CN104844690A - 有生物学活性的、含c-端精氨酸的肽 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及有生物学活性的、含C-端精氨酸的肽。本发明关注来自蛋白胨的活性肽片段的分离、鉴定和表征。

Description

有生物学活性的、含C-端精氨酸的肽
本申请是申请日为2008年09月05日、中国申请号为200880114757.6、发明名称为“有生物学活性的、含C-端精氨酸的肽”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明关注来自蛋白胨的活性肽片段的分离、鉴定和表征。
发明背景
常常将动物和植物组织的水解产物添加至原核和真核细胞的培养基以提高存活细胞数目和重组蛋白质产物滴度。如此，在细胞培养基配方中已经广泛采用了来自多种多样来源的蛋白胨来增强细胞培养物生长、寿命和生产率。然而，由于它们不明确的性质，它们作为用于治疗性蛋白质生产的培养基添加剂的存在呈现了数项挑战。
动物衍生成分作为用于由哺乳动物细胞生产治疗性蛋白质的培养基添加剂的使用会引起病毒、支原体和朊病毒污染(Kallel等,J.Biotechnol.95:195-204(2002))。避免在细胞培养基使用动物衍生成分的努力得到了欧洲和美国管理当局的支持(Castle和Roberston,Dev.Biol.Stand.99:191-196(1999))。在过去的几十年里已经自培养基中成功消除了动物血清，而且大多数当前使用的培养基被证实是不含蛋白质的(Froud,Dev.Biol.Stand.99:157-166(1999))。然而，转换成不含蛋白质的培养基常常导致细胞生长和生产力的损失(Lee等,J.Biotechnol.69:85-93(1999))。
结果是，常常在细胞培养基中使用蛋白质水解产物(也叫作蛋白胨(peptone))作为营养添加剂，因为它们中的一些可以认为是不含蛋白质的(Burteau等,In Vitro Cell.Dev.Biol.-Anim.39(7):291-296(2003))。用于细胞培养的蛋白胨通常通过各种各样的基于生物学的起始材料(动物组织、奶衍生产品、微生物或植物)的酶促消化来制造。
蛋白胨的总体效果是增强细胞生长和提高生产率(productivity)，且产品品质与标准培养基相比相同(Jan等,Cytotechnology 16:17-26(1994)；Heidemann等,Cytotechnology 32:157-167(2000)；Sung等,Appl.Microbiol.Biotechnol.63:527-536(2004))。数份论文显示了蛋白胨含有诸如游离氨基酸、寡肽、铁盐、脂质和痕量元素等物质(Franek等,Biotechnol.Prog.16:688-692(2000)；Martone等,Bioresour.Technol.96:383-387(2005))。一项研究调查了蛋白胨的潜在作用，并显示了它们会具有营养效果(Heidemann等,Cytotechnology 32:157-167(2000))。同样，Schlaeger,J.Immunol.Meth.194:191-199(1996)证明了一种特定的蛋白质水解产物展示出抗凋亡特性。
尽管对蛋白胨在细胞培养中的效果进行了众多调查，它们的作用机制仍然未知。而且即使已经显示了蛋白胨在细胞培养过程中是有益的，然而它们的使用也具有许多缺点。首先，由于有些蛋白胨是动物衍生的，因此产生以使用血清相似的问题。另外，来自其它来源的蛋白胨也可能是外来因子(adventitious agent)的潜在来源。其次，蛋白胨中的“活性”成分及其作用机制的不确定性使之难以测量细胞培养制备过程中所使用的蛋白胨批次的品质(如果不是不可能的话)。最后，因为蛋白胨制备的来源材料和工艺不是标准化的或普遍可互换的，所以蛋白胨自身本性是单一来源的原材料。因此，有机会更好地表征蛋白胨以减少或消除这些缺点。
因此，了解蛋白胨中活性成分的组成和特性以创建已很好确定可再生产浓度的、包含详细说明活性成分的“确定成分培养基”会是有利的。另外，通过打开控制细胞生长和死亡及更好地控制重组蛋白质表达的窗口，活性蛋白胨成分的鉴定预期导致更好地了解重组宿主细胞和细胞系的生理学状况。
因此，本文付出了努力来表征蛋白胨组成和了解它们对细胞培养的效果的机制。
本发明基于将动物衍生的蛋白胨(PP3)分级成可鉴定的成分，并且通过应用现代分析技术(包括高分辨率质谱术)来研究这些化合物的性质。本发明至少部分基于以精氨酸为末端的二肽和三肽在PP3的促进生长和提高滴度的活性中发挥作用的认识。
发明概述
一方面，本发明关注式(X1)nX2R的肽，
其中X1和X2可以相同或不同，且独立代表精氨酸以外的任何氨基酸；
n为0或1；且
R代表精氨酸，
其中所述肽展现出蛋白胨生物学活性。
在一个实施方案中，所述肽是通过对蛋白胨(诸如PP3蛋白胨)分级获得的。
在另一个实施方案中，所述肽选自表1中所列出的肽。
在另一个实施方案中，所述肽是三肽。
在又一个实施方案中，所述肽是三肽，选自表1中所列出的肽。
蛋白胨生物学活性可以例如选自下组：促进细胞生长；提高细胞密度；提高存活细胞计数；和提高重组宿主细胞培养物中的生产产率。
另一方面，本发明关注一种组合物，其包含如上文所定义的二肽或三肽。
在一个实施方案中，所述组合物是细胞培养基。
又一方面，本发明关注一种细胞培养物，其包含如上文所定义的肽。
在一个实施方案中，所述细胞培养物是重组宿主细胞的培养物，其中所述重组宿主细胞可以是任何真核或原核宿主，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和大肠杆菌细胞。
由所述宿主细胞生成的所述异源蛋白质可以是例如抗体(包括抗体片段)或任何治疗性蛋白质。
还有一方面，本发明关注两种或更多种如上文所定义的肽的混合物。
在一个不同的方面，本发明关注一种组合肽文库，其包含(X1)nX2R的肽、基本上由(X1)nX2R的肽组成、或由(X1)nX2R的肽组成，
其中X1和X2可以相同或不同，且独立代表精氨酸以外的任何氨基酸；
n为0或1；且
R代表精氨酸，
其中至少一些所述肽展现出蛋白胨生物学活性。
还有一方面，本发明关注一种用于重组生产异源蛋白质的方法，包括在适合于所述异源蛋白质表达的条件下在培养基中培养含有编码所述蛋白质的核酸的重组宿主细胞，其中所述培养基包含至少一种权利要求1的肽。
由于下面的描述(包括实施例)，本发明的这些和其它方面会变得显而易见。
附图简述
图1是如实施例中所描述的PP3分级和分析的示意图。
图2显示了C18反相层析的结果。
图3显示了C18流出(未结合)级分的层析结果。“相对比活性”定义为相等重量的级分的活性除以PP3的。
图4A和4B显示了G15纯化的材料(级分F3-F7)的比活性相对于PP3的比活性显著升高，就其提高重组蛋白质滴度(图4A)和存活细胞计数(VCC；图4B)的能力而言。
图5。G-15级分的质谱分析。顶图：级分的MS扫描。底图：m/z 403.2、389.2和375.2的ms/ms分析。
图6。一个以R为末端的计算机(in silico)三肽文库中肽的频率分布。X轴：三肽的质量；Y轴：位于每种质量的频率。
图7A和7B。PP3和XXR肽对VCC和产物滴度的影响。图7A：在生物测定法中响应添加浓度渐增的PP3(黑线)或XXR肽(红线)而测量到的VCC。图7B：在生物测定法中响应添加浓度渐增的PP3(黑线)或XXR肽(红线)而测量到的产物滴度。
图8。牛月示蛋白胨(proteose peptone)-3(PP3)多肽的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)。
发明详述
A.定义
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。Singleton等,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY1994)为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导。
术语“蛋白胨”在本文中以最广义使用，而且包括通过部分水解蛋白质获得的水溶性蛋白质衍生物及其混合物，包括但不限于自猪、牛、和其它动物的粘膜组织衍生的，通过用蛋白水解酶水解生成的水解产物混合物，以及来自各种植物组织的水解产物。该术语明确包括但不限于月示蛋白胨(proteosepeptone)-3(PP3)，也称作lactophorin，它是在牛乳中找到的153个残基的次要磷糖蛋白(Sorensen和Sorensen,J.Dairy Res.60:535-542(1993))(SwissProt数据库编号：P80195；GenBank编号：CAA58309)，及在其它物种的乳中表征的同源蛋白质，像骆驼(Beg等,FEBS Lett.216:270-274(1987))、美洲驼(Cantisani等,J.Biochem.Biophys.Methods 21:227-236(1990))、绵羊、和山羊(Sorensen等,J.Dairy Sci.80:3176-3181(1997)及Lister等,J.Dairy Res.81:2111-2115(1998))。到目前为止，在人乳中没有找到PP3。PP3可以自商业来源获得，诸如例如Difco Laboratories(Detroit,Michigan)。
术语“肽”在本文中用于指含有两个或更多个氨基酸的化合物，其中一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基通过酰胺或“肽”键相连接。该定义明确包括由至少两个氨基酸残基形成的肽，特别是二肽和三肽。
“蛋白质”意指链长度足以生成更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。典型的是，本文中的蛋白质会具有至少约15-20kD、优选至少约20kD的分子量。本文中定义内所涵盖的蛋白质的例子包括所有哺乳动物蛋白质，特别是治疗性和诊断性蛋白质，诸如治疗性和诊断性抗体，及一般而言含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常指具有其本领域公认定义的氨基酸，诸如选自下组的氨基酸：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)，但是可以根据需要使用经修饰的、合成的或罕见的氨基酸。如此，37CFR 1.822(b)(4)中列出的经修饰的和不常见的氨基酸包括在此定义内，且通过述及明确收入本文。氨基酸可分成各式各样的亚组。如此，氨基酸可以分组成具有非极性侧链(例如Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷的侧链(例如Asp、Glu)；带正电荷的侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电荷的极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、和Tyr)。氨基酸也可分组成小氨基酸(Gly、Ala)、亲核氨基酸(Ser、His、Thr、Cys)、疏水氨基酸(Val、Leu、Ile、Met、Pro)、芳香族氨基酸(Phe、Tyr、Trp、Asp、Glu)、酰胺(Asp、Glu)、和碱性氨基酸(Lys、Arg)。
涉及本发明肽的术语“生物学活性”或“蛋白胨生物学活性”用于指已知由蛋白胨展现的任何生物学活性，包括但不限于促进细胞生长和/或提高细胞密度和/或提高细胞存活力、和/或提高异源多肽在重组宿主培养物中的生产效率。
术语“层析”指根据混合物中的各种溶质在流动相的影响下或在结合和洗脱过程中穿过静止的介质迁移的速率的差异，将混合物中的感兴趣溶质与混合物中的其它溶质分开的过程。
术语“亲和层析”和“蛋白质层析”在本文中可互换使用，指其中感兴趣蛋白质或感兴趣抗体可逆地且特异性地结合至生物特异性配体的蛋白质分离技术。优选的是，所述生物特异性配体共价附着至层析固相材料且在溶液接触层析固相材料时是溶液中的感兴趣蛋白质可及的。在层析步骤期间，所述感兴趣蛋白质(例如抗体、酶、或受体蛋白质)保留其对生物特异性配体(例如抗原、底物、辅因子、或激素)的特异性结合亲和力，而混合物中的其它溶质和/或蛋白质没有可观察地或特异性地结合配体。感兴趣蛋白质对固定化配体的结合容许污染性蛋白质或蛋白质杂质流过层析介质而感兴趣蛋白质保持特异性结合至固相材料上的固定化配体。然后，特异性结合的感兴趣蛋白质用低pH、高pH、高盐、竞争性配体、等等以活性形式自固定化配体消除，并随洗脱缓冲液流过层析柱，不含早先容许流过柱地污染性蛋白质或蛋白质杂质。任何成分都能用作用于纯化其相应特异性结合蛋白质(例如抗体)的配体。
术语“非亲和层析”和“非亲和纯化”指其中不利用亲和层析的纯化过程。非亲和层析包括依赖感兴趣分子(诸如蛋白质，例如抗体)与固相基质之间的非特异性相互作用的层析技术。
“阳离子交换树脂”指如下的固相，其带负电荷且因此有游离阳离子供与流过该固相的水溶液中的阳离子交换。附着至固相以形成阳离子交换树脂的、带负电荷的配体可以是例如羧酸根或磺酸根。商品化的阳离子交换树脂包括羧甲基纤维素、在琼脂糖上固定化的磺丙基(SP)(例如Pharmacia的SP-SEPHAROSE FAST FLOWTM或SP-SEPHAROSE HIGHPERFORMANCETM)和固定化在琼脂糖上的磺酰基(例如Pharmacia的S-SEPHAROSE FAST FLOWTM)。“混合模式离子交换树脂”指经阳离子、阴离子、和疏性模块共价修饰的固相。商品化的混合模式离子交换树脂是BAKERBOND ABXTM(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)，其含有附着至硅胶固相支持介质的弱阳离子交换基团、低浓度阴离子交换基团、和疏水性配体。
术语“阴离子交换树脂”在本文中用于指带正电荷的固相，例如具有附着于它的一个或多个带正电荷的配体，诸如季氨基团。商品化的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、QAE SEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM(Pharmacia)。
B.详细描述
蛋白胨的分级和分析
本发明基于使用各种层析和其它分离技术对活性蛋白胨片段的鉴定。
蛋白胨的分级可通过本领域公知技术来实施，包括层析步骤的组合。图1中例示了一个用于蛋白胨PP3分级分离和分析的典型方案。此方案中的第一个步骤是反相HPLC(RP HPLC)，其用来基于各成分的疏水特征将它们分开。化合物在高水性流动相中结合至反相HPLC柱，并用高有机性流动相自RPHPLC柱洗脱。如此，可以使用此技术通过运行适宜有机溶剂的线性或非线性梯度将肽分开。
然后可以对来自反相HPLC的流出级分进行进一步的层析分离步骤，诸如大小排阻层析，如图1所示。大小排阻层析(SEC)依赖基于不同水力半径的分子在层析柱内花费的时间对这些分子的分选。作为分子在构成柱的静止相的体积内花费或多或少时间的结果发生分配。具有大水力半径的分子在分离期间早期洗脱；具有较小半径的分子较晚洗脱。SEC树脂是本领域公知的，而且可以自多家制造商购买。在下文实施例所描述的实验中，使用了SEPHADEXTMG15大小排阻柱(Amersham Biosciences)，但是其它大小排阻柱也是合适的。
如果需要，可以通过混合模式层析将蛋白胨细分级(sub-fractionate)。在此技术中，静止相在单一层析配体中含有两种不同的结合域。通常偶联的分离原理是离子交换和RP层析。当反相层析(RP层析)未能将结构上接近的肽分开时，一般需要应用混合模式层析。当前，数家制造商销售显示不同特异性的混合模式树脂，包括Hypercarb树脂(Thermo Scientific)、HLB树脂(Waters Corporation)和DowexSD-2树脂(Dow ChemicalCompany)。Oasis吸附剂是二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮的共聚物。亲水-亲脂平衡组合物容许相对于传统RP树脂而言强的RP保留和改善的孔隙润湿。因此，极性和非极性化合物都能吸附。Oasis珠的平均大小是30μm。Optipore树脂的组成与Oasis树脂的(具有叔胺的二乙烯基苯)类似，从而给予它RP和弱阴离子交换吸收剂二者的特性。颗粒平均大小是几百μm。
在每个纯化步骤，可以对得到的级分分析生物学活性和/或进行各种分析方法以测定它们的组成。
肽活性的测定法
可以使用已知的生物测定法测试所生成的蛋白胨级分，包括实施例中所描述的基于细胞的生物测定法。蛋白胨衍生肽的生物学活性的测定法通常基于对细胞培养中各种培养参数的测量，包括培养基中所讨论的肽。此类参数包括例如细胞密度、存活细胞(viable cell)计数、所生成的异源多肽(例如抗体)的生产率、等。此类测定法披露于例如Franek等,Biotechnol.Prog.16:688-692(2000)；Franek等,Biotechnol.Prog.18:155-158(2002)；Franek等,Biotechnol.Prog.19:169-174(2003)；Franek等,Biotechnol.Prog.21:96-08(2005)。
蛋白胨级分的组成的测定
如此，可以通过质谱术(MS)、NMR、ICPMS、氨基酸分析、及这些技术和本领域公知的其它技术的各种组合来分析蛋白胨和蛋白胨级分的组成。
质谱仪由离子源、质量分析仪、离子检测仪、和数据获取单元组成。首先，将肽在离子源中离子化。然后在质量分析仪中依照离子化的肽的质荷比将它们分开，并检测分开的离子。质谱术已经广泛用于蛋白质分析，尤其在发明基质辅助激光解吸离子化/飞行时间(MALDI-TOF)和电喷射离子化(ESI)方法后。有数种型号的质谱仪，包括例如MALDI-TOF和三联或四极-TOF，或离子阱质谱仪偶联ESI。如此，例如Q-Tof-2质谱仪利用的正交飞行时间分析仪，其容许同时检测跨越整个质谱范围的离子。关于更多详情参加例如Chemusevich等,J.Mass Spectrom.36:849-865(2001)。
如果需要，可以通过本领域已知的技术来测定肽片段和最终衍生它们的蛋白质的氨基酸序列，诸如质谱术的某些变化形式、或Edman降解。
虽然通过在特定蛋白胨的降解产物中鉴定的肽片段例示了本发明，但是预期其它蛋白胨会含有具有相似结构和功能特征的肽成分。
组合肽文库
组合肽文库是本领域公知的，而且标准教科书中记载了用于生成和筛选此类文库的方法，诸如例如Combinatorial Peptide Library Protocols(Methods in Molecular Biology),Shmuel Cabilly,编,Humana Press Inc.1998。
组合肽文库可以是不同的形式。例如，所谓的“一珠一化合物”文库含有数以千计的珠，每个携带单一文库化合物的多个拷贝(Lam等,Nature,354,82-84(1991))。对文库筛选期望的活性，并分离任何有活性的珠。然后通过常规方法(诸如例如通过Edman降解)表征附着至鉴定出的所鉴定的珠的活性化合物。或者，可以采用还原性的(reductive)办法。在另一种方法中，即Houghten的定位固定法(Bioorg.Med.Chem.Lett.,14,1947-1951(2004))，在筛选前生成一组相关文库。每个文库含有其中一个特定残基作为单一构件块固定且剩余残基完全随机化的化合物。不同文库在固定位置处具有不同构件块(building block)。对这组文库筛选期望活性能够直接鉴定位于固定残基处的最适构件块。此过程可序贯进行，一次优化一个残基，或者可以同时筛选整组文库以容许直接自单轮筛选鉴定最适文库化合物。
使用本文中具体公开的肽，可以使用组合肽文库来鉴定别的具有改善的化学和/或生物学特征的肽。
肽合成
依照本发明鉴定的肽可以通过常规肽合成方法来合成，诸如例如固相合成法，其能以多种形式实施，诸如例如使用Fmoc(9H-芴-9-基-甲氧基-羰基)或Boc(叔-丁氧羰基)保护基团来保护合成中所使用的氨基酸单体的N-末端。这两种技术的自动化合成仪都可购买得到，但是固相肽合成也能手工实施。更多详情参加例如Atherton,E.,Sheppard,R.C.(1989).Solid Phase peptidesynthesis:a practical approach.Ocford,England:IRL Press.ISBN 0199630674；及Stewart,J.M.,Young,J.D.(1984).Solid phase peptide synthesis,第2版,Rockford:Pierce Chemical Company,91.ISBN 0935940030。
二肽和三肽的用途
本发明的二肽和三肽可作为生长培养基的成分用于生产重组多肽(包括抗体)。
重组多肽(诸如抗体)可以在各种真核和原核宿主生物体中生成。
适合于表达糖基化多肽(诸如抗体)的宿主细胞可衍生自多细胞真核生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(Bombyx mori)NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规规程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1,ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562,ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝肉瘤系(HepG2)。
例如，可以在dp12.CHO细胞中生成重组多肽(诸如抗体)，其是自CHO-K1DUX-B11细胞生成的，如EP307247所记载的。CHO-K1DUX-B11细胞继而是自CHO-K1(ATCC No.CCL61CHO-K1)细胞获得的，遵循Simonsen,C.C.,和Levinson,A.D.,(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:2495-2499及Urlaub G.,和Chasin,L.,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci USA77:4216-4220中记载的方法。另外，已知且能使用其它CHO-K1(dhfr-)细胞系。
可以在多种培养基中培养用于生成肽、多肽和蛋白质的哺乳动物宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM,Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham和Wallace(1979),Meth.in Enz.58:44；Barnes和Sato(1980),Anal.Biochem.102:255；U.S.Pat.No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；或4,560,655；WO 90/03430；WO 87/00195；U.S.Pat.No.Re.30,985；或U.S.Pat.No.5,122,469，通过述及将它们的公开内容都收入本文。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白、或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GentamycinTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以本领域技术人员知道的适宜浓度包含任何其它必需补充物。培养条件，诸如温度、pH等，就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。
本发明的肽可以单独或以各种组合使用，作为任何商品化或定制的培养基的成分。
本文中的肽的用途不限于培养哺乳动物或一般性的真核宿主细胞。本发明的肽还可用于原核宿主生物体的细胞培养。例示性的原核宿主细胞包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、和志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公开的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。
下面的非限制性实施例提供了本发明的进一步详情。
实施例
使用组合文库进行的有生物学活性的、含C-端精氨酸的三肽的分子鉴定
材料和方法
TubeSpin生物测定法
TubeSpin生物测定法设计用于在5毫升(mL)工作体积中使用1.5x106个细胞/mL的初始存活细胞密度检验细胞培养基调节剂对细胞增殖和生产率(分别通过存活细胞密度和所生成的抗体的浓度来测定)的影响。
以7.15mL的体积制备每份培养物，自此转移5mL至测定管。测定管是带专用帽的50mL离心管，该专用帽装有0.2微米孔径的膜以便于气体流动。将剩余的2.15mL用于测量存活细胞密度(以证实已经达到了靶密度和细胞是可存活的二者)、摩尔渗透压浓度和代谢数据(pH、谷氨酰胺、谷氨酸根、葡萄糖、乳酸根、铵、钠、钾)。
根据期望培养基添加剂的起始浓度和摩尔渗透压浓度，测定该添加剂的靶浓度。自此数据计算需要的添加剂体积、在最终培养基中实现生理学摩尔渗透压浓度需要的氯化钠体积、和达到7.15mL需要的水体积。使用这些值装配培养基添加剂、氯化钠、和水的制备性溶液。
然后通过交换培养基使选择性Genentech必需培养基(GEM)中的细胞进入称作GEM2的生产-品质培养基。然后将GEM2中的细胞添加至每个制备管以在7.15mL中达到规定的1.5x106个细胞/mL。然后每个测定管接受5mL并于37℃温育4.75天。
在温育期结束时，再次测量存活细胞密度、摩尔渗透压浓度、和代谢状况，并将测定培养物样品用于分开的抗体定量测定法以测定浓度。
C18反相制备层析
制备并立即使用PP3的20％(w/v)水溶液。给5x 5cm不锈钢柱装填WatersPreparative C18硅土(孔径；55-105微米粒度)。该柱用10倍体积的含0.02％(w/v)三氟乙酸(TFA)的水(缓冲液A)预平衡，并以60ml/min的流速运行。将200mL上述PP3溶液加载到该柱上。使用受Unicorn软件控制的Akta层析系统(GE Healthcare)实现柱的溶剂控制和流出物监测。加载后，用缓冲液A清洗柱，直至流出液在280nm的吸光度达到基线。然后用含0.02％TFA的85％(v/v)乙腈(ACN)清洗所述柱以洗脱结合的材料。使用生物测定法对各级分测定生物学活性。
G15Sephadex制备层析
来自C18的流出材料通过旋转蒸发来浓缩，并在G-15Sephadex柱(7cm直径x50cm长度)上进一步分级分离。加载前用去离子水平衡该柱，并加载整个C18流出收集物。收集级分，并使用上文所述生物测定法测定活性。
Hypercarb分析层析
使用Hypercarb(石墨)柱(5微米粒度；柱尺寸：0.1mmx50mm)分析活性级分的样品。所使用的缓冲液是缓冲液A：水性0.02％TFA；和缓冲液B：85％ACN+0.02％TFA。将各种体积(0-10微升)加载到用缓冲液A预平衡的柱上，并在25分钟里用达到50％缓冲液B的线性梯度洗脱。以0.1ml/min的流速运行该柱。用配备有二极管阵列检测仪和MSD单一四极质谱仪的Agilent1100 HPLC实现溶剂控制。整个系统在Agilent Chemstation软件的控制下。
质谱术
使用Q-TOF(Waters Corporation)或Orbitrap质谱仪(Thermofinnigan)实施高分辨率质谱术。以静态喷射模式运行该设备，在这两种情况中都发现质量精确度(mass accuracy)小余5ppm。使用图谱来获得精确的质量信息，其用于与肽文库信息关联起来。
生物信息学
以必要的质量精确度来构建二肽和三肽的计算机文库，与如上所述测定的质量关联起来。
肽合成
使用Fmoc固相肽合成来创建三肽文库。该文库设计成含有所有可能的以精氨酸(R)为末端的三肽，即XXR。
结果
PP3的分级
图1中图示了用于PP3分级分离和分析的方案。
C18反相HPLC
PP3的初始分级是使用反相HPLC进行的。图2所示层析图是代表性的PP3反相层析图谱。大部分质量(初始干重的约70％)像大部分生物学活性一样流出柱。
将来自C18的流出级分浓缩并加载到G-15Sephadex上进行大小排阻层析，结果如图3所示。
对来自G15柱的级分分析生物活性。G15纯化的材料(级分F3-F7)的比活性相对于PP3的比活性显著升高，就其提高重组蛋白质滴度(图4A)和存活细胞计数(VCC；图4B)的能力而言。
对G15级分集合进行质谱术
使用质谱术分析活性级分以获得关于活性成分的分子本质的信息。图5显示了自如上所述获得的G15收集物样品获得的代表性质谱。该图谱含有众多质量小余500Da的峰。该图谱的一项惊人特征为它们含有许多以重复方式存在的、质量相差14个质量单位的峰的事实。而且，位于175.1m/z的峰(图5)通过精确的质量和后续的元素组成分析被鉴定为精氨酸。另外，使用碰撞诱导解离(CID)对来自图5所示图谱的三个质量(403.2，389.2和375.2m/z；以方框标示)的分析揭示了小余200Da的质量范围中相似的断裂样式。这包括自这三个质量中的每一个鉴定出位于175.1m/z的完整精氨酸残基。另外，基于精确的质量测量，这些分子被鉴定为具有下述可能身份的肽：
403.2Da：EVR；DIR；DLR
389.2Da：LTR；ITR
375.2Da：SIR；SLR；TVR
上述序列中头2个氨基酸的次序也可以颠倒。由于氨基酸个体组合的交叠，在每个质量处存在数种可能性。
含精氨酸的三肽的计算机文库的创建
在来自蛋白胨级分的质谱中看到的14质量单位重复结构和C-端精氨酸在一组这些分子中的存在提示酶促创建的肽“组合文库”在源自动物组织的PP3中的存在。为了进一步调查此想法，我们决定创建含C-端精氨酸的三肽的计算机文库。该文库含有400种可能的肽，图6所示的图呈现了它的质量组成和分布。该分布确实类似在以14Da间隔具有重复峰的蛋白胨级分中看到的14质量单位差异。
真实XXR组合肽文库的构建和分析
为了进一步探索含C-端精氨酸的肽可能负责在PP3级分中看到的活性的一部分的想法，我们使用固相(Fmoc)肽合成制备了这些分子的组合文库。在去离子水中溶解含有冻干肽的文库，并用NaOH将该溶液的pH调节至约7.0。然后使用G-15柱将该溶液脱盐。收集该文库的级分，通过旋转蒸发来浓缩，并通过质谱术和通过生物测定法来测定。质谱分析揭示了二肽和三肽二者的存在。认为在混合物中找到的二肽源自一定比例的失败的肽合成反应。
质谱术揭示了多个峰的存在，将它们与上文所述计算机文库进行比较。表1列出了在此级分中找到的肽的质量、身份和相对强度。命名基于精确的质量测量结果，误差小余5ppm。此表呈现了此级分中存在的所有肽的部分列表。
G-15XXR级分的生物测定法
对如上所述制备的XXR肽在生物测定法中测定活性，发现对细胞生长和滴度都具有显著的积极效果。
总结
此实施例中所呈现的结果显示了PP3含有分子量小余500Da的活性分子。这些分子中的一些被鉴定为含C-端精氨酸的三肽。这些肽的组合文库在6天生物测定法中显示出生物学活性。我们得出结论，含C-端精氨酸的三肽至少部分负责PP3的促进生长和提高滴度的活性。
本文中例示性描述的发明可以在本文中没有具体公开的任何元素、限制缺失的情况中适当地实践。如此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”、等应当读作可扩展的和没有限制的。另外，本文中所采用的术语和表述用作描述而非限制的术语，而且在使用此类术语和表述时没有意图排除所示发明或其部分的任何等同方案，但是认识到在要求保护的发明范围内各种修改是可能的、如此，应当理解，虽然已经通过优选的实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员能容易地做出本文中所公开的具体化的发明的修改和变化，而且此类修改和变化视为在本文中所公开的发明范围内。本文中已经广泛地和一般性地描述了发明。每个落在上位公开内的较窄上位和亚上位分组也构成这些发明的一部分。这把会容许自上位概念中消除任何主题的附带条件或否定限制包括在每项发明的上位描述内，不管是否具体叙述了要消除的材料。另外，在以马库什组的方式描述发明的特征或方面的情况中，本领域技术人员会认识到本发明也由此以马库什组各成员或成员亚组的方式描述。本文中的方法中所描绘的和/或所使用的各步骤可以以与描绘的和/或规定的不同的次序实施。各步骤仅仅是这些步骤可发生的次序的例示。各步骤可以以期望的任何次序发生，只要使得它仍实现要求保护的发明的目的。
根据本文中对发明的描述，显而易见的是可以使用各种等同实施方案来执行本发明的概念而不背离其范围。此外，虽然已经具体参照某些实施方案描述了本发明，但是本领域普通技术人员会认识到可以在形式和细节上做出变化而不背离本发明的精神和范围。所描述的实施方案在所有方面视为例示性的而非限制性的。还应当理解，本发明不限于本文中所描述的具体实施方案，而是能够有许多等同的实施方案、重排、修改、和替代且不背离本发明的范围。如此，别的实施方案在本发明的范围内和在所附权利要求内。
通过述及将本文中提及的所有美国专利和申请、外国专利和申请、科学论文、书籍、和出版物完整收入本文，就像明确和单独地指出通过述及而完整收录每一篇具体的专利或申请，包括任何附图、图和表，就像完整列出一样。
表1：来自XXR的肽鉴定

Claims (23)

1.式(X1)nX2R的肽，
其中X1和X2可以相同或不同，且独立代表精氨酸以外的任何氨基酸；
n为0或1；且
R代表精氨酸，
其中所述肽展现出蛋白胨生物学活性。
2.权利要求1的肽，其是通过对蛋白胨分级获得的。
3.权利要求2的肽，其中所述蛋白胨是PP3。
4.权利要求1的肽，其选自表1中所列出的肽。
5.权利要求1的肽，其是三肽。
6.权利要求5的肽，其中所述三肽选自表1中所列出的肽。
7.权利要求1的肽，其中所述生物学活性选自下组：促进细胞生长；提高细胞密度；提高存活细胞计数；和提高重组宿主细胞培养物中的生产产率。
8.一种组合物，其包含权利要求1的肽。
9.权利要求8的组合物，其是细胞培养基。
10.一种细胞培养物，其包含权利要求1的肽。
11.权利要求10的细胞培养物，其是重组宿主细胞的培养物。
12.权利要求11的细胞培养物，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
13.权利要求12的细胞培养物，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
14.权利要求11的细胞培养物，其中所述重组宿主细胞生成异源蛋白质。
15.权利要求14的细胞培养物，其中所述重组蛋白质是抗体或抗体片段。
16.权利要求1的两种或更多种肽的混合物。
17.一种组合肽文库，其包含式(X1)nX2R的肽，
其中X1和X2可以相同或不同，且独立代表精氨酸以外的任何氨基酸；
n为0或1；且
R代表精氨酸，
其中至少一些所述肽展现出蛋白胨生物学活性。
18.权利要求17的组合肽文库，其基本上由式(X1)nX2R的肽组成，
其中X1和X2可以相同或不同，且独立代表精氨酸以外的任何氨基酸；
n为0或1；且
R代表精氨酸，
其中至少一些所述肽展现出蛋白胨生物学活性。
19.权利要求17的组合肽文库，其由式(X1)nX2R的肽组成，
其中X1和X2可以相同或不同，且独立代表精氨酸以外的任何氨基酸；
n为0或1；且
R代表精氨酸，
其中至少一些所述肽展现出蛋白胨生物学活性。
20.一种用于重组生产异源蛋白质的方法，包括在适合于所述异源蛋白质表达的条件下在培养基中培养含有编码所述蛋白质的核酸的重组宿主细胞，其中所述培养基包含至少一种权利要求1的肽。
21.权利要求20的方法，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
22.权利要求20的方法，其中所述重组宿主细胞是原核宿主细胞。
23.权利要求20的方法，其中所述异源蛋白质是抗体或抗体片段。
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