PT2155682E - Sais de mostarda de isofosforamida e análogos da mesma - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO SAIS DE MOSTARDA DE ISOFOSFORAMIDA E ANÁLOGOS DA MESMA Antecedentes da Invenção

As autópsias de soldados que morreram devido a gás mostarda na Primeira Guerra Mundial indicaram que a mostarda de enxofre tem um efeito desproporcionado nas células que se dividem rapidamente e sugeriram que os compostos de mostarda de enxofre podem ter efeitos antitumorais. Na realidade, investigadores de outros tempos tentaram tratar o cancro através de injeção direta de mostarda de enxofre nos tumores. Esta investigação foi limitada por causa da extrema toxicidade dos compostos de mostarda de enxofre, e os análogos de mostarda de azoto, tal como a mecloretamina, foram investigados como alternativas menos tóxicas.

Devido à falta de seletividade da maioria dos análogos de mecloretamina, os pró-fármacos, tais como os compostos de fosforamida, que podem ser ativados pela elevada concentração de fosforamidatos presente nas células neoplásicas, foram investigados. Dois agentes de alquilação de fosforamida, a ciclofosfamida (CPA) e o composto isomérico Ifosfamida (Ifos), provaram ser particularmente eficazes.

0 documento W02006047575 divulga sais de mostarda de isofosforamida e análogos da mesma como agentes antitumorais. Os métodos e as composições farmacêuticas para a utilização dessas composições no tratamento de distúrbios hiperproliferativos são igualmente divulgados.

Relativamente à Figura 1, a mostarda de isofosforamida (IPM) é um metabolito comum de CPA e Ifos. Parte-se do principio de que IPM é responsável por, pelo menos, uma porção da atividade antitumoral apresentada por CPA e Ifos. Os esforços para utilizar IPM como um agente anticancerigeno diretamente foram mal sucedidos devido, em parte, à instabilidade do composto. A IPM foi sintetizada e as avaliações biológicas preliminares do composto foram realizadas, mas infelizmente a IPM é demasiado instável para ser isolada e utilizada no tratamento humano.

Sumário da Invenção

Em determinadas formas de realização, a invenção refere-se a compostos cristalinos compreendendo um análogo de IPM com uma estrutura da fórmula (I):

em que A+ corresponde ao ácido conjugado de uma amina alifática hidroxilada; e X e Y representam independentemente grupos de partida selecionados a partir de halogéneos, em que o análogo de IPM e a espécie de amónio estão presentes numa relação de 1:1 e o ponto de fusão do composto cristalino é de 103 a 106 °C.

Em determinadas formas de realização, a invenção refere-se a composições farmacêuticas, compreendendo um composto da fórmula (I) e um diluente ou portador farmaceuticamente aceitável. Os métodos de preparação desses compostos e dessas composições são igualmente descritos .

Igualmente aqui divulgados são um liofilizado e um método de produção de um liofilizado compreendendo mostarda de isofosforamida (IP) e/ou um análogo de IPM, um ou mais equivalentes de uma base e um excipiente. Em determinados exemplos, o método compreende o contacto de um sal cristalino de IPM ou um análogo da mesma e de uma amina alifática, tal como tris(hidroximetil) aminometano (Tris), ou de uma mistura de IPM ou um análogo da mesma e de uma ou mais aminas alifáticas (preferencialmente numa relação de cerca de 1:1 de IPM ou análogo da mesma para a amina ou aminas) com água, e é divulgada a liofilização da mistura resultante. Igualmente descrita é a mistura e o liofilizado resultante compreendendo um excipiente, tal como manitol, lactose anidra, sacarose, D ( + )-trealose, dextrano 40 ou povidona (PVP K24), preferencialmente manitol.

Essa formulação inclui liofilizados, preferencialmente compreendendo um excipiente, tal como manitol, lactose anidra, sacarose, D ( + )-trealose, dextrano 40 ou povidona (PVP K24), preferencialmente manitol, e um composto da fórmula:

em que A+ representa uma espécie de amónio selecionada a partir das formas protonadas (ácido conjugado) ou quaternárias de aminas alifáticas e aminas aromáticas, incluindo aminoácidos básicos, aminas heterocíclicas, piridinas substituídas e não substituídas, guanidinas e amidinas; e X e Y representam independentemente grupos de partida.

Igualmente aqui divulgadas são as composições farmacêuticas adaptadas para a administração oral, compreendendo um diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e um composto conforme aqui divulgado.

Em determinadas formas de realização, a invenção refere-se a um composto ou a formulações aqui descritos para o tratamento de distúrbios hiperproliferativos. Em determinadas formas de realização assim, a invenção refere-se ao tratamento de um distúrbio hiperproliferativo selecionado a partir de leucemias, incluindo leucemias agudas (tais como leucemia linfocitica aguda, leucemia mielocitica aguda, leucemia mielógena aguda e leucemia mieloblástica, promielocitica, mielomonocitica, monocitica e eritroleucemia), leucemias crónicas (tais como leucemia mielocitica (granulocitica) crónica, leucemia mielógena crónica e leucemia linfocitica crónica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin (formas indolores e de elevado grau), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, sindrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.

Os exemplos adicionais de condições que podem ser tratadas através da utilização dos compostos e composições divulgados incluem tumores sólidos, tais como sarcomas e carcinomas, incluindo, mas não se limitando a, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, sarcomas resistentes a ciclofosfamida e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, malignidade linfoide, cancro pancreático, cancro da mama, cancros do pulmão, cancro do ovário, cancro da próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma de dueto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cancro do colo do útero, tumor testicular, carcinoma da bexiga e tumores do SNC (tais como glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma).

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 é um esquema que ilustra o metabolismo de ifosfamida, incluindo a produção de acroleina e mostarda de isofosforamida. A Figura 2 ilustra a difração de raios X de pós de IPM·Tris. A Figura 3 ilustra a calorimetria diferencial de varrimento (DSC) de IPM-Tris. A Figura 4 ilustra a análise termogravimétrica (TGA) de IPM*Tris. A Figura 5 ilustra imagens de microscópio eletrónico de varrimento (SEM) de IPM*Tris cristalino. A Figura 6 ilustra uma comparação de IPM-(LIS)2 com IPM-Tris em xenoenxertos de cancro da mama MX-1 humano. A Figura 7 ilustra uma comparação da atividade antitumoral da administração IP (intraperitoneal) e oral de IPM-Tris em xenoenxertos de cancro da mama MX-1 humano. A Figura 8a ilustra a viabilidade de células de rabdomiossarcoma RD e RH30 quando tratadas com IPM- (LIS)2 em várias concentrações. A Figura 8b ilustra a viabilidade de células de sarcoma de Ewing SKES1 e SKPNDW quando tratadas com IPM·(LIS)2 em várias concentrações. A Figura 8c ilustra a viabilidade de células de osteossarcoma OS230, OS229, OS222 e SaOS quando tratadas com IPM· (LIS)2 em várias concentrações. A Figura 8d ilustra a viabilidade de células de sarcoma sinovial Y01 e HgSYII quando tratadas com IPM- (LIS) 2 em várias concentrações. A Figura 9a ilustra a viabilidade de células de rabdomiossarcoma RH30 quando tratadas com IPM-(LIS)2 em várias concentrações, quer uma vez por dia quer três vezes por dia. A Figura 9b ilustra a viabilidade de células de osteossarcoma OS229 quando tratadas com IPM· (LIS)2 em várias concentrações, quer uma vez por dia quer três vezes por dia. A Figura 10 ilustra que a administração na dose máxima tolerada (DMT) na linha celular de osteossarcoma OS31 resistente a ciclofosfamida implantada em fêmeas de ratinhos scid*/* CB17 para cada um dos três planos de dose (controlo, 175 mg/kg diariamente x 1, ou 100 mg/kg diariamente x 3) de IPM- (LIS)2 resulta num atraso significativo do crescimento do tumor. A Figura 11a ilustra resistência à ciclofosfamida nas células de osteossarcoma OS31 implantadas em fêmeas de ratinhos scid*/* CB17 em termos do volume tumoral relativo, em que o tratamento compreende a administração de ciclofosfamida em comparação com o controlo. A Figura 11b ilustra resistência à ciclofosfamida nas células de osteossarcoma OS33 implantadas em fêmeas de ratinhos scid*/* CB17 em termos do volume tumoral relativo, em que o tratamento compreende a administração de IPM· (LIS)2 em comparação com o controlo. A Figura 12 ilustra a atividade de IPM·(LIS)2 em termos de volume tumoral relativo no tratamento de células de osteossarcoma OS31 resistentes a ciclofosfamida implantadas em fêmeas de ratinhos scid*/* CB17 (100 mg/kg diariamente x 3 em comparação com o controlo).

A Figura 13 ilustra a resposta dos tumores mamários SC MX-1 ao tratamento IP e oral com soro fisiológico com uma dose de qld x 5. A Figura 14 ilustra a resposta dos tumores mamários SC MX-1 ao tratamento IP com IPM*Tris, IPM e IPM· (LIS) 2 com uma dose de qld x 5. A Figura 15 ilustra a resposta dos tumores mamários SC MX-1 ao tratamento oral com IPM*Tris, IPM e IPM· (LIS)2 com uma dose de qld x 5. A Figura 16 ilustra a resposta dos tumores mamários SC MX-1 ao tratamento IP e oral com soro fisiológico com uma dose de qld x 5. A Figura 17 ilustra a resposta dos tumores mamários SC MX-1 ao tratamento IP com IPM*Tris, IPM e IPM- (LIS)2 com uma dose de qld x 5. A Figura 18 ilustra a resposta dos tumores mamários SC MX-1 ao tratamento oral com IPM*Tris, IPM e IPM· (LIS)2 com uma dose de qld x 5. A Figura 19 ilustra o efeito de tumores de cancro da mama MX-1 ao tratamento com IPM-Tris em conjunto com doxorrubicina com uma dose de 12 mg/kg/dia de IPM·Tris QlDx5 e 8 mg/kg de doxorrubicina Q4Dx3. A Figura 20 ilustra o efeito na sobrevivência de IPM-Tris em conjunto com doxorrubicina com uma dose de 12 mg/kg/dia de IPM-Tris QlDx5 e 8 mg/kg de doxorrubicina Q4Dx3. A Figura 21 ilustra o efeito nos tumores de cancro da mama MX-1 do tratamento com IPM· Tris em conjunto com doxorrubicina com uma dose e 24 mg/kg/dia de IPM*Tris QlDx5 e 8 mg/kg de doxorrubicina Q4Dx3. A Figura 22 ilustra o efeito na sobrevivência de IPM-Tris em conjunto com doxorrubicina com uma dose de 24 mg/kg/dia de IPM-Tris QlDx5 e 8 mg/kg de doxorrubicina Q4Dx3. A Figura 23 ilustra o efeito nos tumores de cancro da mama MX-1 do tratamento com IPM-Tris em conjunto com doxorrubicina com uma dose de 54 mg/kg/dia de IPM*Tris QlDx5 e 8 mg/kg de doxorrubicina Q4Dx3. A Figura 24 ilustra o efeito na sobrevivência de IPM·Tris em conjunto com doxorrubicina com uma dose de 54 mg/kg/dia de IPM-Tris QlDx5 e 8 mg/kg de doxorrubicina Q4Dx3. A Figura 25 ilustra a toxicidade do regime de combinação IPM·Tris/doxorrubicina. A Figura 26 ilustra o efeito nos tumores de cancro da mama MX-1 do tratamento com IPM-Tris em conjunto com docetaxel com uma dose de 54 mg/kg/dia de IPM-Tris QlDx5 IP e 10 mg/kg de docetaxel Q6Dx3 IV. A Figura 27 ilustra o efeito nos tumores de cancro da mama MX-1 do tratamento com IPM*Tris administrados quer numa dose de 3 6 mg/kg IP quer numa dose de 81 mg/kg PO.

A Figura 28 ilustra o efeito na sobrevivência de IPM-Tris administrado quer numa dose de 36 mg/kg IP quer numa dose de 81 mg/kg PO. A Figura 29 ilustra a farmacocinética de IPM*Tris administrado por via oral e IV nas fêmeas de ratos

Sprague-Dawley. A Figura 30 ilustra a AUC com doses crescentes de IPM«Tris administrado PO (per os - pela boca) ou IV (de forma intravenosa). A Figura 31 ilustra o Cmáx com doses crescentes de IPM«Tris administrado PO ou IV. A Figura 32 ilustra a estabilidade da solução de IPM no tampão com pH 7,0 a uma temperatura de 25 °C. Descrição Detalhada da Invenção I. Sais de IPM e Análogos da Mesma

As composições aqui divulgadas incluem sais cristalinos de IPM ou análogos da mesma. Em determinadas formas de realização, os sais divulgados incluem um ou mais catiões. Em determinadas formas de realização, os catiões podem ser um ácido conjugado de uma base de amina ou podem ser um catião de amónio quaternário.

Em determinadas formas de realização, os compostos cristalinos divulgados compreendem sais de IPM ou um análogo da mesma. Esses compostos incluem compostos cristalinos da fórmula (I):

em que A+ representa uma espécie de amónio selecionada a partir das formas protonadas (ácido conjugado) ou quaternárias de aminas alifáticas hidroxiladas; e X e Y representam independentemente grupos de partida selecionados a partir de halogéneos, em que o análogo de IPM e a espécie de amónio estão presentes numa relação de 1:1 e o ponto de fusão do composto cristalino é de 103 a 106 °C.

Em determinadas formas de realização, X e Y são iguais. Em determinadas dessas formas de realização, X e Y são ambos Cl.

Os exemplos específicos de ácidos conjugados adequados de bases de amina incluem, sem limitação, o ácido conjugado de mono-, bis- ou tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-tert-butilamina, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina e tris(hidroximetil)aminometano (Tris). Em determinadas dessas formas de realização, A+ corresponde ao ácido conjugado de Tris.

Em determinadas formas de realização, a invenção refere-se a um composto compreendendo um sal cristalino de IPM ou análogo da mesma, em que a IPM ou o análogo da mesma e o contraião, preferencialmente Tris, estão presentes numa relação de 1:1. Em determinadas formas de realização, a composição cristalina compreende mais de uma forma polimórfica de cristais, tais como duas, três, quatro ou até cinco formas polimórficas de cristais. Em determinadas dessas formas de realização alternativas, a composição cristalina compreende uma única forma polimórfica de cristais. Em determinadas formas de realização, esses sais são mais estáveis do que a IPM e os análogos de IPM como ácidos livres.

Em determinadas dessas formas de realização, o composto é um sal cristalino com uma relação de 1:1 de IPM e Tris. Em determinadas dessas formas de realização, o ponto de fusão do sólido cristalino encontra-se entre cerca de 103 e cerca de 106 °C, ou até entre 105 e 106 °C.

Em determinadas formas de realização, o composto, p. ex. um sal cristalino com uma relação de 1:1 de IPM e Tris, é pelo menos cerca de 80% puro, pelo menos cerca de 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro ou até pelo menos 99% puro. Em determinadas dessas formas de realização, nem uma única impureza excede 1% em peso. Em determinadas formas de realização, a pureza é medida em relação a todos os outros componentes da composição, enquanto noutras formas de realização (p. ex., em que o composto faz parte de uma composição farmacêutica ou mistura de liofilizados), a pureza pode ser medida em relação a produtos de degradação do composto (p. ex., produtos de degradação que contêm fósforo do composto) ou subprodutos do fabrico do composto (p. ex., produtos de degradação que contêm fósforo do composto), excluindo assim outros componentes adicionados premeditadamente à composição.

Em determinadas formas de realização, os compostos são sais de IPM ou análogos da mesma, em que o sal tem uma meia-vida à temperatura ambiente (por ex., cerca de 23 °C) na presença de água superior a uma meia-vida de IPM (isto é, como o ácido livre) na presença de água nas mesmas condições. Em determinadas dessas formas de realização, um sal de IPM tem uma meia-vida na presença de água que é igual ou superior ao dobro da duração da própria IPM na presença de água, mais preferencialmente igual ou superior a cinco vezes.

Em determinadas formas de realização, os compostos são sais de IPM e análogos da mesma, em que os sais são estáveis à temperatura ambiente na presença de água durante, pelo menos, um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias ou até mesmo uma semana.

Conforme aqui utilizado, o termo "estável" significa que a pureza do sal de IPM ou análogo da mesma após um período de tempo (p. ex., um mês, dois meses, três meses, seis meses, um ano, etc.) é de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou até pelo menos 99% da pureza inicial, o que pode ser determinado, p. ex., através de HPLC utilizando deteção evaporativa de espalhamento de luz (ELSD). Um ensaio desses pode ser efetuado, por exemplo, utilizando uma coluna C18 e um sistema isocrático com uma fase móvel compreendendo 0,005 M de ácido heptafluorobutírico e 0,1% de ácido trifluoroacético em água. São aqui descritos liofilizados compreendendo um composto da fórmula:

em que A+ representa uma espécie de amónio selecionada a partir das formas protonadas (ácido conjugado) ou quaternárias de aminas alifáticas e aminas aromáticas, incluindo aminoácidos básicos, aminas heterocíclicas, piridinas substituídas e não substituídas, guanidinas e amidinas; e X e Y representam independentemente grupos de partida.

Os exemplos específicos de bases de amina adequadas (e respetivos iões de amónio correspondentes) para a utilização nos presentes compostos incluem, sem limitação, piridina, N,N-dimetilaminopiridina, diazabiciclononano, diazabicicloundeceno, N-metil-N-etilamina, dietilamina, trietilamina, diisopropiletilamina, mono-, bis- ou tris- (2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-tert-butilamina, tris(hidroximetil)aminometano, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina, tri-(2-hidroxietil)amina e N-metil-D-glucamina.

Igualmente aqui descritos são os liofilizados que compreendem o composto da fórmula:

Relativamente à fórmula, B pode corresponder, para cada n, a uma molécula básica selecionada independentemente. Numa forma de realização da fórmula, B pode ser selecionado a partir dos aminoácidos básicos, aminas alifáticas aciclicas, aminas de dialquilo e trialquilo, aminas alifáticas heterocíclicas, aminas aromáticas, piridinas substituídas e não substituídas, guanidinas cíclicas e aciclicas, e amidinas cíclicas e aciclicas. Tipicamente, n é de 1 a cerca de 3, de modo a que a fórmula possa incluir moléculas básicas diferentes. Com a referência contínua à fórmula, X e Y correspondem a grupos de partida. Um perito na técnica irá compreender que a estrutura de mostarda de isofosforamida ilustrada inclui um protão ácido e, como tal, existe predominantemente como a respetiva base conjugada no pH fisiológico e na presença de uma base, tal como B. Igualmente, B, sendo um grupo básico, existe predominantemente como o respetivo ácido conjugado no pH fisiológico e na presença de mostarda de isofosforamida e análogos de mostarda de isofosforamida. Os exemplos dos compostos divulgados são representados na Tabela 1.

II. Composições e Métodos

Em determinadas formas de realização, a invenção refere-se à composição farmacêutica que compreende um sal de IPM ou análogo da mesma e um diluente ou excipiente farmacêutico. Em determinadas formas de realização, a composição farmacêutica é uma solução, preferencialmente um soro fisiológico que compreende IPM ou um análogo de IPM. Em determinadas dessas formas de realização, a concentração do sal de IPM ou sal de análogo de IPM na solução é de cerca de 3 mg/mL a cerca de 30 mg/mL ou até superior. Esses soros fisiológicos podem ser preparados, por exemplo, dissolvendo um composto cristalino da fórmula (1) ou um liofilizado de IPM ou um análogo de IPM conforme aqui divulgado num soro fisiológico, p. ex., durante a agitação à temperatura ambiente. Em determinadas dessas formas de realização, o soro fisiológico é preparado de modo a que a concentração de cloreto de sódio seja de cerca de 0,5%, 0,9%, 2,5%, 2,7%, 3,0%, 4,0% ou até 5,0%.

Em determinadas formas de realização, uma solução aquosa pode ser preparada a partir de um composto cristalino da fórmula I ou um liofilizado de IPM ou um análogo de IPM conforme aqui divulgado. Uma solução aquosa assim (p. ex., em água ou num soro fisiológico isotónico) é estável à temperatura ambiente durante, pelo menos, cerca de 60 minutos, 80 minutos, 100 minutos, 120 minutos, 140 minutos ou até cerca de 160 minutos à temperatura ambiente.

Em determinadas formas de realização, um composto cristalino da fórmula (I), tal como um sal de IPM e Tris, tem uma solubilidade em água de, pelo menos, cerca de 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL ou até mesmo 80 mg/mL. Em determinadas formas de realização, um composto cristalino da fórmula (I), tal como um sal de IPM e Tris, tem uma solubilidade em água de, pelo menos, cerca de 200 mg/mL, pelo menos cerca de 500 mg/mL, pelo menos cerca de 800 mg/mL, pelo menos cerca de 1000 mg/mL, pelo menos cerca de 1200 mg/mL ou até mesmo pelo menos de 1400 mg/mL. Em determinadas formas de realização, o pH de uma solução do composto cristalino em água corresponde a um valor entre cerca de 4,5 e cerca de 10, tal como entre cerca de 5,0 e 8,5, preferencialmente entre cerca de 5,0 e cerca de 7,0. Em determinadas formas de realização, o pH de uma solução assim é de cerca de 5,0.

Em determinadas formas de realização, a invenção refere-se a um kit compreendendo um composto cristalino da fórmula I e um soro fisiológico.

Os liofilizados aqui divulgados incluem IPM e análogos de IPM que são formulados com um ou mais equivalentes de uma base. Uma vez que a IPM e respetivos análogos são de ácido lábil e ácidos, os liofilizados presentemente divulgados oferecem uma maior estabilidade, bem como outras vantagens. As vantagens das formulações divulgadas em termos de síntese, estabilidade e biodisponibilidade serão evidentes para os peritos na técnica na consideração da presente divulgação. As vantagens adicionais da IPM e dos análogos de IPM que são formulados com um ou mais equivalentes de uma base podem incluir maior solubilidade em água ou fluidos corporais.

Em determinados exemplos, os liofilizados divulgados são sais de mostarda de isof osf oramida ou análogos de mostarda de isofosforamida incluindo um ou mais catiões. Em determinados exemplos, os catiões podem ser um ácido conjugado de uma base de amina ou podem ser um catião de amónio quaternário. Os contraiões adequados para mostarda de isofosforamida e respetivos análogos incluem os ácidos conjugados (conforme aqui utilizado, os termos que se referem a aminas devem ser compreendidos como incluindo os respetivos ácidos conjugados, a menos que o contexto indique claramente que é pretendida a amina livre) de bases que incluem aminoácidos básicos, aminas alifáticas, aminas heterocíclicas, aminas aromáticas, piridinas, guanidinas e amidinas. Das aminas alifáticas, as aminas alifáticas acíclicas e as aminas de dialquilo e trialquilo cíclicas e acíclicas são particularmente adequadas para a utilização nos compostos divulgados. Além disso, os contraiões de amónio quaternários são exemplos de contraiões adequados que podem ser utilizados. Em determinados exemplos, um liofilizado assim pode ainda compreender um excipiente. Os excipientes adequados incluem, mas não se limitam a, manitol, lactose anidra, sacarose, D ( + )-trealose, dextrano 40 e povidona (PVP K24).

Em determinadas formas de realização, os compostos e as composições, tais como os liofilizados aqui divulgados, são estáveis à temperatura ambiente durante, pelo menos, duas semanas, pelo menos três meses, pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses ou até mesmo pelo menos seis meses. Em determinadas formas de realização, os sais são estáveis a temperaturas mais baixas (p. ex., 0 °C, 2 °C, 4 °C, 6 °C, etc.) durante pelo menos duas semanas, pelo menos três semanas, pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos três meses ou até mesmo pelo menos seis meses. Em determinadas formas de realização, os compostos e as composições, tais como os liofilizados, são estáveis durante pelo menos um mês, pelo menos dois meses, pelo menos quatro meses ou até mesmo pelo menos seis meses numa temperatura mais baixa (p. ex., entre cerca de 0 °C e cerca de 20 °C, entre cerca de 0 °C e cerca de 10 °C ou até mesmo entre cerca de 2 °C e cerca de 8 °C). Em determinados exemplos, o liofilizado compreende um sal de IPM ou um análogo da mesma. Em determinados exemplos, o liofilizado compreende IPM-Tris ou IPM(LIS)2, preferencialmente IPM-Tris, e em exemplos particularmente preferidos, essas composições compreendem ainda um agente de volume, tal como manitol.

Numa outra forma de realização, os sais descritos acima podem incluir um segundo grupo amina ou amónio. Num exemplo, os liofilizados aqui divulgados incluem mais de um equivalente de uma amina para cada equivalente de mostarda de isofosforamida ou análogo de mostarda de isofosforamida. Esses exemplos incluem os que têm relações sem ser de número inteiro de amina para mostarda de isofosforamida ou análogos de mostarda de isofosforamida. Em determinados exemplos, os liofilizados têm uma relação de dois para um ou de três para um de amina para mostarda de isofosforamida ou um análogo de mostarda de isofosforamida. Nas formas de realização de trabalho, foram produzidos sais que contêm dois equivalentes de base de amina por equivalente de mostarda de isofosforamida. Em determinadas formas de realização, uma base de amina utilizada para formar mostarda de isofosforamida e sais de análogos de mostarda de isofosforamida inclui mais de um grupo amino; essas bases podem ser designadas por "multibásicas". Mais especificamente, determinados exemplos de bases multibásicas que podem ser utilizadas têm dois grupos amino; esses compostos podem ser referidos como "dibásicos". Por exemplo, uma molécula dibásica adequada é N, JV-dimetilaminopiridina, que inclui dois grupos amino básicos. Determinados exemplos de um liofilizado aqui divulgados incluem mostarda de isofosforamida ou um análogo de mostarda de isofosforamida e um equivalente de uma amina dibásica.

Determinados liofilizados de mostarda de isofosforamida e de análogo de mostarda de isofosforamida aqui divulgados incluem dois grupos de partida. Sem limitação à teoria, parte-se do princípio de que os dois grupos de partida são substituídos in vivo por nucleófilos biomoleculares, tais como ácidos nucleicos e proteínas, reticulando assim as biomoléculas. 0 termo "grupo de partida" refere-se a um grupo que pode ser substituído por um nucleófilo. Relativamente aos compostos presentemente divulgados, o grupo de partida refere-se a um grupo que pode ser substituído para formar um intermediário de aziridina, ou pode ser substituído diretamente por um nucleófilo biomolecular, tal como um nucleófilo de ácido nucleico, para formar, por exemplo, uma espécie de guanidina 7-alquilada. Os exemplos de grupos de partida adequados incluem os halogéneos e os sulfonatos (-S02R) . Numa forma de realização dos sais de análogo de isofosforamida divulgados, o composto é um composto de grupo de partida "misturado", incluindo dois tipos diferentes de grupos de partida, por exemplo um halogéneo e um sulfonato ou dois halogéneos diferentes, tais como um brometo e um cloreto. A Patente U.S. n.° 6.197.760 de Struck ensina métodos para criar esses compostos de grupo de partida misturados.

Em determinados exemplos, os liofilizados de sais divulgados melhoram a estabilidade de reconstituição em comparação com uma preparação liofilizada da própria mostarda de isofosforamida. Em determinados desses exemplos, um liofilizado preparado a partir dos sais divulgados de IPM ou um análogo da mesma e um excipiente, tal como a partir de IPM ou um análogo da mesma e Tris, incluindo opcionalmente um excipiente, p. ex., um agente de volume, tal como manitol, que foi reconstituído num soro fisiológico (preferencialmente 5% de cloreto de sódio) mantém uma potência > 90% durante pelo menos cerca de 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 120 minutos, 140 minutos ou até mesmo pelo menos cerca de 160 minutos.

Em determinadas formas de realização, a dissolução de um sal de IPM ou um análogo da mesma, tal como IPM-Tris, ou um liofilizado preparado a partir de um sal de IPM ou um análogo da mesma, tal como IPM-Tris, e um excipiente opcional, p. ex., um agente de volume, tal como manitol, num soro fisiológico mantém uma pureza de pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou até mesmo pelo menos 99% durante pelo menos cerca de 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 3 horas ou até mesmo 4,5 horas ou mais à temperatura ambiente. Em determinadas formas de realização, essas soluções reconstituídas são mais estáveis do que as soluções de IPM· (LIS)2 reconstituídas em condições idênticas. Em determinadas dessas formas de realização, a IPM- (LIS)2 que foi reconstituída degrada-se pelo menos 1,25 vezes mais depressa, pelo menos 1,5 vezes mais depressa, pelo menos duas vezes mais depressa ou até mesmo pelo menos três ou quatro vezes mais depressa do que o sal de IPM ou análogo da mesma.

Em determinados exemplos em que o liofilizado compreende um sal de IPM ou um análogo da mesma e um excipiente, tal como um liofilizado compreendendo IPM ou um análogo da mesma, Tris e manitol, a mistura tem uma solubilidade em água de pelo menos cerca de 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL ou até mesmo 80 mg/mL.

Em determinados exemplos, os liofilizados de sais divulgados de IPM ou um análogo da mesma são mais estáveis do que uma preparação liofilizada da própria mostarda de isofosforamida, isto é, como o ácido livre. Em determinados desses exemplos preferidos, o liofilizado dos sais divulgados tem um tempo de armazenamento mais longo do que uma preparação liofilizada da própria mostarda de isofosforamida, preferencialmente pelo menos duas vezes mais longo, mais preferencialmente pelo menos cinco vezes mais longo. Em determinados exemplos, o liofilizado é formado a partir do sal Tris de IPM, que pode ou não ser cristalino antes da dissolução.

Conforme descrito acima, em determinados exemplos, esses liofilizados compreendem ainda um excipiente, p. ex., um agente de volume, preferencialmente manitol. Em determinados exemplos, o liofilizado compreende um agente de volume selecionado a partir de manitol, lactose anidra, sacarose, D ( + )-trealose, dextrano 40 e povidona (PVP K24), preferencialmente manitol. Em determinados exemplos, a adição de um agente de volume assim pode melhorar a estabilidade do liofilizado em relação à formulação de liofilizado na ausência do agente de volume. Em determinados desses exemplos, um liofilizado assim é estável a uma temperatura de cerca de -70 °C, de cerca de -20 °C ou até mesmo de cerca de 5 °C, p. ex., durante um período de um mês, dois meses, três meses, seis meses, nove meses, um ano ou até mesmo dois anos ou mais.

Em determinados desses exemplos em que o liofilizado compreende um agente de volume, tal como manitol, o liofilizado compreende cerca de 1% a cerca de 10%, ou cerca de 1% a cerca de 5% (p/v) de agente de volume, p. ex., manitol. Antes da liofilização ou na reconstituição, essas composições podem compreender cerca de 15 mg/mL a cerca de 25 mg/mL de IPM, e/ou uma amina, tal como Tris, numa concentração de cerca de 0,5 a cerca de 1,5 M, preferencialmente numa quantidade aproximadamente equimolar em relação à IPM. Em determinados exemplos, ao preparar a solução antes da liofilização, em vez de adicionar IPM e amina, tal como Tris, como componentes separados, as mesmas são adicionadas em conjunto na forma de um sal de IPM-Tris cristalino conforme aqui divulgado.

Em determinados exemplos, a invenção refere-se a um kit compreendendo um liofilizado conforme aqui divulgado e um soro fisiológico.

Os compostos aqui divulgados podem ser administrados de forma oral, tópica, transdérmica, parentérica, via inalação ou pulverização e podem ser administrados em formulações de unidade de dosagem que contêm portadores, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos convencionais.

Em determinadas formas de realização, é preferida a administração parentérica dos sais divulgados de IPM e análogos da mesma através de injeção. Em determinadas formas de realização, é preferida a administração oral dos sais divulgados de IPM e análogos da mesma. Em determinadas formas de realização, os sais de IPM e análogos da mesma administrados oralmente (PO) apresentam parâmetros de farmacocinética (PK) semelhantes aos observados com a administração intravenosa (IV). Os agentes podem ser fornecidos numa única dosagem ou cronicamente, dependendo da doença específica, da condição do paciente, da toxicidade do composto e de outros fatores, tal como será reconhecido por um perito na técnica. A quantidade terapeuticamente eficaz do composto ou compostos administrados pode variar dependendo dos efeitos desejados e dos fatores indicados acima.

As composições farmacêuticas para a administração num indivíduo podem incluir portadores, espessantes, diluentes, tampões, conservantes, agentes tensioativos e afins, além da molécula escolhida. As composições farmacêuticas também podem incluir um ou mais ingredientes ativos adicionais, tais como agentes antimicrobianos, agentes anti-inflamatórios, anestésicos e afins. As formulações farmacêuticas podem incluir componentes adicionais, tais como portadores. Os portadores farmaceuticamente aceitáveis úteis para estas formulações são convencionais. "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 21a Edição (2006), descreve as composições e formulações adequadas para a ministração farmacêutica dos compostos aqui divulgados.

Em geral, a natureza do portador dependerá do modo especifico de administração utilizado. Por exemplo, as formulações parentéricas contêm habitualmente fluidos injetáveis que incluem fluidos aceitáveis de forma farmacêutica e fisiológica, tais como água, soro fisiológico, soluções de sal equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou afins, como um veiculo. Relativamente às composições sólidas (por exemplo, formas em pó, comprimido, pastilha ou cápsula), os portadores sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, categorias farmacêuticas de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além dos portadores biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter menores quantidades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes de humedecimento ou de emulsão, conservantes e agentes de tamponamento de pH e afins, por exemplo acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

Em determinadas formas de realização, um composto divulgado é formulado como uma forma de dosagem oral, tal como um comprimido, uma pastilha ou uma cápsula. Em determinadas formas de realização, a forma de dosagem oral é uma cápsula.

Em determinadas formas de realização, essas formas de dosagem oral compreendem, pelo menos, um excipiente, deslizante, diluente, lubrificante e/ou desintegrante. Em determinadas dessas formas de realização, os excipientes, deslizantes, diluentes, lubrificantes e/ou desintegrantes adequados incluem, mas não se limitam a, talco, dióxido de silicone de fumo, amido, silicato de cálcio, carbonato de magnésio, óxido de magnésio, laurilsulfato de magnésio, laurilsulfato de sódio, lactose, celulose microcristalina, hidroxipropilmetilcelulose, dextrose, glicose, sacarose, amido, derivados de amido, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio dibásico, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, estearato de cálcio, fumarato de estearilo de sódio, polietilenoglicol 4000, polietilenoglicol 6000, benzoato de sódio, óleo mineral leve, óleos vegetais hidrogenados, ácido esteárico, behenato de glicerilo, resinas insolúveis de permuta iónica, glicolato de amido de sódio, carboximetilcelulose de sódio (sódio de croscarmelose), gomas (p. ex., ágar, guar, xantana), ácido alginico, alginato de sódio e crospovidona.

Em determinadas dessas formas de realização, a forma de dosagem oral compreende um composto conforme aqui divulgado e, pelo menos, um excipiente, deslizante, diluente, lubrificante e/ou desintegrante; preferencialmente pelo menos um excipiente, deslizante, diluente, lubrificante e/ou desintegrante que seja adequado para a formulação com um agente ativo higroscópico. Em determinadas dessas formas de realização, a forma de dosagem oral compreende, pelo menos, um excipiente, deslizante, diluente, lubrificante e/ou desintegrante selecionado a partir de celulose microcristalina, lactose, carboximetilcelulose de sódio, estearato de magnésio, fosfato de cálcio dibásico, glicolato de amido de sódio, hidroxipropilmetilcelulose e manitol.

Em determinadas formas de realização, um composto divulgado é formulado para a administração num ser humano. Num aspeto desta forma de realização, a composição farmacêutica inclui entre cerca de 0,1 mg/mL e cerca de 250 mg/mL, tal como entre cerca de 20 e cerca de 100 mg/mL do composto de um sal de IPM ou análogo da mesma.

Num aspeto, determinadas formas de realização de composições farmacêuticas são formuladas em formas de dosagem unitária. Por exemplo, essas formas de dosagem unitária podem conter de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg ou de 100 mg a cerca de 1500 mg, tal como de cerca de 5 mg a cerca 200 mg ou de 200 mg a cerca de 1500 mg de um sal divulgado de IPM ou análogo da mesma por unidade de dosagem. Em determinadas formas de realização, uma unidade de dosagem pode compreender cerca de 15 mg, cerca de 30 mg, cerca de 45 mg, cerca de 60 mg, cerca de 75 mg ou até mesmo cerca de 77 mg de um sal divulgado de IPM ou análogo da mesma. É especificamente contemplado em algumas formas de realização que os presentes compostos são ministrados através de um depósito de fármaco injetado e/ou implantado, por exemplo compreendendo lipossomas multivesiculares, tal como em DepoFoam (SkyePharma, Inc, San Diego, CA) (consulte, por exemplo, Chamberlain et ai. Arch. Neuro. 1993, 50, 261 a 264; Katri et al. J. Pharm. Sei. 1998, 87, 1341 a 1346; Ye et al. , J. Control Release 2000, 64, 155 a 166; e Howell, Cancer J. 2001, 7, 219 a 227) .

Os métodos são aqui divulgados para o tratamento de condições caracterizadas por neoplasia ou atividade proliferativa anormal ou patológica através da administração num indivíduo de um ou mais dos compostos e composições divulgados.

As condições que podem ser tratadas de acordo com o método divulgado incluem as caracterizadas pelo crescimento e/ou a diferenciação de células anormal, tais como cancros e condições neoplásicas. Os exemplos típicos de distúrbios proliferativos que podem ser tratados através da utilização dos compostos e composições divulgados são indicados abaixo.

Os exemplos de tumores hematológicos que podem ser tratados através da utilização dos compostos e composições aqui divulgados incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (tais como leucemia linfocitica aguda, leucemia mielocitica aguda, leucemia mielógena aguda e leucemia mieloblástica, promielocitica, mielomonocitica, monocitica e eritroleucemia), leucemias crónicas (tais como leucemia mielocitica (granulocitica) crónica, leucemia mielógena crónica e leucemia linfocitica crónica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin (formas indolores e de elevado grau), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, sindrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.

Os exemplos adicionais de condições que podem ser tratadas através da utilização dos compostos e composições divulgados incluem tumores sólidos, tais como sarcomas e carcinomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, sarcomas resistentes a ciclofosfamida (CPA) e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, malignidade linfoide, cancro pancreático, cancro da mama, cancros do pulmão, cancro do ovário, cancro da próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma de dueto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cancro do colo do útero, tumor testicular, carcinoma da bexiga e tumores do SNC (tais como glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma).

Em determinadas formas de realização, os compostos aqui divulgados são superiores a CPA ou Ifos sozinhas contra o crescimento do tumor resistente a CPA e/ou Ifos. Por conseguinte, um aspeto de um método aqui divulgado inclui o tratamento de um indivíduo que tem uma condição neoplásica resistente a CPA e/ou Ifos com um sal de IPM ou análogo da mesma aqui divulgado.

Em algumas formas de realização, os compostos aqui divulgados apresentam uma toxicidade reduzida em comparação com CPA e/ou Ifos. Por exemplo, doses elevadas de CPA e/ou Ifos podem resultar em maiores toxicidades do rim, da bexiga e/ou do sistema nervoso central devido à presença de determinados metabolitos, tais como cloroacetaldeído e acroleína. Em algumas formas de realização, os presentes compostos reduzem ou evitam a produção destes ou outros metabolitos tóxicos enquanto mantêm a eficácia. Os presentes compostos são assim capazes de fornecer um tratamento terapêutico enquanto reduzem efeitos secundários deletérios, tal como a morte normal de células do rim, da bexiga ou do sistema nervoso central, que possam estar associados a metabolitos de CPA e/ou Ifos. Em conformidade, os presentes compostos são úteis como substitutos de CPA e/ou Ifos.

Por exemplo, os presentes compostos são úteis na preparação de pacientes para transplantes de células sanguíneas e medula óssea. A CPA e a Ifos são muitas vezes utilizadas nos transplantes de células sanguíneas e medula óssea, e os presentes compostos representam uma alternativa vantajosa, por exemplo, devido ao reduzido perfil de toxicidade e/ou à maior potência dos presentes compostos. Adicionalmente, os presentes compostos também podem ser utilizados nos transplantes de células sanguíneas e medula óssea em que a CPA e a Ifos são inapropriadas, por exemplo, em que doses elevadas de CPA e Ifos mostram ser demasiado tóxicas. Os presentes compostos podem ser administrados minutos, horas, dias, semanas ou meses antes do transplante, particularmente dias ou semanas antes do transplante. Além disso, os presentes compostos podem ser administrados em formas de dosagem únicas, múltiplas e/ou de repetição e/ou com a colaboração de outros agentes na preparação do transplante de células sanguíneas e medula óssea.

Em determinadas formas de realização, os presentes compostos são úteis na determinação de regimes para transplantes de células sanguíneas e medula óssea, por exemplo, como substitutos de CPA e/ou Ifos. Além disso, os presentes compostos podem ser administrados sem utilizar medidas de proteção, tais como mesna e/ou hidratação intravenosa, que são muitas vezes utilizadas com a colaboração de CPA e Ifos.

Noutra forma de realização, os presentes compostos podem ser utilizados em conjunto com CPA e/ou Ifos, por exemplo, na preparação de pacientes para transplantes de células sanguíneas e medula óssea e na determinação de regimes para transplantes de células sanguíneas e medula óssea. As composições que compreendem um ou mais dos presentes compostos em conjunto com CPA e/ou Ifos oferecem benefícios adicionais, tais como toxicidade reduzida e/ou maior potência, em comparação com CPA e/ou Ifos sozinhas.

Em determinadas formas de realização do método, é administrado a um indivíduo cerca de 0,2 mg/kg/dia a cerca de 20 mg/kg/dia de um sal divulgado de IPM ou análogo da mesma. Por exemplo, é possível administrar a um indivíduo cerca de 0,5 a cerca de 10 mg/kg/dia, tal como cerca de 1 a cerca de 7,5 mg/kg/dia, de um composto divulgado.

Em determinadas formas de realização, a IPM, um análogo ou um sal da mesma é administrado a um indivíduo numa dose (p. ex., dose diária) superior a cerca de 1,0 g, superior a cerca de 1,5 g, superior a cerca de 2,0 g ou até mesmo superior a cerca de 2,5 g. Em determinadas formas de realização, o sal de IPM é IPM-Tris, p. ex., até cerca de 2,0 g, 2,5 g ou até mesmo 3,0 g.

Em determinadas formas de realização, a IPM ou um análogo da mesma é administrado a um indivíduo como um sal, de modo a que a dose (p. ex., dose diária) de IPM ou o análogo da mesma (isto é, considerando apenas o anião de IPM do sal e descontando o peso do contraião ou outros componentes da composição) seja superior a cerca de 0,4 g, superior a cerca de 0,6 g, superior a cerca de 0,8 g ou até mesmo superior a cerca de 1,0 g. Em determinadas formas de realização, a IPM é administrada numa composição conforme aqui divulgado numa dose superior a cerca de 0,4 g, superior a cerca de 0,6 g, superior a cerca de 0,8 g ou até mesmo superior a cerca de 1,0 g, p. ex., até cerca de 2,0 g, 2,5 g ou até mesmo 3,0 g.

Em determinadas formas de realização, um curso de um sal de IPM ou análogo da mesma pode compreender uma quantidade total de IPM ou análogo do mesmo (isto é, considerando apenas o anião de IPM do sal e descontando o peso do contraião ou outros componentes da composição) que seja superior a cerca de 0,8 g, superior a cerca de 1,0 g, superior a cerca de 1,5 g ou até mesmo superior a cerca de 2,0 g.

Em determinadas formas de realização, uma dose de sal de IPM ou análogo da mesma pode ser administrada desde uma vez por semana, três vezes por semana, cinco vezes por semana, uma vez por dia ou até mesmo duas vezes por dia, preferencialmente uma vez por dia. Em determinadas dessas formas de realização, pode ser administrado um curso de um sal de IPM ou análogo da mesma, em que um curso corresponde a duas ou mais doses consecutivas. Em determinadas formas de realização, um curso de tratamento pode compreender a administração de uma dose de um sal de IPM ou análogo da mesma uma vez por dia durante dois, três, quatro ou até mesmo cinco dias, preferencialmente três dias. Essas doses podem ser em dias consecutivos ou não consecutivos.

Em determinadas formas de realização, uma única dose (p. ex., uma dose diária) pode compreender mais de uma forma de dosagem, p. ex., uma única dose pode compreender duas ou mais cápsulas, pastilhas ou comprimidos. Em determinadas formas de realização, uma dose diária compreendendo múltiplas formas de dosagem pode ser administrada toda de uma vez, ou podem ser administrados subconjuntos das formas de dosagem em intervalos durante todo o dia.

Noutra forma de realização do método, é administrada a um indivíduo uma dose (p. ex., uma dose diária) de cerca de 1 a cerca de 1500 mg/m2, tal como de cerca de 1 a cerca de 700 mg/m2, de cerca de 5 a cerca de 1000 mg/m2, de cerca de 5 a cerca de 700 mg/m2, de cerca de 5 a cerca de 500 mg/m2, de cerca de 600 a cerca de 1200 mg/m2; de cerca de 100 a cerca de 1500 mg/m2, de cerca de 30 a cerca de 600 mg/m2, de cerca de 10 a cerca de 600 mg/m2 ou de cerca de 10 a cerca de 100 mg/m2 de um sal de IPM ou análogo da mesma conforme agui divulgado. Por exemplo, de cerca de 10 mg/m2, de cerca de 12 ou até mesmo de 14 mg/m2.

Em determinadas formas de realização do método para o tratamento de distúrbios hiperproliferativos agui divulgados, é administrado um composto divulgado a um indivíduo num plano de dosagem diária múltipla. Nessas formas de realização, o composto é administrado em, pelo menos, dois dias e, no máximo, em cinco dias diferentes. Num aspeto de planos de dosagem diária múltipla, o composto é administrado ao indivíduo em dias consecutivos, tal como de dois a cinco dias consecutivos. Em alternativa, o composto é administrado ao indivíduo em dias não consecutivos, tal como dia sim, dia não.

Em determinadas formas de realização do método, um ou mais agentes terapêuticos adicionais são administrados a um indivíduo além dos compostos e composições presentemente divulgados. Por exemplo, os agentes terapêuticos adicionais gue podem ser utilizados incluem agentes de ligação de microtúbulos, intercaladores ou reticuladores de ADN, inibidores de síntese de ADN, inibidores de transcrição de ADN e/ou ARN, anticorpos, enzimas, inibidores de enzima, reguladores de genes e/ou inibidores de angiogénese.

Agente de ligação de microtúbulos refere-se a um agente que interage com tubulina para estabilizar ou desestabilizar a formação de microtúbulos, inibindo assim a divisão celular. Os exemplos de agentes de ligação de microtúbulos que podem ser utilizados em conjunto com IPM, um análogo ou um sal da mesma incluem, sem limitação, paclitaxel, docetaxel, vimblastina, vindesina, vinorelbina (navelbine), as epotilonas, colquicina, dolastatina 15, nocodazole, podofilotoxina e rizoxina. Os análogos e derivados desses compostos também podem ser utilizados e serão conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, as epotilonas e os análogos de epotilona adequados para a incorporação nos presentes compostos são descritos na Publicação Internacional n.° WO 2004/018478. Atualmente, parte-se do princípio de que os taxoides, tais como paclitaxel e docetaxel, são particularmente úteis como agentes terapêuticos nos compostos presentemente divulgados. Os exemplos de taxoides úteis adicionais, incluindo análogos de paclitaxel, são explicados pelas Patentes U.S. n.°s 6.610.860 de Holton, 5.530.020 de Gurram et al. e 5.912.264 de Wittman et al.

Os reguladores de transcrição de ADN e/ou ARN adequados, incluindo, sem limitação, actinomicina D, daunorubicina, doxorrubicina e derivados e análogos dos mesmos, também são adequados para a utilização em conjunto com os compostos presentemente divulgados.

Os intercaladores de ADN e os agentes de reticulação que podem ser incorporados nos compostos divulgados incluem, sem limitação, cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, mitomicinas, tais como mitomicina C, bleomicina, clorambucila, ciclofosfamida e derivados e análogos dos mesmos.

Os inibidores de síntese de ADN adequados para a utilização com agentes terapêuticos incluem, sem limitação, metotrexato, 5-fluoro-5'-desoxiuridina, 5-fluorouracilo e análogos dos mesmos.

Os exemplos de inibidores de enzima adequados para a utilização em conjunto com os compostos presentemente divulgados incluem, sem limitação, camptotecina, etoposido, formestano, tricostatina e derivados e análogos dos mesmos. A terapêutica adequada para a utilização com os compostos presentemente divulgados que afetam a regulação de genes incluem agentes que resultam numa maior ou menor expressão de um ou mais genes, tais como, sem limitação, raloxifeno, 5-azacitidina, 5-aza-2'-desoxicitidina, tamoxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, mifepristona e derivados e análogos dos mesmos.

Os inibidores de angiogénese são conhecidos na técnica e os exemplos de inibidores de angiogénese adequados incluem, sem limitação, angiostatina Kl-3, estaurosporina, genisteina, fumagilina, medroxiprogesterona, suramina, interferão-alfa, inibidores de metaloproteinase, fator 4 plaquetário, somatostatina, trombospondina, endostatina, talidomida e derivados e análogos dos mesmos.

Outros agentes terapêuticos, particularmente agentes antitumorais, que podem ou não inserir-se numa ou mais das classificações acima, também são adequados para a administração em conjunto com os compostos presentemente divulgados. Por exemplo, esses agentes incluem adriamicina, apigenina, rapamicina, zebularina, cimetidina e derivados e análogos dos mesmos.

Em determinadas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado em conjunto com um regulador de transcrição de ADN e/ou ARN, tal como doxorrubicina. Em determinadas formas de realização alternativas, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado em conjunto com um agente de ligação de microtúbulos, tal como docetaxel ou paclitaxel.

Em determinadas formas de realização, as combinações conforme aqui descrito podem ser de natureza sinérgica, o que significa que o efeito terapêutico da combinação do sal de IPM ou análogo da mesma e dos outros agentes terapêuticos é superior à soma dos efeitos individuais quando os dois ou mais agentes são administrados separadamente na mesma quantidade.

Em determinadas dessas formas de realização, um efeito sinérgico assim pode permitir a administração de doses subterapêut icas do sal de IPM ou análogo da mesma. Em determinadas dessas formas de realização, a administração de uma dose subterapêutica pode reduzir ou evitar um efeito secundário associado a doses mais elevadas do sal de IPM ou análogo da mesma, p. ex., os métodos da presente invenção podem ser vantajosos em comparação com as terapias de combinação existentes ao permitirem que os agentes anticancerígenos convencionais exerçam um efeito superior numa dosagem mais pequena.

Em determinadas formas de realização, a eficácia do agente adicional é melhorada quando este é administrado em conjunto com um sal de IPM ou análogo da mesma. Em determinadas dessas formas de realização, o agente adicional é quimioterapêutico, incluindo, mas não se limitando a, agentes de ligação de microtúbulos, intercaladores ou reticuladores de ADN, inibidores de síntese de ADN, inibidores de transcrição de ADN e/ou ARN, anticorpos, enzimas, inibidores de enzima, reguladores de genes e/ou inibidores de angiogénese. Em determinadas dessas formas de realização, a eficácia de um agente de ligação de microtúbulos, tal como um docetaxel ou paclitaxel, é melhorada quando este é administrado em conjunto com um sal de IPM ou análogo da mesma. Em determinadas dessas formas de realização alternativas, a eficácia de um inibidor de transcrição de ADN e/ou ARN, tal como doxorrubicina, é melhorada quando este é administrado em conjunto com um sal de IPM ou análogo da mesma. Em determinadas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é IPM*Tris.

Conforme aqui utilizado, o termo "dose subterapêutica" inclui uma dose que pode estabilizar ou reduzir o volume tumoral, mas que não será considerada um tratamento eficaz nessa dose, ou até mesmo uma dose que sozinha não fornece nenhum efeito terapêutico mensurável.

Em determinadas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado numa dose de cerca de 100 mg a cerca de 500 mg, de cerca de 150 mg a cerca de 400 mg ou até mesmo de cerca de 175 mg a cerca 300 mg. Em determinadas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado numa dose de cerca de 150 mg, de cerca de 175 mg, de cerca de 185 mg, de cerca de 190 mg, de cerca de 200 mg, de cerca de 225 mg, de cerca de 250 mg, de cerca de 275 mg, de cerca de 285 mg, de cerca de 290 ou até mesmo de cerca de 300 mg. Em determinadas dessas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma que é administrado nessas doses é administrado oralmente.

Em determinadas dessas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado em conjunto com doxorrubicina numa dose de cerca de 100 mg a cerca de 200 mg, de cerca de 110 mg a cerca de 180 mg ou até mesmo de cerca de 115 a cerca de 150 mg. Em determinadas dessas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado em conjunto com doxorrubicina numa dose de cerca de 100 mg, de cerca de 110 mg, de cerca de 115 mg, de cerca de 125 mg, de cerca de 135 mg, de cerca de 140 mg, de cerca de 145 mg, de cerca de 155 mg, de cerca de 165 mg, de cerca de 175 mg, de cerca de 185 mg ou até mesmo de cerca de 200 mg.

Em determinadas dessas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado em conjunto com docetaxel numa dose de cerca de 50 mg a cerca de 200 g, de cerca de 75 mg a cerca de 195 mg ou até mesmo de cerca de 80 a cerca de 190 mg. Em determinadas dessas formas de realização, o sal de IPM ou análogo da mesma é administrado em conjunto com docetaxel numa dose de cerca de 50 mg, de cerca de 70 mg, de cerca de 80 mg, de cerca de 90 mg, de cerca de 95 mg, de cerca de 100 mg, de cerca de 110 mg, de cerca de 120 mg, de cerca de 130, de cerca de 140 mg, de cerca de 150 mg, de cerca de 160 mg, de cerca de 170 mg, de cerca de 180 mg, de cerca de 190 mg ou até mesmo de cerca de 200 mg. III. Definições

As seguintes explicações de termos e os exemplos são fornecidos para descrever melhor os presentes compostos, composições e métodos, e para orientar os peritos na técnica na prática da presente divulgação. Convém também compreender que a terminologia utilizada na divulgação destina-se apenas a descrever formas de realização específicas e exemplos e não pretende ser limitativa.

Os intervalos podem ser agui expressados como de "cerca de" um valor específico, e/ou a "cerca de" outro valor específico. Quando é expressado um intervalo desses, outra forma de realização inclui de um valor específico e/ou a outro valor específico. Igualmente, guando são expressados valores como aproximações, através da utilização do "cerca de" antecedente, será compreendido gue o valor especifico forma outra forma de realização. Será ainda compreendido gue os pontos finais de cada um dos intervalos são significativos tanto em relação ao outro ponto final como independentemente do outro ponto final. O termo "amina alifática acíclica" refere-se a uma amina alifática conforme indicado acima, em gue pelo menos um dos grupos alifáticos é acíclico.

Conforme agui utilizado, "amina alifática" refere-se a um composto da fórmula NR1R2R3, em que pelo menos um de R1-3 corresponde a um grupo alifático. 0 termo "inibidor de angiogénese" é aqui utilizado para referir uma molécula, incluindo, mas não se limitando а, biomoléculas, tais como péptidos, proteínas, enzimas, polissacáridos, oligonucleótidos, ADN, ARN, vetores recombinantes, e pequenas moléculas que funcionam para inibir o crescimento de vasos sanguíneos. A angiogénese é implicada em determinados processos patológicos, tais como os envolvidos em distúrbios, tais como retinopatia diabética, doenças inflamatórias crónicas, artrite reumatoide, dermatite, psoríase, úlceras no estômago, e a maioria dos tipos de tumores sólidos humanos. 0 termo "amina heterocíclica" refere-se a um composto da fórmula NR2R2R3, em que pelo menos um de R1-3 corresponde a um grupo heterocíclico ou R1, R2 e/ou R3, considerados em conjunto com o respetivo átomo de azoto comum, formam um anel. 0 termo "grupo de partida" refere-se a um grupo que pode ser substituído por um nucleófilo. Relativamente aos compostos presentemente divulgados, o grupo de partida refere-se a um grupo que pode ser substituído para formar um intermediário de aziridina, ou pode ser substituído diretamente por um nucleófilo biomolecular, tal como um nucleófilo de ácido nucleico, para formar, por exemplo, uma espécie de guanidina 7-alquilada. Os exemplos de grupos de partida adequados incluem os halogéneos e os sulfonatos (-S02R) . Em determinadas formas de realização dos sais de análogo de isofosforamida divulgados, o composto é um composto de grupo de partida "misturado", incluindo dois tipos diferentes de grupos de partida, por exemplo um halogéneo e um sulfonato ou dois halogéneos diferentes, tais como um brometo e um cloreto. A Patente U.S. n.° б. 197.760 de Struck ensina métodos para criar esses compostos de grupo de partida misturados. "Neoplasia" refere-se ao processo de crescimento de células anormal e não controlado. A neoplasia é um exemplo de um distúrbio proliferativo. A consequência da neoplasia é um neoplasma (um tumor), que é um crescimento anormal de tecido resultante da divisão celular excessiva. Um tumor que não desenvolve metástases é designado por "benigno". Um tumor que invade o tecido circundante e/ou pode desenvolver metástases é designado por "maligno". "Opcional" ou "opcionalmente" significa que a circunstância ou evento subsequentemente descrito pode, mas não necessita de, ocorrer e que a descrição inclui casos em que o referido evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre.

Conforme aqui utilizado, o termo estável significa que o composto não se degrada mais de 5%, preferencialmente não mais de 2% ou até mesmo 1% durante, pelo menos, cinco dias ou o período de tempo especificado. Essa degradação pode ser monitorizada através de ΤΗ NMR, HPLC ou outros meios adequados.

Conforme aqui utilizado, e tal como bem compreendido na técnica, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, mas não estão limitados a, alívio ou melhoramento de um ou mais sintomas ou condições, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (isto é, que não se agrava) da doença, prevenção da propagação da doença, atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhoramento ou paliação do estado da doença e remissão (quer parcial quer total), independentemente de ser detetável ou não detetável. "Tratamento" também pode significar sobrevivência prolongada em comparação com a sobrevivência esperada sem receber tratamento. IV. Exemplos A divulgação anterior é ainda explicada através dos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

Um reator foi carregado com Tris (103,3 mg) e MeCN (3 mL), seguindo-se a adição de IPM (200,5 mg) em MeCN (3 mL). A mistura de reação foi agitada durante a noite. O sólido foi depois recolhido mediante filtração e o bolo foi lavado com MeCN. O bolo foi seco sob vácuo até atingir um peso constante para fornecer o produto final (296 mg). O produto final foi submetido a difração de raios X de pós para confirmar a cristalinidade (Figura 2). A cristalinidade foi ainda suportada por DSC, onde apareceu um pico acentuado em 105,77 (Figura 3). Adicionalmente, o sal de IPM-Tris mostrou uma perda de peso de 0,7692% aproximadamente a uma temperatura de 125 °C através de TGA (Figura 4) . Finalmente, SEM mostrou que IPM·Tris tinha um formato de cristal tipo placa. A estabilidade do IPM-Tris cristalino foi monitorizada através de ΤΗ NMR e verificou-se que permaneceu estável à temperatura ambiente até um máximo de seis dias. A estabilidade da estrutura cristalina foi monitorizada através de DSC que indicou que os cristais de IPM-Tris não absorveram água ou mudaram em termos de estrutura durante o período de dez dias à temperatura ambiente.

Exemplo 2

Um reator foi carregado com Tris (8,563 g) e DMF (40 mL) e aquecido para formar uma solução clara. Depois de a solução ter arrefecido à temperatura ambiente, foi adicionada IPM. A mistura foi agitada para formar uma solução clara. O acetonitrilo (40 mL) e uma pequena quantidade de sementes foram adicionados à solução, seguindo-se a adição lenta de MTBE (240 mL) para fornecer uma mistura semilíquida. A mistura semilíquida foi agitada durante mais uma hora e depois o precipitado foi recolhido através de filtração, e o bolo de filtração foi lavado com MTBE (80 mL) . O bolo de filtração foi seco sob vácuo até atingir um peso constante à temperatura ambiente para fornecer o produto final (23,2 g) .

Exemplo 3

Fragmentos de 30 a 40 mg de tumores mamários humanos MX-1 de uma passagem in vivo foram implantados subcutaneamente em ratinhos nu/nu na gordura mamária e puderam atingir 75 a 200 mg em peso antes do inicio do tratamento. O tratamento foi iniciado no Dia 10 a seguir à implantação do tumor; a administração foi intraperitoneal uma vez por dia durante 5 dias. A IPM- (LIS)2 (43% de IPM e 57% de Lis) e o IPM-Tris apresentaram uma atividade semelhante contra tumores MX-1 quando as doses foram normalizadas para IPM (consulte a Figura 6).

Exemplo 4

Fragmentos de 30 a 40 mg de tumores mamários humanos MX-1 de uma passagem in vivo foram implantados sc em ratinhos nu/nu na gordura mamária e puderam atingir 75 a 200 mg em peso antes do inicio do tratamento. O tratamento foi iniciado no Dia 10 a seguir à implantação do tumor; a administração foi intraperitoneal ou oral uma vez por dia durante 5 dias. O IPM-Tris, que pode ser preparado conforme descrito no Exemplo 1, em doses máximas toleradas para cada administração, foi igualmente ativo contra tumores MX-1 quando administrado de forma oral ou sistémica (consulte a Figura 7).

Exemplo 5

Ensaio de Proliferação de Células A inibição do crescimento foi determinada através do método de tetrazólio em microcultura. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de microtitulo de 96 poços com fundo plano numa densidade de 500 células/poço em 100 pL de meios. Após a incubação durante a noite, 100 pL de meios que contêm IPM-(LIS)2 foram adicionados para alcançar concentrações finais especificadas e um volume final de 200 pL/poço. Os pontos de dados representam a viabilidade média e as barras de erro (desvio padrão de cada experiência efetuado em triplicado). Após 120 horas, as atividades metabólicas relativas de células tratadas e não tratadas foram medidas através de conversão mitocondrial de brometo de 3-[ 4,5-dimetiltiazon-2-il]-2,5-difenil tetrazólio (MTT, Sigma, St. Louis, MO) em formazina. Na conclusão do tratamento com fármaco, foram adicionados 250 pg de MTT a cada poço e incubados a 37 °C, 5% de C02 durante 6 horas. Os cristais de formazina foram dissolvidos em DMSO e a densidade ótica em 595 nm foi medida num espetrofotómetro VERSAmax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . A viabilidade foi definida como a absorvância em 595 nm nas amostras tratadas divididas pela absorvância em 570 nm nas amostras de controlo. O IC50 foi definido como a concentração na qual a viabilidade das células tratadas correspondia a 50% da dos controlos (tratadas/controlo = 0,5).

Modelos de Xenoenxertos Murinos

Foram implantados tumores no flanco de forma subcutânea nas fêmeas de ratinhos scid*/* CB17 (Taconic Farms, Germantown, NY) . A linha tumoral OS31 foi estabelecida no St. Judes Children's Cancer Research Hospital e foi descrita anteriormente (20). Para a transplantação com tumor OS1, os ratinhos foram anestesiados com 4% de isoflurano. Em seguida, foi efetuada uma pequena incisão no flanco do ratinho e implantado subcutaneamente um tumor com um corte de 4 mm por 4 mm.

As fêmeas de ratinhos scid*/* CB 17 (Taconic Farms, Germantown, Nova Iorque) foram tratadas com IPM*(LIS)2 diariamente durante 1 ou 3 dias através de injeção na veia caudal a começar no dia 1 a cada 21 dias durante 2 ciclos. Foram atribuídos cinco ratinhos não portadores de tumor a cada grupo de tratamento. Os ratinhos foram tratados com 75 mg/kg/dia, 100 mg/kg/dia, 150 mg/kg/dia ou 200 mg/kg/dia de IPM· (LIS)2. Foi definido um evento tóxico como perda de peso igual ou superior a 20% do peso do animal no momento da seleção aleatória, ou morte. A DMT é definida como a dose mais elevada na qual não ocorreu nenhuma toxicidade.

Quando os tumores atingiram um diâmetro de aproximadamente 0,20 a 0,7 cm, os ratinhos portadores de tumor foram selecionados aleatoriamente em grupos de 5 a 8 ratinhos com 1 grupo de tratamento e 1 grupo e controlo. Os ratinhos tratados receberam tasidotin numa dose de 90 mg/kg/dia como uma injeção intraperitoneal diária durante 5 dias a começar nos dias 1 e 21. Assumindo um tumor esférico, o volume foi determinado através da fórmula: mm3 = */6(D)d2, em que D corresponde ao diâmetro máximo e d corresponde ao diâmetro perpendicular a D. Os volumes são expressados como volumes tumorais relativos (VTR), em que o volume tumoral a qualquer momento é dividido pelo volume tumoral inicial. O VTR para ratinhos tratados e de controlo foi medido, no mínimo, uma vez por semana.

Avaliação da Resposta do Tumor e Considerações Estatísticas nos Ratinhos

Utilizando critérios definidos anteriormente por Houghton, et ai., a doença progressiva é definida como inferior a 50% de regressão em relação ao volume tumoral original durante todo o período de estudo (VTR >0,5) e superior a 25% de aumento no volume tumoral no final do período de estudo (VTR > 1,25) . A regressão de tumor de doença estável não excede 50% do volume tumoral original durante todo o período de estudo (VTR >0,5) e é inferior a 25% de aumento no volume tumoral no final do período de estudo (VTR < 1,25) . Uma resposta parcial é definida como superior a 50% de regressão no volume tumoral (VTR < 0,5), mas com uma massa tumoral mensurável superior a 0,10 cm3. A perda de massa tumoral mensurável (< 0,10 cm3) a qualquer momento durante o período de tratamento (6 semanas) foi definida como uma resposta completa (RC). Uma RC prolongada foi definida como uma perda de massa tumoral mensurável (< 0,10 cm3) a qualquer momento após o início da terapia sem novo crescimento durante o período de estudo de 6 semanas. Os ratinhos que morreram antes da semana 9 ou antes de o tumor atingir 4 vezes o volume inicial foram excluídos. A análise estatística baseou-se na sobrevivência livre de eventos (EFS) . Um evento é definido como um volume tumoral relativo de 4x (isto é, o quádruplo do tamanho de tumor inicial), ou morte. A EFS é definida como o tempo entre o início do estudo e um evento. Relativamente aos tumores que não alcançam um evento até 6 semanas, o final do período de estudo, o tempo de EFS foi excluído nesse tempo. 0 teste de log-rank exato foi utilizado para comparar distribuições de sobrevivência livres de eventos entre grupos de tratamento e controlo. Adicionalmente, no dia 22, os VTR para os ratinhos de controlo e tratados foram comparados utilizando o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney. Isto permite a comparação do volume tumoral após um ciclo de tasidotin e no, ou perto do, tempo do evento para os ratinhos não tratados.

Dados Biológicos

As linhas celulares tumorais utilizadas incluíam linhas de rabdomiossarcoma RD e RH30 (Coleção Americana de Culturas Celulares, Manassas, VA), linha de osteossarcoma Saos-2, linhas de sarcoma de Ewing SKPNDW e SKES1 e linhas de sarcoma sinovial HSSYII e SYOI. As células cresceram em monocamada a 37 °C, 5% de CO2 nos meios de MEM (Saos-2, SYO-1, HSSY-II), DME (SK-PN-DW, RD) ou RPMI (RH30) completados com 10% de soro fetal bovino (Invitrogen,

Carlsbad, CA), 0,5% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 1% de glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os resultados são ilustrados abaixo (Figuras 8 e 9) .

A resistência à ciclofosfamida (CPA) e ifosfamida (IFOS) é um grande obstáculo a superar no tratamento do cancro. Os ratinhos com xenoenxertos de células de sarcoma humano resistentes a CPA tiveram uma redução de mais de 5 vezes no crescimento de sarcoma quando tratados com IPM· (LIS) 2; a terapia de CPA não teve qualquer efeito (Figuras 10 a 12).

Ensaios Clínicos Humanos

Os estudos de segurança e variação de doses de fase I utilizaram IPM-(LIS)2 administrada diariamente durante três dias consecutivos a cada quatro semanas (1 ciclo). Os resultados mostraram sinais de atividade clinica no sarcoma (2/11 indivíduos incluindo pelo menos um que careceu de terapia IFOS) e mesotelioma (1 indivíduo com doença estável prolongada) . A dose máxima tolerada (DMT) de IPM- (LIS) 2 neste plano foi de 400 mg/m2/d. Existiu pouca toxicidade da medula óssea e nenhuma cistite hemorrágica (toxicidade da bexiga) ou toxicidade do SNC. A toxidade limitadora de dose foi caracterizada por desequilíbrios de eletrólitos. Esta DMT é comparável com doses de IFOS superiores a 25 g/m2 e esta dose alcança níveis de soro que são 25 vezes superiores aos das doses que destroem 50% de linhas celulares de sarcoma humano.

Exemplo 6

Materiais e Métodos

Tratamento dos Animais: foram adquiridos machos de ratinhos CD2F1 com cinco a seis semanas de idade no Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD).

Modelo de Tumor: um milhão de células da leucemia murina P388 foram implantadas ip nos ratinhos utilizando uma agulha de calibre 23. A linha tumoral P388 foi mantida como uma passagem in vivo. 0 dia da implantação do tumor foi designado como dia 0, com o tratamento a começar no dia 1 a seguir à implantação do tumor. Foi implantado um número suficiente de ratinhos para que fossem selecionados para o ensaio animais com pesos corporais numa gama o mais pequena possível.

Formulação do Fármaco: a IPM- (LIS)2, fornecida em frascos previamente pesados de 100 mg, foi formulada no soro fisiológico no primeiro dia de tratamento (dia 1) numa concentração de 70 mg/mL. Uma porção desta solução foi depois diluída para as concentrações de dosagem mais pequena de 46, 65, 23,35, 14, 9,35, 4, 65 e 2,8 mg/mL. Nos dias subsequentes de tratamento, a IPM-(LIS)2 foi formulada em 14 mg/mL e uma porção dessa solução foi depois diluída para as concentrações de dosagem mais pequena. Todas as injeções foram administradas com base no peso corporal exato com o volume de injeção sendo de 0,2 mL/10 g de peso corporal.

Tratamento do Fármaco: o estudo consistiu em oito grupos de tratamento de oito ratinhos por grupo e dois grupos de controlo tratados com veículo com dez ratinhos para um total de 84 ratinhos no primeiro dia de tratamento. A IPM· (LIS)2 foi administrada como uma única injeção no dia 1 (qld x 1) em dosagens de 1400, 933 e 467 mg/kg fornecidas po e numa dosagem de 280 mg/kg fornecida ip. A IPM- (LIS)2 também foi administrada diariamente durante cinco dias consecutivos (qld x 5) em dosagens de 280, 187 e 93 mg/kg/dose fornecidas po e numa dosagem de 56 mg/kg/dose fornecida ip. Um grupo de controlo foi tratado com soro fisiológico administrado po como uma única injeção no dia 1. 0 segundo grupo de controlo foi tratado com soro fisiológico administrado po num plano de tratamento de qld x 5 .

Duração do Estudo: o estudo terminou 61 dias após a implantação do tumor. Qualquer animal que tenha ficado moribundo foi eutanasiado antes do fim do estudo.

Parâmetros Avaliados: número de mortes não especificas, dias medianos de morte, e o aumento na esperança de vida com base no dia mediano de morte e expressado como uma percentagem (% de ILS); tempo mediano de sobrevivência e a % de ILS calculada com base no tempo mediano de sobrevivência.

Análise Estatística: o tempo de sobrevivência de cada animal foi utilizado como o ponto final numa análise de estatísticas de mortalidade (estimativa de Kaplan-Meier estratificada seguida pelo teste de Mantel-Haenszel log-rank) para comparar estatisticamente os dados de sobrevivência entre grupos. Uma análise de estatísticas de mortalidade permite a comparação dos dados de sobrevivência entre os grupos utilizando os animais que não alcançaram o ponto final através da exclusão dos mesmos.

Resultados 0 dia mediano de morte em ambos os grupos de controlo tratados com veículo correspondeu a 11,0, com as mortes a ocorrerem entre os dias 10 e 14. A ascite estava presente em todos os animais. A IPM· (LIS)2, administrada po como um único tratamento fornecido no dia 1, foi tóxica para os ratinhos em dosagens de 1400 e 933 mg/kg. No grupo que recebeu tratamento com a dosagem de 1400 mg/kg, um animal morreu e quatro animais foram eutanasiados. Por se encontrarem moribundos no dia 5, dois animais foram eutanasiados no dia 6, e o último animal morreu no dia 10. No grupo que recebeu tratamento com a dosagem de 933 mg/kg, seis animais foram eutanasiados no dia 5 por se encontrarem moribundos e os restantes dois animais do grupo morreram no dia 9. A necropsia não indicou nenhuma presença de tumor nestes dois grupos de tratamento. Antes da morte ou eutanásia dos animais, foram observadas perdas de peso significativas de 24% e 22% nos grupos que receberam IPM- (LIS)2 em dosagens de 1400 e 933 mg/kg, respetivamente. A IPM·(LIS)2 administrada numa dosagem de 467 mg/kg como um único tratamento po foi melhor tolerada; contudo, dois animais foram eutanasiados no dia 8 por se encontrarem moribundos. A perda máxima no peso corporal médio para este grupo foi de 8%. Os restantes seis animais do grupo morreram entre os dias 11 e 15 e verificou-se a presença de ascite na necropsia. O ILS para este grupo de tratamento foi de 9% independentemente de o cálculo ter sido baseado no dia mediano de morte ou no tempo mediano de sobrevivência. A comparação estatística dos dados de sobrevivência deste grupo com os do grupo de controlo tratado com veículo (grupo 1, tratado qld x 1) indicou que a diferença não era significativa. A IPM- (LIS)2, administrada ip numa dosagem de 280 mg/kg como uma única injeção, foi tolerada sem mortes e com uma perda mínima no peso corporal médio (4%, 1 g) . O dia mediano de morte para este grupo correspondeu a 34,5 com um ILS de 214%. O tempo mediano de sobrevivência foi de 38,0 dias com um ILS de 245%. Adicionalmente, dois animais sobreviveram até ao fim do estudo no dia 61. A necropsia não indicou a presença de nenhum tumor. A análise estatística dos dados de sobrevivência deste grupo de tratamento e do grupo de controlo tratado com veiculo (grupo 1, tratado qld x 1) indicou que a diferença era significativa. A IPM- (LIS)2, administrada po em dosagens de 280, 187 e 93 mg/kg/dose num plano de tratamento de qld x 5, foi tolerada sem mortes relacionadas com o tratamento. Uma perda mínima no peso corporal médio (4%, 1 g) foi observada no grupo que recebeu IPM- (LIS) 2 numa dosagem de 280 mg/kg/dose. Não foi observada nenhuma perda de peso nos dois grupos com dosagem mais pequena. Os dias medianos de morte e tempos medianos de sobrevivência corresponderam a 17,0, 17,0 e 15,0 dias com valores ILS de 55%, 55% e 36% para as dosagens de 280, 187 e 93 mg/kg/dose, respetivamente. A comparação estatística dos dados de sobrevivência de cada um destes três grupos com os dados de sobrevivência do controlo tratado com veículo (grupo 6, tratado qld x 5) indicou que o aumento na esperança de vida para cada grupo foi estatisticamente significativo. A IPM- (LIS) 2, fornecida ip numa dosagem de 56 mg/kg/dose num plano de injeção qld x 5, foi bastante eficaz contra a leucemia P388/0 com um dia mediano de morte de 28,5. A primeira morte ocorreu no dia 24 e a última morte no dia 33, com quatro dos oito animais do grupo a sobreviverem até ao fim do estudo no dia 61. O valor ILS calculado com base no dia mediano de morte foi de 159%. O tempo mediano de sobrevivência deste grupo de tratamento foi > 47,0 dias com um valor ILS calculado de 327%. Este regime de tratamento foi bem tolerado sem nenhumas mortes relacionadas com o tratamento e uma perda de 4% (1 g) no peso corporal médio. Quando os dados de sobrevivência deste grupo foram comparados estatisticamente com os do grupo de controlo tratado com veículo (grupo 6, tratado qld x 5) , verificou-se uma diferença significativa.

Sumário da Análise Estatística

Conclusões A IPM·(LIS)2 foi tóxica para os ratinhos quando administrada po como um único tratamento em dosagens de 1400 e 933 mg/kg. Um único tratamento com a dosagem de 467 mg/kg administrado po foi tolerado, mas provocou apenas um aumento mínimo na esperança de vida que não foi estatisticamente significativo. A IPM- (LIS)2, administrada como uma única injeção ip numa dosagem de 280 mg/kg, foi bastante eficaz e resultou em dois sobreviventes de 61 dias e num aumento significativo na esperança de vida. A IPM- (LIS) 2/· administrada po num plano qld x 5 em dosagens de 280, 187 e 93, foi muito melhor tolerada e mais eficaz contra a leucemia P388/0 do que os tratamentos únicos com dosagens maiores. O tratamento com a totalidade das três dosagens fornecido po qld x 5 produziu aumentos estatisticamente significativos na esperança de vida. Quando administrado ip num plano de tratamento qld x 5 numa dosagem de 56 mg/kg/dose, a IPM-(LIS)2 provocou aumentos significativos na esperança de vida com quatro de oito animais do grupo a sobreviverem até ao fim do estudo no dia 61.

Exemplo 7

Materiais e Métodos

Tratamento dos Animais: foram adquiridas fêmeas de ratinhos NCr-nu/nu atímicos com cinco semanas de idade em Taconic Farms (Germantown, Nova Iorque).

Modelo de Tumor: fragmentos de 30 a 40 mg de tumores mamários humanos MX-1 mantidos numa passagem in vivo foram implantados sc (subcutaneamente) em ratinhos na gordura mamária utilizando uma agulha trocarte de calibre 12 e puderam crescer. O dia da implantação do tumor foi designado como dia 0. Os tumores puderam alcançar 138 a 245 mg em peso (138 a 245 mm3 em tamanho) antes do inicio do tratamento. Foi implantado um número suficiente de ratinhos para que fossem selecionados para o ensaio tumores numa gama de peso o mais pequena possível no dia do início do tratamento (dia 10 após a implantação do tumor) . Esses animais selecionados com tumores na gama apropriada de tamanho foram atribuídos aos vários grupos de tratamento para que os pesos de tumores medianos no primeiro dia de tratamento fossem o mais próximos possível uns dos outros (172 a 197 mg).

Formulação do Fármaco: o IPM-Tris (205 mg de IPM/frasco), que pode ser preparado conforme descrito no Exemplo 1, e a IPM foram ambos formulados em soro fisiológico no primeiro dia de tratamento (dia 10) numa concentração de 6,0 mg/mL e depois diluídos com soro fisiológico para as concentrações de dosagem mais pequena de 4,05, 1,8 e 1,2 mg/mL. A IPM- (LIS)2 (100 mg de IPM-

Lisina/frasco) foi formulada em soro fisiológico no primeiro dia de tratamento numa concentração de 14 mg/mL e depois diluída com soro fisiológico para as concentrações de dosagem mais pequena de 9,35, 4,2 e 2,8 mg/mL. Cada concentração foi depois transformada em alíquota para utilização diária, congelada, armazenada a uma temperatura de -20 °C e descongelada para utilização diária. Todas as injeções foram administradas com base no peso corporal exato com o volume de injeção sendo de 0,2 mL/10 g de peso corporal.

Tratamento do Fármaco: a experiência consistiu em 12 grupos de tratamento de oito ratinhos por grupo e dois grupos de controlo tratados com veiculo com dez ratinhos cada para um total de 116 ratinhos no primeiro dia de tratamento. Todos os agentes (e o veículo) foram administrados diariamente durante cinco dias consecutivos (qld x 5) . O IPM-Tris e a IPM foram ambos administrados ip em dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose e po em dosagens de 120 e 81 mg/kg/dose. A IPM-(LIS)2 foi administrada ip em dosagens de 84 e 56 mg/kg/dose e po em dosagens de 280 e 187 mg/kg/dose. Os grupos de controlo foram tratados ip ou po com o veiculo (soro fisiológico).

Medições do Tumor e Pesos Corporais: os tumores sc foram medidos e os animais foram pesados duas vezes por semana a começar no primeiro dia de tratamento. O volume tumoral foi determinado através de medições com calibrador (mm) e utilizando a fórmula para uma esfera elipsoide:

LxWJ/2-am\ em que L e W se referem às dimensões perpendiculares maiores e menores recolhidas em cada medição. Esta fórmula é igualmente utilizada para calcular o peso do tumor, assumindo uma densidade unitária (1 mm3 = 1 mg) .

Duração do Estudo: o estudo terminou 50 dias após a implantação do tumor. Qualquer animal que tenha ficado moribundo ou cujo tumor tenha ficado ulcerado ou atingido 4000 mg foi eutanasiado antes do fim do estudo.

Parâmetros Avaliados: foram determinados o número de mortes não especificas, o número de regressões tumorais parciais e completas, o número de sobreviventes livres de tumor e os tempos de cada animal até alcançar duas duplicações de massa tumoral. O tempo mediano até alcançar duas duplicações de massa tumoral nos grupos de tratamento (T) e no grupo de controlo (C) foi utilizado no cálculo do atraso total no crescimento do tumor mediano (T-C).

Análise Estatística: o tempo de cada animal até alcançar duas duplicações de massa tumoral foi utilizado como o ponto final num teste t de Student/teste de Mann Whitney rank sum ou numa análise de estatísticas de mortalidade para comparar estatisticamente os dados de crescimento entre grupos. Uma análise de estatísticas de mortalidade (estimativa de Kaplan-Meier estratificada seguida pelo teste de Mantel-Haenszel log-rank) permite comparar os dados de crescimento entre grupos utilizando os animais cujos tumores não alcançaram o ponto de avaliação através da exclusão dos mesmos.

Resultados

Os tumores em ambos os grupos de controlo tratados com veiculo cresceram bem em todos os 10 ratinhos. O tumor mediano alcançou duas duplicações de massa tumoral em 7,4 e 7,2 dias, respetivamente, para os grupos tratados ip e tratados po. Não existiu nenhuma perda no peso corporal médio para estes dois grupos durante o estudo. A administração intraperitoneal de IPM-Tris em dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose provocou atrasos no crescimento do tumor (T-C) de 10,2 e 7,7 dias, respetivamente. A dosagem maior tinha um sobrevivente livre de tumor. Ambas as dosagens foram toleradas com perdas máximas no peso corporal médio de 10% (2 g) e 0% para dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose, respetivamente. A administração intraperitoneal de IPM em dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose provocou atrasos no crescimento do tumor de 5,2 e 2,6 dias, respetivamente. Ambas as dosagens foram toleradas com perdas máximas no peso corporal médio de 0% e 5% (1 g) para dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose, respetivamente. Os tempos até alcançar duas duplicações de massa tumoral para IPM foram estatisticamente inferiores aos da dosagem correspondente de IPM-Tris (p = 0,000 para a dosagem de 36 mg/kg/dose; p = 0,021 para a dosagem de 24 mg/kg/dose) . A administração intraperitoneal de IPM- (LIS)2 em dosagens de 84 e 56 mg/kg/dose, que corresponde a dosagens de IPM de 36 e 24 mg/kg/dose, provocou atrasos no crescimento do tumor de 24,3 e 9,0 dias, respetivamente. A dosagem maior de IPM- (LIS)2 foi tóxica - dois ratinhos mortos no dia 20 e dois eutanasiados por se encontrarem moribundos ou com uma perda excessiva de peso corporal. A dosagem mais pequena de IPM- (LIS)2 foi tolerada com uma perda máxima no peso corporal médio de 15% (3 g). A dosagem de IPM· (LIS)2 tolerada apresentou uma atividade comparável à de IPM-Tris numa dosagem correspondente de 24 mg/kg/dose (p = 0,766) e uma atividade superior à de IPM numa dosagem correspondente de 24 mg/kg/dose (p = 0,0047). A administração oral de IPM-Tris em dosagens de 120 e 81 mg/kg/dose provocou atrasos no crescimento do tumor de 8,7 e 9,0 dias, respetivamente. A dosagem maior de IPM-Tris provocou uma perda máxima no peso corporal médio de 15% (3 g) com um ratinho sendo eutanasiado por causa de um peso corporal inferior a 14 g. A dosagem mais pequena foi tolerada com uma perda máxima no peso corporal médio de 10% (2 g). A administração oral de IPM em dosagens de 120 e 81 mg/kg/dose provocou atrasos no crescimento do tumor de 4,6 e 4,0 dias, respetivamente. Ambas as dosagens foram toleradas com uma perda máxima no peso corporal médio de 5% (1 g) . Os tempos até alcançar duas duplicações de massa tumoral não foram estatisticamente diferentes dos tempos para a dosagem correspondente de IPM-Tris (p = 0,1174 para a dosagem de 120 mg/kg/dose; p = 0,1152 para a dosagem de 81 mg/kg/dose). A administração oral de IPM·(LIS)2 em dosagens de 280 e 187 mg/kg/dose, que corresponde a dosagens de IPM de 120 e 81 mg/kg/dose, provocou atrasos no crescimento do tumor de 5,0 e 3,5 dias, respetivamente. Ambas as dosagens foram toleradas com perdas máximas no peso corporal médio de 5% (1 g) e 0%. A dosagem maior de IPM- (LIS)2 apresentou uma atividade comparável à de

IPM-Tris e IPM numa dosagem correspondente de 120 mg/kg/dose (p = 0,1000 e p = 0,9143, respetivamente). A dosagem mais pequena de IPM-(LIS)2 apresentou uma atividade inferior à de IPM-Tris numa dosagem correspondente de 81

mg/kg/dose (p = 0,0290) e uma atividade comparável à de IPM numa dosagem correspondente de 81 mg/kg/dose (p = 0,3073) . Sumário da Tabela de Análise Estatística

A resposta dos xenoenxertos de tumor mamário humano MX-1 ao tratamento com (1) veículo - ip e po, (2) IPM-Tris, IPM e IPM-(LIS)2 ip, e (3) IPM-Tris, IPM e IPM-(LIS)2 po é ilustrada nas Figuras 13, 14 e 15, respetivamente.

Conclusão

Para a administração ip de dosagens de IPM equivalentes, a atividade antitumoral de IPM-Tris foi superior à de IPM (ambas as dosagens) e comparável à de IPM- (LIS)2 (ambas as dosagens) . Para a administração po de dosagens de IPM equivalentes, a atividade antitumoral de IPM-Tris foi comparável à de IPM (ambas as dosagens), comparável à de IPM-(LIS)2 na dosagem maior e superior à de IPM-(LIS)2 na dosagem menor.

Exemplo 8

Materiais e Métodos

Tratamento dos Animais: foram adquiridas fêmeas de ratinhos NCr-nu/nu atímicos com cinco semanas de idade em Harlan (Prattville, AL).

Modelo de Tumor: fragmentos de trinta a quarenta mg de tumor mamário humano MX-1 mantidos numa passagem in vivo foram implantados sc em ratinhos na gordura mamária utilizando uma agulha trocarte de calibre 12 e puderam crescer. 0 dia da implantação do tumor foi designado como dia 0. Os tumores puderam alcançar 113 a 245 mg em peso (113 a 245 mm3 em tamanho) antes do inicio do tratamento. Foi implantado um número suficiente de ratinhos para que fossem selecionados para o ensaio tumores numa gama de peso o mais pequena possível no dia do início do tratamento (dia 6 após a implantação do tumor). Esses animais selecionados com tumores na gama apropriada de tamanho foram atribuídos aos vários grupos de tratamento para que os pesos de tumores medianos no primeiro dia de tratamento fossem o mais próximos possível uns dos outros (144 a 162 mg).

Formulação do Fármaco: o IPM-Tris (205 mg de IPM/frasco, Cardinal Health), que pode ser preparado conforme descrito no Exemplo 1, foi formulado em soro fisiológico todos os dias do tratamento numa concentração de 13,5 mg/mL e depois diluído com soro fisiológico para as concentrações de dosagem mais pequena de 9, 6, 4,05, 2,7, 1,8 e 1,2 mg/mL. A IPM (Eagle-Picher Pharmaceutical Service) foi formulada em soro fisiológico todos os dias do tratamento numa concentração de 6,0 mg/mL e depois diluída com soro fisiológico para as concentrações de dosagem mais pequena de 4,05, 1,8 e 1,2 mg/mL. A IPM- (LIS)2 (100 mg de IPM-Lisina/frasco, Universidade de Iowa) foi formulada em soro fisiológico todos os dias do tratamento numa concentração de 14 mg/mL e depois diluída com soro fisiológico para as concentrações de dosagem mais pequena de 9,35, 4,2 e 2,8 mg/mL. Todas as soluções de dosagem foram mantidas em gelo após a formulação e foram administradas em menos de 30 min. Todas as injeções foram administradas com base no peso corporal exato, com o volume de injeção sendo de 0,2 mL/10 g de peso corporal.

Tratamento do Fármaco: a experiência consistiu em 16 grupos de tratamento de oito ratinhos por grupo e dois grupos de controlo tratados com veículo com dez ratinhos cada para um total de 148 ratinhos no primeiro dia de tratamento. Todos os agentes (e o veículo) foram administrados diariamente durante cinco dias consecutivos (qld x 5) . 0 IPM-Tris foi administrado ip em dosagens de 81, 54, 36 e 24 mg/kg/dose e po em dosagens de 270, 180, 120 e 81 mg/kg/dose. A IPM foi administrada ip em dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose e po em dosagens de 120 e 81 mg/kg/dose. A IPM- (LIS)2 foi administrada ip em dosagens de 84 e 56 mg/kg/dose e po em dosagens de 280 e 187 mg/kg/dose. Os grupos de controlo foram tratados ip (grupo n.° 1) ou po (grupo n.° 10) com o veículo (soro fisiológico).

Medições do Tumor e Pesos Corporais: os tumores sc foram medidos e os animais foram pesados duas vezes por semana a começar no primeiro dia de tratamento. O volume tumoral foi determinado através de medições com calibrador (mm) e utilizando a fórmula para uma esfera elipsoide: L x W2 / 2 “ mra3, em que L e W se referem às dimensões perpendiculares maiores e menores recolhidas em cada medição. Esta fórmula é igualmente utilizada para calcular o peso do tumor, assumindo uma densidade unitária (1 mm3 = 1 mg) .

Duração do Estudo: o estudo terminou 52 dias após a implantação do tumor. Qualquer animal que tenha ficado moribundo ou cujo tumor tenha ficado ulcerado e atingido 4000 mg foi eutanasiado antes do fim do estudo.

Parâmetros Avaliados: foram determinados o número de mortes não específicas, o número de regressões tumorais parciais e completas, o número de sobreviventes livres de tumor e os tempos de cada animal até alcançar duas duplicações de massa tumoral. O tempo mediano até alcançar duas duplicações de massa tumoral nos grupos de tratamento (T) e no grupo de controlo (C) foi utilizado no cálculo do atraso total no crescimento do tumor mediano (T-C).

Análise Estatística: o tempo de cada animal até alcançar duas duplicações de massa tumoral foi utilizado como o ponto final num teste t de Student/teste de Mann Whitney rank sum para comparar estatisticamente os dados de crescimento entre grupos.

Resultados

Os tumores em ambos os grupos de controlo tratados com veiculo cresceram bem em todos os 10 ratinhos. O tumor mediano alcançou duas duplicações de massa tumoral em 9,2 e 8,9 dias, respetivamente, para os grupos tratados ip e tratados po. Não existiu nenhuma perda no peso corporal médio para estes dois grupos durante o estudo. A administração intraperitoneal de IPM-Tris numa dosagem de 81 mg/kg/dose foi tóxica para os ratinhos, provocando três mortes e uma eutanásia devido ao estado moribundo e uma perda máxima no peso corporal médio de 20% (4,5 g). As dosagens mais pequenas de 54, 36 e 24 mg/kg/dose foram toleradas com perdas máximas no peso corporal médio de 5% (1,2 g) , 6% (1,3 g) e 1% (0,2 g) , respetivamente. As dosagens de 54, 35 e 24 mg/kg/dose provocaram atrasos no crescimento do tumor (T-C) de 4,4, 3,3 e 0,9 dias, respetivamente. A administração intraperitoneal de IPM em dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose provocou atrasos no crescimento do tumor de 1,1 e 0,3 dias, respetivamente. Ambas as dosagens foram toleradas com perdas máximas no peso corporal médio de 8% (1,8 g) e 2% (0,4 g) para dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose, respetivamente. Os tempos até alcançar duas duplicações de massa tumoral para IPM foram estatisticamente inferiores aos das dosagens maiores toleradas de IPM-Tris, mas estatisticamente iguais aos da dosagem correspondente de IPM-Tris (p = 0,0148 para a dosagem de 54 mg/kg/dose; p = 0,1879 para a dosagem de 36 mg/kg/dose). A administração intraperitoneal de IPM*-LIS)2 em dosagens de 84 e 56 mg/kg/dose, que correspondem a dosagens de IPM de 36 e 24 mg/kg/dose, provocou atrasos no crescimento do tumor de 0,5 e 0,3 dias, respetivamente. Ambas as dosagens foram toleradas com perdas máximas no peso corporal médio de 1% (0,3 g) e 0% para dosagens de 36 e 24 mg/kg/dose, respetivamente. Os tempos até alcançar duas duplicações de massa tumoral para IPM-(LIS)2 foram estatisticamente inferiores aos da dosagem maior tolerada de IPM-Tris, mas estatisticamente iguais aos da dosagem correspondente de IPM-Tris (p = 0,0104 para a dosagem de 54 mg/kg/dose; p = 0,1578 para a dosagem de 36 mg/kg/dose). A administração oral de IPM-Tris nas dosagens de 270, 180 e 120 mg/kg/dose foi tóxica para os ratinhos, provocando oito mortes/eutanásias devido ao estado moribundo, sete mortes e três mortes, respetivamente. As dosagens de 180 e 120 mg/kg/dose provocaram perdas máximas no peso corporal médio de 23% (5,3 g) e 20% (4,7 g) , respetivamente. A dosagem mais pequena de 81 mg/kg/dose foi tolerada com uma perda máxima no peso corporal médio de 10% (2,2 g). A dosagem de 81 mg/kg/dose provocou um atraso no crescimento do tumor de 2,6 dias. A administração oral de IPM numa dosagem de 120 mg/kg/dose foi tóxica para os ratinhos, provocando duas mortes e uma perda máxima no peso corporal médio de 18% (3,8 g). A dosagem mais pequena de 81 mg/kg/dose foi tolerada com uma perda máxima no peso corporal médio de 9% (2 g) e provocou um atraso no crescimento do tumor de 2,3 dias. Os tempos até alcançar duas duplicações de massa tumoral não foram estatisticamente diferentes dos tempos para a dosagem correspondente de IPM-Tris (p = 0,2932 para a dosagem de 81 mg/kg/dose). A administração oral de IPM-(LIS)2 em dosagens de 280 e 187 mg/kg/dose, que correspondem a dosagens de IPM de 120 e 81 mg/kg/dose, provocou atrasos no crescimento do tumor de 3,9 e 4,7 dias, respetivamente. Ambas as dosagens foram toleradas com perdas máximas no peso corporal médio de 14% (3 g) e 7% (1,6 g) . A dosagem mais pequena de IPM- (LIS)2 apresentou uma atividade semelhante à de IPM-Tris numa dosagem correspondente de 81 mg/kg/dose (p = 0,8785).

Tabela de Sumário da Análise Estatística

A resposta dos xenoenxertos de tumor mamário humano MX-1 ao tratamento com (1) veículo - ip e po, (2) IPM-Tris, IPM e IPM-(LIS)2 ip, e (3) IPM-Tris, IPM e IPM-(LIS)2 po é ilustrada nas Figuras 16, 17 e 18, respetivamente. Conclusões

Para a administração ip de dosagens de IPM equivalentes, a atividade antitumoral de IPM-Tris era comparável à de IPM e IPM-(LIS)2 (dosagem maior). A dosagem mais pequena foi inativa contra o tumor MX-1 neste estudo. A dosagem maior tolerada de IPM-Tris era superior à dosagem testada maior de IPM ou IPM-(LIS)2. Para a administração po de dosagens de IPM equivalentes, a atividade antitumoral do IPM-Tris era comparável à de IPM e IPM- (LIS)2 na dosagem mais pequena. A dosagem de 120 mg/kg/dose foi tóxica para os ratinhos tanto no que respeita a IPM-Tris como a IPM.

No estudo MX-1 anterior (Exemplo 7), para a administração ip de dosagens de IPM equivalentes, a atividade antitumoral de IPM-Tris era superior à de IPM (ambas as dosagens) e comparável à de IPM- (LIS)2 (ambas as dosagens) . Para a administração po de dosagens de IPM equivalentes, a atividade antitumoral de IPM-Tris era comparável à de IPM (ambas as dosagens) , comparável à de IPM- (LIS) 2 na dosagem maior e superior à de IPM- (LIS)2 na dosagem menor.

Ao comparar os dois estudos, a atividade dos três agentes quando administrados ip foi inferior neste estudo (p. ex., para IPM-Tris numa dosagem de 36 mg/kg/dose -valor T-C de 10,2 dias vs. 3,3 dias; para IPM numa dosagem de 36 mg/kg/dose - valor T-C de 5/2 dias vs. 1,1 dias; e para IPM- (LIS) 2 numa dosagem de 56 mg/kg/dose - valor T-C de 9,0 dias vs. 0,3 dias). A atividade de IPM-Tris quando administrado po também foi inferior (valores comparáveis para IPM e IPM- (LIS)2) neste estudo (p. ex. para IPM-Tris numa dosagem de 81 mg/kg/dose - valor T-C de 9,0 dias vs. 2,6 dias; para IPM numa dosagem de 81 mg/kg/dose - valor T-C de 4,0 dias vs. 2,3 dias; e para IPM- (LIS) 2 numa dosagem de 280 mg/kg/dose - valor T-C de 5,0 dias vs. 3,9 dias). As razões para a atividade diminuída não são óbvias, dada a variação de estudo para estudo com esse sistema biológico. Em relação ao componente de tumor do estudo, os tumores de controlo tratados com veículo cresceram em taxas comparáveis nos dois estudos. Os pesos de tumores medianos no primeiro dia de tratamento foram ligeiramente maiores no Exemplo 7 (gama de 172 a 197 mg) do que neste exemplo (gama de 144 a 162 mg); contudo, esta pequena diferença não deverá ter nenhum efeito significativo na atividade antitumoral.

Exemplo 9

Materiais e Métodos

Três grupos de oito ratinhos foram tratados com IPM-Tris, que pode ser preparado conforme descrito no Exemplo 1, três grupos de oito ratinhos foram tratados com doxorrubicina, um grupo de dez ratinhos foi tratado com veiculo, e dezoito grupos de oito ratinhos foram tratados com a combinação IPM-Tris/doxorrubicina. Foram implantados fragmentos de tumor MX-1 (30 a 40 mg, de uma passagem in vivo) subcutaneamente na gordura mamária em fêmeas de ratinhos nus atimicos. O IPM-Tris (ou respetivo veiculo)

foi fornecido diariamente de forma intraperitoneal durante cinco dias consecutivos (Qldx5) em três dosagens (12, 24 e 54 mg/kg/dose), em que a formulação IPM-Tris compreendia 258, 9 mg de IPM (MW 221,02), 141, 9 mg de base Tris (MW 121,14, relação molar IPM:base Tris 1:1) e 3% de manitol. A doxorrubicina (ou respetivo veiculo) foi fornecida de forma intravenosa a cada quatro dias em três injeções (Q4dx3) em 8 mg/kg/dose). As soluções de dosagem foram preparadas no dia de tratamento e as soluções de dosagem de IPM-Tris foram mantidas em gelo depois de preparadas. O tratamento começou quando os tumores tinham um tamanho de aproximadamente 175 mg (gama de 100 a 250 mg) . Cada tumor foi medido através de calibrador em duas dimensões e convertido em massa tumoral utilizando a fórmula para um elipsoide alongado (a x b2/2), em que a corresponde à dimensão maior e b corresponde à dimensão mais pequena, assumindo a densidade unitária (1 mm3 = 1 mg) . As medições do tumor foram registadas duas vezes por semana e a atividade antitumoral foi avaliada pelo atraso no crescimento do tumor dos grupos tratados em comparação com o grupo de controlo tratado com veiculo, as regressões parciais e completas e os sobreviventes livres de tumor. Note que quando IPM-Tris foi administrado em 54 mg/kg/dia em conjunto com doxorrubicina em 8 mg/kg/dia, dois animais no grupo de combinação morreram prematuramente devido à toxicidade. Os resultados podem ser observados nas figuras 19 a 25. A combinação de IPM-Tris com doxorrubicina resultou numa atividade antitumoral significativa, em que a inibição de crescimento do tumor através da combinação excedeu a observada com a administração de agente único, e a combinação aumentou significativamente a sobrevivência em comparação com a administração de agente único. Na realidade, o efeito da combinação mostra uma eficácia sinérgica, ou seja, superior à eficácia aditiva em comparação com os agentes administrados individualmente em doses iguais, mesmo quando a dosagem de IPM-Tris sozinho é tão baixa de modo a fornecer pouco ou nenhum melhoramento em comparação com um animal de controlo tratado com veiculo. Embora os pesos dos animais nos grupos de combinação tenham reduzido durante o tratamento (os pesos médios dos animais reduziram em 20% no final da dosagem no dia 22), os mesmos recuperaram rapidamente após o final da dosagem (foi observada a recuperação total por volta do dia 38), sugerindo que a toxicidade era reversível. Estes dados sugerem que a terapia de combinação com IPM-Tris e doxorrubicina pode ser útil para o tratamento de qualquer cancro que responda a doxorrubicina ou ao IPM-Tris como agentes únicos ou numa combinação, incluindo, mas não se limitando a, cancro da mama, cancro do ovário e sarcoma. Exemplo 10

Fragmentos (30 a 40 mg cada) de tumores mamários humanos MX-1 de uma passagem in vivo foram implantados subcutaneamente em ratinhos nus na gordura mamária e puderam atingir 75 a 198 mg em peso antes do início do tratamento. IPM-Tris (54 mg/kg), que pode ser preparado conforme descrito no Exemplo 1, e docetaxel (10 mg/kg) foram administrados QlDx5 IP e Q6Dx3 IV, respetivamente, a começar dez dias após a implantação do tumor. A combinação dos dois agentes demonstrou um maior efeito antitumoral em comparação com o agente administrado como um único agente conforme observado na Figura 26.

Exemplο 11

Fragmentos (30 a 40 mg cada) de tumores mamários humanos MX-1 de uma passagem in vivo foram implantados subcutaneamente em ratinhos nus na gordura mamária e puderam atingir 75 a 198 mg em peso antes do inicio do tratamento. 0 IPM-Tris (36 mg/kg), que pode ser preparado conforme descrito no Exemplo 1, administrado IP mostrou suprimir o crescimento do tumor aproximadamente até à mesma escala que o IPM-Tris (81 mg/kg) administrado PO conforme observado na Figura 27. Adicionalmente, a administração oral ou sistémica de IPM-Tris resultou em aumentos semelhantes na sobrevivência de ratinhos portadores de xenoenxertos MX-1. A sobrevivência mediana do grupo IP foi de 39 dias, a sobrevivência mediana do grupo PO foi de 37,5 dias, e a sobrevivência mediana do grupo de controlo de veiculo foi de 30 dias conforme observado na Figura 28. A atividade antitumoral equivalente destas doses PO e IP encontra-se na gama esperada a partir da PK do IPM-Tris administrado de forma oral e sistémica.

Exemplo 12

Os ratos Sprague-Dawley receberam IPM-Tris, que pode ser preparado conforme descrito no Exemplo 1, uma vez por dia através de sonda gástrica (PO) ou injeção IV em bolo. O IPM-Tris foi administrado em doses de 20, 30 ou 40 mg/kg, e as amostras de sangue para avaliação PK foram obtidas pré-dose e em 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas pós-dose a partir do seio retro-orbital. Foram recolhidas amostras de três animais por grupo em cada momento. Os resultados PK para pré-dose e 0,5, 1, 2 e 4 horas são ilustrados na Figura 29, em que Tmáx parece corresponder aproximadamente a 0,5 horas. As estimativas de terminal ti/2 variaram entre 0,25 e 0,64 horas. Para cada dose, foram utilizados valores AUC para estimar a bioequivalência absoluta de IPM-Tris administrado oralmente como a relação (AUC pós-dose PO) / (AUC pós-dose IV) . Os valores AUC para cada dose são ilustrados na Figura 30 e os valores Cmáx para cada dose são ilustrados na Figura 31. Tanto os valores AUC como Cmáx aumentaram linearmente com a dose crescente de IPM-Tris administrado PO ou IV. A biodisponibilidade das doses PO de 20, 30 e 40 mg/kg de IPM-Tris correspondia a 48%, 65% e 73%, respetivamente. A biodisponibilidade média total era de 62% nas fêmeas. Uma PK semelhante foi observada nos ratos; contudo, a biodisponibilidade média nos machos foi estimada como sendo de 41%.

Exemplo 13

Estabilidade da Solução de IPM-Tris/Manitol e IPM- (LIS)2 A estabilidade reconstituída da formulação de IPM-Tris foi avaliada numa solução de 5% de cloreto de sódio para injeção. Verificou-se que a concentração de IPM manteve uma potência > 90% durante um máximo de 2,0 horas. A formulação de IPM-(LIS)2 foi avaliada numa solução de 0,9% de cloreto de sódio para injeção. Verificou-se que a concentração de IPM manteve uma potência > 90% durante um máximo de 1,0 horas.

Estabilidade da Solução de IPM-Tris/Manitol A Tabela apresenta dados de estabilidade de reconstituição para IPM-Tris/manitol na presença de 25 mL da solução de 5% de cloreto de sódio para injeção. As alíquotas foram retiradas nos tempos-alvo de ~1 hora, 1,5 horas, 2,5 horas, 3,5 horas, 4,0 horas e 5,0 horas. As amostras foram analisadas relativamente à potência de IPM.

Tabela 1. Estabilidade de Reconstituição de IPM-Tris/Manitol na Presença da Solução de 5% de Cloreto de Sódio

Estabilidade da Solução de IPM- (LIS)2 A Tabela 2 apresenta dados de estabilidade de reconstituição para IPM- (LIS) 2 na presença de 25 mL da solução de 0,9% de cloreto de sódio para injeção. As aliquotas foram retiradas nos tempos-alvo de ~1 hora, 2 horas, 2,5 horas, 3,5 horas, 4,0 horas e 5,0 horas. As amostras foram analisadas relativamente à potência de IPM- (LIS)2 ·

Tabela 2. Estabilidade de Reconstituição de IPM-(LIS)2 na Presença da Solução de 0,9% de Cloreto de Sódio

Conclusão A formulação de IPM/trometamina/manitol mantém 90% de potência durante 2,0 horas quando submetida a 5% de cloreto de sódio na solução. A formulação de IPM- (LIS)2 mantém 90% de potência durante 1,0 na presença de 0,9% de cloreto de sódio. A diferença na estabilidade de reconstituição (> 90% de potência) entre as duas formulações é de 1,0 horas, um fator de dois. O aumento no tempo de estabilidade pode ajudar os médicos durante a preparação e a administração do fármaco.

Exemplο 14

Estabilidade da Solução de IPM A estabilidade reconstituída da formulação de IPM foi avaliada no tampão de pH 7 numa temperatura de aproximadamente 25 °C durante 3,5 horas conforme ilustrado abaixo na Tabela 3 e na Figura 32.

Estabilidade da Solução de IPM-Tris/Manitol A Tabela 4 apresenta dados de estabilidade de reconstituição para IPM-Tris/Manitol na presença de 25 mL da solução de 5% de cloreto de sódio para injeção. As alíquotas foram recolhidas nos tempos-alvo de 1,5, 3,0 e 4,5 horas.

Estabilidade da Solução de IPM- (LIS)2 A Tabela 5 apresenta dados de estabilidade de reconstituição para IPM- (LIS)2 na presença de 25 mL da solução de 0,9% de cloreto de sódio para injeção. As alíquotas foram recolhidas nos tempos-alvo de 1,5, 3,0 e

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 2006047575 A [0003] • US 6197760 B, Struck [0035] [0094] • WO 2004018478 A [0072] • US 6610860 B, Holton [0072] • US 5530020 B, Gurram [0072] • US 5912264 B, Wittman [0072]

Documentos de não patente citados na descrição • E. W. MARTIN. Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 2006 [0046] • CHAMBERLAIN et al. Arch. Neuro., 1993, vol. 50, 261-264 [0053] • KATRI et al. J. Pharm. Scl., 1998, vol. 87, 1341-1346 [0053] • YE et al. J. Control Release, 2000, vol. 64, 155-166 [0053] • HOWELL. Cancer J., 2001, vol. 7, 219-227 [0053]

Lisboa, 15 de Setembro de 2015

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto cristalino compreendendo um análogo de IPM tendo uma estrutura da fórmula (I):

   em que A+ corresponde ao ácido de uma amina alifática hidroxilada; e X e Y representam independentemente grupos de partida selecionados a partir de halogéneos; o análogo de IPM e a espécie de amónio estão presentes numa relação de 1:1; e o ponto de fusão do composto cristalino é de 103 a 106 °C.
2. 2. Um composto cristalino de acordo com a reivindicação 1, em que A+ é selecionado a partir do ácido conjugado de mono-, bis- ou tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-tert-butilamina, N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina e tris(hidroximetilaminometano (Tris), opcionalmente Tris.
3. 3. Um composto cristalino de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que X e Y são iguais, tal como X e Y correspondem ambos a Cl.
4. 4. Um composto cristalino de acordo com a reivindicação 1, em que o ponto de fusão do composto cristalino é de 105 a 106 °C.
5. 5. Um composto cristalino de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o composto cristalino compreende uma única forma polimórfica de cristais.
6. 6. Um composto cristalino de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o composto é estável à temperatura ambiente na presença de água durante, pelo menos, um dia, opcionalmente durante, pelo menos, três dias, tal como durante, pelo menos, seis dias.
7. 7. Um método de preparação de uma composição farmacêutica, compreendendo a dissolução de um composto cristalino de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 num soro fisiológico, em que opcionalmente: a) a solução é estável à temperatura ambiente durante, pelo menos, 120 minutos; b) a solubilidade do composto cristalino é de, pelo menos, 50 mg/ml; e/ou c) a composição farmacêutica é formulada para administração oral, tópica, transdérmica ou parentérica, tal como para administração parentérica ou administração oral.
8. 8. Um composto cristalino de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para a utilização no tratamento de: a) um distúrbio hiperproliferativo, tal como leucemias agudas, leucemias crónicas, policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de cadeia pesada, sindrome mielodisplásico, leucemia de células pilosas, mielodisplasia, sarcomas e carcinomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, malignidade linfoide, cancro pancreático, cancro da mama, cancros do pulmão, cancro do ovário, cancro da próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma de dueto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cancro do colo do útero, tumor testicular, carcinoma da bexiga e tumores do SNC, ou b) uma condição resistente a CPA.
9. 9. Uma composição farmacêutica adaptada para administração oral, compreendendo um diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável e um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
10. 10. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 no fabrico de um medicamento para o melhoramento da eficácia de uma agência quimioterapêutica através da administração conjunta com um agente quimioterapêutico.
11. 11. Um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 para a utilização no melhoramento da eficácia de um agente quimioterapêutico através da administração conjunta com um agente quimioterapêutico. Lisboa, 15 de Setembro de 2015