PT2193803E - Ácidos nucleicos que codificam imunoglobulinas que possuem epítopos de gp100 e trp2 - Google Patents

Ácidos nucleicos que codificam imunoglobulinas que possuem epítopos de gp100 e trp2 Download PDF

Info

Publication number
PT2193803E
PT2193803E PT10152624T PT10152624T PT2193803E PT 2193803 E PT2193803 E PT 2193803E PT 10152624 T PT10152624 T PT 10152624T PT 10152624 T PT10152624 T PT 10152624T PT 2193803 E PT2193803 E PT 2193803E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
ser
leu
epitope
thr
gly
Prior art date
Application number
PT10152624T
Other languages
English (en)
Inventor
Linda Gillian Durrant
Rachael Louise Metheringham
Victoria Anne Pudney
Original Assignee
Scancell Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scancell Ltd filed Critical Scancell Ltd
Publication of PT2193803E publication Critical patent/PT2193803E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6056—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Description

1
DESCRIÇÃO
"ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM IMUNOGLOBULINAS QUE POSSUEM EPÍTOPOS DE gplOO e TRP2" A presente invenção refere-se a ácidos nucleicos e a sua utilização como vacinas, aos ácidos nucleicos que codificam epitopos de linfócitos T contra os quais se quer desencadear uma resposta imune. Tais vacinas podem ser utilizadas no tratamento de tumores.
No campo das vacinas contra o cancro e infecções virais crónicas, está-se a tornar evidente que factores diferentes da frequência, tais como a avidez funcional de células T especificas de tumor e via de sensibilização, são determinantes principais na maximização da eficácia da vacina. Vários grupos mostraram que as células T CD8+ de alta avidez demonstram actividade antitumoral superior (Alexander-Miller, Immunologic Research, 2005: 31: 13-24. Hodge et al, J Immunol 2005; 174: 5994-6004, Valmori et al, J
Immunol 2002; 168: 4231-40, Zeh et al, J Immunol 1999; 162; 989-94) . Foi sugerido que os linfócitos T de alta avidez desempenham um papel vital na regressão tumoral em pacientes. Isto é exemplificado num estudo em que se detectaram linfócitos que se infiltram em tumores (TIL) específicos de antigénios de alta avidez num paciente com uma impressionante regressão tumoral (Khong & Rosenberg, J Immunol 2002; 168: 951-6). Também estão a aparecer evidências que demonstram que a transferência adoptiva de células T específicas de tumor autólogas estimuladas in vitro é bem sucedida, possivelmente porque a estimulação in vitro permite a selecção das células T de alta avidez (Vignard et al., J Immunol 2005; 175: 4797-805, Dudley et al., J Immunother 2001; 24: 363-73, Morgan et al, J Immunol 2003; 171: 3287-95, Rosenberg & Dudley,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004; 101 Supl 2: 14639-45).
Até agora vários grupos tentaram induzir uma resposta imune celular contra um epítopo predeterminado utilizando um anticorpo como um portador para esse epítopo. Por exemplo, o documento WO 96/19584 (Bona et al.) revela anticorpos quiméricos em que são inseridos epitopos de células T nas regiões determinantes de 2 complementaridade (CDR) de um anticorpo e alega que tais anticorpos quiméricos são adequados para induzir uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL). No entanto, este documento revela que o ADN deve codificar uma proteína funcional. Portanto, no resumo, indica-se que "as capacidades funcionais do epítopo e da imunoglobulina parental são conservadas". Além disso, na página 21, indica-se "que a inserção do epítopo desejado deveria ser numa região do ácido nucleico que codifica a molécula de imunoglobulina parental que não seja essencial para a expressão ou função da molécula de imunoglobulina parental". Além disso, todos os exemplos no documento WO 96/19584 mostram que é produzida imunoglobulina intacta após a inserção do epítopo de linfócitos T. A Patente dos Estados Unidos N° 7.067.110 revela um método para induzir uma resposta imune contra um antigénio utilizando uma proteína de fusão de anticorpo que não possui um domínio de região variável de imunoglobulina fusionado com o antigénio por uma ligação polipeptídica. A proteína de fusão conserva a capacidade de se ligar a Fc. 0 documento EP0759944 revela um procedimento para incorporar epítopos de células T dentro de uma molécula de anticorpo que é secretada como uma proteína de imunoglobulina intacta e que pode direccionar epítopos de CTL para tumores para torná-los melhores alvos para CTL. O documento WO 00/64488 revela que uma resposta de CTL pode ser induzida por um ácido nucleico que codifica um anticorpo quimérico que tem epítopos de linfócitos T heterólogos inseridos nas CDR mas não na região variável dos mesmos, contanto que o ácido nucleico se destine a expressão em linfócitos B. Já que os linfócitos B não podem estimular respostas de linfócitos T naive, a vacina descrita no documento WO 00/64488 seria útil somente no reforço de respostas de linfócitos T preexistentes. 0 documento WO 02/092126 revela que uma resposta de CTL pode ser induzida por um polipéptido que compreende um epítopo de linfócitos T heterólogos e a parte de Fc humano que se liga ao receptor CD64 de alta afinidade. No entanto, os presentes inventores mostraram agora que a disrupção da sequência de anticorpo pela inserção de um epítopo de linfócitos T, por exemplo, dentro de uma CDR inapropriada ou inclusive dentro da 3 região variável de um anticorpo, evita a associação de cadeia pesada e leve e não é secretado anticorpo funcional. 0 ADN que codifica estes anticorpos com enrolamento incorrecto gera de forma inesperada respostas de linfócitos T fortes. Além disso, isto não é mediado por meio de CD64 já que IgG2 humana, que não se une a CD64 de ratinho ou humano, funciona tão eficazmente como IgGl humana.
Num aspecto da presente invenção é proporcionado um ácido nucleico que compreende um promotor não especifico e uma sequência que codifica um anticorpo recombinante, em que a molécula de anticorpo tem epítopos de linfócitos T heterólogos de modo que o anticorpo não pode tomar a sua conformação nativa quando o ácido nucleico é expresso, sendo os epítopos de linfócitos T heterólogos: GTGRAMLGTHTMEVTVYH em CDRH1 e CDRL3 SVYDFFVWL em CDRH2, e WNRQLYPEWTEAQRLD em CDRH3 e CDRL1.
Sem desejar estar vinculado pela teoria, a presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, no conceito de que uma resposta a linfócitos T contra um epítopo de linfócitos T específicos (tal
como um epítopo de CTL), pode ser gerada por meio da administração de um ácido nucleico que codifica um polipéptido que inclui o epítopo de linfócitos T mas não epítopos de linfócitos T reguladores. Acredita-se que o ácido nucleico é captado por células apresentadoras de antigénios (APC), migra para os gânglios linfáticos e é apresentado directamente ou é expresso para produzir um polipéptido que é secretado e que é captado depois por outras APC. 0 primeiro ácido nucleico mencionado é adequado para estimular epítopos de linfócitos T auxiliares e o segundo é adequado para estimular respostas de CTL. 0 polipéptido que é codificado pelo ácido nucleico idealmente não tem nenhum epítopo de linfócitos T naturais. Os polipéptidos adequados com respeito a isso são moléculas imunes, tais como anticorpos. São adequadas para a prática da presente invenção cadeias pesadas e leves de anticorpos que não se podem associar de modo que a cadeia leve permanece nas APC e de modo que a cadeia pesada é secretada.
Foi identificada uma população de linfócitos T supressores aproximadamente há 40 anos, mas o progresso foi dificultado pela 4 falta de técnicas específicas para identificar as células e devido ao cepticismo científico com respeito à existência de supressão. No entanto, Sakaguchi et al. ressuscitou o interesse nas células supressoras em 1995 demonstrando que a transferência de linfócitos com depleção de linfócitos T CD4+CD25+ em ratinhos atímicos provocou o desenvolvimento de diversas doenças autoimunes nos ratinhos receptores e que a reconstituição com linfócitos T CD4+CD25+ evitou reacções autoimunes nestes ratinhos (Sakaguchi et al J. Immunol 1995; 155: 1151-1164). Posteriormente, numerosos estudos em ratinhos e seres humanos mostraram que diversas populações de linfócitos T com actividade reguladora desempenham um papel importante na supressão de respostas imunes (tanto inatas como adaptativas) a antigénios próprios - self - (controlando a tolerância ao self) (Sakaguchi et al J Immunol 1995; 155: 1151-1184) assim como exógenos (Shevach, Immunity 2006; 25: 195-201, Coleman et al, J. Cell Mot. Med 2007; 11: 1291-1325). Foi mostrado que a depleção de linfócitos Treg em modelos de ratinho de cancro melhora a rejeição de tumores mediada por resposta imune endógena (Shimizu, et al, J. Immunol. 1999; 163: 5211-5218, Onizuka et al, Câncer Research 1999; 59: 3128-3133) e a imunidade antitumoral específica de antigénios (Tanaka, et al, J. Immunother. 2002; 25: 207-217). Além disso, a depleção de linfócitos Treg aumenta a imunoterapia tumoral incluindo vacinação (Tanalca, et al, J. Immunother. 2002; 25: 207-217, Dannull et al, J. Clin. Invest. 2005: 115: 3623-3633) e bloqueio de CTLA-4 (Sutmuller et al, J. Exp. Mad. 2001; 194: 823-832). Além disso, são aumentados os números de linfócitos Treg no sangue periférico (Woo et al, Câncer Research 2001; 61: 4766-4772, Curiel et al, Nature Medicine 2004; 10: 942-949, Wolf et al. Clin. Câncer Research 2003; 9: 606-612. Sasada et al, Câncer 2003; 98: 1089-1099) e populam o microambiente tumoral e drenam os gânglios linfáticos (Curiel et al, Nature Medicine 2004; 10: 942-949, Sasacia et al, Câncer 2003; 98: 1089-1099, Liyanage et al, J. Immunology 2002: 169: 2756-2761, Matsuura et al, Câncer 2006 ; 106: 1227-1236. Yang et al, Blood 2006; 107: 3639-3646, Álvaro et al, Clin. Câncer Research 2005; 11: 1467-1473) de pacientes com diferentes cancros. Em pacientes com carcinoma gástrico (Sasada et al, Câncer 2003; 98: 1089-1099, Ichihara et al, Clinicai Câncer Research 2003; 9; 4404-4408) e 5 cancro de ovário (Curiel et al, Nature Medicine 2004; 10: 942-949) foram associados prognóstico negativo e taxas de sobrevivência reduzidas com maiores frequências de linfócitos Treg. Também foi mostrado que os linfócitos Treg suprimem/inibem a proliferação, produção de citocinas (IFNy, IL-2) e actividade citolitica de linfócitos T CD8+ (Liyanage et al, J. Immunology 2002; 169: 2756-2761, Piccirillo et al. J. Immunology 2001; 167: 1137-1140, Mempel et al, Immunity 206; 25: 129-141, Annacker et al, J. Immunology 2001; 166: 3008-3018, Woo et al, J. Immunology 2002; 168: 4272-4276) e CD4+ (Liyanage et al, J, Immunology 2002, 169: 2756-2761, Ichihara et al, Clinicai Câncer Research 2003; 9: 4404-4408, Nishikawa et al, Blood 2005; 106,008-1011) específicos de tumor. Além disso, os linfócitos Treg podem suprimir as funções das células dendríticas (Romagnani et al, Eur. J. Immunol. 2005; 35: 2452-2458), linfócitos NK (Ralainirina et al, J. Loukoc Biol. 2007; 81: 144-153) e linfócitos B (Lim et al, J. Immunology 2005; 175: 4180-4183). Tomados juntos, estes estudos sugerem um papel importante dos linfócitos Treg na imunopatologia tumoral e indicam uma correlação próxima entre as frequências de linfócitos Treg e o crescimento tumoral.
Os linfócitos Treg são divididos em linfócitos T CD4+CD25+ naturais e diversas populações de linfócitos Treg induzidos/adaptativos (Shevach, Immunity 2006; 25: 196-201, Bluestone et al, Nat. Immunol. 2005; 6: 345-352) (Quadro 1). Aproximadamente 5 %-10 % dos linfócitos T CD4+ em ratinhos e seres humanos são linfócitos Treg naturais (Sakaguchi et al, Nat. Immunology 2005; 6: 345-352). Os linfócitos Treg naturais desenvolvem-se no timo por interacção de TCR forte com péptido próprio (Picca et al, Current Opinion in Immunafogy 2005; 17: 131-136, Jordan et al, Nature Immunology 2001; 2(4): 301-306, Picca et al, Immunological Reviews 2006; 212: 74-85), enquanto que os linfócitos Treg induzidos desenvolvem-se a partir de linfócitos T não reguladores na periferia. Esta conversão extratímica requer condições imunológicas especiais tais como exposição contínua a baixa dose de antigénio, exposição a um antigénio periférico sistémico ou exposição a TGFP (Shevach. Immunity 2006; 25: 195-201, Akbar et al, Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 231-237). Os linfócitos Treg podem mediar sua supressão por um ou uma combinação dos 6 seguintes mecanismos: i) mecanismo dependente de contacto célula-célula, ii) através da secreção de citocinas imunosupressoras como IL-10 ou TGFP ou iii) morte directa de células alvo pela via de perforina-grancima (von Boehmer, Nature Immunology 2005; 6(4): 338-344).
Até hoje, sabe-se muito pouco sobre a especificidade de antigénio dos linfócitos Treg humanos. Wang et al. notificaram a identificação de clones de linfócitos Treg funcionais CD4+CD25+GITR+ específicos de LAGE-1 em pacientes com cancro (Whang et al, Immunity 2004; 20: 107-118). Vence et al. demonstraram a presença de linfócitos Treg CD4+ específicos de antigénio tumoral no sangue periférico de pacientes com melanoma metastásico (Vence et al, PNAS 2007; 104(52) : 20884-20889) . Estes linfócitos Treg reconheceram uma ampla série de antigénios tumorais, incluindo TRP1, NY-ESO—1, gplOO e survivina. Além disso, Vence et al. foram os primeiros em demonstrar a presença de epítopos de linfócitos Treg específicos de NY-ESO-1 dentro da molécula de NY-ESO-1. Além disso, mostrou-se que a vacinação de pacientes com melanoma com células dendríticas carregadas com péptidos sintéticos ou lisados tumorais induzia o aumento das frequências de linfócitos Treg, juntamente com a expansão de linfócitos T CD8+ específicos de tumores (Chakraborty et al, Hum. Immunology 2004; 65: 794-802).
Isto sugere a possibilidade de que a vacina continha epítopos de linfócitos Treg não identificados assim como epítopos de linfócitos T CD8+, que levam à expansão de linfócitos Treg in vivo por activação específica de ligando através do receptor de linfócitos T de linfócitos Treg (TCR) . É amplamente aceite que os linfócitos Treg requerem activação especifica de antigénios através de união/reconhecimento de TCR mas mediam na supressão de testemunha não específica de antigénio (Thorton & Shevach, J. Immunology 2000; 164: 183190) . Além disso, Li et al. sugeriram a existência de epítopos de Treg dominantes dentro da proteína do núcleo do Vírus da Hepatite C que estimulavam os linfócitos Treg específicos de VHC em pacientes infectados (Li et al, Immunol. Cell Biol. 2007; 85(3): 197-204). Colectivamente, estes estudos além do achado recente de que a imunização de ratinhos transgénicos HHD com a construção de ADN antiendotelial C200Fc, não estimulava uma resposta imune antitumoral específica de Tie-2i_ 7 196 significativa e o aumento da frequência de células secretoras de IFNy especificas de Tie-2i_i98 de esplenócitos de ratinhos HHD depois da eliminação de linfócitos Treg CD4+CD25+ (por administração de 400 μρ de anticorpo monoclonal PC61) antes de imunização com ADN de C200Fc (Middleton, Tese de Doutorado. Universidade de Nottingham, Novembro de 2007) indicam que o Tie-2i_i96 dentro da vacina de ADN contém epítopos de linfócitos Treg não identificados assim como o epitopo CD8+. Isto explicaria o fracasso da vacina para romper a tolerância com o antigénio próprio Tie-2 e para induzir imunidade antitumoral em ratinhos HHD devido a linfócitos Treg expandidos específicos de antigénio abundantes que suprimem a resposta imune antitumoral mediada por células. Existe, portanto, uma vantagem em expressar epítopos efectores de T com portadores imunes inertes que não expressam epítopos de Treg para dirigir a resposta imune ao epitopo efector e evitar estimulação da resposta de Treg dominante.
Vantajosamente, o ácido nucleico da presente invenção inclui uma sequência que codifica uma sequência, tal como uma sequência líder, que permite que o polinucleótido expresso, e especificamente a cadeia pesada do anticorpo recombinante, seja secretado. Isto permite que o polinucleótido seja transferido a células apresentadoras de antigénios (APC). A sequência poderia ser uma sequência líder que se expressa de forma natural com o polinucleótido ou poderia ser uma sequência líder heteróloga, tal como uma sequência líder de imunoglobulina, que é adicionada. A estrutura de uma cadeia pesada de anticorpo é conhecida pelos pertios na especialidade e geralmente inclui regiões variáveis e constantes. 0 anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal e pode ser IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, embora seja preferido IgG. O anticorpo de IgG pode ser qualquer subclasse de IgG, tal como IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3 de ratinho. O anticorpo de IgG pode ser um anticorpo de IgGl humana que tem o domínio de união Fc de IgG2 ou um anticorpo de IgG2 humana que tem o domínio de união de Fc de IgGl. A cadeia pesada pode ter a região constante de um anticorpo humano e a região variável ou hipervariável (CDR) de um anticorpo monoclonal de ratinho em que foram inseridos epítopos de linfócitos T heterólogos. A região variável distinta da região 8 hipervariável também pode ser derivada da região variável de um anticorpo humano. Quando se aplica a anticorpos (isto é, que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve) , é dito que o anticorpo é humanizado. Conhecem-se na técnica métodos para preparar anticorpos humanizados. São descritos métodos, por exemplo, em Winter, Patente de Estados Unidos N° 5.225.539. A região variável da cadeia pesada fora da região hipervariável de ratinho também pode ser de um anticorpo monoclonal de ratinho. Em tal caso, a região variável completa deriva de anticorpo monoclonal murino e, quando se aplica a anticorpos, diz-se que o anticorpo está quimerizado. Conhecem-se na técnica métodos para preparar anticorpos quimerizados. Tais procedimentos incluem, por exemplo, os descritos nas Patentes de Estados Unidos de Boss (Celltech) e de Cabilly (Genentech). Veja-se também Patente de Estados Unidos N° 4.816.397 e 4.816.567, respectivamente.
Pode ser proporcionado um ácido nucleico separado que codifica a cadeia leve do anticorpo. 0 epitopo de linfócitos T pode ser tal que a cadeia leve não toma sua conformação nativa quando se expressa o ácido nucleico. A cadeia leve pode ter qualquer das caracteristicas descritas no presente documento com respeito à cadeia pesada. 0 anticorpo da invenção pode ter a sequência da Figura 6 0 . A invenção também proporciona: • uma vacina que compreende um ácido nucleico da invenção e um adjuvante; • uma composição farmacêutica que compreende um ácido nucleico da invenção e um portador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável; • um ácido nucleico da invenção para utilização em medicina; • a utilização de um ácido nucleico tal da invenção no fabrico de um medicamento para estimular uma resposta imune contra pelo menos um dos epítopos de linfócitos T; e • um ácido nucleico da invenção para utilização na estimulação de uma resposta imune contra pelo menos um dos epitopos de linfócitos T.
Surpreendentemente, os presentes inventores decobriram que anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, que podem ser humanos ou não humanos, que têm epitopos de linfócitos T 9 predeterminados clonados dentro de suas regiões variáveis, de modo que se rompa a estrutura de anticorpo primária, inibem o dobramento e/ou limitam a secreção a somente cadeia pesada ou quantidades muito baixas de anticorpo intacto, estimulam respostas de linfócitos T específicos de antigénio e auxiliares fortes. Os inventores também descobriram que este efeito pode ser conseguido utilizando ácido nucleico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo. Acredita-se que o epítopo de linfócitos T seja processado mas não seja destruído pelo imunoproteassoma. Em certas formas de realização, a invenção proporciona uma vacina de ADN que apresenta epítopos de linfócitos T predefinidos dentro de imunoglobulina desnaturada que potência a frequência e a avidez da resposta de linfócitos T. Os polipéptidos codificados pelos ácidos nucleicos da invenção podem ser denominados no presente documento "immunobodies". 0 achado de que pode ser estimulada uma resposta imune contra um epítopo de linfócitos T por um ácido nucleico que codifica pelo menos a cadeia pesada de uma cadeia de imunoglobulina em que foi inserido o epítopo de linfócitos T de modo que uma molécula de imunoglobulina não pode tomar sua conformação nativa é contrário às expectativas da técnica, em que é ensinado que o anticorpo deve ser expressa numa forma funcional. Por exemplo, como foi analisado anteriormente o documento WO 96/19584 ensina que, quando um ácido nucleico codifica um anticorpo em que são inseridos epítopos de linfócitos T nas CDR do anticorpo, o ácido nucleico deve codificar um anticorpo funcional. De forma similar, o documento EP0759944 descreve um procedimento para incorporar epítopos de linfócitos T dentro de uma molécula de anticorpo que é secretado como uma proteína de imunoglobulina intacta. Embora a patente de Estados Unidos n° 7.067.110 revela que pode ser induzida uma resposta imune contra um antigénio por uma proteína de fusão de anticorpo e o antigénio, o anticorpo é revelado que não possui uma região variável de imunoglobulina. Além disso, esta proteína de fusão terá epítopos de linfócitos T reguladores no antigénio. Portanto, embora a proteína pode estimular uma resposta imune, não estimulará respostas de linfócitos T de alta avidez devido a epítopos de linfócitos T reguladores no antigénio. 10
Como foi analisado anteriormente, o documento WO 00/64488 revela um ácido nucleico que codifica um anticorpo quimérico que tem epítopos de linfócitos T heterólogos inseridos nas CDR mas não a região variável dos mesmos, o dito ácido nucleico sendo dirigido para expressão em linfócitos B. 0 ácido nucleico da presente invenção não é dirigido para a expressão em linfócitos B e, portanto, não será dirigida a linfócitos B especificamente in vitro ou in vivo. 0 ácido nucleico da presente invenção pode ser captado por qualquer célula apresentadora de antigénio, incluindo células dendriticas, e, portanto, pode sensibilizar respostas de linfócitos T auxiliares e CTL naive, enquanto que a vacina descrita no documento WO 00/64488 somente seria útil no reforço de respostas de linfócitos T preexistentes. A análise da avidez funcional de respostas induzidas por ácidos nucleicos de acordo com a invenção demonstrou que pode ser gerada uma resposta de alta avidez em comparação com imunização com péptido sintético. Isto está correlacionado também com uma capacidade potenciada de reconhecer e matar células tumorais in vitro e in vivo. Esta observação é comparável com a documentada em outros estudos em que a actividade antitumoral é melhor mostrada por CTL específicos de TRP2 de alta avidez (Zeh et al, J Immunol 1999; 162: 989-94, Harada et al, Immunology 2001; 104: 67-74).
Os ácidos nucleicos da presente invenção têm um promotor não especifico; isto é, um promotor que promoverá a expressão do ácido nucleico mas que não tem especificidade para células em que é promovida a expressão. O promotor provoca preferivelmente expressão do ácido nucleico em células dendriticas e/ou queratinócitos. Os exemplos de promotores adequados incluem o promotor de CMV, o promotor de SV40 e outros promotores não específicos conhecidos pelos peritos na especialidade. O ácido nucleico de certos aspectos da invenção codifica um anticorpo que inclui todos os elementos principais de um anticorpo, isto é cadeias pesadas e leves que incluem regiões variáveis e constantes. O anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal e pode ser IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM, embora seja preferido IgG. O anticorpo de IgG pode ser de qualquer subclasse de IgG, tal como IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3 de ratinho. O anticorpo de IgG pode ser um anticorpo 11 de IgGl humana que tem o domínio de união a Fc de IgG2. 0 anticorpo pode ter a região constante de um anticorpo humano e a região variável ou hipervariável de um anticorpo monoclonal de
ratinho em que foram inseridos epítopos de linfócitos T heterólogos. A região variável distinta da região hipervariável também pode derivar da região variável de um anticorpo humano. Um anticorpo tal é dito que é humanizado. Conhecem-se na técnica procedimentos para preparar anticorpos humanizados. Os procedimentos são descritos, por exemplo, em Winter, Patente de Estados Unidos N° 5.225.539. A região variável do anticorpo fora da região hipervariável de ratinho também pode derivar de um anticorpo monoclonal de ratinho. Em tal caso, a região variável completa deriva de anticorpo monoclonal murino e é dito que o anticorpo está quimerizado. Conhecem-se na técnica métodos para preparar anticorpos quimerizados. Tais procedimentos incluem, por exemplo, os descritos nas patentes de Estados Unidos de Boss (Celltech) e de Cabilly (Genentech). Vejam-se também Patentes de Estados Unidos N° 4.816.397 e 4.816.567, respectivamente. 0 ácido nucleico de certos aspectos da invenção é tal que a cadeia pesada, cadeia leve ou molécula de imunoglobulina expressa do mesmo tem pelo menos um epítopo de linfócitos T heterólogo no mesmo de modo que a cadeia pesada, cadeia leve ou anticorpo completo não possa tomar sua conformação nativa. 0 epítopo de linfócitos T pode interromper a proteína expressa de modo que a cadeia pesada ou o anticorpo já não podem unir-se a seu antigénio, de modo que as cadeias pesadas e leves já não se podem associar ou de modo que a cadeia pesada ou o anticorpo não possam ser secretadas de forma apropriada, por exemplo. A interrupção pode ser na estrutura terciária do anticorpo que pode evitar a formação das ligações dissulfureto.
Como é analisado em mais detalhe posteriormente, os epítopos de linfócitos T são inseridos em ou substituídos pelas regiões CDR1 e CDR2 do anticorpo. CDR1 e CDR2 formam parte da conformação em lâmina β do anticorpo e estão submersas parcialmente dentro da molécula dobrada. Qualquer mudança em seu comprimento, composição de aminoácidos ou carga romperá esta estrutura e evitará o dobramento e associação das cadeias pesadas e leves. CDRH3 são expostas na superfície da molécula de imunoglobulina e é, 12 portanto, mais permissiva para alterações. Em certas formas de realização a perda de regiões flanqueantes nos pontos de união de CDRH rompe completamente o dobramento do anticorpo, mas, não obstante, a inserção dos epitopos nestas regiões proporciona boas respostas de linfócitos T. A incorporação de qualquer epitopo dentro da CDRHl (5 aminoácidos de comprimento) ou CDRH2 (17 aminoácidos de comprimento) provoca suficiente interrupção para permitir a secreção de cadeia pesada, mas somente quantidades muito pequenas de anticorpo intacto, inclusive se a cadeia leve tem sua sequência nativa. Isto mostra que a estrutura secundária é importante para emparelhamento de cadeias pesadas e leves. A incorporação de qualquer epitopo dentro de CDRLl da cadeia leve da como resultado um baixo nivel de secreção da cadeia leve, inclusive se somente existe um epitopo simples incorporado na CDRH3 da cadeia pesada.
Pretende-se que "epitopo de linfócitos T heterólogo" signifique um epitopo de linfócitos T que é heterólogo para o anticorpo. Por exemplo, um epitopo de linfócitos T heterólogo pode ser um que não estava previamente presente no anticorpo. 0 epitopo de linfócitos T heterólogo pode ser inserido completo, embora possa ser composto de uma sequência de aminoácidos inserida, juntamente com aminoácidos flanqueantes da segunda parte. Isto é para assegurar que o epitopo inserido tem um perfil de processamento similar no ácido nucleico heterólogo ao do antigénio original.
Surpreendentemente os inventores descobriram que, quando são inseridos epitopos de linfócitos T em regiões CDR ou não CDR estruturalmente confinadas da cadeia pesada, proporcionam respostas de CTL superiores. Isto parece ser devido à secreção de grandes quantidades de cadeia pesada, que somente podem ser associadas debilmente com cadeia leve devido à inserção de epitopos volumosos em suas regiões variáveis. Isto é contrário ao dogma, que indica "que somente as proteínas utilizadas de forma endógena por células apresentadoras de antigénios apresentam-se em moléculas de MHC de classe I e são reconhecidas por CTL", documento WO 96/19584. A captação de antigénio exógeno e apresentação em MHC de classe I é um processo conhecido como apresentação cruzada e habitualmente requer captação por meio de 13 receptores específicos. Este poderia ser o receptor de CD64 para anticorpos Fcyl humanos. No entanto, seria previsível que grandes quantidades de anticorpo intacto ou complexos de antigénio-anticorpo seriam melhores na direcção a este receptor. Pelo contrário, os resultados apresentados no presente documento claramente mostram que niveis muito baixos de anticorpo intacto e grandes quantidades de cadeia pesada livre, que não se deveriam ligar a CD64, proporcionam respostas de CTL superiores. De facto, mostram-se no presente documento que as respostas de CTL podem ser estimuladas quando são inseridos epítopos de CTL em anticorpos que não se podem unir a CD64, tais como anticorpos IgG2 ou moléculas IgGl com sua região de ligação a CD64 substituída com a região que não se liga a CD64 de IgG2. 0 ácido nucleico que codifica a cadeia pesada preferivelmente inclui uma sequência líder para permitir que seja secretado. Os presentes inventores descobriram que, se a sequência líder da cadeia pesada é retirada para evitar a secreção e permitir que seja produzida mais proteína endógena, isto reduz a resposta de CTL. Isto é completamente contrário às expectativas. Sem desejar estar vinculado à teoria, os inventores acreditam que isto implica que o ácido nucleico expressa-se em células não apresentadoras de antigénios, que secretam altos níveis de cadeia pesada e baixos níveis de proteína nativa que podem depois ser captadas por células apresentadoras de antigénios. Como alternativa, o ácido nucleico pode transfectar directamente as células apresentadoras de antigénios que migram ao gânglio linfático de drenagem em que secretam baixas quantidades de proteína nativa e grandes quantidades de cadeia pesada que é captado pelas mesmas ou células apresentadoras de antigénios adjacentes e apresentam-se em MHC de classe I a CTL naive. Portanto, para que uma vacina de ácido nucleico estimule respostas de CTL eficazes, deve codificar preferivelmente epítopos de CTL dentro de uma proteína que é secretada a níveis muito baixos e/ou ao mesmo tempo secreta grandes quantidades de proteína desnaturada. No entanto, uma resposta de CTL não pode maturar a uma resposta de memória descritiva de alta afinidade na ausência de respostas auxiliares. Portanto, prefere-se se forem inseridos epítopos auxiliares T na cadeia pesada ou a molécula de imunoglobulina, preferivelmente na 14
Região variável da cadeias leves de anticorpo. De novo, surpreendentemente e ao contrário do dogma que indica que "somente as proteínas captadas de forma exógena pelas células alvo apresentam-se por moléculas do MHC de classe II e são reconhecidas por linfócitos T auxiliares", a cadeia leve foi secretada somente em quantidades muito baixas. A retirada da sequência livre para evitar a secreção da cadeia leve não teve efeito nas respostas auxiliares. Consequentemente, o ácido nucleico da presente invenção pode ou não ter uma sequência líder para a cadeia leve do anticorpo. Estes resultados implicam que o ácido nucleico é captado pelas células apresentadoras de antigénios que apresentam os epítopos de linfócitos T no contexto de MHC de classe II de proteína sintetizada de forma endógena, possivelmente por autofagia. Para que os linfócitos T auxiliares auxiliem às respostas de CTL, ambos os epítopos de linfócitos T que reconhecem devem ser apresentados nas mesmas células apresentadoras de antigénios num processo conhecido como ajuda de linfócitos T ligados. Isto implica que a célula apresentadora de antigénios que sintetiza a cadeia leve, codificada pelo ácido nucleico, também deve sintetizar, secretar e apresentar de forma cruzada os epítopos de CTL por si mesmas ou captar a cadeia pesada de uma APC adjacente. São revelados no presente documento células dendríticas isoladas que apresentam os epítopos de linfócitos T auxiliares heterólogos em MHC de classe II de cadeia leve produzida de forma endógena e epítopos de CTL heterólogos de cadeia pesada apresentada de forma cruzada. Tais células dendríticas podem ser utilizadas nas terapias descritas no presente documento.
Os ácidos nucleicos da presente invenção podem tornar os epítopos de linfócitos T existentes mais imunogénicos codificando um anticorpo desnaturalizado que leva a um aumento em tanto a frequência como a avidez de respostas de linfócitos T. 0 ácido nucleico da invenção pode ser ADN, ADNc ou ARN tal como ARNm, obtido por clonagem ou produzido completamente ou parcialmente por síntese química. Para utilização terapêutica, o ácido nucleico está preferivelmente numa forma capaz de ser expressa no sujeito a tratar. 15 0 ácido nucleico da presente invenção pode ser recombinante ou ser proporcionado como um isolado, em forma isolada e/ou purificada. Pode estar sem ou substancialmente sem ácido nucleico que flanqueie o gene no genoma humano, excepto possivelmente uma ou mais sequências reguladoras para a expressão. Quando o ácido nucleico de acordo com a invenção inclui ARN, a referência às sequências mostradas no presente documento deveria ser interpretada como referência ao ARN equivalente, com T substituída por U.
Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser preparados facilmente pelo perito na especialidade, por exemplo, utilizando a informação e referências contidas no presente documento e técnicas conhecidas na matéria (por exemplo, veja-se Sambrook, Fritsch e Maniatis, "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. e Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, 1992), dadas as sequências de ácido nucleico e clones disponíveis. Estas técnicas incluem (i) a utilização da reacção em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar amostras de dito ácido nucleico, por exemplo, de fontes genómicas, (ii) síntese química ou (iii) preparar sequências de ADNc. 0 ADN que codifica o polipéptido pode ser gerado e utilizado de qualquer maneira adequada conhecida pelos peritos na especialidade, incluindo tomando ADN codificante, identificando locais de reconhecimento de enzimas de restrição adequados a qualquer dos lados da parte a expressar e cortando a dita parte do ADN. Outra abordagem recombinante consiste em amplificar a parte relevante do ADN com iniciadores de PCR adequados. Podem ser realizadas modificações às sequências, por exemplo, utilizando mutagénese dirigida, para levar à expressão de péptido modificado ou para levar em consideração preferências a nível dos codões nas células hospedeiras utilizadas para expressar o ácido nucleico.
Com a finalidade de obter a expressão das sequências de ácido nucleico, as sequências podem ser incorporadas num vector que tenha uma ou mais sequências de controlo unidas operativamente ao ácido nucleico para controlar sua expressão. Os vectores podem incluir outras sequências tais como promotores ou potenciadores para regular a expressão do ácido nucleico inserido, sequências de ácido nucleico de modo que o polipéptido seja produzido como uma 16 fusão e/ou ácido nucleico que codifica sinais de secreção de modo que o polipéptido produzido na célula hospedeira seja secretado da célula. Se for desejado, pode ser obtido depois o polipéptido transformando os vectores em células hospedeira em que o vector é funcional, cultivando as células hospedeiras de modo que o polipéptido seja produzido e recuperando o polipéptido das células hospedeiras ou do meio circundante. São utilizadas células procariotas e eucariotas para esta finalidade na técnica, incluindo estirpes de E. coli, levedura e células eucariotas tais como células de insecto e células animais, por exemplo, células COS, CHO, Melanoma de Bowes e outras células humanas adequadas. Quando a presente invenção se refere a ácido ou ácido nucleicos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpo, os ácidos nucleicos respectivos podem estar presentes no mesmo vector de expressão, dirigidos pelos mesmos ou diferentes promotores ou vectores de expressão separados.
Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser utilizados para estimular uma resposta imune contra pelo menos um dos epitopos de linfócitos T num paciente tal como um mamífero, incluindo ser humano. As respostas de linfócitos T auxiliares e/ou citotóxicos podem ser estimuladas. A resposta de linfócitos T contra um epítopo particular obtido pela presente invenção pode ter uma maior avidez que a obtida por imunização com o mesmo epítopo como um péptido simples ou por imunização com o mesmo epítopo codificado dentro de um antigénio como um péptido ou um ácido nucleico. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser administrados como uma terapêutica de combinação, isto é, um ácido nucleico que codifica a cadeia leve e ácido nucleico que codifica a cadeia pesada. 0 ácido nucleico pode ser administrado por via intravenosa, via intradérmica, via intramuscular, via oral ou por outras vias. Prefere-se administração intradérmica ou intramuscular devido a que estes tecidos contêm células dendríticas.
Como é utilizado no presente documento, o termo "tratamento" inclui qualquer regime que possa beneficiar a um ser humano ou animal não humano. 0 tratamento pode ser de uma doença herdada ou adquirida. Preferivelmente, o tratamento é de uma afecção/distúrbio associado com proliferação celular tal como 17 cancro ou doença infecciosa. Os exemplos de tipos de cancro que podem ser tratados com o ácido nucleico incluindo qualquer tumor sólido, cancro colorrectal, tumores de pulmão, mama, gástrico, de ovário, uterino, de fígado, de rim, pancreático, melanoma, de bexiga, de cabeça e pescoço, cerebral, esofágico, pancreático e de osso, assim como cancros de tecido mole e leucemias. 0 ácido nucleico pode ser utilizado em combinação com um portador ou portadores farmaceuticamente aceitáveis. Tais portadores podem incluir, mas sem limitação, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, lipossomas, água, glicerol, etanol e combinações dos mesmos.
Podem ser utilizados adjuvantes para facilitar a estimulação da resposta imune do hospedeiro e podem incluir hidróxido de alumínio, lisolecitina, pluronic, polióis, polianiões, péptidos, proteínas e emulsões em óleo.
Os ácidos nucleicos úteis na invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas. Estas composições podem compreender, além de uma das substâncias anteriores, um excipiente, portador, tampão, estabilizador farmaceuticamente aceitável ou outros materiais bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Tais materiais deveriam ser não tóxicos e não deveriam interferir com a eficácia do princípio activo. A natureza exacta do portador ou outro material pode depender da via de administração, por exemplo, vias intradérmica, oral, intravenosa, cutânea ou subcutânea, nasal, intramuscular, intraperitoneal. A formulação é preferivelmente ácido nucleico como um pó seco estável precipitado na superfície de partículas de ouro microscópicas e adequado para injecção por meio de uma pistola génica. A formulação pode ser adequada para administração intradérmica ou intramuscular utilizando electroporação.
As composições que compreendem, ou para distribuição de, ácidos nucleicos são administradas preferivelmente a um indivíduo numa "quantidade terapeuticamente eficaz", sendo suficiente esta para mostrar benefício ao indivíduo. A quantidade real administrada, e a taxa e ciclo temporal de administração, dependerá da natureza e gravidade do que é tratado. A prescrição de tratamento, por exemplo, decisões sobre a dosagem etc., está dentro da responsabilidadr dos facultativos generais e outros 18 doutores em medicina e tipicamente leva em consideração o distúrbio a tratar, a condição do paciente individual, o local de distribuição, o método de administração e outros factores conhecidos pelos facultativos. Os ácidos nucleicos da invenção são particularmente relevantes para o tratamento de cancro existente e na prevenção da recaída de cancro depois do tratamento inicial ou cirurgia. Os exemplos das técnicas e protocolos mencionados anteriormente podem ser encontrados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A. (ed), 1980.
Preferivelmente, o ácido nucleico da invenção estimula linfócitos T auxiliares e/ou citotóxicos que podem inibir de forma significativa o crescimento de células tumorais quando são administrados num ser humano numa quantidade eficaz. A dose óptima pode ser determinada pelos médicos com base em vários parâmetros incluindo, por exemplo, idade, sexo, peso, gravidade da afecção a tratar, o principio activo que é administrado e a via de administração. Por exemplo, uma dose de 1-1000 μg de ADN é suficiente para estimular respostas de linfócitos T tanto auxiliares como citotóxicos.
Os ácidos nucleicos da invenção podem ser administrados juntamente com ingredientes farmaceuticamente aceitáveis adicionais. Tais ingredientes incluem, por exemplo, estimuladores do sistema imune.
Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, simultaneamente ou sequencialmente dependendo da afecção a tratar. Outros tratamentos de cancro incluem outros anticorpos monoclonais, outros agentes quimioterapêuticos, outras técnicas de radioterapia ou outra imunoterapia conhecida na matéria. Uma aplicação particular das composições da invenção é como um auxiliar para cirurgia, isto é para ajudar a reduzir o risco de reaparição de cancro depois de que tenha sido retirado um tumor.
As injecções (id) podem ser a via primária para administração terapêutica do ácido nucleico da presente invenção.
Os ácidos nucleicos podem ser administrados de uma maneira localizada a um local tumoral ou outro local desejado ou podem ser distribuídos de uma maneira em que se dirijam a tumor ou outras células. 19 A dose de ácido nucleico dependerá das propriedades do agente utilizado, por exemplo, sua actividade de união e semivida em plasma in vivo, a concentração do polipéptido na formulação, a via de administração, o local e a taxa de dosagem, a tolerância clinica do paciente implicado, a afecção patológica que aflige o paciente e similares, como está dentro da experiência do médico. Por exemplo, preferem-se doses de 100 μρ de ácido nucleico por paciente por administração, embora as dosagens possam variar de aproximadamente 10 μρ a 1 mg por dose. Ão utilizados diferentes dosagens durante uma série de inoculações sequenciais; o facultativo pode administrar uma inoculação inicial e depois reforçar com doses relativamente mais pequenas de ácido nucleico. É revelado no presente documento um procedimento para obter por engenharia genética, epítopos de linfócitos T de antigénios alvo nas regiões variáveis de anticorpos e a utilização de tais anticorpos obtidos por engenharia genética como vacinas para estimular respostas de linfócitos T tanto auxiliares como citotóxicos.
Também se revela no presente documento uma célula hospedeira que contém um ácido nucleico como é revelado no presente documento. O ácido nucleico da invenção pode ser integrando no genoma (por exemplo, cromossoma) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma de acordo com técnicas convencionais. 0 ácido nucleico pode estar num vector extracromossómico dentro da célula ou ser de outra forma heterólogo de forma identificável ou alheio à célula.
Também se revela no presente documento um método, que compreende introduzir o ácido nucleico da invenção numa célula hospedeira. A introdução, que pode (particularmente para introdução in vítro) geralmente ser denominada sem limitação "transformação", pode emplear qualquer técnica disponível. Para células eucariotas, as técnicas adequadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-Dextrano, electroporação, transfecção mediada por lipodsoma e transducção utilizando retrovirus ou outro vírus, por exemplo, vaccinia ou, para células de insecto, baculovírus. Para células bacterianas, as técnicas adequadas podem incluir transformação com cloreto de cálcio, 20 electroporação e transfecção utilizando bacteriófago. Como alternativa, pode ser utilizada injecção directa do ácido nucleico.
Podem ser utilizados genes marcadores tais como genes de sensibilidade ou resistência a antibióticos na identificação de clones que contêm o ácido nucleico de interesse, como conhece-se bem na técnica. A introdução pode ser seguida provocando ou permitindo a expressão do ácido nucleico, por exemplo, cultivando as células hospedeira (que podem incluir células de facto transformadas, embora mais provavelmente as células serão descendentes das células transformadas) em condições para a expressão do gene, de modo que é produzido o polipéptido (ou péptido) codificado. Se o polipéptido expressa-se acoplado a um péptido lider de sinal apropriado, pode ser secretado da célula ao meio de cultivo. Após a produção por expressão, pode ser isolado um polipéptido ou péptido e/ou ser purificado da célula hospedeira e/ou meio de cultivo, conforme seja o caso, e posteriormente ser utilizado como for desejado, por exemplo, na formulação de uma composição que pode incluir um ou mais componentes adicionais, tal como uma composição farmacêutica que inclui um ou mais excipientes, portadores ou veículos farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, veja-se posteriormente).
Revela-se no presente documento um método para identificar epitopos de linfócitos T num antigénio candidato, que compreende: esgotar os linfócitos T reguladores num animal não humano; imunizar ao animal não humano com um antigénio candidato; e explorar para ver se foi induzida uma resposta de linfócitos T contra péptidos para epitopos previstos no antigénio candidato ou todos os péptidos sobrepostos possíveis dentro do antigénio candidato. 0 procedimento pode ser levado a cabo a cabo num animal não humano, tal como um ratinho ou uma rato. Os linfócitos T reguladores podem ser eliminados no animal não humano utilizando anticorpos anti-CD25, que opcionalmente podem ser conjugados com toxinas tais como Ontak, ou por quimioterapia tal como ciclofosfamida que preferivelmente mata linfócitos T reguladores. Uma vez que foram esgotados os linfócitos T reguladores, o animal 21 não humano pode ser imunizado com ADN que codifica o antigénio candidato ou por meio do antigénio candidato em si mesmo. Prefere-se que o antigénio candidato seja proporcionado como uma proteína de fusão de Fc-antigénio. Na etapa de exploração, identifica-se o péptido contra o que foi estimulada qualquer resposta de linfócitos T no animal não humano. Isto pode ser realizado in vítro utilizando uma técnica tal como ELISPOT. Se for induzida uma resposta de linfócitos T a um epítopo candidato, este epítopo pode ser utilizado para imunizar um animal não humano. Se este péptido induzir uma resposta de linfócitos T, a avidez e frequência pode ser potenciada codificando o epítopo dentro de um ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Este método pode permitir a identificação de epítopos de linfócitos T que são processados pelo imunoproteasoma. A invenção será descritas agora adicionalmente nos seguintes exemplos não limitativos. É feita referência aos seguintes desenhos:
Figura 1; Mapa que representa os elementos do vector de cadeia pesada pOrigHIB. A região variável pesada desimunizada de tipo selvagem do anticorpo SC100 foi clonada utilizando HindIII/Afel in frame com a região constante de Fc de IgGl humana. A região Fc compreende os domínios CHI, CH2, CH3 e a região dobradiça. A expressão a alto nível em células de mamífero é dirigida a partir do promotor precoce imediato de citomegalovírus humano. A poliadenilação de BGH sinaliza a jusante da cadeia de IgGl humana HIB Orig para assegurar a estabilidade do ARNm e sua terminação eficaz. EM7 é um promotor bacteriano que controla a expressão do gene de resistência a zeocina que permite a selecção por antibióticos em E. coli enquanto que o promotor precoce de SV40 a montante do gene de resistência permite a selecção em células de mamífero. A poliadenilação de SV40 sinaliza a jusante do gene de resistência para dirigir o processamento apropriado da extremidade 3' do ARNm zeo. 0 vector também contém dentro de sua cadeia principal a origem ColEl de replicação para propagação em bactérias. As sequências de ADN determinantes de complementaridade foram retiradas eficazmente e foram mudadas por locais de restrição REI, RE2 e RE3 (FspI, MacI e Srf I respectivamente) de forma simples e em combinação. 22
Figura 2: Mapa que representa os elementos do vector de cadeia pesada pOrigLIB. A região variável leve desimunizada de tipo selvagem do anticorpo SC100 foi clonada utilizando BamHI/BsiWI in frame com a região constante kappa humana. A expressão de alto nível em células de mamífero é dirigida desde o promotor precoce imediato de citomegalovirus humano. A poliadenilação de BGH sinaliza a jusante da cadeia de Orig LIB para assegurar a estabilidade do ARNm e sua terminação eficaz. 0 vector também inclui a origem de replicação ColEl e o gene de resistência a antibióticos para ampicilina que permite a propagação e selecção em bactérias. As regiões determinantes de complementaridade foram retiradas eficazmente e foram mudadas pelos locais de restrição RE4, RES e RE6 (EcoRV, Ssp I e Hpa I FspI, MacI e Srf I respectivamente) de forma simples e em combinação.
Figura 3: Sequência da cadeia pesada quimérica de Immunobody de tipo selvagem. A sequência de nucleótidos e de aminoácidos em tradução é ilustrada para a cadeia pesada de IgGl quimérica de comprimento completa. As localizações CDR estão dentro de caixas definidas pelo esquema de numeração de kabat. 0 codão de parada é representado por um asterisco vermelho. Destacam-se os locais de restrição de HíndIII/Afe I utilizados na transferência da região pesada variável.
Figura 4: Sequência da cadeia kappa quimérica de Immunobody de tipo selvagem. São ilustradas as sequências de nucleótidos e de aminoácidos em tradução para a cadeia de kappa quimérica de comprimento completa. As localizações de CDR estão dentro de caixas definidas pelo esquema numérico de kabat. 0 codão de parada é representado por um asterisco. Destacam-se os locais de restrição de BamHIlBsiVJI utilizados na transferência da região leve variável.
Figura 5: PCR de extensão sobreposta
Foram retiradas as CDR e foram substituídas com locais de restrição únicos por meio de PCR sobreposta. Os iniciadores directos Hl, H2, H3, Ll, L2 e L3 (Quadro 2) foram desenhados para substituir CDR1, 2 e 3 dentro da Região variável da cadeia pesada e leve respectivamente. Cada iniciador continha, localizado de forma central, a sequência de reconhecimento enzimático única seleccionada desprovida da sequência CDR a retirar (secção verde) 23 e flanqueada por 10-20 pb de sequência de tipo selvagem. Os iniciadores directos foram utilizados num primeiro ciclo de PCR juntamente com um iniciador reverso geral, huHeClonR ou huLiClonR (Quadro 2), que híbrida com os domínios constantes pesados e leves humanos dentro das construções de tipo selvagem pOrigHIB e pOrigLIB respectivamente. 0 fragmento gerado não contém sequência CDR de tipo selvagem (secção vermelha), mas se intercambia eficazmente pelo local de restrição. Para amplificar a região pesada e leve variável completa, é requerido um segundo ciclo de PCR utilizando o produto de PCR gerado do primeiro ciclo como um iniciador reverso com o iniciador directo de CMV geral que híbrida com o promotor de CMV dentro dos plasmídeos simples. Foram subclonados produtos de PCR de segundo ciclo em pCR 2,1 (Invitrogen) e, depois da confirmação da sequência, as regiões variáveis pesada/leve (VH e VL) que continham versões Hl, H2, H3,
Ll, L2 e L3 de forma simples, em combinação e juntas foram inseridas de novo nas construções simples pOrigHIB e pOrigLIB, permutando as regiões de tipo selvagem utilizando HindIII/Afel e BamHI/BsiWI respectivamente.
Figura 6 : Sequência da Região variável da cadeia pesada de ImmunoBody. Sequência de nucleótidos e aminoácidos da região variável pesada em que as CDR foram substituídas com seu local de enzima correspondente Hl, H2 e H3, de forma simples, em combinação e juntos. Destacam-se os locais de enzima de restrição únicos. CDR1, 2 e 3 foram substituídas com Fspl, Msc I e Srf I respectivamente.
Figura 7: Sequência da Região variável da cadeia kappa de ImmunoBody. Sequência de nucleótidos e aminoácidos da região variável pesada em que as CDR foram substituídas com seu local de enzima correspondente Ll, L2 e L3, de forma simples, em combinação e juntos. Destacam-se os locais de enzima de restrição únicos. CDR1, 2 e 3 foram substituídas com FcoRV, Ssp I e Hpa I respectivamente.
Figura 8: Mapa que representa os elementos do vector de expressão duplo pDCOrig. Uma vez que todos os epítopos foram incorporados nos locais pesados variáveis e leves variáveis dentro dos vectores simples, são transferidos ao vector de expressão duplo utilizando como se destaca HindIII/Afel e BamHI/BsiWI em 24
quadro com suas regiões constantes humanas respectivas. A região Fc da cadeia pesada compreende os domínios CHI, CH2, CH3 e a região dobradiça. A expressão de alto nível das cadeias tanto pesadas como leves em células de mamífero é dirigida desde o promotor precoce imediato de citomegalovirus humano. A
poliadenilação de BGH sinaliza a jusante de ambas cadeias para assegurar a estabilidade do ARNm e sua terminação eficaz. EM7 é um promotor bacteriano que controla a expressão do gene de resistência a zeocina permitindo a selecção por antibióticos em E. coli enquanto que o promotor precoce de SV40 a montante do gene de resistência permite a selecção em células de mamífero. A poliadenilação de SV40 sinaliza a jusante do gene de resistência com a finalidade de dirigir o processamento apropriado da extremidade 3' do ARNm zeo. 0 vector também contém dentro de sua cadeia principal a origem ColEl de replicação para propagação em bactérias.
Figura 9: Sequência da cadeia pesada de IB15 de immunobody que contém um codão de parada que evita a síntese da região Fc.
Sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia pesada quimérica, pDCOrig IB15 CHI parada. Foi inserido um codão de parada por mutagénese dirigida depois do domínio CHI da região constante de Fc de IgGl humana como é representado por um asterisco. Os nucleótidos e aminoácidos em negrito representam o domínio CHI. Os aminoácidos dentro de caixas representam o epítopo GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) e o epítopo TRP2 em H2 (SVYDFFVWL) . Destacam-se os locais de restrição de HindIII/Afe I utilizados na transferência da região pesada variável da construção simples.
Figura 10: Sequência de nucleótidos e aminoácidos da região variável pesada de DCIB15 sem um líder. O líder é retirado por meio de PCR utilizando o iniciador directo pOrig pesado sem líder com o iniciador reverso huHeClonR (Quadro 2) que se une ao domínio CHI de IgGl humana reamplifiçando eficazmente a região variável pesada (VH) . Depois de confirmação de sequência, a região VH sem líder é clonada de novo na construção de expressão dupla DCIB15 utilizando HindII/Afel in frame com a região constante de IgGl humana. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) e o epítopo 25 TRP2 em H2 (SVYDFFVWL). Os locais de restrição HindIII/Afe I utilizado na transferência da região variável pesada destacam-se.
Figura 11: Sequência de nucleótidos e aminoácidos da região variável kappa de DCIB15 sem um lider. 0 lider foi retirado por meio de PCR utilizando o iniciador directo pOrig leve sem lider, reamplifiçando o iniciador reverso huLiClonR (Quadro 2) a região variável leve (VL) . Depois da confirmação de sequência, a região VL sem lider é clonada de novo na construção de expressão dupla DCIB15 utilizando BamRI/BsiWI in frame com a região constante kappa humana. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de HepB CD4 em Li (TPPAYRPPNAPIL). Destacam-se os locais de restrição de BamRI/BsíWII utilizados na transferência da região leve variável.
Figura 12: Sequência de região constante de IgG2 humana Sequência de nucleótidos e aminoácidos da região constante de
IgG2 humana pesada amplificada. Destacam-se os locais de restrição
AfeI e SapI utilizados na transferência e substituição da região constante de huigGl no vector de expressão duplo DCIB15.
Figura 13: Sequência de região constante de IgG3 humana Sequência de nucleótidos e aminoácidos da região constante de
IgG2 humana pesada amplificada. Destacam-se os locais de restrição de Afe I e SapI utilizados na transferência e substituição da região constante de huigGl no vector de expressão duplo DCIB15
Figura 14: Isotipos humanos do vector de expressão duplo de immunobody. A Mapa do vector de expressão duplo pDC0rigIB15 huigG2. B Mapa do vector de expressão duplo pDCOrigIB15huigG3. Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afel e Bamhl / BsiVII utilizados na transferência da região pesada e leve variável.
Figura 15: Sequência de cadeia pesada de DCIB66 que contém o motivo G2. Sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia pesada quimérica. Os aminoácidos E233 L234 L235 dentro de um motivo de união critico para a interacção com o FcyRl de alta afinidade (CDR64) foram substituídos com P233 V234 A235 de IgG2 humana destacada em negrito dentro de uma caixa. Outros aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) e o epítopo de TRP2 em H2 (SVYDFFVWL) . 26
Os locais Agel/Ahdl destacados foram utilizados na transferência da secção que contém as substituições a pDC0rigIB15 huigGl. Os locais de restrição Hindlll/Afel utilizados na transferência da região pesada variável se representam em negrito.
Figura 16: Sequência de cadeia pesada de DCIB67 que contém o motivo de união G1. Sequência de nucleótidos e aminoácidos da cadeia pesada quimérica. Os aminoácidos P233 V234 A235 dentro da região constante de IgG2 humana foram substituídos com o motivo de união crítico para interacção com o FcyRl de alta afinidade (CDR64) E233 L234 L235 G236 de IgGl humana destacadas em negrito dentro de uma caixa. Outros aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) e o epítopo de TRP2 em H2 (SVYDFFVWL).
Os locais Agel/Ahdl destacados foram utilizados na transferência da secção que contém as substituições a pDC0rigIB15 huigGl. Os locais de restrição Hindlll/Afel utilizados na transferência da região variável pesada se representam em negrito.
Figura 17: Vectores de expressão de Immunobody de IgG2a murina. Mapas de (A) vector pMoOrigHIB de cadeia simples, (B) vector de expressão duplo DCIB53 que contém o epítopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV), o epítopo de TRP2 em H2 (SVYDFFVWL) e o epítopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL) e (C) vector de expressão duplo OGIB63 que contém o epítopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) em Hl, o epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H2 e o epítopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR4 em H3 (WNRQLYPEWTEAQRLO). Representam-se os locais de restrição utilizados.
Figura 18: Diagrama esquemático para representar a construção do plasmídeo conforme regulador pVAXDCIB54. 0 vector de cadeia simples pesado pVaxIB54 HIB (A) foi linearizado utilizando Nrul. 0 cassete de expressão de cadeia leve de pOrgLIB (B) foi excisado utilizando Nrul e Hpal e foi clonado no plasmídeo linearizado para gerar o vector de expressão duplo pVaxDCIB54 (C). Destacam-se os locais de restrição Hindlll/Afe 1 e BamHl/BsiWI utilizados na transferência de região variável pesada e leve.
Figura 19: Sequência de DCIB15 27
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epitopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) , o epitopo de TRP2 em H2, (SVYDFFVWL) e o epitopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamHl/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 20: As construções de ImmunoBody produzem níveis baixos de proteína intacta. A, quantificação do nível de cadeia pesada de ImmunoBody por meio de ELISA de tipo sanduíche do sobrenadante de células CHO-S transfectadas com ImmunoBody que contêm gplOO/Hl, TRP2/H2 e HepB CD4/L1 (DCIB15). Foi utilizado sobrenadante puro e diluiu-se 1 em 3, 1 em 10 e 1 em 30 em meio e foi comparado com um controlo positivo de IgG humana. B, análise de ImmunoBody purificado que contém gplOO/Hl, TRP2/H2 e HepB help/Ll (DCIB15) por meio de ELISA de tipo sanduíche em comparação com um controlo positivo. C e D. Determinação da expressão de cadeia pesada e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S por meio de ELISA de tipo sanduíche. As placas foram revestidas com um anticorpo específico anti-Fc humano. Para detectar a cadeia pesada foi utilizado um anticorpo de HRP específico anti-Fc de IgG humana e para detectar o ImmunoBody intacto foi utilizado um anticorpo de HRP especifico anti-cadeia kappa humana. E, determinação de cadeia pesada, cadeia leve e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S (DCIB15, DCI831. DCIB32, DCIB36, DCI848, DCIB49. DCIB52, DCIB54) por meio de ELISA de tipo sanduíche. Foram revestidas placas com um anticorpo específico anti-Fc humano ou anticorpo anti-cadeia kappa humano. Para detectar a cadeia pesada foi utilizado um anticorpo de HRP específico anti-Fc de IgG humana em combinação com o anticorpo de revestimento específicos anti-Fc humano. Para detectar o ImmunoBody intacto foi utilizado um anticorpo de HRP específico anti-cadeia kappa humana em combinação com anticorpo de revestimento especifico anti-Fc humano. Para detectar a cadeia leve foi utilizado anticorpo de HRP específico 28 anti-cadeia kappa humana em combinação com o anticorpo especifico anti-cadeia kappa humana.
Figura 21: Sequência de DCIB24
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de ovoalbumina em H2 (SIINFEKL) e o epítopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL).
Destacam-se os locais de restrição HíndIII / Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 22 Sequência de DCIB25
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões pesadas e leves variáveis clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) , o epítopo de TRP2 em H2 (SVYDFFVWL) e o epítopo de HepB CD4 em L3 (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição Hindi 11/Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 23: Sequência de DCIB31
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H3. Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 24: Sequência de DCIB32
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H3 e o epítopo de HepB CD4 em L3 (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição HíndIII/Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples. 29
Figura 25: Sequência de DCIB36
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em L3. Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamEI /Bsi¥ll utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 26: Sequência de DCIB48
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epitopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H2 e o epítopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR4 em H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamEI/Bsi¥II utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 27: Sequência de DCIB49
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) em H3. Destacam-se os locais de restrição
HindIII/Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 28: Sequência de DCIB52
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H2 e o epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) em H3. Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamEI/BsiVII utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 29: Sequência de DCIB54
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os 30 aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) em Hl. O epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H2 e o epítopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR4 em H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamRI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 30: Sequência de DCIB18
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de TRP2 em H2 (SVYDFFVWL) e o epítopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL).
Destacam-se os locais de restrição HindIII / Afe I e Bamtil / BsiVH. utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 31: os epítopos de CTL incorporados na armação de
ImmunoBody são processados e apresentam-se para induzir uma resposta imune in vivo. A, ratinhos C57BI/6 foram imunizados nos dias 0, 7 e 14 com uma construção de ImmunoBody que continha o epítopo de TRP2 em CDR H2 e o epítopo de HepB CD4 em CDR LI (DCIB18) . O dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2, péptido auxiliar de HepB e um controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, os esplenócitos dos ratinhos imunizados foram ensaiados com respeito a avidez para o epítopo de TRP2 medindo as respostas a concentração crescente de péptido em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % da função efectora máxima. C, foram esgotados os linfócitos T CD8 de esplenócitos de ratinhos imunizados e foram analisados contra péptido TRP2, péptido auxiliar HepB e um controlo de meio com respeito à presença de respostas específicas de epítopo no ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. 31 D, citotoxicidade de esplenócitos de ratinhos imunizados num ensaio de libertação de 51Cr de quatro horas contra as linhas celulares de melanoma B16F10, B16F10 IFNa e B16F10 siKb depois de 6 dias de estimulação com péptido TRP2 in vitro. E, ratinhos transgénicos C57BI/6 ou HLA-DR4 foram imunizados nos dias 0, 7 e 14 com ADN de ImmunoBody (DCIB15, DCIB31, DCIB32, DCIB36, DCIB48, DCIB52 e DOB54). O dia 19 os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2 e controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. F, foram ensaiados os esplenócitos de ratinhos imunizados com respeito a avidez para o epitopo de TRP2 medindo as respostas a concentração crescente de péptido em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. G, ratinhos transgénicos C57BI/6 ou HLA-DR4 foram imunizados nos dias 0, 7 e 14 com ADN de ImmunoBody (DCIB15, DCIB31, DCIB32, DCIB36, DCIB48, DCIB52 e DOB54) . No dia 19 os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido auxiliar HepB (DOB15, DCIB49 e DCIB52) ou péptido auxiliar gpl 00DR4 (DCIB48 e DCIB54) e um controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Figura 32: A imunização com ADN de ImmunoBody é melhor que a imunização com péptidos ou imunização com antigénio completo. A, foi comparada a imunização com ADN de ImmunoBody (misturas DOB18) com a imunização s.c. com epitopo peptídico em adjuvante incompleto de Freund ou imunização com um ADN que expressa antigénio de TRP2. Foram imunizados ratinhos C57BI/6 nos dias 0, 7 e 14 e no dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2 (), péptido auxiliar HepB (SÉ) e um controlo de meios (□) . As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, foram ensaiados os esplenócitos de ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody (0) e péptido (♦) com respeito a avidez para o epitopo de TRP2 medindo as respostas a concentração crescente de péptido em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas 32 como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. C, citotoxicidade de esplenócitos de ratinhos imunizados num ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas contra as linhas celulares de melanoma B16F10 () , B16F10 IFNa (Ê) e B16F10 siKb (□) depois de 6 dias de estimulação com péptido TRP2 in vitro. D, foi comparada a imunização com ADN de ImmunoBody (DCIB18) com a imunização com DC pulsadas com péptido TRP2. Foram imunizados ratinhos C57BI/6 nos dias 0, 7 e 14 e no dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra quantidades de titulação de péptido TRP2. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. E, foi comparada a imunização com ADN de ImmunoBody (DCIB18) com a imunização com DC pulsadas com péptido TRP2. Foram imunizados ratinhos C57BI/6 nos dias 0, 7 e 14 e no dia 19 os esplenócitos foram estimulados in vitro com blastos de LPS pulsados com péptido TRP2. Seis dias depois da estimulação foram avaliadas as linhas de CTL por meio de ensaio de libertação de cromo com respeito à capacidade para lisar linhas de melanoma B16F10 ou B16F10 siKb. As respostas foram medidas como % de citotoxicidade. F, foi comparada a imunização com ADN de ImmunoBody (DCIB24) com a imunização com péptido SIINFEKL. Foram imunizados ratinhos C57BI/6 nos dias 0, 7 e 14 e no dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido SIINFEKL e um péptido de controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. G, foi comparada a imunização por ADN de ImmunoBody (DCIB15) com a imunização com péptido gplOO 210M. Foram imunizados ratinhos HHDII nos dias 0, 7 e 14 e no dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra quantidades de titulação de péptido gplOO 210M e um controlo. Foram medidas as respostas de controlo como pontos/milhões de esplenócitos. H, foi comparada a imunização com ADN de ImmunoBody (DCIB24) com a imunização com péptido SIINFEKL. Foram imunizados ratinhos 33 C57BI/6 nos dias 0, 7 e 14 e no dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra quantidades de titulação de péptido SIINFEKL. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. I, foi comparada a imunização com ADN de ImmunoBody (DCIB15) com a imunização com péptido gplOO 210M. Foram imunizados ratinhos HHDII nos dias 0, 7 e 14 e no dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra quantidades de titulação de péptido gplOO 210m. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima.
Figura 33: Sequência de DCIB21
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões pesadas e leves variáveis clonadas ín frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epitopo de HepB S Ag TRP2 em H2 (IPQSLDSWWTSL) e o epitopo Flu HA CD4 restringido com I-Ad em LI (FERFEIFPLE). Destacam-se os locais de restrição Hindi 11 / Afe I e BamRI / BsiYII utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 34: epítopos múltiplos podem ser processados a partir do local CDR H2. A, foram imunizados ratinhos C57BI/6 nos dias 0, 7 e 14 com construção de ImmunoBody que continha epitopo SIINFEKL em CDR H2 e epitopo HepB CD4 em CDR LI (DCIB24). No dia 19 foram analisados os esplenócitos em ensaio de elispot de IFNy contra péptido SIINFEKL, um péptido irrelevante, péptido HepB CD4 e controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, foram imunizados ratinhos Balb/c nos dias 0, 7 e 14 com
construção de ImmunoBody que continha epitopo de HepB CDB em CDR H2 e epitopo de Flu HACD4 em CDR LI (DCIB21) . No dia 19 foram analisados os esplenócitos em ensaio de elispot de IFNy contra péptido HepB CD8, um péptido irrelevante, péptido Flu HA CD4 e controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. 34
Figura 35: Sequência de 0CIB17
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epitopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) e o epitopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 36: Sequência de DCIB26
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões pesada e leve variáveis clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epitopo de Tie-2 Z84 em Hl (FLPATLTMV) e o epitopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição HindIII / Afe I e BamHI / Bsi¥!I utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 37: Podem ser processados múltiplos epítopos de CTL da região variável. A, foram imunizados ratinhos HHDII nos dias 0, 7 e 14 com construção de ImmunoBody que continha epitopo de gyplOO IMDQVPFSV em CDR Hl com retirada de parte do armação e epitopo de HepB CD4 em CDR LI (DCIB17) . No dia 19 foram analisados os esplenócitos em ensaio de elispot de IFNy contra péptido de gplOO IN1DQVPFSV, péptido HepB CD4 e controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, foram imunizados ratinhos HHDII nos dias 0, 7 e 14 com construção de ImmunoBody que continha epitopo de Tie2 em CDR Hl com retirada de parte da região framework e epitopo de HepB CD4 em CDR LI (DCIB26) . No dia 19 foram analisados os esplenócitos em ensaio de elispot de IFNy contra péptido Tie2, péptido HepB CD4 e controlo de meios. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Figura 38: Podem ser geradas respostas de CTL múltiplos de diferentes epítopos dentro da mesma construção de ImmunoBody. Oepítopo de gplOO IMDQVPFSV restringido por HLA-A2 foi obtido por engenharia genética no local CDR Hl juntamente com o epitopo de 35 TRP2 SVYDFFVWL em CDR H2 e o epítopo de HepB CD4 estava presente no local CDR LI (DCIB15). A, foram imunizados ratinhos HHDII nos dias 0, 7 e 14 com ADN de ImmunoBody. No dia 19 foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido gplOO, péptido TRP2, péptido auxiliar HepB e um controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, foram ensaiados esplenócitos de ratinhos imunizados com respeito a avidez para o epítopo de gplOO modificado IMDQVPFSV (♦), epítopo de gplOO wt ITDQVPFSV (A) e epítopo TRP2 () medindo as respostas a concentração de péptido crescente em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. C, citotoxicidade dos esplenócitos de ratinhos imunizados num ensaio de libertação de 51Cr de 4 horas contra linfócitos T2 pulsados com péptido gyplOO IMDQVPFSV, péptido TRP2 ou controlo e as linhas celulares de melanoma B16F10 e B16F10 HHD. D, foram imunizados ratinhos HHDII nos dias 0, 7 e 14 com ADN de ImmunoBody que continha 1) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR LI (DCIB15) ou ii) epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR LI (DCIB18) . No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido gplOO () , péptido TRP2 (ϋ) , péptido auxiliar HepB (SÉ) e um controlo de meio (□) . As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. E, foram imunizados ratinhos C57BI/6 i.m. com 10 μρ de solução de ADN combinada com electroporação. Foram realizadas imunizações três vezes a intervalos semanais nos músculos tibiais. Os ratinhos foram imunizados com DCIB24 ou OCIB18 somente, ambos combinados no mesmo local ou com ambos ao mesmo tempo mas em locais separados. No dia 19 foram analisados os esplenócitos com respeito à presença de respostas imunes específicas de péptido de TRP2, SIINFEKL. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Figura 39: Sequência de DCIB37
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis leves e pesadas clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os 36
aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100 F7L em Hl (TITDQVPLSV) e o epítopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição HindIII / Afe I e BamHI / BsiVII utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 40: Sequência de DC1840
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões pesadas e leves variáveis clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os
aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100 F71 em Hl (TITDQVPISV) e o epítopo de HepB CD4 em Ll (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 41: Sequência de DGIB41
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes Fc e kappa de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de tipo selvagem de GP100 em Hl (TIMDQVPFSV) e o epítopo de HepB CD4 em Ll (TPPAYRPPNAPIL). Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamRI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 42: Sequência de DCIB42
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100 F7Y em Hl (TITDQVPYSV) e o epítopo de HepB CD4 em Ll (TPPAYRPPNAPIL) . Destacam-se os locais de restrição HindIII / Afe I e Bamtil/BsiVII utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 43: Sequência de DCIB43
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100 V5L em Hl (TITDQLPFSV) e o epítopo de HepB CD4 em Ll (TPPAYRPPNAPIL) . 37
Destacam-se os locais de restrição de Hindi 11 /Afe I e BamHI / BsiVII utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 44: A modificação nos resíduos não de ancoramento pode potenciar a imunogenicidade de epítopos.
Foram imunizados ratinhos HHDII nos dias 0, 7 e 14 com construções de ImmunoBody que continham epítopos de gplOO modificados na região CDR Hl (DCIB37, DCIB40, DCIB41, DCIB42 e OCIB43). No dia 19, foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido epitópico de tipo selvagem de gplOO e um controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Figura 45: Sequência de DCIB35
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões pesadas e leves variáveis clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100210M em Hl (TIMOAVPFSV) , o epítopo de TRP2 em H2 (SVYDFFVWL) e o epítopo de gplOO CD4 restringido por HLA-OR4 em LI (WPIRQLYPEWTEAQRLD). Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamRI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 46 : Múltiplas respostas auxiliares de CD4 podem ser processadas e apresentadas para induzir uma resposta imune in vivo. A, Foram imunizados ratinhos HHDII ou C57B1/6 nos dias 0, 7 e 14 com construções de ImmunoBody que continham o epítopo de HepB CD4 restringido com I-Ab na região CDR LI (DCIB15). B, foram imunizados ratinhos Balb/c nos dias 0, 7 e 14 com construção de ImmunoBody que continham o epítopo de Flu HA CD4 restringido com I-Ad na região CDR LI (DCIB21). C, foram imunizados ratinhos transgénicos HLA-DR4 nos dias 0, 7 e 14 com construções de ImmunoBody que continham o epítopo de gplOO CD4 restringido com HLA-DR4 na CDR LI (DCIB35) . No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra o péptido correspondente, um péptido irrelevante e um controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. 38 D. Foram imunizados ratinhos transgénicos HLJ-DR4 nos dias 0, 7 e 14 com construções de ImmunoBody que continham o epitopo de gyplOO CD4 restringido com HLA-CD4 na CDR LI (DCIB35) , na CDR H3 (DCIB54) e na CDR L3 (DOISSO) . No dia 19, foram analisados os esplenócitos por meio de ensaio elispot de IFNy contra o péptido correspondente, um péptido irrelevante e um controlo de meio. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Figura 47: Sequência de DCIB50
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epitopo de GP100210M (TIMDQVPFSV) em Hl, o epitopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H2 e o epitopo de gplOO CD4 restringido com HLA-DR4 (WNRQLYPEWTEAQRLD) em L3. Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamRI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 48: As respostas de linfócitos T CD8 dependem parcialmente da cadeia pesada secretada, mas as respostas auxiliares não requerem cadeia leve secretada. A, foram imunizados ratinhos HHDII no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham i) epitopo de gplOO em CDR Hl, epitopo de TRP2 em CDR H2 e epitopo de HepB CD4 em CDR LI (DCIB15), ii) epitopo de gplOO em CDR Hl, epitopo de TRP2 em CDR H2 e epitopo de HepB CD4 em CDR LI sem a sequência lider na cadeia pesada, iii) epitopo de gplOO em CDR Hl, epitopo de TRP2 em CDR H2 e epitopo de HepB CD4 em CDR LI sem a sequência lider na cadeia leve. No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptidos gplOO () e HepB CD4 (H) e um controlo de meio (□) . As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Para B, determinação de cadeia pesada, cadeia leve e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S por meio de ELISA de tipo sanduíche. As placas foram revestidas com um anticorpo específico anti-Fc humano ou anticorpo anti-cadeia kappa humana. Para detectar a cadeia pesada foi utilizado um anticorpo de HRP específico anti-Fc de IgG humana em combinação com o anticorpo de revestimiento especifico anti-Fc humano. 39 detectar o ImmunoBody foi utilizado um anticorpo de HRP especifico anti-cadeia kappa humana em combinação com anticorpo de revestimento especifico anti-Fc humano. Para detectar a cadeia leve foi utilizado anticorpo de HRP especifico de anti-cadeia kappa humana em combinação com o anticorpo especifico anti-cadeia kappa humana. C, foram imunizados ratinhos C57BI/6 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham i) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR LI (DCIB15), ii) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll sem a sequência líder na cadeia pesada. No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. D, foram imunizados ratinhos C57BI/6 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham i) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll (DCIB15), ii) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll sem a sequência líder na cadeia pesada. No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido auxiliar HepB. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Figura 49: A região Fc de ImmunoBody é benéfica para estabelecer uma resposta imune eficaz. A, foram imunizados ratinhos C57BI/6 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham i) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll (DCIB15) , ii) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll sem a região Fc. No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2 (S) , um controlo de meio (□) , a linha de melanoma B16F10 () e a linha celular de controlo negativo B16F10 siKb (¾) . As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, foram imunizados ratinhos C57BI/6 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham i) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll (DCIB15) , ii) epítopo de gyplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em 40 CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR LI sem a região Fc. No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. C, os mesmos ratinhos foram analisados com respeito a respostas especificas para o epítopo auxiliar HepB. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. D, os esplenócitos de ratinhos imunizados com DCIB15 ou DCIB15 sem a região Fc (DCIB15 FcStop) foram ensaiados com respeito a avidez para o epítopo de TRP2 medindo as respostas a concentração de péptido crescente em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. E, foram imunizados ratinhos C57BI/6 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham i) epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR LI de IgG humana (DCIB15), ii) a mesma construção com região constante de IgG2 humana (DCIB33), iii) a mesma construção com região constante de IgG3 humana (DCIB65), iv) a mesma construção com o motivo de união a IgGl humana substituído com o motivo de ligação de IgG2 humana (DCIB66) e v) DCIB33 com o motivo de ligação substituído pelo motivo de IgGl humana (DCI867). No dia 19 os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2 () , um controlo de meio (□) e o péptido auxiliar HepB (H) . As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. F, determinação de cadeia pesada, cadeia leve e ImmunoBody intacto de sobrenadante de transfectantes de CHO-S (DCIB15, DCIB33, DCIB65, DCIB66 e DCIB67) por meio de ELISA de tipo sanduíche. As placas foram revestidas com um anticorpo específico anti-Fe humano ou anticorpo anti-cadeia kappa humana. Para detectar a cadeia pesada foi utilizado um anticorpo de HRP específico de anti-Fc de IgG humana em combinação com o anticorpo de revestimento específico anti-Fc humano. Para detectar o ImmunoBody intacto foi utilizado anticorpo de HRP especifico anti-cadeia kappa humana em combinação com anticorpo de revestimento específico anti-Fc humano. Para detectar a cadeia leve foi 41 utilizado anticorpo de HRP especifico anti-cadeia kappa humana em combinação com o anticorpo especifico anti-cadeia kappa humana. G, determinação de ImmunoBody de cadeia pesada de sobrenadante de CHO-S transf ect adas com DCIB53 por meio de ELISA de tipo sanduíche. As placas foram revestidas com um anticorpo específico anti-Fc de ratinho. Para detectar a cadeia pesada foi utilizado um anticorpo de HRP específico anti-IgG2a de ratinho.
Figura 50: a imunização com ImmunoBody potência as respostas imunes e supera a regulação observada de antigénio completo. A, foram imunizados ratinhos transgénicos HLA-A2 (HHDFII) no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody DCIB15 ou antigénio gplOO completo no vector pcDNA3. No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido gplOO ou controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, nos ratinhos C57BI/6 foram esgotados as células positivas para CD25 por injecção de 400 μρ i.p. de anticorpo anti-CD25 (PCR61). Tanto os ratinhos esgotados para CD25 como os animais não esgotados foram imunizados posteriormente no dia 4, 11 e 18 com construções de ADN de ImmunoBody DCIB15 ou antigénio TRP2 completo no vector pOrig. No dia 23, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2 ou controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. C e D, os ratinhos HHDII foram deixados sem tratar (c) ou foram tratados com 400 μρ de mAb PC61 i.p., (d) . 4 dias depois, todos os ratinhos foram imunizados com a construção de ADNc Tie2 C200HFc. As imunizações de ADN repetiram-se a intervalos de 7 dias para um total de 3 imunizações. 6 dias depois da imunização final, os esplenócitos foram colhidos e estimulados de novo num ensaio de ELISPOT de IFNy ex vivo com 1 μρ/ml de cada um dos epítopos de CTL previstos de Tie-2 . As barras indicam a média dos valores em triplicata para cada ratinho individual, normalizados a controlos de fundo, representando as barras de erro o desvio tipico da média. E e F, os ratinhos HHDII foram deixados sem tratar (e) (n = 3) ou foram tratados (f) (n = 2) com 400 μρ de anticorpo PC61 i.p. Depois de 4 dias, todos os ratinhos foram imunizados com 100 μρ de péptido Z12 e 100 μρ de péptido Z48, misturados 1:1 em IFA (s.c) . 42
Foram administradas imunizações de péptidos repetidas 7 dias depois da primeira imunização com péptido. Os esplenócitos foram colhidos 14 dias depois da imunização final e estimulados de novo com péptido 212 1 μ9/πι1 (barras pretas) ou somente meio (barras abertas) num ensaio de elispot de IFNy. As barras indicam a média dos valores em triplicata representando as barras de erro o desvio típico da média. G, foram imunizados ratinhos HHDII com 100 de péptido Z12 misturado 1:1 em IFA (s.c). Foram administradas imunizações com péptidos repetidas nos dias 7 e 14 dias depois da primeira imunização com péptido. Os esplenócitos foram colhidos 7 dias depois da imunização final e foram analisados com respeito à presença de respostas específicas de epítopo a concentração de péptido crescente em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas de ratinhos individuais como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. H, foram imunizados ratinhos HHDII com construção de ADN de ImmunoBody DCIB71 por meio de pistola génica nos dias 0, 7 e 14. Foram colhidos os esplenócitos 7 dias depois da imunização final e foram analisados com respeito à presença de respostas específicas de epítopo a concentração de péptido crescente em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas de ratinhos individuais como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima.
Figura 51: Sequência de DCIB71
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões pesadas e leves variáveis clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de Tie-2 Z12 (ILINSLPLV) em Hl e o epítopo de HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) em Ll. Destacam-se os locais de restrição HindIII / Afe I e BamHI /BsiVII utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 52: Sequência de DCIB72
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões pesada e leve variáveis clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os 43 aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo Tie-2 Z12 (ILINSLPLV) em H2 e o epítopo HepB CD4 (TPPAYRPPNAPIL) em Ll. Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamHI/BsiWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 53: 0 papel de Fc xenogénico ao proporcionar ajuda de linfócitos T e o requisito de ajuda de linfócitos T específica de antigénio. A, foram imunizados ratinhos C57BI/6 ou HHDII no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody de cadeia pesada que continham epítopo de gplOO em CDR Hl ou epítopo de TRP2 em CDR H2 (IB17 e IB18 respectivamente) . No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido gplOO ou péptido TRP2 e controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B, foram ensaiados esplenócitos de ratinhos imunizados com cadeia pesada de ImmunoBody que continha epítopo de TRP2 em CDR H2 com respeito a avidez para o epítopo de TRP2 medindo as respostas a concentração de péptido crescente em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. C, foram imunizados ratinhos C57BI/6 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll de IgGl humana (DCIB15) ou epítopo de gplOO em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de HepB CD4 em CDR Ll com região constante de IgG2a murina (DCI853). No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2, péptido auxiliar HepB e controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. D, foram ensaiados esplenócitos de ratinhos imunizados com DCIB15 ou OCIB53 com respeito à avidez para o epítopo TRP2 medindo respostas a concentração de péptido crescente em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima. 44 E, foram imunizados ratinhos transgénicos HLA-DR4 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham epítopo de gpl00DR4 em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de gpl00DR7 em CDR H3 de IgGl humana (DCIB54) ou epítopo de gpl G0DR4 em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de gpl00DR7 em CDR H3 com região constante de IgG2a murina (OCIB64) . No dia 19, os esplenócitos foram analisados com ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2, péptido auxiliar gpl00DR4 e controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. F, foram ensaiados esplenócitos de ratinhos imunizados com OCIB54 ou DCIB64 com respeito a avidez para o epítopo de TRP2 medindo respostas a concentração de péptido crescente em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima.
Figura 54: Sequência de OCIB53
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das cadeias de comprimento completa pesadas e leves murinas dentro do vector de expressão pDCOrig moigG2a. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de GP100210M em Hl (TIMDQVPFSV) , o epítopo de TRP2 em H2 (SVYDFFVWL) e o epítopo de HepB CD4 em LI (TPPAYRPPNAPIL) em Ll. Destacam-se os locais de restrição Hindi 11 /Afe I e BamEI / BsiVJI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 55: Sequência de DCIB64
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das cadeias de comprimento completa murinas pesadas e leves dentro do vector de expressão pDCOrig moigG2a. 0 codão de parada é representado por um asterisco. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epítopo de gpl00 CD4 restringido por HLA-0R7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) em Hl, o epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) em H2 e o epítopo de gpl 0 0 CD4 restringido por HLA-DR4 em H3 (WNRQLYPEWTEAQRLD). Destacam-se os locais de restrição HindIII/Afe I e BamHI/BsíWI utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 56: 0 processamento de imunoproteasoma é importante na geração de respostas de epítopos dentro de construções de ImmunoBody. 45
Foram imunizados ratinhos HHDII no dia 0, 7 e 14 com construções de ImmunoBody que continham o epítopo de gplOO em CDR Hl (DCIB41) ou a versão modificada gpl00210M em CDR Hl (DCI815) . No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido gplOO209”217 ou péptido gpl00210M e controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
Figura 57: Diferentes procedimentos de imunização são eficazes na indução de respostas imunes de vacina de ImmunoBody. A, foram imunizados ratinhos C57BI/6 com ADN de ImmunoBody (OCIB15) por meio de pistola génica, i.m. + /- electroporação ou i.d. + /- electroporação nos dias 0, 7 e 14. No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2, péptido auxiliar HepB e controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos. B. Foram ensaiados esplenócitos de ratinhos imunizados por diferentes vias com respeito a avidez para o epítopo de TRP2 medindo as respostas a concentração crescente de péptido em ensaio de elispot de IFNy. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos e a avidez é designada como a concentração que proporciona 50 % de função efectora máxima.
Figura 58: A imunização com ImmunoBody induz despigmentação de tipo vitiligo e protege contra apresentação de tumores. A, os ratinhos C57BI/6 imunizados com ADN de ImmunoBody que contém o epítopo de TRP2 em CDR H2 e o epítopo deHepB CD4 em CDR LI (DCIB18) demonstram despigmentação no crescimento capilar no local de imunização. B, a ratinhos imunizados C57BI/6 foram desafiados entre a 3a e 4a imunizações 2xl04 células B16F10 IFNa i.v. Foi avaliada a carga tumoral nos pulmões aos 49 dias depois da apresentação tumoral. A carga tumoral expressa-se como uma área de tumor média como uma percentagem da área pulmonar total. Foram apresentados aos ratinhos imunizados 7 dias depois da imunização final 2xl04 células B16F10 IFNa s.c. 0 tamanho do tumor foi medido a intervalos de 3-4 dias e os ratinhos foram sacrificados uma vez que o crescimento tumoral excedeu o limite máximo permitido. C, o tamanho do tumor foi avaliado no dia 46 depois da injecção de tumor. 46 D, sobrevivência.
Figura 59: A imunização com ImmunoBody retarda significativamente o crescimento tumoral. A, ratinhos C57BI6 foram injectados com 2xl04 células 816F10 s.c. Quatro dias depois da injecção do tumor os ratinhos foram imunizados com ADN de ImmunoBody DCIB52. Foram realizadas imunizações de repetição nos dias 11 e 18 depois da injecção do tumor. A carga tumoral foi analisada a intervalos de 3-4 dias e os ratinhos foram sacrificados uma vez que o crescimento tumoral excedeu o limite máximo permitido. 0 volume tumoral ao longo do tempo foi representado. B, ratinhos C57BI6 foram injectados com 2xl04 células 816F10 IFNa s.c. Catorze dias depois da injecção do tumor os ratinhos foram imunizados com ADN de ImmunoBody DCIB52. Foram realizadas imunizações repetidas nos dias 21 e 28 depois da injecção do tumor. A carga tumoral foi analisada a intervalos de 3-4 dias e os ratinhos foram sacrificados uma vez que o crescimento tumoral excedeu o limite máximo permitido. 0 volume tumoral é mostrado no dia 47 depois do implante do tumor. C, ratinhos C57BI6 foram injectados 2xl04 células B16F10 s.c e anticorpo anti-CD25 i.p. quando era apropriado. Quatro dias depois da injecção de tumor os ratinhos foram imunizados com ADN de ImmunoBody DCIB52 ou ADN de ImmunoBody de controlo. Foram realizadas imunizações repetidas nos dias 11 e 18 depois da injecção do tumor. A imunização no dia 11 foi combinada com a injecção de anticorpo anti-CTLa-4 i.p. quando foi apropriado. Foi analisada a carga tumoral a intervalos de 3-4 dias e os ratinhos foram sacrificados uma vez que o crescimento tumoral excedeu o limite máximo permitido. 0 volume tumoral ao longo do tempo foi representado.
Figura 60: Sequência de DGIB68
Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes kappa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig. Os aminoácidos dentro das caixas representam o epitopo de gplOO CD4 restringido por HLA-OR7 (GTGRAMLGTHTMEVTVYH) em Hl e L3, os epítopos de TRP2 (SVYDFFVWL) em H2 e o epitopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR4 em H3 e LI (WNRQLYPEWTEAQRLD) . Destacam-se 47 os locais de restrição Hindi 11 / Afe I e Bamtil / Bsi¥ll utilizados na transferência da região variável pesada e leve da construção simples.
Figura 61: Podem ser geradas respostas imunes a partir de construções de ImmunoBody expressas de diferentes cadeias principais de vector.
Foram imunizados ratinhos C57BI/6 no dia 0, 7 e 14 com construções de ADN de ImmunoBody que continham epítopo de gpl00DR4 em CDR Hl, epítopo de TRP2 em CDR H2 e epítopo de gplOODR7 em CDR H3 de IgGl humana (DCIB54, Bl-3) uma construção equivalente no vector pVax (VaxDCIB54. Cl-3). No dia 19, os esplenócitos foram analisados por meio de ensaio de elispot de IFNy contra péptido TRP2 e controlo. As respostas foram medidas como pontos/milhões de esplenócitos.
EXEMPLOS Métodos
Geração de vectores de ADN
As regiões variáveis pesadas e leves murinas desimunizadas do clone de SC100 VHd VKb (documento WOOl/88138) dentro dos vectores pSVgptHuigGl e pSVhygHuCk (Biovation Ltd) foram amplificadas por meio de PCR. Os produtos de PCR da região VH e VL foram clonados in frame com as regiões constantes kappa e IgGl humanas utilizando locais HindIII/Afel e BamHl/BsiWI para produzir as construções de cadeia simples pOrigHIB e pOrigLIB (veja-se Figuras 1 e 2). A sequência da cadeia kappa e pesada quimérica de comprimento completa foi confirmada pelo procedimento de terminação de cadeia de dideoxi (Sanger et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1977; 74: 5463-7). mostram-se as sequências proteicas traduzidas e de ADN para a cadeia pesada e leve quimérica nas Figuras 3 e 4 respectivamente. Representam-se as localizações das regiões determinantes de complementaridade (CDR).
Com a excepção da região CDR2 pesada que conserva seis aminoácidos, as CDR das cadeias pesadas e leves foram retiradas completamente e foram permutadas por locais de enzima de restrição únicos. Isto foi conseguido por meio de exame cuidadoso das regiões a cada lado da sequência para uma retirada que permitirá que seja gerado um local de enzima de restrição. Estes locais de 48 restrição únicos são utilizados para abrir o ADN de modo que possa ser inserido um oligonucleótido que codifique um epítopo antigénico. A maioria das sequências flanqueadoras que são perdidas na geração de local de restrição é substituída por inclusão nos iniciadores de epítopos para assegurar que, durante a tradução, os aminoácidos sejam conservados e que as sequências sejam mantidas ín frame. 0 Quadro 1 enumera locais enzimáticos escolhidos e sequências de oligonucleótidos epitópicas para todas as CDR.
As regiões CDR foram retiradas e foram substituídas com locais de restrição únicos por meio de PCR de extensão de sobreposição (overlap extension) como é mostrado na Figura 5. Para a região variável pesada, os oligonucleótidos Hl, H2 e H3 (veja-se o Quadro 2) foram desenhados para substituir cada uma das três CDR. Cada iniciador específico contém 10-20 pb de sequência em cada lado do local enzimático a incorporar. Utilizadas juntamente com o iniciador reverso geral huHeClonR (veja-se Quadro 2) que se une à região constante de IgGl humana foram preparadas PCR de primeiro ciclo consistentes em 1 μΐ do plasmídeo molde pOrigHIB, 2 μΐ de dNTP (2,5 mM) , 5 μΐ de tampão de taq polimerase ΙΟχ, 1 μΐ de iniciador directo e inverso (25 pmoles), 5 unidades de taq polimerase (New England Biolabs) composto a um volume final de 50 μΐ com água destilada estéril. As reacções foram submetidas a uma desnaturação inicial de 5 minutos a 95 °C seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C (hibridação) e 1 minuto a 72 °C (extensão). O ciclo final continha uma extensão de 10 minutos utilizando um reactor cíclico programável Techne PHC-1. De forma similar, para a região variável leve, os oligonucleótidos Ll, L2 e L3 foram desenhados para substituir cada uma das três CDR (veja-se Quadro 2). Foram preparadas PCR de primeiro ciclo como foi descrito anteriormente mas com o iniciador reverso huLiClonR (veja-se Quadro 2) que se une à região constante da cadeia kappa humana e o molde porigLIB.
Quadro 1. Lista de enzimas de substituição de CDR e sequências de oligonucleótidos epitópicas COR Local de RE Oligo epitópico
Hl Fsp I 5'NNNNNNTGGGTTCG3 3'NNNNNNACCCAAGC5 49 COR Local de RE Oligo epitópico H2 Msc I 5'TNNNNNNCGATTCA3' 3'ANNNNNNGCTAAGT 5' H3 Srf I 5'GANNNNNNTG3' 3'CTNNNNNNAC5' Ll Eco RV 5'CTCTTGCNNNNNNTGGT3' 3'GAGAACGNMNNNNACCA5' L2 Ssp I 5'CTACNNNNNNAG3' 3'GATGNNNNNNTC5 ' L3 Hpa I 5TATTACTGCNNNNNNTTCGGTGGAGG3' 'ATAATGACGNNNNNNAAGCCACCTCC5' N representa sequência de ADN epitópica 0 resto das letras representa nucleótidos flanqueadores que necessitam ser incorporados
Foi utilizado depois 1 μΐ dos produtos de PCR resultantes numa PCR posterior como um iniciador reverso juntamente com o iniciador directo de CMV preparado como foi descrito anteriormente. 0 fragmento de ADN amplificado de 450 pb foi clonado directamente no vector de TA TOPO pCR 2,1 (Invitrogen) e os clones foram sequenciados para confirmar a amplificação da região VH e VL desprovidas das CDR e substituição de local de restrição.
As CDR dentro da região pesada e leve variável foram substituídas com seu local enzimático correspondente Hl, H2, H3, Ll, L2 e L3 de forma simples, em combinação e juntas (Figura 6 e 7) . As diferentes versões foram inseridas depois em pOrig HIB e pOrigLIB utilizando HindIII/Afel e BamHI/BsiWI com substituição directa das regiões VH e VL de SC100 desimunizadas de tipo selvagem parentais. Isto permite a geração de moléculas que contêm epítopos simples ou múltiplos (do mesmo ou diferentes antigénios).
Quadro 2 - Iniciadores
Oligonucleótido Sequência Hl Fspl 50 01igonucleótido Sequência 5'-CCT GAG AAT GTC CTG CTG CGC AGG CTC CGG GGA AG- H2 Mscl 5'CAT TGG TAG TGG TGG CCA TTT CCA GAG AC-3' H3 Srfl 5'CCG TGT ATT ACT GTG CCC GGG CCA AGG AAC CAC GGT C-3' LI EcoRV 5'-GGA GCC AGC CTC GAT ATC TGC AGA AAC CAG GC-3' L2 SspI 5'CCA CAG CTC CTA ATA TTC AGT GGC AGT GGA TC-3' L3 Hpal 5'-GCT GAG GAT ACC GGA GTT AAC CAA GGT GGA AAT C 3' huHeCronR 5'CGC CTG AGT TCC ACG ACA CC-3' huLiClonR 5'-CAG GCA CAC AAC AGA GGC-3' Directo de CMV 5'-GGC GTG GAT AGC GGT TTG AC-3' OrigstophuHeCH 1 Dir 5'-CCA AGG TTG ACA AGA AAG TTT GAC CCA AAT CTT GTG ACA OrigstophuHeCH 1 rev 5'-GAG TTT TGT CAC AAGATT TGG GTC AAA CTT TCT TGT CCA OCT TGG-3' pOrig leve sem líder 5'-AGG ATC CAC CAT GGA TGT GTT GAT GAC CC-3' Dir pOrig pesado sem líder 5'-AAA GCT TAT GCA GGT GCA GCT GGT G-3' Dir huigG3rev2 5'-ATC GAT ATC ATT TAC CCG GAG ACA GG-3' IgG3hutor2 5'-ACT GTC TCC AGC GCT TCC ACC AAG-3' IgG2 dir 5'-AGT CAC CGT TTC CAG CGC TTC CAC-3' IgG2 rev 5'-AGT GGA TAT CAT TTA CCC GGA GAC AGG-3' HIBF 5'-AAC AGT CTG AGG GOT GAG GA 3' huigGIPVA REV 5'-A GAC TGA CGG TCC CCC CGC GAC TGG AGG TGC TGG-3' HulgG2ELLGRev 5'-A GAC TGA CGG TCC TCC TAA CAG TTC TGG TGC TGG-3' Sv40premDIR 5'-A GCT AGC ATC AGC ACG TGT TGA CAA TTA ATC ATC-3' SV4 OprecnREV 5'-ACC GAT TCC GAA GCC CAA CCT TTC ATA G-3' migG2aClAfelF2 5'-TTT ACA GCG CTA AAA CAA CAG CCC CAT CGG TC-3' migG2aXbaRA 5'-TCT AGA TCA TTT ACC CGG AGT CCG GGA GAA GCT C-3' MoLCl BsiFl 5'-TTT CGT ACG GAT GCT GCA CCA ACT GTA TCC-3 ' MoLCXhoRl 5'-TTT CTC GAG TCA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC-3' MolgG2BamHI Dir 5'-CC TTG ACC TGG AAC TCT GGT TCC CTG TCC AGT GGT G-3' 51
Oligonucleótido Sequência MolgG2BamHI Rev 5'-C ACC ACT GGA CAG GGA ACC AGA GTT CCA GGT CAA GG-3' MoigG2xhol Dir 5'-GC AGC TGA GTG ACT GTA ACT TCG AGC ACC TGG CCC AGC-3' MaigG2Xhol Rev 5'-GCT GGG CCA GGT GCT CGA AGT TAC AGT CAC TGA GCT GC-3' wtkappavarLldir 5'-C TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC CTG GTA CAT AGT AAT GGA AAC ACC TATTTA GAA TGG T-3 ' wtkappavarLlrev 5Ά CCA TTC TAA ATA GGT GTT TCC ATT ACT ATG TAC CAG GCT CTG ACT AGA TCT GCA AGA G-3’ Directo de TRP2 murino 5'-TTT CTA AGC TTA TGG GCC TTG TGG GAT GGG GGC TTC-3' Reverso de TRP2 murino 5'-TTT CTG ATA TCT CAG GCT TCC TCC GTG TAT CTC TTG C-3' Directo de GP100 5'-TTT CTG ATA TCA TGG GTG TCC AGA GAA GGA GOT TC-3' Reverso de GplOO 5 r-TTT CTC TCG AGA CAG ACC TGC TGT CCA CTG AGG AGC-3'
Inserção de epítopos antigénicos em locais COR de vectores de cadeia simples. São enumerados vários epítopos de CTL CD8 e auxiliares CD4 no quadro, 3, embora possa ser inserido facilmente qualquer epítopo em qualquer dos locais dentro dos vectores de cadeia simples. Por exemplo, a inserção do epítopo de TRP2 no local H2 do vector pOrigHIB foi conseguida como segue.
Foram desenhados oligonucleótidos complementares para codificar uma sequência de nucleótidos que na tradução expressa o epítopo. A sequência de ADN que codifica o epítopo foi flanqueada pelos nucleótidos de CDR correspondentes para assegurar que, ao traduzir, os aminoácidos se conservassem e que a sequência permanecesse in frame (veja-se Quadro 1). Os iniciadores foram enviados para síntese (MWG) e foram fosforilados na extremidade 5 ' . SVY0F FVWL S-fbsforilado-T AGTGTTTATGATTTT TTT GTG TGG CTCCGA7TC A-3‘ 3’· A TCA CAA ATA CTA AAAAAA CAC ACC GAG GCT MG T-Fosforilado-5'
Os oligonucleótidos complementares foram ressuspensos a uma concentração final de 1 mg/ml em água duplamente destilada estéril e foram ligados entre si preparando uma reacção com 10 μΐ de cada iniciador composta a um volume final de 50 μΐ com tampão TE. A reacção foi submetida a ciclo a 95 °C durante 5 minutos (0,1
°C/segundo), 72 °C durante 20 minutos (0,1 °C/segundo), 55 °C durante 20 minutos e depois foi mantido a 4 °C. 52
Para inserção no local H2, o vector pOrigHlB H2 e/ou pOrigHlB H1H2 foi linearizado preparando um produto de digestão de restrição com Msel (dependente de CDR para ser utilizado para inserção de epítopo) e foi incubado durante uma noite a 37 °C. 0 produto de digestão foi submetido a electroforese num gel de agarose 1,5 % e o vector cortado foi purificado por extracção em gel. Para evitar a autoligação do vector linearizado, foram retirados os grupos fosfato das extremidades 5' do vector por tratamento e incubação durante uma noite a 37 °C com fosfatase alcalina intestinal de bezzero (CIAP) 5 unidades, 10 μΐ de tampao NEB 3 10 x composto a um volume final de 100 μΐ com água destilada estéril. O vector desfosforilado foi purificado e foram preparadas ligações com diluições puras, 1/100 e 1/200 dos oligonucleótidos anelados para terminar directamente no local H2 utilizando técnicas convencionais. As inserções de epítopos foram confirmadas sequenciando dentro dos vectores simples utilizando o iniciador universal de CMV directo. 53
Quadro 3 Epítopos auxiliares e de CTL PROTEÍNA COORDENADAS SEQUÊNCIA RESTRIÇÃO POR HLA TRP2 180-188 SVYDFFVWL agtgtttatgattttttgtgtggctc A2, Kb GP100 209-217 ITDQVPFSV accattactgaccggtgcctttctccgtg A2 GP100 (210H) 209-217(M) IMDQVPFSV accattatggaccaggtgcctttctccgtg A2 GP100 (F7L) 209-217 ITDQVPLSV accattactgaccaggtgcctttgtccgtg A2 GP100 44-59 WNRQLYPEWTEAQRLD tggaacaggcacctgtatccagagtggacagaaocccagagacttoac DR0401 HEPB S AG 28-39 IPQSLDSWWTSL ataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctc Ld (CTL) Nucleoproteína HepB 128-140 TPPAYRPPNAPIL actcctccagcttatagaccaccaaalaccctatccta I-Ab (auxiliar) MAGE3 271-279 FLWGPRALV ttcctgtggggtccaagggccctcgtt A2 Tie2 (Z83) 124-132 FLPATLTMT ttcctaccagctactttaactatgact A2 Tie2 (ZB4) 124-132 FLPATLTMV ttcctaccaactactttaactatggtt A2 Tre2 (Z9) 431-439 GMVEKPFNI A2 54 PROTEÍNA COORDENADAS SEQUÊNCIA RESTRIÇÃO POR HLA gggatggtggaaaaqcccttcaacatt Tie2 (mZ9) 431-439 GMVEKPFNV ggatggtggaaaagcccttcaacgtt A2 FLU HA 111-120 FERFEIFPKE tttgaaaggtttgagatattccccaaggaa I-Ad (auxiliar) ovoalbumina 258-265 SIINFEKL agtataatcaactttgaaaaacta Kb Triosafosfato isomerase (wt) 23-37 GELIGTLNAAKVPAD ggggagctcatcggcattctgaacgcggccaaggtgccggccgac DR0101 Triosafosfato isomerase (ml) 23-37 GELIGILNAAKVPAD ggggagctcatcggcactctvaacgcggccaaggtgccggccgac DR0101 VEGFR2 773-781 VIAMFFWLL gtgattoccatgttcttctggclactt A2 mVE6FH2 773-781 VLAMFFWLL gtgcttaccatggttcttctggctactt A2 55
Transferência ao vector de expressão duplo pDCOrig
Uma vez que foram incorporados todos os epitopos nos locais VH e VL dentro dos vectores simples, são transferidos ao vector de expressão duplo pDCOrig utilizando HindIII/Afel e BarriRI /BsiWI in frame com suas regiões constantes humanas respectivas. Para gerar o vector de expressão de ImmunoBody™ pDCOrig, foi linearizado pOrigHIB utilizando a endonuclease de restrição de extremidades cegas Nrul localizada adjacente ao promotor de CMV. pOrigLIB foi digerido com as endonucleasas de extremidades cegas Nrul e Hpal para escisar o cassete de expressão de cadeia leve completo que consiste no promotor de CMV, cadeia kappa humana desimunizada e o sinal de poli A de BGH. Depois de electroforese em gel, isolamento e extracção em gel do vector linearizado pOrigHIB e do cassete de expressão de cadeia leve o vector foi desfosforilado e o cassete de expressão de cadeia leve foi ligado para formar a construção pDCOrig (Figura 8) . A orientação do cassete de cadeia leve dentro de pDCOrig foi confirmada por análise de restrição. pDCOrig contém as sequências codificantes o gene tanto de cadeia leve como de cadeia pesada combinadas dentro da mesma construção, eliminando sequências intrónicas e o sistema de dois vectores. A expressão é dirigida pelos promotores precoces imediatos de CMV de alto nivel e outros elementos de controlo de ADN, tais como sinal de poliadenilação de hormona de crescimento bovina. 0 marcador de selecção zeocina também foi incluído para maximizar a expressão e eficácia de produção. 0 desenho cuidadoso deste vector conservou os locais de enzimas de restrição únicos nos pontos de união das regiões variáveis e constantes e proporciona um método fácil e rápido para criar diferentes combinações das regiões variáveis (inserções de epitopos, veja-se a Figura 8). 0 quadro 4 enumera algumas das construções de pDcOrig IB geradas. 56Quadro 4. Construções de pDCOrig
Hl H2 H3 LI L3 DCIB15 GplOO 210M IIMDQVPFSV 1RP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB17 GplOO 210M IIMDOVPFSV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB18 TRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB21 Ag S de HepB IPOSLDSWWTSL Fiu HA FERFEIFPKE OCIB24 OVOALBUMINA SHNFEKL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB25 GplOO 210M TMDOVPFSV IRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepBTPPAYRPPNAPIL DCIB26 Tie-2 254 FLPAILIMV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB30 GplOO F7L 1I1DCVPLSV IRF2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB31 IRP2 SVYDFFVWL DCIB32 1RP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB33 huigG2 GplOO F7L II1DCVPLSV IRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL 57
Hl H2 H3 LI L3 DCIB35 GplOO 210M TMDOVPFSV IRP2 SVYDFFVWL GplOO WMROLYPEWTEAQPLD DCIB36 TRP2 SWDFFVWL DCIB37 GplOO F7L II1DOVFLSV Nucleoproteína Hep9 TPPAYRPPNAPIL DCIB40 GplOO F7I 1I1DOVFISV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB41 GplOO wt 1I1COVPFSV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB42 GplOO F7Y TITDOVPYSV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPHAPIL DCIB43 GplOO V5L II1DOLPFSV Nucleoproteína HspB TPPAYRPFNAPIL DCIB48 IRP2 GVYDFFVWL GplOO WNROLYFEWTEAQRLD DCIB49 Nucleoproteína HepB TPPAVRPPNAPIL DCIB50 GplOO 210M 1IMDOVPFSV 1RP2 SVYDFFVWL GplOO WNROLYPEW 1EACALD DCIB52 IRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAVRPPNAPIL 58
Hl H2 H3 LI L3 DCIB53 HolgG2a GplOO 210M IIMCOVFFSV IRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAVRPPNAPIL DCIB54 GplOO GTGRAMLGTHTMEVTVYH IRF2 SVYDFFVWL GplOO WNRQLYPEWTEAQRLD DCIB64 MoigG2a GplOO GIGRMLGFIMTMEVTVYH IRP2 SVYDFFVWL CIB65 huigG3 GplOO 210M IIMDQVPFSV IRP2 SVYDFFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL Motivo huig 61 + 62 de DCIB66 GplOO 210M IIMDQVPFSV IRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRFPNAPIL Motivo huig 62 + 61 de DCIB87 GplOO 210M IIMDQVPFSV IRP2 SVYDFFVWL Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL DCIB68 GplOO GTGRAMLGTHEM EVITVYH IRP2 SVYDFFVWL GplOO WNROLYPEWTEAORLD GplOO WNRQLYPEWTEACRLD GplOO GTGRAMLGTHTM EVIVYH DCIB69 MoigG2a GplOO GTGRAMLGTHTM EVTVYR IRP2 SVYDFFVWL GplOO WNRQLYPEWTEAQRLD GplOO WNRQLYPEWTEAQRLD GplOO GTGRAMLGTHTM EVIWH OCIB71 lie-2 Z12 ILINSLPLV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL 59
Hl H2 H3 LI L3 DCIB72 Iie-2 Z12 ILINSLPLV Nucleoproteína HepB TPPAYRPPNAPIL 60
Geração de pDcOrig IB15 CHI stop É incorporado um codão de parada depois do domínio CHI da região constante de IgGl humana dentro da construção pOCOrig IB15 utilizando o kit de mutagénese dirigida Quik change (Stratagene) e os iniciadores oligonucleotídicos complementares directo origstophuHeCHl e inverso OrigstophuHeCHl (veja-se Quadro 2) como é indicado pelo fabricante. A incorporação de codão de parada é confirmada por sequenciamento de ADN (Figura 9).
Retirada de sequências líder de pDCOrig IB15 Para retirar a sequência líder da cadeia pesada e leve do vector pDCOrig IB15, foram preparadas PCR utilizando o molde pDCOrig IB15 com os iniciadores directos leve pOrig sem líder e pesado pOrig sem líder juntamente com os iniciadores inversos huHeClonR e hiLiClonR respectivamente (Quadro 2). Os fragmentos amplificados foram ligados com TA TOPO no vector pCR 2,1 (Invitrogen) e os clones foram confirmados por sequenciamento. As regiões de IB15 tanto VH como VL desprovidas de líder foram clonadas de novo em pDCOrig IB15 utilizando locais HindIII/Afel e BamHI/BsiWI respectivamente. A sequência de ADN e tradução para as regiões VH e VL se mostram nas Figuras 10 e 11 respectivamente.
Construção de isotipos IgG2 e IgG3 humanos do vector de expressão duplo Immunobody™ pDCOrig A região constante de IgG3 humana foi amplificada por meio de PCR utilizando os iniciadores directo e inverso huigg3 (Quadro 2) incorporando um Afel e EcoRV respectivamente com o molde pOTB7huigG3 (clone de imagem 4566267 MGC 45809). De forma similar a região constante de IgG2 humana foi amplificada utilizando iniciadores IgG2Dir e IgG2Rev (Quadro 2) com o molde pTOB7 huigG2 (clone de imagem 6281452 MGC 71314). 61
Ambos fragmentos foram ligados com TOPO em pCR 2,1 e a sequência foi confirmada (Figuras 12 e 13) . A região constante huigGl dentro da construção pDC0rigIB15 foi substituída eficazmente com tanto huigG2 como huigG3 clonados in frame com a variável pesada utilizando locais Atei e Sapl para gerar pDC0rigIB15 huigG2 e pDC0rigIB15 huigG3 (Figural4). Ambos os vectores conservam os mesmos locais de restrição únicos no ponto de união da região variável/constante. Isto permite uma permuta fácil de regiões variáveis entre todos os vectores de Immunobody de cadeia dupla e simples de isotipo humano.
Mutação de IgGl Fcy humano e domínio de união a Receptor de IgG2 humana
Para substituir os aminoácidos E233 L234 L235 do motivo de união huigGl dentro do domínio CH2 com P233 V234 A235 de huigG2, uma secção curta foi amplificada de novo por meio de PCR incorporando a mutação. Foi utilizado o iniciador reverso huigGl PVA Inv que continha as substituições e o local de restrição constitutivo Ahdl com o iniciador directo HIBF (Quadro 2) e o molde pDCOrig IB15. 0 fragmento resultante foi ligado no vector pCR 2,1 (Invitrogen). Depois de confirmação de sequência, a sequência de tipo selvagem foi substituída eficazmente com a secção que continha as mutações pela inserção de nos locais de corte simples Agel/Ahdl do plasmídeo pDCOrig IB15 huigGl (Figura 15).
Os aminoácidos P233 V234 A235 dentro do domínio constante de huigG2 da construção pDCOrig IB15 huigG2 também foram substituídos com o motivo de união a huigGl ELLG. Como antes, foi utilizado o iniciador reverso huigG2ELLGInv (Quadro 2) que continha as substituições e o local de restrição constitutivo Ahdl com o iniciador directo HIBF e a IgG2 humana do molde pDCOrig IB15. 0 fragmento foi ligado com TA TOPO no vector pCR 2,1. Depois 62 de confirmação de sequência, a sequência de tipo selvagem foi substituída de novo com a secção que continha o motivo de união a huigGl utilizando locais Agel/Ahdl do plasmídeo pDCOrig IB15 huigG2 (Figura 16).
Geração de plasmídeos de IgG2a murinos de pDCOrig DCIB53 e DCIB63
Para construir uma versão de IgG2a murina do vector de duplo expressão pDCOrig, foi sintetizado ADNc de ARN total isolado da linha celular de hibridoma 337. Para amplificação da região constante de IgG2a murina, foi utilizado o iniciador directo migG2aCl AfeF2 que continha local de restrição Afel juntamente com o iniciador reverso migG2aXbaRA que albergava um local Xbal depois do codão de parada. 0 fragmento de PCR foi ligado com TOPO no vector pCR 2,1. Depois de conformação de sequência, a região constante de IgG2a murina foi excisada e foi clonada in frame com a região variável pesada murina nos locais Afel/Xbal do vector pOrigHIB substituindo eficazmente IgGl humana. Foi retirado um local BamHI e Xhol sem alterar, na tradução, a sequência de aminoácidos da região constante de IgG2a murina, sequencialmente por mutagénese dirigida utilizando kit de mutagénese dirigida Quik change (Stratagene) e os iniciadores complementares MoigG2BamHIDIR e REV, MoigG2XhoIDIR e REV respectivamente. Isto gerou o vector de ImmunoBody de cadeia simples pMoOrigHIB (Figura 17A). Uma secção de pMoOrigHIB que continha a região constante de McigG2a da construção simples foi transferida ao vector de duplo expressão pDCOrig IB15 in frame com a região variável pesada murina utilizando Afel e Avrll de corte simples localizados no promotor de SV40 para gerar o vector intermediário pDCOrigIB15MoigG2a hukappa que ainda continha uma região kappa humana.
Para amplificação da região kappa murina, foi utilizado o ADNc como um molde com os iniciadores 63
MoLClBslFl que continha um local BsiWI e MoLCXhol incorporando um local Xhol depois do codão de parada. 0 fragmento amplificado foi clonado por TOPO no vector pCR 2,1 como antes. A região kappa murina foi excisada e foi ligada no vector de ImmunoBody pOrigLIB LI e pOrigLIB hepB auxiliar hepB/Ll substituindo a constante kappa humana utilizando BsiWI/Xhol gerando o vector intermediário pMoLIBLIBsi e pMoLIB HepB auxiliar hepB/Ll Bsi. 0 sistema de Immunobody implica a transferência de regiões variáveis utilizando um local de restrição único no ponto de união das regiões variáveis e constantes enquanto que o ponto de união entre a variável pesada murina e a constante moigG2a podem acomodar um local Afel (presente dentro de todos os vectores de Immunobody humanos) e não alterar a sequência de aminoácidos na tradução, a região entre a kappa e variável murina é problemática. Na análise de sequência neste ponto de união não se poderia incorporar local de restrição único que não alterasse a sequência de aminoácidos. 0 local BsiWI no ponto de união foi retirado para voltar à sequência de tipo selvagem. Isto foi conseguido amplificando a cadeia de comprimento completa murina inteira por meio de PCR sobreposta. Foi preparado uma primeira PCR utilizando o iniciador directo MoKappaSDMdir que continha sequência de tipo selvagem no ponto de união e região flanqueante retirando eficazmente BsiWI, o iniciador reverso BGH e os vectores de cadeia leve intermediários pMoLIBLl Bsi e pMoLIB hepB auxiliar hepB/Ll Bsi como molde respectivamente. Foi utilizado um fragmento amplificado de aproximadamente 430 pb do primeiro ciclo de PCR como um iniciador reverso contendo o iniciador directo Immuno-LikozDir um local BamHI. As cadeias kappa murinas de comprimento completa amplificadas foram ligados por TOPO em pCR 2,1 e foi confirmada sua sequência. A cadeia kappa murina de comprimento completa que continha ajuda de hepB 64 no local de LI em pCR 2,1 foi excisada e foi clonada nos locais BamHI/Xhol do vector de expressão duplo intermediário pCCCrigIB15MoigG2a hukappa substituindo a cadeia kappa humana para gerar o vector de expressão duplo murino pDCOriglB GPl00210m/Hl TRP2/H2 HepB auxiliar/Ll molgG2a (DCIB 53, Figura 17 B e 54).
De forma similar, a cadeia kappa murina de comprimento completa que continha um local LI foi excisada e foi clonada nos locais BamHI/Xhol do vector de expressão duplo intermediário pDCOrigIB15MoigG2a hukappa substituindo a cadeia kappa humana para gerar o vector de expressão duplo murino intermediário pDCOrigIBl5molgG2a com um local Ll vácuo. Para gerar a construção com uma região variável leve de tipo selvagem, os iniciadores fosforilados 5' complementares wtkappavarLl dir e rev (Quadro 2) foram hibridados e inseridos no local Ll depois de linearização com EcoRV como foi descrito anteriormente. Finalmente a região variável pesada de DCIB 54 que continha GP100DR7/H14 TRP2/H2 e GP100DR4/H3 foi transferida utilizando HindiII/Afei para gerar pDCOrigGP100DR7/HlTRP2/H2GP100DR4/H3moigG2a kappa de tipo selvagem (DCIB68 Figura 17C e 60).
Retirada do promotor de SV40 eucariota do vector de expressão duplo de Immunobody pDCOrig para requisitos de vacina de ADN reguladora 0 promotor bacteriano EM7 e gene de zeocina foram amplificados utilizando o iniciador directo SV40PremDIR incorporando um local Nhel e iniciador reverso SV40remINV (Quadro 2) com o molde pOrigHIB. O fragmento de PCR de 511 pb resultante foi ligado por TOPO em pCR 2,1 e foi confirmada por sequenciamento. O promotor EM7 e uma secção do gene de zeocina foram excisados utilizando Nhel e Fsel de pCR 2,1 e foram clonados directamente em pOrigHIB Hl retirando eficazmente o promotor de SV40. O local Nhel 65 reside antes do promotor de SV40 enquanto que na sequência de reconhecimento de Fsel é um cortador simples dentro do gene de zeocina do vector. Depois de confirmação de sequência uma secção maior do vector simples foi transferida ao vector pDCOrig IB68 que codifica a extremidade de cauda de huigGl, poliA de BGH, EM7 e parte do gene de zeocina digerindo com SapI e Frei retirando eficazmente o promotor de SV40 do vector de expressão duplo.
Alteração da cadeia principal de pDCOrig para uma pVaxl (Invitrogen) compatível com a regulação da FDA A cadeia pesada de IgGl humana de comprimento completa de Immunobody foi excisada da construção DCIB54 utilizando Hindlll e Xbal e foi inserida nestes locais dentro do MCS do vector pVaxl (Figura 18 A). Para gerar a versão pVax do vector de expressão de duplo cadeia, pVaxIB54HIB foi linearizado utilizando a endonuclease de restrição de extremidade romo Nrul localizada adjacente ao promotor de CMV. pOrigLIB (Figura 18 B) , foi digerida com as endonucleases Nrul e Hpal de extremidades cegas para excisar o cassete de expressão de cadeia leve completo consistente no promotor de CMV, cadeia kappa humana de Immunobody e a sinal poliA de BGH. Depois de electroforese em gel, isolamento e extracção de gel do vector linearizado pVaxIB54HIB e o cassete de expressão de cadeia leve o vector foi desfosforilado e o cassete de expressão de cadeia leve foi ligado para formar a construção pVaxDCIB54 (Figura 18C). A orientação do cassete de cadeia leve dentro de pVaxDCIB54 foi confirmada por meio de análise de restrição. pVaxOCIB54 conserva os mesmos locais de restrição únicos no ponto de união de região constante/variável permitindo a permuta fácil de regiões variáveis entre todos os vectores de Immunobody de cadeia duplo e simples de isotipo humano. Por exemplo para gerar pVaxDCIB68 (Figura 60) a região variável leve murina que continha GplOODR4/Ll e Gpl00D37/L3 foi excisada de DCIB68 utilizando BamHl/BsiWI e foi clonada em pVaxDCIB54 substituindo eficazmente a região variável de tipo selvagem leve.
Geração de TRP2 murino de pOrig e GP100 de pCDNA3
Para construir TRP2 murino de pOrig, foi utilizado ADNc sintetizado de 5 μg de ARN total isolado da linha celular B16F10 como um molde para a amplificação de proteína relacionada com tirosinase 2 (TRP2) murina de comprimento completa utilizando os iniciadores murinos de TRP2 directo e inverso (Quadro 2) com incorporação de um local Hindlll ou EcoRV respectivamente. Foi ligado TRP2 de comprimento completa no local de clonagem múltiple HindiII/EcoRV do vector pOrigHIB. Também se amplifico GP100 murino de comprimento completa do ADNc utilizando os iniciadores murinos de GP100 desenhados directo e inverso que continham locais EcoRV e Xhol respectivamente. (Quadro 1) . O produto de PCR foi clonada nos locais EcoRV/Xhol do vector de expressão de mamíferos pCDNA3 (Invitrogen). Ambos plasmídeos foram identificados por análise de restrição e foram confirmados por sequenciamento de ADN. ELISA de tipo sanduíche
Foram revestidas placas flexíveis de 96 poços Falcon, durante a noite a 4 °C, com 50 μΐ de anticorpo específico anti-Fc de IgG humana (Sigma 12136) ou anticorpo de anti-cadeia leve kappa humana (Dako A0191) a 10 μρ/πιΐ em PBS. As placas foram lavadas três vezes com PBS-Tween 20 (0,05 %) 200 μΐ/poço, utilizando um Skan Washer 400 (Molecular Devices), e os poços foram bloqueados com gelatina de pele de peixe a 1 % (Sigma) em PBS (FSG/PBS 1 %) . As placas foram incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente e foram lavadas com FSG/PBS 1 %. O sobrenadante de cultivo de tecido que continha Immunobody expresso ou proteína de 67
Immunobody purificada (50 μΐ) foi adicionado aos poços, em triplicata, e as placas foram incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram lavadas com FSG/PBS a 1 % e Immunobody foi detectado unido adicionando 50 μΐ/poço de anticorpo especifico anti-Fc de IgG humana conjugado com peroxidase (Sigma A0170) ou anticorpo anti-cadeia leve kappa humana (Sigma A7164), diluído 1/2000 em FSG/PBS a 1 %, e foi incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. As placas foram lavadas com FSG/PBS 1 % e foram desenvolvidas adicionando substrato TMB (R&D Systems) a 50 μΐ/poço. A absorvância foi medida a 650 nm num leitor de microplacas VERSA max (Molecular Devices).
Ratinhos e imunizações O trabalho com os animais foi levado a cabo sob uma licença de projecto aprovada pelo Ministério do Interior. Foram utilizados machos e fêmeas transgénicos HLA-A2 (HHDII) ou C57BI/6 (Harian) (Instituto Pasteur, Paris) entre 6 e 12 semanas de idade. Péptidos sintéticos foram emulsifiçados (fabricados por John Keyte, Departamento de Ciências Biomédicas, Universidade de Nottingham, Reino Unido) com adjuvante incompleto de Freund e foram injectados por uma via subcutânea. Cada ratinho recebeu 10 μρ de péptido/imunização. Partículas de ouro de 1,0 μπι foram revestidas com ADN (BioRad, Homel Hempstead, Reino Unido) utilizando as instruções do fabricante e foram administradas por via intradérmica pela pistola génica Hélios (BioRad). Cada ratinho recebeu 1 μg de ADN/imunização. Também foi administrada solução de ADN desnudo i.d. ou i.m. (10 μg/imunização) combinada imediatamente depois da injecção com um pulso eléctrico curto. Os ratinhos foram imunizados a 0, 1 e 2 semanas e os baços foram retirados na semana 3. O esgotamento do subconjunto de linfócitos T in vivo foi realizado por injecção de 400 μρ de anticorpo anti-CD25 (PCR61) i.p. 68 quatro dias antes da imunização ou 200 μg de anticorpo anti-CTLa-4 i.p. simultaneamente com a imunização secundária.
Reestimulações in vitro
Cinco dias depois da imunização final, esplenócitos (5xl06/ml) foram cocultivados a 37 °C com blastos com lipopolissacáridos (LPS) pulsados com péptidos singénicos irradiados (20 Gy) (0,5 a lxlO6 células/ml) em 2 ml de RPMI-1644 com FBS a 10 %, glutamina 2 mM, tampão HEPES 20 M, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 μg/ml“1 e 2-mercaptoetãool 10“5 M em placas de 24 poços. Os blastos com LPS foram obtidos activando esplenócitos (1,5 x 105 células/ml) com LPS 25 μρ/πιΐ (Sigma) e dextrano sulfato 7 μg/ml (Pharmacia, Mitton Keynes, Reino Unido) durante 3 dias a 37 °C. Antes de utilização, foram cultivados 2 x 107 blastos de LPS com péptido sintético 100 μg/ml durante 1 hora. Os cultivos foram ensaiados com respeito a actividade citotóxica no dia 6 num ensaio de libertação de 51Cr.
Ensaio de libertação de 51Cr
As células alvo foram marcadas durante 1 hora com cromato (51Cr) de sódio 1,85 MBq (Amersham, Essex, Reino Unido) com ou sem péptido 100 μρ/πιΐ. Depois da incubação foram lavadas 3 vezes em RPMI e foram incubadas durante 1 hora adicional com péptido 100 μρ/πιΐ. Foram preparados 5 x 103 alvos/poço de placas de fundo em V de 96 poços e foram coincubados com diferentes densidades de células efectoras num volume final de 200 μΐ. Depois de 4 horas a 37 °C, foram retirados 50 μΐ dos sobrenadantes de cada poço e foram transferidos a uma Lumaplate (Packard, Rigaweg, Países Baixos). As placas foram lidas num Contador de cintilação de Microplaca Topcount (Packard). A percentagem de lise específica foi calculada utilizando a seguinte fórmula: 69
Lise especifica = 100 x [ (libertação experimental - libertação espontânea)/(libertação máxima - libertação espontânea)]
Ensaio de Elispot ex vivo
Foram realizados ensaios de elispot utilizando rewagentes de captura e detecção de IFNy murino de acordo com as instruções do fabricante (Mabtech, Suécia). Brevemente, poços da placa de Inmobilina P de 96 poços foram revestidos com anticorpos anti-IFNy e poços repetidos foram semeados com 5 x 105 esplenócitos. Péptidos sintéticos (a uma diversidade de concentrações) ou 5 x 104 células de melanoma alvo foram adicionados a estes poços e foram incubados durante 40 horas a 37 °C. Depois da incubação, o IFNy capturado foi detectado por meio de um anticorpo anti-IFNy biotinilado e desenvolvimento com uma fosfatase alcalina de estreptavidina e substrato cromogénico. Os pontos foram analisados e foram contados utilizando um leitor de placa automático (CTL). A avidez funcional foi calculada como a concentração que media 50 % da função efectora máxima utilizando um gráfico de função efectora contra concentração de péptido. O esgotamento de linfócitos CD8 de populações de esplenócitos foi realizado utilizando Dynabeads CD* (Dynal) de acordo com as instruções do fabricante e depois foram adicionaos a ensaio de elispot ex vivo.
Ensaios de tumor
Foram seleccionados aleatoriamente ratinhos C57BI/6 em grupos de tratamento e foram imunizados a intervalos semanais durante cinco semanas. Entre a terceira e quarta imunização foram desafiados por injecção i.v. na veia da cauda 1 x 104 células de melanoma B16F10 IFNGC. Quando são injectadas i.v., as células B16F10 migram aos pulmões para formar metástase. Os ratinhos foram monitorizados com respeito a sinais de crescimento tumoral e dor. No dia 49 70 depois da apresentação de tumor, os ratinhos foram sacrificados e os pulmões foram analisados com respeito à presença de metástase. Os baços foram analisados com respeito à presença de epitopo e respostas imunes especificas de tumor em ensaio de elispot ex vivo.
Foram imunizados ratinhos HHDII a intervalos semanais durante três semanas e 7 dias depois da imunização final foram aplicados s.c. no flanco direito 2 x 104 células de melanoma B16F10 HHD. O crescimento tumoral foi controlado a intervalos de 3-4 dias e o tamanho do tumor foi medido utilizando um calibrador.
Exemplo 1 - Construções de ImmunoBody produzem baixos níveis de anticorpo intacto
Prepararam-se transfectantes de células CHO-S estáveis com uma construção de ImmunoBody que continha o epitopo de gplOO IMDQVPFSV e o epitopo de TRP2 SVYDFFVWL em CDR Hl e CDR H2 respect ivamente com o epitopo de HepB CD4 TPPAYRPPNAPIL em CDR LI (DCIB15; Figura 19). O sobrenadante destes transfectantes foi analisado em relação a expressão de proteína de ImmunoBody por ELISA de tipo sandwich. Foram revestidas placas com anticorpo específico anti Fc de IgG humana e adicionou-se sobrenadante. Detectou-se ImmunoBody unido utilizando um anticorpo de HRP específico anti Fc humano para detectar cadeia pesada. A cadeia pesada detectou-se no sobrenadante a uma concentração de aproximadamente 1 μg/ml em comparação com o controlo (Figura 20a) . Purificou-se ImmunoBody do sobrenadante utilizando uma coluna de afinidade de proteína A e analisou-se em relação à presença de ImmunoBody. A purificação de ImmunoBody produziu quantidades muito mais baixas de proteína do que se esperava previamente em comparação com o controlo (Figura 20b). Já que tais rendimentos baixos de proteína intacta podiam purificar-se, as construções de ImmunoBody foram analisadas em relação à 71 expressão de tanto cadeia pesada como anticorpo intacto no sobrenadante de células transfectadas por ELISA de tipo sandwich. As construções com o epitopo de HepB CD4 em CDR LI e o epitopo de SIINFEKL em CDR H2 (GCIB24; Figura 21) ou o epitopo de gplOO IMDQVPFSV e o epitopo de TRP2 SVYDFFVWL em CDRH1 e CDRH2 respectivamente com o epitopo de HepB CD4 TPPAYRPPNAPIL em CDR L3 (DCIB25; Figura 22) também foram ensaiadas. As placas foram revestidas com anticorpo especifico anti Fc de IgG humana e adicionou-se o sobrenadante. 0 ImmunoBody unido detectou-se utilizando um anticorpo de HRP específico anti Fc humano para detectar cadeia pesada ou um anticorpo de HRP específico de anti cadeia capa humana para detectar ImmunoBody intacto. Os transfectantes de ImmunoBody mostram alto nível de secreção de cadeia pesada, mas muito baixos níveis de ImmunoBody intacto (Figura 20c e d).
Estes dados indicam que a incorporação de epítopos de linfócitos T CD8 e CD4 nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve quebrou a estrutura global do ImmunoBody evitando a formação de anticorpo intacto.
Os dados adicionais sobre a análise de sobrenadante de células CHO-S transfectadas demonstram que somente as construções com epítopos de CTL incorporados na CDRH3 ou CDRL3 são secretadas como anticorpo intacto (Figura 20e) . Ao contrário, a incorporação de qualquer epitopo dentro da CDRH1 ou CDRH2 permitiu a secreção de quantidades pesadas, mas baixas de anticorpo intacto inclusive se não se incorporava nada dentro da cadeia leve se secretava. A incorporação de qualquer epitopo dentro de CDRL1 de qualquer das cadeias leves tinha como resultado a secreção de nível baixo de cadeia leve inclusive se somente havia um epitopo incorporado na CDRH3 da cadeia pesada. 72
Exemplo 2 - Epitopos de CTL incorporados na armação de ImmunoBody são processados e apresentados para induzir uma resposta imune in vivo 0 epítopo de CTL anteriormente publicado de TRP2, aa280-288 (Bloom et al, The Journal of Experimental Medicine 1997; 185: 453-9), obteve-se por engenharia genética na região CDR H2 da construção de ImmunoBody junto com um epítopo de CD4 universal de Hepatite B em CDR LI (DCIB18; Figura 30). Os ratinhos C57BI/6 foram imunizados três vezes a intervalos semanais por via intradérmica com ADN de ImmunoBody por meio do bombardeamento de partículas. Os esplenócitos foram analisados posteriormente por elispot de IFNy em relação a respostas específicas de TRP2. Os ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody demonstraram respostas específicas de péptido de TRP2 consideráveis em comparação com o controlo, mas respostas de nível mais baixo específicas para o péptido de HepB CD4 (Figura 31a). A avidez das respostas especificas de TRP2 também foi estudada por titulação de péptido em elispot de IFNy. Nos quinze ratinhos ensaiados dentro de cinco experiências diferentes, a avidez das respostas varia de 1CT9 M a 1CT11 M de péptido. Mostra-se um exemplo representativo na Figura 31 b.
Com a finalidade de confirmar que esta resposta específica de TRP2 estava mediada por linfócitos T CD8, os ratinhos C57BI/6 foram imunizados três vezes com ADN de ImmunoBody a intervalos semanais. Seis dias depois da última imunização os esplenócitos foram isolados e analisados in vitro em relação a respostas especificas por elispot de IFNy. Para determinar se a resposta específica de TRP2 estava mediada por linfócitos T CD8, suprimiram-se os linfócitos T CD8 antes da análise no ensaio de elispot. A supressão de linfócitos T CD8 conduziu à supressão da resposta específica de TRP2; no entanto, o esgotamento de 73 CD8 não afectou à resposta de péptido HepB CD4, o que sugere que está mediada mais provavelmente por linfócitos T CD4 (Figura 31 c).
Para determinar se as respostas geradas por imunização com ADN de ImmunoBody são capazes de matar as células alvo ín vitro, os esplenócitos foram estimulados com blastos de LPS pulsados com péptido TRP2 in vitro durante 6 dias e foram analisados num ensaio de libertação de cromo contra células de melanoma B16F10. Os esplenócitos de ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody demonstraram lise superior tanto de células B16F10, que têm baixos niveis de MHC de classe I na superfície, como de células B16F10 IFNa, que têm alta expressão de MHC de classe I na superfície em comparação com a da linha B16F10 que não expressa moléculas H-2Kb (B16F10 siKb). A supressão da morte frente à linha celular B16F10 siKb demonstra que a morte depende de CD8 e está restringida através de H-2Kb (Figura 31d).
Estes resultados mostram que o epítopo de TRP2 (SVYDFFVWL) CD8 incorporado na região CDR H2 da armação de ImmunoBody é processado e apresentado para induzir respostas de alta frequência mediadas por meio de MHC de classe I. 0 epítopo de HepB CD4 também é processado e apresentado no contexto de MHC de classe II para induzir boas respostas mediadas por CD4 de imunização com ADN.
As respostas específicas de epítopo de TRP2 também foram analisadas de outras construções que contêm epítopo de TRP2 utilizando metodologia idêntica. A incorporação do epítopo de TRP2 em CDR dentro da cadeia pesada tinha como resultado respostas especificas de péptido de alta frequência (Figura 31e) . Ao contrário, a incorporação de epítopos de CTL dentro da cadeia leve tinha como resultado uma redução significativa da frequência de CTL (DCIB36). A análise da avidez das respostas específicas de epítopo de TRP2 revela que são de alta avidez quando se geram a partir 74 de epítopos dentro da cadeia pesada, mas esta é consideravelmente menor com a expressão de epítopos da cadeia leve (Figura 31f). Observaram-se respostas auxiliares de alta avidez de alta frequência para todas as construções (Figura 31 g) , o que sugere que a secreção de cadeia pesada era uma vantagem para estimular respostas de CTL, mas não para respostas auxiliares.
Exemplo 3 - A imunização de ADN de ImmunoBody é melhor que a imunização com péptido ou imunização com antigénio completo
Para analisar a eficácia de imunização de ADN de ImmunoBody, comparou-se com imunização s.c. com epítopo peptídico em adjuvante incompleto de Freund ou imunização com um ADN que expressa o antigénio de TRP2.
Os ratinhos C57BI/6 receberam três imunizações semanais com ADN ou péptido que compreendia o epítopo de TRP2 ligado ao epítopo auxiliar universal em IFA. As respostas especificas de péptido auxiliar e TRP2 geradas em ratinhos imunizados com ImmunoBody foram muito superiores em magnitude às induzidas por imunização com péptido ou imunização com o antigénio de TRP2 completo (Figura 32a). A análise adicional da avidez destas respostas específicas de péptido revelaram que as respostas geradas por ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody têm uma avidez mais de um logarítmico maior que as de indivíduos imunizados com péptido (Figura 32b) . As respostas geradas em ratinhos C57BI/6 foram analisadas posteriormente em relação à capacidade citotóxica in vitro frente à linha celular B16F10 e, como um controlo negativo, a linha celular B16F10 siKb. A Figura 32c mostra que os ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody são capazes de actividade tumoral in vitro que está restringida por H-2Kb e tanto os ratinhos imunizados com péptido como os ratinhos imunizados com 75 antigénios completos são incapazes de matar as mesmas linhas celulares de melanoma. A administração de ImmunoBody também se comparou com a imunização com péptido DC +. Os ratinhos C57BI/6 receberam três imunizações semanais com ADN ou péptido DC +. As respostas especificas de péptido de TRP2 foram de frequência comparável, mas os ratinhos imunizados com ImmunoBody geraram respostas de maior avidez em comparação com os imunizados com péptido DC + (Figura 32d) . Isto também se demonstrou quando estas respostas foram analisadas em relação a capacidade para matar células de melanoma B16F10 in vitro (Figura 32e). As respostas geradas por imunização com ImmunoBody mostraram maiores mortes de melanoma B16F10 a menor razão de efector e alvo que as respostas de ratinhos imunizados com péptido DC +. Também mostraram maior lise especifica da linha de melanoma B16F20 siKb que tinha níveis reduzidos de H-2Kb.
As construções de ImmunoBody que continham o epítopo de Ovoalbumina restringido por H-2Kb, SIINFEKL, e o epítopo de gplOO restringido por HLA-A2 modificado em ancoragem, IMDQVPFSV (21 CM) compararam-se com a imunização com péptido epitópico correspondente em ratinhos C57BI/6 ou HHDII respectivamente. Os ratinhos receberam três imunizações semanais com ADN ou péptido em IFA. A análise das respostas depois da imunização final revela que os ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody geram respostas específicas de péptido de maior frequência em comparação com ratinhos imunizados com péptido (Figura 32f e g). Estas respostas também foram analisadas em relação a avidez por titulação de péptidos. A imunização com ImmunoBody induz respostas de avidez significativamente maior que a imunização com péptido (Figuras 32h e i). A magnitude da resposta específica de TRP2 gerada pela vacina de ADN de ImmunoBody é muito superior à gerada por 76 péptido sintético ou antigénio de TRP2 completo. No entanto, as provas de ensaios clínicos sugerem que a presença de uma frequência alta de linfócitos T CD8 específicos de tumor não conduz necessariamente à regressão tumoral e geralmente em ensaios de vacina a taxa de resposta clínica objectiva é muito baixa (Rosenberg et al, J Immunol 2005; 175: 6169-76; Rosenberg et al, Nature Medicine 2004; 10: 909-15). Está a tornar-se evidente agora que factores distintos da frequência tais como avidez funcional dos linfócitos T específicos de tumor e a via de sensibilização são determinantes importantes na maximização da eficácia de vacina. Vários grupos mostraram que os linfócitos T CD8 de alta avidez demonstram actividade antitumoral superior (Alexander-Miller, Immunologic research, 2005; 31: 13-24; Hodge et al, J Immunol 2005; 174: 5994-6004; Valmori et al, J Immunol 2002; 168: 4231-40; Zeh et al, J Immunol 1999; 162: 989-94; Alexander-Miller et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996; 93: 4102-7). No estudo dos investigadores, a análise da avidez funcional de respostas específicas de TRP2 induzidas por ImmunoBody demonstrou que pode ser gerada uma resposta de alta avidez em comparação com imunização com péptido sintético. Esta resposta de alta avidez também se correlaciona com a capacidade melhorada para reconhecer e matar células tumorais in vitro. O sinal da APC ou via de sensibilização da resposta também é crucial para a indução de respostas imunes de alta avidez (Oh et al, J Immunol 2003; 170: 2523-30) .
Exemplo 4 - Podem ser processados múltiplos epitopos do local CDR H2
Para demonstrar que múltiplos epitopos podem ser processados e apresentados de CDR H2 para induzir uma resposta imune, o epítopo restringido por H-2Kb SIINFEKL 77 (DCIB24; Figura 21) de ovoalbumina e o epítopo de Hepatite B restringido por H-2Kd IPQSLDSWWTSL (DCIB21; Figura 33) foram inseridos por engenharia genética no local H2 na região variável pesada. Estas construções de ImmunoBody também continham um epítopo de Hepatite B CD4 restringido por I-Ab (TPPAYRPPNAPIL) ou epítopo de hemaglutinina de gripe restringido por I-Ad (FERFEIFPKE) no local CDR LI na região variável leve.
Foram imunizados ratinhos C57BI/6 ou Balb/c três vezes a intervalos semanais por via intradérmica com ADN de ImmunoBody por meio do bombardeamento de partículas. Os esplenócitos foram analisados posteriormente por elispot de IFNy em relação à presença de respostas de CD8 e CD4 específicas de epítopo.
Os ratinhos imunizados C57BI/6 demonstraram respostas específicas de SIINFEKL de alta frequência, mas menores respostas específicas para o epítopo auxiliar (Figura 34a). Os ratinhos Balb/c também criaram respostas de CD8 específicas de epítopo de Hepatite B de alta frequência com níveis de resposta similares ao epítopo auxiliar (Figura 34b) .
Estes dados sugerem que o processamento e presentação de epítopos de CD8 do local CDR H2 não estão restringidos por sequência ou comprimento de epítopo específico.
Exemplo 5 - Podem ser processados múltiplos epitopos de CTL da região variável
Para demonstrar que podem ser processados e apresentados epítopos da região variável e não somente as regiões CDR, incorporam-se epítopos no local CDR Hl com a retirada de parte da região flanqueante.
Os epítopos exemplares são os epítopos restringidos por HLA-A2 modificados IMDQVPFSV (DCIB17; Figura 35) de gplOO e FLPATLTMV de Tie-2 (DCIB26; Figura 36). As 78 construções de ImmunoBody também continham o epítopo de Hepatite B CD4 no local CDR Ll.
Foram imunizados ratinhos transgénicos HLA-A2 (HHDII) três vezes a intervalos semanais por via intradérmica com ADN de ImmunoBody por meio do bombardeamento de partículas. Os esplenócitos foram analisados posteriormente por elispot de IFNy em relação à presença de respostas de CD8 e CD4 específicas de epítopo.
Os ratinhos HHDII induziram respostas específicas de epítopo de gplOO 210M de alta frequência com respostas razoáveis para o epítopo de HepB CD4 (Figura 37a) . As respostas em ratinhos HHDII imunizados com a construção que continha o epítopo de Tie2 não eram de frequência tão alta, mas foram geradas respostas específicas consideráveis tanto para o epítopo de Tie2 como o epítopo de HepB CD4 (Figura 37b) .
Os dados neste exemplo indicam que os epítopos inseridos dentro da região variável podem ser processados e apresentados para induzir uma resposta imune in vivo. Também resulta evidente que isto não se restringe a uma sequência de epítopo.
Exemplo 6 - Podem ser geradas múltiplas respostas de CTL de diferentes epitopos dentro da mesma construção de ImmunoBody 0 epítopo de gplOO restringido por HLA-A2 previamente mencionado IMDQVPFSV foi inserido por engenharia genética no local CDR Hl junto com o epítopo de TRP2 SVYDFFVWL que também está restringido através de HLA-A2 no local CDR H2 da mesma construção. 0 epítopo de HepB CD4 estava presente no local CDR Ll (DCIB15; Figura 19).
Os ratinhos HHDII foram imunizados três vezes a intervalos semanais por via intradérmica com ADN de ImmunoBody por meio do bombardeamento de partículas. Os esplenócitos foram analisados posteriormente por elispot de 79 IFNy em relação à presença de respostas de CD8 e CD4 específicas de epítopo. A Figura 38a mostra que se geram respostas específicas para os epítopos tanto de gplOO como de TRP2, embora a frequência das respostas específicas de TRP2 são menores. Também se geram respostas de péptido de HepB CD4. A avidez das respostas específicas de TRP2 também foi estudada por titulação peptídica em elispot de IFNy. A avidez das respostas varia de 1CT10 M a 1CT11 M de péptido para o epítopo de gp 100 e 10 9 M a 10 10 M de péptido para o epítopo de TRP2. Mostram-se exemplos representativos na Figura 38b. Para determinar se as respostas são capazes de matar as células alvo in vitro, foram estimulados esplenócitos com blastos de LPS pulsados com péptido TRP2 e gplOO in vitro durante 6 dias e foram analisados num ensaio de libertação de cromo contra células T2 marcadas com péptido e células de melanoma B16F10 HHD. A morte especifica de linha de melanoma B16F10 HHD era comparável à da linha de melanoma B16F10 de controlo. As respostas também demonstraram lise específica de células T2 marcadas com péptido em comparação com o controlo (Figura 38c). A combinação de dois epítopos de CD8 numa construção de ImmunoBody simples parece dar como resultado um grau de imunodominância entre os epítopos. O epítopo imunodominante é o epítopo com a maior afinidade pelo MHC de classe I. Quando os ratinhos imunizados com a construção que contém epítopos tanto de gplOO como de TRP2 CD8 são comparados com os imunizados com uma construção que contém somente o epitopo de TRP2 CD8, a frequência da resposta de TRP2 diminui (Figura 38d).
Estes dados demonstram que podem ser geradas respostas imunes específicas de epítopo da mesma construção de ADN específica para dois epítopos de CD8 diferentes. Estes também são capazes de actividade antitumoral in vitro. No 80 entanto, existe um grau de imunodominância que governa a frequência da resposta ao epítopo subdominante.
Realizou-se um estudo similar com construções de ImmunoBody separadas que continham o epítopo de TRP2 em CDRH2 (DCIB18) ou o epítopo SIINFEKL em CDRH2 (DCIB24). Os ratinhos foram imunizados com DCIB18 ou DCIB24 somente, DCIB18 e DCIB24 combinados no mesmo local ou DCIB18 e DCIB24 à vez, mas em locais separados. Realizaram-se imunizações três vezes a intervalos semanais e injectou-se ADN i.m. No músculo tibial em combinação com electroporação. A análise das respostas imunes geradas mostra que podem ser induzidas respostas específicas de péptido de alta frequência quando os ratinhos foram imunizados com DCIB18 ou DCIB24 somente (Figura 38e) . A imunização de ratinhos com estas construções no mesmo local tem como resultado a perda significativa da resposta específica de péptido TRP2. Isto sugere que o epítopo SIINFEKL é dominante sobre o epítopo de TRP2. A resposta específica de TRP2 pode ser recuperada se os ratinhos forem imunizados com construções em locais separados (p=0,0026). Estes dados sugerem que a imunodominância influi nas respostas imunes geradas por imunização com IB, mas isto pode ser resolvido por imunização em locais separados espacialmente.
Exemplo 7 - As modificações de residuos não de ancoragem podem potenciar o reconhecimento de linfócitos T 0 exemplo anterior mostra que o epítopo de gplOO modificado IMDQVPFSV é imunodominante e tem uma alta afinidade por HLA-A2 (predito utilizando o algoritmo de SYFPEITHI e demonstrado no ensaio de estabilização de T2 -Quadro 5) . Já que o epítopo de gplOO de tipo selvagem ITDQVPFSV não é imunogénico, realizaram-se modificações em resíduos não de ancoragem que teriam uma afinidade de união a HLA-A2 similar à do epítopo de tipo selvagem, mas também 81 potenciaria a imunogenicidade. Estes epítopos modificados foram inseridos por engenharia genética no local CDR Hl da construção de ImmunoBody e foram ensaiados junto com o epitopo de tipo selvagem (DCIB37, DCIB40, DCIB41, DCIB42, DCIB43; Figuras 39-43).
Foram imunizados ratinhos HHDII três vezes a intervalos semanais por via intradérmica com ADN de cadeia pesada de ImmunoBody somente por meio do bombardeamento de partículas. Os esplenócitos foram analisados pósteriormente por elispot de IFNy em relação à presença de respostas de CD8 específicas de epitopo. Duas modificações (F7L e F7I; DCIB37; Figura 39, DCIB40; Figura 40) do epitopo de gplOO de tipo selvagem que conservavam a afinidade por HLA-A2 (Quadro 5) demonstraram uma capacidade superior para induzir respostas imunes específicas de epítopos em comparação com o epitopo de tipo selvagem (Figura 44a).
Quadro 5
Antigénio Epitopo Ensaio de estabilização de T2 (m.f.i) Pontuação de SYFPEITHI GplOO (210M) IMDQVPFSV 23,1 22 GplOO (wt) ITDQVPFSV 18,5 18 GplOO (F7L) ITDQVPLSV 18 19 GplOO (F7I) ITDQVPISV Nd 18 TRP2 SVYDFFVWL 19 21 Controlo 7, 29 -
Exemplo 8 - Podem ser processadas e apresentadas múltiplas respostas auxiliares de CD4 para induzir uma resposta imune in vivo
Para examinar se os epítopos auxiliares de CD4 podiam ser processados e apresentados para induzir uma resposta imune in vivo, foram inseridos por engenharia genética de forma independente diferentes epítopos no local de CDR Ll da construção de ImmunoBody. Estes incluem o epitopo 82 restringido por I-Ad FERFEIFPKE (DCIB21; Figura 33) de hemaglutinina da gripe, o epitopo restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL de HBcAg (DCIB15; Figura 19) e o epitopo restringido por HLA-DR4 WNRQLYPEWTEAQRLD de gplOO (DCIB35;
Figura 45).
Foram imunizados ratinhos transgénicos Balb/c, C57BI/6 ou HHDII e DR4 três vezes a intervalos semanais por via transdérmica com ADN de ImmunoBody por meio do bombardeamento de partículas. Foram analisados posteriormente os esplenócitos por meio de elispot de IFNy em relação à presença de respostas de CD4 específicas de epitopo. As Figuras 46a, b e c demonstram que os três epítopos auxiliares de CD4 podem ser processados e apresentados do local CDR LI para induzir uma resposta imune específica de epitopo in vivo. 0 epitopo restringido por HLA-DR4 de gplOO também se ensaiou em relação ao processamento e apresentação de diferentes CDR. As construções que incorporam o epitopo em CDRL1 (DCIB35; Figura 45), CDRH3 (DCIB54; Figura 29) ou CDRL3 (QCIB50; Figura 47) foram utilizadas para imunizar ratinhos transgénicos HLA-DR4 três vezes a intervalos semanais. A Figura 46d mostra que o epitopo auxiliar pode ser processado eficazmente de diferentes CDR para induzir respostas auxiliares de alta frequência.
Exemplo 9 — As respostas de CTL são parcialmente dependentes da cadeia pesada secretada, mas as respostas auxiliares não requerem cadeia leve secretada
Classicamente são processados epítopos de linfócitos T CD4 de proteínas que se adquirem de forma exógena e epítopos de linfócitos T CD8 de proteínas produzidas de forma endógena. Existem provas agora de que a apresentação cruzada de epítopos de antigénios adquiridos de forma exógena induz uma resposta mediada por linfócitos T CD8. Também foi proposto que esta via de sensibilização é mais 83 eficaz no desenvolvimento de respostas imunes mediadas por linfócitos T CD8. Recentemente ocorreram achados similares para respostas mediadas por CD4. As provas crescentes sugerem que os epítopos de linfócitos T CD4 derivados de proteínas intracelulares podem ser processados e apresentados no contexto de MHC de classe II.
Para determinar se seria requerido ImmunoBody secretado para a indução de respostas de linfócitos T CD8 e CD4, prepararam-se construções de ImmunoBody que continham o epítopo de gplOO restringido por HLA-A2 IMDQVPFSV no local CDR Hl e o epítopo auxiliar de HepB restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL no local de CDR LI sem sequências líder na cadeia pesada ou cadeia leve (Figuras 10 e 11).
Foram imunizados ratinhos HHDII três vezes em intervalos semanais por via intradérmica com ADN de ImmunoBody por meio do bombardeamento de partículas. Os esplenócitos foram analisados posteriormente por meio de elispot de IFNy em relação à presença de respostas de linfócitos T CD8 e CD4 específicas de epítopo. Quando as respostas foram analisadas em relação a resposta de CD8 específica de gplOO, observou-se que a retirada da sequência líder da cadeia pesada da construção de ImmunoBody tinha como resultado uma redução das respostas específicas de epítopo, no entanto as respostas de CD4 não foram afectadas (Figura 48a). A retirada da sequência líder da cadeia pesada afectou à secreção de cadeia pesada pelas células CHO-S transfectadas (Figura 48b) . A retirada da sequência líder da cadeia leve, evitando deste modo a secreção de cadeia leve, não pareceu afectar às respostas de CD8 ou CD4 específicas de epítopo (Figura 48c) . As respostas de CD8 reduziram-se significativamente na ausência de uma sequência líder na cadeia pesada, mas as respostas de CD4 não foram afectadas (Figuras 48c e d). 84
Estes dados implicam que a secreção de cadeia pesada é importante para a indução eficaz de uma resposta de linfócitos T CD8, o que sugere que os epítopos de CD8 estão a passar por apresentação cruzada. Em segundo lugar, implica que os epitopos de CD4 derivam de ImmunoBody intracelular para induzir uma resposta imune.
Exemplo 10 - Respostas de CTL reduzidas sem Fc devido a falta de secreção de proteína
Esta experiência examina se a presença da região Fc é beneficiosa para estabelecer uma resposta imune eficaz. A região Fc foi retirada da construção de ImmunoBody, que contém o epítopo de TRP2 restringido por H-2Kb SVYDFFVWL em CDR H2 e o epítopo de HepB CD4 restringido por I-Ab TPPAYRPPNAPIL em CDR LI (0CIB15), incorporando um codão de parada antes do Fc para evitar a transcrição e tradução (Figura 9).
Foram imunizados ratinhos C57BI/6 três vezes a intervalos semanais por via intradérmica com ADN de ImmunoBody por meio do bombardeamento de partículas. Os esplenócitos foram analisados posteriormente por elispot de IFNy em relação à presença de respostas de linfócitos T CD8 e CD4 específicas de epítopo.
Os ratinhos imunizados com a construção de ImmunoBody sem a região Fc geraram um nível baixo de resposta específica de péptido TRP2 que era capaz de reconhecimento de nível muito sob da linha celular tumoral B16F10 em comparação com uma construção com a região Fc (Figura 49a). A análise das respostas específicas de péptido auxiliar HepB e TRP2 de várias experiências demonstra que as construções sem a região Fc geram respostas específicas de péptido TRP2 significativamente mais baixas (Figura 49b) . No entanto, as respostas auxiliares de HepB não foram afectadas pela retirada da região Fc (Figura 49c) . Isto é coerente com os resultados anteriores dos investigadores 85 que mostram que a ajuda funciona melhor na cadeia leve quando não é secretada e funciona portanto por apresentação directa. Ao contrário, as respostas de CTL são estimuladas por apresentação tanto directa como indirecta e a segunda pode beneficiar-se da direcção a Fc. Como alternativa a construção sem Fc tem como resultado menor secreção da cadeia pesada truncada o que pode explicar a resposta reduzida. Obteve-se por engenharia genética portanto um ImmunoBody que codificava TRP-2 com uma IgG2 (DGIB33) e uma região constante de IgG3 (DCIB65). A primeira não deveria unir-se a CD64, mas pode ser unida a CD32 e também pode ser unida ao receptor IV de Fc em ratinhos. A IgG3 humana pode ser unida tanto a CD32 como CD64. Ambos ImmunoBodies estimularam respostas de CTL fortes (Figura 49e) . Isto sugere que a direcção de Fc não é um componente forte da apresentação indirecta. Para verificar adicionalmente esta questão, o domínio de direcção Fc de IgGt foi substituído com o domínio de IgG2 equivalente e vice-versa (DCIB56, 67, Figuras 15 e 16). Ambas as construções estimularam respostas de CTL fortes (Figura 49e). Isto pode ser devido a que as vacinas de ImmunoBody™ somente secretam cadeia pesada que pode não estar associada e permitir a união de Fc (Figura 49f e g).
Exemplo 11- A imunização com ImmunoBody potência as respostas imunes e supera a regulação observada do antigénio completo. Também permite a identificação de novos epitopos de linfócitos T heterólogos.
Isto pode conduzir ao segundo benefício de imunização com um epítopo de linfócitos T que codificam anticorpo humano que é, a diferença da maioria dos antigénios próprios, um portador inerte que não expressa epitopos reguladores. Um ImmunoBody™ que expressa um epítopo de gplOO ou um epítopo de TRP-2 estimulou uma resposta de linfócitos T de alta avidez de alta frequência (frequência 86 3 _ ι ο 1/10 avidez 10 Μ) enquanto que a imunização com o antigénio de gplOO ou TRP-2 completo estimulou linfócitos T com baixa frequência e avidez (frequência 1/105 avidez 10-7 M). O esgotamento de CD25 restaurou parcialmente a resposta ao antigénio, mas o ImmunoBody ainda era 100 vezes superior (Figura 50a e b).
De forma similar a imunização com ADN que codifica os primeiros 200 aminoácidos de Tie-2 ligado a Fc, não estimulou uma resposta imune aos 10 epítopos preditos superiores. A sequência dos primeiros 196 aminoácidos de Tie-2 foi introduzida nos algoritmos de predição em linha EpiJen e NetCTL. Ambos estes métodos levam em conta a excisão proteossómica e transporte de TAP além de predizer a afinidade de união a HLA-A*0201. Os algoritmos MHCpred e Syfpeithi foram utilizados também como exemplos dos algoritmos de predição mais antigos que somente levam em conta a afinidade de união ao MHC predita. A molécula de Tie-2 completa poderia conter epítopos de CTL adicionais que podem exercer um efeito imunodominante sobre os presentes nos primeiros 196 aminoácidos. A sequência completa de Tie-2 foi introduzida também portanto nos mesmos algoritmos para obter os intervalos de cada epítopo predito da molécula completa. Os péptidos que não eram homólogos em ratinhos e homens foram descontados. Seleccionaram-se seis dos péptidos restantes que se prediziam consistentemente que representavam bons epítopos de CTL por vários algoritmos diferentes de predição. As pontuações relativas obtidas com os diferentes algoritmos para cada um destes péptidos, junto com resultados para Z83 (um epítopo previamente identificado) , são resumidos no Quadro 6.
Dados adicionais da análise de sobrenadante de células CHO-S transfectadas demonstram que somente as construções com epítopos de CTL incorporados na CDRH3 ou CDRL3 são 87 secretadas como anticorpo intacto (Figura 20e) . Ao contrário, a incorporação de qualquer epítopo dentro da CDRH1 ou CDRH2 permitiu a secreção de quantidades pesadas, mas baixas de anticorpo intacto inclusive se não foi incorporado nada dentro da cadeia leve e secretado. A incorporação de qualquer epitopo dentro de CDRLl da cadeia leve tinha como resultado secreção de nivel baixo da cadeia leve inclusive se somente havia um epitopo incorporado na CDRH3 da cadeia pesada.
Para determinar se existe um repertório de linfócitos T em ratinhos transgénicos HLA-A*0201 que reconheça qualquer dos epítopos de CTL preditos de Te-2, os animais foram imunizados com a construção de ADN de Tie2 C200hFc nativa (Ramage et al. Int. J. Câncer 2004; 110: 245-250) e os esplenócitos foram explorados em relação a respostas de IFNy especificas de péptido num ensaio de ELISPOT. Imunizou-se um grupo separado de ratinhos com C200hFc depois de tratamento com PC61, como antes, 4 dias antes da imunização com ADN.
Os ratinhos que foram imunizados com a construção de C200HFc nativa não montaram uma resposta de IFNy que reconhecesse Z83, independentemente de se fossem esgotados os linfócitos T reguladores CD25+ dos animais antes da imunização ou não. Não houve respostas de IFNy significativas para nenhum dos novos péptidos ensaiados de animais em que não se esgotaram os linfócitos T reguladores antes da imunização, com a excepção de Z284 que parecia estimular uma resposta num animal (M3) com uma média de 69 SFC/milhão de esplenócitos (Figura 50c e d). Dos animais em que foram esgotados os linfócitos T reguladores antes da imunização de ADN, 213 animais (my e M3) demonstraram uma resposta de IFNy à reestimulação com péptido Z282, com valores médios de 320 e 94 SFC/milhão de esplenócitos respectivamente. Ml também demonstrou uma resposta parcial à reestimulação com Z285, com uma média de 85 SFC/milhão de esplenócitos.
Os resultados aparentemente em conflito do rastreio in vivo dos epitopos de CD8+ preditos de Tie-2 poderiam ser o resultado de imunodominância, já que as respostas de IFNy dos ratinhos que foram imunizados com a construção de C200HFc nativa na ausência de células CD25+ pareciam inclinar-se em direcção a um péptido predominante. Para investigar adicionalmente o repertório de linfócitos T que está disponível para responder ao epítopo Z282, na ausência de competição de outros epitopos de CD8 + potenciais, imunizou-se a um grupo de ratinhos HHD com o péptido de Z282 em IFA na presença ou ausência de linfócitos T reguladores CD25+. Todos os ratinhos imunizados com Z282 montaram respostas de IFNy específicas de péptido, inclusive quando foram imunizados na presença de linfócitos T reguladores CD25+. 0 ratinho 3 dos animais não empobrecidos montou a resposta mais alta, com um valor médio de 215 SFC/milhão de células. A resposta mais alta dos animais empobrecidos foi observada do ratinho 2 com um valor médio de 137 SFC/milhão de células (Figuras 50e e f).
As respostas induzidas por imunização com péptido continuam a ser de baixa frequência. Para examinar se seria possível gerar respostas de maior frequência se o epítopo fosse retirado de qualquer influência reguladora gerada pelo antigénio completo, o epítopo de z282 (também conhecido como zl2) foi introduzido por engenharia genética no local Hl de uma construção de ImmunoBody junto com Hep B CD4 em LI (DCIB71, Figura 51). Foram imunizados depois ratinhos transgénicos HLA-A2 com péptido zl2 ou ADN de ImmunoBody (por meio de bombardeamento de partículas) três vezes a intervalos semanais e depois foram analisados em relação à presença de respostas imunes específicas de epítopo. Todos os ratinhos imunizados com péptido zl2 89 mostram respostas específicas de epítopo de baixa frequência e avidez (Figura 50g) . No entanto, quando o epítopo zl2 é introduzido por engenharia genética na construção de ImmunoBody induzem-se respostas de maior frequência e avidez em todos os ratinhos (Figura 50h).
Para resumir, se forem empobrecidas as células CD25 antes da imunização, seria estimulada uma resposta imune a 3/10 dos epítopos de Tie2. De forma similar se um destes epítopos fosse apresentado como um péptido, poderiam ser geradas respostas imunes fracas. No entanto, se este epítopo fosse apresentado dentro de uma construção de
TM
ImmunoBody seriam geradas respostas de linfócitos T de alta frequência e alta avidez. Estes resultados sugerem que existem epítopos de T-reg dentro dos primeiros 200 aminoácidos de Tie-2 que inibem respostas de CTL. Se estes T-reg ou seus epítopos fossem retirados seria possível revelar uma resposta a antigénios próprios que pode ser potenciada adicionalmente por apresentação dentro de um
Nome1 Começo2 Péptido3 EpiJen4 NetCTL5 Sytpeithi6 MHCPred7 Pontuação (CI50 nM) Intervalo Pontuação Intervalo Pontuação Intervalo Pontuação (CI50 nM) Intervalo Z83 124 FLPATLTM T — — 0,73 9 (27) 19 18 (55) 2978 96 (55) Z282 27 ILINSLPL V 0,05 1 1,39* 1 29 1 (2) 16 2 (6) Z283 146 VLIKEEDA V 0,23 2 (5) 0,7 10 (31) 24 5 (11) 89 9 (34) Z284 64 LMNQHQD PL 0,98 3 (7) 0,88* 3 (11) 21 9 (32) 113 11 (51) Z285 8 VLCGVSLL L 1,19 4 (10) 0,94* 2 (9) 24 4 (10) 242 21 (125) Z286 34 LVSDAETS L — — 0,74 8 (26) 19 15 (52) 887 65 (349) 90 Z287 26 LILINSLP L — — 0, 88* 4 (12) 23 7 (16) 607 57 (271) Z1S (flu) GILGFVFT L 0,19 a> 1,29 (2) 30 419 (87)
Quadro 6. Epítopos de CTL restringidos por HLA-A*0201 preditos de Tie-2, 1Nome do péptido. 2 Posição de começo do resíduo de aminoácido dentro da molécula de Tie-2. 3
Sequência peptídica. 4 Predição utilizando o servidor web EpiJen. A pontuação é proporcionada em unidades de CI50 nM, representando as pontuações mais baixas péptidos de maior afinidade. 6 Predição utilizando o servidor web NotCTL 1.2. A pontuação representa a soma ponderada de três métodos de predição individuais, indicando uma ponderação relativa de união a MHC de 1 uma pontuação acima do valor limite de 0,75 identificado como o ponto de corte para epítopos de CTL do conjunto de dados obtido para epítopos conhecidos. Predição utilizando o programa SYFPEITHI. A pontuação máxima para péptidos de união a HLA-A*0201 é 36. 7 Predição utilizando o método aditivo de MHCPred para predizer a afinidade dos péptidos por MHC e TAP. A pontuação é proporcionada de novo em unidades de CI50 nM, representando as pontuações mais baixas péptidos de maior afinidade. Os valores de CI50 sugeridos estão entre 0,01 e 5000 nM. Para todos os métodos de predição, os valores de intervalo indicam a ordem em que os epítopos são preditos do fragmento de 196 aminoácidos, representando os valores entre parenteses as predições de intervalo da molécula de Tie-2 completa. Os valores obtidos para o epítopo de Z18 CTL conhecido derivado da proteína de matriz do vírus da gripe A são incluídos para comparação.
Exemplo 12-0 papel de Fc xenogénico ao proporcionar ajuda de linfócitos T e o requisito de ajuda de linfócitos T específica de antigénio 91 A estimulação de respostas de linfócitos T de alta avidez habitualmente requer ajuda de linfócitos T durante a sensibilização. Concebeu-se originalmente que esta se proporcionaria pelo epítopo auxiliar estranho Hep B codificado dentro da cadeia leve. De facto, são geradas respostas auxiliares fortes para este epítopo. No entanto, a medida que se secretava a cadeia pesada e não a cadeia leve embora o epítopo de hep B poderia ter proporcionado ajuda para a apresentação directa quando se produzisse ambas cadeias pela mesma APC é pouco provável que pudesse proporcionar ajuda para a cadeia pesada apresentada de forma indirecta já que é pouco provável que esta se capte pela mesma célula apresentadora de antigénios. Foram imunizados portanto ratinhos com um vector de ADN que codifica somente a cadeia pesada. Geraram-se ainda respostas de CTL de alta avidez e alta frequência (Figura 53 a e b). Isto implica que não se requer ajuda ou que o Fc humano que é xenogénico em ratinhos está a proporcionar ajuda estranha ligada. Avaliou-se portanto uma construção de IgG2a de ratinho em relação a secreção de cadeias pesadas e leves (Figura 49g) e rastreou-se em relação a geração de respostas imunes (OCIB53 Figura 54). Embora ainda proporcionasse resposta de linfócitos T de alta avidez e alta frequência estas não foram tão fortes como a construção humana equivalente o que sugere que o Fc xenogénico estava a proporcionar ajuda ligada (Figura 53c e d) . Foi incorporado depois um epítopo de gyplOO HLA-DR4 na construção de IgG2a de ratinho (DCIB64, Figura 55) para proporcionar ajuda ligada para geração de CTL, mas também ajuda de linfócitos T específicos de antigénio para estimular a inflamação dentro do ambiente tumoral. Estas construções estimulam respostas auxiliares e de CTL de alta avidez e alta frequência (Figura 53e e f). Pode ser 92 utilizado uma construção de hlgGl que expresse o mesmo epitopo em pacientes humanos.
Exemplo 13-0 processamento de imunoproteassoma é importante na geração de respostas de epítopos dentro de construções de ImmunoBody
Sugeriu-se que o imunoproteassoma tem a capacidade de alterar a disposição dos epítopos gerados de antigénios próprios já que possui um padrão diferente de excisão. Em alguns casos, geram-se novos epítopos após a regulação positiva do imunoproteassoma e em outros se destruem os epítopos. Existem provas de que o imunoproteassoma é incapaz de gerar vários epítopos derivados de antigénios de melanoma, a saber MelanA/MART-1, gplOO 209-217 e Tirosinase 369-377 (0hapiro et al 2006. J Immunol; 176:1053-61). Chapiro et al sugeriram que a capacidade para processar e apresentar o epitopo de gplOO está relacionada com a regulação positiva do imunoproteassoma. Acredita-se que as DC maduras sejam responsáveis pela sensibilização de respostas imunes e sabe-se que expressam constitutivamente o imunoproteassoma (Macagno et al. 2001. Eur J Immunol; 31: 3271-80). 0 epitopo de gplOO209-217 foi introduzido portanto por engenharia genética no local de CDRH1 de uma construção de ImmunoBody e ensaiou-se em relação a sua capacidade para induzir respostas imunes específicas de péptido em ratinhos transgénicos HLA-A2. Não foram observadas respostas específicas de péptidos desta construção (Figura 56). No entanto, quando o epitopo se modificou para possuir uma metionina na posição 210 (210M) em lugar de treonina isto evitou sua excisão pelo imunoproteassoma e observaram-se respostas específicas de epitopo (Figura 56).
Também foram ensaiadas um péptido restringido por HLA-A2 derivado de VEG32 (aa 773-781 VIAMFFWLL) e dois péptidos de hTERT modificados (aa 572-580 YLFFYRKSV e aa 988-997 YLQVNSLOTV) em relação a geração de respostas de 93 construções de ImmunoBody. Descobriram-se estes epítopos inicialmente por predição de epítopos in silico e imunização por péptido negando portanto o requisito de processamento proteossómico. No entanto, são apresentados na superfície de células hospedeiras tumorais/endoteliais o que sugere que são processados a partir de antigénio completo por meio do proteassoma constitutivo. Nenhum destes epítopos gerou respostas quando foram introduzidos por engenharia genética na construção de ImmunoBody o que sugere que pode ser requerido o processamento por meio do imunoproteassoma para geração eficaz de respostas imunes. Exemplo 14- Diferentes métodos de imunização são eficazes na indução de respostas imunes de vacina de ImmunoBody
Foi mostrado que a vacina de ImmunoBody é eficaz na indução de respostas de CD8 e CD4 de alta frequência e avidez quando se administram por meio de bombardeamento de partículas. A vacina de ImmunoBody foi ensaiada posteriormente em relação a geração de respostas de linfócitos T utilizando outros métodos de imunização.
Foram imunizados ratinhos C57B1-6 com ADN de
ImmunoBody que continha o epítopo de TRP2 em CDRH2 por meio da via i.d. ou i.m. As imunizações foram combinadas com e sem electroporação e foram realizadas três vezes a intervalos semanais.
Os ratinhos imunizados com bombardeamento de partículas mostram respostas específicas de péptido TRP2 de alta frequência. Estas são comparáveis em ratinhos imunizados por meio de via i.m. ou i.d. combinada com electroporação. A imunização, por meio de via i.m. ou i.d. na ausência de electroporação gerou respostas específicas de péptido TRP2 de frequência menor (Figura 57a). Todas as respostas específicas de péptido TRP2 são de alta avidez de acordo com a medição por titulação de péptidos (Figura 57b) . 94
Exemplo 15 - A imunização com ImmunoBody induz despigmentação de tipo vitiligo e protege contra desafio tumoral Já que os ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody geram respostas imunes capazes de actividade citotóxica frente à linha celular tumoral altamente metastásica e escassamente imunogénica B16F10, a vacina foi ensaiada em relação a eficácia protectora in vivo.
Foram imunizados ratinhos com ADN de IB (DCIB1B; Figura 30) por meio de bombardeamento de partículas na pele afeitada do abdómen a intervalos de cinco semanas. Na metade do programa de imunizações, injectou-se aos ratinhos i.v. 1 x 104 células B16F10 que expressavam IFNa que forma tumores metastásicos no pulmão. Quando se permitiu que o pelo crescesse de novo depois da última imunização, observou-se que os ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody tinham crescimento de pelo alvo no local de imunização (Figura 58a). Sete semanas depois da injecção de células tumorais, os ratinhos foram sacrificados e foi analisado o número de metástase de pulmão internas e externas. Os ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody mostraram uma redução significativa no número de metástase de pulmão em comparação com ratinhos de controlo não tratados (Figura 58b).
Também se imunizou aos ratinhos com ADN de IB (DCIB18) por meio de bombardeamento de partículas a três intervalos semanais. Sete dias depois da imunização final os ratinhos foram desafiados com 2 x 104 células B16F10 que expressavam IFNa de forma subcutânea. Os ratinhos foram monitorizados em relação ao crescimento tumoral e sobrevivência. Os ratinhos foram sacrificados uma vez que os tumores alcançassem o limite máximo de acordo com as regulações do Ministério do Interior. Os ratinhos imunizados com ADN de ImmunoBody mostraram crescimento tumoral subcutâneo 95 significativamente mais lento e sobrevivência prolongada (Figura 58c e d). A resposta especifica de TRP2 está mediada por CD8 já que o esgotamento das células CD8+ suprime a resposta. Identificaram-se os linfócitos T CD8 como um factor importante na imunização antitumoral e os resultados dos investigadores mostram que a imunização com ADN de ImmunoBody induz a imunidade antitumoral in vivo num modelo de ratinho. Todos os ratinhos imunizados sem sinais de doença mostraram despigmentação de tipo vitiligo da pelagem no local de imunização. Anteriormente, o vitiligo era associado com frequência à protecção tumoral em ratinhos e foi correlacionado em grande medida com imunoterapia de IL-2 bem-sucedida em pacientes com melanoma metastásico (Overwijk et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1999; 96: 2982-7; Lance et al, Câncer Research 2004; 64: 1509-14; Steitz et al, Câncer Immunol Immunother 2006, 55: 246-53; Rosenberg & White, J Immunother Emphase Tumor Immunol 1996;19: 81-4). Exemplo 16 - A imunização com ImmunoBody retarda significativamente o crescimento tumoral.
Foi mostrado previamente que a imunização com
ImmunoBody protege significativamente contra a apresentação de tumor. A vacina foi ensaiada posteriormente em relação a eficácia num ambiente terapêutico.
Injectou-se aos ratinhos C57BI/6 s.c. 2 x 104 células tumorais B16F1C. Quatro dias depois da injecção imunizou-se aos ratinhos com ADN de ImmunoBody que continha epitopo de TRP2 em C0RH2 ou ADN de ImmunoBody de controlo. Realizaram-se imunizações repetidas nos dias 11 e 18 depois da injecção do tumor. O crescimento tumoral foi monitorizado a intervalos de 3-4 dias. Os ratinhos imunizados com ImmunoBody demonstram um retardamento significativo do 96 crescimento do melanoma B16F10 agressivo em comparação com ratinhos imunizados com o controlo (Figura 59a).
Realizou-se também um estudo similar utilizando a linha tumoral de IFNalfa B16F10 menos agressiva. Injectou-se aos ratinhos C57BI/6 2 x 104 células tumorais s.c. e imunizaram-se no dia 14 com ADN de ImmunoBody ou ADN de controlo. Realizaram-se imunizações repetidas nos dias 21 e 28 depois da injecção do tumor. Os ratinhos imunizados com ImmunoBody mostraram crescimento tumoral significativamente menor que os ratinhos imunizados com controlo no dia 47 depois da injecção tumoral (Figura 59b) . Os dados anteriores sugeriram que o esgotamento de linfócitos T reguladores potência a geração de respostas imunes, portanto realizou-se um estudo antitumoral. Neste estudo injectou-se aos ratinhos 2 x 104 células tumorais B16F10 s.c. e foram imunizados no dia 4, 11 e 18 com ADN de ImmunoBody ou ADN de controlo. No dia 0 foram esgotados os linfócitos T reguladores dos ratinhos por meio de injecção de anticorpo anti-CD25 (PC61). Simultaneamente com a segunda imunização também se injectou aos ratinhos anticorpo anti-CTLA4 uma vez que foi mostrado também que o bloqueio de CTLA-4 é benéfico na inibição de linfócitos T reguladores. 0 crescimento tumoral foi monitorizado e embora a imunização com ImmunoBody retarda significativamente o crescimento tumoral (p=0,0188) isto foi melhorado adicionalmente por tratamento com anticorpos anti-CD25 e anti-CTLA-4 (p=0,001) (Figura 59c). 0 tratamento com anticorpo anti-CD25 não pareceu retardar significativamente o crescimento tumoral observado em ratinhos imunizados com ImmunoBody.
Exemplo 17 - Podem ser geradas respostas imunes de construções de ImmunoBody expressas de diferentes cadeias principais de vector. 97
Foram analisadas as respostas quando as construções de ImmunoBody foram expressas a partir de diferentes cadeias principais de vector. Foi introduzida por engenharia genética uma construção de ImmunoBody que continha epítopo de gpl00DR7 em CDRH1, epítopo de TRP2 em CDRH2 e epítopo de gpl0 0DR4 em CDRH3 com cadeia leve de tipo selvagem nos vectores de expressão doble OCOrig e DCVax (DCIB54, Figuras 18 e 29) . Foram imunizados ratinhos transgénicos HLA-DR4 por meio de bombardeamento de partículas três vezes a intervalos semanais e as respostas foram analisadas ex vivo por ensaio de elispot de IFNy.
Realizaram-se experiências similares utilizando uma construção de ImmunoBody que continha epítopo de gpl00DR7 em CDRH1 e CDRL3, epítopo de TRP2 em CDRH2, epítopo de gpl0 0DR4 em CDRH3 e CDRL1 (DCIB68, Figura 60). Esta construção foi inserida por engenharia genética nas cadeias principais de vector tanto OCOrig, DCOrig desprovisto do promotor de SV40, como DCVax.
Os ratinhos imunizados com a construção de ImmunoBody no vector Orig (Bl-3) demonstram respostas de epítopo de frequência similar em comparação com a construção de Immunobody no vector pVax (Cl -3) (Figura 61).
Em resumo, a tecnologia de ImmunoBody tem capacidade superior para induzir respostas imunes de CD8 e CD4 de alta frequência e avidez a partir de uma armação de anticorpo não imunogénico que pode evitar eficazmente o crescimento tumoral in vivo. Tem a capacidade de dirigir-se a até seis antigénios diferentes simultaneamente e tem a capacidade de evitar o problema dos linfócitos T reguladores que com frequência aparece quando são utilizados imunogénios de antigénio completo. Esta tecnologia apresenta uma abordagem nova para a vacinação e demonstra o potencial para que os sistemas de ImmunoBody sejam utilizados como uma vacina 98 multivalente para muitos outros tipos de cancro e doenças relacionadas com microrganismos. 99
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> SCANCELL LIMITED
<120> ÁCIDOS NUCLEICOS
<130> P42394WO/NJL <140> PCT/EP2008/053761 <141> 28-03-2008 <150> GBO70 6 0 7 0.0 <151> 28-03-2007 <160> 247 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo restringido por I-Ad de hemaglutinina de gripe <400> 1
Phe Glu Arg phe Glu lie Phe Pro Lys Glu 15 10 <210> 2 100 <211> 9
<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Tie-2 ζ84 <400> 2
Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Vai 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR7 <400> 3
Gly Thr Gly Arg Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu vai Thr vai 15 10 15
Tyr His <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Tie-2 Z12 <400> 4 101 ile Leu rle Asn Ser Leu Pro Leu vai 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo gplOO restringido por HLA-A2 <400> 5 ile Met Asp Gin vai Pro Phe Ser vai 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de HepB S Ag <400> 6 ile Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr ser Leu 1 5 10
<210> 7 <211> 9 <212> PRT 102 <213> Artificial <220> <223> Epitopo de gplOO wt ITDQVPFSV <400> 7
Ile Thr Asp Gin vai Pro Phe Ser Vai 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de ovoalbumina <400> 8
Ser ile ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de TRP2 <400> 9
Ser vai Tyr Asp Phe Phe Vai Trp Leu 1 5 103
<210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epítopo de GP100 de tipo selvagem/GPl00210M <4 0 0> 10 Thr ile Thr Asp Gin vai Pro Phe Ser vai 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de GP100 F71 <4 0 0> 11 Thr ile Thr Asp Gin vai Pro Ile Ser vai 1 S 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de GP100 F7L 104 <400> 12
Thr lie Thr Asp Gin vai Pro Leu Ser vai 15 10 <210> 13 <211> 10
<212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de GP100 F7Y <400> 13
Thr ile Thr Asp Gin vai Pro Tyr ser vai 15 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo restringido por I-Ab/epítopo de HepB CD4 <400> 14
Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro rle Leu 1 5 10 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> 105 <223> Epítopo de gplOO CD4 restringido por HLA-DR4 <400> 15
Trp Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin Ara Leu Asp 15 10 15 <210> 16 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Local enzimático seleccionado (Fsp 1) e sequência oligonucleotidica epitópica para CDR Hl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Sequência de ADN epitópica <400> 16 nnnnnntggg ttcg 14 <210> 17 <211> 14 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Local enzimático seleccionado (Msc I) e sequência oligonucleotidica epitópica para CDR H2 <220> 106 <221> misc_feature <222> (2)..(7) <223> η é a, c, g, ou t <400> 17 tnnnnnncga ttca 14 <210> 18 <211> 10 <212> ADN <213> Artificial <220> sequência <223> Local enzimático seleccionado (Srf I) oligonucleotidica epitópica para CDR H3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(8) <223> n é a, c, g, ou t <400> 18 gannnnnntg 10 <210> 19 <211> 17 <212> ADN <213> Artificial <220> sequência
<223> Local enzimático seleccionado (Eco RV) oligonucleotidica epitópica para CDR LI 107 <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> η é a, c, g, ou t <400> 19 ctcttgcnnn nnntggt 17 <210> 20 <211> 12 <212> ADN <213> Artificial <220> e sequência <223> Local enzimático seleccionado (Ssp I) oligonucleotidica epitópica para CDR L2 <220> <221> misc_feature <222> (5)..(10) <223> n é a, c, g, ou t <400> 20 ctacnnnnnn ag 12 <210> 21 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Local enzimático seleccionado (Hpa I) e sequência oligonucleotidica epitópica para CDR L3 108 <220> <221> misc_feature <222> (10)..(15) <223> n é a, c, g, ou t <400> 21 tattactgcn nnnnnttcgg tggagg 26 <210> 22 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador Hl <400> 22 cctgagaatg tcctgctgcg caggctccgg ggaag 35 <210> 23 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador H2 <400> 23 cattggtagt ggtggccatt tccagagac 29
<210> 24 <211> 37 <212> ADN 109 <213> Artificial <220> <223> Iniciador H3 <400> 24 ccgtgtatta ctgtgcccgg gccaaggaac cacggtc 37 <210> 25 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador LI <400> 25 ggagccagcc tcgatatctg cagaaaccag gc 32 <210> 26 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador L2 <400> 26 ccacagctcc taatattcag tggcagtgga tc 32 <210> 27 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> 110 <223> Iniciador L3 <400> 27 gctgaggata ccggagttaa ccaaggtgga aat 33 <210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador huHeClonR <400> 28 cgcctgagtt ccacgacacc 20 <210> 29 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador huLidonR <400> 29 caggcacaca acagaggc 18 <210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> 111 <223> Iniciador CMV Directo <400> 30 ggcgtggata gcggtttgac 20 <210> 31 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador OrigstophuHeCHl Dir <400> 31 ccaaggtgga caagaaagtt tgacccaaat cttgtgaca 39 <210> 32 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador origstophuHeCHl Inv <400> 32 gagttttgtc acaagatttg ggtcaaactt tcttgtccac cttgg 45 <210> 33 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <220> 112 <223> Iniciador pOrig ligero sem líder Dir <400> 33 aggatccacc atggatgtgt tgatgaccc 29 <210> 34 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador pOrig pesado sem líder Dir <400> 34 aaagcttatg caggtgcagc tggtg 25 <210> 35 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador huigG3lnv2# <400> 35 atcgatatca tttacccgga gacagg 26 <210> 36 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador IgG3hudir2 113 <400> 36 actgtctcca gcgcttccac caag 24 <210> 37 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador IgG2 dir <400> 37 agtcaccgtt tccagcgctt ccac 24 <210> 38 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador IgG2 Inv <400> 38 agtggatatc atttacccgg agacagg 27 <210> 39 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220>
<223> Iniciador HIBF 114 <400> 39 aacagtctga gggctgagga 20 <210> 40 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador huigGIPVA INV <400> 40 agactgacgg tccccccgcg actggaggtg ctgg 34 <210> 41 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador HuigG2ELLGInv <400> 41 agactgacgg tcctcctaac agttctggtg ctgg 34
<210> 42 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador SV40premDIR <400> 42 115 agctagcatc agcacgtgtt gacaattaat catc 34 <210> 43 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador Sv40premlnv <400> 43 aacgattccg aagcccaacc tttcatag 28 <210> 44 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador migG2aClAfelF2 <400> 44 tttacagcgc taaaacaaca gccccatcgg tc 32 <210> 45 <211> 34 <212> ADN <213> <220> Artificial <223> Iniciador migG2axbaRA <400> 45 tctagatcat ttacccggag tccgggagaa gctc 34 116 <210> 46 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador MoLCIBsiFl <400> 46 tttcgtacgg atgctgcacc aactgtatcc 30 <210> 47 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador MoLCxhoRl <400> 47 tttctcgagt caacactcat tcctgttgaa gc 32 <210> 48 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador MOIgG2BamHI Dir <400> 48 ccttgacctg gaactctggt tccctgtcca gtggtg 36 <210> 49 117 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador MoigG2BamHI Inv <400> 49 caccactgga cagggaacca gagttccagg tcaagg 36 <210> 50 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador MoigG2XhoI Dir <400> 50 gcagctcagt gactgtaact tcgagcacct ggcccagc 38 <210> 51 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador MoigG2xhoI Inv <400> 51 gctgggccag gtgctcgaag ttacagtcac tgagctgc 38 <210> 52 <211> 59 118 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador wtkappavarLIDir <400> 52 aacacctatt ctcttgcaga tctagtcaga gcctggtaca tagtaatgga tagaatggt 59 <210> 53 <211> 59 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador wtkappavarLl Inv <400> 53 ctgactagat accattctaa ataggtgttt ccattactat gtaccaggct ctgcaagag 59 <210> 54 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador TRP2 Murino Directo <400> 54 tttctaagct tatgggcctt gtgggatggg ggcttc 36 <210> 55 119 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador TRP2 Murino Reverso <400> 55 tttctgatat ctcaggcttc ctccgtgtat ctcttgc 37 <210> 56 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador GP100 Directo <400> 56 tttctgatat catgggtgtc cagagaagga gcttc 35 <210> 57 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador GplOO Reverso <400> 57 tttctctcga gtcagacctg ctgtccactg aggagc 36 <210> 58 <211> 35 120 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador Fosforilado (exemplo de epitopo de TRP2) <400> 58 tagtgtttat gatttttttg tgtggctccg attca 35 <210> 59 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> com <223> Epitopo de auxiliar CD4 ou CTL CD8 (TRP2, A2 restrição por HLA, Kb) <400> 59 agtgtttatg atttttttgt gtggctc 27 <210> 60 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> com <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (GP100, A2 restrição por HLA) <400> 60 accattactg accaggtgcc tttctccgtg 30 <210> 61 121 <211> 30
<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (GP100 (210M), A2 com restrição por HLA) <400> 61 accattatgg accaggtgcc tttctccgtg 30 <210> 62 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (GP100 (F7L)) <400> 62 accattactg accaggtgcc tttgtccgtg 30 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epítopo de GP100 (F7L), A2 com restrição por HLA <400> 63 lie Thr Asp Gin vai Pro Leu Ser vai 1 5 <210> 64 122 <211> 48
<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (GP100, DR0401 restrição por HLA) <400> 64 tggaacaggc agctgtatcc agagtggaca gaagcccaga gacttgac 48 <210> 65 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (HEPB S AG, Kd(CTL) com restrição por HLA) <400> 65 ataccgcaga gtctagactc gtggtggact tctctc 36 <210> 66 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (nucleoproteína Hep8, I-Ab com restrição por HLA (auxiliar)) <400> 6 6 actcctccag cttatagacc accaaatgcc cctatccta 39 123 <210> 67 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> com com <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (MAGE3, A2 restrição por HLA) <400> 67 ttcctgtggg gtccaagggc cctcgtt 27 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (MAGE3, A2 restrição por HLA) <400> 68
Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu vai <210> 69 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (Z83), A2 com restrição por HLA) 124 <4 Ο Ο> 6 9 ttcctaccag ctactttaac tatgact 27 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (z83), A2 com restrição por HLA) <400> 70
Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met Thr 1 5 <210> 71 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (z84), A2 com restrição por HLA) <400> 71 ttcctaccag ctactttaac tatggtt 27 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> 125 <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (Z84), A2 com restrição por HLA) <400> 72
Phe Leu Pro Ala Thr Leu Thr Met vai 1 5 <211> 27
<212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (z9), A2 com restrição por HLA) <400> 73 gggatggtgg aaaagccctt caacatt 27 <210> 74 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (29), A2 com restrição por HLA) <400> 74
Gly Met Val Glu Lys Pro Phe Asn lie 1 5 126 <210> 75 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (mZ9), A2 com restrição por HLA) <400> 75 gggatggtgg aaaagccctt caacgtt 27 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Tie2 (mZ9), A2 com restrição por HLA) <400> 76
Gly Met vai Glu Lys Pro Phe Asn Vai 1 5 <210> 77 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (FLU HA, I-Ad com restrição por HLA (auxiliar)) 127 <400> 77 tttgaaaggt ttgagatatt ccccaaggaa 30 <210> 78 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (ovoalbumina, Kb com restrição por HLA) <400> 78 agtataatca actttgaaaa actg 24 <210> 79 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Triosef osf ato isomerase (wt), DR0101 com restrição por HLA) <400> 79 ggggagctca tcggcattct gaacgcggcc aaggtgccgg ccgac 45 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> 128 <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Triosef osf ato isomerase (wt), DR0101 com restrição por HLA) <400> 80
Gly Glu Leu lie Gly Thr Leu Asn Ala Ala Lys vai Pro Ala Asp 15 10 15 <210> 81 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Triosef osf ato isomerase (ml), DR0101 com restrição por HLA) <400> 81 ggggagctca tcggcactct gaacgcggcc aaggtgccgg ccgac 45 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epítopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (Triosef osf ato isomerase (ml), DR0101 com restrição por HLA) <400> 82
Gly Glu Leu Ile Gly lie Leu Asn Ala Ala Lys Vai Pro Ala Asp 15 10 15 <210> 83 129 <211> 27
<212> ADN <213> Artificial <220> com <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (VEGFR2, A2 restrição por HLA) <400> 83 gtgattgcca tgttcttctg gctactt 27 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> com <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (VEGFR2, A2 restrição por HLA) <400> 84
Vai lie Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu 1 5 <210> 85 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial <220> com <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (mVEGFR2, A2 restrição por HLA) <400> 85 130 gtgcttgcca tggttcttct ggctactt 28 <210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> com <223> Epitopo de Auxiliar CD4 ou CTL CD8 (mVEGFR2, A2 restrição por HLA) <400> 86 val Leu Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu 1 5 <210> 87 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de <400> 87
Thr lie Thr Asp Gin Leu Pro Phe Ser Val 1 S 10 <210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> 131 <223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predito de Tie-2 (Z282) <400> 88 ile Leu Ile Asn Ser Leu Pro Leu vai 1 5 <210> 89 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predito de Tie-2 (Z283) <400> 89 vai Leu Ile Lys Glu Glu Asp Ala vai <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predito de Tie-2 (z284) <400> 90
Leu Met Asn Gin His Gin Asp Pro Leu 1 5 132 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predito de Tie-2 (z 2 8 5) <400> 91 vai Leu Cys Gly vai Ser Leu Leu Leu <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epitopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predito de Tie-2 ( z286) <400> 92
Leu vai Ser Asp Ala Glu Thr ser Leu 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> 133 <223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predito de Tie-2 (z 2 8 7) <400> 93
Leu ile Leu ile Asn Ser Leu Pro Leu l 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Epítopo de CTL restringido por HLA-A*0201 predito de Tie-2 ( Z18) <400> 94
Gly lie Leu Gly Phe vai Phe Thr Leu 1 S <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido restringido por HLA-A2 derivado de VEGFR2 <400> 95
Vai lie Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu 1 5 134 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptidos hTERT modificados <400> 96
Tyr Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser vai 1 s <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> péptidos hTERT modificados <400> 97
Tyr Leu Gin vai Asn Ser Leu Gin Thr Vai 15 10 <210> 98 <211> 1489 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Cadeia pesada quimérica de immunobody <400> 98 135 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tgatagaacc 240 tactatccag acactgtgaa gggccgattc accatttcca gagacaatag caagaacacc 300 ctgtatttgc aattgaacag tctgagggct gaggacacag ccgtgtatta ctgtgcaaga 360 cattatggtc actacgtgga ctatgctgtg gactactggg gtcaaggaac cacggtcacc 420 gtctccagcg ettecaeeaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 480 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 540 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 600 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 660 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 720 gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 780 ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 840 cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 900 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 960 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1020 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1080 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1140 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1200 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1260 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 1320 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgcga tgcatgaggc tctgcacaac 1380 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat gatctaaagg gcgaattcgc 1440 ccttaagggc gaattttgca gatatccatc acactggcgg ccgctcgag 1489
<210> 99 <211> 467 <212> PRT <213> Desconhecido 136 <220> <223> Cadeia pesada quimérica de immunobody <400> 99
Met 1 Gly Trp Ser cys ile ile Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly val His Ser Gin val Gin Leu val Glu Thr Gly Met Gly Trp Ser Cys 20 25 30 Ile Ile Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gin Val 35 40 45 Gin Leu Val Glu Thr Gly Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile 50 55 60 Ala 65 Tyr ile Gly Ser Gly 70 Gly ASP Arg Thr W Tyr pro Asp Thr val 80 Lys Gly Arg Phe Thr 85 Ile Ser Arg Asp Asn 90 Ser Lys Asn Thr Leu 95 Tyr Leu Glrt Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr cys 100 105 110 Ala Arg His 11S Tyr Gly His Tyr val 120 Asp Tyr Ala Val SS Tyr Trp Gly Gin SK Thr Thr val Thr Val 135 Ser Ser Ala Ser Thr 140 Lys Gly pro Ser vai phe pro Leu Ala pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 14S 150 155 160 Ala Leu Gly cys Leu 165 val Lys Asp Tyr Phe 170 Pro Glu Pro val Thr 175 val Ser Trp Asn ser ISO Gly Ala Leu Thr ser 185 Gly val His Thr Phe 190 pro Ala val Leu Gin 195 Ser ser Gly Leu Tyr 200 ser Leu Ser Ser val 205 val Thr val 137 ΡΓΟ Ser 210 Ser Ser Leu Gly Thr 21S Gin Thr Tyr Ile Hl Asn val Asn His ííl pro Ser Asn Thr Lys 230 Val ASp Lys Lys val 235 Glu pro Lys Ser cys 240 ASP Lys Thr His Thr cys pro pro Cys pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 ile Ser 27? Thr Pro Glu val Thr 280 Cys Val val val ASP 285 val Ser His Glu Asp Pro Glu val Lys phe Asn Trp Tyr val ASp Gly val Glu val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 31S 320 Arg Vai Vai Ser val Leu Thr val Leu His Gin ASp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro ile 340 345 350 Glu Lys Thr 355 lie ser Lys Ala Gly Gin Pro Arg Glu 365 Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg ASP Glu Leu Thr Lys Asn Gin val ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala val Glu 385 390 395 400 Trp GlU Ser Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro pro 405 410 415 vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr val 420 425 430 ASP Lys Ser 435 Arg Trp Gin Gin Gly 440 Asn val Phe Ser cys 445 ser val Met HiS Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 pro Gly Lys 465 138
<210> 100 <211> 732 < 212 > ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Cadeia capa quimérica de immunobody <400> 100 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta 180 gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccaeagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctttca aggttcacat 360 gttccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtacggt agcggcccca 420 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660 tgcgaagtca cccaccaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720 tgttgactcg ag 732
<210> 101 <211> 238 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Cadeia capa quimérica de immunobody <400> 101 139
Met Gly Trp Ser cys ile ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai HÍS Ser Asp 20 vai Leu Met Thr Gin 25 Ser pro Leu Ser Leu 30 Pro val Thr Pro Gly 35 Glu pro Ala Ser lie 40 Ser Cys Arg Ser Ser 45 Gin Ser Leu Vai His 50 Ser Asn Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Glu Trp Sr Leu Gin Lys pro Gly Gin 6S Ser pro Gin Leu 70 Leu ile Tyr Lys val 75 Ser Asn Arg Phe ser 80 Gly Vai pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys 11 e ser 100 Arg vai Glu Ala Glu 105 Asp Thr Gly val Tyr 110 Tyr cys phe Gin Gly 115 Ser His Vai Pro Trp 120 Thr Phe Gly Gly Gly 125 Thr Lys val Glu lie 130 Lys Arg Thr vai Ala 135 Ala Pro Ser val Phe 140 Ile Phe Pro Pro Ser 145 ASp Glu Gin Leu & Ser Gly Thr Ala Ser 155 val Val cys Leu Leu 160 Asn Asn Phe Tyr pro Arg 165 Glu Ala Lys vai 170 Gin Trp Lys val ASp 175 Asn Ala Leu Gin Ser 180 Gly Asn Ser Gin Glu 185 Ser val Thr Glu Gin 190 ASP Ser Lys Asp Ser 195 Thr Tyr Ser Leu Ser 200 Ser Thr Leu Thr Leu 205 Ser Lys Ala Asp Tyr 210 Glu Lys His Lys vai 215 Tyr Ala cys Glu Val 220 Thr His Gin Gly Leu 225 Ser Ser pro vai Thr 230 Lys Ser Phe Asn Arg 235 Gly Glu Cys 140
<210> 102 <211> 376 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (Hl) <400> 102 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactcccag 60 gtgcagctgg tggagactgg gggaggctta atccagcctg gagggtccct gagaatgtcc 120 tgcgcaggct ccggggaagg ggctggagtg gatcgcatac attggtagtg gtggtgatag 180 aacctactat ccagacactg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca atagcaagaa 240 caccctgtat ttgcaattga acagtctgag ggctgaggac acagccgtgt attactgtgc 300 aagacattat ggtcactacg tggactatgc tgtggactac tggggtcaag gtaccacggt 360 caccgtctcc agcgct 376
<210> 103 <211> 125 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (Hl) <400> 103 141
Met Gly Trp ser Cys lie lie Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly
Vai hís ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin 20 25 30 pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu
Glu Trp Ile Ala Tyr Ile Gly ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro * Vv 50 60 ASO Thr vai Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn 65 70 75 80
Thr Leu Tvr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai «5 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Gly His Tyr Vai Asp Tyr Ala Vai Asp 100 105 110
Tyr Tro Glv Gin Gly Thr Thr vai Thr vai Ser Ser Ala 115 120 125
<210> 104 <211> 382 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H2' <400> 104 142 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactcccag 60 gtgcagctgg tggagactgg gggaggctta atccagcctg gagggtccct gagaatgtcc 120 tgtgcagcct ctggattcgc tttcaatacc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gccatttcca gagacaatag 240 caagaacacc ctgtatttgc aattgaacag tctgagggct gaggacacag ccgtgtatta 300 ctgtgcaaga cattatggtc actacgtgga ctatgctgtg gactactggg gtcaaggtac 360 cacggtcacc gtctccagcg ct 382 <210> 105 <211> 126
<212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H2) <400> 105 143
Met 1 Gly Trp Ser cys Ile ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai H1S Ser Gin val Gin Leu val GlU Thr Gly Gly Gly Leu ile Gin 20 25 30 Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Ala phe Asn Thr Tyr ASP Met Ser Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu 65 Trp rle Ala Tyr He 70 Gly ser Gly Ile Ser 75 Arg Asp Asn Ser ar Asn Thr Leu Tyr Leu 85 Gin Leu Asn Ser Leu 90 Arg Ala Glu Asp Thr 95 Ala Val Tyr Tyr SS Ala Arg His Tyr Gly 105 HÍS Tyr val Asp Tyr 110 Ala val Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val Ser Ser Ala 115 120 125
<210> 106 <211> 383 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H3) <400> 106 144 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactcccag 60 gtgcagctgg tggagactgg gggaggctta atccagcctg gagggtccct gagaatgtcc 120 tgtgcagcct ctggattcgc tttcaatacc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtgatagaac ctactatcca 240 gacactgtga agggccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg 300 caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcccg ggccaaggta 360 ccacggtcac cgtctccagc gct 383
<210> 107 <211> 127 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H3) <400> 107 145
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Vai Ala A^a vai His ser Gin Vai Gin Leu Vai Glu Thr Gly Gly Gly 30° Ile Gl° 20 25
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Met ser cys Ala Ala se** p^e p*ie
Asn Thr Tyr Asp Met Ser Trp vai Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu 50 55 6°
Glu Trp He Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80
Thr teu Tyr Leu Gin Leu Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai 100 105 110
Tyr Tyr cys Ala Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr Vai Ser Ser Ala 115 120 125
<210> 108 <211> 335 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H1/H2) <400> 108 146 146 60 120 180 240 300 335 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactcccag gtgcagctgg tggagactgg gggaggctta atccagcctg gagggtccct gagaatgtcc tgcgcaggct ccggggaagg ggctggagtg gatcgcatac attggtagtg gtggccattt ccagagacaa tagcaagaac accctgtatt tgcaattgaa cagtctgagg gctgaggaca cagccgtgta ttactgtgca agacattatg gtcactacgt ggactatgct gtggactact ggggtcaagg taccacggtc accgtctcca gcgct
<210> 109 <211> 110 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H1/H2) <400> 109
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai His Ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Jrp Ile Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 50 55 60 Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 65 70 75 80 Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 Arg HÍS Tyr Gly HÍS 90 Tyr vai ASP Tyr Ala 95 val Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr vai Ser Ser Ala 100 105 110 147
<210> 110 <211> 336 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H1/H3) <400> 110 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactcccag 60 gtgcagctgg tggagactgg gggaggctta atccagcctg gagggtccct gagaatgtcc 120 tgcgcaggct ccggggaagg ggctggagtg gatcgcatac attggtagtg gtggtgatag 180 aacctactat ccagacactg tgaagggccg attcaccatt tccagagaca atagcaagaa 240 caccctgtat ttgcaattga acagtctgag ggctgaggac acagccgtgt attactgtgc 300 ccgggccaag gtaccacggt caccgtctcc agcgct 336
<210> 111 <211> 111 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H1/H3) <400> 111 148
Met 1 ciy Trp Ser tft >% UlA ile Ile Leu phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly val Hl S Ser Gin 20 val Gin Leu val Glu 25 Thr Gly Giy Gly Leu 30 Ile Gin Pro ciy Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 cys Gin Ala pro Gly 45 Lys Gly Leu Glu Trp 50 Ile Ala Tyr ile Gly 55 Ser Gly Gly ASp Arg 60 Thr Tyr Tyr pro Asp 65 Thr val Lys Gly Arg 70 Phe Thr Ile Ser Arg 75 ASP Asn Ser Lys Asn 80 Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala GlU Asp Thr Ala val 85 90 95 Tyr tyr Cys Ala 100 Gly Gin Gly Thr Thr 105 val Thr val Ser Ser 110 Ala
<210> 112 <211> 342 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H2/H3) <400> 112 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactcccag 60 gtgcagctgg tggagactgg gggaggctta atccagcctg gagggtccct gagaatgtcc 120 tgtgcagcct ctggattcgc tttcaatacc tatgacatgt cttgggttcg ccaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gccatttcca gagacaatag 240 caagaacacc ctgtatttgc aattgaacag tctgagggct gaggacacag ccgtgtatta 300 ctgtgcccgg gccaaggtac cacggtcacc gtctccagcg ct 342 149
<210> 113 <211> 112 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região vsniâvel de cedeiâ pesadâ de immunofoody (H2/H3) <400> 113
Met Gly Trp ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 ·*·5 val His ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin v 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Met ser cys Ala Ala ser Gly Phe Ala Phe 35 40
Asn Thr Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 w
Glu Trp Ile Ala Tyr He Gly Ser Gly ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 65 70 75 eu
Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85
<210> 114 <211> 295 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H1/H2/H3) 150 <400> 114 atgggatgga gctgtatcat gtgcagctgg tggagactgg tgcgcaggct ccggggaagg ccagagacaa tagcaagaac cagccgtgta ttactgtgcc cctcttcttg gtagcaacag gggaggctta atccagcctg ggctggagtg gatcgcatac accctgtatt tgcaattgaa cgggccaagg taccacggtc ctaccggagt ccactcccag gagggtccct gagaatgtcc attggtagtg gtggccattt cagtctgagg gctgaggaca accgtctcca gcgct 60 120 180 240 295
<210> 115 <211> 96 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia pesada de immunobody (H1/H2/H3) <400> 115
val His ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu ile Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Glu Trp ile Ala Tyr
Arg Met Ser Cys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 3 40 45 ile Gly Ser Gly lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys 55 60
Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser 65 70 val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gin Gly Thr 85
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 75 80 Thr val Thr Val Ser Ser Ala 90 95 <210> 116 151
<211> 340 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (Ll) <400> 116 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactccgat 60 gtgttgatga cccaatctcc actctccctg cctgtcactc ctggggagcc agcctcgata 120 tctgcagaaa ccaggccagt ctccacagct cctgatctac aaagtttcca accgattttc 160 tggggtccca gacagattca gtggcagtgg atcagggaca gatttcacac tcaagatcag 240 cagagtggag gctgaggata ccggagtgta ttactgcttt caaggttcac atgttccgtg 300 gacgttcggt ggaggcacca aggtggaaat caagcgtacg 340
<210> 117 <211> 110 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (Ll) <400> 117 152
Met 1 <31 y Trp Ser çys Ile Ile Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly Vai His Ser Asp 20 val Leu Met Thr Gin 25 Ser Pro Leu Ser Leu 30 Pro val Thr Pro Gly 35 Glu pro Ala Ser Leu 40 Gin Lys Pro Gly Gin 45 ser Pro Gin Leu Leu 50 ile Tyr Lys val Ser 55 Asn Arg Phe Ser Gly 60 val Pro Asp Arg phe 65 Ser Gly Ser Gly ser 70 Gly Thr Asp Phe Thr 75 Leu Lys ile Ser Arg 80 Vai Glu Ala Glu Asp 85 Thr Gly Val Tyr y Cys Phe Gin Gly Ser 95 HÍS vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu Ile *-ys 100 105 110
<210> 118 <211> 360 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L2) <400> 118 60 120 180 240 300 360 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactccgat gtgttgatga cccaatctcc actctccctg cctgtcactc ctggggagcc agcctccatc tcttgcagat ctagtcagag cctggtacac agtaatggaa acacctattt agaatggtac ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctaatattca gtggcagtgg atcagggaca gatttcacac tcaagatcag cagagtggag gctgaggata ccggagtgta ttactgcttt caaggttcac atgttccgtg gacgttcggt ggaggcacca aggtggaaat caagcgtacg <210> 119 153
<211> 117 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L2) <400> 119
Met 1 Gly Trp ser Cys 5 Ile ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly Vai His Ser Asp 20 vai Leu Met Thr Gin 25 Ser Pro Leu ser Leu 30 Pro Val Thr pro Gly 35 Glu pro Ala ser ile 40 ser cys Arg Ser Ser 45 Gin Ser Leu Vai Hi s ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp IV Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly 65 Gin Ser pro Gin Leu 70 Leu phe ser Gly Ser 75 Gly Ser Gly Thr Asp 80 Phe Thr Leu Lys lie 85 Ser Arg Val Glu Ala 90 Glu ASp Thr Gly val 95 Tyr Tyr Cys phe Gin 100 Gly Ser His vai pro 105 Trp Thr Phe Gly Gly 110 Gly Thr
Lys vai Glu He Lys 115
<210> 120 <2ll> 352 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L3) 154 <400> 120 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactccgat 60 gtgttgatga cccaatctcc actctccctg cctgtcactc ctggggagcc agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cctggtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagttaac caaggtggaa atcaagcgta cg 352
<210> 121 <211> 115 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L3) <400> 121 155
Met 1 Gly Trp ser cys 5 Ile Ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai H1S Ser ASP 20 val Leu Met Thr Gin 25 Ser ΡΓΟ Leu Ser Leu 30 pro val Thr ΡΓΟ Gly 35 Glu pro Ala Ser lie 40 Ser Cys Arg ser Ser 45 Gin Ser Leu vai HÍS so Ser Asn Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Glu Trp ar Leu Gin Lys Pro Gly 65 Gin Ser Pro Gin Leu 70 Leu Ile Tyr Lys val 75 ser Asn Arg Phe Ser 80 Gly val Pro ASP Arg 85 Phe Ser Gly Ser Gly 90 Ser Gly Thr Asp Phe 95 Thr Leu Lys Ile ser 100 Arg val Glu Ala Glu 105 Asp Thr Gly val Thr 110 Lys val
Glu Ile Lys 11S
<210> 122 <211> 301 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L1/L3) <400> 122 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactccgat 60 gtgttgatga cccaatctcc actctccctg cctgtcactc ctggggagcc agcctcgata 120 tctgcagaaa ccaggccagt ctccacagct cctaatattc agtggcagtg gatcagggac 180 agatttcaca ctcaagatca gcagagtgga ggctgaggat accggagtgt attactgctt 240 tcaaggttca catgttccgt ggacgttcgg tggaggcacc aaggtggaaa tcaagcgtac 300 g 301 156
<210> 123 <211> 96 <212> PRT <213> Desconhecido <22 0> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L1/L3) <400> 123
Met Gly Trp Ser Cys ile lie Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 1° 15
Vai His Ser Asp vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin 35 40 45
Leu Leu Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr asp Phe Thr Leu Lys lie 50 55 60
Ser Arg vai Glu Ala Glu asp Thr Gly vai Tyr Tyr cys Phe Gin Gly 65 70 75 80 ser His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu lie Lys 85 90 95
<210> 124 <211> 313 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L2/L3) <400> 124 157 atgggatgga gtgttgatga tcttgcagat ctgcagaaac gatttcacac aatcaagcgt gctgtatcat cccaatctcc ctagtcagag caggccagtc tcaagatcag acg cctcttcttg actctccctg cctggtacat tccacagctc cagagtggag gtagcaacag cctgtcactc agtaatggaa ctaatattca gctgaggata ctaccggagt ctggggagcc acacctattt gtggcagtgg ccggagttaa ccactccgat agcctccatc agaatggtac atcagggaca ccaaggtgga 60 120 180 240 300 313 <210> 125 <211> 101 <212> PRT <213> Desco nhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immun obody (L2/L3 <400> 125 Met Gly Trp Ser cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai i nis Ser ASp vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu pro val 20 25 30 Thr i Pro Gly 35 Glu pro Ala Ser He 40 Ser Cys Arg ser Ser 45 Gin Ser Leu Vai His Ser 50 Α5Π Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Glu Trp X Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 65 Pro Gin Leu 70 Leu Phe Ser Gly Ser 75 Gly Ser Gly Thr Asp 80 phe Thr Leu Lys ile 85 Ser Arg vai Glu Ala 90 Glu ASP Thr Giy val 95 Thr
Lys vai Glu lie Lys 100 158 <210> 126
<211> 254 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L1/L2/L3) <400> 126 cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactccgat 60 actctccctg cctgtcactc ctggggagcc agcctcgata 120 ctccacagct cctaatattc agtggcagtg gatcagggac 180 gcagagtgga ggctgaggat accggagtta accaaggtgg 240 254 atgggatgga gctgtatcat gtgttgatga cccaatctcc tctgcagaaa ccaggccagt agatttcaca ctcaagatca aaatcaagcg tacg
<210> 127 <211> 80 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L1/L2/L3) <400> 127 159 , ι , . dKp Leu val Ala Thr Ala Thr Gly
Met Gly Trp Ser Cys ile ile Leu Pne l®u jc
15 iKJ , . * , , rin Ser pro Leu Ser Leu Pro val val His Ser Asp val Leu Met Thr Gin =»er 20 25
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin 35 40 45
Leu Leu Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile S0 55 w
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Thr Gly val Thr Lys val Glu ile Lys 65 70 75 80
<210> 128 <211> 293 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável da cadeia capa de immunobody (L1/L3) <400> 128 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctaccggagt ccactccgat 60 gtgttgatga cccaatctcc actctccctg cctgtcactc ctggggagcc agcctcgata 120 tctgcagaaa ccaggccagt ctccacagct cctgatctac aaagtttcca accgattttc 180 tggggtccca gacagattca gtggcagtgg atcagggaca gatttcacac tcaagatcag 240 cagagtggag gctgaggata ccggagttaa ccaaggtgga aatcaagcgt acg 293
<210> 129 <211> 94 <212> PRT <213> Desconhecido <220> 160 <223> Região variável da cadeia <400> 129 Met Gly Trp Ser Cys rle ile Leu Phe 1 5 Vai His Ser Asp vai Leu Met Thr Gin 20 25 Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser Leu Gin 35 40 Leu Leu lie Tyr Lys vai Ser Asn Arg 50 55 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 capa de immunobody (L1/L3)
Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 10 15
Ser pro Leu Ser Leu Pro val 30
Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin 45
Phe Ser Gly val Pro Asp Arg 60
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 75 80
Lgs Val Glu Ile Lys val Glu Ala Glu Asp Thr Gly vai Thr 85
<210> 130 <211> 720 <212> ADN <213> Desconhecido <220> immunobody IB15 <223> Cadeia pesada de <400> 130 161 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt 240 gtgtggctcc gattcaccat ttccagagac aatagcaaga acaccctgta tttgcaattg 300 aacagtctga gggccgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac 360 gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgcttcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagtttg acccaaatct 720
<210> 131 <211> 236 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Cadeia pesada de immunobody IB15 <400> 131 162
Met Gly Trp Ser Cys lie He Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly vai His ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu ile Gin
Pro Glv Gly Ser Leu Arg Met ser cys Thr lie Met asp Gin vai Pro 35 4<> 45
Phe Ser vai Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 50 55 60
Ala Tvr ile Gly Ser Gly Gly Ser vai Tyr Asp Phe Phe Vai Trp Leu 65 70 75 ΰυ
Leu Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 100 105 110
His Tyr Gly His Tyr vai Asp Tyr Ala vai Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 115 120 125
Thr Thr Vai Thr Vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro ser Vai Phe 130 IBS 140
Pro Leu Ala pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 14S 150 1S5 160
Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr Vai Ser Trp 165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu 180 185 190
Gin Ser Ser Gly Leu Tyr ser Leu ser Ser vai vai Thr vai Pro Ser 195 200 205
Ser Leu Gly Thr G^n Thr Tyr ile Cys Asn vai Asn His Lys pro 210 215 220 225 ASn Τ^Γ LyS Va^ 23$ LyS LyS Va^ ΡΓΟ 2^5 Sei" 163
<210> 132 <211> 363 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Região variável pesada de DCIB15 sem um líder (cadeia pesada) <400> 132 aagcttacca tgcaggtgca gctggtggag actgggggag gcttaatcca gcctggaggg 60 tecctgagaa tgtcctgcac cattatggac caggtgcctt tctccgtgtg ggttcggcag 120 gctccgggga aggggctgga gtggatcgca tacattggta gtggtggtag tgtttatgat 180 ttttttgtgt ggctccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg 240 caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcgag acattatggt 300 cactacgtgg actatgctgt ggactactgg ggtcaaggta ccacggtcac cgtctccagc 360 gct 363
<210> 133 <211> 117 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável pesada de DCIB15 sem um líder (cadeia pesada) <400> 133 164
Met Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly oly Gly Leu Ile Gin Pro Gly
val Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala Tyr 35 40 45
Ile Gly Ser Gly Gly Ser val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu Arg Phe 50 55 60
Thr Πβ Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn 65 70 75 80
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val T^r Tyr Cys Ala Arg His Tyr
Gly His Tyr val Asp Tyr Ala Val As^ Tyr Trp Gly Gin Glg Thr Thr val Thr Val Ser Ser
<210> 134 <211> 345 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Região variável capa de DCIB15 sem um líder (cadeia leve) <400> 134 165 ggatccacca tggatgtgtt gatgacccaa tctccactct ccctgcctgt cactcctggg 60 gagccagcct ccatctcttg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc ccctatccta 120 tggtatctgc agaaaccagg ccagtetcca cagctcctga tctacaaagt ttccaaccga 180 ttttctgggg tcccagacag attcagtggc agtggatcag ggacagattt cacactcaag 240 atcagcagag tggaggctga ggataccgga gtgtattact gctttcaagg ttcacatgtt 300 ccgtggacgt tcggtggagg caccaaggtg gaaatcaagc gtacg 34 5
<210> 135 <211> 110 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Região variável capa de DCIB15 sem um líder (cadeia leve) <400> 135
Met asd val Leu Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu Pro vai Thr Pro 15 10 IS
Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser Cys Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro 20 25 30
Asn Ala Pro lie Leu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin 35 40 45
Leu Leu lie Tyr Lys val Ser Asn Arg Phe Ser Gly val Pro Asp Arg 50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 65 70 75 80
Val Glu Ala Glu A|p Thr Gly Val Tyr T^r Cys Phe Gin Gly |er His
val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 100 105 HO 166
<210> 136 <211> 857 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 136 agcgcttcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc 60 gagagcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 120 tcgtggaact caggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 180 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcaactt cggcacccag 240 acctacacct gcaacgtaga tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gacagttgag 300 cgcaaatgtt gtgtcgagtg cccaccgtgc ccagcaccac ctgtggcagg accgtcagtc 360 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg 420 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggac 480 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccacgggagg agcagttcaa cagcacgttc 540 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcgtgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 600 tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaaaccaaa 660 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 720 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 780 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac ctaagggcga attctgcaga tatccagcac 840 agtggcggcc gctcgag 857
<210> 137 <211> 654 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser 167
Arg Ser Thr Ser 20 Glu Ser Thr Ala Ala 25 Leu Gly cys Leu Val 30 Lys ASp Tyr Phe Pro 35 Glu Pro val Thr val 40 Ser Trp Asn Ser Gly 45 Ala Leu Thr Ser Gly 50 vai HÍS Thr Phe Pro 55 Ala val Leu Gin Ser 60 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val val Thr val Pro ser Ser Asn phe Gly Thr Gin o/\ 65 70 75 80 Thr Tyr Thr Cys Asn 85 val Asp HÍS Lys pro 90 ser Asn Thr Lys val 95 Asp Lys Thr vai Glu 100 Arg Lys Cys Cys val 105 Glu cys pro Pro Cys 110 Pro Ala Pro pro vai Ala Gly Pro Ser val Phe Leu phe Pro Pro Lys Pro Lys 11S 120 125 asp Thr 130 Leu Met ile Ser 13? Thr pro Glu val Thr 140 Cys val val val Asp 145 vai ser HÍS Glu Asp 150 Pro Glu val Gin phe 155 Asn Trp Tyr val Asp 160 Gly Vai Glu vai HÍS 165 Asn Ala Lys Thr 83 pro Arg Glu Glu Gin 175 Phe Asn Ser Thr Phe Arg val Val Ser val Leu Thr val val His Gin Asp 180 185 190 Trp Leu Asn 195 Gly tys Glu Tyr % Cys Lys val Ser Asn 205 Lys Gly Leu Pro Ala 210 Pro lie Glu Lys Thr 215 Ile ser Lys Thr Gly Gin Pro Arg Glu pro Gin vai Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gin vai ser Leu 245 Thr Cys Leu val 83 Gly phe Tyr Pro Ser 255 Asp zle Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser ASP Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 27S 280 285 168
Lys Leu Thr Val ASP Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser 290 295 300 Cys 305 Ser vai Met H1S Glu 310 Ala Leu His Asn His 315 Tyr Thr Gin Lys Ser 320 Leu Ser Leu Ser pro 325 Gly Lys ser Ala Ser 330 Thr Lys Gly Pro Ser 335 val Phe Pro Leu Ala 340 Pro cys ser Arg Ser 345 Thr Ser Glu Ser Thr 350 Ala Ala Leu Gly m Leu Val Lys Asp Tyr 360 Phe Pro Glu pro val 365 Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val HIS Thr phe Pro Ala val 370 375 380 Leu 385 Gin Ser Ser Gly Leu 390 Tyr Ser Leu Ser Ser 395 val val Thr Val Pro 400 ser Ser Asn phe Gly 405 Thr Gin Thr Tyr Thr 410 cys Asn Val Asp His 415 Lys pro Ser Asn Thr 420 Lys val Asp Lys Thr 425 val Glu Arg Lys 4:S0 Cys Val Glu cys Pro 435 pro cys Pro Ala pro 440 Pro val Ala Gly Pro 445 Ser val Phe Leu Phe Pro pro Lys Pro Lys ASP Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 450 455 460 Glu 465 vai Thr Cys val val 470 val Asp val Ser HÍS 475 Glu Asp Pro Glu Val 480 Gin Phe Asn Trp 3S val Asp Gly Val Glu 490 Val His Asn Ala tf! Thr Lys pro Arg Glu 500 Glu Gin Phe Asn Ser 505 Thr Phe Arg val Val 510 ser Val Leu Thr val 515 val HiS Gin Asp 158 Leu Asn Gly Lys Glu 525 Tyr Lys cys Lys vai 530 Ser Asn Lys Gly Leu 535 Pro Ala Pro ile Glu 540 Lys Thr ile Ser Lys 545 Thr Lys Gly Gin pro 550 Arg Glu Pro Gin val 555 Tyr Thr Leu Pro pro 560 169
Ser Ara Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu vai 565 570 575
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser asd lie Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 580 585 590
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 595 600 605
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp 610 615 620
Gin Gin Gly Asn Vai phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 625 630 635 640
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu ser Leu Ser Pro Gly Lys 645 650
<210> 138 <211> 1164 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 138 170 agcgcttcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctct 60 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 120 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 180 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 240 acctacacct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag 300 ctcaaaaccc cacttggtga cacaactcac acatgcccac ggtgcccaga gcccaaatct 360 tgtgacacac ctcccccgtg cccacggtgc ccagagccca aatcttgtga cacacctccc 420 ccatgcccac ggtgcccaga gcccaaatct tgtgacacac ctcccccatg cccacggtgc 480 ccagcacctg aactcctggg aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggat 540 acccttatga tttcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccccgagg tccagttcaa gtggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggacagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcagcgggca gccggagaac 960 aactacaaca ccacgcctcc catgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacatct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccgctt cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgatat 1140 ccatcacact ggcggccgct cgag 1164
<210> 139 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 171
Ser 1 Ala Ser Thr r Gly Pro ser val Phe 10 pro Leu Ala pro cys 15 Ser Arg Ser Thr Ser 20 Gly Gly Thr Ala Ala 25 Leu Gly Cys Leu val 30 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu pro vai Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 55 40 45 Ser Gly Vai His Thr phe Pro Ala val Leu Gin ser Ser Gly Leu Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser ser vai vai Thr Val pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 65 70 75 80 Thr Tyr Thr cys Asn 85 Vai Asn HIS Lys pro 90 Ser Asn Thr Lys val 95 Asp Lys Arg Vai Glu 100 Leu Lys Thr Pro Leu 105 Gly Asp Thr Thr HIS 110 Thr Cys Pro Arg Cys 115 Pro Glu Pro Lys Ser 120 Cys ASP Thr Pro pro 125 pro Cys Pro Arg 3o Pro Glu pro Lys Ser 135 cys ASp Thr pro Pro 140 pro cys pro Arg cys 145 Pro Glu Pro Lys Ser 150 Cys ASp Thr pro Pro 155 Pro cys Pro Arg Cys 160 Pro Ala Pro Glu Leu 165 Leu Gly Gly Pro ser 170 val phe Leu Phe Pro 175 Pro Lys Pro Lys ASp 180 Thr Leu Met ile Ser 185 Arg Thr pro Glu val 190 Thr Cys vai Vai Vai 195 Asp vai ser His Glu 200 ASP pro Glu val Gin 205 Phe Lys Trp Tyr Vai 210 ASP Gly Vai Glu vai 215 His Asn Ala Lys Thr 220 Lys pro Arg Glu 61 u Gin phe Asn Ser Thr Phe Arg val val Ser val Leu Thr Val His 172 225 230 235 240 Gin ASp Trp Leu Asn 245 Gly Lys Glu Tyr íll cys Lys val ser Asn 255 Lys Ala Leu pro Ala 260 Pro lie Glu Lys Thr 265 Ile ser Lys Thr 2% Gly Gin ΡΓΟ Arg Glu Pro Gin val Tyr Thr Leu Pro pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr & Asn Gin Val Ser Leu 295 Thr cys Leu val Lys 300 Gly Phe Tyr pro Ser ASP i1e Ala Vai Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin pro Glu Asn Asn 305 310 315 d£,\J Tyr Asn Thr Thr Pro 325 Pro Met Leu ASP Ser 330 ASp Gly Ser Phe Phe 335 Leu Tyr Ser Lys Leu 340 Thr val Asp Lys Ser 345 Arg Trp Gin Gin Gly 350 Asn lie Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg ífiE phe Thr Gin 355 360 303 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375
<210> 140 <2ll> 1440 <2l2> ADN <2l3> Desconhecido <220> <223> Cadeia pesada de DCIB66 <40 0> 140 173 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt 240 gtgtggctcc gattcaccat ttccagagac aatagcaaga acaccctgta tttgcaattg 300 aacagtctga gggctgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac 360 gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgcttcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac S40 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctc cagtcgcggg gggaccgtca 780 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380 agcctctccc tgtctccggg taaatgatct aaagggcgaa ttcgccctta agggcgaatt 1440
<210> 141 <211> 465 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Cadeia pesada de DCIB66 174 <4 Ο 0> 141
vai His ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu ile Gin 20 25 30 pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Thr ile Met Asp Gin vai Pro 35 45
Phe Ser vai Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 50 55 60
Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser vai Tyr Asp Phe Phe vai Trp Leu Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys aso Thr Leu Tyr Leu Gin
^5 ** 7J
Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Ala Arg 100 110
His Tyr Gly His Tyr vai Asp Tyr Ala Vai Asp Tyr trp Gly Gin Gly 175 115 120 125
Thr Thr val Thr Val ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val phe 130 135 140 Pro Leu Ala pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 Gly Cys Leu val Lys ASP Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly val HÍS Thr Phe Pro Ala val Leu 180 185 190 Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val pro ser 195 200 20S Ser Ser 210 Leu Gly Thr Gin Thr 215 Tyr lie cys Asn Val 220 Asn His Lys pro Ser Asn Thr Lys val ASp Lys Lys val GlU Pro Lys Ser Cys ASP Lys 225 230 235 240 Thr HlS Thr cys Pro Pro cys Pro Ala Pro pro Val Ala Gly Pro 245 250 255 Ser Vai phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 260 265 270 Arg Thr pro Glu val Thr Cys val val Val ASp val Ser HÍS Glu ASP 275 280 285 Pro Glu val Lys Phe Asn Trp Tyr val ASp Gly val Glu val His ASn 290 295 300 Ala 305 Lys Thr Lys pro Arg 310 Glu Glu Gin Tyr Asn 315 Ser Thr Tyr Arg val 320 vai Ser val Leu Thr 325 val Leu HÍS Gin $!8 Trp Leu Asn Gly K! Gl U Tyr Lys cys Lys 340 val Ser Asn Lys Ala 345 Leu pro Ala Pro He 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu pro Gin Val Tyr Thr 355 360 365 Leu Pro Pro Ser Arg ASp Glu Leu Thr Lys Asn Gin val Ser Leu Thr 370 375 380
Cys Leu vai Lys Gly p^e Τ*Γ pro Ser AsP 11e Ala val G^u TrP Glu 176 385 390 395 400 Ser Asn Gly Gin pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Vai Leu 405 410 415 Asp Ser Asp Gly 420 Ser Phe Phe Leu Tyr 425 Ser Lys Leu Thr vai 430 Asp Lys Ser Arg Gin Gin Gly Asn vai 440 Phe Ser cys Ser Vai 445 Met HIS Glu Ala Leu Hl S Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460
<210> 142 <211> 1440 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Cadeia pesada de DCIB67 que contém motivo de união a G1 <400> 142 177 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagaçtggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt 240 gtgtggctcc gattcaccat ttccagagac aatagcaaga acaccctgta cttgcaattg 300 aacagtctga gggctgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac 360 gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgcttcc 420 accaagggcc catcggtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcaact tcggcaccca gacctacacc 660 tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt 720 tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca gaactgttag gaggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatgata tccactaagg gcgaattctg cagatatcca gcacagtggc 1440 <210> 143 <211> 462
<212> PRT <213> Desconhecido <220> 178 <223> Cadeia pesada de DCIB6 Gl que contém motivo de união a <400> 143
Met 1 Giy Trp ser Cys Ile Ile Leu val HÍS Ser Gin 20 val Gin Leu val ΡΓΟ Giy Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Phe ser 50 Val Trp val Arg Gin 55 Ala Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser 65 70 Arg phe Thr Ile Ser 85 Arg ASP Asn Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 100 HÍS Tyr Gly 115 HÍS Tyr Val Asp Tyr 120 Thr Thr val Thr val Ser Ser Ala 130 135 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg ser 145 150 Gly Cys Leu val Lys 165 ASP Tyr phe Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 10 15 Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin 25 30 Cys Thr ile Met Asp 45 Gin val pro Pro Gly Lys Gly 60 Leu Glu Trp ile Val Tyr Asp Phe Phe val Trp Leu 75 80 Ser W Asn Thr Leu Tyr Leu 95 Gin Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala Arg 105 110 Ala val ASP Tyr ul Gly Gin Gly Ser Thr Lys Gly 140 pro Ser val phe Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 155 160 O L. CL Glu Pro val Thr Val ser Trp 170 175 val HÍS Thr phe Pro Ala Val Leu 179 180 185 190 Gin Ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser val val Thr val Pro Ser 195 200 205 Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn val Asp His Lys Pro 210 215 220 Ser 22S Asn Thr Lys Val ASp 230 Lys Thr val Glu íli Lys Cys Cys val Glu 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met ile Ser Arg Thr pro 260 265 270 Glu val Thr 275 cys val Val val ASp 280 val Ser His Glu Asp 285 pro Glu val Gin Phe Asn Trp Tyr val ASP Gly val Glu val HIS Asn Ala Lys Thr 290 295 300 38! pro Arg Glu Glu Gin 310 Phe Asn Ser Thr Phe 315 Arg val val Ser val 320 Léu Thr Val Val His 325 Gin Asp Trp Leu Asn 330 Gly Lys Glu Tyr & Cys Lys val ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser 340 345 350 Lys Thr m Gly Gin Pro Arg Glu 360 Pro Gin Val Tyr Thr 365 Leu Pro Pro ser Ara 370 Glu Glu Met Thr Lys 375 Asn Gin val Ser Leu 380 Thr Cys Leu val íít Gly Phe Tyr pro Ser 390 ASP rle Ala val Glu 395 Trp Glu Ser Asn Gly 400 Gin pro Glu Asn Asn 405 Tyr Lys Thr Thr Pro 410 pro Met Leu Asp Ser 415 Asp Giy Ser Phe Phe 420 Leu Tyr Ser Lys Leu 425 Thr val Asp Lys ser 430 Arg Trp Gin Gin Gly 435 Asn val phe Ser Cys 440 Ser val Met HIS Glu 445 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 180 450 455 460
<210> 144 <211> 417 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) <400> 144 60 120 160 240 300 360 417 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt gtgtggctcc gattcaccat ttccagagac aatagcaaga acaccctgta tttgcaattg aacagtctga gggctgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgct
<210> 145 <211> 135 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig 181 <400> 145
Met Gly Trp Ser cys ile ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 IS val His Ser Gin vai Gin Leu Vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu lie Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Thr ile Met Asp Gin Val Pro 35 40 45 phe Ser val Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 50 55 60
Ala Tyr lie Gly Ser Gly Gly Ser val Tyr Asp Phe Phe val Trp Leu 65 70 75 80
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 85 90 95
Leu Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 100 105 110
His Tyr Gly His Tyr val Asp Tyr Ala val Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 115 120 125
Thr Thr val Thr val Ser Ser 130 135
<210> 146 <211> 309 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCorig (variável leve) 182 <4 Ο 0> 146 ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat 60 agaccaccaa atgcccctat cctatggtat ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc 120 ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct ggggtcccag acagattcag tggcagtgga 180 tcagggacag atttcacact caagatcagc agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat 240 tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc 300 aagcgtacg 309
<210> 147 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDcorig (variável leve) <400> 147 183
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10
Vai His Ser Asp Vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai 20 25
Thr Pro Gly Glu pro Ala ser He Ser Cys Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 35 40
Pro Pro Asn Ala Pro He Leu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 50 55 60
Pro Gin Leu Leu ile Tjr Lys vai ser Asn Arg Phe Ser Gly vai Pro
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 85 90 y:>
Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 100 105 11°
Ser His vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu ile Lys 115 120 125
<210> 148 <211> 422 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e F c de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCorig (variável pesada) (sequência de DCIB24) <400> 148 184
aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc W cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 aggctccggg gaaggggctg gagtggatcg catacattgg tagtggtggt agtataatca 240 actttgaaaa actgcgattc accatttcca gagacaatag caagaacacc ctgtatttgc 300 aattgaacag tctgagggct gaggacacag ccgtgtatta ctgtgcaaga cattatggtc 360 actacgtgga ctatgctgtg gactactggg gtcaaggaac cacggtcacc gtctccagcg 420 ct 422
<210> 149 <211> 137 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDcorig (variável pesada) (sequência de DCIB24) <400> 149 30 185 Met 1
Gll 65 130 50 Trp ser Cys Ile Ile Leu phe Leu 10 val Ser Gin vai Gin Leu Val Glu Thr Gly 20 25 Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Ala Ala 35 40 Tyr Asp Met ser Trp 55 Val Arg Gin Ala ile Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser 70 75 Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn Ser 85 90 Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 HÍS Tyr Gly His Tyr val Asp Tyr Ala 115 120 Thr Thr Vai Thr vai Ser Ser 45 60 135 80 95 110 125
<210> 150 <211> 398 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDcorig (variável leve) (sequência de DCIB24) <400> 150 186 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttctg 240 gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc aagatcagca 300 gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctttca aggttcacat gttccgtgga 360 cgttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtacg 398
<210> 151 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas ín frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB24) <400> 151 187
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 lie Ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr IS Gly Vai HÍS Ser ASp 20 val Leu Met Thr Gin 25 ser Pro Leu Ser Leu 30 Pro val Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser cys Thr Pro pro Ala Tyr Arg 35 40 45 pro pro 50 Asn Ala Pro lie Leu 55 Trp Tyr Leu Gin B* Pro Gly Gin Ser pro 65 Gin Leu Leu ile Tyr 70 Lys val ser Asn Arg 75 Phe Ser Gly val Pro 80 Asp Arg Phe ser Gly 85 Ser Gly Ser Gly Thr 90 Asp Phe Thr Leu Lys 95 Ile ser Arg vai Glu 100 Ala Glu ASp Thr Gly 105 Val Tyr Tyr Cys Phe 110 Gin Gly Ser HÍS Vai pro Trp Thr phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 12 S
<210> 152 <211> 417 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB25) <400> 152 188 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt 240 gtgtggctcc gattcaccat ttccagàgac aatagcaaga acaccctgta tttgcaattg 300 aacagtctga gggctgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac 360 gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgct 417
<210> 153 <211> 420 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB25) <400> 153 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta 180 gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgcactcc tccagcttat 360 agaccaccaa atgcccctat cctattcggt ggaggcacca aggtggaaat caagcgtacg 420
<210> 154 <211> 135 <212> PRT 189 <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCorig (variável leve) (sequência de DCIB25) <400> 154
Met 1 Gly Trp ser Cys 5 Ile ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai His ser ASp 20 Vai Leu Met Thr Gin 25 Ser pro Leu Ser Leu 30 Pro val Thr Pr o Gly 35 Glu Pro Ala Ser Ile 40 Ser cys Arg Ser Ser 45 Gin Ser Leu vai His ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 3r Leu Gin Lys pro 50 55 6U Gly 65 Gin Ser Pro Gin Leu 70 Leu ile Tyr Lys val 75 Ser Asn Arg Phe Ser 80 Gly Vai Pro ASp Arg 85 Phe Ser Gly Ser Gly 90 ser Gly Thr ASP phe 95 Thr Leu Lys Ile Ser 100 Arg val Glu Ala Glu 105 ASP Thr Giy val Tyr 110 Tyr Cys Thr pro pro 11S Ala Tyr Arg Pro pro 120 A$n Ala pro ile Leu 125 Phe Gly Gly Gly Thr 130 Lys vai Glu Ile m
<210> 155 <211> 135 <212> PRT <213> Desconhecido <220> 190 <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCorig (variável pesada) (sequência de DCIB25) <400> 155
Met Gly Trp Ser Cys ile Ile Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 val His Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 val His 50 Ser Asn Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Glu Trp Sr Leu Gin Lys pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly val Pro Asp Arg 85 Phe Ser Gly Ser Gly 90 Ser Gly Thr Asp phe 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg val Glu Ala Glu ASp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro ile Leu Phe Gly Gly 115 120 125 Gly Thr 130 Lys val Glu ile Si
<210> 156 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões 191 constantes capa e Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCorig (variável pesada) (sequência de DCIB31) <400> 156 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tgatagaacc 240 tactatccag acactgtgaa gggccgattc accatttcca gagacaatag caagaacacc 300 ctgtatttgc aattgaacag tctgagggct gaggacacag ccgtgtatta ctgtgcccga 360 agtgtttatg atttttttgt gtggctctgg ggccaaggaa ccacggtcac cgtctccagc 420 gct 423
<210> 157 <211> 137 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCorig (variável pesada) (sequência de DCIB31) <400> 157 192 192 val H1S Ser Gin val Gin Leu val 20 pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Asn Thr Tyr ASp Met Ser Trp Val 50 55 Glu Trp Ile Ala Tyr ile Gly Ser 65 70 ASP Thr Val Lys Gly 85 Arg Phe Thr Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser 100 Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Ser val 1¾ Gin Gly Thr Thr val Thr val Ser 130 135 Ser
Met Gly Trp Ser cys ile Ile Leu 1 5 phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 10 i;>
Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin 25
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 60
Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro 75 βϋ ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 90 95
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai
105 HO
Asp Phe Phe vai Trp Leu Trp Gly
<210> 158 <211> 407 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DC1831) <400> 158 193 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata graatggaaa cacctattta 180 gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt gcagtggatc agggacagat ttcacactca 300 agatcagcag agtggaggct gaggataccg gagtgtatta ctgctttcaa ggttcacatg 360 ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacg 407
<210> 159 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB31) <400> 159 194
Met Gly Trp Ser Cys lie ile Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai His Ser Asp val Leu Met Thr Gin Ser pro Leu Ser Leu Pro val 20 25 30 Thr pro Gly Glu Pro Ala ser He Ser cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu GlU Trp Tyr Leu Gin Lys pro 50 55 60 Gly Gin Ser pro Gin Leu Leu He Tyr Lys val Ser Asn Arg Phe ser 65 70 75 80 Gly val Pro ASP Arg phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys lie Ser Arg val Glu Ala Glu ASP Thr Gly val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gin Hl Ser His val Pro Trp 120 Thr Phe Gly Gly Gly 125 Thr Lys val Glu lie Lys 130
<210> 160 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB32) <400> 160 195 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tgatagaacc 240 tactatccag acactgtgaa gggccgattc accatttcca gagacaatag caagaacacc 300 ctgtatttgc aattgaacag tctgagggct gaggacacag ccgtgtatta ctgtgcccga 360 agtgtttatg atttttttgt gtggctctgg ggccaaggaa ccacggtcac cgtctccagc 420 gct 423
<210> 161 <211> 137 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (Sequência de DCIB32) <400> 161 196 Ala Thr Ala Thr Gly
Met Gly Trp ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu vai 1 5 10 Vai His Ser Gin Vai Gin Leu Vai Glu Thr Gly 20 25 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Ala Ala 35 40 Asn Thr Tyr asd Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala 50 55 Glu Trp ile Ala Tyr ile Gly Ser Gly Gly Asp 65 70 75 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr xle Ser Arg 85 90 Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala 100 105 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser val Tyr Asp Phe Phe 115 120 Gin Gly Thr Thr val Thr val ser ser 130 135 <210> 162 <211> 420 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB32)
Gly I,e s1" ς-r Gly Ph« Ala phe * 45 pro Gly Lys Gly Leu 60 Arg Thr Tyr Tyr Pro
Asp Asn Ser Lys Asn
Glu Asp Thr Ala val 110 val Trp Leu Trp Gly 125 <400> 162 197 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttccg gggtcccaga cagáttcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctattcggt ggaggcacca aggtggaaat caagcgtacg
<210> 163 <211> 432 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pocorig (variável pesada) (sequência de DCIB36) 60 120 180 240 300 360 420 60 120 180 240 300 360 420 432 <400> 163 aagcttacca tgggatggag cactcccagg tgcagctggt agaatgtcct gtgcagcctc caggctccgg ggaaggggct tactatccag acactgtgaa ctgtatttgc aattgaacag cattatggtc actacgtgga gtctccagcg ct ctgtatcatc ctcttcttgg ggagactggg ggaggcttaa tggattcgct ttcaatacct ggagtggatc geatacattg gggccgattc accatttcca tctgagggct gaggacacag ctatgctgtg gactactggg tagcaacagc taccggagtc tccagcctgg agggtccctg atgacatgtc ttgggttcgc gtagtggtgg tgatagaacc gagacaatag caagaacacc ccgtgtatta ctgtgcaaga gtcaaggaac cacggtcacc
<210> 164 <211> 140 <212> PRT 198 <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (Sequência de DCIB36) <400> 164
Met 1 Gly Trp Ser Cys lie Ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly Val HÍS Ser Gin val Gin Leu val Glu Thr Gly Gly Gly Leu ile Gin 20 25 30 Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Ala Phe Asn Thr 50 Tyr Asp Met Ser Trp 55 val Arg Gin Ala Pro 60 Gly tys Gly Leu Glu 65 Trp ile Ala Tyr ile 70 Gly Ser Gly Gly Asp 75 Arg Thr Tyr Tyr pro 80 Asp Thr vai Lys Gly 85 Arg phe Thr ile Ser 90 Arg Asp Asn Ser Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Leu Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala val Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg His Tyr να Hl S Tyr val ASP JK Ala val Asp Tyr Trp 130 Gly Gin Gly Thr Thr 135 Val Thr val Ser Ser 140
<210> 165 <211> 408 <212> ADN <213> Desconhecido <220> 199 <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDcorig (variável leve) (sequência de DCIB36) <400> 165 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta 180 gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgcagtgt ttatgatttt 360 tttgtgtggc tcttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtacg 408
<210> 166 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (Sequência de DCIB36) <400> 166 200
Met Gly Trp Ser Cys ile ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 vai His Ser Asp vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin ser Leu 3S 40 45 vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys 100 105 110
Ser Val Tyr Asp Phe Phe vai Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai 115 120 125
Glu lie Lys 130
<210> 167 <211> 438 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (Sequência de DCIB48) <400> 167 201 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tagtgtttat 240 gatttttttg tgtggctccg attcaccatt tccagagaca atagcaagaa caccctgtat 300 ttgcaattga acagtctgag ggctgaggac acagccgtgt attactgtgc ccgatggaac 360 aggcagctgt atccagagtg gacagaagcc cagagacttg actggggcca aggaaccacg 420 gtcaccgtct ccagcgct 438
<210> 168 <211> 142 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (Sequência de DCIB48) <400> 168 202
Met Giy τγρ Ser cvs Ile Ile Leu Phe Leu val Ala Thr Ala 151* Gly ^ 5 10 20 val Mis ser Gin val Gin Leu val Glu Thr Gly Gly Gly Ile Gin pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
Asn
Thr Tyr ASp Met Ser Trp val Arg Gin Ala Pro Gly *-ys Gly Leu ct 60 50 55
Glu Trp He Ala Tyr ile Gly Ser Gly Gly ser val Tyr Asp Phe Phe 65 70 75 val Trp Leu Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 85
Tvr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
7 100 105 A-W
Cys Ala Ar^j Trp Asn Arg Gin Leu Tyr pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin 130
Arg Leu Asp Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val Ser Ser
<210> 169 <211> 317 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regj_oes variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB48) <400> 169 203 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta 180 gcagtggatc agggacagat ttcacactca agatcagcag agtggaggct gaggataccg 240 gagtgtatta ctgctttcaa ggttcacatg ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagg 300 tggaaatcaa gcgtacg 317
<210> 170 <211> 435 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB49) <400> 170 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tgatagaacc 240 tactatccag acactgtgaa gggccgattc accatttcca gagacaatag caagaacacc 300 ctgtatttgc aattgaacag tctgagggct gaggacacag ccgtgtatta ctgtgcccga 360 actcctccag cttatagacc accaaatgcc cctatcctat ggggccaagg aaccacggtc 420 accgtctcca gcgct 435
<210> 171 <211> 141 <212> PRT <213> Desconhecido <220> 204 <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (Sequência de DCIB49) <400> 171
Met Gly Trp Ser Cys ile lie Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 S 10 15
Vai His Ser Gin vai Gin Leu val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin 20 25 30 Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Cys Ala Ala ser Gly 45 Phe Ala Phe Asn Thr 50 Tyr ASP Met Ser Trp 55 val Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu Glu 65 Trp Ile Ala Tyr Ile 70 Gly Ser Gly Gly ASp 75 Arg Thr Tyr Tyr Pro 80 ASp Thr vai Lys Gly 85 Arg phe Thr Ile ser 90 Arg ASp A$n Ser Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Leu Asn Ser Leu 105 Arg Ala GlU ASp Thr 110 Ala Val Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Thr pro pro 120 Ala Tyr Arg Pro Pro 125 Asn Ala Pro lie Leu 130 Trp Gly Gin Gly Thr 135 Thr val Thr Val Ser 140 ser
<210> 172 <211> 408 <212> ADN <213> Desconhecido <220> 205 <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (Sequência de DCIB49) <400> 172 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta 180 gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctttca aggttcacat 360 gttccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtacg 408
<210> 173 <211> 429 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB52) <400> 173 206 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tagtgtttat 240 gatttttttg tgtggctccg attcaccatt tccagagaca atagcaagaa caccctgtat 300 ttgcaattga acagtctgag ggctgaggac acagccgtgt attactgtgc ccgaactcct 360 ccagcttata gaccaccaaa tgcccctatc ctatggggcc aaggaaccac ggtcaccgtc 420 tccagcgct 429
<210> 174 <211> 139 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB52) <400> 174 207
Met 1 Gly Trp Ser Ile Ile Leu phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr IS Gly Vai HÍS Ser Gin 20 vai Gin Leu val Glu 25 Thr Gly Gly Gly Leu 30 ile Gin ΡΓΟ Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Ala Phe Asn Thr 50 Tyr Asp Met Ser Trp 55 val Arg Gin Ala pro 60 Gly Lys Gly Leu Glu 65 Trp lie Ala Tyr Ile 70 Gly Ser Gly Gly Ser 75 val Tyr Asp Phe Phe 80 Vai Trp Leu Arg Phe 65 Thr ile Ser Arg ASP 90 Asn Ser Lys Asn Thr 95 Leu Tyr Leu Gin Leu 100 Asn Ser Leu Arg Ala 105 Glu Asp Thr Ala val 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg 115 Thr Pro pro Ala 25 Arg Pro Pro Asn Ala 125 Pro Ile Leu Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr val Ser Ser 130 135
<210> 175 <211> 407 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas ín frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB52) <400> 175 208 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctatttg 180 aatggtacct gcagaaacca ggccagtctc cacagctcct gatctacaaa gtttccaacc 240 gattttctgg ggtcccagac agattcagtg gcagtggatc agggacagat ttcacactca 300 agatcagcag agtggaggct gaggataccg gagtgtatta ctgctttcaa ggttcacatg 360 ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacg 407
<210> 176 <211> 453 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB54) <400> 176 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcgggacagg cagggcaatg ctgggcacac acaccatgga agtaactgtc 180 taccattggg ttcggcaggc tccggggaag gggctggagt ggatcgcata cattggtagt 240 ggtggtagtg tttatgattt ttttgtgtgg ctccgattca ccatttccag agacaatagc 300 aagaacaccc tgtatttgca attgaacagt ctgagggctg aggacacagc cgtgtattac 360 tgtgcccgat ggaacaggca gctgtatcca gagtggacag aagcccagag acttgactgg 420 ggccaaggta ccacggtcac cgtctccagc gct 453
<210> 177 <211> 147 <212> PRT <213> Desconhecido <220> 209 <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB54) <400> 177
Met Gly Trp Ser cys ile ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15
Vai His Ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu lie Gin 20 25 30
Pro Gly Gly ser Leu Arg Met Ser Cys Gly Thr Gly Arg Ala Met Leu 3S 40 45
Gly Thr His Thr Met Glu vai Thr vai Tyr His Trp vai Arg Gin Ala 50 55 60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile Ala Tyr ile Gly ser Gly Gly Ser 65 70 75 80 vai Tyr Asp Phe Phe Vai Trp Leu Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn 85 90 95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 100 105 110
Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asn Arg Gin Leu Tyr pro Glu 115 120 125
Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu Asp Trp Gly Gin Gly Thr Thr vai Thr 130 135 140
Vai Ser Ser 145
<210> 178 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> 210 <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB52) <400> 178
Met Gly Trp Ser çys lie xle Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai HÍS Ser ASp Vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30 Thr pro Gly GlU Pro Ala ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 vai His 50 Ser Asn Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Glu Trp 8r Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly vai pro Asp Arg Phe ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr ASp Phe Thr 85 90 - 9S Leu Lys ile Ser Arg vai Glu Ala Glu ASP Thr Gly vai Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gin Gly Ser His vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai 115 120 125 Glu lie Lys 130
<210> 179 <211> 408 <212> ADN <213> Desconhecido <220> 211 <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB54) <400> 179 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc €0 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120
gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta ISO gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctttca aggttcacat 360 gttccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtacg 408
<210> 180 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB54) <400> 180 212
Met Gly Trp Ser Cys He ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 2 5 10 15 vai His Ser Asp vai Leu Met Thr Gin Ser pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30
Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser He ser Cys Arg Ser ser Gin ser Leu 35 40 45
Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60
Asn Arg Phe Ser 80
Glv Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys vai Ser 65 70 75
Thr Asp Phe Thr 95
Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 85 90 vai Tyr Tyr Cys 110
Leu uys Ile Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Thr Gly 100 105
Gly Thr Lys Vai 125
Phe Gin Gly Ser His vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly 115 120
Glu ile tys 130
<210> 181 <211> 426 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB18) <400> 181 213 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tagtgtttat 240 gatttttttg tgtggctccg attcaccatt tccagagaca atagcaagaa caccctgtat 300 ttgcaattga acagtctgag ggctgaggac acagccgtgt attactgtgc aagacattat 360 ggtcactacg tggactatgc tgtggactac tggggtcaag gaaccacggt caccgtctcc 420 agcgct 426
<210> 182 <211> 138 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável pesada) (sequência de DCIB18) <400> 182 214 214 10
Met Gly Trp Ser Cys lie ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly vai His ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly ^eu He Gin 20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Ala Ala Ser Gly p^e A^a p^e 35 40 45
Asn Thr Tyr Asp Met Ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Ala Tyr lie Gly Ser Gly Gly Ser vai Tyr Asp Phe Phe 65 70 75 80
Val Trp Leu Arg Phe Thr ile Ser Arg asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu
85 90 9S
Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr 100 105 HO
Cys Ala Arg His Tyr Gly His Tyr val Asp Tyr Ala val Asp Tyr Trp 115 120 125
Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135
<210> 183 <211> 398 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB18) <400> 183 215 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac cgattttctg 240 gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc aagatcagca 300 gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctttca aggttcacat gttccgtgga 360 cgttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtacg 398
<210> 184 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB18) <400> 184 216
Met Gly Trp Ser Cys ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai His Ser Asp vai Leu Met Thr Gin ser Pro Leu ser Leu Pro vai 20 25 30 Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr pro Pro Ala Tyr Arg 35 40 45 ΡΓΟ pro 50 Asn Ala Pro Ile Leu 55 Trp Tyr Leu Gin 8’ Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly vai Pro 65 70 75 80 ASp Arg phe Ser Gly SS ser Gly ser Gly Thr 90 Asp phe Thr Leu 8* Ile Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys phe Gin Gly 100 105 110 Ser His vai 115 Pro Trp Thr Phe SS Gly Gly Thr Lys vai 125 Glu Ile Lys
<210> 185 <211> 135 <212> PRT <213> Desconhecido <22 0> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB32) <400> 185 217
Met Gly Trp Ser Cys Ile He Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 val His ser Asp vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 vai His ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Gly val Pro Asp Arg phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg val Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr cys 100 105 110
Thr pro Pro Ala Tyr Arg pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Phe Gly Gly 115 120 125
Gly Thr Lys val Glu ile Lys 130 135
<210> 186 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB48) <400> 186 218
Met 1 Gly Trp ser Cys 5 ile Ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly Val His Ser Asp Val Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin 5er Leu 35 40 45 vai HÍS 50 ser Asn Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Glu Trp 8r Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser pro Gin Leu Leu ile Tyr Lys val Ser Asrt Arg phe Ser 65 70 75 80 Gly val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gin fã Ser Hi s val Pro Trp 120 Thr Phe Gly Gly Gly 125 Thr Lys val
Glu Ile Lys 130
<210> 187 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de nucleótidos e aminoácidos das regiões variáveis pesadas e leves clonadas in frame com as regiões constantes capa Fc de IgGl humana dentro do vector de expressão pDCOrig (variável leve) (sequência de DCIB49) <400> 187 219
Met Gly Trp Ser cys ile Ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai His Ser Asp vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30 Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg ser Ser Gin ser Leu 35 40 45 vai HÍS 50 Ser Asn Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Glu Trp Tyr 60 Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Lys vai Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 7S 80 Gly Vai Pro Asp Arg phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 9S Leu Lys ile Ser 100 Arg vai Glu Ala Glu 105 ASP Thr Gly vai Tyr 110 Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Hl S vai pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai 115 120 125
Glu Ile Lys 1B0
<210> 188 <211> 435 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB21 - Variável pesada <400> 188 220 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tataccgcag 240 agtctagact cgtggtggac ttctctccga ttcaccattt ccagagacaa tagcaagaac 300 accctgtatt tgcaattgaa cagtctgagg gctgaggaca cagccgtgta ttactgtgca 360 agacattatg gtcactacgt ggactatgct gtggactact ggggtcaagg aaccacggtc 420 accgtctcca gcgct 435
<210> 189 <211> 141 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB21 - Variável pesada <400> 189 221 Met 1
Gly Trp ser cys Ile lie Leu Phe Leu Val Ala val His Ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly
Thr Ala Thr Gly 1 15 Gly Leu Ile Gin 30 pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Ala Ala Ser
Asn Thr Tyr Asp Met Ser Trp val Arg Gin Ala pro 50 55 oO
Gly Phe Ala Phe 45 Gly Lys Gly Leu 55 60
Glu Trp ile Ala Tyr ile Gly ser Gly Gly ile Pro Gin Ser Leu Asp
Ser Trp Trp Thr Ser Leu Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn ser Lys 85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu asd Thr Ala 100 10S 110
val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Gly His Tyr val Asp Tyr Ala val 115 120 12S
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Jhr Thr val Thr Val Ser Ser 130 135 WO
<210> 190 <211> 390 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB21 - Variável leve <400> 190 222 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgctttga aaggtttgag atattcccca aggaatggta cctgcagaaa 180 ccaggccagt ctccacagct cctgatctac aaagtttcca accgattttc tggggtccca 240 gacagattca gtggcagtgg atcagggaca gatttcacac tcaagatcag cagagtggag 300 gctgaggata ccggagtgta ttactgcttt caaggttcac atgttccgtg gacgttcggt 360 ggaggcacca aggtggaaat caagcgtacg 390
<210> 191 <211> 125 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB21 - Variável leve <400> 191 223
Met eiy Trp Ser cys rle ile Leu phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai HiS Ser ASp 20 vai Leu Met Thr Gin 25 ser Pro Leu Ser Leu 30 Pro Vai Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser Cys Phe Glu Arg Phe Glu lie 35 40 45 Phe pro Lys Glu Trp Tyr Leu Gin Lys ΡΓΟ Gly Gin Ser Pro Gin Leu 50 55 60 Leu 65 lie Tyr Lys vai Ser 70 Asn Arg Phe Ser Gly 75 Vai Pro ASP Arg Phe 80 Ser Gly Ser Gly Ser 85 Gly Thr Asp Phe Thr 90 Leu Lys lie Ser Arg 95 Vai Gl.u Ala Glu ASP 100 Thr Gly vai Tyr Tyr 10S cys Phe Gin Gly Ser 110 HIS vai pro Trp Thr 115 phe Gly Gly Gly Thr 120 Lys vai Glu lie Lys 12S
<210> 192 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB26 - Variável pesada <400> 192 224 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtgatagaac ctactatcca 240 gacactgtga agggccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg 300 caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcaag acattatggt 360 cactacgtgg actatgctgt ggactactgg ggtcaaggaa ccacggtcac cgtctccagc 420 gct 423
<210> 193 <211> 137 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB26 - Variável pesada <400> 193 225
Met Gly TrP Ser Cys ς ile ile Leu 1 o val His Ser Gin 20 val Gin Leu val pro Giy ciy Ser Leu Arg Met Ser 40 phe ser val 50 Trp val Arg Gin 55 Ala Ala Tyr Ile 65 Gly Ser Gly 70 Gly Asp Lys Gly Arg phe Thr 85 Ile Ser Arg Leu Gin Leu Asn 100 Ser Leu Arg Ala Ala Arg His 115 Tyr Gly HIS Tyr Val 120 Gin Gly Thr 130 Thr Val Thr val 135 Ser
<210> 194 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB26 -
Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly Glu 25 Thr Gly Gly Gly Leu 30 Ile Gin Cys Thr ile Met Asp 45 Gin val pro pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 60 Arg Thr Tyr Tyr pro ASp Thr val 75 80 ASp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 90 95 Glu ASP Thr Ala val Tyr Tyr Cys 105 110 Asp Tyr Ala val ASP 125 Tyr Trp Gly Ser <400> 194
Variável leve 226 ggatccacca tgggatggag cactccgatg tgttgatgac gcctcgatct cttgcactcc ctgcagaaac caggccagtc ggggtcccag acagattcag agagtggagg ctgaggatac acgttcggtg gaggcaccaa ctgtatcatc ctcttcttgg ccaatctcca ctctccctgc tccagcttat agaccaccaa tccacagctc ctgatctaca tggcagtgga tcagggacag cggagtgtat tactgctttc ggtggaaatc aagcgtacg tagcaacagc taccggagtc ctgtcactcc tggggagcca atgcccctat cctatggtat aagtttccaa ccgattttct atttcacact caagatcagc aaggttcaca tgttccgtgg 60 120 180 240 300 360 399 <210> 195 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <400> 195
Met 1 Gly Trp Ser cys rle lie Leu phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly Val HlS Ser Asp val Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val 20 25 30 Thr pro Gly GlU Pro Ala Ser lie ser Cys Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 35 40 45 Pro pro 50 Asn Ala Pro ile Leu 55 Trp Tyr Leu Gin Lys 60 Pro Gly Gin Ser
Pro 65 Gin Leu Leu lie Tyr 70 Lys Val Ser Asn Arg 75 Phe Ser Gly val pro 80 Asp Arg Phe Ser Gly 85 Ser Gly Ser Gly Thr 90 ASp Phe Thr Leu 8* Ile Ser Arg val Glu 100 Ala Glu Asp Thr Gly 105 val Tyr Tyr Cys Phe 110 Gin Gly Ser HiS val 115 pro Trp Thr Phe Gly 120 Gly Gly Thr Lys val 125 Glu He Lys 227
<210> 196 <211> 420 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB26 - Variável pesada <400> 196 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcttcctacc agctacttta actatggttt gggttcggca ggctccgggg 180 aaggggctgg agtggatcgc atacattggt agtggtggtg atagaaccta ctatccagac 240 actgtgaagg gccgattcac catttccaga gacaatagca agaacaccct gtatttgcaa 300 ttgaacagtc tgagggctga ggacacagcc gtgtattact gtgcaagaca ttatggtcac 360 tacgtggact atgctgtgga ctactggggt caaggaacca cggtcaccgt ctccagcgct 420
<210> 197 <211> 136 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB26 - Variável pesada <400> 197 228
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 Ile Ile Leu Phe Leu 10 vai Ala Thr Ala Thr 15 Gly Vai His Ser Gin 20 Vai Gin Leu vai Glu 25 Thr Gly Gly Giy Leu 30 Ile Gin pro Giy Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Cys Phe Leu pro Ala 45 Thr Leu Thr Met vai 50 Trp vai Arg Gin Ala 55 Pro Gly Lys Gly Leu 60 GlU Trp ile Ala Tyr 65 Xle Gly ser Gly Gly 70 ASp Arg Thr Tyr Tyr 75 pro ASp Thr vai Lys 80 Gly Arg phe Thr Ile 85 Ser Arg Asp Asn Ser 90 Lys Asn Thr Leu Tyr 95 Leu Gin Leu A$n Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110
Ara His Tyr Gly His Tyr Vai Asp Tyr Ala vai Asp Tyr Trp Gly Gin 115 120 125
Gly Thr Thr vai Thr Vai ser Ser 130 135
<210> 198 <2ll> 399 <212> ADN <2l3> Desconhecido <220> <223> sequência de DCIB26 - Variável leve <400> 198 229 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacg 399
<210> 199 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB26 - Variável leve <400> 199 230
Met 1 Gly Trp Ser cys lie ile vai His Ser Asp 20 vai Leu Met Thr Pro Gly 35 Glu pro Ala Ser Pro Pro Asn Ala pro lie Leu 50 55 Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys 65 70 ASP Arg Phe Ser Gly 85 Ser Gly Ser Arg vai Glu Ala Glu ASP 100 Ser HIS vai Pro Trp Thr Phe 115
Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 10 15 Ser Pro Leu Ser Leu 30 Pro vai cys Thr Pro pro Ala Tyr Arg 45 Leu Gin 8* pro Gly Gin Ser Asn Arg 75 phe Ser Gly Vai Pro 80 Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 90 95 vai Tyr Tyr cys Phe 110 Gin Gly Gly Thr Lys vai Glu ile Lys 125
<210> 200 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> ável pesada <223> Sequência de DCIB37 <400> 200 231 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattac tgaccaggtg cctttgtccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtgatagaac ctactatcca 240 gacactgtga agggccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg 300 caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcaag acattatggt 360 cactacgtgg actatgctgt ggactactgg ggtcaaggaa ccacggtcac cgtctccagc 420 gct 423
<210> 201 <211> 137 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB37 - variável pesada <400> 201 232 232 Ala Thr Gly 15 Leu ile Gin 30 Gin Val Pro Glu Trp Ile Asp Thr val 80 Thr Leu Tyr 9S Tyr Tyr cys 110 Tyr Trp Gly
Met Gly TrP Ser cys lie ile Leu Phe Leu Val Ala Thr 2 S 10 vai His Ser Gin Vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly
pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser Cys Thr ile Thr Asp pro 3S 40 4S Lí>u cer Val Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu eU 50 55 60
Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75
Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn
Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val 100 105
Ala Arg His Tyr Gly His Tyr val Asp Tyr Ala val Asp 115 120 125
Gin Gly Thr Thr val Thr val Ser Ser 130 135
<210> 202 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB37 - variável leve <400> 202 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 233 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 9999tcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacg 399
<210> 203 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB37 - variável leve <400> 203
Met Gly Trp ser cys lie Ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly I 5 10 15 val His Ser Asp vai Leu Met Thr G]n Ser pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala ser Ile 35 40
Ser Cys Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 45
Pro Pro Asn Ala Pro ile Leu Trp 50 55
Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 60
Pro Gin Leu Leu ile Tyr Lys Val 65 70
Ser Asn Arg Phe Ser Gly val Pro 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly Ser
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile 90 95
Ser Arg val Glu Ala Glu Asp Thr 100
Gly val Tyr Tyr cys Phe Gin Gly 105 110
Ser His val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Thr Lys val Glu Ile Lys
H5 1ZU 234
<210> 204 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB40 - variável pesada <400> 204 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattac tgaccaggtg cctatctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtgatagaac ctactatcca 240 gacactgtga agggccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg 300 caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcaag acattatggt 360 cactacgtgg actatgctgt ggactactgg ggtcaaggaa ccacggtcac cgtctccagc 420 gct 423
<210> 205 <211> 137 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB40 - variável pesada <400> 205 235 wet
Giy
Trp ser cys lie ile t-eu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly val hís ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly teu ile Gin pr0 ciy Gly ser Leu Arg Met Ser Cys Thr lie Thr Asp Gin val Pro
Ile ser val Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He 50 55
Ala Tyr Ile Gly ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr pro Asp Thr Val 65 70 80 95
Gly Arg Phe Thr ile ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr
90 QS p.j Qln Leu Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 100 10S lio
Ala Arg Hís Tyr Gly hís Tyr val Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly 115 125 cln Gly Thr Thr Val Thr val ser Ser 6 130 135
<210> 206 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB40 - variável leve <400> 206 236 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacg 399
<210> 207 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB40 - variável leve <400> 207 237
Met Gly Trp 1 Ser cys 5 Ile Ile Leu vai His Ser ASP 20 vai Leu Met Thr Thr pro Gly 35 Glu pro Ala Ser ile 40 ΡΓΟ pro 50 Asn Ala pro Ile Leu SS Trp ΡΓΟ 65 Gin Leu Leu ile %r Lys vai Asp Arg Phe Ser Gly 85 ser Gly Ser Ser Arg vai Glu 100 Ala Glu Asp Thr ser Hl S Vai 115 Pro Trp Thr Phe Gly 120
<210> 208 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB41 -<400> 208
Phe Leu 10 vai Ala Thr Ala Thr 15 Gly Gin 25 Ser Pro Leu ser Leu 30 Pro val Ser cys Thr Pro Pro 45 Ala Tyr Arg Tyr Leu Gin Lys 60 Pro Gly Gin Ser Ser Asn Arg 75 Phe Ser Gly val Pro 80 Gly Thr 90 ASp Phe Thr Leu Lys 95 Ile Gly 105 vai Tyr Tyr cys phe 110 Gin Gly Gly Gly Thr Lys vai 125 Glu Ile Lys variável pesada aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 60 120 238 agaatgtcct gcaccattac tgaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtgatagaac ctactatcca 240 gacactgtga agggccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg 300 caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcaag acattatggt 360 cactacgtgg actatgctgt ggactactgg ggtcaaggaa ccacggtcac cgtctccagc 420 gct 423
<210> 209 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB41 - variável leve <400> 209 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacg 399
<210> 210 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB41 - variável leve <400> 210 239
Met 1 Gly Trp Ser cys 5 Ile ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly Vai HlS Ser ASp 20 val Leu Met Thr Gin 25 Ser Pro Leu Ser Leu 30 Pro val Thr Pro Gly 35 Glu pro Ala Ser Ile 40 Ser Cys Thr Pro Pro 45 Ala Tyr Arg ΡΓΟ Pro Asn Ala pro Ile Leu Trp Tyr Leu Gin pro Gly Gin Ser 50 55 60 pro 65 Gin Leu Leu ile %r Lys val Ser Asn Arg 75 Phe Ser Gly Val pro 80 ASp Arg Phe Ser Gly 85 Ser Gly Ser Gly Thr 90 ASp Phe Thr Leu Lys 95 Ile Ser Arg vai Glu 100 Ala Glu ASp Thr Gly 105 val Tyr Tyr Cys Phe 110 Gin Gly Ser Hl S val 115 Pro Trp Thr phe Gly 120 Gly Gly Thr Lys val 125 Glu ile Lys
<210> 211 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB42 - variável pesada <400> 211 240 240 60 120 ISO 240 300 360 420 423 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg agaatgtcct gcaccattac tgaccaggtg ccttactccg tgtgggttcg gcaggctccg gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtgatagaac ctactatcca gacactgtga agggccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcaag acattatggt cactacgtgg actatgctgt ggactactgg ggtcaaggaa ccacggtcac cgtctccagc gct <210> 212 <211> 137
<212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB42 - variável pesada <400> 212
Met Gly Trp Ser Cys vai His Ser Gin Vai 20
Pro Gly Gly Ser Leu 35
Tyr ser vai Trp vai 50
Ala Tyr ile Gly Ser ile lie Leu Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 10 15 Gin Leu val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin 25 30 Arg Met Ser Cys Thr lie Thr Asp Gin val Pro 40 45 Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile 55 60 Gly 70 Gly Asp Arg Thr Tyr 75 Tyr pro Asp Thr val 80 241 241 Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn ser Lys Asn Thr Leu Tyr 85 90 95 Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala vai Tyr Tyr cys 100 105 110 Ala Arg Hl S 115 Tyr Gly His Tyr vai 120 Asp Tyr Ala Vai ASP 125 Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai ser Ser 130 135 <210> 213 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB42 - variável leve <400> 213 ggatccacca tgggatggag cactccgatg tgttgatgac gcctcgatct cttgcactcc ctgcagaaac caggccagtc ggggtcccag acagattcag agagtggagg ctgaggatac acgttcggtg gaggcaccaa ctgtatcatc ctcttcttgg ccaatctcca ctctccctgc tccagcttat agaccaccaa tccacagctc ctgatctaca tggcagtgga tcagggacag cggagtgtat tactgctttc ggtggaaatc aagcgtacg tagcaacagc taccggagtc ctgtcactcc tggggagcca atgcccctat cctatggtat aagtttccaa ccgattttct atttcacact caagatcagc aaggttcaca tgttccgtgg 60 120 180 240 300 360 399
<210> 214 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> variável leve <223> sequência de DCIB42 242 <400> 214
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15
Vai His Ser asp Vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro vai 20 25 30
Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 35 40 45 pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 50 55 60
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly vai Pro 65 70 75 «0
Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys ile 85 90 95
Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 100 105 110
Ser His vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu ile Lys 115 120 125
<210> 215 <211> 423 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB43 - variável pesada <400> 215 243 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattac tgaccagctg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtgatagaac ctactatcca 240 gacactgtga agggccgatt caccatttcc agagacaata gcaagaacac cctgtatttg 300 caattgaaca gtctgagggc tgaggacaca gccgtgtatt actgtgcaag acattatggt 360 cactacgtgg actatgctgt ggactactgg ggtcaaggaa ccacggtcac cgtctccagc 420 gct 423
<210> 216 <211> 136 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> sequência de DCIB43 - variável pesada <400> 216 244
Met 1 Gly Trp Ser cys 5 Ile Ile Leu phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly val His Ser Gin 20 val Gin Leu val Glu 25 Thr Gly Gly Gly Leu 30 He Gin pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Cys Thr Ile Thr ASP 45 Gin Leu pro Phe Ser Vai Trp val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 50 55 60 Ala 65 Tyr Ile Gly Ser Gly 70 Gly Asp Arg Thr Tyr 75 Tyr pro ASP Thr Val 80 Lys Gly Arg Phe Thr 85 Ile Arg ASP Asn Ser 90 cys Asn Thr Leu Tyr 95 Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110
Arg His Tyr Gly His Tyr vai asp Tyr Ala vai Asp Tyr Trp Gly Gin 115 7 120 125
Gly Thr Thr vai Thr vai ser ser 130 135
<210> 217 <211> 128 <212> PRT <2l3> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB43 - variável leve <400> 217 245 245 Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 10 15 Thr Gin Ser pro Leu Ser Leu pro vai 25 30 ile Ser cys Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 40 45 Trp Tyr Leu Gin a* Pro Gly Gin Ser vai ser Asn Arg Phe Ser Gly vai Pro 75 80
Ser Gly Thr ASP Phe Thr Leu j-ys Ile 90 95 Thr Gly Vai Tyr Tyr Cys phe Gin Gly 105 110 Gly Gly Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 120 125
Met Gly Trp Ser Cys Ile lie 1 5 vai His Ser Asp vai Leu Met 20
Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser 35
Pro pro asíi Ala pro ile Leu 50 55
Pro Gin Leu Leu ile Tyr Lys 65 70
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 65
Ser Arg Vai Glu Ala Glu asp 100
Ser His vai pro Trp Thr Phe 115
<210> 218 <211> 137 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB41 - <400> 218 variável pesada 246
Met Gly Trp Ser Cys Ile lie Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 S 10 is val His ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu ile Gin 20 25 30 pro Gly Gly Ser Leu Arg Met ser Cys Thr ile Thr Asp Gin Val ργο 35 40 45
Phe Ser val Trp val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile 50 55 60
Ala Tyr ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr pro Asp Thr Val 65 70 75 80
Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 85 90 95
Leu Gin Leu Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys 100 105 110
Ala Arg His Tyr Gly His Tyr Val Asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly 115 120 125
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val ser ser 130 135
<210> 219 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB43 - variável leve <400> 219 247 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacg 399
<210> 220 <211> 417 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB35 - variável pesada <400> 220 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt 240 gtgtggctcc gattcaccat ttccagagac aatagcaaga acaccctgta tttgcaattg 300 aacagtctga gggctgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac 360 gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgct 417
<210> 221 <211> 135 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB35 - variável pesada 248 <400> 221
Met 1 Gly Trp Ser cys 5 Xle ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai Hi S Ser Gin 20 vai Gin Leu vai Glu 25 Thr Gly Gly Gly Leu 30 ile Gin Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met ser 40 cys Thr Ile Met Asp 45 Gin val pro Phe Ser 50 Vai Trp Vai Arg Gin 55 Ala Pro Gly Lys Gly 60 Leu Glu Trp Ile Ala 65 Tyr ile Gly Ser Gly 70 Gly Ser vai Tyr ASp 75 Phe phe Val Trp Leu 80 Arg phe Thr ile Ser 85 Arg ASp Asn Ser Lys 90 Asn Thr Leu Tyr Leu 95 Gin Leu Α5Π Ser Leu 100 Arg Ala GlU ASP Thr 105 Ala val Tyr Tyr Cys 110 Ala Arg His Tyr Gly 115 HIS Tyr vai ASp Tyr 120 Ala val Asp Tyr Trp 125 Gly Gin Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 130 135
<210> 222 <211> 408 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB35 - variável leve <400> 222 249 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgctggaa caggcagctg tatccagagt ggacagaagc ccagagactt 160 gactggtatc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctttca aggttcacat 360 gttccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtacg 408
<210> 223 <211> 131 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB35 - variável leve <400> 223 250
Met Gly Trp Ser Cys ile ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Vai His Ser A$p Vai Leu Met Thr Gin ser Pro Leu Ser Leu pro vai 20 25 30 Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser Cys Trp Asn Arg Gin Leu Tyr 35 40 45 Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu ASp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly 65 Gin Ser pro Gin Leu 70 Leu lie Tyr Lys vai 75 ser Asn Arg phe Ser 80 Gly vai Pro ASp Arg 85 Phe Ser Gly Ser Gly 90 Ser Gly Thr Asp phe 95 Thr Leu t-ys ile Ser 100 Arg vai Glu Ala Glu 105 ASP Thr Gly vai Tyr 110 Tyr cys Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Trp Thr phe Gly Gly Glí Thr Lys vai 115 120 125
Glu Ile Lys 130
<210> 224 <211> 417 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB50 - variável pesada <400> 224 251 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt 240 gtgtggctcc gattcaccat ttccagagac aatagcaaga acaccctgta tttgcaattg 300 aacagtctga gggctgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac 360 gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgct 417
<210> 225 <211> 135 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB50 - variável pesada <400> 225 252
Met 1 Gly Trp Ser Cys lie Ile Leu phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai HIS ser Gin 20 val Gin Leu val Glu 25 Thr Gly Gly Gly Leu 30 Ile Gin ΡΓΟ Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Cys Thr ile Met Asp 45 Gin val ΡΓΟ Phe Ser 50 Val Trp val Arg Gin 55 Ala pro Gly Lys Gly 60 Leu Glu Trp Ile Ala Tyr Ile Gly Ser Gly Gly Ser val Tyr ASp Phe Phe Val Trp Leu 65 70 75 80 Arg Phe Thr Ile Ser Arg ASP Asn ser !-ys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 85 90 95 Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala ΑΓ9 100 105 110 His Tyr Gly 115 His Tyr val ASP Tyr 120 Ala val Asp Tyr Trp 125 Gly Gin ciy Thr Thr val Thr val Ser Ser 130 135
<210> 226 <211> 431 <212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Sequência de DCIB50 - variável leve <400> 226 253 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta 180 gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctggaa caggcagctg 360 tatccagagt ggacagaagc ccagagactt gacttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc 420 aagcgtacgm g 431
<210> 227 <211> 138 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB50 - variável leve <400> 227 254
Met Gly TrP Ser Cys lie lie Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 vai His Ser Asp vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu ser Leu Pro vai
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu 35 40 45 vai His ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60
Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Glv vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Thr Asp Phe Thr 7 85 90 95
Leu Lys ile Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Thr Gly vai Tyr Tyr cys 100 105 110
Trp Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu Asp 115 120 125
Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu lie Lys 130 13S
<210> 228 <211> 420 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB71 - Variável pesada <400> 228 255 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcatcttgat caattcccta cctcttgtat gggttcggca ggctccgggg 180 aaggggctgg agtggatcgc atacattggt agtggtggtg atagaaccta ctatccagac 240 actgtgaagg gccgattcac catttccaga gacaatagca agaacaccct gtatttgcaa 300 ttgaacagtc tgagggccga ggacacagcc gtgtattact gtgcaagaca ttatggtcac 360 tacgtggact atgctgtgga ctactggggt caaggaacca cggtcaccgt ctccagcgct 420
<210> 229 <211> 136 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB71 - Variável pesada <400> 229 256
Met Gly Trp Ser CyS 11 e Ile LeU Phe LoU Va1 Αΐ3 Thf AU 15"* €lV 1 5 10 vai His Ser Gin vai Gin Leu vai Glu Thr Gly Gly Gly l1e Gln
Pro
Gly Gly Ser Leu Arg Met ser Cys ile Leu ile Asn ser Leu Pro 35 40
Leu
val Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile Ala 6U 50 55
Tvr ile Gly Ser Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 65 70 75 S0
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 85 90 95
Gin Leu Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala 100 105 110
Arg His Tyr Gly His Tyr val asp Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gin 115 120 125
Gly Thr Thr val Thr val Ser Ser 130 135
<210> 230 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> - Variável leve <223> Sequência de DCIB71 <400> 230 257 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacg 399
<210> 231 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB71 - Variável leve <400> 231 258
Met 1 ciy Trp ser Cys 5 Ile Ile Leu phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai H1S Ser Asp 20 Val Leu Met Thr Gin 25 Ser Pro Leu Ser Leu 50 Pro val Thr pro Gly 55 Glu pro Ala ser He 40 Ser cys Thr pro pro 45 Ala Tyr Arg Pro pro 50 Asn Ala pro ile Leu 55 Trp Tyr Leu Gin Lys 60 pro Gly Gin Ser Pro 65 Gin Leu Leu Ile Tyr 70 Lys vai Ser Asn Arg 75 phe Ser Gly Val Pro 80 Asp Arg Phe Ser Gly 85 Ser Gly Ser Gly Thr 90 ASP Phe Thr Leu Lys 95 ile Ser Arg vai Glu 100 Ala Glu Asp Thr Gly 105 val Tyr Tyr Cys phe 110 Gin Gly Ser His Vai 115 Pro Trp Thr Phe Gly 120 Giy Gly Thr Lys val 125 Glu ile Lys
<210> 232 <211> 426 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB72 - variável pesada <400> 232 259 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gtgcagcctc tggattcgct ttcaatacct atgacatgtc ttgggttcgc 180 caggctccgg ggaaggggct ggagtggatc gcatacattg gtagtggtgg tatcttgatc 240 aattccctac ctcttgtacg attcaccatt tccagagaca atagcaagaa caccctgtat 300 ttgcaattga acagtctgag ggctgaggac acagccgtgt attactgtgc aagacattat 360 ggtcactacg tggactatgc tgtggactac tggggtcaag gaaccacggt caccgtctcc 420 agcgct 426
<210> 233 <211> 138 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB72 - variável pesada <400> 233 260
Met Gly TrP ser Cys ile ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly j 5 vai His Ser cln vai Gin Leu Vai Glu Thr Gly Gly Gly Leu lie Gin 20 25 pro Gly Gly Ser Leu Arg Met Ser cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe 35 40 45
Asn Thr Tyr Asp Met Ser Trp vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp ile Ala Tyr ile Gly Ser Gly Gly lie Leu Ile Asn Ser Leu 6S 70 75 80
Pro Leu val Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 85 90 95
Tyr Leu Gin Leu Asr> Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr 100 105 110
Cys Ala Arg His Tyr Gly His Tyr val Asp Tyr Ala val Asp Tyr Trp 115 120 125
Gly Gin Gly Thr Thr val Thr Val ser ser 130 13S
<210> 234 <211> 399 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB72 - variável leve <400> 234 261 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtacg 399
<210> 235 <211> 128 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB72 - variável leve <400> 235 262 vai His Ser Asp vai Leu Met Thr 20
Thr pro Gly Glu Pro Ala Ser lie 3S 40
Pro Pro Asn Ala Pro He Leu Trp 50 55 pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Vai 65 70
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Thr 100 ser His val Pro Trp Thr Phe Gly 115 120
<210> 236 <211> 1413 <212> ADN <213> Desconhecido
Phe Leu val Ala Thr Ala Thr Gly 10 15 Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro val 25 30 Ser Cys Thr pro pro 45 Ala Tyr Arg Tyr Leu Gin &!s Pro Gly Gin ser ser Asn Arg Phe Ser Gly val Pro 75 80 Gly Thr Asp phe Thr Leu cys He 90 95 Gly val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 105 110 Gly Gly Thr Lys val Glu ile Lys 125 <220> variável pesada <223> Sequência de DCIBS3 - <400> 236 263 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcaccattat ggaccaggtg cctttctccg tgtgggttcg gcaggctccg 180 gggaaggggc tggagtggat cgcatacatt ggtagtggtg gtagtgttta tgattttttt 240 gtgtggctcc gattcaccat ttccagagac aatagcaaga acaccctgta tttgcaattg 300 aacagtctga gggctgagga cacagccgtg tattactgtg cgagacatta tggtcactac 360 gtggactatg ctgtggacta ctggggtcaa ggtaccacgg tcaccgtctc cagcgctaaa 420 acaacagccc catcggtcta tccactggcc cctgtgtgtg gagatacaac tggctcctcg 480 gtgactctag gatgcctggt caagggttat ttccctgagc cagtgacctt gacctggaac 540 tctggttccc tgtccagtgg tgtgcacacc ttcccagctg tcctgcagtc tgacctctac 600 accctcagca gctcagtgac tgtaacttcg agcacctggc ccagccagtc catcacctgc 660 aatgtggccc acccggcaag cagcaccaag gtggacaaga aaattgagcc cagagggccc 720 acaatcaagc cctgtcctcc atgcaaatgc ccagcaccta acctcttggg tggaccatcc 780 gtcttcatct tccctccaaa gatcaaggat gtactcatga tctecctgag ccccatagtc 840 acatgtgtgg tggtggatgc gagcgaggat gacccagatg tccagatcag ctggtttgtg 900 aacaacgtgg aagtacacac agctcagaca caaacccata gagaggatta caacagtact 960 ctccgggtgg tcagtgccct ccccatccag caccaggact ggatgagtgg caaggagttc 1020 aaatgcaagg tcaacaacaa agacctccca gcgcccatcg agagaaccat ctcaaaaccc 1080 aaagggtcag taagagctcc acaggtatat gtcttgcctc caccagaaga agagatgact 1140 aagaaacagg tcactctgac ctgcatggtc acagacttca tgcctgaaga catttacgtg 1200 gagtggacca acaacgggaa aacagagcta aactacaaga acactgaacc agtcctggac 1260 tctgatggtt cttacttcat gtacagcaag ctgagagtgg aaaagaagaa ctgggtggaa 1320 agaaatagct actcctgttc agtggtccac gagggtctgc acaatcacca cacgactaag 1380 agcttctccc ggactccggg taaatgatct aga 1413
<210> 237 <211> 465 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB53 - variável pesada 264 <400> 237 265
Met 1 Gly Trp Ser cys Ile Ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly vai Hl S Ser Gin Val Gin Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Ile Gin 20 25 30 Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 cys Thr ile Met Asp 45 Gin val pro Phe Ser Vai Trp Val Arg Gin Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ile 50 55 60 Ala 6S Tyr rle Gly Ser Gly 70 Gly Ser val Tyr ASp 75 Phe Phe val Trp Leu 80 Arg Phe Thr. Ile Ser 8S Arg Asp Asn Ser Lys 90 Asn Thr Leu Tyr Leu 95 Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala Arg 100 105 110 His Tyr Gly 115 His Tyr val Asp í5o Ala val Asp Tyr S! Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 130 135 140 Pro Leu Ala pro val cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser val Thr Leu 145 150 155 160 Gly cys Leu Val Lys Gly Tyr phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 165 170 175 Asn Ser Gly ser Leu Ser Ser Gly val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 Gin ser ASp Leu Tyr Thr Leu ser Ser Ser val Thr val Thr ser Ser 195 200 205 Thr Trp pro Ser Gin ser ile Thr Cys Asn val Ala His pro Ala Ser 210 215 220 ser 225 Thr Lys val ASp Lys ile Glu Pro & Gly Pro Thr lie Lys 240 Pro cys pro pro Cys 245 Lys cys pro Ala Pro 250 Asn Leu Leu Gly til Pro 266
Ser Vai Phe Ile 260 Phe Pro Pro Lys ile 265 Lys ASp val Leu Met 270 Ile ser Leu Ser Pro 275 ile val Thr cys val 280 val val Asp val Ser 285 Glu Asp Asp Pro Asp 290 val Gin Ile ser Trp 295 Phe val Asn Asn Val 300 Glu val His Thr Ala 305 Gin Thr Gin Thr HÍS 310 Arg Glu Asp Tyr Asn 315 Ser Thr Leu Arg val 320 vai Ser Ala Leu pro 325 Ile Gin His Gin Asp 330 Trp Met Ser Gly Lys 335 Glu Phe Lys Cys Lys 340 val Asn Asn Lys Asp 345 Leu Pro Ala Pro ile 350 Glu Arg Thr Ile ser 355 Lys pro Lys Gly Ser 360 val Arg Ala Pro Gin 365 val Tyr Val Leu Pro 370 pro pro Glu Glu Glu 375 Met Thr Lys Lys Gin 380 Val Thr Leu Thr Cys 385 Met Val Thr Asp Phe 390 Met Pro Glu ASp Ile 395 Tyr val Glu Trp Thr 400 ASn Asn Gly Lys Thr 405 Glu Leu Asn Tyr Lys 410 Asn Thr Glu Pro val 415 Leu ASp Ser ASP Gly 420 Ser Tyr Phe Met & Ser Lys Leu Arg Val 430 Glu Lys Lys A$n Trp 435 val Glu Arg Asn Ser 440 Tyr Ser cys Ser val 445 val His GlU Gly Leu 450 HiS Asn His His Thr 455 Thr Lys Ser Phe Ser 460 Arg Thr pro Gly Lys 465
<210> 238 <211> 729 <212> ADN 267 <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB53 - variável leve <400> 238 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgcactcc tccagcttat agaccaccaa atgcccctat cctatggtat 180 ctgcagaaac caggccagtc tccacagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acagattcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatac cggagtgtat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtgg 360 acgttcggtg gaggcaccaa ggtggaaatc aagcgtgcag atgctgcacc aactgtatcg 420 atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480 aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540 aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600 agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660 actcacaaga catctacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttagctc 720 gagtctaga 729
<210> 239 <211> 235 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB53 - variável leve <400> 239 268
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Vai Ala Thr Ala Thr Gly 268vai
His Ser ASP vai Leu Met Thr Gin Ser pro Leu ser Leu Pro vai 20
2S
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie ser cys Thr Pro Pro Ala Tyr Arg 35 4<> 45
Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 50 55 60 pro Gin Leu Leu He T^r Lys vai ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 65 70 75
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 90 65
9S
Ser Arg vai Glu Ala Glu Asp Thr Gly vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 100 105 HO
Ser his vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys vai Glu ile Lys 115 120 125
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr vai Ser ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 130 135 UO
Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser vai vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160
Tyr Pro Lys Asp ile Asn vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 165 170 175
Gin Asn Gly vai Leu Asn ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190
Thr Tyr Ser Met ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 195 200 205
Arg His Asn Ser Tyr Thr cys Glu Ala Thr his Lys Thr ser Thr ser 210 215 220
Pro lie Vai Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 235 <210> 240 <211> 1449 269
<212> ADN <213> Desconhecido <22 0> <223> Sequência de DCIB64 - Variável pesada <400> 240 aagcttacca tgggatggag actcecaggt gcagctggtg agaatgtcct gcgggacagg taccattggg ttcggcaggc ggtggtagtg tttatgattt aagaacaccc tgtatttgca tgtgcccgat ggaacaggca ggccaaggaa ccacggtcac ctggcccctg tgtgtggaga ggttatttcc ctgagccagt cacaccttcc cagctgtcct acttcgagca cctggcccag accaaggtgg acaagaaaat aaatgcccag cacctaacct aaggatgtac tcatgatctc gaggatgacc cagatgtcca ctgtatcatc ctcttcttgg gagactgggc ggaggcttaa cagggcaatg ctgggcacac tccggggaag gggctggagt ttttgtgtgg ctccgattca attgaacagt ctgagggctg gctgtatcca gagtggacag cgtctccagc gctaaaacaa tacaactggc tectcggtga gaccttgacc tggaactctg gcagtctgac ctctacaccc ccagtccatc acctgcaatg tgagcccaga gggcccacaa cttgggtgga ccatccgtct cctgagcccc atagtcacat gatcagctgg tttgtgaaca tagcaacagc taccggagtc 60 tccagcctgg agggtccctg 120 acaccatgga agtgactgtc 180 ggatcgeata cattggtagt 240 ccatttccag agacaatagc 300 aggacacagc cgtgtattac 360 aagcccagag acttgactgg 420 cagccccatc ggtctatcca 480 ctctaggatg cctggtcaag 540 gttccctgtc cagtggtgtg 600 tcagcagctc agtgactgta 660 tggcccaccc ggcaagcagc 720 tcaagccctg tcctccatgc 780 tcatcttccc tccaaagatc 840 gtgtggtggt ggatgtgagc 900 acgtggaagt acacacagct 960 cagacacaaa cccatagaga atccagcacc aggactggat ctcccagcgc ccatcgagag gtatatgtct tgcctccacc atggtcacag acttcatgcc gagctaaact acaagaacac agcaagctga gagtggaaaa gtccacgagg gtctgcacaa tgatctaga ggattacaac agtactctcc gagtggcaag gagttcaaat aaccatctca aaacccaaag agaagaagag atgactaaga tgaagacatt tacgtggagt tgaaccagtc ctggactctg gaagaactgg gtggaaagaa tcaccacacg actaagagct gggtggtcag tgccctcccc gcaaggtcaa caacaaagac ggtcagtaag agctccacag aacaggtcac tctgacctgc ggaccaacaa cgggaaaaca atggttctta cttcatgtac atagctactc ctgttcagtg tctcccggac tccgggtaaa 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1449 270 270 4 - Variável pesada
<210> 241 <211> 476 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB6 <400> 241
Met Gly ΤΓΡ Ser Cys Ile Ile 1 5 vai His Ser Gin vai Gin Leu pro Gly Gly ser Leu Arg Met
Gly Thr His Thr Met Glu vai 50 55
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 65 70 vai Tyr asp Phe Phe vai Trp
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 100
Thr Ala val Tyr Tyr cys Ala 115
Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu 130 135 val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 145 150
Leu phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr 15 Gly val Glu 25 Thr Gly Gly Gly Leu 30 ile Gin Ser 40 Cys Gly Thr Gly Arg 45 Ala Met Leu Thr Val Tyr His Trp 60 Val Arg Gin Ala Ile Ala Tyr ile 75 Gly Ser Gly Gly Ser 80 Leu Arg Phe 90 Thr ile Ser Arg ASP 95 Asn Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu ASp 105 110 Arg 120 Trp Asn Arg Gin Leu 125 Tyr pro GlU ASP Trp Gly Gin Gly 140 Thr Thr val Thr Ala Pro ser val Tyr pro Leu Ala pro 155 160 271 val Cys Gly ASp Thr 165 Thr Gly Ser Lys Gly Tyr Phe pro Glu Pro val 180 Leu Ser Ser Gly val His Thr Phe 195 200 Tyr rhr Leu Ser Ser Ser val Thr 210 215 Gin Ser lie Thr cys Asn Val Ala 225 230 ASP Lys Lys Ile Glu 245 Pro Arg Gly cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu 260 Pro Pro Lys He Lys ASp val Leu 275 280 Thr cys val Val Val Asp val Ser 290 295 Ser Trp Phe val Asn Asn val Glu 305 310 His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr 325 lie Gin His Gin ASP Trp Met Ser 340 Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro 355 360 Lys Gly 370 Ser Val Arg Ala Pro 375 Gin Glu Glu Met Thr Lys Lys Gin val 385 390 phe Met Pro Glu Asp ile Tyr val 405 Glu Leu Asn TYr Lys A$n Thr Glu 4
Ser val Thr Leu Gly Cys Leu val 170 175 Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly ser 185 190 Pro Ala Val Leu Gin Ser Asp Leu 205 val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser 220 His Pro Ala Ser ser Thr Lys val 235 240 Pro Thr ile Lys pro Cys Pro Pro 250 255 Leu Gly Pro Ser val Phe lie Phe 265 270 Met ile Ser Leu Ser Pro lie val 285 Glu Asp Asp Pro ASP Val Gin Ile 300 val His Thr Ala Gin Thr Gin Thr 315 320 Leu Arg 330 val val Ser Ala Leu 335 pro Gly Lys Glu Phe Lys cys Lys val 345 350 Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro 365 Val Tyr val Leu Pro Pro Pro Glu 380 Thr Leu Thr Cys Met val Thr Asp 395 400 Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr 410 415 pro val Leu Asp Ser ASP Gly Ser 425 430 272
Tyr Phe Met Tyr Ser >-ys Leu Arg Vai Glu Lys Lys Asn Trp val Glu 435 440 445 Arg Asn Ser Tyr Ser cys Ser Vai val HlS Glu Gly Leu His Asn His 450 455 460 Hi s Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 465 470 475
<210> 242 <211> 738 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB64 - variável leve <400> 242 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctccatct cttgcagatc tagtcagagc ctggtacata gtaatggaaa cacctattta 180 gaatggtacc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgctttca aggttcacat 360 gttccgtgga cgttcggtgg aggcaccaag gtggaaatca agcgtgcaga tgctgcacca 420 actgtatcga tcttcccacc atccagtgag cagttaacat ctggaggtgc ctcagtcgtg 480 tgcttcttga acaacttcta ccccaaagac atcaatgtca agtggaagat tgatggcagt S40 gaacgacaaa atggcgtcct gaacagttgg actgatcagg acagcaaaga cagcacctac 600 agcatgagca gcaccctcac gttgaccaag gacgagtatg aacgacataa cagctatacc 660 tgtgaggcca ctcacaagac atctacttca cccattgtca agagcttcaa caggaatgag 720 tgttagctcg agtctaga 738 <210> 243 <211> 238 273
<212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB64 - variável leve <400> 243 274
Met 1 Gly Trp Ser Cys 5 Ile Ile Leu Phe Leu 10 val Ala Thr Ala Thr Gly 15 Vai HÍS Ser Asp 20 val Leu wet Thr Gin 25 Ser pro Leu Ser Leu Pro Val 30 Thr Pro Gly 35 Glu pro Ala Ser ile 40 Ser Cys Arg Ser Ser 45 Gin ser Leu vai His 50 Ser Asm Gly Asn Thr 55 Tyr Leu Gl u Trp Tyr 60 Leu Gin Lys pro Gly Gin 6S Ser pro Gin Leu 70 leu ile Tyr Lys val 75 Ser Asn Arg Phe Ser 80 Gly vai pro ASP Arg 85 Phe Ser Gly Ser Gly 90 Ser Gly Thr Asp Phe 95 Thr Leu Lys Ile Ser 100 Arg Vai Glu Ala Glu 105 Asp Thr Gly Val Tyr 110 Tyr Cys Phe Gin Gl y 115 Ser His vai Pro Trp 120 Thr Phe Gly Gly Gly 125 Thr tys Val Glu rle 130 Lys Arg Ala Asp Ala 135 Ala Pro Thr Val Ser 140 Ile Phe pro Pro ser 145 Ser Glu Gin Leu Thr ISO Ser Gly Gly Ala ser 155 Val Val Cys Phe Leu 160 Asn Asn Phe Tyr Pro 165 Lys Asp Ile Asn val 170 Lys Trp Lys ile ASP Gly 175 Ser Glu Arg Gin 180 Asn Gly val Leu Asn 185 Ser Trp Thr ASp Gin 190 ASp Ser Lys ASp Ser 195 Thr Tyr ser «et ser 200 Ser Thr Leu Thr Leu 205 Thr Lys Asp Glu Tyr 210 Glu Arg His Asn Ser 215 Tyr Thr Cys Glu Ala 220 Thr HÍS Lys Thr Ser 225 Thr Ser Pro Ile vai 230 Lys Ser phe Asn Arg 235 Asn Glu Cys
<210> 244 <211> 453 <212> ADN 275 <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB68 - variável pesada <400> 244 aagcttacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactcccagg tgcagctggt ggagactggg ggaggcttaa tccagcctgg agggtccctg 120 agaatgtcct gcgggacagg cagggcaatg ctgggcacac acaccatgga agtaactgtc 180 taccattggg ttcggcaggc tccggggaag gggctggagt ggatcgcata cattggtagt 240 ggtggtagtg tttatgattt ttttgtgtgg ctccgattca ccatttccag agacaatagc 300 aagaacaccc tgtatttgca attgaacagt ctgagggctg aggacacagc cgtgtattac 360 tgtgcccgat ggaacaggca gctgtatcca gagtggacag aagcccagag acttgactgg 420 ggccaaggta ccacggtcac cgtctccagc gct 453
<210> 245 <211> 147 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB68 - variável pesada <400> 245 276
Met 1 Gly Trp Ser Cys S ile lie Leu Phe Leu 10 Val Ala Thr Ala Thr 15 Gly val His Ser Gin 20 val Gin Leu val Glu 25 Thr Gly Gly Gly Leu 30 Ile Gin pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Met Ser 40 Cys Gly Thr Gly Arg 45 Ala Met Leu Gly Thr 50 His Thr Met Glu val 55 Thr val Tyr His Trp 60 val Arg Gin Ala Pro 65 Gly Lys Gly Leu Glu 70 Trp lie Ala Tyr ile 75 Gly Ser Gly Gly Ser 80 val Tyr ASP Phe Phe 85 val Trp Leu Arg Phe 90 Thr lie Ser Arg ASp 95 Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 100 10S 110 Thr Ala val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asn Arg Gin Leu Tyr pro Glu 115 120 125 Trp Thr GlU Ala Gin Arg Leu ASP Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr 130 135 140 val Ser Ser 145
<210> 246 <211> 435 <212> ADN <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB68 - variável leve <400> 246 277 ggatccacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc taccggagtc 60 cactccgatg tgttgatgac ccaatctcca ctctccctgc ctgtcactcc tggggagcca 120 gcctcgatct cttgctggaa caggcagctg tatccagagt ggacagaagc ccagagactt 180 gactggtatc tgcagaaacc aggccagtct ccacagctcc tgatctacaa agtttccaac 240 cgattttctg gggtcccaga cagattcagt ggcagtggat cagggacaga tttcacactc 300 aagatcagca gagtggaggc tgaggatacc ggagtgtatt actgcgggac aggcagggca 360 atgctgggca cacacaccat ggaagtgact gtctaccatt tcggtggagg caccaaggtg 420 gaaatcaagc gtacg 435
<210> 247 <211> 140 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Sequência de DCIB68 - variável leve <400> 247 278
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu vai Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15 val His ser Asp vai Leu Met Thr Gin Ser Pro Leu ser Leu Pro Vai 20 25 30
Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser ile Ser cys Trp Asn Arg Gin Leu Tyr 35 40 45 pro Glu Trp Thr Glu Ala Gin Arg Leu Asp Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60
Glv Gin Ser Pro Gin Leu Leu ile Tyr Lys Val ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80
Glv val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr y 85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg val Glu Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 HO
Glv Thr Gly Arg Ala Met Leu Gly Thr His Thr Met Glu val Thr val y 115 120 125
Tyr His Phe Gly Gly Gly Thr Lys val Glu Ile Lys 130 135 140 279
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • WO 9619584 A, Bona [0003] [0018] [0026] • US 7067110 B [0004] [0018] • EP 0759944 A [0005] [0018] • WO 0064488 A [0006] [0019] • WO 02092126 A [0007] • US 5225539 A, Winter [0014] [0022] • US 4816397 A [0014] [0022] • US 4816567 A [0014] [0022] • WO 0188138 A [0054] • EP 2008053761 W [0152] • GB 0706070 A [0152]
Literatura não relacionada com patentes referida na descrição • Alexander—Miller. Immunologic Research, 2005, vol. 31, 13-24 [0002] • Hodge et al. J Immunol, 2005, vol. 174, 5994-6004 [0002] [0098] • Valmori et al. J Immunol, 2002, vol. 168, 4231-40 [0002] [0098] • Zeh et al. J Immunol, 1999, vol. 162, 989-94 [0002] [0020] [0098] • Khong ; Rosenberg. J Immunol, 2002, vol. 168, 951-6 [0002] 280 • Vignard et al. J Immunol, 2005, vol. 175, 4797-805 [0002] • Dudley et al. J Immunother, 2001, vol. 24, 363-73 [0002] • Morgan et al. J Immunol, 2003, vol. 171, 3287-95 [0002] • Rosenberg ; Dudley. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, vol. 101 (2), 14639-45 [0002] Sakaguchi et al. J. Immunol, 1995, vol. 155, 1151-1164 [0010] Sakaguchi et al. J Immunol, 1995, vol. 155, 1151-1184 [0010] Shevach. Immunity, 2006, vol. 25, 195-201 [0010] [0011] Coleman et al. J. Cell Mot. Med, 2007, vol. 11, 1291- 1325 [0010] Shimizu et al. J. Immunol., 1999, vol. 163, 5211-5218 • Onizuka et al. Câncer Research, 1999, vol. 59, 3128-3133 [0010] • Tanaka et al. J. Immunother., 2002, vol. 25, 207-217 [0010] • Tanalcaetal. J. Immunother.,2002,vol.25, 207-217 [0010] • Dannull et al. J. Clin. Invest., 2005, vol. 115, 3623- 3633 [0010] • Sutmuller et al. J. Exp. Mad., 2001, vol. 194, 823-832 [0010] • Woo et al. Câncer Research, 2001, vol. 61, 4766-4772 [0010] • Curieletal. Nature Medicine, 2004, vol. 10, 942-949 [0010] • Wolf et al. Clin. Câncer Research, 2003, vol. 9, 606-612 [0010] • Sasada et al. Câncer, 2003, vol. 98, 1089-1099 [0010] • Sasacia et al. Câncer, 2003, vol. 98, 1089-1099 [0010] 281 • Liyanage et al. J. Immunology, 2002, vol. 169, 2756-2761 [0010] • Matsuura et al. Câncer, 2006, vol. 106, 1227-1236 [0010] • Yang et al. Blood, 2006, vol. 107, 3639-3646 [0010] • Álvaro et al. Clin. Câncer Research, 2005, vol. 11, 1467-1473 [0010] • Ichihara et al. Clinicai Câncer Research, 2003, vol. 9, 4404-4408 [0010] • Curieletal. Nature Meáicine, 2004, vol. 10, 942-949 [0010] • Piccirillo et al. J. Immunology, 2001, vol. 167, 1137- 1140 [0010]
Mempel et al . Immunity, 2006, vol. 25, 129-141 [0010] Annacker et al. J. Immunology, 200 1, vol. 166, 3008-3018 [0010] Wooetal. J. Immunology, 2002, vol. 168, 4272-4276 [0010] Liyanage et al. J, Immunology, 200 2, vol. 169, 2756-2761 [0010] Nishikawa et al. Blood, 2005, vol. 106, 008-1011 [0010]
Romagnani et al. Eur. J. Immunol., 2005, vol. 35, 2452 2458 [0010] Ralainirina et al. J. Loukoc Biol. , 2007, vol. . 81, 144 153 [0010] • Limetal. J. Immunology, 2005, vol. 175, 4180-4183 [0010] • Shevach. Immunity, 2006, vol. 25, 196-201 [0011] • Bluestone et al. Nat. Immunol., 2005, vol. 6, 345-352 [0011] • Sakaguchi et al. Nat. Immunology, 2005, vol. 6, 345-352 [0011] • Picca et al. Current Opinion in Immunafogy, 2 0 05, vol. 17, 131-136 [0011] • Jordan et al. Nature Immunology, 2001, vol. 2 (4), 301- 306 [0011] 282 • Picca et al. Immunological Revíews, 2006, vol. 212, 74- 85 [0011] • Akbar et al. Nat. Rev. Immunol., 2007, vol. 7, 231-237 [0011] • von Boehmer. Nature Immunology, 2005, vol. 6 (4), 338- 344 [0011] • Whang et al. Immunity, 2004, vol. 20, 107-118 [0012] • Venceetal. PNAS,2007, vol.104(52),20884-20889 [0012] • Chakraborty et al. Hum. Immunology, 2004, vol. 65, 794- 802 [0012] • Thorton ; Shevach. J. Immunology, 2000, vol. 164, 183190 [0012] • Lietal.Immunol.Cell Biol., 2007, vol.85(3),197-204 [0012] • Harada et al. Immunology, 2001, vol. 104, 67-74 [0020] • Sambrook ; Fritsch ; Maniatis.MolecularCloning'', A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 [0032] • Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 1992 [0032] • Remington's Pharmaceutical Sciences. 1980 [0039] • Sanger et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1977, vol. 74, 5463-7 [0054] • Bloom et al. The Journal of Experimental Medicine, 1997, vol. 185, 453-9 [0089] • Rosenberget al.J Immunol,2005, vol. 175, 6169-76 [0098] • Rosenberg et al. Nature Medicine, 2004, vol. 10, 909-15 [0098] • Alexander-Miller. Immunologic research, 2005, vol. 31, 13-24 [0098] • Alexander-Miller et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, vol. 93, 4102-7 [0098] 283 • Oh et al. J Immunol, 2003, vol. 170, 2523-30 [0098] • Ramageetal. Int. J. Câncer, 2004, vol. 110, 245-250 [0129] • Chapiro et al. J Immunol, 2006, vol. 176, 1053-61 [0136] • Macagno et al. Eur J Immunol, 2001, vol. 31, 3271-80 [0136] • Overwijk et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, vol. 96, 2982-7 [0144] • Lance et al. Câncer Research, 2004, vol. 64, 1509-14 [0144] • Steitz etal. Câncer Immunol Immunother, 2006, vol. 55, 246-53 [0144] • Rosenberg ;White. JlmmunotherEmphasisTumor Immunol, 1996, vol. 19, 81-4 [0144]

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um ácido nucleico que compreende um promotor não específico e uma sequência que codifica um anticorpo recombinante, em que a molécula de anticorpo tem epítopos de linfócitos T heterólogos na mesma de modo que o anticorpo não pode tomar a sua conformação nativa quando o ácido nucleico é expresso, sendo os epítopos de linfócitos T heterólogos: GTGRAMLGTHTMEVTVYH em CDRH1 e CDRL3 SVYDFFVWL em CDRH2, e WNRQLYPEWTEAQRLD em CDRH3 e CDRL1.
2. Um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que os epítopos de linfócitos T são inseridos no anticorpo.
3. Um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que os epítopos de linfócitos T são substituídos no anticorpo.
4. Um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
5. Um ácido nucleico de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo é humanizado ou quimerizado.
6. Um ácido nucleico de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a sequência que codifica a cadeia pesada do anticorpo recombinante compreende adicionalmente uma sequência líder.
7. Um ácido nucleico de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo tem a sequência da Figura 60. 2
8. Uma vacina que compreende um ácido nucleico de acordo com qualquer reivindicação anterior e um adjuvante.
9. Uma composição farmacêutica que compreende um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 e um veiculo, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
10. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 para utilização em medicina.
11. Um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10 para utilização na estimulação de uma resposta imune contra pelo menos um dos epitopos de linfócitos T.
12. A utilização de um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 no fabrico de um medicamento para estimular uma resposta imune contra pelo menos um dos epitopos de linfócitos T.
PT10152624T 2007-03-28 2008-03-28 Ácidos nucleicos que codificam imunoglobulinas que possuem epítopos de gp100 e trp2 PT2193803E (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0706070.0A GB0706070D0 (en) 2007-03-28 2007-03-28 Nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT2193803E true PT2193803E (pt) 2012-01-16

Family

ID=38050410

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT10152624T PT2193803E (pt) 2007-03-28 2008-03-28 Ácidos nucleicos que codificam imunoglobulinas que possuem epítopos de gp100 e trp2
PT87355830T PT2134357T (pt) 2007-03-28 2008-03-28 Ácidos nucleicos

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT87355830T PT2134357T (pt) 2007-03-28 2008-03-28 Ácidos nucleicos

Country Status (16)

Country Link
US (1) US8742088B2 (pt)
EP (2) EP2193803B1 (pt)
JP (1) JP5415399B2 (pt)
KR (4) KR20170040387A (pt)
CN (2) CN101678092B (pt)
AT (1) ATE529128T1 (pt)
AU (1) AU2008231723B2 (pt)
BR (1) BRPI0808599A2 (pt)
CA (1) CA2681531C (pt)
DK (2) DK2134357T3 (pt)
ES (2) ES2375463T3 (pt)
GB (1) GB0706070D0 (pt)
PL (1) PL2134357T3 (pt)
PT (2) PT2193803E (pt)
WO (1) WO2008116937A2 (pt)
ZA (1) ZA200907242B (pt)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0706070D0 (en) 2007-03-28 2007-05-09 Scancell Ltd Nucleic acids
CN107427590B (zh) 2015-02-02 2021-08-31 伯明翰大学 具有多个t细胞表位的靶向部分肽表位复合物
WO2017210149A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 Igc Bio, Inc. Compositions and methods for generating an antibody library
US11419928B2 (en) 2017-10-25 2022-08-23 The Johns Hopkins University Methods and compositions for treating cancer
WO2021195089A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Sorrento Therapeutics, Inc. Fc-coronavirus antigen fusion proteins, and nucleic acids, vectors, compositions and methods of use thereof
CN111423504B (zh) * 2020-04-17 2021-03-26 安徽高安生物医学科技有限公司 黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞
JP2023539642A (ja) 2020-08-26 2023-09-15 スキャンセル リミテッド ヒトＩｇＧ１の改変ＦＣ領域 及び少なくとも１つの異種抗原を含むポリペプチドをコードする核酸

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5969109A (en) * 1990-02-28 1999-10-19 Bona; Constantin Chimeric antibodies comprising antigen binding sites and B and T cell epitopes
WO1995031483A1 (en) 1994-05-13 1995-11-23 Eclagen Limited Improvements in or relating to peptide delivery
CA2195642A1 (en) * 1994-07-27 1996-02-08 Andreas Suhrbier Polyepitope vaccines
US5698679A (en) * 1994-09-19 1997-12-16 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for targeting an immune response
AUPO784197A0 (en) * 1997-07-10 1997-08-07 Csl Limited Treatment of nasopharyngeal carcinoma
EP1030684A4 (en) * 1997-11-14 2004-09-15 Euro Celtique Sa MODIFIED ANTIBODIES WITH IMPROVED CAPACITY TO TRIGGER ANTI-IDIOTYPE RESPONSE
JP5000807B2 (ja) * 1999-04-27 2012-08-15 ネバジェン エルエルシー 体細胞導入遺伝子免疫および関連方法
US7067110B1 (en) * 1999-07-21 2006-06-27 Emd Lexigen Research Center Corp. Fc fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
GB0102145D0 (en) * 2001-01-26 2001-03-14 Scancell Ltd Substances
GB0111628D0 (en) 2001-05-11 2001-07-04 Scancell Ltd Binding member
AU2002331704A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-10 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health A Peptides of melanoma antigen and their use in diagnostic, prophylactic and therapeutic methods
CA2499123A1 (en) * 2002-09-17 2004-04-15 Antigen Express, Inc. Ii-key/antigenic epitope hybrid peptide vaccines
GB0706070D0 (en) 2007-03-28 2007-05-09 Scancell Ltd Nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
US20100260806A1 (en) 2010-10-14
JP5415399B2 (ja) 2014-02-12
DK2134357T3 (en) 2017-09-11
PT2134357T (pt) 2017-08-29
CN103667304A (zh) 2014-03-26
WO2008116937A2 (en) 2008-10-02
GB0706070D0 (en) 2007-05-09
ES2638188T3 (es) 2017-10-19
JP2010522550A (ja) 2010-07-08
KR20150013357A (ko) 2015-02-04
ES2375463T3 (es) 2012-03-01
EP2193803B1 (en) 2011-10-19
CA2681531A1 (en) 2008-10-02
KR101729458B1 (ko) 2017-04-21
DK2193803T3 (da) 2012-02-13
KR20100015699A (ko) 2010-02-12
EP2134357A2 (en) 2009-12-23
AU2008231723A1 (en) 2008-10-02
BRPI0808599A2 (pt) 2019-01-08
ATE529128T1 (de) 2011-11-15
AU2008231723B2 (en) 2013-05-16
CN103667304B (zh) 2018-02-02
CA2681531C (en) 2017-11-28
US8742088B2 (en) 2014-06-03
CN101678092B (zh) 2014-04-02
PL2134357T3 (pl) 2018-03-30
CN101678092A (zh) 2010-03-24
EP2134357B1 (en) 2017-05-31
KR20170040387A (ko) 2017-04-12
WO2008116937A3 (en) 2009-01-22
KR20160091458A (ko) 2016-08-02
EP2193803A1 (en) 2010-06-09
ZA200907242B (en) 2010-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111655728B (zh) 结合ctla-4的抗体及其用途
CN106715470B (zh) 与pd-1和lag-3具有免疫反应性的共价结合的双抗体和其使用方法
CN109790215B (zh) 异源二聚体免疫球蛋白构建体和其制备方法
KR101901458B1 (ko) Ｔｃｒ 복합체 면역치료제
JP4904443B2 (ja) 結合構築体およびその使用方法
DK2536764T3 (en) ANTI-CD28 HUMANIZED ANTIBODIES
US6294654B1 (en) Modified immunoglobulin molecule incorporating an antigen in a non-CDR loop region
CN107056951A (zh) Cd86拮抗物多靶点结合蛋白
KR101729458B1 (ko) 핵산
JP2007528194A5 (pt)
WO2021195089A1 (en) Fc-coronavirus antigen fusion proteins, and nucleic acids, vectors, compositions and methods of use thereof
CN112823166A (zh) 用于修饰的t细胞的条件活性嵌合抗原受体
TW201915017A (zh) 標靶bcma的抗體及其應用
TW202241943A (zh) Tau特異性抗體基因療法組合物、方法及其用途
KR101596364B1 (ko) 면역원성 복합 단백질을 생산하는 형질전환 식물체의 제조방법 및 이로부터 수득된 면역원성 복합 단백질
CN114480413B (zh) 一种活化肿瘤免疫应答的基因修饰干细胞制备方法
TW202411246A (zh) 經工程化之b型肝炎病毒中和抗體及其用途
WO2023230439A1 (en) Fc-engineered hepatitis b virus neutralizing antibodies and uses thereof