PT2134374E

PT2134374E - Inibidores de btk para o tratamento quimioterapêutico de tumores epiteliais resistentes a fármacos

Info

Publication number: PT2134374E
Application number: PT87178406T
Authority: PT
Inventors: Marialuisa Lavitrano; Emanuela Grassilli; Kristian Helin
Original assignee: Bionsil S R L In Liquidazione
Priority date: 2007-03-14
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2014-03-03
Also published as: EP2550976A3; KR20100015529A; ES2447868T3; CY1115141T1; JP5832721B2; US20100081704A1; US8889643B2; KR101791981B1; CA2680589A1; US20130041014A1; US20130041012A1; US20130041013A1; HRP20140160T1; WO2008110624A2; DK2134374T3; US9820987B2; EP2546651A1; EP2550976A2; PL2134374T3; US8232085B2

Description

DESCRIÇÃO

INIBIDORES DE BTK PARA O TRATAMENTO QUIMIOTERAPÊUTICO DE TUMORES EPITELIAIS RESISTENTES A FÁRMACOS

Campo Técnico A presente invenção refere-se uma proteína isolada de acordo com as características indicadas no preâmbulo da reivindicação principal. Pretende-se também um método in vitro para reduzir a resistência ao fármaco em células tumorais epiteliais, bem como em células estaminais tumorais.

Estado tecnológico

Uma das estratégias mais seguidas na terapia de patologias neoplásicas prevê o uso de fármacos (quimioterapia), capazes de danificar o ADN das células do tumor, assim como induzir o processo natural de apoptose nas mesmas.

No entanto, sabe-se que as células tumorais podem responder de uma forma inesperada à terapia do fármaco, mostrando, pelo contrário, uma forte resistência ao mesmo. Sabe-se também que uma das principais razões para a resistência aos fármacos mostrada pelas células tumorais é a incapacidade das células para iniciarem o processo de apoptose, mesmo na presença de danos consideráveis no ADN.

Este fenómeno foi rastreado até a uma alteração funcional (mutação ou deleção) do gene p53, que já não é capaz de iniciar o processo de apoptose celular, levando as células a resistir à ação do fármaco. Os níveis de resistência a fármacos das células de tumor podem ser muito elevados. Por exemplo, no caso de células de tumor do cólon-recto, em 1 fase avançada, a terapia de fármacos com base em 5-fluorouracil (5-FU) mostra uma resposta eficaz apenas em cerca de 10-15% das células, e uma combinação de 5-FU com novos fármacos, tais como irinotecano e oxaliplatina, leva a um aumento da mortalidade de células até 40-50%, um valor que não é ainda inteiramente satisfatório para uma ação terapêutica eficaz para as patologias neoplásicas.

Em Clinicai Câncer Research vol. 8 (2002) p. 1224-1233 Uckun FM et al demostraram a atividade de quimiosensibilização de LFM A13 visando BTK em células de leucemia.

Os resultados mostrados em Biorganic & Medicinal Chemistry vol. 15 (2007) p. 800-814 por Uckun FM et al indicam que LFM A13 é um inibidor da proteína-quinase que tem um efeito anti-proliferativo em células de cancro da mama humano e células de glioblastoma. A WO 02/38797 relata a sequência de nucleótidos (número de acesso GenBank X58957) e a sequência de aminoácidos (número de acesso GenBank CAA41728) de BTK humano.

Nos últimos anos, um fenómeno celular foi descoberto chamado "interferência de ARN" (ARNi) , por meio do qual a expressão do gene é silenciada de uma maneira especifica. Ao tirar vantagem deste processo, é possivel obter o silenciamento seletivo de genes com função desconhecida, permitindo, assim, a definição da sua função especifica, através do estudo do fenótipo obtido. Através da aplicação de técnicas de ARNi e estudando os resultados fenotípicos, 2 é, além disso, possível atribuir novas funções a genes já conhecidos.

Os genes envolvidos no fenómeno da resistência aos medicamentos das células tumorais são hoje em grande parte desconhecidos. Há muito a necessidade, por isso, de identificar novos genes envolvidos na resistência aos fármacos, para a concepção de métodos e compostos capazes de diminuir substancialmente a resistência das células tumorais aos fármacos.

Descrição da invenção 0 problema subjacente à presente invenção é a produção de compostos disponíveis, capazes de reduzir a resistência ao fármaco das células de tumor do tipo epitelial, a fim de permitir o fabrico de medicamentos destinados à terapia de patologias neoplásicas afins. A invenção refere-se a uma proteína isolada da sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2, que codifica para uma isoforma da proteína BTK e o polinucleótido isolado que codifica a mesma, tendo um tal polinucleótido isolado a sequência do primeiro exão correspondendo à SEQ ID N°: 1.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona um método in vitro de acordo com a reivindicação 4, e o Kit farmacêutico de acordo com a reivindicação 7. 3

Breve descrição dos desenhos

As caracteristicas e vantagens da invenção serão mais claras a partir da descrição detalhada que se segue dos testes e resultados que conduziram à sua definição, descritos com referência ao desenho definido em que: A Figura 1 é um gráfico que ilustra os resultados da inibição da capacidade de formar colónias de células tumorais do cólon resistentes a fármacos tratadas com os compostos de acordo com a invenção e um fármaco quimioterapêutico,

As Figuras 2a e 2b são gráficos que mostram os resultados de uma análise de reversão da resistência de uma linha de células de tumor a dois fármacos quimioterapêuticos diferentes, por meio de silenciamento de isoformas alfa e beta do gene GSK3,

As Figuras 3a-3c são gráficos que ilustram os resultados dos testes de reversão da resistência a um fármaco quimioterapêutico de três linhas de células tumorais do cólon diferentes por meio de silenciamento do gene GSK3beta, A Figura 4a é um gráfico que ilustra os resultados dos testes de reversão da resistência a um fármaco quimioterapêutico diferente de duas linhas celulares de tumores do cólon diferentes por meio de silenciamento do gene GSK3beta, A Figura 4b é um gráfico que ilustra os resultados de uma análise de reversão da resistência de uma linha de células do tumor para a combinação de dois fármacos quimioterapêuticos diferentes, por meio de silenciamento da isoforma beta do gene GSK3, 4 A Figura 5 é um conjunto de imagens que ilustram o local do citocromo C por morte celular induzida por 5-FU, na ausência de GSK3. A Figura 6 um gráfico que ilustra os resultados de ensaios de ativação caspase 3 e caspase 7 em resposta ao tratamento com 5-FU, de genes silenciados HCT116, GSK3alfa e GSK3beta de células de carcinoma do cólon HCT116p53KO, A Figura 7 é um conjunto de imagens que ilustra a translocação de AIF para o núcleo durante a morte celular induzida por 5-FU, na ausência de GSK3, A Figura 8 é um gráfico que ilustra a reversão da resistência a um fármaco quimioterapêutico de uma linha de células de tumor realizada por meios de bloqueio funcional do gene BTK obtido com métodos diferentes, A Figura 9 é um gráfico que ilustra a percentagem de morte celular induzida por 5-FU sobre a superexpressão de BTK em células HCT116 de carcinoma do cólon,

As Figuras 10a e 10b são gráficos que ilustram a reversão da resistência a fármacos quimioterapêuticos, por meio do bloqueio funcional do gene BTK em diferentes linhas de células de tumor do cólon, A Figura 11 é uma análise de mancha de Western mostrando a expressão de BTK em várias linhas celulares tumorais derivadas de diferentes cancros epiteliais,

As Figuras 12a e 12b são gráficos que ilustram a reversão da resistência a fármacos quimioterapêuticos, por meio do bloqueio funcional do gene BTK linhas celulares tumorais epiteliais, excepto do cólon, 5 A Figura 13 é um conjunto de imagens que ilustram a acumulação citoplásmica do citocromo C em células tratadas com 5-FU, sobre a inibição de BTK, A Figura 14 é um gráfico que ilustra os resultados de ensaios fluorimétricos de ativação das caspases após 72 horas e 96 horas em células de carcinoma do cólon HCT116 e HCT116p53K0 tratadas com 5-FU, a inibição de BTK, ou a combinação dos dois, A Figura 15a é uma imagem de western blot mostrando que o anticorpo SC-1696 reconhece especificamente a proteína de BTK e que, em células de carcinoma epitelial (HCT116p53KO) BTK tem um peso molecular aparente de ~ 67 kDa e que a mesma forma da proteína está presente, em conjunto com a forma "clássica" de 77 kDa, também em células leucémicas (Nalm6) , A Figura 15b é uma imagem western blot de imunoprecipitação, confirmando que também um anticorpo diferente (BL7) identifica a proteína BTK como sendo ~ 67 kDa em células HCT116p53KO e que esta isoforma está presente em células leucémicas (Nalm6), juntamente com a forma "clássica" de 77 kDa, A Figura 16 é uma imagem que ilustra os resultados de uma experiência de PCR que mostra que a extremidade 5' a montante do nucleótido 202 em BTK codificando mARN a partir de células HCT116p53KO está ausente ou é diferente da extremidade 5' do mARN de BTK de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), A Figura 17 é uma imagem que ilustra os resultados de alinhamento ClustalW da transcrição de BTK, identificado pelo número de acesso GenBank # NM_000061, e a nova

transcrito identificada em células HCT116p53KO por PCR 6 5'RACE seguido por clonagem e seguenciação (indicado como alteARNtiva) , com a caixa que define o parte da sequência de BTK (a partir do nucleotideo 131 da transcrição conhecida) comum entre BTK mARN decorrente de # NM_000061 e a nova transcrição de BTK encontrada em HCT116p53K0, A Figura 18 é uma imagem que ilustra os resultados de um alinhamento Blast vs. uma base de dados do genoma de exons 1-5 de transcrição de BTK identificada pelo número de acesso GenBank # NM_000061 e os mesmos exões da nova transcrição de BTK, os pontos indicando a posição no cromossoma X dos diferentes exons de BTK, A Figura 19 é uma imagem que ilustra os resultados de uma experiência de PCR aninhada, mostrando que a nova transcrição de BTK é é expressa em BTK em tecidos tumorais embebidos em parafina fixados em formalina (FFPE) de pacientes de carcinoma do cólon.

Metodologia de identificação dos genes que modulam a resistência a fármacos em células tumorais epiteliais e testes de validação relacionados 0 problema técnico acima mencionado foi resolvido através da sujeição de várias linhas de células tumorais epiteliais a uma série de testes e análises orientadas para identificar e caracterizar os genes capazes de dar origem à expressão fenotípica de interesse, ou seja, a reversão da resistência à apoptose induzida por fármacos quimioterapêuticos.

Esta identificação foi realizada por meio de triagem fenotípica de uma linha de células representativa de 7 células tumorais epiteliais seguindo o silenciamento seletivo de um grupo alargado de genes por meio de ARNi.

Este trabalho complexo de triagem foi possível devido a uma biblioteca de vetores retrovirais pRetroSuper (PRS) recentemente realizados pelos laboratórios BeARNrds. Sabe-se que tais vectores são capazes de expressar uma molécula de oligonucleótido específico de uma maneira estável, conhecido como ARN de pequena interferência, resumidamente siARN, capaz de bloquear o processo de tradução de um ARN mensageiro especifico (mARN) na proteína correspondente. Tal mecanismo, em resumo, prevê que a molécula de siARN (ou um filamento do mesmo) seja associada com o complexo enzimático RISC, ativando-o, de modo que este último seja capaz de reconhecer e se ligar ao mARN complementar da mesma siARN associado e, em seguida, degradá-lo. Segue-se que o mARN, identificado de uma forma específica pela siARN, não pode ser traduzido na cadeia de aminoácidos correspondente, obtendo-se assim o silenciamento do gene a partir do qual o mARN foi transcrito. O processo de interferência é específico, de modo que uma molécula de siARN é normalmente capaz de degradar apenas um mARN e, por conseguinte, o silenciamento de um único gene. Por outro lado, em vez disso é possível que o mesmo mARN possa ser degradado, através RISC, por diferentes siARN.

Este mecanismo é um dos diversos modos possíveis para bloquear funcionalmente um gene (nocaute funcional). No entanto, a consequente degradação do siARN via RISC produz apenas um efeito transitório sobre os níveis de proteína, permitindo assim experiências só a curto prazo, cujos resultados podem não ser relevantes no longo prazo. Para superar este problema, ARNs curtos em gancho de cabelo 8 (shARNs) , uma sequência de ARN dobrado na forma de um gancho de cabelo, foi usada como um mecanismo para o nocaute funcional. Em resumo, um vector é utilizado para introduzir e incorporar o shARN no cromossoma da célula. A transcrição do ADN produz shARN que é subsequentemente clivado pela maquinaria celular, DICER, em siARN. 0 siARN então funciona como anteriormente mencionado. A incorporação do vector shARN no cromossoma da célula permite o silenciamento do gene a ser herdado pelas células filhas. Assim, o uso de shARNs permite o nocaute de células funcionais que podem ser utilizadas em experiências de longa duração. É também conhecido na literatura de que a eficiência da transfecção para os siARNs nunca é de 100%. Portanto, o uso de siARNs transfectados não garante que todas as células tratadas são privadas com êxito de uma proteína alvo. A ausência de um marcador selecionável cria ainda um problema em trabalhar com populações homogéneas de células. Utilizando um marcador de seleção, tal como um gene de resistência à puromicina, juntamente com uma biblioteca retroviral, permite a recuperação de apenas as células que transportam shARNs. Além disso, após a seleção da expressão shARN, apenas genes cujo silenciamento é compatível com a sobrevivência das células normais e proliferação são selecionados. A ausência destes genes não influencia a fisiologia celular normal, mas apenas a resposta a fármacos anticancro, uma consideração muito importante durante o desenvolvimento de terapia anticancro.

No entanto, é importante especificar que o mesmo efeito pode, em geral, ser alcançado pela ação em qualquer outra etapa do processo de codificação da proteína de um gene, 9 tal como, por exemplo, o passo de transcrição do gene em mARN, ou o passo de transdução de mARN, ou por meio da inibição da proteína resultante do processo de codificação. É evidente que o passo essencial e crítico para a resolução do problema é representado pela identificação do gene ou genes responsáveis do fenótipo desejado. A biblioteca retroviral providenciada pelos laboratórios Bernards consiste em cerca de 25000 elementos diferentes, capaz de silenciar cerca de 8300 genes do genoma humano, com uma proporção de cerca de três vectores diferentes para cada gene.

Os testes foram inicialmente realizados in vitro e posteriormente validados ex vivo em diferentes linhagens de células tumorais epiteliais, caracterizados pela falta de, ou pela mutação do gene p53 e, por conseguinte, fornecidas com uma acentuada resistência a fármacos quimioterapêuticos.

Em detalhe, foi criada uma biblioteca de ARNi humano (biblioteca NKi), composto de 8300 genes alvo para silenciar. Os genes alvo incluído quinases, fosfatases, oncogenes, supressores de tumor, fatores de transcrição, genes envolvidos na transformação, metástase, ciclo celular, diferenciação, apoptose, processos metabólicos e anabolizantes. Um protocolo foi seguido semelhante ao mencionado numa publicação prévia ( Berns et al., NATURE vol. 428, 25 de Março de 2004) . 10 A sequência de ARNm para cada gene alvo foi selecionada a partir de UniGene. As sequências foram mascaradas com RepeatMasker para remover as sequências repetitivas e pesquisar com NCBI BLAST contra UniVec para mascarar a contaminação do vetor. Foram desenhadas três sequências diferentes do nucleótido 19 (19-mer) para o silenciamento de cada um de genes alvo, para um total de aproximadamente 25000 oligonucleótidos 59-mer que especificam ARNs em gancho de cabelo curtos (shARNs). As sequências de 19-mer foram selecionadas usando um critério de seleção, como mencionado na publicação Berns que, a) não havia trechos de quatro ou mais resíduos consecutivos T ou A (para evitar sinais de terminação da transcrição da polimerase III prematuros) ; b) ter 30-70% de teor global de GC; c) estar dentro da sequência de codificação do gene alvo; d) começar com um resíduo G ou C (de acordo com regras estabelecidas para recentemente estirpes em viés); e) começar após um dímero AA na sequência flanqueada 5'; f) terminar imediatamente antes de um dupleto TT, TG ou GT na sequência flanqueada 3'; g) não conter locais de enzimas de restrição Xhol e EcoRI para facilitar o vaivém posterior da cassete nocaute em estruturas do vector; h) partilhar sítios de identidade mínima de sequência com outros genes; i) atingir todas as transcrições variantes representadas por RefSeq mRNAs; e j) não se sobrepor a outros 19-mer selecionados a partir da mesma sequência alvo. Os oligonucleótidos 59-mer foram concebidos de forma a conter uma sequência de 19-mer, complementar à sequência de 19-mer, sítio de iniciação da transcrição PolIII, sítio de terminação PolIII, e sítios de clonagem Hind III/BglII. Utilizando os sítios de clonagem Hind III/Bg/II, os oligonucleotídeos foram ligados em vetores retrovirais pRetroSuper (PRS), que incluíram uma cassete de seleção para a resistência à puromicina. O ADN a partir dos três vectores diferentes que tinham como alvo 11 o mesmo gene foi reunido e foram produzidos virus para infectar as células-alvo EXEMPLO 1 A linhagem de células tumorais utilizada foi inicialmente HCT116p53KO (que difere do tipo selvagem HCT116 devido à ausência do gene p53), relacionada com o tumor do cólon, enquanto estudos posteriores detalhados de genes específicos foram realizados em outras linhas de células tumorais do cólon resistentes a fármacos, tal como a DLD-1 e SW480, bem como em outras linhas de células de tumor do pulmão e do ovário. Em particular, todas as linhas celulares, objecto da análise, foram relacionadas com tumores do tipo epitelial.

Preliminarmente, as linhas celulares HCT116p53KO, DLD-1 e SW480 foram tratados com fármacos quimioterapêuticos comuns, a fim de confirmar a sua resistência à apoptose induzida por fármacos.

Os fármacos quimioterapêuticos utilizáveis em conformidade com a presente invenção podem ser de qualquer tipo adequado para induzir o processo de apoptose nas células tumorais afectadas, tais como, por exemplo, um antimetabolito ou qualquer agente danificador de ADN que compreende os inibidores da topoisomerase I, inibidores da topoisomerase II, compostos de coordenação de platina e agentes alquilantes.

Os testes preliminares acima referidos têm mostrado que, após o tratamento durante 72 horas em 200 μΜ de 5-FU, a 12 contra uma mortalidade celular foi inferior a 10%, mortalidade celular em peso de HCR116 superior a 95%.

Os exames complementares de ensaios formadores de colónias (CFA), têm, além disso, demonstrada como tal resistência ao fármaco era do tipo não-transitório.

Uma vez que a resistência à apoptose induzida por agentes quimioterapêuticos foi confirmada, 200xl06 de células HCT116p53KO foram infectadas com a biblioteca pRetroSuper acima identificada, fornecida pelos laboratórios Bernards. Cada vector desta biblioteca foi vantajosamente equipado com uma cassete de seleção para um gene de resistência à puromicina, de modo que foi possível selecionar as células HCT116p53KO realmente infectadas pelos vectores da biblioteca através de tratamento com puromicina (2 mg/1 no meio de cultura para dois dias).

No final do tratamento com antibióticos, as células ainda vivas foram então recolhidas, o que, por conseguinte, compreendia todas as células infectadas pelo retrovírus da biblioteca cujos genes silenciados, não foram incompatíveis com a sobrevivência celular.

As células assim obtidas foram então tratadas com 200 μΜ de 5-FU durante 72 horas, enquanto ao mesmo tempo as células HCT-116 em peso e as células não infectadas HCT116p53K0 foram também submetidas ao mesmo tratamento, como controlos. 13

No final do tratamento, verificou-se que cerca de metade das células estavam a flutuar no meio de cultura, portanto, mortas. Tais células representavam o fenótipo procurado, de maneira que foram recolhidas e submetidas ao tratamento necessário para a identificação dos genes silenciados pela biblioteca retroviral.

Em resumo, esses tratamentos compostos pela extração do ADN e amplificação por meio de PCR (Polymerase Chain Reaction), de uma região de 643 pares de bases contendo a região Hl do promotor especifico e a região adjacente que codifica a sequência de nucleótidos de interesse. A amplificação por PCR foi realizada utilizando um iniciador pRS-FW: 5'-CCCTTGAACCTCCTC GTTCGACC-3' e iniciador pRS-rev: 5'-GAGACGTGCTACTTCCATTTGTC-3'. Os produtos obtidos por amplificação foram então ligados em vectores retrovirais pRS e o processo de infecção de células HCT115p53KO foi completamente repetido com os novos vectores, assim como para refinar o rastreio. Os produtos foram digeridos com EcoRI/Xhol e reclonados com pRS.

Os produtos obtidos a partir do segundo tratamento com a amplificação por PCR no DNA extraído a partir de células mortas após novo tratamento com 5-FU, foram novamente isolados e ligados em vectores retrovirais pRS e, em seguida, utilizados para transformar bactérias DH5alfa cujos plasmídeos respectivos foram sequenciados para a identificação dos genes que deram origem à expressão fenotípica de interesse.

Uma vez que os genes individuais foram obtidos e identificados cujo silenciamento por meios de interferência 14 com o ARN deu origem à reversão da resistência das células tumorais testadas para o 5-FU, teve lugar a validação separada e independente dos genes individuais.

Em primeiro lugar, a validação foi realizada em amostras de células de tumor HCT116p53KO in vitro, cada uma das quais infectadas separadamente com um dos plasmídeos anteriormente feitos, de modo a silenciar de um modo especifico e estável um dos genes indicados pelo rastreio anterior e verificar a sua capacidade de modular a resistência a fármacos. As amostras foram selecionadas, em seguida, com puromicina, colocadas em placas de Petri, a 50% de confluência e tratadas com 200 μΜ de 5-FU durante 12 horas. A avaliação da reversão da resistência ao fármaco foi realizada por meio da observação da formação de colónias de acordo com o protocolo definido pelo CFA e a sua comparação com uma amostra de peso HCT116 e uma amostra HCT116p53KO não infectada.

Na Figura 1, os resultados são apresentados na forma de gráfico, que foram obtidos a partir desta primeira validação in vitro. Como claramente mostra o gráfico, uma elevada percentagem de genes identificados são capazes, quando funcionalmente bloqueados, de forma consistente reverterem a capacidade de formação de colónias de células HCT116p53KO tratadas com 5-FU. HCT116 e KO representam os controlos positivos e negativos. 15 particular em

Esta primeira validação, em particular, permitiu identificar um grupo de genes cuja silenciamento especifico deu origem a uma inibição do crescimento das colónias de tumor induzida por 5-FU maior do que 50% em relação à amostra HCT116p53KO.

Estes genes, conhecidos e caracterizados, estão listados abaixo com o seu símbolo oficial, juntamente com o seu número de identificação (entre parênteses) como consta do banco de dados do NCBI Entrez Gene:

EphAl (2041), o EphA2 (1969), EphA8 (2046), EphB2 (2048), CSF1R (1436), VEGFR2 (3791), RAMP2 (10266), RAMP3 (10268), CLRN1 (7401), MAPK4 (5596), PIK3C2A (5286), PIK3CG (5294), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213), DAPK1 (1612), JAK1 (3716), CHEKl (1111), PIM1 (5292), TRB3 (57.761), BTG1 (694), LATS1 (9113), LIMK2 (3985), MYLK (4638), ΡΑΚΙ (5058), PAK2 (5062), CDC2 (983), BTK (695), PNRC2 (55629), NCOA4 (8031), NR2C1 (7181), TPR (7185), RBBP8 (5932), TRPC7 (57113), FXYDl (5348), ERN1 (2081), PRSS16 (10279), RPS3 (6188), CCL23 (6368) e SERPINE1 (5054).

Entre os genes acima referidos, um primeiro subgrupo de genes é também identificável cujo silenciamento vantajosamente leva a uma inibição de mais de 75% do crescimento de células tumorais.

Tal primeiro subgrupo é constituído pelos seguintes genes:

EphAl (2041), o EphA2 (1969), EphA8 (2046), EphB2 (2048), CSF1R (1436), VEGFR2 (3791), RAMP2 (10266), RAMP3 (10268), MAPK4 (5596), PIK3C2A (5286), PIK3CG (5294), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213), DAPK1 (1612), JAK1 (3716), CHEKl (1111), PIM1 (5292), TRB3 (57.761), BTG1 (694), LATS1 16 (9113), LIMK2 (3985), ΒΤΚ (695), PNRC2 (55629), NC0A4 (8031), NR2C1 (7181), TPR (7185), TRPC7 (57113), FXYDl (5348), ERN1 (2081), RPS3 (6188) e SERPINE1 (5054).

De uma forma mais vantajosa, um segundo subgrupo de genes foi ainda identificado cujo silenciamento leva vantajosamente a uma inibição de mais de 95% do crescimento das células tumorais.

Tal subgrupo é formado pelos seguintes genes:

EphAl (2041), EphA2 (1969), EphA8 (2046), RAMP3 (10268), PIK3C2A (5286), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213), DAPK1 (1612), CHEK1 (1111), PIM1 (5292), BTK (695), NCOA4 (8031), TPR (7185). O gene GSKalpha (2931), isoforma do gene GSK3beta, deve ser adicionado aos genes acima referidos, em testes separados, cujos resultados são apresentados nos gráficos das Figuras 2a e 2b tem mostrado uma eficiência óptima na reversão da resistência tanto para o 5-FU e a oxaliplatina em células HCT116p53KO, inteiramente comparável com a sua isoforma beta. Em pormenor, a Figura 2a compara as percentagens de mortes de células na ausência (símbolo "-") e na presença (símbolo " + ") de 200 ym de 5-FU (tratamento de 72 horas) após o tipo selvagem (wt) de células HCT-116, as células resistentes a fármacos HCT116p53KO, células genéticas silenciadas GSK3alfa e GSK3beta. Em comparação com as células resistentes a fármacos HCT116p53KO, as células HCT116p53KO com genes silenciados GSK3alfa e GSK3beta resultaram numa percentagem elevada de morte de células tumorais, na presença de 5-FU. A Figura 2b compara os percentuais de mortes celulares na ausência (símbolo "-") e na presença (símbolo " + ") de 50 ym de oxaliplatina 17 (tratamento de 72 horas) sobre células wt HCT116, células resistentes a fármacos HCT116p53KO, células genéticas silenciadas GSK3alfa e GSK3beta. Em comparação com as células resistentes a fármacos HCT116p53KO, as células HCT116p53KO com genes silenciados GSK3alfa e GSK3beta também resultaram numa percentagem elevada de morte de células de tumor na presença de oxaliplatina. A confirmação formal do silenciamento dos genes específicos por meio da interferência foi realizada através da análise de Western blot dos níveis da proteína codificada por elas, se o anticorpo estava disponível comercialmente (EphAl, EphA2, CSF1R, VEGFR, GSK3, JAK1, CHEK1, LIMK2, CDC2, BTK) . A análise Western Blot foi realizada por lise das células selecionadas de puromicina em tampão de EIA (50 mM de Hepes pH 8; 500 mM de NaCl, 0,1% de NP-40, 1 M de DTT, 1 mM de EDTA). Electroforese em gel de 8-12% de SDS-poliacrilamida foi utilizada para separar 30 yg de proteína, que foi depois transferida para membranas de difluoreto de polivinilideno. Os anticorpos foram então utilizados para sondar os western blots. A eficácia dos plasmídeos capazes de silenciamento dos genes pertencentes ao grupo acima identificado foi ainda testada em outras linhas de células DLD-1 e SW480 de tumor do cólon conhecidas por possuírem p53 mutado e pela sua resistência a fármacos. A capacidade de diminuir a resistência a fármacos quimioterápicos geralmente foi confirmada, mesmo com diferentes performances. Em particular, a percentagem de inibição do crescimento de colónias após tratamento com 18 fármacos sobre todas as três linhas de células era óptimo quando os seguintes genes foram silenciados:

EphAl (2041), EphA2 (1969), EphA8 (2046) , EphB2 (2048), CSF1R (1436), VEGFR2 (3791), PIK3C2A (5286), PIK3CG (5294), GSK3alpha (2931), GSK3beta (2932), IRAK3 (11213) , CDC2 (983), CHEK1 (1111) , LATS1 (9113), TRB3 (57.761) , JAK1 (3716), BTK (695), PIM1 (5292), LIMK2 (3985), PAK2 (5062). EXEMPLO 2 (Exemplo Comparativo) A titulo de exemplo, nas Figuras 3a-3c são apresentados gráficos seguindo os ensaios de silenciamento do gene GSK3beta em três linhas celulares tumorais testadas, em que a fracção de células mortas após o tratamento com 5-FU em amostras infectadas com vectores capazes de silenciar o referido gene é relatada e comparada com as amostras infectadas com os vectores vazios. Em detalhe, a Figura 3a compara as percentagens de mortes celulares na ausência (símbolo "-") e na presença (símbolo "+") de 200 pm de 5-FU (tratamento de 72 horas) sobre células wt HCT116, células resistentes a fármacos HCT116p53KO e células genéticas silenciadas GSK3beta. Em comparação com as células resistentes a fármacos HCTl16p53KO, células HCT116p53KO com o gene silenciado GSK3beta resultaramu numa percentagem elevada de morte de células tumorais, na presença de 5-FU. A Figura 3b compara as percentagens de mortes celulares na ausência (símbolo "-") e na presença (símbolo "+") de 200 ym de 5-FU (tratamento de 72 horas) sobre células wt DLD-1 e células DLD-1 com os genes silenciados GSK3beta. Em comparação com as células WT DLD-1, as células DLD-1 com o gene silenciado GSK3beta resultaram numa percentagem elevada de morte de células tumorais, na presença de 5-FU. A Figura 3c compara as percentagens de mortes celulares na ausência (símbolo "-") e na presença (símbolo "+") de 200 19 ym de 5-FU (tratamento de 72 horas) sobre células SW480 wt e células SW480 com o gene silenciado GSK3beta. Em comparação com as células SW480 wt, as células SW480 com o gene silenciado GSK3beta resultaram numa percentagem elevada de morte de células tumorais, na presença de 5-FU.

Para além de 5-FU, um exemplo representativo da família de fármacos quimioterapêuticos do tipo antimetabólico, a reversão da resistência a fármacos também foi testada em fármacos quimioterapêuticos de diferentes tipos, tais como oxaliplatina.

Na Figura 4a, as fracções de células mortas induzidos por um tratamento com oxaliplatina (50 μΜ) são relatadas em amostras de linhas de células de tumor do cólon DLD-1 e SW480, respectivamente infectados com vectores vazios e com os vectores de silenciamento do gene de GSK3beta. A diminuição substancial da resistência à apoptose induzida por oxaliplatina na amostra em que GSK3beta foi silenciado é evidente. Na Figura 4b, é relatado um gráfico em que os resultados de um teste análogo são indicados na linha de células SW480, em que o fármaco utilizado foi uma combinação de 5-FU e oxaliplatina.

Tal como mencionado anteriormente e mostrado nas Figuras 2a e 2b, o silenciamento de GSK3alfa tem o mesmo efeito que o de GSK3beta em modular a resposta apoptótica a 5FU e oxaliplatina. 20

Um estudo adicional foi realizado para determinar se a morte celular induzida por 5-FU na ausência de GSK3 foi citocromo C dependente e independente. Utilizando o anti-citocromo C e coloração com DAPI, como mostrado na Figura 5, verificou-se que a morte celular induzida por 5-FU, na ausência da GSK3 é independente do citocromo-C. Mais especificamente, utilizando-se anti-AIF e coloração com DAPI, como mostrado na Figura 7, foi descoberto que na ausência de GSK3, AIF transloca para o núcleo, resultando na morte celular. Isto foi ainda apoiado pela descoberta de que as caspases 3 e 7 não foram ativadas durante a morte celular induzida por 5-FU em células GSK3 silenciadas, como mostrado na Figura 6. EXEMPLO 3

Um outro exemplo particularmente representativo do grupo de genes acima identificado é constituído pelo gene da BTK, sobre a qual várias investigações foram realizadas. A quinase BTK é uma proteína citoplasmática quinase de tirosina crucial para o desenvolvimento de células B e diferenciação. A mutação BTK é de facto responsável pela ligação X de agamaglobulinemia (XLA), uma imunodeficiência primária caracterizada principalmente pela falta de células B maduras, bem como pelos baixos níveis de imunoglobulinas. Em células B de BTK tem sido relatadas como tendo funções quer pró-apoptóticas ou anti-apoptóticas. Além disso, BTK foi até agora assumida como sendo expressa apenas em algumas linhagens derivadas da medula óssea, tais como células B e mastócitos, progenitoras eritróides, plaquetas. A nossa descoberta de que a BTK é um gene cujo silenciamento reverte a resistência à ação citotóxica de 5FU demonstra pela primeira vez que a BTK é expressa também 21 em outros tipos de células do que as células da linhagem hematopoiética. Em primeiro lugar, a eficácia de reversão da resistência a fármacos foi testada em células tumorais HCT116p53KO tratadas com um composto inibidor da proteína de BTK, para demonstrar que o bloqueio funcional do gene de interesse pode ser realizado de formas alternativas para o silenciamento por meio de ARNi. 0 composto utilizado nestes testes foi (2Z)-2-ciano-N- (2,5-dibromofenil)-3-hidroxi-2-butenamida, conhecido como LFM-A13, cuja fórmula estrutural é relatada abaixo na Fórmula 1.

Formula 1

Na Figura 8, os resultados do teste de comparação são referidos num gráfico do bloqueio funcional do gene BTK por meio de plasmídeos, siRNA ou LFM-A13 em amostras de células HCT116p53KO tratadas com 5-FU. Pode ser facilmente notado como o nível obtido de reversão para a resistência a fármacos, expresso por meio da fracção de percentagem de células mortas, é inteiramente comparável. Em detalhe, a Figura 8 compara as percentagens de mortes celulares na presença de 200 ym de 5-FU (tratamento de 72 horas) sobre células wt HCT116 e células resistentes a fármacos HCT116p53KO com ou sem (símbolo "vazio" e depleções

específicas de BTK seguido pela transfecção transitória siRNA (símbolo "BTKI"), interferência mediada por ARN 22 retroviral estável (símbolo "shBTK") e usando LFMA13, um composto inibidor de BTK.

De acordo com o efeito protetor de BTK revelado pelas experiências de inibição acima descritas, a superexpressão BTK protege o wt de HCT116 sensível da morte celular induzida por 5-FU. Em pormenor, a Fig. 9 compara as percentagens de mortes de células na presença de 200 pm de 5-FU (tratamento de 72 horas) sobre células de wt HCT-116 infectadas com o vector vazio pBabe, células wt HCT116 infectadas com o vector pBabe BTK e as células resistentes a fármacos HCT116p53KO.

Também foi determinado que a inibição de BTK reverte também a resistência à oxaliplatina (Figura 10a) e em DLD-1 (Figura 10b). A diminuição da resistência a fármacos quimioterapêuticos após o bloqueio funcional do gene BTK por meio de LFM-A13 foi ainda confirmada por meio de ensaios conduzidos in vitro sobre as linhas de células tumorais epiteliais diferentes daquelas do cólon. Na Figura 11 os níveis de BTK foram investigadas, por meio de Western blot, em várias linhas de células de carcinoma epitelial diferentes, mostrando que a quinase é expressa na maioria delas. Em particular, nas Figuras 12a e 12b, gráficos foram relatados dos testes de reversão obtidos nas linhas de células SKOV (relacionadas com um tumor do ovário) e linhas de células A549 (relacionados com um tumor do pulmão). 23

Em detalhe, a Figura 12a compara as percentagens de mortes de células na ausência (símbolo "NT" e e na presença de 200 ym de 5-FU, 50 μΜ de OxPt, e a combinação dos dois em células do ovário resistentes (SKOV) com ou sem inibição de BTK através da utilização de LMFA13. Em comparação com as células SKOV sem LMFA13, as células SKOV com LMFA13 resultaram numa percentagem elevada de morte de células tumorais. A Figura 12b compara as percentagens de mortes de células na ausência (símbolo "NT" e e na presença de 200 ym de 5-FU, 50 μΜ de OxPt, e a combinação dos dois em células de pulmão resistente (A549), com ou sem a inibição da BTK por meio do uso de LMFA13. Em comparação com as células A549 sem LMFA13, as células A549 com LMFA13 resultaram numa percentagem elevada de morte de células tumorais.

Em ambos os casos, observa-se como o tratamento das linhagens celulares com LFM-A13, inibidor funcional do gene BTK, conduz a um considerável aumento da mortalidade celular após exposição ao 5-FU ou oxaliplatina ou a ambos os medicamentos em combinação.

Além disso, a alta eficácia da ação de diminuição da resistência aos fármacos também nestas linhas de células, que confirma a validade dos resultados obtidos nos ensaios anteriores pode ser alargada, pelo menos, para todos os tipos de tumores epiteliais, tais como o tumor de pulmão, tumor do ovário e o tumor da mama. Os ótimos resultados apontados acima sugerem a validação do gene BTK também através de análise ex-vivo em amostras de tumores epiteliais humanos. Em primeiro lugar, verificou-se por meio de Western Blot que os níveis de proteína BTK estavam elevados em 30% das amostras de células de tumor de ovário 24 extraídas de pacientes em estado avançado da doença e/ou resistentes a fármacos quimioterapêuticos. Em segundo lugar, os exames foram realizados em células estaminais de tumor de cólon isoladas a partir de pacientes de modo a verificar se os genes estruturais foram expressos (e em que medida), também neste tipo de células. Na verdade, de acordo com estudos recentes (Dean et al., 2005), essas células estaminais seriam as principais responsáveis pela resistência aos fármacos.

Em todas as quatro linhas de células estaminais tumorais analisadas, isoladas de diferentes pacientes, a expressão da proteína de BTK é muito elevada, pelo menos 4-5 vezes maior do que a expressão detectada nas linhas celulares de carcinoma de cólon utilizadas nas experiências funcionais, o que sugere que a determinação dos níveis de BTK pode vantajosamente ser usada como um método para definir as propriedades das células estaminais des células de tumor examinadas, e, consequentemente, também a sua resistência a fármacos quimioterapêuticos.

Os resultados demonstraram que os níveis de BTK determinam a sensibilidade de células tumorais para o 5-FU e que a inibição de BTK inverte a resistência a fármacos. Imunocoloração anti-citocromo C em células tratadas com 5-FU (Figura 13) mostrou uma acumulação citoplasmática após o tratamento com 5-FU em células resistentes somente quando BTK foi inibida, apoiando a constatação de que a reversão da resistência a fármacos sobre a inibição de BTK é devido à ativação da apoptose. A mesma conclusão é também suportada pelo gráfico apresentado na Figura 14, a avaliação do nível de ativação das caspases 3/7 por tratamento com 5-FU em células resistentes HCT116p53KO na 25 presença ou na ausência de inibidor de BTK LFM-A13. Altos níveis de ativação de caspase 3/7, medidos por meio de um ensaio luminométrico como RLU/número de células, são observados em células HCT116p53KO tratadas com 5-FU apenas quando BTK é inibida. 0 peso molecular previsto e relatado da proteína BTK é de 77 kDa. A proteína identificada em western blot como BTK por um anticorpo específico (sc-1696, Santa Cruz Biotechnology) em HCT116p53KO e em todas as outras linhas de células de carcinoma epitelial testadas (6 linhas de células da mama, três linhas de células do ovário, 7 linhagens de células do pulmão, 5 linhas celulares do cólon), em contraste, possuem um peso molecular aparente em torno de 65-68 kDa (Figura 11, Figura 15a), sugerindo que, em linhas de células epiteliais é expressa uma isoforma mais curta de BTK.

Para confirmar estes resultados foi realizada uma análise de imunoprecipitação utilizando dois anticorpos BTK diferentes e específicas (SC-1696 acima citado e BL7, cedidos pelo Dr. Mike Tomlinson, da Universidade de Birmingham, Reino Unido). Os resultados na Figura 15b mostram que apenas esta nova isoforma é expressa em linhagens de células epiteliais enquanto numa linha celular de leucemia (Nalm6), já conhecida da literatura para expressar a forma 77 kDa clássica, ambas as isoformas estão presentes.

Portanto, foi realizada uma análise bioinformática da sequência codificadora (CDS) de BTK e, por conseguinte, tem sido identificado um segundo tripleto de nucleótidos ATG 26 (nt 428-430), em moldura com um conhecido por ser utilizado para traduzir BTK (nt 164-166) e passível de iniciar a tradução de uma proteína. O peso molecular esperado da proteína putativa traduzida a partir desta segunda ATG é de 67 kDa, consistente com o peso molecular aparente da banda identificada por diferentes anticorpos BTK em células de carcinoma epitelial. A fim de identificar qual a parte que falta do mARN que codifica para a isoforma mais curta e nova da proteína BTK, foram realizadas experiências de PCR utilizando pares de iniciadores diferentes (recozimento a diferentes partes das cds como indicado no diagrama superior da Figura 16) . Como mostrado na Figura 16, estas experiências indicam que a extremidade 5', a montante do nucleótido 202, está ausente ou é diferente em células HCT116p53KO.

Experiências de sequenciação 5'RACE foram efectuadas em mARN a partir de células HCT116p53KO, a fim de determinar a identidade da extremidade desconhecida 5'. Subsequentemente, a análise de alinhamento entre o cADN derivado de mARN a partir de células HCT116p53KO e o cADN derivada do BTK mARN padrão, identificado por GenBank # NM_00061, usando o programa de computador ClustalW (resultados mostrados na Figura 17) , demonstrou que a sequência a montante do segundo exão (a partir de 134 nt dos cds) é diferente do que relatada na literatura, isto é, as células epiteliais de carcinoma do cólon expressam um primeiro exão diferente. A análise BLAST utilizando uma base de dados genómica (Figura 18) localiza o primeiro exão de NM_000061 BTK transcrito em 101160K no cromossoma X contíguo, em correspondência com o início do locus BTK. Na variação, o 27 primeiro exão do novo transcrito BTK alinha 15192 pb 5' do primeiro exão BTK conhecido, imediatamente a jusante do locus RPL36A, sugerindo que isso corresponde a um exão BTK até agora não reconhecido. Além disso, este novo exão está presente em HCT116p53KO em vez do primeiro exão "clássico", sugerindo que se trata de uma "alternativa" ao primeiro exão, cuja utilização dá origem a um BTK mARN diferente, transcrito em células que expressam esta isoforma BTK mais curta. As experiências de sequenciação PCR demonstraram a expressão deste BTK mARN "alternativo" não só em todas as linhas celulares do carcinoma do cólon testadas (HCT116p53KO, DLD-1 e SW480), mas também em amostras 9/9 FFPE de pacientes com carcinoma do cólon (Figura 19).

Deve notar-se que o primeiro exão de BTK, conforme identificado por GenBank # NM_000061, corresponde a 5'UTR do mARN, sendo o tripleto ATG que codifica para o primeiro aminoácido Met da proteína BTK localizado no segundo exão. 5'UTRs geralmente desempenham funções regulatórias, tais como dirigir cap dependente ou tradução independente de IRES mediada por cap. Um primeiro exão diferente, tal como identificado na nova transcrição, pode, por conseguinte, determinar se um ATG diferente (neste caso, um ATG localizado no exão 4) tem de ser utilizado para iniciar a tradução da proteína BTK, e, por conseguinte, regular a expressão de diferentes isoformas. A sequência de nucleótidos do primeiro exão correspondendo a 5'UTR do novo mARN expresso pelo gene BTK está descrita na SEQ ID N°: 1, em anexo à presente descrição. 28 A sequência de aminoácidos da nova isoforma da proteína BTK codificada pelo novo transcrito é descrita na SEQ ID N°: 2, em anexo à presente descrição.

Os resultados acima sugerem um método para determinar a resistência das células tumorais a fármacos quimioterapêuticos, bem como um método para a identificação da presença de células estaminais do tumor, em que a expressão do gene da BTK compreende as etapas de verificação da presença da nova isoforma da proteína BTK. A presença da nova isoforma da proteína BTK pode ser controlada verificando a presença da proteína, por exemplo, utilizando transferência de Western ou imunoprecipitação ou análise imunoquímica ou de imunofluorescência, ou, de preferência, a verificação da presença de mARN que tem o primeiro exão alternativo, cujo cADN mostra a sequência de nucleótidos definida na SEQ ID N°: 1. 0 último pode ser vantajosamente levado a cabo por meio de análise de PCR, utilizando preferencialmente iniciadores possuindo uma sequência incluída na SEQ ID N°: 1.

Este novo método é esperado demonstrar as vantagens relevantes, relativamente à técnica anterior conhecida, particularmente quando utilizada para a análise de tecidos tumorais tomados a partir de pacientes humanos.

Na verdade, é bem sabido que os tecidos tumorais tomados a partir de pacientes humanos, podem conter uma quantidade eficaz de linfócitos que também podem expressar a proteína 29 BTK, perturbando assim a busca da proteína BTK expressa pelas células tumorais.

No entanto, a proteína BTK expressa por linfócitos é a isoforma "clássica" da proteína BTK tendo um peso molecular de 77 kDa, de modo que a busca de novas isoformas da proteína BTK pode ser levada a cabo sem qualquer interferência, com uma simples análise de PCR procurando a presença de BTK mARN tendo o primeiro exão alternativo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Università degli Studi di Miiano - Bieooca Lavitrano, Marialuisa Grassiiíi, Emanuela Helin, Kristian <120> Modulaior compounds of the drug resistance in epíthelial turnour cells <130> B E004398- PCT356 <160>2 <170> Patentln version 3.3 30 60 <210> 1 <211> 300 <212> DNA <213> Ηοιηο sapíens <400> 1 120 180 240 300 ttttggtgga ctctgctacg tagtggcgtt cagtgaaggg agcagtgttt ttcccagatc ctctggcctc cccgtccccg agggaagcca ggactagggt cgaatgaagg ggtcctccac ctccacgttc cattcctgtt ccacctcaag gtcactggga acacctttcg cagcaaactg çtaattcaat gaagacctgg agggagccaa Ctgttccagt tcatctatca catggccagt tggtccattc aacaaatggt tattggatgc ccattatgtg gcaggcactg ttccggggga <210 2 <211 >571 <212> PRT <213> Hemo sapiens <400> 2

Met Glu Gin Ile Ser Ile Ile Glu Arg Phe Pro Tyr Pro Phe Gin Vai 1 5 10 15

Vai Tyr Asp Glu Gly Pro Leu Tyr Vai Phe Ser Pro Thr Glu Glu Leu 20 25 30

Arg Lys Arg Trp Ile His Gin Leu Lys Asn Vai Ile Arg Tyr Asn Ser 35 40 45

Asp Leu Vai Gin Lys Tyr Hig Pro Cys Phe Trp Ile Asp Gly Gin Tyr 50 55 60

Leu Cys Cys Ser Gin Thr Ala Lys Asn Ala Met Gly Cys Gin Ile Leu 65 70 75 80

Glu Asn Arg Asn Gly Ser Leu Lys Pro Gly Ser Ser His Arg Lys Thr 31 85 90 95

Lys Lys fira Lei, Pro Pro TM Pró' Glu Slu:: Asp Gin Ile Leu Lys Lys 10G 105 110

Pro Leu Proí Pro Glu Pro Ala Ala AlaPro Vai Ser Thr SM Glu, Leu 115 .120 '225:

Lys Lyà Vai Vai Ala Leu Tyr Asp Tyr Met Pró Mét Asn Ala Asπ Asp ISO 1Ϊ> 240

Leu Gin Leu Arg Lys Gly Asp Glu Tyr Phe Ile Leu Glu Glu Ser Asrt 145 150 155 160

Leu Pro Trp Trp Arg Ala Arg Asp Lys Asn Gly Gin Glu Gly Tyr Ile 165 170 115

Pro Ser Asp Tyr Vai |hr Glu Ala Glu Asp Ser Ile Glu Met Tyr Glu 180 185 390

Trp Tyr Ser Lvs Bis Met Thr Arg Ser Gin Ala Glu Gin Leu Leu Lys 195 200 205

Glu. Glu Gly Lys Glu Gly Gly Phe IJe Vai Arg Asp Ser Ser Lys Ala 210 " 215 220

Gly Lys Tyr Thr Vai Ser Vai Phe Ala Lys Óer Thr Gly Asp Pro Gin 22Í ' .....230 " ÉÍ5 24|

Gly Vai He Arg His Tyr Vai Vai Cys :Ser Thr· Pro Gin Ser Gin Tyr 245 :250 255

Tyr His Gin His Asn Ser Ma Gly Leu lie Ser Arg Leu lys Tyr Pro 275 280 285

Vai ;S©:r GIH .Sln Asn Ay®: Asr; Ala Pro Ser Thr Ala Gly Leu Gly Tyr 250 295 300 .Gly Se.? Trp Glu Ile Asp Pro Lys Asp Leu Thr Phe Leu Lys Glu !©» 305 3 Í0: :3i5 ............. 320

Gly Thr Gly Gin Phe Gly Vai Vai. Lys Tyr Gly Lys Trp Arg Gly Gin 32:5 330 333 32

Tyr Asp Vai Ala Ile Lys Met Ile Lys Glu Gly Ser Met Ser Glu Asp 340 345 350

Glu Phe Ile Glu Glu Ala Lys Vai Met Met Asn Leu Ser His Glu Lys 355 360 365

Leu Vai Gin Leu Tyr Gly Vai Cys Thr Lys Gin Arg Pro Ile Phe Ile 370 375 380

Ile Thr Glu Tyr Met Ala Asn Gly Cys Leu Leu Asn Tyr Leu Arg Glu 385 390 395 400

Met Arg His Arg Phe Gin Thr Gin Gin Leu Leu Glu Met Cys Lys Asp 405 410 415

Vai Cys Glu Ala Met Glu Tyr Leu Glu Ser Lys Gin Phe Leu His Arg 420 425 430

Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Leu Vai Asn Asp Gin Gly Vai Vai Lys 435 440 445

Vai Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Tyr Vai Leu Asp Asp Glu Tyr Thr 450 455 460

Ser Ser Vai Gly Ser Lys Phe Pro Vai Arg Trp Ser Pro Pro Glu Vai 465 470 475 480

Leu Met Tyr Ser Lys Phe Ser Ser Lys Ser Asp Ile Trp Ala Phe Gly 485 490 495

Vai Leu Met Trp Glu Ile Tyr Ser Leu Gly Lys Met Pro Tyr Glu Arg 500 505 510

Phe Thr Asn Ser Glu Thr Ala Glu His Ile Ala Gin Gly Leu Arg Leu 515 520 525

Tyr Arg Pro His Leu Ala Ser Glu Lys Vai Tyr Thr Ile Met Tyr Ser 530 535 540

Cys Trp His Glu Lys Ala Asp Glu Arg Pro Thr Phe Lys Ile Leu Leu 545 550 555 560

Ser Asn Ile Leu Asp Vai Met Asp Glu Glu Ser 565 570 33

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Proteína isolada da sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2, que codifica para uma isoforma da proteína BTK.
2. Polinucleótido isolado que codifica para a proteína isolada de acordo com a reivindicação 1.
3. Polinucleótido da reivindicação 2, possuindo a sequência do primeiro exão correspondendo à SEQ ID N°: 1 4. ;étodo in vitro para reduzir a resistência ao fármaco de células tumorais de tipo epitelial, compreendendo o passo de bloquear seletivamente funcionalmente um gene BTK por: a. a. uma molécula oligonucleotídica de ARN de pequena interferência (siRNA); ou b.
LFM-A13, em que o gene BTK codifica uma isoforma da proteína tendo um peso molecular entre 65 e 68 kDa da sequência de aminoácidos SEQ ID N°: 2
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que as referidas células de tumor são células estaminais.
6. Composto capaz de bloquear funcionalmente o gene BTK, para utilização na diminuição da resistência a fármacos quimioterapêuticos para o tratamento terapêutico de patologias tumorais epiteliais, em que o referido composto é uma molécula oligonucleotídica de ARN de pequena interferência (siRNA), ou LEM-A13.
7. Kit farmacêutico compreendendo uma molécula oligonucleotídica de ARN de pequena interferência (siRNA) ou LFM-A13 capaz bloquear funcionalmente e seletivamente um gene BTK, e um fármaco quimioterapêutico, escolhido a partir do grupo consistindo em 5-fluorouracil, oxaliplatina ou oxaliplatina em mistura com 5 - fluorouracil, em que o referido kit é para utilização no tratamento de patologias tumorais epiteliais. Kit farmacêutico para utilização de acordo com a reivindicação 7, em que as patologias tumorais epiteliais são escolhidas a partir do grupo consistindo em tumores do cólon, da mama, do pulmão e dos ovários.