JP2012530090A - HEPG2細胞のコレステロール恒常性に関与するダイズ7Sグロブリンα’サブユニットの伸長領域のクローニング、酵母発現、精製および生物活性 - Google Patents
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Abstract
Description
高コレステロール血症患者の血中脂質レベル(lipidemic level)の制御における食事性のダイズタンパク質の役割は、広く受け入れられている論点である[1]。以前の研究[2〜4]においては、LDL受容体のアップレギュレーションにおけるダイズ7Sグロブリンの1つのサブユニットであるα’サブユニットの直接的な関与がin vitroおよびin vivo系において証明され、コレステロール恒常性を調節することができる生物活性(ポリ)ペプチドが、細胞酵素処理により産生される可能性が高いことが示唆されている。
今般、ダイズ7SグロブリンのN末端側に対応するそのいわゆるα’伸長領域が有益な生物活性を有することが分かり、LDLの取込みおよび分解に対してフルサイズのα’鎖より効果的でさえあることが証明された。
本発明は、次に、以下の実験の項において詳細に説明する。
酵母、細菌株および化学物質。酵母発現にPichia pastoris X33(WT)株(Invitrogen、San Diego、CA)を使用した。遺伝子操作に利用した細菌株はE.coli XL1−Blue(Invitrogen、San Diego、CA)であった。制限酵素Pst IおよびXba IをRoche(Indianapolis、IN)から、Sac IをFermentas(Ontario、Canada)から購入した。Taq DNAポリメラーゼはInvitrogen(San Diego、CA)から購入した。ゼオシンはInvivogen(San Diego、CA)から購入した。PCR用のオリゴヌクレオチドはPrimm(Milano、Italy)から得た。ペプトン、トリプトン、酵母エキスおよび寒天はBecton Dickinson and Company(Sparks、MD)から購入した。グルコースおよびソルビトールはSigma(St.Louis MO)から購入した。透析膜はSpectrum Laboratories(Rancho Dominguez、CA)から購入した。DEAE樹脂はWhatman(Maidstone、England)から購入した。NiNTA樹脂はQiagen(Hilden、Germany)から購入した。Symmetry C4 HPLCカラムはWaters(Milford、MA)から購入した。
より高性能のゲル電気泳動のために、供給業者の手順に従ってNuPAGE(登録商標)プレキャストゲルシステム(Invitrogen)を使用した。2グラムの凍結乾燥粉末を150mL 50mM Tris−HCl、pH7.50に溶解し、同じ緩衝液を用いて平衡化したDEAE−セルロースカラム(6×10cm、Whatman、Maidstone、UK)に装填した。それぞれ150および250mM NaClを含有する同じ緩衝液を用いて、保持されたタンパク質の溶出を実施した。0.25M NaCl(300mL)を用いて溶出した画分が、最も多いeα’の含量を示した。凍結乾燥により該溶液を100mLまで濃縮し、次いで、6000〜8000Daの膜を用いてmilliQ限外濾過水により4℃で24時間透析し、次いで、凍結乾燥した。約370mgのタンパク質を得た。
Pichia pastorisにおけるeα’の発現。Pichia pastoris細胞を形質転換するのに使用したプラスミドの構造を図1に示している。挿入物の配列およびα’サブユニットを有するそのアラインメントを図2に示している。材料および方法の項において述べたように、組換えポリペプチドと野生型のポリペプチドの間の唯一の差異はN末端第1アミノ酸残基にあり、それは、技術的な理由から、組換え鎖においてはアラニンであった。培養基のSDS−PAGE分析により判断したところ、最大の組換えポリペプチドの生産を示している(図示せず)クローンを大量生産のために選択した。図3−Aは、メタノールによる誘導の前(レーンn.1)および1〜8〜19および25時間後(レーンn.2、n.3、n.4、n.5)の酵母培養物の上清の電気泳動分析を示している。図3−Aが示しているように、約20kDaの明らかな分子量での明白なバンドが誘導の結果として生じている。
Claims (3)
- 配列番号1を有するN末端親水性フラグメントダイズ7Sグロブリンα’サブユニット。
- 組換えポリペプチドのクローニング、Pichia pastorisにおける発現および精製を含む、請求項1に記載のダイズ7SグロブリンのN末端親水性フラグメントの調製方法。
- 好適な担体との混合剤中に活性成分として請求項1に記載のダイズ7SグロブリンのN末端親水性フラグメントを含む組成物。
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