MX2011013680A - Clonacion, expresion de levadura, purificacion y actividad biologica de la region de extension de la subunidad alfa-prima de la globulina 7s de soya incluida en la homeostasis del colesterol en celulas hepg2. - Google Patents

Abstract

Una forma truncada de la cadena a' (ea'), la globulina 7S de soya, que actúa para controlar la homeóstasis del colesterol y los triglicéridos en modelos in vitro e in vivo se clonó y expresó en la levadura Pichia pastoris; el polipéptido recombinante abarcó 142 residuos de aminoácidos del lado Nterminal e incluyeron la región de extensión N-terminal de la subunidad alfa' de la soya; el polipéptido ea' se purificó mediante técnicas bioquímicas convencionales y su potencial para modular la actividad del receptor de LDL se evaluó en una línea celular de hepatoma de humano (Hep G2) al monitorear la captación y degradación de LDL etiquetados.

Description

CLONACIÓN, EXPRESIÓN DE LEVADURA, PURIFICACIÓN Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE LA REGIÓN DE EXTENSIÓN DE LA SUBUNIDAD ALFA- PRIMA DE LA GLOBULINA 7S DE SOYA INCLUIDA EN LA HOMEOSTASIS DEL COLESTEROL EN CÉLULAS HEPG2 La presente invención se refiere a un fragmento a' recombinante de la globulina 7S de soya que corresponde al fragmento hidrófilo N-terminal de la subunidad a' natural, a un procedimiento para su preparación y a las composiciones que la contienen como un ingrediente activo útil para controlar la homeostasis del colesterol y triglicéridos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El papel de las proteínas de soya dietéticas en el control de los niveles lipidémicos de los pacientes hipercolesterolémicos es un tema ampliamente aceptado [1]. En estudios previos [2-4], la participación directa de una subunidad de la globulina 7S de soya, la subunidad a', en la supra regulación del receptor LDL se demostró en sistemas in vitro e ¡n vivo, sugiriendo que los (poli)péptidos biológicamente activos, capaces de modular la homeostasis del colesterol, son probables que se produzcan mediante el procesamiento de enzimas celulares.

La globulina 7S natural se compone de tres cadenas de polipéptidos variados aleatoriamente, las subunidades a', a y ß [5], codificadas mediante diferentes genes. Las cadenas de ' (N. de muestreo P1 1827 base de datos UniProtKB/Swiss-Prot) y a maduras (N. de muestreo P13916 base de datos UniProtKB/Swiss-Prot) comparten una región extendida N-terminal de aproximadamente 145 residuos de aminoácidos que falta en la subunidad ß (N. de muestreo P25974 base de datos UniProtKB/Swiss-Prot). Con base en la secuencia de aminoácidos peculiar de la región de extensión de a', esta subunidad se purifica mediante cromatografía de afinidad al metal y administrada oralmente a ratas hipercolesterolémica, asi permitiendo mostrar tanto su propiedad de reducir los lípidos en el plasma como la supra regulación de los receptores hepáticos ß-VLDL [4]. Por otro lado, ya que el peso molecular de la subunidad a' está alrededor de 71 kDa [6], no parece probable que pueda cruzar in vivo la barrera intestinal con ninguna modificación.

Por esta razón, nuestra investigación se ha dirigido a buscar la/s secuencia/s de aminoácidos de la subunidad a' responsable del efecto farmacológico. Ya que las regiones del núcleo de las tres subunidades tienen secuencias de aminoácidos más parecidas, cabe la posibilidad de que la actividad biológica debe residir en uno o más (poli)péptidos de la región de extensión. En principio, las diferencias de los aminoácidos localizadas pero importantes entre las regiones de extensión de las cadenas de a' y a limitarían el número de péptidos responsables de la actividad biológica.

A partir de estas afirmaciones anteriores, la primera estrategia buscada fue analizar el efecto de ambos polipéptidos en las células Hep G2, obtenidas de la digestión ¡n vitro (pepsina/tripsina) de CroksoyR70, un concentrado de soya libre de isoflavona empleada como rutina en el tratamiento dietético de los pacientes hipercolesterolémicos [7-8], y péptidos sintéticos, correspondientes a las secuencias de aminoácidos específicas que difieren entre las subunidades de globulina 7S de soya, en la modulación del receptor LDL (LDL-R). Los resultados obtenidos en estos estudios mostraron que una supra regulación del LDL-R marcado podría inducirse en las células HepG2 expuestas a los productos de digestión de enzimas de CroksoyR70 con MW variando de 3,000 a 20,000 Da, así como a un péptido sintético pequeño (2.271 Da) de la globulina 7S de soya agregada a las células a una concentración de ??^? [9]. El estudio obtenido con péptidos pequeños actualmente está bajo investigación y hasta ahora no ha sido concluyente [10].

La capacidad de disminuir el colesterol y los triglicéridos de las proteínas de soya es un tema consolidado. La diete de proteína de soya es actualmente la herramienta dietética más potente para el tratamiento de pacientes hipercolesterolémicos, así proporciona una oportunidad única para el manejo de adultos e individuos muy jóvenes. Además, está claramente establecido que la reducción de colesterol en plasma es mayor en pacientes que tienen un alto grado de línea basal de colesterolemia [14].

La hipótesis de que las proteínas per se reducen el colesterol en sangre surge de los estudios experimentales que indican que un cambio de proteínas animales a vegetales en la dieta activa el sistema del receptor LDL en el hígado de animales de laboratorio [15], así como en los linfomonocitos circulantes de los pacientes hipercolesterolémicos [16]. Para identificar los componentes de la proteína de soy responsables del efecto de disminución de colesterol, se llevaron a cabo estudios in vitro con una línea celular de hepatomas humanos que es altamente sensible a los factores que regulan la expresión del receptor LDL y la biosíntesis/descomposición del colesterol. Se encontró que la subunidad a' purificada de la globulina 7S de soya supra regula los receptores LDL en las células Hep G2 [3] y esto se confirmó en las ratas alimentadas con colesterol [4]. Aunque estos datos sustentan la hipótesis de que la porción de proteína es responsable del efecto biológico observado, los argumentos pueden dar lugar al destino biológico de la cadena dea' in vivo, ya que los péptidos y aminoácidos se producen normalmente mediante la acción de las enzimas proteolíticas gástricas y/o intestinales. No obstante, se asegura que un número en aumento de (poli)péptidos animales y vegetales desempeña funciones reguladoras pertinentes, generalmente atribuidas a los efectos antioxidantes, antiproliferativos y antiinflamatorios [17]. En cuanto a la soya se refiere, la evidencia experimental indica claramente la posibilidad de que los péptidos e incluso las proteínas compactas pequeñas, como el inhibidor Bowman-Birk, pueden adsorberse [18], de este modo provoca numerosos efectos, incluyendo los anticancerosos, antiinflamatorios, radioprotectores [19]. También los (poli)péptidos de soya genéticamente modificados han mostrado que activan las respuestas biológicas, como los efectos hipotensores [20].

Recientemente, se ha identificado un péptido estimulador de la transcripción de LDL-R (FWNATSN), que deriva de la cadena de ß de globulina 7S, del hidrosilado de soya preparado mediante una proteasa de Bacillus amyloliquefaciens y después mediante síntesis química [21]. En este caso, se detectó una transcripción aumentada del LDL-R (+148%) en las células Hep G2 expuestas al péptido en una concentración de 100 µ?. Otros péptidos que surgen de la globulina 1 S han mostrado que ejercen actividad similar, pero menor [21].

Sería deseable poner a disposición los polipéptidos más cortos que mantienen o incluso mejoran las propiedades biológicas de la proteína de longitud completa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ahora se ha encontrado que la llamada Región de Extensión a' de la globulina 7S correspondiente al lado N-terminal de la misma tienen actividad biológica ventajosa y mostró ser incluso más efectiva en la captación y degradación de LDL que la cadena de a' de tamaño completo.

La invención proporciona dicha Región de Extensión de ', que en lo sucesivo se mencionará como ea', así como un procedimiento para su preparación mediante la clonación, expresión de levadura y purificación del polipéptido recombinante que contiene la región de extensión N-terminal de la subunidad a'de soya Para este propósito, se asumió la expresión heteróloga del fragmento N-terminal de la cadena de a'. El objetivo se alcanzó en las células de levadura competentes para la secreción de levadura Pichia pastoris. El polipéptido recombinante se purificó y su actividad biológica se evaluó en las células HepG2. Mediante el uso de este enfoque biotecnológico, se podrían obtener cantidades adecuadas del polipéptido recombinante para analizarse en ensayos in vitro y también en experimentos in vivo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 vista general de la construcción de pPICZaB-ea' . La expresión de ea' se impulsa mediante el promotor inducible con metanol de AOX (Alcohol OXidasa) (5???1 ); el factor de acoplamiento a(a-MF) promueve la secreción de la proteína recombinante al medio; AOX1 TT: Región de terminación de transcripción de AOX. El gen Sh ble gen atribuye resistencia a la zeocina; pUC Ori: origen de replicación para un alto número de copias de plásmidos enE. coli. Las otras abreviaciones se refieren a las posiciones de segmentación de las enzimas de restricción; pb: par de base.

La figura 2 es la alineación de secuencias del polipéptido recombinante (ea') y de la subunidad a' de soya natural. Las estrellas indican los residuos de aminoácidos idénticos en las dos secuencias.

La figura 2A es la secuencia del polipéptido recombinante (ea)' (SEQ ID1 ) La figura 2B es la secuencia de la subunidad a' de soya natural (SEQ ID2) La figura 3A es la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés) bajo condiciones de reducción de cultivo de Pichia pastoris recombinante: Banda M: Marcador de peso molecular Banda 1 : Sobrenadante de cultivo precipitado con TCA (sin células) antes de la inducción con metanol.

Banda 2: Sobrenadante de cultivo precipitado con TCA (sin células) después de 1 h de inducción con metanol.

Banda 3: Sobrenadante de cultivo precipitado con TCA (sin células) después de 8h de inducción con metanol.

Banda 4: Sobrenadante de cultivo precipitado con TCA (sin células) después de 19h de inducción con metanol.

Banda 5: Sobrenadante de cultivo precipitado con TCA (sin células) después de 25h de inducción con metanol.

La figura 3B es la SDS-PAGE bajo condiciones de reducción de los pasos de purificación de ea': Banda M: Marcador de peso molecular Banda 1 : polvo liofilizado de caldo de fermentación Banda 2: Fracción eluida con 150 mN de NaCI de dietilaminoetilcelulosa (DEAE, por sus siglas en inglés Banda 3: Fracción eluida con 250 mN de NaCI de DEAE DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Ahora, se describirá la invención detalladamente en la siguiente sección experimental.

Materiales y Métodos Levadura, cepas bacterianas y productos químicos. Pichia pastoris cepa X33 (WT) (Invitrogen, San Diego, CA) se utilizó para la expresión de levadura. La cepa bacteriana utilizada para las manipulaciones genéticas fue E. coli XL1-Blue (Invitrogen, San Diego, CA). Las enzimas Pst I y Xbal se obtuvieron de Roche (Indianapolis, IN), Sac I de Fermentas (Ontario, Canadá) La Taq ADN polimerasa se obtuvo de Invitrogen (San Diego, CA). Se obtuvo la zeocina de Invivogen (San Diego, CA). Los oligonucleótidos para PCR se obtuvieron de Primm (Milán, Italia). La peptona, triptona, el extracto de levadura y agar se obtuvieron de Becton Dickinson and Company (Sparks, MD). La glucosa y el sorbitol se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). Las membranas de diálisis se obtuvieron de Spectrum Laboratories (Rancho Domínguez, CA). La resina de DEAE se obtuvo de Whatman (Maídstone, Inglaterra). La resina de NiNTA se obtuvo de Qiagen (Hilden, Alemania). La columna para HPLC simetría C4 se obtuvo de Waters (Milford, MA).

Otros productos químicos tienen un grado de reactivo de Sigma (St. Luis, MO) o de Merck (Darmstadt, Alemania).

Medios y condiciones de crecimiento. P. pastoris cepa X33 se cultivó en un medio completo de YPD (Levadura Peptona Dextrosa) (peptona al 2%, extracto de levadura al 1 %, glucosa al 2%). Los transformados de Mut+ se seleccionaron en placas que contienen YPD, agar 1.5%, 100 mg/mL de zeocina. Todos los cultivos de levadura se mantuvieron a 30°C. Para la detección de proteina heteróloga, los transformados de Zeor-Mut+ se cultivaron a una densidad óptica de 5 en 600 nm en un medio de YPS (Levadura Peptona Sorbitol) (peptona al 2%, extracto de levadura al 1 %, sorbitol al 2%). Luego se agregó metanol al 1 % de la concentración final. Todos los transformados bacterianos se seleccionaron en placas de un medio de LB (Luria-Bertani) con poco contenido de sal que contiene zeocina (triptona al 1 %, extracto de levadura al 0.5%, cloruro de sodio al 0.5%, agar al 1.5%, 25mg/mL de zeocina). Todos los cultivos bacterianos se mantuvieron a 37°C.

Construcción del vector de expresión del gen eo!. El gen ea' se amplió por medio de PCR en una plantilla de expresión de ADN de plásmido Pichia pastoris (pPICZaB) que contiene un inserto (ta') que comprende la secuencia de interés (ea ). El oligonucleótido 5'-GAAAAGATAGATTAAAGCTGCAGTGGAGGAAG -3' se diseñó para generar el sitio de restricción de Pstl en el extremo 5' del gen ea' . Esta mutación resultó en una inserción de residuos de alanina en la posición N-terminal de ea'. Un segundo oligonucleótido 5'- CCCTTCTTATTCTTTCTAGATCATGGTTCTCTTTGAGACTC -3' se diseñó para generar el sitio de restricción de Xbal en el extremo 3' del gen ea' . Ambos oligonucleótidos se disolvieron en agua estéril mQ. La mezcla de reacción de PCR consistió en 0.5 mM de iniciadores, 0.8 mM de dNTP (Eppendorf, Hamburg, Alemania), plantilla de 30 ng (pPICZaB /ta'), 2.5 U Taq ADN Polimerasa, regulador de PCR (composición final: 50 mM de KCI, 1.5 mM de MgCI2, 20 mM de Tris-CI, pH 8.4 y agua estéril mQ para un volumen final de 25 mL). La amplificación de PCR se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer Geneamp PCR System 2400 (Perkin Elmer Corp., Wellesley, MA) utilizando las siguientes condiciones: inicia en 94°C durante 10 min; 30 ciclos a 94°C durante 40 seg, 60°C durante 40 seg, 72°C durante 20 seg; extensión final a 72°C durante 10 min y se mantuvo a 4°C. El producto de PCR de 465 pb se digirió enzimáticamente a una construcción de tamaño completo de 423 pb y se clonó en el vector pPICZaB resultando en la construcción de pPICZaB-ea' y se transformó en células de E. coli XL1 -Blue. Los clones positivos se seleccionaron en medios LB semisólido que contiene tetraciclina y zeocina. Uno de estos clones se ordenó en serie mediante Primm (Milán, Italia) para asegurar que no sucediera ninguna mutación en la secuencia de construcción pPICZaB-ea' . La construcción de veinte µg pPICZaB-ea' y el vector de expresión de 30 µg pPICZaB (control negativo) se linealizaron mediante la digestión con la enzima de restricción Sacl y después se purificaron.

Transformación de pPICZaB-ea' en genoma de P. pastoris. Las células de levadura naturales (wt, por sus siglas en inglés) se transformaron mediante la electroporación con 20 µg de la construcción pPICZaB-ea' linealizadas y 30 µg de pPICZaB linealizado en un aparato electroporador Eppendorf (Hamburgo, Alemania) 2510 configurado a 1.5 kV. Los transformados primero se seleccionaron al ponerlos en placas en placas de YPD que contienen 100 mg/mL de zeocina. Para verificar la integración de nuestra construcción en el genoma P pastoris transformado, se utilizó el Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania) para extraer el ADN genómico. El ADN genómico se utilizó como plantilla para verificar la inserción de la construcción en el sitio del promotor de alcohol oxidasa (AOX1 ) mediante PCR utilizando 5' AOX1 (5 -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ) e iniciadores 3???1 (5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 '). La mezcla de reacción de PCR consistió en 0.5 m de iniciadores, 0.25 mM de dNTP, 100 ng para la plantilla genómica, 2.5 U de Taq ADN Polimerasa, regulador de PCR (composición final como la anterior). La reacción de PCR se llevó a cabo usando las siguientes condiciones: inicio a 94°C durante 10 min; 30 ciclos a 94°C durante 40 s, 60°C durante 40 s, 72°C durante 20 s; extensión final a 72°C durante 10 min y se mantuvo a 4°C.

Selección del clon de transformado. Dieciocho transformados de Zeo+ y un transformado que contiene el vector de expresión pPICZaB (control negativo) se cultivaron en 50 ml_ del medio de YPS a 30°C en una incubadora de agitación (180 rpm) a un OD6oo = 5. La fase de inducción se activó al agregar metanol a la concentración final al 1 % y se prolongó durante 24 horas. Los alícuotas de los sobrenadantes se examinaron para la expresión de ea' mediante SDS-PAGE. El transformado del clon con la expresión más alta ea' se seleccionó para la producción a escala del termentador de la proteína recombinante.

Expresión de ea': escala del termentador. Para la producción masiva, se cultivó el clon seleccionado en 14 L del termentador (Chemap, Suiza), de acuerdo con "Pichia Fermentation Process Guidelines" de Invitrogen (Versión B, 053002). Se preparó el cultivo inoculo en el medio de YNB (KH2P04 2.0 g; (NH4)2S04 10.0 g; MgS04 7H20 1.0 g; NaCI 0.2 g; CaCI2 0.2 g; Glicerol 100% 10.0 g; KOH a pH 5.2; agua destilada a 1.0 L) en matraces oscilantes sin deflectores. Después de la incubación durante aproximadamente 24 horas a 30°C a 250 rpm, se utilizó 1.0 L del cultivo de semillas para inocular el termentador, preparado con 8.5 L del medio basal salino (H3P04 85% 227 mL¡ CaSO4 2H20 7.9 g; K2SO4 155 g; MgSO4 7H2O 127 g; KOH 35 g; Glicerol 100% 340 g; agua destilada a 8.5 L; pH ajustado a 5.0 con NH OH después de la esterilización). Ambos medios de cultivo mencionados se complementaron con biotina e inositol (1 mg/l cada uno). El medio basal salino también se complementó con solución salina traza de PTM1 modificado (H2S04 96% 2.5 mL; CoC204»2H20 243 mg; CuS04°5H20 3.0 g; Kl 44.5 mg; MnS0 °H2O 1.5 g; Na2Mo04»2H20 100 mg; H3BO3 10 mg; FeS04°7H20 32.5 g; ZnCI2 10 g; agua destilada a 500 ml_).

El crecimiento del microorganismo y la expresión de la proteína heteróloga se obtuvieron por medio de un procedimiento de tres pasos. Una primera fase de crecimiento por lotes (glicerol como fuente de C) de aproximadamente 24 horas está seguida de una fase de suministro por lotes (glicerol como fuente de C limitante) de aproximadamente 4 horas. Durante estas dos primeras fase, se mantiene el pH a 5.0 al agregar 20 % de NH4OH . Una vez que todo el glicerol se consume, se inicia un suministro de metanol para activar la expresión de la proteína ea' y el pH se cambia a 6.0 al agregar 20 % de NH4OH . La fase de suministro por lotes de metanol dura aproximadamente 24 horas. Durante estas dos fases de suministro por lotes el oxígeno disuelto (DO en %) se mantiene estable a 30% mediante la regulación electrónica fina de la velocidad del agitador (rpm) mientras el índice de ventilación (wm) se aumenta manualmente de manera progresiva. Cada pocas horas, la condición limitante de la fuente de C se verifica al seguir el nivel de DO en %: su valor debe mostrar un repentino aumento después de un alto repentino del suministro de metanol y viceversa, una disminución rápida después de la reanudación. Cada pocas horas, se toman las muestras en condiciones asépticas del fermentador para los siguientes análisis: La densidad óptica (lambda 600 nm), % de biomasa celular (peso húmedo), esterilidad, observación microscópica, SDS-PAGE.

Purificación de ea': procesamiento descendente del caldo de fermentación. Aproximadamente 9.2 L del cultivo se derrama del fermentador y se enfría en hielo. Todas las operaciones posteriores se llevan a cabo a +4°C. El cultivo completo se separa mediante centrifugación (Centrikon T-124, Kontron Instruments) a 3,000 *g durante 30 min; la biomasa (pella) se desecha; aproximadamente 7.5 L del sobrenadante se aclara por medio de la filtración de profundidad en Zetaplus 30SP (Cuno) y posteriormente se microfiltró en un filtro de 0.22 µ?t? (Millipak 100, Millipore). El filtrado claro se concentra por ultrafiltración en la membrana de polietersulfona, MWCO 10 kDA (Filtro Omega, Pall). El concentrado, aproximadamente 300 mL, se diafiltra contra 3.0 L de Tris-HCI 10 mM pH 7.2 y finalmente se liofilizó. Con este procedimiento se obtuvieron 34.5 g de polvo liofilizado, mostrando un bajo grado de proteínas contaminantes en SDS-PAGE y teniendo un contenido total de proteína de aproximadamente 25 % en p/p (Ensayo de proteínas Bradford, Albúmina de suero bovino como calibración estándar).

Purificación de ea': purificación cromatográfica.

Para la electroforesis de gel de desempeño más alto, se utilizó un sistema de gel premoldeado, NuPAGE® (Invitrogen) de acuerdo con los procedimientos del proveedor. Se disolvieron dos gramos de polvo liofilizado en 150 mL de 50 mM de Tris-HCI, pH 7.50 y se cargaron en una columna de DEAE celulosa (6 x 10 cm, Whatman, Maidstone, UK) equilibrada con el mismo regulador de pH. La elución de las proteínas retenidas se llevó a cabo con el mismo regulador de pH que contiene 150 y 250 mM de NaCI respectivamente. La fracción eluida con 0.25 M de NaCI (300 mL) mostró el mayor contenido de ea'. La solución se concentró a 100 mL mediante secado por congelación y después se dializó con una membrana de 6000-8000 Da a 4°C durante 24 horas con agua ultrafiltradas milliQ y después se liofilizó. Se obtuvieron aproximadamente 370 mg de proteínas.

Para verificar la homogeneidad de la proteína, se cargó aproximadamente 1 mg de proteína en una columna de fase inversa (4.6 ? 250 mm) simetría C4. Se utilizaron el regulador de pH A (agua ultrafiltrada y 0.1 % de ácido trifluoroacético) y el regulador de pH B ( 00% de Acetonitrilo + 0.1% de ácido trifluoroacético).

Técnicas electrof oráticas. Se llevó a cabo el SDS-PAGE bajo condiciones de reducción (ß-mercaptoetanol al 2%) en geles de poliacrilamida al 12%, de acuerdo con la ref. 1 1 , usando una célula mini-Protean II (Bio-Rad). Se tiñeron los geles con Coomassie Blue.

Cultivos celulares. Se obtuvo la línea celular de hepatoma humano establecida (HepG2) de American Type Culture Collection (Rockville, MD). Se obtuvo el medio esencial mínimo de Eagle (MEM), suero fetal bovino, tripsina-EDTA (1x), penicilina (105 U/L), estreptomicina (100 g/L), regulador de tricina (1 mmol/L, pH 7.4) y soluciones de aminoácidos no esenciales (100x) de GIBCO (Madison, Wl). Las cajas de Petri fueron de COSTAR (Cambridge, MA). Los filtros de Millípore (Bedford, MA). El kit de Ensayo de Proteínas Coomassie Plus se obtuvo de Pierce (Rockford, IL, EUA). 125lodina, libre de portador, en 100 mmoles/L de NaOH se obtuvo de Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA). Las columnas Sephadex G25 (PD10) de Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). El kit de LDH y MTT de Sigma Diagnostics (Milán-Italia).

Todos los demás productos químicos de grado analítico de Merck (Darmstadt, Alemania). Se cultivaron las células en monocapas en cajas de Petri de 90 mm de diámetro, y se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de aire al 95%, C02 al 5% en MEM complementado con suero fetal bovino (FCS) al 10% , solución de aminoácidos esenciales (1 %, v/v), penicilina (105 U/L), estreptomicina (0.1 g/L), regulador de tricina (20 mmoles/L, pH 7.4), NaHC03 (24 mmoles/L) y piruvato de sodio (0.11 g/L). Para los experimentos diseñados para evaluar la modulación del receptor LDL, se sembraron células en cajas de plástico de 35 mm (3-5 x 105 células) y se utilizaron justo antes de alcanzar la confluencia. En todos los experimentos celulares, el medio se cambió cada 2-3 días. Para evaluar la viabilidad celular, los medios de cultivo de las células expuestas a ea' en diferentes concentraciones se evaluaron mediante el ensayo de sales de metiltetrazolio (MTT), esencialmente como se describe en la ref. 9. La fuga de enzimas celulares se determinó al medir la actividad del lactato deshidrogenasa (LDH), utilizando un kit de diagnóstico (LDH/LD) cinético (Sigma Diagnostics). LDL (1.019< d <1.063 g/L) se aislaron mediante la centrifugación preparativa en secuencias [12] del plasma de los voluntarios normolipidémicos clínicamente saludables. Las lipoproteinas se etiquetaron de acuerdo con el método de McFarlane como lo modifica Bilheimer et al. [13], y describe anteriormente [3]. 125I-LDL se esterilizaron mediante filtración (filtros Míllipore, 0.45 pm de tamaño de poro) y se almacenaron a 4°C hasta el uso. El suero deficiente de lipoproteinas humanas (LPDS) se preparó como se describe anteriormente [9].

Captación y degradación de 125I-LDL. Las monocapas de las células se preincubaron a 37°C durante 24 h en MEM complementado con 5g/100g de LPDS para supra regular los receptores LDL [2], en la presencia/ausencia de ea' en diferentes concentraciones mencionadas en el Cuadro o 3.5 µ?????e/? de la subunidad a' purificada o 1 .0 µ????/L de simvastatina. Después, se agregó una concentración fija (7.5 mg/L) de 125l-LDL al medio y la incubación continuó durante unas 5 h adicionales a 37°C. La captación específica (enlace + internalización) y la degradación de 125I-LDL se evaluaron como previamente se reportó [2].

Análisis estadísticos. Se determinaron las diferencias en la captación y degradación celular de LDL después de la incubación celular con ea' en diferentes concentraciones mediante ANOVA seguido por las pruebas de Dunnett . Se expresan los valores como valores + SD medios; los valores P < 0.05 se consideraron como estadísticamente importantes.

Resultados Expresión de ea' en Pichia pastoris. La estructura del plásmido utilizado para transformar las células de Pichia pastoris se muestra en la figura 1. La secuencia del inserto y su alineación con la subunidad a' se muestran en la figura 2. Como se mencionó en los Materiales y Métodos, la única diferencia entre los polipéptidos recombinantes y naturales consistió en el primer residuo de aminoácido N-terminal que, por razones técnicas, fue una alanina en la cadena recombinante. El clon que muestra la mayor producción de polipéptido recombinante, según el análisis de SDS-PAGE del medio de cultivo (no se muestra) fue seleccionado para la producción masiva. La figura 3A muestra el análisis electroforético del sobrenadante del cultivo de levadura antes (carril n.1) y después de la inducción con metanol por 1 - 8 - 19 y 25 horas (carril n.2, n.3, n.4, n.5). Como se muestra, una banda evidente en un peso molecular aparente de aproximadamente 20 kDa surge como resultado de la inducción.

Purificación de ea'. La purificación de ea' se logró por métodos cromatográficos. Las muestras de cada paso se recolectaron y se analizaron mediante SDS-PAGE. El efecto de los pasos de purificación en la homogeneidad del polipéptido identificado se muestra en la figura 3B. Un grado muy bajo de contaminación por proteína de levadura ya se habóía logrado en el medio de cultivo, pero los pasos cromatográficos adicionales removieron proteínas contaminantes importantes y permitieron la recuperación del polipéptido recombinante en una forma casi homogénea. El análisis de la secuencia N-terminal de esta banda confirmó que este polipéptido de 20 kDa correspondía a la cadena ea'. Se consideró que la pureza de esta muestra era apropiada para los ensayos celulares.

Actividad biológica de ea. La adición de la subunidad purificada de a', como control positivo y su forma truncada de a' a las células HepG2 produjeron un aumento significativo en la captación y degradación mediadas por el receptor de LDL en comparación con las células no tratadas, reporta en el siguiente cuadro.

CUADRO El efecto de a' y su forma truncada (ea') en la captación v degradación de LDL por células de HepG21 2 Tipo de Concentración3 Captación Degradación muestra /^no/es/L ngr¿bl-LDU % ngr¿ül-LDU % mg protelna mg proteína de de célula célula LPDS4 - 94 + 5.1 100 80 + 4.3 100 subunidad 7S a' 3.5 154 + 9.1* 164 128 + 4.8* 160 ea' 0.5 113 + 7.1* 120 100 + 10* 125 1.0 138 + 9.2* 146 118 + 9.3* 148 2.0 169 + 6.7** 179 157 + 8.7** 196 Simvastatina 1.0 188 + 10** 200 143 + 7.9** 179 Los datos son medias + SD de 3 experimentos independientes, cada uno realizado en cuadruplicados. *P< 0.05 vs LPDS y **P<0.001 vs LPDS. 2Monocapas confluentes de células de HepG2 se preincubaron por 24 h a 37°C en un medio esencial mínimo con 5% LPDS, en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de polipéptido recombinante (ea') o subunidad purificada de ' (7S a') o simvastatina. Después de la adición de 125I-LDL (7.5 mg/L de medio) las células se incubaron por 5 h adicionales. 4LPDS, suero desprovisto de lipoproteína.

Los resultados mostraron que la modulación de LDL fue dependiente de la dosis con ea' y que la concentración más elevada fue semejante a la del control positivo, simvastatina. En ninguna concentración de ea' se encontró evidenci alguna de toxicidad celular, según los ensayos de MTT y LDH (no se muestran).

Por lo tanto se ha encontrado según la invención que la secuencia de aminoácidos capaz de inducir la respuesta biológica yace en el dominio de extensión N-terminal de la cadena de a'. Además, se encontró que el fragmento hidrófilo N-terminal ejerce sus efectos en concentraciones en el orden de magnitud igual al de la simvastatina, un poderoso fármaco hipolipidémico. Este efecto podría deberse por lo menos parcialmente a la interacción in vitro entre el fragmento anterior y la tioredoxina, una pequeña proteína multifuncional con un disulfuro-ditiol activado por redox en la secuencia de sitio activo conservada Cys-Gly-Pro-Cys, como lo reportan los presentes inventores [3]. Este hallazgo quizás explique la fase de demora más larga de de la oxidación de LDL inducida por óxido cúprico observada en conejos alimentados con una dieta rica en colesterol que contiene proteína de soya vs. la encontrada en conejos alimentados con la misma dieta pero con caseína como fuente de proteína [22].

Los datos obtenidos son particularmente interesantes porque muestran por primera vez que el fragmento hidrófilo N-terminal de la cadena a' de globulina 7S de la soya está activa en el modelo in vitro en concentraciones menores a 10 µ?, que son similares a las reportadas para la simvastatina. Además, el uso de una proteína recombinante descarta cualquier participación de otros componentes de proteína y no proteína de soya, inclusive isoflavonas, de las cuales se a reportado una falta de beneficios claros y toxicidad potencial [23].

La invención proporciona alimentos y composiciones funcionales con efectos beneficiosos sobre varias enfermedades, incluyendo hiperlipidemia y enfermedad cardiovascular, para ser utilizados solos o en combinación con fármacos en terapias para disminución de lípidos, es decir estatinas tales como simvastatina, pravastatina, fluvastatina, atorvastatina, lovastatina.

Las composiciones de la invención se preparan usando excipientes y métodos convencionales. La dosificación del polipéptido recombinante de la invención dependerá de varios factores, como el peso de paciente, su edad y sexo y será determinado fácilmente por el facultativo con base en la farmacodinámica, farmacocinética y en las características toxicológicas del polipéptido. En general, no obstante, dicha dosificación estará en la escala de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 mg, una a tres veces al día.

REFERENCIAS 1. Sirtori CR. et al., Curr Atheroscler Rep. 2001 ; 3: 47-53. 2. Lovati MR. et al., J Nutr. 1992; 122: 1971-8. 3. Manzoni C. et al., J Nutr. 2003; 133: 2149-55. 4. Duranti M. et al., J Nutr. 2004;134: 1334-39. 5. Thanh, VH. et al., Biochim Biophys Acta. 1976; 439: 326-38. 6. Maruyama N. et al., J Agrie Food Chem. 1999; 47: 5278-84. 7. Sirtori CR. et al., Nutr Metab Cardiovasc Dis. 1998; 8: 334-40. 8. Lovati MR. et al., J Agric Food Chem. 1998; 46: 2474-80. 9. Lovati MR. et al., J Nutr. 2000; 130: 2543-2549. 10. Lovati MR. et al., Faseb J. 2006; LB 391 : 86. 1 1. Laemmli UK. Nature. 1970; 227: 660-5. 12. Havel RY. et al., J Clin Invest. 1955; 34: 1345-53. 13. Bilheimer DW. et al.,. Biochim. Biophys. Acta 1972; 260: 212- 14. Sirtori CR. et al., Brit J Nutr. 2007; 97: 816-22. 15. Lovati MR. et al., Nutr Metab Cardiovasc Dis. 1991 ; 1 : 18-24. 16. Lovati MR. et al., J Clin Invest. 1987; 80: 1498-502. 17. Kitts DD. et al., Curr Pharm Des. 2003; 9: 1309-23. 18. Wan XS. et al., Nutrition and Cáncer. 2002; 43:167-73. 19. Clemente A. et al., Recent Progress in Medicinal Plants. 397-417. 20. Matoba N. et al., FEBS Lett. 2001 ; 497: 50-4. 21. Cho SJ. et al., J Agrie Food Chem. 2008; 56: 4372-6. 22. Castiglioni S. et al., Atherosclerosis. 2003; 171 : 163-70. 23. Sirtori CR. et al., Drug Safety 2001 ; 24: 665-82.

Claims (3)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El fragmento hidrófilo N-terminal de la subunidad a' de globulina 7S de soya que tiene la SEQ ID1.

2 - Un procedimiento para la preparación del fragmento hidrófilo N-terminal de la globulina 7S de soya de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende la clonación, la expresión en Pichia pastoris y la purificación del polipéptido recombinante.

3 - Composiciones que comprenden como el ingrediente activo el fragmento hidrófilo N-terminal de la globulina 7S de soya de conformidad con la reivindicación 1 en mezcla con un portador adecuado.