PT2207790E - Péptidos que contêm arginina c-terminal biologicamente ativos - Google Patents

Description

ΕΡ2207790Β1

DESCRIÇÃO

PÉPTIDOS QUE CONTÊM ARGININA C—TERMINAL BIOLOGICAMENTE

ATIVOS

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito à separação, identificação e caracterização de fragmentos de péptidos ativos a partir de peptonas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os hidrolisados de tecidos animais e vegetais são muitas vezes adicionados a meios de cultura de células procarióticas e eucarióticas para reforçar o número de células viáveis e a titulação de produtos de proteínas recombinantes. Deste modo, as peptonas de diversas origens foram muito utilizadas nas formulações de meio de cultura de células para melhorar o crescimento, a longevidade e a produtividade da cultura de células. Contudo, a respetiva presença como aditivos de meios para a produção de proteínas terapêuticas representa diversos desafios devido à sua natureza indefinida. A utilização de componentes derivados de animais como aditivos de meios para a produção de proteínas terapêuticas através de células de mamífero pode causar contaminações virais, por micoplasma e do prião (Kallel et al., J. Biotechnol. 95:195 a 204 (2002)). O esforço para evitar a utilização de componentes derivados de animais nos meios de cultura de células é suportado tanto pelas autoridades reguladoras europeias como americanas (Castle e Roberston, Dev. Biol. Stand. 99:191 a 196 (1999)). O soro animal foi eliminado com êxito dos meios nas últimas décadas, e a 1 ΕΡ2207790Β1 maioria dos meios atualmente utilizados são certificados como livres de proteínas (Froud, Dev. Biol. Stand. 99:157 a 166 (1999)). Contudo, a mudança para meios sem proteínas resulta muitas vezes numa perda de crescimento e produtividade celular (Lee et ai., J. Biotechnol. 69:85 a 93 (1999)).

Por consequência, os hidrolisados de proteína (igualmente conhecidos como peptonas) são frequentemente utilizados nos meios de cultura de células como aditivos nutrientes, uma vez que alguns deles podem ser considerados livres de proteínas 25 (Burteau et ai., In Vitro Cell. Dev. Biol. - Anim. 39 (7):291 a 296 (2003), US-A1-2004/0138428, EP-A2-0810283 e "BD Bionutrients Technical Manual" Terceira Edição Revista (2006) BD BIOSCENCE). As peptonas para a cultura de células são habitualmente fabricadas através de digestão enzimática de uma variedade de materiais iniciais com base biológica: tecidos animais, produtos derivados do leite, micro-organismos ou plantas. O efeito geral das peptonas é um melhoramento do crescimento celular e um aumento da produtividade, com a mesma qualidade de produto em comparação com o meio padrão (Jan et ai., Cytotechnology 16:17 a 26 (1994); Heidemann et ai., Cytotechnology 32:157 a 167 (2000); Sung et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 63:527 a 536 (2004)). Diversos documentos mostraram que as peptonas contêm materiais, tais como aminoácidos livres, oligopéptidos, sais de ferro, lípidos e oligoelementos (Franck et ai., Biotechnol. Prog. 16:688 a 692 (2000); Martone et al. , Bioresour. Technol. 96:383 a 387 (2005)). Um estudo investigou as potenciais funções das peptonas e mostrou que estas podem ter um efeito nutritivo (Heidemann et al., Cytotechnology 32:157 a 167 (2000). Igualmente, Schlaeger, J. Immunol. Meth. 194:191 a 199 (1996), demonstrou que um determinado 2 ΕΡ2207790Β1 hidrolisado de proteína apresenta propriedades antiapoptose.

Apesar das muitas investigações sobre os efeitos da peptona na cultura de células, o respetivo mecanismo de ação ainda é desconhecido. Além disso, mesmo que as peptonas tenham demonstrado ser benéficas nos processos de cultura de células, a sua utilização também tem muitas desvantagens. Primeiro, uma vez que algumas peptonas são derivadas de animais, são encontrados problemas semelhantes aos da utilização do soro. Além disso, as peptonas de outras origens também podem ser uma potencial fonte de agentes adventícios. Segundo, a incerteza dos componentes "ativos" na peptona e respetivo mecanismo de ação torna difícil, se não impossível, ter uma medida de qualidade nos lotes de peptona utilizados nos processos de fabrico de cultura de células. Finalmente, uma vez que os materiais de origem e os processos no fabrico de peptona não são uniformizados ou universalmente permutáveis, as próprias peptonas são, por natureza, um material em bruto de uma única origem. Por conseguinte, é possível caracterizar melhor as peptonas, de modo a reduzir ou eliminar estas desvantagens.

Por isso, seria vantajoso compreender a composição e identidade dos componentes ativos nas peptonas para criar "meios definidos", compreendendo componentes ativos bem especificados em concentrações reproduzíveis bem definidas. Além disso, espera-se que a identificação de componentes de peptona ativos leve a uma melhor compreensão da fisiologia de células hospedeiras recombinantes e linhas celulares abrindo uma janela para o controlo do crescimento e da morte celular e um melhor controlo da expressão de proteínas recombinantes. 3 ΕΡ2207790Β1

Por conseguinte, foram desenvolvidos esforços para caracterizar as composições de peptona e compreender os mecanismos do respetivo efeito nas culturas de células. A presente invenção baseia-se no fracionamento de uma peptona derivada de animais, PP3, em componentes identificáveis e na aplicação de técnicas analíticas modernas, incluindo espetrometria de massa de alta resolução, para estudar a natureza destes compostos. A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, no reconhecimento de que os di- e tripéptidos que terminam em arginina desempenham uma função nas atividades de estimulo do crescimento e da titulação de PP3.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção é conforme apresentado nas reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma ilustração esquemática do fracionamento e da análise de PP3, conforme descrito no Exemplo. A Figura 2 ilustra os resultados da cromatografia de fase reversa C18. A Figura 3 ilustra os resultados de cromatografia da fração (não ligada) de passagem C18. A "atividade especifica relativa" é definida como a atividade de um peso igual da fração dividido pelo de PP3.

As Figuras 4A e 4B ilustram que a atividade especifica do material purificado com G15 (frações F3-F7) 4 ΕΡ2207790Β1 aumentou significativamente em comparação com a de PP3 relativamente à respetiva capacidade de aumentar a titulação de proteínas recombinantes (Figura 3A) e a contagem de células viáveis (VCC; Figura 3B).

Figura 5. Análise espetral de massa da fração G-15. Painel superior: análise MS da fração. Painéis inferiores: análise ms/ms de m/z 403,2, 389,2 e 375,2 respetivamente.

Figura 6. Distribuição de frequência de péptidos numa biblioteca de tripéptidos in silico que terminam em R. Eixo X: massa de tripéptidos; eixo Y: frequência em cada massa.

As Figuras 7A e B. Efeitos de PP3 e péptidos XXR na VCC e titulação de produto. A. VCC medida no bioensaio em reposta à adição de concentrações crescentes de PP3 (Linha preta) ou péptidos XXR (Linha vermelha). B. Titulação de Produto medida no bioensaio em resposta à adição de concentrações crescentes de P33 (Linha preta) ou péptidos XXR (Linha vermelha).

Figura 8. Sequência de aminoácidos de componente 3 de proteose peptona (PP3) de polipéptido bovino (SEQ. ID N.0 1) . DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. Definições

Salvo definição em contrário, os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como é geralmente compreendido por um perito na técnica ao qual pertença esta invenção. Singleton et al., Dictionary of 5 ΕΡ2207790Β1

Microbiology and Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (Nova Iorque, NY 1994) fornecem um guia geral para muitos dos termos utilizados no presente pedido de patente a um perito na técnica. 0 termo "peptona" é utilizado aqui no sentido mais lato e inclui derivados de proteína solúveis em água obtidos através de hidrólise parcial de proteínas, e misturas dos mesmos, incluindo, sem limitação, misturas de hidrolisado derivadas do tecido mucoso de suínos, gado vacum e outros animais, produzidas por hidrólise com enzimas proteolíticas, bem como hidrolisados de vários tecidos vegetais. 0 termo inclui especificamente, sem limitação, o Componente 3 de proteose peptona (PP3), igualmente designado por lactoferrina, que é uma fosfoglicoproteína menor de 153 resíduos (Sorensen e Sorensen, J. Dairy Res. 60:535 a 542 (1993)) encontrada no leite bovino (número de acesso no banco de dados SwissProt: P80195; N.° de Acesso GenBank CAA58309), e proteínas homólogas caracterizadas no leite de outras espécies, como camelo (Beg et al., FEBS Lett. 216:270 a 274 (1987)), lama (Cantisani et al., J. Biochem. Biophys. Methods 21:227 a 236 (1990)), ovelha e cabra (Sorensen et al., J. Dairy Sei. 80:3176 a 3181 (1997)) e Lister et al., J. Dairy Res. 81:2111-2115 (1998). Até agora, não foi encontrado PP3 no leite humano. Ο PP3 está disponível em fontes comerciais, tais como, por exemplo, Difco Laboratories, Detroit, Michigan. O termo "péptido" é utilizado aqui para referir um composto que contém dois ou mais aminoácidos, nos quais o grupo carboxílico de um ácido é ligado ao grupo amino do outro por uma ligação de amida ou "péptido". A definição inclui especificamente péptidos formados por, pelo menos, dois resíduos de aminoácido e, em particular, di- e 6 ΕΡ2207790Β1 tripéptidos. O termo "proteína" significa uma sequência de aminoácidos para a qual o comprimento da cadeia é suficiente para produzir os níveis mais elevados de estrutura terciária e/ou quaternária. Habitualmente, a proteína aqui terá um peso molecular de, pelo menos, cerca de 15 a 20 kD, preferencialmente, pelo menos, cerca de 20 kD. Os exemplos de proteínas abrangidos na definição aqui apresentada incluem todas as proteínas de mamífero, em particular, proteínas terapêuticas e diagnósticas, tais como anticorpos terapêuticos e diagnósticos e, em geral, proteínas que contêm uma ou mais ligações dissulfureto, incluindo polipéptidos de múltiplas cadeias compreendendo uma ou mais ligações dissulfureto inter e/ou intracadeia. 0 termo "aminoácido" ou "resíduo de aminoácido" refere-se habitualmente a um aminoácido com a respetiva definição reconhecida na técnica, tal como um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) : cisteína (Cys) : glutamina (Gin) ; ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (pyro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Vai), embora possam ser utilizados aminoácidos modificados, sintéticos ou raros, conforme desejado. Deste modo, os aminoácidos modificados e invulgares indicados em 37 CFR 1.822(b) (4) são incluídos nesta definição e expressamente incorporados aqui por motivos de referencia. Os aminoácidos podem ser subdivididos em vários subgrupos. Deste modo, os aminoácidos podem ser agrupados como tendo uma cadeia lateral não polar (por ex., Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Vai); uma cadeia lateral carregada negativamente (por 7 ΕΡ2207790Β1 ex., Asp, Glu); uma cadeia lateral carregada positivamente (por ex., Arg, His, Lys) ; ou uma cadeia lateral polar não modificada (por ex., Asn, Cys, Gin, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp e Tyr) . Os aminoácidos também podem ser agrupados como aminoácidos pequenos (Gly, Ala), aminoácidos nucleofilicos (Ser, His, Thr, Cys), aminoácidos hidrofóbicos (Vai, Leu, Ile, Met, Pro), aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp, Asp, Glu) , amidas (Asp, Glu) e aminoácidos básicos (Lys, Arg). 0 termo "atividade biológica" ou "atividade biológica de peptona" em relação aos péptidos descritos aqui é utilizado para referir qualquer atividade biológica conhecida da apresentada pelas peptonas, incluindo, sem limitação, a capacidade de estimular o crescimento celular, e/ou a densidade celular, e/ou a viabilidade celular e/ou a eficácia de produção de polipéptidos heterólogos em culturas de hospedeiros recombinantes. 0 termo "cromatografia" refere-se ao processo através do qual um soluto de interesse numa mistura é separado de outros solutos numa mistura como consequência das diferenças nas velocidades em que os solutos individuais da mistura migram através de um meio estacionário sob a influência de uma fase móvel, ou em processos de ligação e eluição. 0 termo "cromatografia de afinidade" e "cromatografia de afinidade de proteína" são utilizados alternadamente aqui e referem-se a uma técnica de separação de proteínas na qual uma proteína de interesse ou anticorpo de interesse é ligado de forma reversível e específica a um ligando bioespecífico. Preferencialmente, o ligando bioespecífico é ligado de forma covalente a um material de fase sólida cromatográfico e é acessível à proteína de interesse na 8 ΕΡ2207790Β1 solução, uma vez que a solução toca no material de fase sólida cromatográfico. A proteína de interesse (por ex., anticorpo, enzima ou proteína de recetor) mantém a respetiva afinidade de ligação específica para o ligando bioespecífico (antigénio, substrato, cofator ou hormona, por exemplo) durante as etapas cromatográficas, enquanto outros solutos e/ou proteínas na mistura não se ligam de forma considerável ou específica ao ligando. A ligação da proteína de interesse ao ligando imobilizado permite que as proteínas ou impurezas de proteínas contaminadas passem pelo meio cromatográfico, enquanto a proteína de interesse permanece especificamente ligada ao ligando imobilizado no material de fase sólida. A proteína de interesse especificamente ligada é depois removida na forma ativa do ligando imobilizado com pH baixo, pH alto, sal elevado, ligando concorrente, e afins, e passa pela coluna cromatográfica com o tampão de eluição, livre das proteínas ou impurezas de proteínas contaminadas que passaram anteriormente pela coluna. Qualquer componente pode ser utilizado como um ligando para purificar a respetiva proteína de ligação específica, por ex. anticorpo.

Os termos "cromatográfia de não-afinidade" e "purificação de não-afinidade" referem-se a um processo de purificação no qual a cromatográfia de afinidade não é utilizada. A cromatográfia de não-afinidade inclui técnicas cromatográficas que dependem de interações não específicas entre uma molécula de interesse (tal como uma proteína, por ex., anticorpo) e uma matriz de fase sólida.

Uma "resina de troca catiónica" refere-se a uma fase sólida que é carregada negativamente e que tem assim catiões livres para troca com catiões numa solução aquosa que ignorou ou passou pela fase sólida. Um ligando carregado negativamente ligado à fase sólida para formar a 9 ΕΡ2207790Β1 resina de troca catiónica pode, por ex., ser um carboxilato ou sulfonato. As resinas de troca catiónica disponíveis comercialmente incluem carboximetilcelulose, sulfopropil (SP) imobilizado em agarose (por ex. SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ ou SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™, de Pharmacia) e sulfonil imobilizado em agarose (por ex. S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de Pharmacia) . Uma "resina de troca iónica de modo misto" refere-se a uma fase sólida que é modificada de forma covalente com partes catiónicas, aniónicas e hidrofóbicas. Uma resina de troca iónica de modo misto disponível comercialmente é BAKERBOND ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) que contém grupos de troca catiónica fraca, uma baixa concentração de grupos de troca aniónica, e ligandos hidrofóbicos ligados a uma matriz de suporte de fase sólida de gel de sílica. 0 termo "resina de troca aniónica" é utilizado aqui para referir uma fase sólida que é carregada positivamente, por ex., contendo um ou mais ligandos carregados positivamente, tais como grupos amino quaternários, ligados aí. As resinas de troca aniónica disponíveis comercialmente incluem DEAE celulose, QAE SEPHADEX™ e FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia). B. Descrição Detalhada

Fracionamento e análise de peptonas A presente invenção baseia-se na identificação de fragmentos de peptona ativos, utilizando uma variedade de técnicas de cromatografia e outras técnicas de separação. 0 fracionamento de peptonas pode ser efetuado através de técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo uma combinação de etapas cromatográficas. Um esquema típico 10 ΕΡ2207790Β1 para o fracionamento e análise da peptona PP3 é ilustrado na Figura 1. A primeira etapa neste esquema é HPLC de fase reversa (RP HPLC), que serve para separar componentes com base no respetivo caráter hidrofóbico. Os compostos ligam-se a colunas HPLC de fase reversa na fase móvel aquosa alta e são eluidos a partir de colunas RP HPLC com a fase móvel orgânica alta. Deste modo, os péptidos podem ser separados utilizando esta técnica, passando gradientes lineares ou não lineares de um solvente orgânico apropriado. A fração de passagem a partir da HPLC de fase reversa pode depois ser submetida a mais etapas de separação cromatográfica, tal como cromatografia de exclusão de tamanho, conforme ilustrado na Figura 1. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) depende da classificação das moléculas de raio hidrodinâmico diferente com base no tempo que estas moléculas passam numa coluna cromatográfica. A divisão ocorre como resultado de as moléculas passarem mais ou menos tempo no volume da fase estacionária que constitui a coluna. As moléculas com um raio hidrodinâmico grande são eluidas primeiro durante a separação; as moléculas com raios menores são eluidas mais tarde. As resinas SEC são bem conhecidas na técnica e estão disponíveis comercialmente numa variedade de fabricantes. Nas experiências descritas no Exemplo abaixo, foi utilizada a coluna de exclusão de tamanho SEPHADEX™ G15 (Amersham Biosciences), mas são igualmente adequadas outras colunas de exclusão de tamanho.

Se desejado, as peptonas podem ser subfracionadas através de cromatografia de modo misto. Nesta técnica, a fase estacionária contém dois domínios de ligação distintos num único ligando cromatográfico. Os princípios de separação geralmente associados são a troca iónica e a cromatografia RP. A aplicação de cromatografia de modo 11 ΕΡ2207790Β1 misto é habitualmente necessária quando a cromatografia de fase reversa (cromatografia RP) não consegue separar os péptidos estruturalmente próximos. Atualmente, diversos fabricantes oferecem comercialmente resinas de modo misto que mostram especificidades diferentes, incluindo a resina Hypercarb (Thermo Scientific), resina HLB Oásis® (Waters Corporation) e a resina SD-2 Dowex Optipore® (Dow Chemical Company). 0 adsorvente Oásis é um copolimero de divinilbenzeno e N-vinilpirrolidona. A composição equilibrada hidrofilica-lipofilica permite uma retenção RP forte e um melhor humedecimento dos poros em relação às resinas RP tradicionais. Por conseguinte, tanto os compostos polares como não polares podem ser adsorvidos. 0 tamanho médio das esferas Oásis é de 30 pm. A composição da resina Optipore é semelhante à da resina Oásis (divinilbenzeno com aminas terciárias) fornecendo-lhe propriedades de RP e um absorvente de troca aniónica fraca. 0 tamanho médio das partículas é de algumas centenas de pm.

Em cada etapa de purificação, as frações obtidas podem ser analisadas relativamente à atividade biológica e/ou submetidas a vários métodos analíticos para determinar a respetiva composição.

Ensaios de Atividade peptidica

As frações de peptona geradas podem ser testadas utilizando bioensaios conhecidos, incluindo um bioensaio baseado em células descrito no Exemplo. Os ensaios da atividade biológica de péptidos derivados de peptonas baseiam-se habitualmente na medição de vários parâmetros de cultura nas culturas de células, incluindo o péptido em questão no meio de cultura. Esses parâmetros incluem, por exemplo, densidade celular, contagem de células viáveis, produtividade de um polipéptido heterólogo (por ex. 12 ΕΡ2207790Β1 anticorpo) produzido, etc. Esses ensaios são divulgados, por exemplo, em Franek et al., Biotechnol. Prog. 16:688 a 692 (2000); Franek et al., Biotechnol. Prog. 18:155 a 158 (2002) ; Franek et al. , Biotechnol. Prog. 19:169 a 174 (2003) ; Franek et al., Biotechnol. Prog. 21:96 a 08 (2005).

Determinação da Composição de Frações de Peptona

Deste modo, as composições de peptonas e frações de peptona podem ser analisadas através de espetrometria de massa (MS), RMN, ICPMS, análise de aminoácidos e várias combinações destas e outras técnicas bem conhecidas na técnica.

Os espetrómetros de massa consistem numa fonte iónica, num analisador de massa, num detetor iónico e numa unidade de aquisição de dados. Primeiro, os péptidos são ionizados na fonte iónica. Depois, os péptidos ionizados são separados de acordo com a respetiva relação massa-carga no analisador de massa e os iões separados são detetados. A espetrometria de massa foi muito utilizada na análise de proteínas, especialmente desde a invenção dos métodos de ionização e dessorção a laser assistida por matriz/tempo de voo (MALDI-TOF) e ionização por eletropulverização (electrospray) (ESI). Existem diversas versões de analisador de massa, incluindo, por exemplo, MALDI-TOF e triplo ou quadripolo TOF, ou analisador de massa de armadilha de iões associado a ESI. Deste modo, por exemplo, um espetrómetro de massa Q-Tof-2 utiliza um analisador de tempo de voo ortogonal que permite a deteção simultânea de iões por toda a extensão do espetro de massa. Para obter mais detalhes, consulte, por ex., Chemusevich et al., J. Mass Spectrom. 36:849 a 865 (2001).

Se desejado, as sequências de aminoácidos dos 13 ΕΡ2207790Β1 fragmentos de péptidos e eventualmente as proteínas das quais derivam podem ser determinadas através de técnicas conhecidas na técnica, tais como determinadas variações da espetrometria de massa ou degradação de Edman.

Embora a presente invenção seja ilustrada através de fragmentos de péptidos identificados nos produtos de degradação de uma determinada peptona, parte-se do princípio de que outras peptonas terão componentes de péptidos com características estruturais e funcionais semelhantes.

Bibliotecas de péptidos combinatórias

As bibliotecas de péptidos combinatórias são bem conhecidas na técnica, e os métodos para a geração e verificação dessas bibliotecas são descritos em manuais recomendados, tais como, por exemplo, em Combinatorial Peptide Library Protocols (Methods in Molecular Biology), Shmuel Cabilly, ed., Humana Press Inc. 1998. Uma biblioteca de péptidos é igualmente descrita em Sloostra et al., Molecular Diversity, 1995, 1:87 a 96.

As bibliotecas de péptidos combinatórias podem ter formatos diferentes. Por exemplo, as chamadas bibliotecas "one bead one compound" (uma esfera-um composto) contêm milhares de esferas, cada uma com múltiplas cópias de um único composto de biblioteca (Lam et al., Nature, 354, 82 a 84 (1991)). A biblioteca é examinada relativamente a uma atividade desejada e todas as esferas ativas são isoladas. 0 composto ativo ligado às esferas identificadas é depois caracterizado através de métodos convencionais, tais como, por exemplo, degradação de Edman. Em alternativa, é possível utilizar uma abordagem simplista. Noutro método, a metodologia de fixação posicionai de Houghten (Bioorg. Med. 14 ΕΡ2207790Β1

Chem. Lett., 14, 1947 a 1951 (2004)), é gerado um conjunto de bibliotecas relacionadas antes da verificação. Cada biblioteca contém compostos com um residuo especifico fixo como um único bloco de construção e os restantes resíduos completamente selecionados de forma aleatória. As bibliotecas diferentes têm um bloco de construção diferente na posição fixa. A verificação deste conjunto de bibliotecas, relativamente a uma atividade desejada, permite a identificação direta do bloco de construção ótimo no resíduo fixo. Este processo pode ser realizado sequencialmente, otimizando um resíduo de cada vez ou, em alternativa, todos os conjuntos de bibliotecas podem ser examinados simultaneamente para permitir que o composto de biblioteca ótimo seja identificado diretamente a partir de uma única ronda de verificação.

Através da utilização dos péptidos especificamente divulgados aqui, as bibliotecas de péptidos combinatórias podem ser utilizadas para identificar péptidos adicionais com características químicas e/ou biológicas melhoradas. Síntese de péptidos

Os péptidos identificados conforme descrito aqui podem ser sintetizados através de métodos convencionais de síntese de péptidos, tais como, por exemplo, métodos de síntese de fase sólida, que podem ser efetuados de várias formas, tais como, por exemplo, utilizando grupos de proteção Fmoc (9H-fluoren-9-il-metoxi-carbonilo) ou Boc (tert-butoxicarbonilo) para proteger os N-terminais de monómeros de aminoácido utilizados na síntese. Os sintetizadores automatizados estão disponíveis comercialmente para ambas as técnicas, mas a síntese de péptidos de fase sólida também pode ser efetuada manualmente. Para obter mais detalhes, consulte, por 15 ΕΡ2207790Β1 exemplo, Atherton, E., Sheppard, R.C. (1989). Solid Phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford,

Inglaterra: IRL Press. ISBN 0199630674; e Steward, J.M., Young, J.D. (1984). Solid phase peptide synthesis, 2a edição, Rockford: Pierce Chemical Company, 91. ISBN 0935940030.

Utilizações dos di- e tripéptidos

Os di- e tripéptidos descritos agui podem ser utilizados como componentes de meios de crescimento utilizados para a produção de polipéptidos recombinantes, incluindo anticorpos.

Os polipéptidos recombinantes, tais como os anticorpos, podem ser produzidos numa variedade de organismos hospedeiros eucarióticos e procarióticos.

As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptido glicosilado, tais como anticorpos, podem derivar de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas diversas variantes e estirpes de baculovirus e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros, tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori. Diversas estirpes de virus para a transfeção estão disponíveis publicamente, por ex. a variante L-l de Autographa californica NPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser utilizados como o vírus aqui divulgado, particularmente para a transfeção de células Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais de algodão, cereais, batatas, rebentos de soja, petúnias, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como 16 ΕΡ2207790Β1 hospedeiros .

Contudo, o interesse foi maior nas células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrados na cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento habitual. Os exemplos de linhas de células hospedeiras de mamíferos úteis são linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (293 ou 293 células subclonadas para o crescimento na cultura de suspensão, Graham et ai., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebé (BHK, ATCC CCL 10); DHFR/células de ovário de hamster chinês (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243 a 251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL, 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células humanas de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL 2); células de rim caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) : células humanas de pulmão (W138, ATCC CCL 75) ; células humanas de fígado (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44 a 68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Ilep G2).

Por exemplo, os polipéptidos recombinantes, tais como os anticorpos, podem ser produzidos em células dpl2.CHO, cuja produção a partir de células CH0-K1 DUX-B11 é descrita no documento EP307247. As células CHO-K1 DUX-B11 foram, por sua vez, obtidas a partir de células CHO-K1 (ATCC N.° CCL61 CHO-K1), seguindo os métodos descritos em Simonsen. C. C., e Levinson, A. D., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 80:2495 a 2499 e Urlaub G., e Chasin, L. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei E.U.A. 77: 4216 a 4220. Além disso, são conhecidas outras linhas celulares CHO-K1 (dhfr-) e podem 17 ΕΡ2207790Β1 ser utilizadas.

As células hospedeiras de mamíferos utilizadas para produzir péptidos, polipéptidos e proteínas podem ser cultivadas numa variedade de meios. Os meios disponíveis comercialmente, tais como Ham's FIO (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPM1-1640 (Sigma) e Meio de Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma), são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, quaisquer meios descritos em Ham e Wallace (1979), Meth. in Enz. 58:44, Barnes e Sato (1980), Anal. Biochem. 102:255, Patente U.S. n.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; ou 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00195; Patente U.S. n.° Re. 30.985; ou Patente U.S. n.° 5.122.469, podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Todos estes meios podem ser completados conforme necessário com hormonas e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleósidos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como o fármaco Gentamycin™), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes nas concentrações finais na gama micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos nas concentrações apropriadas que serão conhecidas dos peritos na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e afins, são as anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para o perito na técnica.

Os péptidos descritos aqui podem ser utilizados, individualmente ou em várias combinações, como componentes de qualquer meio de cultura disponível comercialmente ou 18 ΕΡ2207790Β1 personalizado .

Neste caso, a utilização dos péptidos não é limitada à cultura de células hospedeiras de mamíferos ou, em geral, eucarióticas. Os péptidos descritos aqui também são úteis nas culturas de células de organismos hospedeiros procarióticos. As células hospedeiras procarióticas exemplares incluem, sem limitação, eubactéria, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaecae, tal como Escherichia, por ex., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ex., Salmonela typhimurium, Serratia, por ex., Serratia marcescens e Shigella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (por ex., B. licheniformis 41P divulgada em DD 266,710 publicada a 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31,446), embora outras estirpes, tais como E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31,537) e E. coli W3110 (ATCC 27,325), sejam adequadas.

Outros detalhes da presente invenção são fornecidos no Exemplo seguinte.

Exemplo

Identificação molecular de tripéptidos que contêm arginina Ç-terminal biologicamente ativos utilizando uma biblioteca combinatória

Materiais e Métodos

Bioensaio TubeSpin O bioensaio TubeSpin foi concebido para examinar os 19 ΕΡ2207790Β1 efeitos de um aditivo de meio de cultura de células na proliferação e produtividade celular (conforme determinado pela densidade de células viáveis e concentração de anticorpo produzido, respetivamente) num volume de trabalho de 5 mililitros (mL) utilizando uma densidade de células viáveis inicial de 1,5 x 10Λ6 células/mL.

Cada cultura foi preparada num volume de 7,15 mL dos quais 5 mL foram transferidos para o tubo de ensaio. 0 tubo de ensaio é um tubo de centrifugação de 50 mL com uma tampa especializada que contém uma membrana com um tamanho de poro de 0,2 micrones para facilitar o fluxo de gases. Os 2,15 mL restantes foram utilizados para medir a densidade de células viáveis (para confirmar que a densidade-alvo foi alcançada e que as células são viáveis), a osmolalidade e os dados metabólicos (pH, glutamina, glutamato, glicose, lactato, amónio, sódio, potássio).

Dependendo da concentração e osmolalidade iniciais do aditivo de meio desejado, foi determinada uma concentração-alvo para esse aditivo. A partir destes dados, são calculados o volume do aditivo necessário, o volume de cloreto de sódio necessário para alcançar a osmolalidade fisiológica na cultura final, e o volume de água necessário para alcançar 7,15 mL. Ao utilizar estes valores, foi obtida uma solução preparatória de aditivo de meio, cloreto de sódio e água.

As células no meio essencial Genentech (GEM Genentech Essential Médium) seletivo foram depois trocadas para um meio de qualidade de produção designado por GEM2. Em seguida, as células no GEM2 foram adicionadas a cada tubo preparatório para alcançar as especificadas 1,5 x 10Λ6 células/mL em 7,15 mL. Cada tubo de ensaio recebeu depois 5 mL e foi incubado a 37 graus centígrados durante 4,75 dias. 20 ΕΡ2207790Β1

No final do período de incubação, a densidade de células viáveis, a osmolalidade e o perfil metabólico foram medidos mais uma vez, e uma amostra da cultura de ensaio foi enviada para um ensaio de quantificação de anticorpo separado, de modo a determinar a respetiva concentração.

Cromatografia preparatória de fase reversa C18

Uma solução aquosa de 20% (p/v) de PP3 foi preparada e foi utilizada imediatamente. Uma coluna de aço inoxidável de 5 x 5 cm foi embalada com sílica C18 preparativa Waters (tamanho de poro de 125Â; tamanho de partícula de 55 a 105 mícrones). A coluna foi previamente equilibrada com 10 volumes de 0,02% (p/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em

água (Tampão A) e foi acionada numa taxa de fluxo de 60 ml/min. 200 mL da solução PP3 acima foram carregados para a coluna. O controlo de solvente e a monitorização de efluente da coluna foram alcançados utilizando um sistema de cromatografia Akta controlado pelo software Unicom (GE Healthcare). A seguir ao carregamento, a coluna foi lavada com o tampão A até a absorvância do efluente em 280 nm atingir a base de referência. A coluna foi depois lavada com 85% (v/v) de acetonitrilo (ACN) contendo 0,02% de TFA para eluir material ligado. As frações foram analisadas relativamente à atividade biológica utilizando o bioensaio.

Cromatografia preparativa Sephadex G15 O material de passagem a partir de C18 foi concentrado pela evaporação rotativa e foi ainda fracionado numa coluna Sephadex G-15 (7 cm de diâmetro x 50 cm 1.). A coluna foi equilibrada com água desionizada antes do carregamento e todo o pool de passagem C18 foi carregado. As frações foram recolhidas e analisadas relativamente à atividade utilizando o bioensaio descrito acima. 21 ΕΡ2207790Β1

Cromatografia analítica Hypercarb

As amostras de frações ativas foram analisadas utilizando uma coluna Hypercarb (grafite) (tamanho de partícula de 5 mícrones; dimensões de coluna: 0,1 mm x 50 mm). Os tampões utilizados foram Tampão A: 0,02% de TFA aquoso; e Tampão B: 85% de ACN + 0,02% de TFA. Vários volumes (0 a 10 microlitros) foram carregados para a coluna que foi previamente equilibrada com o Tampão A e eluídos com um gradiente linear passando para 50% do Tampão B durante 25 minutos. A coluna foi acionada numa taxa de fluxo de 0,1 ml/min. O controlo de solvente foi alcançado com um HPLC Agilent 1100 equipado com detetor de díodos e um espetrómetro de massa quadripolo único MSD. Todo o sistema estava sob o controlo do software Agilent

Chemstation.

Espetrometria de massa A espetrometria de massa de alta resolução foi efetuada utilizando um Q-TOF (Waters Corporation) ou um espetrómetro de massa Orbitrap (Thermofinnigan). Os instrumentos foram acionados no modo de pulverização estática e foi detetada uma precisão de massa <5 ppm em ambos os casos. Os espetros foram utilizados para obter informações de massa precisa que foram utilizadas para a correlação com informações de biblioteca de péptidos.

Bi oinformática

As bibliotecas in silico de dipéptidos e tripéptidos foram criadas com as precisões de massa necessárias para correlacionar com massas determinadas conforme descrito acima. 22 ΕΡ2207790Β1 Síntese de péptidos

Uma biblioteca de tripéptidos foi criada utilizando a síntese de péptidos em fase sólida Fmoc. A biblioteca foi concebida para conter todos os tripéptidos possíveis que terminam em arginina (R), ou seja XXR.

Resultados

Fracionamento de PP3 0 esquema para o fracionamento e análise de PP3 é ilustrado de forma esquemática na Figura 1. HPLC de fase reversa C18 0 fracionamento inicial de PP3 foi realizado utilizando HPLC de fase reversa. 0 cromatograma ilustrado na Figura 2 é representativo do perfil de cromatografia de fase reversa de PP3. A maior parte da massa (-70% do peso seco inicial) circula pela coluna como a maior parte da atividade biológica. A fração de passagem de C18 foi concentrada e carregada para Sephadex G-15 para a cromatografia de exclusão de tamanho, cujos resultados são ilustrados na Figura 3.

As frações da coluna G15 foram analisadas relativamente à bioatividade. A atividade específica do material purificado com G15 (frações F3-F7) aumentou significativamente em comparação com a de PP3 relativamente à respetiva capacidade de aumentar a titulação de proteínas recombinantes (Figura 4A) e a contagem de células viáveis (VCC; Figura 4B). 23 ΕΡ2207790Β1

Espetrometria de massa no pool de frações G15

As frações ativas foram analisadas utilizando a espetrometria de massa, de modo a obter informações sobre a natureza molecular dos componentes ativos. A Figura 5 ilustra um espetro de massa representativo de uma amostra de pool G15 obtida conforme descrito acima. 0 espetro contém diversos picos com massas <500 Da. Uma caracteristica surpreendente dos espetros foi o facto de estes conterem muitos picos que diferem na massa em 14 unidades de massa numa forma de repetição. Igualmente, foi identificado um pico em 175,1 m/z (Figura 5) como arginina através da massa exata e subsequente análise de composição elementar. Além disso, a análise de três das massas (403,2, 389,2 e 375,2 m/z; assinaladas pela caixa) do espetro ilustrado na Figura 5 utilizando dissociação induzida por colisão (CID) revelou padrões de fragmentação semelhantes na gama de massa <200 Da. Isto incluiu a identificação de um resíduo de arginina intacto em 175,1 m/z de cada uma das três massas. Além disso, com base nas medições de massa exata, estas moléculas foram identificadas como péptidos com as seguintes identidades possíveis: 403,2 Da: EVR; DIR; DLR 389,2 Da: LTR; ITR 375,2 Da: SIR; SLR; TVR A ordem dos primeiros 2 aminoácidos nas sequências acima também pode ser invertida. Existem diversas possibilidades em cada massa por causa da sobreposição nas combinações de aminoácidos individuais. 24 ΕΡ2207790Β1

Criação de uma biblioteca in silico de tripéptidos que contêm arginina A estrutura de repetição de 14 unidades de massa nos espetros de massa das frações de peptona e a presença de arginina C-terminal num grupo destas moléculas sugeriram a presença de uma "biblioteca combinatória" criada enzimaticamente de péptidos em PP3 provenientes dos tecidos animais. Para investigar mais esta ideia, foi tomada a decisão de criar uma biblioteca in silico de tripéptidos que contêm arginina C-terminal. A biblioteca contém 400 péptidos possíveis e a composição e distribuição de massa correspondentes são representadas no gráfico ilustrado na Figura 6. Na realidade, a distribuição assemelha-se às diferenças de 14 unidades de massa observadas nas frações de peptona com picos de repetição em intervalos de 14 Da.

Construção e análise de uma biblioteca de péptidos combinatória XXR real

Para explorar mais a ideia de que os péptidos que contêm arginina C-terminal podem ser responsáveis por alguma da atividade observada nas frações PP3, foi criada uma biblioteca combinatória destas moléculas utilizando a síntese de péptidos em fase sólida (Fmoc). A biblioteca que contém péptidos liofilizados foi dissolvida em água desionizada e o pH da solução foi ajustado para ~ 7,0 com NaOH. A solução foi depois dessalgada utilizando uma coluna G-15. Uma fração da biblioteca foi recolhida, concentrada por evaporação rotativa e analisada através de espetrometria de massa e bioensaio. A análise espetral da massa revelou a presença de di- e tripéptidos. Partiu-se do princípio de que os dipéptidos encontrados na mistura eram provenientes de uma determinada proporção de reações de síntese de péptidos que falharam. 25 ΕΡ2207790Β1 A espetrometria de massa revelou a presença de vários picos, que foram comparados com a biblioteca in silico referida acima. A Tabela 1 indica as massas, identidades e intensidades relativas dos péptidos encontrados nesta fração. As tarefas baseiam-se nas medições de massa precisa com erros <5 ppm. A lista representa uma lista parcial de todos os péptidos presentes nesta fração.

Bioensaio de fração XXR G-15

Os péptidos XXR preparados conforme referido acima foram analisados relativamente à atividade no bioensaio e demonstraram ter efeitos positivos significativos tanto no crescimento como na titulação celular.

Sumário

Os resultados apresentados neste exemplo mostram que PP3 contém moléculas ativas com massas moleculares <500 Da. Algumas destas moléculas foram identificadas como tripéptidos que contêm arginina C-terminal. Uma biblioteca combinatória destes péptidos mostrou atividade biológica num bioensaio de 6 dias. Foi concluído que os tripéptidos que contêm arginina C-terminal são responsáveis, pelo menos em parte, pelas atividades de estímulo do crescimento e da titulação de PP3. TABELA 1 _Identificações de péptidos a partir de XXR_ Péptidos XXR identificados a partir da fração bioativa G15_ O Tarefa Teor m/z Erro (abs) Erro (ppm) Intensidade rei. 1 DIR 403,2305 0,000408 1,011915 52 2 DLR 403,2305 0,000408 1,011915 52 3 EVR 403,2325 0,000408 1,011915 52 4 IR 288,2036 0,000365 1,266195 45 5 LR 288,2036 0,000365 1,266195 45 26 ΕΡ2207790Β1

Identificações de péptidos a partir de XXR Péptidos XXR identificados a partir da fração bioativa G15 N. ° Tarefa Teor m/z Erro (abs) Erro (ppm) Intensidade rei. 6 DPR 387,1992 0,000308 0,795164 38 7 PR 272,1723 0,000365 1,340232 38 8 DR 290,1464 0,000344 1,185539 19 9 TVR 375,2356 0,000293 0,781895 27 10 EIR 417,2462 0,000458 1,097935 27 11 ELR 417,2462 0,000458 1,097935 27 12 VR 274,1879 0,000415 1,513006 25 13 SR 262,1515 0,000429 1,637755 25 14 AR 246,1566 0,000415 1,6847 24 15 ER 304,1621 0,000294 0,966767 23 16 INR 402,2465 0,000392 0,975621 23 17 LNR 402,2465 0,000392 0,975621 23 18 QVR 402,2465 0,000392 0,975621 23 19 AVR 345,225 0,000229 0,662411 22 20 GIR 345,225 0,000229 0,662411 22 21 GLR 345,225 0,000229 0,662411 22 22 MR 306,16 0,000387 1,262895 7 23 IVR 387,272 0,000379 0,97839 20 24 LVR 387,272 0,000379 0,97839 20 25 ITR 389,2512 0,000343 0,882384 19 26 LTR 389,2512 0,000343 0,882384 19 26 DTR 391,1941 0,000323 0,824468 17 28 ESR 391,1941 0,000323 0,824468 17 29 GGR 289,1624 0,000328 1,1356642 17 30 NR 289,1624 0,000328 1,135642 1 31 DVR 389,2149 0,000358 0,9197 17 32 I IR 401,2876 0,000429 1,069001 17 33 ILR 401,2876 0,000429 1,069001 17 34 LLR 401,2876 0,000429 1,069001 17 35 AIR 359,2407 0,000279 0,775956 16 36 ALR 359,2407 0,000279 0,775956 16 37 ADR 361,1836 0,000258 0,7138 16 27 ΕΡ2207790Β1

Identificações de péptidos a partir de XXR Péptidos XXR identificados a partir da fração bioativa G15 N. ° Tarefa Teor m/z Erro (abs) Erro (ppm) Intensidade rei. 38 EGR 361,1836 0,000258 0,7138 16 39 AGR 303,1781 0,000278 0,918467 16 40 QR 303,1781 0,000278 0,918467 15 41 GR 232,141 0,000465 2,001482 15 42 DQR 418,205 0,000422 1,008051 14 43 ENR 418,205 0,000422 1,008051 14 44 DMR 421,1869 0,00043 1,020357 13 45 EMR 435,2026 0,00048 1,102556 11 46 ASR 333,1886 0,000243 0,729836 11 47 GTR 333,1886 0,000243 0,729836 11 48 FPR 419,2407 -0,003021 -7,206469 11 49 IMR 419,2441 0,000351 0,836513 11 50 LMR 419,2441 0,000351 0,836513 11 51 IPR 385,2563 0,000329 0,853533 10 52 LPR 385,2563 0,000329 0,853533 10

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora tenha sido tomado muito cuidado na compilação das referências, não se poderão excluir erros e omissões e o IEP nao assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição • US 20040138428 AI [0004] • EP 0810283 A2 [0004] • EP 307247 A [0041] • US 4767704 A [0042] • US 4657866 A [0042] • US 4927762 A [0042] • US 4560655 A [0042] 28 ΕΡ2207790Β1 • WO 9003430 A [0042] • WO 8700195 A [0042] • US RE30985 E [0042] • US 5122469 A [0042] • DD 266710 [0044]

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Lisboa, 28 de Outubro de 2013 30

Claims (9)

1. ΕΡ2207790Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um péptido da fórmula (XI)nX2R em que XI e X2 podem ser idênticos ou diferentes e representam independentemente qualquer aminoácido que não seja arginina; n corresponde a 0 ou 1; e R representa arginina, caracterizada por o referido péptido apresentar uma atividade biológica de peptona para estimular o crescimento celular, e/ou a densidade celular, e/ou a viabilidade celular e/ou a eficácia de produção de polipéptidos heterólogos em culturas de hospedeiros recombinantes.
2. 2. A utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido péptido ser obtido através de fracionamento de uma peptona ou ser quimicamente sintetizado.
3. 3. A utilização de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por a referida peptona que é fracionada ser uma peptona PP3 (componente 3 de proteose peptona).
4. 4. A utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido péptido ser selecionado a partir dos péptidos DIR, DLR, EVR, DPR, TVR, EIR, ELR, INR, LNR, QVR, AVR, GIR, GLR, IVR, LVR, ITR, LTR, DTR, ESR, GGR, DVR, IIR, ILR, LLR, AIR, ALR, ADR, EGR, AGR, DQR, ENR, DMR, EMR, ASR, GTR, IMR, FPR, LMR, IPR, LPR, IR, LR, PR, DR, VR, 1 1, ΕΡ2207790Β1 SR, AR, ER, MR, NR, QR e GR.
5. 5. A utilização caracterizada por o de acordo com a reivindicação referido péptido ser um tripéptido.
6. 6. A utilização de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o referido tripéptido ser selecionado a partir dos tripéptidos DIR, DLR, EVR, DPR, TVR, EIR, ELR, INR, LNR, QVR, AVR, GIR, GLR, IVR, LVR, ITR, LTR, DTR, ESR, GGR, DVR, I IR, ILR, LLR, AIR, ALR, ADR, EGR, AGR, DQR, ENR, DMR, EMR, ASR, GTR, IMR, FPR, LMR, IPR e LPR *
7. 7. A utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido péptido ser um dipéptido.
8. 8. A utilização de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o referido dipéptido ser selecionado a partir dos dipéptidos IR, LR, PR, DR, VR, SR, AR, ER, MR, NR, QR e GR.
9. 9. Uma biblioteca de péptidos combinatória que consiste em péptidos da fórmula (XI)nX2R em que XI e X2 podem ser idênticos ou diferentes e representam independentemente qualquer aminoácido que não seja arqinina; n corresponde a 0 ou 1; e R representa arginina, caracterizada por, pelo menos, alguns dos referidos péptidos apresentarem uma atividade biológica de peptona para estimular o crescimento celular, e/ou a densidade 2 ΕΡ2207790Β1 celular, e/ou a viabilidade celular e/ou a eficácia de produção de polipéptidos heterólogos em culturas de hospedeiros recombinantes. Lisboa, 28 de Outubro de 2013 3