이러한 발견은 대두 단백질을 포함한 콜레스테롤 풍부 식이로 양육된 토끼에서 관찰된 산화 제이구리(cupric oxide)에 의해 유도된 LDL 산화의 지체기(lag phase)가, 단백질원으로 카제인을 포함하는 것을 제외하고 동일한 식이로 양육된 토끼에서 보여지는 것에 비하여 길다는 것을 설명할 수 있다[22].

상기의 수득된 데이터는 대두 7S 글로불린 α' 사슬의 N-말단의 친수성 단편이, 심바스타틴에서 보고된 것과 비슷하게 10 μM 미만의 농도에서 인비트로 모델에서 활성이 있다는 것을 최초로 보인 것이기에, 특히 흥미롭다. 더욱이, 재조합 단백질의 이용은 다른 단백질, 및 명백한 잇점의 결여 및 잠재적인 독성이 보고된 이소플라본[23]을 포함하는 비-단백질 대두 성분의 임의의 관련성을 배제한다.

본 발명은 단독으로 또는 다른 지질강하 치료 약들, 예를 들어 심바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 로바스타틴과 조합되어 사용되어진 고지혈증 및 심혈관계 질환을 포함하는 다양한 질환에 유익한 효과를 보이는 기능성 식품 및 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 종래의 부형제 및 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 재조합 폴리펩티드의 용량(dosage)은 환자의 체중, 나이 및 성별과 같은 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 약물동력학(pharmaco-dynamics), 약물동태학(pharmacokinetics) 및 폴리펩티드의 독성학적 성질에 근거하여 의사에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 그러나, 일반적으로 상기 용량은 약 50 내지 약 500 mg, 하루에 1회 내지 3회의 범위일 것이다.

<110> INDENA S.P.A. <120> CLONING, YEAST EXPRESSION, PURIFICATION AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE EXTENSION REGION OF THE SOYBEAN 7S GLOBULIN ALFA' SUBUNIT INVOLVED IN HEP G2 CELL CHOLESTEROL HOMEOSTASIS <130> PM11-28482PCT <150> EP 09162939.4 <151> 2009-06-17 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> soybean sp. <400> 1 Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Cys Glu Glu Gly Gln Ile Pro Arg Pro 1 5 10 15 Arg Pro Gln His Pro Glu Arg Glu Arg Gln Gln His Gly Glu Lys Glu 20 25 30 Glu Asp Glu Gly Glu Gln Pro Arg Pro Phe Pro Phe Pro Arg Pro Arg 35 40 45 Gln Pro His Gln Glu Glu Glu His Glu Gln Lys Glu Glu His Glu Trp 50 55 60 His Arg Lys Glu Glu Lys His Gly Gly Lys Gly Ser Glu Glu Glu Gln 65 70 75 80 Asp Glu Arg Glu His Pro Arg Pro His Gln Pro His Gln Lys Glu Glu 85 90 95 Glu Lys His Glu Trp Gln His Lys Gln Glu Lys His Gln Gly Lys Glu 100 105 110 Ser Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Asp Glu Glu Gln Asp Lys 115 120 125 Glu Ser Gln Glu Ser Glu Gly Ser Glu Ser Gln Arg Glu Pro 130 135 140 <210> 2 <211> 577 <212> PRT <213> Soybean sp. <400> 2 Val Glu Glu Glu Glu Glu Cys Glu Glu Gly Gln Ile Pro Arg Pro Arg 1 5 10 15 Pro Gln His Pro Glu Arg Glu Arg Gln Gln His Gly Glu Lys Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Gly Glu Gln Pro Arg Pro Phe Pro Phe Pro Arg Pro Arg Gln 35 40 45 Pro His Gln Glu Glu Glu His Glu Gln Lys Glu Glu His Glu Trp His 50 55 60 Arg Lys Glu Glu Lys His Gly Gly Lys Gly Ser Glu Glu Glu Gln Asp 65 70 75 80 Glu Arg Glu His Pro Arg Pro His Gln Pro His Gln Lys Glu Glu Glu 85 90 95 Lys His Glu Trp Gln His Lys Gln Glu Lys His Gln Gly Lys Glu Ser 100 105 110 Glu Glu Glu Glu Glu Asp Gln Asp Glu Asp Glu Glu Gln Asp Lys Glu 115 120 125 Ser Gln Glu Ser Glu Gly Ser Glu Ser Gln Arg Glu Pro Arg Arg His 130 135 140 Lys Asn Lys Asn Pro Phe His Phe Asn Ser Lys Arg Phe Gln Thr Leu 145 150 155 160 Phe Lys Asn Gln Tyr Gly His Val Arg Val Leu Gln Arg Phe Asn Lys 165 170 175 Arg Ser Gln Gln Leu Gln Asn Leu Arg Asp Tyr Arg Ile Leu Glu Phe 180 185 190 Asn Ser Lys Pro Asn Thr Leu Leu Leu Pro His His Ala Asp Ala Asp 195 200 205 Tyr Leu Ile Val Ile Leu Asn Gly Thr Ala Ile Leu Thr Leu Val Asn 210 215 220 Asn Asp Asp Arg Asp Ser Tyr Asn Leu Gln Ser Gly Asp Ala Leu Arg 225 230 235 240 Val Pro Ala Gly Thr Thr Phe Tyr Val Val Asn Pro Asp Asn Asp Glu 245 250 255 Asn Leu Arg Met Ile Ala Gly Thr Thr Phe Tyr Val Val Asn Pro Asp 260 265 270 Asn Asp Glu Asn Leu Arg Met Ile Thr Leu Ala Ile Pro Val Asn Lys 275 280 285 Pro Gly Arg Phe Glu Ser Phe Phe Leu Ser Ser Thr Gln Ala Gln Gln 290 295 300 Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser Lys Asn Ile Leu Glu Ala Ser Tyr Asp 305 310 315 320 Thr Lys Phe Glu Glu Ile Asn Lys Val Leu Phe Gly Arg Glu Glu Gly 325 330 335 Gln Gln Gln Gly Glu Glu Arg Leu Gln Glu Ser Val Ile Val Glu Ile 340 345 350 Ser Lys Lys Gln Ile Arg Glu Leu Ser Lys His Ala Lys Ser Ser Ser 355 360 365 Arg Lys Thr Ile Ser Ser Glu Asp Lys Pro Phe Asn Leu Gly Ser Arg 370 375 380 Asp Pro Ile Tyr Ser Asn Lys Leu Gly Lys Leu Phe Glu Ile Thr Gln 385 390 395 400 Arg Asn Pro Gln Leu Arg Asp Leu Asp Val Phe Leu Ser Val Val Asp 405 410 415 Met Asn Glu Gly Ala Leu Phe Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Ile 420 425 430 Val Val Leu Val Ile Asn Glu Gly Glu Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly 435 440 445 Ile Lys Glu Gln Gln Gln Arg Gln Gln Gln Glu Glu Gln Pro Leu Glu 450 455 460 Val Arg Lys Tyr Arg Ala Glu Leu Ser Glu Gln Asp Ile Phe Val Ile 465 470 475 480 Pro Ala Gly Tyr Pro Val Met Val Asn Ala Thr Ser Asp Leu Asn Phe 485 490 495 Phe Ala Phe Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala 500 505 510 Gly Ser Lys Asp Asn Val Ile Ser Gln Ile Pro Ser Gln Val Gln Glu 515 520 525 Leu Ala Phe Pro Arg Ser Ala Lys Asp Ile Glu Asn Leu Ile Lys Ser 530 535 540 Gln Ser Glu Ser Tyr Phe Val Asp Ala Gln Pro Gln Gln Lys Glu Glu 545 550 555 560 Gly Asn Lys Gly Arg Lys Gly Pro Leu Ser Ser Ile Leu Arg Ala Phe 565 570 575 Tyr

Claims (3)

1. 서열번호 1을 갖는 N-말단 친수성 단편 대두 7S 글로불린 α' 서브유닛.
2. 재조합 폴리펩티드의 클로닝, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 발현 및 정제를 포함하는, 제1항의 대두 7S 글로불린의 N-말단 친수성 단편을 제조하는 방법.
3. 적절한 담체와 혼합된 제1항의 대두 7S 글로불린의 N-말단 친수성 단편을 유효 성분으로서 포함하는 조성물.

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