CN111423504B - 黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞 - Google Patents

黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞及其在治疗黑色素瘤中的应用。本发明通过调整黑色素瘤特异性抗原肽，有效地提高了抑制黑色素瘤的生长，预示着其对于黑色素瘤的治疗能够取得更好的效果。

Description

黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞及其在治疗黑色素瘤中的应用。
背景技术
自身T细胞对自身MHC分子呈递的肿瘤抗原肽的反应通常是微弱和无效应的。同种限制性T细胞库的存在有可能产生针对非自身 MHC分子结合的自身肽的T细胞，因为自身耐受是针对自身MHC分子呈递的自身肽无反应。因此，同种T细胞为过继肿瘤特异性T细胞治疗肿瘤提供了很有发展潜力的细胞来源。
华中科技大学同济医学院免疫学院的吴雄文教授指导的博士论文《利用aAPC制备pMHC特异性T细胞及其在同种T细胞识别和抗肿瘤实验研究中的应用》探索了用由表面包被有H-2Kb-Ig/TRP2180-188复合物分子和抗鼠CD28分子的微球制备人工抗原呈递细胞 H-2Kb-Ig/TRP2180-188-aAPCs从BALB/c鼠体内同种限制性T细胞库中诱导针对H-2Kb限制性来自酪氨酸酶相关蛋白2黑色素瘤特异性抗原表位TRP2180-188的同种细胞毒性的杀伤T淋巴细胞(CTLs)来过继治疗黑色素瘤。实验结果显示H-2Kb-Ig/TRP2-aAPC诱导的肽pTRP2 特异性同种T细胞能特异抑制黑色素瘤的生长。
发明内容
但是，上述论文提供的抑制黑色素瘤的生长的程度还有进一步提升的空间。在上述论文中，H-2Kb限制性的黑色素瘤特异性抗原肽TRP2中的第180-188位氨基酸残基N-SVYDFFVWL-COOH。发明人尝试对上述抗原肽的序列进行改进以进一步提高抑制黑色素的生长。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种黑色素瘤特异性抗原肽及其在治疗黑色素瘤中的应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列或者是SEQ ID NO.1 所示的氨基酸序列缺失、替换或增加其中一个氨基酸的序列。
在本发明的另一方面，还涉及一种肽复合物及其在治疗黑色素瘤中的应用，其由上述黑色素瘤特异性抗原肽与二聚体H-2Kb-Ig混合孵育得到。
在本发明的另一方面，还涉及一种人工抗原呈递细胞及其在治疗黑色素瘤中的应用，其由上述肽复合物和抗鼠CD28抗体吸附在微球表面制备而成。
在本发明的另一方面，还涉及一种载体，其编码有上述黑色素瘤特异性抗原肽。
有益效果
本发明通过调整黑色素瘤特异性抗原肽，有效地提高了抑制黑色素瘤生长的效果，预示着其对于黑色素瘤的治疗能够取得更好的效果。
附图说明
图1是示出以二聚体染色方法来检测用PBS、 H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs诱导后特异性CTL 的频率的统计结果的图。
图2是示出以对空白对照组肿块重量100％为肿瘤负荷时无关肽对照组和实验组的肿块重量占空白对照组肿块重量的百分率的图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1
(1)设备和材料
1.动物
8-10周BALB/c(H-2Kd)雌性鼠和C57BL/6(H-2Kb)雌性鼠购自华中科技大学同济医学院动物饲养中心。
2.细胞株
RMA-S：TAP缺陷的B细胞转化淋巴母细胞系，表面表达空载的 H-2Kb。
B16：C57BL/6(H-2Kb)鼠来源黑色素瘤细胞系。
3.抗原肽
发明人提出对H-2Kb限制性的黑色素瘤特异性抗原肽TRP2中的第180-188位氨基酸残基N-SVYDFFVWL-COOH中的氨基酸序列进行调整。具体而言，发明人在本次实验中使用H-2Kb限制性的黑色素瘤特异性抗原肽TRP2中的第180-188位氨基酸残基中的第182位进行调整，即合成序列为N-SVVDFFVWL-COOH黑色素瘤特异性抗原肽TRP2’以及作为对照的黑色素瘤特异性抗原肽TRP2。此外还合成H-2Kb限制性的肺癌特异性抗原肽Mut1中第52-59位氨基酸残基N-FEQNTAQP-COOH均由上海生工公司合成，纯度大于90％。
4.主要试剂
1)PE标记CD8单克隆抗体和FITC标记羊抗鼠IgG1的抗体购自BD公司，均1：10稀释使用。
2)鼠ELISPOT试剂盒购自U-CyTech biosciences。
3)淋巴细胞分层液购自达科为公司。
4)羊抗鼠抗CD28抗体分子为BD公司产品。
5)二聚体H-2Kb-Ig为BD公司产品。
5.仪器设备
1)CO2细胞培养箱(Heraeus，德国)
2)超净工作台YJ-875(苏州净化设备公司)
3)低速台式大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)
4)高速低温台式离心机(Heracus，德国)
5)-80℃低温冰箱(Nuaire,德国)
6)液氮罐(云南冷冻仪器设备厂)
7)流式细胞仪(FACalibration，美国BD公司)
8)倒置显微镜(日本Nikon)
9)恒温水浴锅(武汉科学仪器厂)
10)振荡摇床(武汉科学仪器厂)
(2)人工抗原递呈细胞H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和 H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs的制备
将肽段TRP2(100ug/ml，作为阳性)和TRP2’(100ug/ml)分别与二聚体H-2Kb-Ig(20ug/ml)混合于37℃孵育过夜即可以制备获得MHC/肽复合物H-2Kb-Ig/pTRP2和H-2Kb-Ig/pTRP2’。将肽段pMut1(100ug/ml)与二聚体H-2Kb-Ig(20ug/ml)混合于37℃孵育过夜即可以制备获得肽/MHC复合物H-2Kb-Ig/pMut1。
把肽/MHC复合物H-2Kb-Ig/pTRP2或肽/MHC复合物 H-2Kb-Ig/pTRP2’分别和抗鼠CD28抗体吸附在微球表面制备成人工抗原呈递细胞H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs。把 MHC/肽复合物H-2Kb-Ig/pMut1和抗鼠CD28抗体吸附在微球表面制备成人工抗原呈递细胞H-2Kb-Ig/pMut1-aAPCs。
实验操作步骤：
1)用PBS洗涤微球并调整浓度为107/ml，加入H-2Kb-Ig/pTRP2 或H-2Kb-Ig/pTRP2’(2ug/ml)分别和抗CD28抗体分子(2ug/ml) 于4℃转动反应1h。
2)离心洗涤后加入0.4ml 1％BSA封闭15min。
3)洗涤后重悬于PBS中，即可获得H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和 H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs。
4)用上述同样的方法可制备人工抗原呈递细胞 H-2Kb-Ig/pMut1-aAPCs用作实验对照。
(3)用人工抗原呈递细胞H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和 H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs分别从BALB/c(H-2Kd)鼠体内诱导肽特异性同种T细胞
把制备好的人工抗原呈递细胞H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和 H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs(5×106/只)分别通过尾静脉输入BALB/c (H-2Kd)鼠体内，每隔6-7天尾静脉输入H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和 H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs进行刺激，共刺激三次。同时，输入PBS于另一组BALB/c鼠作为空白对照组。输入H-2Kb-Ig/pMut1-aAPCs于另一组 BALB/c鼠作为无关肽对照组。
(4)体内黑色素瘤模型实验
以每只皮下输入1.0×105细胞于C57BL/6(H-2Kb)雌性鼠，共免疫 28只。10天后，当肿瘤块生长到16-25mm2大小时，把免疫鼠随机分成 4组，每组7只。对第一组鼠进行黑色素瘤内注射PBS 200μl，对第二组鼠进行黑色素瘤内注射H-2Kb-Ig/pMut1-aAPCs免疫鼠脾脏淋巴细胞悬液200μl(3.0×107/只)，对第三组鼠进行黑色素瘤内注射 H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs免疫鼠脾脏淋巴细胞悬液200μl(3.0×107/只)，对第四组鼠进行黑色素瘤内注射H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs免疫鼠脾脏淋巴细胞悬液200μl(3.0×107/只)。6天后，处死所有处理的C57BL/6雌性鼠，取出黑色素瘤肿块，比较各组肿块重量负荷。
(5)实验结果
依据二聚体特异结合相应肽特异性T细胞的原理，以二聚体染色方法来检测用PBS、H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs 诱导后特异性CTL的频率，统计结果如图1所示。图1所示的柱状图结合频率平均值证实H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs和H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs 都诱导出的特异性T细胞可以特异结合相应的二聚体H-2Kb-Ig/pTRP2。
在体内黑色素瘤模型实验中，用PBS治疗黑色素瘤组作为空白对照组，以H-2Kb-Ig/pMut1-aAPCs诱导的鼠脾脏同种T细胞治疗黑色素瘤组作为无关肽对照组，以H-2Kb-Ig/pTRP2-aAPCs诱导的鼠脾脏同种T 细胞治疗黑色素瘤组作为阳性对照组，以H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs诱导的鼠脾脏同种T细胞治疗黑色素瘤组作为实验组。结果如图2所示，对空白对照组肿块重量以100％为肿瘤负荷，无关肽对照组和实验组的肿块重量占空白对照组肿块重量的百分率作为他们的肿瘤负荷。用SAS软件对结果进行方差分析，可知H-2Kb-Ig/pTRP2’-aAPCs诱导的鼠脾脏同种T 细胞治疗黑色素瘤组的肿块负荷与空白对照组、无关肽对照组和阳性对照组的肿块负荷相比差异显著(P<0.05)，而空白对照组和无关肽对照组的肿块负荷相比差异不显著(P>0.05)。从这结果可知，H-2Kb-Ig/TRP2’-aAPC 诱导的肽pTRP2特异性同种T细胞更能特异抑制黑色素瘤的生长。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 安徽高安生物医学科技有限公司
<120> 黑色素瘤特异性抗原肽、肽复合物以及人工抗原呈递细胞
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Melanomma radicans
<400> 1
Ser Val Val Asp Phe Phe Val Trp Leu
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> carcinoma of the lungs
<400> 2
Phe Glu Gln Asn Thr Ala Gln Pro
1 5

Claims (2)

1.黑色素瘤特异性抗原肽在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，所述的黑色素瘤特异性抗原肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的序列。
2.肽复合物在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用，所述肽复合物由权利要求1所述的黑色素瘤特异性抗原肽与二聚体H-2Kb-Ig混合孵育得到。
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