PT1982190E

PT1982190E - Composições farmacêuticas e métodos de vacinação contra a candidíase disseminada e outros agentes infecciosos

Info

Publication number: PT1982190E
Application number: PT07709622T
Authority: PT
Inventors: John E Edwards; Scott G Filler; Ashraf Ibrahim; Yue Fu; Brad J Spellberg; Michael Yeaman
Original assignee: Los Angeles Biomed Res Inst
Priority date: 2006-01-06
Filing date: 2007-01-05
Publication date: 2012-10-22
Also published as: US20070077256A1; CA2636277C; CA2636277A1; ES2608354T3; DK1982190T3; JP2014148547A; EP2532361A1; AU2007205065B2; EP1982190B1; ES2391580T3; JP5692963B2; WO2007081896A3; US10300120B2; EP2532360B1; EP2428800B1; JP2009524601A; JP2012255031A; EP1982190A4; ES2608309T3; AU2007205065A1

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E MÉTODOS DE VACINAÇÃO CONTRA A CANDIDÍASE DISSEMINADA E OUTROS AGENTES INFECCIOSOS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a proteínas de adesão da superfície de Candida albicans e a vacinas para a prevenção e/ou tratamento de uma infeção por Staphilococcus aureus.

Nos últimos anos houve um aumento dramático na incidência de infeções nosocomiais provocadas por espécies de Candida. A incidência de infeções por Candida hematologicamente disseminadas aumentou 11 vezes de 1980 para 1989. Esta incidência crescente progrediu nos anos de 1990. As infeções por espécies de Candida são agora a quarta causa mais comum de septicemia nosocomial, são iguais às da Escherichia coli e superam a incidência provocada por espécies de Klebsiella. Além disso, as espécies de Candida são a causa mais comum de infeções fúngicas profundas em doentes com queimaduras extensas. Até 11% dos indivíduos que sofrem transplante de medula óssea e 13% daqueles que possuem um transplante ortotópico de fígado desenvolverá uma infeção invasiva por Candida. A Candida albicans, o agente patogénico principal neste género, pode alternar entre duas morfologias: as fases de blastosporo (levedura em gemulação) e filamentosa (hifas e pseudo-hifas). Os mutantes de Candida com deficiência nos genes que regulam a filamentação são descritos como tendo menor virulência em modelos animais. Esta menor virulência sugere que a capacidade de mudar de um blastosporo para um filamento é um fator de virulência chave da C. albicans. 2

Até à data não foram identificados quaisquer efetores essenciais destas vias de filamentação na C. albicans. Ver Caesar-TonThat, T.C. e J.E. Cutler, "A monoclonal antibody to Candida albicans enhances mouse neutrophil candidacidal activity," Infect. Immun. 65:5354-5357, 1997.

As infeções por staphilococcus aureus também são comuns e resultam cada vez mais em resistência farmacológica a antibióticos. Por exemplo, o S. aureus é uma causa comum de infeções da pele e estrutura da pele, endocardite e bacteriemia nos E.U.A. e em todo o mundo. Antigamente, as infeções por S. aureus adquiridas na comunidade (CA-5. aureus) eram quase uniformemente suscetíveis a beta-lactamas resistentes a penicilinase tais como cefazolina, oxacilina, meticilina, penicilina e amoxicilina. No entanto, na última década, foram observadas epidemias de infeção por S. aureus resistentes a beta-lactamas (MRSA) em vários locais em todo o mundo, especialmente de MRSA adquirido na comunidade (CA-MRSA). Em muitos lugares, o MRSA tornou-se a estirpe predominante de S. aureus que origina infeções CA. Um estudo prospetivo, recente, de base populacional em três estados nos E.U.A. estimou que a incidência de infeções por CA-MRSA é de 500 casos por 100 000 habitantes, o que se traduz em aproximadamente 1,5 milhões de casos por ano apenas nos E.U.A.. A frequência crescente de infeções por S. aureus resistente a fármacos realça a necessidade de novas maneiras para prevenir e tratar estas infeções. A identificação de efetores nas vias reguladoras do organismo que contribuem para a virulência oferece uma oportunidade para intervenção terapêutica com métodos ou composições que são superiores aos agentes antifúngicos existentes. A identificação de proteínas da superfície 3 celular que afetam uma via reguladora envolvida na virulência é particularmente promissora porque a caracterização da proteina permite técnicas imunoterapêuticas que são superiores aos agentes antifúngicos existentes no combate a uma infeção por Candida. A virulência da Candida albicans é regulada por vários fatores de virulência putativos dos quais a aderência a constituintes do hospedeiro e a capacidade de se transformar de levedura em hifas estão entre os mais criticos para determinar a patogenicidade. Apesar de existirem agentes antifúngicos potentes que são microbicidas para a Candida, a mortalidade atribuível à candidemia é de aproximadamente 38%, mesmo com tratamento com agentes antifúngicos potentes tais como a anfotericina B. Além disso, os agentes existentes tais como a anfotericina B tendem a exibir toxicidade indesejável. Embora possam ser desenvolvidos outros antifúngicos que são menos tóxicos do que a anfotericina B, é pouco provável que sejam desenvolvidos agentes que são mais potentes. Por conseguinte, a imunoterapia passiva ou ativa para tratar ou prevenir a candidiase disseminada é uma alternativa promissora à terapia antifúngica corrente.

Mamo et al. (Microbiol. Immunol. 2000;44(5):381-4) refere-se à proteção induzida em ratos vacinados com proteina de ligação a colagénio recombinante (CnBP) e alfa-toxóide contra a infeção por desafio intramamário com Staphilococcus aureus.

Além disso, Sheppard et al., (J. Biol. Chem. 2004 Jul 16; 279 (29) :30480-9) refere-se à diversidade funcional e estrutural na familia de proteínas Ais de Candida albicans. 4

Adicionalmente, Nilsson et al. (J. Clin. Invest 1998 Jun 15; 101 (12):2640-9) refere-se à vacinação com um fragmento recombinante de adesão de colagénio proporciona proteção contra morte sética mediada por Staphilococcus aureus.

Assim, existe uma necessidade de imunogénios eficazes que proporcionarão proteção imunitária e imunoproteção passiva do hospedeiro contra Candida, S. aureus e outros agentes patogénicos imunogenicamente relacionados. A presente invenção satisfaz esta necessidade e proporciona ainda vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona uma vacina incluindo um membro da família de proteínas Ais isolado possuindo atividade de adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, opcionalmente com um adjuvante num meio farmaceuticamente aceitável. 0 membro da família de proteínas Ais pode ser derivado de uma estirpe de Candida selecionada do grupo consistindo de Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida parapsilosis e o membro da família de proteínas Ais inclui Alslp, Als3p, Als5p, Alsôp, Als7p ou Als9p. É também proporcionado um membro da família de proteínas Ais isolado com origem em Candida possuindo atividade de adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, para ser utilizado num método de tratamento ou prevenção de uma infeção por Staphilococcus aureus num corpo humano ou animal. O método inclui administrar uma quantidade imunogénica de uma vacina de um membro da família de proteínas Ais isolado possuindo atividade de 5 adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, num meio farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura ΙΑ, 1B mostram a mediação a aderência de Alslp de C. albicans a células endoteliais da veia umbilical humana. Os valores representam a média ± DP de pelo menos três experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. (A) Aderência de células endoteliais de mutantes ALS11/als2 alsl/alsl e complementados com ALS1 e CAI12(30) de tipo selvagem (B) Aderência de células endoteliais de mutante PADHi-ALS1 que sobreexpressa ALS1, em comparação com C. Albicans de tipo selvagem. 0 tratamento estatístico foi obtido pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon e corrigido para comparações múltiplas com a correção de Bonferroni. *P<0,001 para todas as comparações. A Figura 2A-D mostra a localização na superfície da célula de Alslp em filamentos de C. albicans por imunofluorescência indireta. A filamentação de C. albicans foi induzida incubando células de levedura em meio RPMI 1640 com glutamina durante 1,5 horas a 37°C. A Alslp foi detetada incubada organismos primeiro com mAb anti-Alslp de rato seguido de IgG anti-rato de cabra marcada com FITC. A superfície celular de C. albicans foi também revelada com Ab policlonal anti-C. albicans conjugado com Alexa 594 (Molecular Probes, Eugene, OR) . As áreas com revelação amarela representam a localização de Alslp. (A) C. albicans de tipo selvagem. (B) estirpe mutante alsl/alsl. (C) alsl/alsl complementada com ALS1 de tipo selvagem (D) mutante de sobreexpressão PADHi-ALS1. 6 A Figura 3A, 3B mostra a mediação de Alslp na filamentação de C. albicans em meio sólido. Os blastosporos de C. albicans foram aplicados em placas de ágar de Lee e incubados a 37°C durante 4 dias (A) ou 3 dias (B). A Figura 4A, 4B mostram o controlo da expressão de ALS1 e a mediação da filamentação de C. albicans pela via reguladora de filamentação EFG1. (A) Análise de transferência de Northern que mostra a expressão de ALS1 em (i) mutantes deficientes em várias vias reguladoras de filamentação. (ii) mutante efgl/efgl complementado com EFG1 ou PADHi-ALS1. 0 ARN total foi extraído de células cultivadas em meio RPMI 1640 + glutamina a 37°C durante 90 minutos para induzir filamentação. As manchas foram sondadas com ALS1 e TEF1. (B) Fotomicrografias do mutante efgl/efgl e mutante efgl/efgl complementado com PAdhi_ALS1 cultivado em placas de ágar de Lee a 37°C durante 4 dias. A Figura 5A, 5B mostram a redução de virulência no modelo de candidiase hematologicamente disseminada em rato por (A) Ratos Balb/C machos (n = 30 for cada estirpe de levedura) foram injetados com blastosporos em fase estacionária (106 por rato em 0,5 mL de PBS) . As curvas são os resultados compilados de três experiências repetidas (n = 30 ratos para cada estirpe) . Os tempos de duplicação de todas as estirpes, cultivadas em YPD a 30°C, variaram entre 1,29 a 1,52 horas e não foram estatisticamente diferentes uns dos outros. A análise de transferência de Southern do ADN cromossómico total foi utilizada para combinar a identidade do genótipo das estirpes de C. albicans recuperadas de órgãos infetados com as de estirpes de C. albicans utilizadas para infetar o ratos. A análise estatística foi obtida pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon e corrigida para comparações múltiplas com a correção de 7

Bonferroni. *P<0,002 para o mutante alsl/alsl contra cada uma das outras estirpes. (B) Micrografias histológicas de rins infetados com C. albicans de tipo selvagem, mutante alsl nulo homozigótico ou mutante complementado com ALS1 heterozigótico. As amostras de rim foram recuperadas 28 horas (a) ou 40 (b) horas após infeção, fixadas em paraformaldeido e secções foram reveladas com prata (ampliação X400). As setas denotam células de C. albicans. A Figura 6 mostra o efeito profilático de anticorpo anti-ALS contra candidiase disseminada como uma função dos animais sobreviventes ao longo de um periodo de 30 dias para animais infundidos com poli-soro anti-Alslp. A Figura 7 é um alinhamento da sequência de polipéptido da porção N-terminal de polipéptidos de ALS selecionados organizados por fenótipo de aderência. As três linhas de cima são as sequências dos polipéptidos ALS1, 3 e 5 (SEQ ID NOS: 1-3, respetivamente), os quais ligam células endoteliais. As três do fundo são as sequências dos polipéptidos ALS6, 7 e 9 (SEQ ID NOS; 4-6, respetivamente), os quais não ligam células endoteliais. A última linha representa a sequência consenso da familia de polipéptidos ALS (SEQ ID NO:7). A Figura 8 mostra que as proteínas Ais conferem propriedades de aderência especificas em relação ao substrato quando expressadas de forma heteróloga em Saccharonzyces cerevisiae. Cada painel demonstra a percentagem de aderência de uma estirpe de expressão de Alsp (barras a cheio) a uma variedade de substratos aos quais se sabe que a C. albicans adere. A aderência de S. cerevisiae transformada com o vetor vazio (barras vazias) é incluida em cada painel como um controlo negativo. Gel, gelatina; FN, fibronectina; LN, laminina; FaDU, células epiteliais FaDU; EC, células endoteliais. *, p < 0,01 quando comparado com o controlo de plasmídeo vazio por análise de variância unifatorial. Os resultados são a média ± D.P. de pelo menos três experiências realizadas em triplicado. A Figura 9 mostra a troca de dominio que demonstra que a aderência especifica em relação ao substrato é determinada pela composição do dominio N-terminal das proteínas Ais. A representação do gene de ALS ou construção a ser testada é representada como uma barra constituída por sequências de ALS5 (preto) ou ALS6 (branco). As propriedades de aderência de cada mutante são exibidas como uma fotomicrografia ilustrando a aderência de S. cerevisiae transformada a esferas revestidas com fibronectina e um gráfico que demonstra a aderência a gelatina (barras pretas) e células endoteliais (barras cinzentas) como medida no ensaio de placa de 6 poços. Os resultados são a média ± D.P. de pelo menos três experiências, cada uma realizada em triplicado. A Figura 10 mostra um subconjunto de proteínas Ais que medeiam a invasão de células endoteliais quando expressadas em S. cerevisiae. A, aderência a células endoteliais por estirpes de S. cerevisiae que expressam proteínas Ais ou transformadas com o plasmídeo vazio (controlo). Os dados representam o número total de organismos associados a células endoteliais e são expressados como células por campo de alta potência. B, grau de invasão de células endoteliais por estirpes de S. cerevisiae que expressam Alsp apresentado como o número de organismos intracelulares por campo de alta potência. *, p < 0,01 quando comparado com o controlo de plasmídeo vazio por análise de variância 9 unifatorial. Os resultados são a média ± D.P. de pelo menos três experiências realizadas em triplicado. A Figura 11 mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos N-terminal de proteínas Ais de função conhecida que demonstra um padrão alternado de CRs e HVRs. A, percentagem de identidade consenso entre as regiões N-terminais de proteínas Ais de função conhecida. Refira-se que não é mostrada a região do péptido sinal (aminoácidos 1-20) . As caixas abertas indicam as regiões designadas como HVRs 1-7. B, alinhamento esquemático de proteínas Ais (SEQ ID NOS:1-6, respetivamente) que mostram a composição das HVRs individuais. As sequências são organizadas para comparar proteínas com uma afinidade para vários substratos com aquelas que ligam poucos ou nenhuns substratos identificados. 0 número de aminoácidos em cada região conservada é indicado entre parênteses. A Figura 12 mostra os espetros de CD e FTIR do domínio N-terminal da proteína Alsl. A, espetro de dicroísmo circular de Alslp 10 μΜ em soro fisiológico tamponado com fosfato. B, espetro de FTIR da auto-película de Alslp hidratada com vapor de D20. A Figura 13 mostra uma comparação das propriedades físico-químicas previstas dos domínios N-terminais entre a família de proteínas Ais. As características hidrófobas, eletrostáticas ou de ligação de hidrogénio são previstas nas superfícies acessíveis à água de cada domínio. As hidrófobas são mostrados como se segue: castanho, mais hidrófoba; azul, mais hidrófila. As eletrostáticas (contínuo espetral) são mostradas como se segue: vermelho, carga mais positiva (+10 kcal/mol); azul, carga mais negativa (-10 kcal/mol). O potencial de ligação de hidrogénio (H ligação) é mostrado como se segue: vermelho, 10 doador; azul, aceitador. As proteínas Ais podem ser distinguidas em três grupos com base na composição destas propriedades. Por exemplo, observe os perfis hidrófobo, eletrostático e de ligação de hidrogénio semelhantes entre as proteínas Ais do grupo A, Alslp, Als3p e Als5p. Em contraste, os membros Ais do grupo B, Als6p e Als7p, exibem diferenças marcantes nas características hidrófobas e eletrostáticas daquelas do grupo A de Ais. Além dos perfis bioquímicos, observe as diferenças na estrutura prevista entre estes domínios.

Figura 14. Modelo conceptual das relações estrutura-função nas proteínas da família Ais. As proteínas Ais são constituídas por três componentes gerais: um domínio N-terminal, repetições em série e um domínio C-terminal rico em serina/treonina contendo uma âncora de glicosilfosfatidilinositol que estabelece a interface com a p+arrede celular de C. albicans. Como ilustrado, as proteínas Ais contêm várias regiões em folha β antiparalelas conservadas (CRl-n) que são interrompidas por vãos longos, característicos da superfamília de imunoglobulinas. A partir dos domínios de folha β projetam-se estruturas em ansa/espiral contendo as HVRs. As propriedades físico-químicas tridimensionais de HVRs específicas da proteína Ais provavelmente governam as interações com os substratos do hospedeiro que conferem funções adesivas e invasivas à Candida. Para fins ilustrativos, sapo mostrados apenas três domínios N-terminais de folha β/espiral e as respetivas componentes CR/HVR. Refira-se que esta projeção é vista em ângulos retos em relação às imagens estruturais mostradas na Fig. 13.

Figura 15. A imunização de ratos (reprodutores retirados) com rAlslp-N melhora a sobrevivência durante candidíase 11 disseminada posterior. Sobrevivência de ratos imunizados com Alslp e adjuvante. N = 16 ratos por grupo em experiências em duplicado em dias diferentes; Adj. = adjuvante. *p < 0,05 vs adjuvante.

Figura 16. A imunização com rAlslp-N melhora a sobrevivência de ratos reprodutores retirados e juvenis. Sobrevivência de ratos reprodutores retirados (A) e juvenis (B) infetados com um inoculo 106 de C. Albicans, rapidamente fatal. N = 16 ratos por grupo em experiências em duplicado em dias diferentes; Adj. = adjuvante. *p < 0,05 vs controlo de adjuvante.

Figura 17. Os titulos de anti-rAlslp-N não correlacionam com a sobrevivência. Titulos de anticorpos policlonais anti-rAlslp-N gerados em ratos Balb/c imunizados com doses variáveis de rAlslp-N com ou sem adjuvante. Adj. = adjuvante. *p ^ 0,005 para 200 yg vs. todos os outros.

Figura 18. Apenas a dose de proteção de rAlslp-N induz um aumento em esplenócitos Thl estimulados por C. albicans. Indução de esplenócitos Thl (CD4 + IFN-y+IL-4) e Th2 (CD4+TFN-y~IL-4 + ) por doses diferentes da vacina de rAlslp-N. Os esplenócitos de ratos imunizados (n = 9 por grupo) foram estimulados durante 48 h com C. albicans pré-germinada morta termicamente e em seguida analisados por citometria de fluxo tricolor. *p = 0,03 vs. adjuvante.

Figura 19. Apenas a dose de proteção de rAlslp-N induz um aumento na hipersensibilidade de tipo retardada estimulada por rAlslp-N. Hipersensibilidade de tipo retardada, avaliada por tumefação da planta da pata, em ratos (n = 9-12 por grupo) vacinados com rAlslp-N ou CFA sozinho. Os ratos foram imunizados com a quantidade indicada de rAlslp- 12 N e em seguida injetados com 50 yg de rAlslp-N na planta da pata. A tumefação da planta da pata foi avaliada 24 h depois. *p < 0,05 versus adjuvante, 0,2 yg e 200 yg.

Figura 20. A vacina de rAlslp-N requer células T, mas não células B, para induzir imunidade protetora. A sobrevivência de ratos com deficiência em células B, com deficiência em células T (glabros) e ratos Balb/c de tipo selvagem congénicos de controlo (n = 7 ou 8 por grupo) foi simultaneamente avaliada após vacinação com rAlslp-N + adjuvante ou adjuvante sozinho. *p < 0,04 versus adjuvante sozinho, 'p = 0,003 versus tipo selvagem tratado com adjuvante.

Figura 21. A vacinação SQ com rAlslp-N induz uma resposta DTH in vivo em ratos imunocompetentes. A tumefação da planta da pata foi avaliada 24 h após injeção de 50 yg de rAlslp-N na planta da pata em ratos BALB/c (n = 10 por grupo). Os valores medianos são apresentados como barras pretas. *p = 0,002 vs. controlo pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon.

Figura 22. A vacina de rAlslp-N melhora a sobrevivência de ratos imunocompetentes com candidiase hematologicamente disseminada e reduz a carga fúngica tecidular. A) Sobrevivência de ratos BALB/c vacinados ou de controlo (n = 7 ou 10 por grupo para inóculos de 2,5 ou 5 x 105, respetivamente) ratos subsequentemente infetados através da veia da cauda com C. albicans. Cada experiência foi terminada aos 30 dias após infeção com todos os ratos remanescentes em boa condição. *p < 0,05 vs. Controlo pelo teste de Mantel-Cox. B) Carga fúngica renal em ratos BALB/c (n = 7 por grupo) infetados através da veia da cauda com 5 x 105 blastosporos de C. albicans. O eixo dos y reflete o 13 limite de deteção inferior do ensaio. Os valores medianos são apresentados como barras pretas. *p = 0,01. vs controlo pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon.

Figura 23. A vacina de rAlslp-N induz uma reação DTH em ratos neutropénicos e melhora a sua sobrevivência durante a candidiase hematologicamente disseminada subsequente. A) A tumefação da planta da pata foi avaliada 24 h após injeção de 50 yg de rAlslp-N na planta da pata em ratos BALB/c (n = 10 parta o Controlo, n = 8 para rAlslp-N) . * p = 0, 006 vs Controlo pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon. B) Sobrevivência de ratos BALB/c neutropénicos (n = 16 por grupo a partir de 2 experiências) infetados com 2,5 x 104 blastosporos de C. albicans. *p = 0,007 vs controlo de adjuvante pelo teste de Mantel-Cox.

Figura 24. A vacina de rAlslp-N diminui a gravidade de lesões fúngicas histopatológicas nas línguas de ratos com candidiase orofaríngea. N = 4 ratos por grupo. Pontuação inflamatória gerada por um observador cego como descrito no texto. *p = 0,03 pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon. A Figura 25 mostra que a vacina de rAls3p-N mas não a de rAlslp-N diminui a colonização fúngica da vagina de ratos inoculados com C. albicans (*p=0,01 vs ratos vacinados com CFA sozinho, pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon) N= 11 ratos por grupo. A Figura 26 mostra um mapa de homologia da Alslp contra o fator aglutinante A de S. aureus (cln67A). Os sítios funcionais consenso da Alslp de C. albicans e ClfA de S. aureus foram mapeados num modelo de homologia de Alslp. Um grande número de resíduos das extremidades N-terminais de 14

Alslp e ClfA associam com um motivo fenda consenso, que é onde se prevê que ocorre a ligação ao substrato para ambas as adesinas. A Figura 27 mostra que as vacinas rAlslp-N e rAls3p-N melhoram a sobrevivência de ratos estafilocócicos. (*p<0,003 vs ratos vacinados com CFA sozinho, pelo teste de Mantel-Cox). N = 22 ratos por grupo. A Figura 28 mostra que os titulos de anticorpo não correlacionam com o grau de proteção em ratos vacinados particulares, mas distinguem ratos não vacinados de vacinados. Os titulos de anticorpos policlonais anti-rAlslp-N ou anti-rAls3p-N gerados em ratos BALB/c imunizados com CFA sozinho, ou CFA + 20 yg de rAlsl p-N ou rAls3p-N, respetivamente. No seu todo existe uma correlação significativa entre os titulos de anticorpo e a sobrevivência (rho =0,474, p=0,0057), indicando que os titulos de anticorpo podem ser utilizados como um marcador representante de proteção da vacina. No entanto, quando são excluídos os dados de ratos que recebem CFA sozinho, não há qualquer correlação entre os titulos de anticorpo e a sobrevivência de ratos vacinados com rAlslp-N ou rAls3p-N (rho 0,041143, p=0,847), indicando que os anticorpos são provavelmente um mecanismo não predominante de proteção da vacina. A Figura 29 mostra que a vacina de rAlslp-N protege ratos CD1, não consanguíneos da candidiase hematologicamente disseminada. A) ratos CD1 (n = 8 por grupo) foram vacinados SQ com rAlslp-N (20 yg) + CFA ou CFA sozinho, e infetados através da veia da cauda com C. albicans SC53-14 catorze dias após o reforço. B) ratos CD1 (n = 8 por grupo) foram vacinados SQ com rAlsl p-N a várias doses com alúmen, ou com alúmen sozinho, e infetados através da veia da cauda 15 com C. albicans SC5314 catorze dias após o reforço. * p < 0,05 vs. controlo de adjuvante pelo teste de Mantel-Cox. A Figura 30 mostra que a vacina de rAlslp-N melhora a sobrevivência de ratos BALB/c infetados com uma de várias estirpes de C. albicans. Sobrevivência de ratos BALB/c imunizados com rAlslp-N mais CFA contra CFA sozinho e infetados através da veia da cauda com C. albicans 15563 (7 x 105 blastosporos) , 16240 (4 x 105 blastosporos) ou 36082 (4 x 105 blastosporos) (n = 8 ratos por grupo). *p < 0,05 vs controlo de adjuvante pelo teste de Mantel-Cox. A Figura 31 mostra que a vacina de rAlslp-N reduz a carga fúngica tecidular em ratos BALB/c infetados com várias espécies não-albicans de Candida. Os ratos BALB/c (n = 5 por grupo) foram vacinados com CFA ou CFA + rAlslp-N (20 pg) e infetados através da veia da cauda com C. glabrala, C. krusei, C. parapsilosis ou C. tropicalis. Os inóculos infecciosos são mostrados entre parênteses por baixo dos nomes das espécies. A carga fúngica renal foi determinada no dia cinco após infeção. O eixo dos y reflete o limite de deteção inferior do ensaio. *p < 0,05 vs. controlo de adjuvante pelo teste não paramétrico de Steel para comparações múltiplas. A Figura 32 mostra que ratos imunizados com rAls3p-N geraram anticorpos que reagiram de forma cruzada contra a rAlslp-N. Titulos de ratos particulares imunizados com CFA sozinho, CFA + rAlsl p-N, ou CFA + rAls3p-N. N = 7 ratos por grupo para CFA e CFA + rAls3p-N; n = 6 ratos para CFA + rAlslp-N. *p < 0,05 vs. CFA sozinho; **p < 0,002 vs. CFA sozinho & p < 0,011 vs. CFA + rAlslp-N pelo teste U de Mann Whitney. As barras denotam medianas. 16

A Figura 33 mostra que tanto a rAlslp-N como a rAls3p-N preparou os ratos para respostas de hipersensibilidade de tipo retardada in vivo. Os ratos (n = 7 por grupo para CFA e CFA + rAls3p-N; n = 6 para CFA + rAlslp-N) foram vacinados com CFA sozinho, CFA + rAlslp-N, ou CFA + rAls3p-N. A hipersensibilidade de tipo retardada in vivo foi medida pela tumefação da planta da pata. *p < 0,05 vs. CFA sozinho pelo teste U de Mann Whitney. As barras denotam medianas. A Figura 34 mostra que as vacinas rAlslp-N e rAls3p-N mediaram uma eficácia semelhante contra a candidíase hematologicamente disseminada em murideo. Sobrevivência de ratos BALB/c (n = 15 por grupo a partir de 2 experiências para CFA e CFA + rAls3p-N, e n = 14 a partir de 2 experiências para CFA + rAlslp-N) infetados através da veia

da cauda com 5 x 105 blastosporos de C. albicans. A experiência foi terminada no dia 28 após infeção com todos os ratos remanescentes em boa condição. *p< 0,0001 vs controlo de CFA pelo teste de Mantel-Cox. A Figura 35 mostra que a hipersensibilidade de tipo retardada in vivo correlacionou com a sobrevivência durante a candidiase disseminada. Os títulos de anticorpo anti-rAlslp-N ou anti-rAls3p-N e as reações de tumefação da planta da pata foram medidos nos ratos (n = 7 por grupo para CFA ou CFA + rAls3p-N, n = 6 para CFA + rAlslp-N) dois dias antes da infeção através da veia da cauda com C. albicans. Correlações determinadas com o teste da soma dos números de ordem de Spearman. A Figura 36 mostra que a vacina de rAls3p-N reduz significativamente a carga fúngica tecidular durante a candidíase orofaríngea em murideo. Carga fúngica da língua 17 em ratos (n = 7 para CFA e 8 para grupos vacinados com rAlsl p-N ou rAls3p-N) com candidíase orofaríngea. 0 eixo dos y reflete o limite de deteção inferior do ensaio. *p = 0,005 vs. CFA pelo teste U de Mann Whitney. A Figura 37 mostra que a rAls3p-N reduz a carga fúngica vaginal em comparação com o CFA sozinho e o CFA + rAlslp-N na vaginite por Candida em murideo. Carga fúngica vaginal em ratos (n = 11 por grupo a partir de 2 experiências) vacinados com CFA, CFA + rAlslp-N, ou CFA + rAls3p-N. O eixo dos y reflete o limite de deteção inferior do ensaio. *p ê 0,02 vs CFA e CFA + rAlslp-N pelo teste de Steel para comparações múltiplas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A Candida albicans e o Staphilococcus aureus são agentes patogénicos comuns em humanos. Por exemplo, a C. albicans, apesar de ser normalmente um parasita inofensivo, este organismo pode originar uma variedade de condições que vai desde infeção mucocutânea superficial tal como candidiase vaginal e/ou orofaríngea, até ao envolvimento de órgãos profundos na candidíase disseminada. Antes de originar a doença, o fungo coloniza o aparelho gastrointestinal, e nalguns casos a pele e membranas da mucosa. A aderência às superfícies da mucosa do hospedeiro é um pré-requisito chave para este passo inicial. Após colonização, a C. albicans entra na corrente sanguínea através de dispositivos intravasculares infetados ou por transmigração através da mucosa gastrointestinal comprometida por quimioterapia ou ulcerações de stress. Em seguida os organismos disseminam-se através da corrente sanguínea, ligam-se e penetram no endotélio vascular para sair a 18 partir da árvore vascular, e invadir órgãos profundos tais como figado, baço e rim. A identificação e caracterização funcional de uma variedade de membros ilustrativos da familia de proteínas Ais aqui descritos permitem que esta família de proteínas seja eficazmente utilizada no tratamento da candidíase. A atividade de ligação específica a vários substratos e outras funções de adesão celular seletivas podem ser exploradas na produção de vacinas para imunização ativa ou passiva, na produção de péptidos, análogos de inibidores miméticos da adesão celular para reduzir ou prevenir a infeção inicial inibindo a ligação, adesão ou invasão de uma célula hospedeira. Além do mais, os perfis de ligação e invasão diferencial permitem conceber e utilizar a inibição de espetro largo ou dirigida das atividades de membros da família de proteínas Ais. Adicionalmente, fragmentos funcionais que conferem atividade de ligação e/ou invasão permitem eliminar sequências proteicas estranhas indesejadas, aumentando, desse modo, a eficácia da vacina ou terapêutico inibidor do membro da família de proteínas Ais. A natureza da patogénese de C. albicans por aderência a células endoteliais é discutida na USP 5,578,309. Para uma descrição do gene de ALS1 e caracterí sticas do mesmo, incluindo a caracterização do produto de gene como uma adesina ver, Fu, Y., G. Rieg, W.A. Forizi, P.H. Belanger, J.E.J. Edwards, e S.G. Filler. 1998. Expression of the Candida albicans gene ALS1 in Saccharomyces cerevisiae induces adherence to endothelial and epithelial cells. Infect. Immun. 66:1783-1786; Hoyer, L.L. 1997. Fu Y, Ibrahim AS, Sheppard DC, Chen Y-C, French SW, Cutler JE, Filler SG, Edwards, JE, Jr. 2002. Candida albicans Alslp: an adhesin that is a downstream effector of the EFG1 19 filamentation pathway. Molecular Microbiology 44:61-72. Sheppard DC, Yeaman MR, Welch WH, Phan QT, Fu Y, Ibrahim AS, Filler SG, Zhang M, Waring AJ, Edwards, Jr., JE 2004. Functional and Structural Diversity in the Ais Protein Family of Candida albicans. Journal Biological Chemistry. 279: 30480-30489. The ALS gene family of Candida albicans. International Society for Human and Animal Mycology SALSlmorge, Italy:(Resumo); Hoyer, L.L., S. Scherer, A.R. Shatzman, e G.P. Livi. 1995. Candida albicans ALS1: domains related to a Saccharonzyces cerevisiae sexual agglutinin separated by a repeating motif. Mol. Microbiol. 15:39-54. A este respeito, o agente patogénico fúngico humano Candida albicans coloniza e invade uma grande gama de tecidos do hospedeiro. A aderência aos constituintes do hospedeiro desempenha um papel importante neste processo. Verificou-se que dois membros da família de proteínas Ais de C. albicans (Alslp e Als5p) medeiam a aderência e exemplificam as atividades de ligação, adesão e invasão celular de membros da família de proteínas Ais. Como aqui descrito, membros da família do gene de ALS foram clonados e expressados em S. cerevisiae para caracterizar as suas funções individuais. Proteínas Ais diferentes conferiram perfis de aderência distintos aos vários substratos do hospedeiro. Utilizando construções quiméricas Als5p-Als6p, as regiões que medeiam a aderência específica em relação ao substrato foram circunscritas aos domínios N-terminais das proteínas Ais. Em particular, um subconjunto de proteínas Ais também mediou a invasão de células endoteliais, uma função anteriormente desconhecida desta família. Coerente com estes resultados, a modelação de homologia revelou que os membros Ais contêm motivos em folha β antiparalelos interrompidos por regiões prolongadas, homólogas às adesões ou invasinas da superfamília de imunoglobulinas. Esta 20 observação foi confirmada utilizando dicroismo circular e análise espetrométrica no infravermelho com transformada de Fourier do dominio N-terminal de Alslp. Foram encontradas regiões especificas de hipervariabilidade de aminoácidos entre os domínios N-terminais das proteínas Ais e modelos com base em energia previram semelhanças e diferenças nos domínios N-terminais que provavelmente governam a função diversificada dos membros da família de Ais. Coletivamente, estes resultados indicam que a diversidade estrutural e funcional dentro da família de Ais proporciona a C. albicans com uma matriz de proteínas da parede celular capazes de reconhecer e interagir com uma grande gama de constituintes do hospedeiro durante a infeção. A invenção proporciona uma vacina possuindo um membro da família de proteínas Ais isolado possuindo atividade de adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, e opcionalmente um adjuvante num meio farmaceuticamente aceitável. A vacina pode ser um membro da família de proteínas Ais derivado de uma espécie de Candida tal como Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata ou Candida parapsilosis. O membro da família de proteínas Ais pode ser, por exemplo, Alslp, Als3p, Als5p, Als6p, Als7p e Als9p, ou um fragmento imunogénico dos mesmos. Todos os outros membros da família de proteínas Ais dentro de uma espécie de Candida podem ser analogamente utilizados como uma vacina da invenção. A presente invenção utiliza o produto de gene membro da família de proteínas de sequência tipo aglutinina de C. albicans como uma vacina para tratar, prevenir ou aliviar candidíase disseminada. A vacina é eficaz contra várias estirpes de C. albicans bem como contra várias espécies de Candida. O membro da família de proteínas Ais pode ser, por 21 exemplo, Alslp, Als3p, Als5p, Als6p, Als7p e Als9p. A invenção explora o papel dos produtos do gene de ALS na aderência e invasão pela C. albicans de células endoteliais e/ou epiteliais e a suscetibilidade da proteína membro da família de proteínas Ais expressada na superfície para ser utilizada como uma vacina para retardar a patogénese do organismo.

De acordo com esta invenção, um gene do membro da família de ALS codifica uma adesina de superfície que é selecionada como o alvo de uma estratégia imunoterapêutica contra a C. albicans. Uma demonstração que o produto de expressão do gene ALS1, a proteína Alslp, tem características estruturais típicas de proteínas de superfície e é, de facto, expressada na superfície da célula de C. albicans é um critério para proteínas que atuam como adesinas para tecidos do hospedeiro. Os membros da família de proteínas Ais podem ser estruturalmente caracterizados como tendo um péptido sinal na extremidade N-terminal, uma sequência de ancoragem de glicosilfosfatidilinosina (GPI) na extremidade C-terminal, e uma região central compreendendo repetições ricas em treonina e serina. Além disso, os membros da família de proteínas Ais têm sítios de N- e O-glicosilação, típicos de proteínas que são expressadas na superfície da célula. Por exemplo, a imunofluorescência indireta utilizando um anticorpo monoclonal dirigido contra a extremidade N-terminal de ALslp revelou que a ALslp é expressada durante a fase log dos blastosporos. Esta expressão de ALslp é aumentada durante a formação de hifas e localiza-se na junção onde o elemento de hifa se prolonga a partir dos blastosporos como indicado pela revelação superficial difusa. Além disso, este anticorpo monoclonal bloqueou a aderência melhorada do mutante de sobreexpressão de C. albicans às células endoteliais, estabelecendo, desse 22 modo, o princípio para aplicações de imunoterapia utilizando ALslp. As características funcionais que estejam relacionadas com a adesão celular e invasão de outros membros da família de Ais são descritos mais abaixo no Exemplo VI.

Assim, de acordo com um aspeto, a invenção proporciona uma proteína de adesão de superfície membro da família de Ais, designada, por exemplo, Alslp, Als3p, Als5p, Als6p, Als7p e Als9p, ou um fragmento funcional, conjugado ou análogo da mesma, possuindo propriedades úteis quando formulada numa composição farmacêutica e administrada como uma vacina com ou sem um adjuvante. Um membro da família de proteínas Ais, associação de dois ou mais membros da família de proteínas Ais ou um ou mais fragmentos funcionais, análogos, conjugados ou derivados do mesmo, pode ser obtido a partir de, por exemplo, Candida albicans. As moléculas ou análogos de adesina ou invasina semelhantes ou seus derivados podem ter origem em Candida e podem ser obtidos, por exemplo, a partir de espécies pertencentes aos géneros Candida, por exemplo Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida glabrata e Candida tropicalis. A proteína adesina ou invasina de superfície de acordo com a invenção pode ser obtida na forma isolada ou purificada e, desse modo, de acordo com uma forma de realização da invenção uma proteína adesina da superfície de Candida membro da família de proteínas Ais substancialmente pura, ou fragmento funcional, fragmento imunogénico, análogo, conjugado ou derivado da mesma, é formulada como uma vacina para originar uma resposta imunológica num doente para desencadear uma resposta imunológica contra Candida e/ou para bloquear a adesão do organismo às células endoteliais. Os fragmentos de membros da família de proteínas Ais que exibem atividade de ligação, adesão ou invasão semelhante à 23 de um membro intacto da família de proteínas Ais é aqui referido como um fragmento funcional. Os fragmentos de membros da família de proteínas Ais que são capazes de desencadear um anticorpo ou uma resposta imunológica celular contra uma espécie de Candida são aqui referidos como um fragmento imunogénico. Os fragmentos funcionais ilustrativos incluem a região polipeptídica N-terminal do membro da família de proteínas Ais descritos mais abaixo no Exemplo VI. Os fragmentos imunogénicos ilustrativos incluem a região polipeptídica N-terminal de Ais, a região polipeptídica C-terminal de Ais bem como qualquer outro fragmento de Ais que é suficiente para gerar um anticorpo, uma resposta imunológica celular ou ambos um anticorpo e uma resposta imunológica celular. Tais fragmentos imunogénicos podem ser tão pequenos quanto cerca de quatro aminoácidos e tão grandes quanto o polipéptido intacto e incluem também todos os comprimentos de polipéptido entre os dois.

Um análogo ou derivado da proteína de adesão de superfície de acordo com a invenção pode ser identificado e adicionalmente caracterizado pelos critérios aqui descritos para um gene do membro da família de ALS e/ou produto de gene. Por exemplo, um mutante nulo do análogo ou derivado partilharia de uma adesão acentuadamente reduzida às células endoteliais em comparação com controlos. Analogamente, a sobreexpressão do análogo ou derivado num modelo apropriado exibiria uma maior aderência às células endoteliais em comparação com controlos e seria confirmado como uma adesina da superfície celular de acordo com os critérios descritos acima. Além disso, antissoros para um análogo ou derivado podem reagir de modo cruzado com anticorpos anti-membro da família de proteínas Ais e podem exibir tempos de sobrevivência maiores quando administrados 24 num modelo de candidíase disseminada em rato como aqui divulgado. A eficácia das vacinas da invenção contra as diferentes estirpes de Candida, diferentes espécies de Candida, outras bactérias e agentes infecciosos e a sua grande gama de atividade imunológica são descritas mais abaixo e exemplificadas nos Exemplos. Por exemplo, o Exemplo V mostra que os anticorpos anti-ALS são eficazes contra infeções da mucosa e hematologicamente disseminadas por Candida. 0 Exemplo VII mostra que a vacinação com rAlslp-N melhora a sobrevivência durante a candidíase disseminada em murídeo melhorando a imunidade mediada por células. 0 Exemplo VIII mostra que as vacinas da invenção reduzem a carga fúngica e melhoram a sobrevivência em ratos imunocompetentes e imunocomprometidos. 0 Exemplo IX mostra a eficácia das vacinas de ALS da invenção contra infeções por S. aureus. 0 Exemplo X exemplifica que as vacinas da invenção são eficazes contra diferentes estirpes de C. albicans e contra diferentes espécies tais como C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis bem como a eficácia em diferentes modelos animais. 0 Exemplo XI também exemplifica a eficácia das diferentes vacinas da invenção em diferentes modelos animais, bem como proporciona uma comparação das diferentes respostas desencadeadas e da potência de duas vacinas de ALS representativas. A atividade de adesão celular inclui a ligação a gelatina, fibronectina, laminina, células epiteliais ou células endoteliais e/ou a promoção da invasão celular.

Além disso, a invenção também proporciona um membro da família de proteínas Ais isolado com origem em Candida como 25 aqui descrito possuindo atividade de adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, para ser utilizado num método de tratamento ou prevenção de uma infeção por Staphilococcus aureus num corpo humano ou animal. Em particular, o método de tratamento ou prevenção de infeções por Staphilococcus aureus inclui administrar uma quantidade imunogénica de uma vacina de um membro da família de proteínas Ais isolado possuindo atividade de adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, num meio farmaceuticamente aceitável.

As Alslp e Als3p são particularmente eficazes devido à homologia significativa com as proteínas da superfície celular de S. aureus. Por exemplo, a sequência e homologia estrutural das Alslp e Als3p são descritas mais abaixo no Exemplo IX. Dado os ensinamentos e orientação aqui proporcionados, os especialistas na técnica compreenderão que as vacinas e métodos da invenção podem ser aplicados de forma semelhante ao tratamento de infeções por Candida e Staphilococcus. Analogamente, dado os ensinamentos e métodos aqui descritos, os especialistas na técnica também compreenderão que as vacinas e métodos da invenção também podem ser aplicados a outros agentes patogénicos possuindo polipéptidos da superfície celular com imunogenicidade, sequência e/ou homologia estrutural semelhante aos membros da família de proteínas Ais aqui descritos, incluindo fungos, bactérias e semelhantes.

As estratégias imunoterapêuticas e/ou de inibição da adesão ou invasão celular por polipéptidos Ais contra a infeção por Candida ou Staphilococcus podem atuar ao nível da ligação às células endoteliais vasculares bem como através de um efetor a jusante da via reguladora de filamentação. Uma estratégia imunoterapêutica ou de inibição da ligação 26 utilizando um membro ou fragmento funcional solúvel da familia de proteínas Ais é útil neste contexto porque: (i) a morbidade e mortalidade associada à candidíase hematologicamente disseminada e outros agentes infecciosos patogénicos permanece inaceitavelmente alta, mesmo com a terapia antifúngica atualmente disponível; (ii) uma incidência crescente de resistência a antifúngicos e antibióticos está associada à utilização crescente de agentes antifúngicos e antibacterianos, iii) a população de doentes em risco de infeções graves por Candida e Staphilococcus é bem definida e muito grande, e inclui doentes pós-operatórios, doentes de transplante, doentes com cancro e bebés com baixo peso à nascença; e iv) uma percentagem elevada dos doentes que desenvolvem infeções graves por Candida não são neutropénicos e podem, desse modo, respondes a uma vacina ou um polipéptido competitivo ou composto inibidor. Por estas razões, a Candida e Staphilococcus são alvos fúngicos e bacterianos atrativos para imunoterapia passiva, imunoterapia ativa ou uma associação de imunoterapia passiva ou ativa. Adicionalmente, a Candida também é atrativa para inibição competitiva utilizando um polipéptido membro da família de proteínas Ais, fragmento funcional do mesmo e/ou um composto ou mimético do mesmo que se liga a um ou mais membros da família de Ais e impede a ligação de Candida a um recetor celular do hospedeiro.

Dado os ensinamentos e orientação aqui proporcionados, os especialistas na técnica compreenderão que podem ser utilizados métodos imunoterapêuticos bem conhecidos na técnica com os membros da família de proteínas Ais da invenção, fragmentos imunogénicos, análogos, conjugados e/ou derivados dos mesmos, para utilizar uma ou mais das moléculas como um imunogénio numa composição 27 farmaceuticamente aceitável administrada como uma vacina com ou sem um adjuvante. Para os fins desta invenção, os termos "farmacêutica" ou "farmaceuticamente aceitável" referem-se a composições formuladas por técnicas conhecidas para serem não tóxicas e, quando desejado, utilizadas com veículos ou aditivos que podem ser administrados de forma sequra a humanos. A administração pode ser realizada utilizando vias bem conhecidas incluindo, por exemplo, injeção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea. Tais vacinas da invenção também podem incluir tampões, sais ou outros solventes conhecidos destes especialistas na técnica para conservar a atividade da vacina em solução. Analoqamente, pode ser utilizado qualquer um de uma grande gama de adjuvantes bem conhecidos na técnica com a vacina da invenção para desencadear, promover ou melhorar uma resposta imunológica terapeuticamente eficaz capaz de reduzir ou bloquear a ligação, invasão e/ou infeção por Candida ou Staphilococcus numa célula hospedeira suscetível.

Analogamente, dado os ensinamentos e orientação aqui proporcionados, os especialistas na técnica também compreenderão que também podem ser utilizados métodos terapêuticos bem conhecidos na técnica para administrar e bloquear seletivamente a ligação de moléculas da superfície celular aos seus recetores cognatos com os membros da família de proteínas Ais da invenção, fragmentos funcionais, análogos, conjugados e/ou derivados dos mesmos, para utilizar um ou mais dos membros da família de proteínas Ais como um inibidor numa composição farmaceuticamente aceitável. Tal como sucede com as formulações de vacina, as formulações de inibidor podem ser analogamente administradas utilizando métodos bem conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, injeção intravenosa intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea. 28

Tais composições de inibidor que ligam recetores de membros da família de Ais e bloqueiam a ligação de um membro da família de proteínas Ais também podem incluir tampões, sais ou outros solventes conhecidos destes especialistas na técnica para conservar a atividade da vacina em solução. Além disso, pode ser utilizada qualquer uma de uma grande gama de formulações bem conhecidas na técnica com as composições de inibidor da invenção para direcionar e/ou melhorar a administração ou captação de modo a reduzir ou inibir a ligação, invasão e/ou infeção por Candida ou Staphilococcus numa célula hospedeira suscetível.

Em relação à molécula utilizada como um imunogénio terapêutico ou inibidor de ligação ao recetor de acordo com a presente invenção, os especialistas na técnica reconhecerão que as moléculas de membros da família de proteínas Ais podem ser truncadas ou fragmentadas sem perder as qualidades essenciais como uma vacina imunogénica ou inibidor da adesão ou invasão celular. Por exemplo, um membro da família de proteínas Ais pode ser truncado para produzir um fragmento N-terminal por truncamento da extremidade C-terminal conservando as propriedades funcionais descritas acima e mais abaixo nos Exemplos. Analogamente, os fragmentos C-terminais podem ser gerados por truncamento a partir da extremidade N-terminal com conservação das suas propriedades funcionais. Outras modificações de acordo com os ensinamentos e orientação aqui proporcionados podem ser feitas de acordo com esta invenção para criar outros fragmentos funcionais, fragmentos imunogénicos, análogos de membros da família de proteínas Ais ou derivados dos mesmos, para conseguir as propriedades terapeuticamente úteis aqui descritas para a proteína nativa. 29

Um aspeto da eficácia terapêutica dos membros da familia de proteínas Ais e métodos da invenção é que consegue interferir com a regulação da filamentação, para bloquear a aderência do organismo aos constituintes do hospedeiro e melhorar a eliminação do organismo por células imunoefetoras e outros mecanismos fisiológicos. Uma vez que as células endoteliais cobrem a maior parte da vasculatura, as estratégias para bloquear a aderência, invasão e/ou ambas do organismo às células endoteliais utilizando anticorpos, proteínas membros da família de Ais, polipéptidos ou péptidos ou qualquer associação destes incluem formas de realização úteis da presente invenção. Como anteriormente descrito, tais terapias de bloqueio da aderência e/ou invasão incluem imunoterapia ativa ou passiva ou ligação inibidora dirigida contra as adesinas, invasinas ou recetores cognatos de Candida aqui divulgados. Assim, por exemplo, qualquer hospedeiro adequado pode ser injetado com a proteína e o soro recolhido para produzir o anticorpo anti-adesina desejado após purificação e/ou concentração apropriadas. Antes da injeção, a proteína da adesina ou invasina ou uma associação destas, pode ser formulada num veículo adequado preferencialmente um imunoestimulante conhecido tal como um polissacárido ou formulação de administração tal como lipossomas ou composições de libertação controlada. Assim, de acordo com um outro aspeto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de adesina ou invasina de Candida em conjunto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis numa formulação para ser utilizada como uma vacina ou inibidor do recetor de Ais. A invenção proporciona o melhoramento e/ou prevenção da infeção por Candida ou Staphilucoccus ao bloquear a aderência de C. albicans às células endoteliais ou 30 epiteliais de um constituinte do hospedeiro ou, por exemplo, por ligação de anticorpo ao Staphilococcus e permitir que os mecanismos imunológicos removam o agente patogénico. Assim, de acordo com um aspeto da invenção, uma composição farmacêutica compreendendo uma proteina de adesina ou invasina membro da família de proteínas Ais, fragmento funcional ou imunogénico, derivado, análogo ou conjugado da mesma é formulada como uma vacina ou inibidor do recetor de Ais numa composição farmacêutica contendo um veículo biocompatível para injeção ou infusão e é administrada a um doente. Além disso, a administração direta de antissoro gerado contra uma proteína membro da família de Ais ou proteína membro da família de Ais isolada ou recombinante pode ser utilizada para bloquear a aderência de C. albicans a um constituinte do hospedeiro mamífero ou efetuar a remoção de um agente patogénico de Staphilococcus. O antissoro contra a proteína de adesina pode ser obtido por técnicas conhecidas, Kohler e Milstein, Nature 256: 495-499 (1975), e pode ser humanizado para reduzir a antigenicidade, ver USP 5,693,762, ou produzido em ratos transgénicos deixando um gene de imunoglobulina humana não rearranjado, ver USP 5,877,397. Analogamente, o membro da família de proteínas Ais isolado ou recombinante também pode ser produzido utilizando métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica incluindo, por exemplo, a produção recombinante descrita nos Exemplos abaixo.

Ainda uma outra utilização da invenção é, por exemplo, a utilização da proteína de adesina ou invasina membro da família de proteínas Ais para desenvolver estratégias de vacina para a prevenção e/ou melhoramento de infeções por Candida ou Staphilococcus. Assim, de acordo com um aspeto da invenção podem ser utilizadas, por exemplo, técnicas de imunologia correntes para construir uma estratégia de 31 vacina multi-componente que pode melhorar e/ou desencadear uma resposta imunológica a partir de um constituinte do hospedeiro para bloquear a aderência de C. albicans ou para efetuar a eliminação de agentes patogénicos de Staphilococcus.

Ainda uma outra utilização da invenção é, por exemplo, o desenvolvimento de estratégias de vacina de ADN. Assim, de acordo com um aspeto da invenção, por exemplo, os polinucleótidos de membros da familia de Ais que codificam o membro da família de proteínas Ais adesina ou invasina ou um fragmento funcional do mesmo é administrado de acordo com um protocolo concebido para produzir uma resposta imunológica ao produto de gene. Ver, por exemplo, Felgner USP 5,703,055.

Ainda uma outras utilização da invenção é, por exemplo, o desenvolvimento de estratégias de vacina de associação. Assim, de acordo com um aspeto da invenção, por exemplo, anticorpos anti-membro da família de proteínas Ais podem ser utilizados com anticorpos no tratamento e/ou prevenção de infeções por Candida ou Staphilococcus. Ver USP 5,578,309.

Os Exemplos que se seguem ilustram a utilidade imunoterapêutica da adesina ALS I como a base para medidas ou tratamentos profiláticos de candidíase disseminada. O Exemplo 1 descreve a preparação de um mutante nulo de ALS I e uma estirpe de C. albicans caracterizada pela sobreexpressão de ALS1 a confirmam a mediação da aderência a células endoteliais. O Exemplo 2 descreve a localização de Alslp e a implicação da via reguladora de filamentação efg. O Exemplo 3 descreve a purificação da proteína de adesina ALS1. O Exemplo 4 descreve a preparação de 32 anticorpos policlonais de coelho gerados contra a proteína de adesina de superfície ALS1 a ser utilizada para demonstrar o bloqueio da proteína de adesina de superfície. 0 Exemplo 5, descreve o bloqueio da aderência in vivo, utilizando anticorpos policlonais gerados contra a proteína de adesão de superfície ALSl como aqui descrito de acordo com a invenção para proteger contra a candidíase disseminada num modelo de rato. 0 Exemplo VI descreve as características estruturais e funcionais de membros da família de proteínas Ais.

Os seguintes exemplos destinam-se a ilustrar mas não a limitar a presente invenção.

EXEMPLO I

Alsl Medeia a Aderência de C. albicans a Células Endoteliais A técnica blaster de URA foi utilizada para construir um mutante nulo de C. albicans que carece da expressão de Alslp. 0 mutante alsl/alsl foi construído na estirpe de C. albicans CAI4 utilizando uma modificação da metodologia blaster Ura (Fonzi e Irwin, Genetics 134, 717 (1993)) como se segue: Duas construções alsl-hisG-IRA3-hisG-alsl separadas foram utilizadas para romper os dois alelos diferentes do gene. Uma sequência de codificação de AsLSl de 4,9 kb foi gerada com PCR de alta fidelidade (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) utilizando os iniciadores: 5'-CCCTCGAGATGCTTCAACAATTTACATTGTTA-3' (SEQ ID NO:8) e 5'-CCGCTCGAGTCACTAAATGAACAAGGACAATA-3' (SEQ ID NO:9). Em seguida, o fragmento de PCR foi clonado no vetor pGEM-T (Promega, Madison, WI), obtendo-se desse modo pGEM-T-ALSl. A construção hisG-URA3-hisG foi libertada a partir de pMG-7 33 por digestão com Kpnl e Hind3 e utilizada para substituir uma porção de ALS1 libertada por digestão de pGEM-T-ALSl com Kpnl e Hind3. A construção final de alsl-hisG-URA3-hisG-alsl foi libertada a partir do plasmideo por digestão com Xhol e utilizada para romper o primeiro alelo de ALS1 por transformação da estirpe CAI-4.

Uma segunda construção alsl-hisG-URA3-hisG-alsl foi gerada em dois passos. Primeiro, um fragmento Bgl2-Hind3 hisG-URA3-hisG de pMB7 foi clonado nos sitios BamHl-Hind3 de pUC19, gerando desse modo pYC2. A PYC2 foi então digerida com Hind3, parcialmente preenchida com dATP e dGTP utilizando polimerase de ADN T4, e em seguida digerida com Smal para produzir um novo fragmento de hisGURA3-hisG. Segundo, para gerar as regiões flanqueadoras complementares de ALS1, pGEM-T-ALSl foi digerida com Xbal e em seguida parcialmente preenchida com dCTP e dTTP. Este fragmento foi digerido com Hpal para suprimir a porção central de ALS1 e em seguida ligado ao fragmento hisG-URA3-hisG gerando pYC3. Este plasmideo foi então digerido por Xhol para libertar uma construção que foi utilizada para romper o segundo alelo de ALS1. Foram efetuadas curvas de crescimento ao longo da experiência para garantir que as mutações geradas não tinham qualquer efeito nas velocidades de crescimento. Todas as integrações foram confirmadas por análise de transferência de Southern utilizando uma sonda especifica de ALS1 de 0, 9kb gerada por digestão de pYF5 com Xbal e HindiII. O mutante nulo foi comparado com a CAI-12 de C. albicans (uma estirpe URA + com mutação reversa) quanto à sua capacidade para aderir às células endoteliais da veia umbilical humana in vitro. Para os estudos de aderência, uma cultura de um dia para o outro de células de levedura 34 de YPD (2% glucose, 2% peptona e 1% de extrato de levedura), foram cultivadas em RPMI com glutamina a 25°C durante 1 hora para induzir a expressão de Alslp. Foram adicionados 3 x 102 organismos em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS) (Irvine Scientific, Irvine, CA) a cada poço das células endoteliais, após o que a placa foi incubada a 37 °C durante 30 minutos. O tamanho do inoculo foi confirmado por cultura quantitativa em ágar de YPD. No final do periodo de incubação, os organismos não aderentes foram aspirados e as monocamadas de células endoteliais foram lavadas duas vezes com HBSS de uma maneira padronizada. Os poços foram recobertos com ágar de YPD e o número de organismos aderentes foram determinados por contagem de colónias. O tratamento estatístico foi obtido pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon e corrigido para comparações múltiplas com a correção de Bonferroni. P<0,001.

Reportando à Figura 1, uma comparação das estirpes ALS1/ALS1 e alsl/alsl mostrou que o mutante nulo de ALS1 era 35% menos aderente às células endoteliais do que a CAI-12 de C. albicans. Para reduzir aderência de base, a aderência da estirpe de tipo selvagem cultivada sob condições que não expressam ALS1 foi comparada com um mutante que expressa autonomamente Alslp. Este mutante foi construído integrando uma terceira cópia de ALS1 sob o controlo do promotor constitutivo ADH1 na C. Albicans de tipo selvagem. Para conseguir a expressão constitutiva de ALS1 na C. albicans, um gene URA3 gerado por PCR de extremidade romba é ligado num sítio Bgl2 de extremidade romba do vetor pOCUS-2 (Novagen, Madison, WI), produzindo pOU-2. Um fragmento Notl-Stul de 2,4 kb, que continha o promotor e finalizador do gene de álcool-desidrogenase de C. albicans (ADH1) (isolado de pLH-ADHpt e amavelmente 35 cedido por A. Brown, Aberdeen, UK) , foi clonado em pOU-2 após digestão com Notl e Stul. 0 novo plasmídeo, designado pOAU-3 tinha apenas um sitio Bgl2 entre o promotor e finalizador ADH1. A sequência de codificação de ALSl flanqueada por sitios da enzima de restrição BamHI foi gerada por PCR de alta fidelidade utilizando pYF-5 como uma cadeia molde e os seguintes iniciadores: 5'- CGGGATCCAGATGCTTCA-ACAATTTACATTG-3' (SEQ ID NO:10) e 5'-CGGGATGCTCACTAATGAACAAGGACAATA-3' (SEQ ID NO:11). Este fragmento de PCR foi digerido com BamHI e em seguida clonado no sitio Bgl2 compatível de pOAU-3 para gerar pAU-1. Finalmente, o pAU-1 foi linearizado por Xbal antes da transformação de CAI-4 de C. albicans. A integração especifica no sitio foi confirmada por análise de transferência de Southern. Reportando à Figura 1B, a sobreexpressão de ALSl nesta estirpe PADHi-ALS1 resultou num aumento de 76% na aderência a células endoteliais em comparação com a C. Albicans de tipo selvagem. Na comparação da aderência de células endoteliais de tipo selvagem à do mutante de sobreexpressão, células de levedura foram cultivadas de um dia para o outro em YPD a 25°C (condição de não indução de Alslp). A expressão de Alslp não foi induzida para reduzir a aderência de base de tipo selvagem, amplificando assim o papel da Alslp na aderência através do gene híbrido PADHi-ALS1. O ensaio de aderência foi realizado como descrito acima. O tratamento estatístico foi obtido pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon e corrigido para comparações múltiplas com a correção de Bonferroni. P<0,001.

Um anticorpo monoclonal de IgG de murídeo anti-Alslp foi gerado contra uma extremidade N-terminal de Alslp purificada e truncada (aminoácidos #17 a #432) expressada utilizando Clontech YEXpress (™) Sistema de Expressão de 36

Levedura (Paio Alto, CA). A capacidade de bloqueio da aderência destes anticorpos monoclonais anti-Alslp foi avaliada incubando células C. albicans com anticorpos anti-Alsl ou IgG de rato (Sigma, St. Louis, MO) a uma diluição de 1:50. Após o que as células de levedura foram utilizadas no ensaio de aderência como descrito acima. O tratamento estatístico foi obtido pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon e corrigido para comparações múltiplas com a correção de Bonferroni. P<0,001. Os resultados revelaram que a aderência da estirpe PAdhi-ALS1 foi reduzida de 26,8%±3,5% para 14,7%±5,3%. Assim, os efeitos da supressão e sobreexpressão de ALS1 demonstram que a Alslp medeia a aderência de C. albicans às células endoteliais.

EXEMPLO II

Localização de Alslp

Para a Alslp atuar como uma adesina, ela tem de estar localizada na superfície da célula. A localização na superfície da célula da Alslp foi verificada utilizando imunofluorescência indireta com o anticorpo monoclonal anti-Alslp. Foi detetada revelação difusa na superfície de blastosporos durante o crescimento exponencial. Esta revelação não foi detetável nos blastosporos em fase estacionária. Reportando à Figura 2A, quando os blastosporos foram induzidos a produzir filamentos, foi observada revelação intensa que se localizou exclusivamente na base do filamento emergente. Não foi observada qualquer imunofluorescência com o mutante alsl/alsl, confirmando a especificidade deste anticorpo para a Alslp. Ver Figura 2B. Estes resultados estabelecem que a Alslp é uma proteína da superfície celular. 37 A localização específica de Alslp na junção blastosporo-filamento implica a Alslp no processo de filamentação. Para determinar o mecanismo, analisou-se o fenótipo de filamentação de mutantes ALS1 de C. albicans. Reportando à Figura 3A, o mutante alsl/alsl falhou em formar filamentos após uma incubação de 4 dias em meio sólido de Lee, enquanto tanto as estirpes ALS1/ALS1 e ALSl/alsl bem como o mutante complementado com ALS1 produziram filamentos abundantes nesta altura. 0 mutante alsl/alsl foi capaz de formar filamentos após períodos de incubação mais compridos. Além disso, a sobreexpressão de ALS1 aumentou a filamentação: a estirpe PADHi-ALS1 formou filamentos profusos após uma incubação de 3 dias, enquanto que a estirpe de tipo selvagem produziu filamentos escassos nesta altura. Ver Figura 3B. Para confirmar ainda melhor o papel da Alslp na filamentação, foi proporcionado um controlo negativo utilizando um mutante semelhante ao mutante de sobreexpressão de ALS1, exceto que a sequência de codificação do ALS1 foi inserida na orientação oposta. Foi mostrado que o fenótipo de filamentação da estirpe resultante era semelhante ao da estirpe de tipo selvagem. As propriedades de indução de filamentos da Alslp são especificas para células cultivadas em meios sólidos, porque todas as estripes descritas acima filamentaram de maneira comparável em meio liquido. Os dados demonstram que a Alslp promove a filamentação e implica a expressão de ALS1 na regulação das vias de controlo da filamentação. Foi realizada a análise de transferência de Northern da expressão de ALS1 em mutantes com defeitos em cada uma destas vias, incluindo mutantes efgl/efgl, cphl/cphl, efgl/efg cphl/cphl, tupl/tupl e cla4/cla4. Reportando à Figura 4A, mutantes nos quais ambos os alelos de EFG1 foram rompidos falharam em expressar o ALSl. A introdução de uma cópia de EFGl de tipo selvagem no mutante efgl/efgl estabeleceu a expressão de ALSl, embora a um nivel 38 reduzido. Ver Figura 4B. Além disso, como se observa na Figura 4A, nenhuma das outras mutações reguladoras da filamentação alteraram significativamente a expressão de ALS 1 (Fig. 4A). Assim, a Efglp é necessária para expressão de ALS1.

Se a Efglp estimula a expressão de ALS1, a qual por sua vez induz a filamentação, a expressão de ALSl na estirpe efgl/efgl deveria restabelecer a filamentação. Um alelo funcional de ALSl sob o controlo do promotor ADH1 foi integrado na estirpe efgl/efgl. A fim de investigar a possibilidade de que o produto de gene de ALSl possa complementar o defeito de filamentação no mutante nulo efgl, um mutante nulo Ura efgl foi transformado com pAU-1 linearizado. Os clones Ura+ foram selecionados e a integração da terceira cópia de ALSl foi confirmada por PCR utilizando os iniciadores: 5'-CCGTTTATACCATCCAATC-3' (SEQ ID NO:13) e 5'-CTACA TCCTCCAATGATATAAC-3' (SEQ ID N0:14). A estirpe resultante expressava autonomamente o ALSl e recuperou a capacidade para filamentar em ágar de Lee. Ver Figuras 4B e C. Por conseguinte, a Efglp induz a filamentação através da ativação da expressão de ALSl.

Uma vez que a filamentação é um fator de virulência critico na C. albicans a conceção de uma via que regule a filamentação tem implicações importantes para a patogenicidade. Antes do ALSl, não tinha sido identificado qualquer gene que codificasse um efetor a jusante destas vias reguladoras. A rutura de outros dois genes que codificam as proteínas da superfície celular, HWP1 e INTI, resulta em mutantes com defeitos de filamentação. Embora a expressão de HWP1 também seja regulada por Efglp, a expressão autónoma de HWP1 no mutante efgl/efgl falha em recuperar a filamentação. Por conseguinte, o Hwplp sozinho não atua como um efetor de filamentação a jusante de EFG1. 39

Além disso, não são conhecidos elementos reguladores que controlem a expressão de INT1. Assim, a Alslp é a primeira proteína da superfície celular identificada que atua como um efetor a jusante da filamentação, sugerindo desse modo um papel essencial para esta proteína na virulência de C. albicans. A contribuição de Alslp para a virulência de C. albicans foi testada num modelo de candidíase hematologicamente disseminada, A.S. Ibrahim et al., Infect. Immun. 63, 1993 (1995). Reportando à Figura 5A, ratos infetados com o mutante nulo alsl/alsl sobreviveram significativamente mais tempo do que os ratos infetados com a estirpe ALS1/ALS1, o mutante ALSl/alsl ou o mutante complementado com ALS1. Após 28 horas de infeção, os rins de ratos infetados com o mutante alsl/alsl continham significativamente menos organismos (5,70±0,46 logio CFU/g) (P<0,0006 para ambas as comparações). Não foi detetada qualquer diferença nas contagens de colónias de organismos recuperados a partir do baço, pulmões ou fígado de ratos infetados com qualquer uma das estirpes em qualquer altura testada. Estes resultados indicam que a Alslp é importante para o crescimento e persistência de C. albicans no rim durante as primeiras 28 horas de infeção. Reportando à Figura 5B, o exame dos rins de ratos após 28 horas de infeção revelou que o mutante alsl/alsl produzia filamentos significativamente mais curtos e desencadeava uma resposta inflamatória mais fraca do que o tipo selvagem de estirpes complementadas com ALS1. No entanto, às 40 horas de infeção, o comprimento dos filamentos e o número de leucócitos que os circundava eram semelhantes para todas as três estirpes. O defeito de filamentação do mutante alsl/alsl observado em histopatologia assemelhava-se aos ensaios de filamentação 40 in vitro em meio sólido. Este mutante mostrou filamentação deficiente nos momentos iniciais do tempo tanto in vivo como in vitro. Esta deficiência era eventualmente resolvida durante infeção/incubação prolongada. Estes resultados sugerem que uma via reguladora de filamentação que é independente de ALS1 pode tornar-se ativa em pontos no tempo posteriores. A ativação desta via de filamentação alternativa pelas 40 horas de infeção é provavelmente a razão pela qual os ratos infetados com o mutante alsl/alsl sucumbiram posteriormente nos 2-3 dias que se seguiram.

Coletivamente, estes dados demonstram que a C. albicans ALS1 codifica uma proteína da superfície celular que medeia tanto a aderência a células endoteliais como a filamentação. A Alslp é o único efetor a jusante identificado de qualquer via reguladora de filamentação conhecida em C. albicans. Adicionalmente, a Alslp contribui para a virulência na infeção hematológica por Candida. A localização na superfície celular e funcionalidade dupla da Alslp tornam-na um alvo atrativo para terapias de base farmacológica e imunológica.

EXEMPLO III

Purificação da Proteína de Adesina de ALS1 A proteína de ALS1 sintetizada pela E. coli é adequada como um imunogénio. No entanto, as proteínas eucarióticas sintetizadas por E. coli podem não ser funcionais devido a dobragem inadequada ou carência de glicosilação. Por conseguinte, para determinar se a proteína de ALS1 pode bloquear a aderência de C. albicans a células endoteliais, a proteína é, preferencialmente, purificada de C. Albicans geneticamente manipulada. 41 A PCR foi utilizada para amplificar um fragmento de ALS1, a partir dos nucleótidos 52 a 1296. Este fragmento de 1246 pb abrangia a extremidade N-terminal da proteína de ALS1 prevista a partir do fim do péptido sinal até ao começo das repetições em série. Esta região de ALS1 foi amplificada porque provavelmente codifica o sítio de ligação da adesina, com base an sua homologia com a região de ligação do produto de gene Agalde S. cerevisiae. Além disso, esta porção da proteína de ALS1 prevista tem poucos sítios de glicosilação e o seu tamanho é apropriado para expressão eficiente em E. coli. 0 fragmento de ALS1 foi ligado a pQE32 para produzir pINS5. Neste plasmídeo, a proteína é expressada sob controlo do promotor lac e tem uma etiqueta de 6 his fundida com a sua extremidade N-terminal pelo que pode ser purificada por afinidade. Nós transformamos E. coli com pINS5, cultivamo-la sob condições de indução (na presença de IPTG) e em seguida submetemos as células a lise. 0 lisado celular foi feito passar através de uma coluna de agarose-Ni2+ para purificar por afinidade a proteína de fusão ALSl-6His. Este procedimento produziu quantidades substanciais de ALS1-6His. A proteína de fusão foi ainda purificada por SDS-PAGE. A banda contendo a proteína foi excisada do gel de modo a poder gerar antissoro policlonal de coelho contra a mesma. Será entendido por um especialista na técnica que a proteína de adesina de superfície de acordo com a invenção pode ser preparada e purificada por uma variedade de processos conhecidos. A sequência da Alslp é listada na Figura 7 .

EXEMPLO IV 42

Geração de Antissoros Policlonais contra a Proteína de ALSl

Para determinar se os anticorpos contra a proteina ALS I bloqueiam a aderência de Candida albicans a células endoteliais e epiteliais, e ao constituinte do hospedeiro selecionado in vitro, coelhos foram inoculados com S. cerevisiae transformada com proteina de ALSl. 0 protocolo de imunização utilizado foi a dose e o plano utilizado por Hasenclever e Mitchell para a produção de antissoros que identificavam a relação antigénica entre as várias espécies de Candida. Hasenclever, H. F. e W. 0. Mitchell. 1960. Antigenic relationships of Torulopsis glabrata and seven species of the genus Candida. J. Bacteriol. 79:677-681. Foram também gerados antissoros de controlo contra 5. cerevisiae transformados com o plasmideo vazio. Todas as células de levedura foram cultivadas em galactose para induzir a expressão dos genes de ALS. Antes de ser testado nas experiências de aderência, o soro foi inativado por aquecimento a 56 C para remover toda a atividade de complemento.

Os soros de coelhos imunizados foram absorvidos com células inteiras de S. cerevisiae transformadas com o plasmideo vazio para remover os anticorpos que são reativos com outros componentes da levedura que não o ALSl. 0 titulo dos antissoros foi determinado por imunofluorescência utilizando S. cerevisiae que expressa o gene ALSl. Os anticorpos anti-coelho marcados com FITC foram adquiridos de fontes comerciais (Southern Biotechnology, Inc) . Os anticorpos secundários purificados por afinidade foram essenciais porque muitos soros comercialmente disponíveis contêm anticorpos reativos com o glucano e manano de levedura. Os anticorpos secundários foram pré-testados utilizando Candida albicans e S. cerevisiae transformada 43 com o plasmídeo e foram absorvidos. Conforme necessário, para remover quaisquer anticorpos anti-S. cerevisiae ou anti-Candida. Os controlos negativos foram 1) soro pré-imune 2) S. cerevisiae transformada com o plasmídeo vazio e 3) S. cerevisiae transformada com o gene de ALS mas cultivada sob condições que suprimem a expressão do gene de ALS (glucose) .

Além das experiências acima, a transferência de Western foi utilizada para proporcionar uma confirmação adicional que um antissoro se liga especificamente à proteína ALS contra a qual foi gerado. S. cerevisiae transformada com o ALS1 foram cultivadas sob condições de indução e as suas membranas do plasma foram isoladas por métodos correntes. Panaretou R e P. Piper. 1996. Isolation of yeast plasma membranes. p. 117-121. In I.H. Evans. (ed.), Yeast Protocols. Methods in Cell and Molecular Biology. Humana Press, Totowa, New Jersey. Foram também preparadas membranas do plasma de S. cerevisiae transformadas com o plasmídeo vazio e cultivadas sob condições idênticas. As proteínas da membrana foram separadas por SDS-PAGE e, em seguida, transferidas para membrana de PVDF por eletrotransferência. Harrow, E. e D. Lane. 1988. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Depois de ter sido bloqueada com leite desnatado, a mancha foi incubada com o antissoro de ALS. 0 antissoro pré-absorvido não reagiu com as proteínas extraídas de S. cerevisiae contendo o plasmídeo vazio. Este antissoro bloqueou a aderência da S. cerevisiae pYF5 (um clone que expressa o ALS1 de Candida albicans) a células endoteliais.

EXEMPLO V 44

Anticorpos Policlonais Contra Proteínas de ALS Especificas Protegem Profilaticamente Ratos de Infeções da Mucosa e Hematologicamente Disseminadas por Candida

Tendo identificado os antissoros que bloqueiam a aderência de um clone de S. cerevisiae transformado com um gene de ALS sob as condições acima, foi demonstrado que estes antissoros protegem ratos de um desafio intravenoso com Candida albicans.

Os antissoros contra as proteínas de ALS foram inicialmente testados no modelo murídeo de candidíase hematologicamente disseminada. Os anticorpos anti-ALS purificados por afinidade são eficazes na prevenção da adesão e células de levedura aos vários substratos (ver EXEMPLO 3) . A purificação por afinidade é útil neste sistema porque as doses de anticorpo podem ser determinadas com exatidão. Além do mais, os antissoros não fracionados conterão indubitavelmente grandes quantidades de anticorpo dirigidos contra antigénios das células transportadores de S. cerevisiae. Muitos destes anticorpos anti-Saccharomyces ligar-se-iam provavelmente a C. albicans e tornariam impossível a interpretação dos resultados. Além disso, é muito possível que o procedimento utilizado para eluir os anticorpos de S. cerevisiae que expressam a proteína de ALS possa também eluir pequenas quantidades de manano ou glucano de levedura que poderiam ter atividade tipo adjuvante. Os anticorpos purificados por imunoafinidade são ainda purificados antes da utilização. Eles também podem ser pré-absorvidos com esplenócitos de rato.

Podem ser administradas doses de anticorpo de modo a cobrir a gama que inclui os níveis de anticorpo no soro que podem ser esperados nos protocolos de imunização mais ativos e de 45 modo a cobrir a gama de doses de anticorpo que são tipicamente utilizadas para imunização passiva em modelos de candidiase em murideo. Ver Dromer, F., J. Charreire, A. Contrepois, C. Carbon, e P. Yeni. 1987, Protection, of mice against experimental cryptococcosis by anti-Cryptococcus neofornwns monoclonal antibody, Infect. Immun. 55:749-752; Han, Y. e J.E. Cutler. 1995, Antibody response that protects against disseminated candidiasis, Infect. Immun. 63:2714-2719; Mukherjee, J., M.D. Scharff, e A. Casadevall. 1992, Protective murine monoclonal antibodies to Cryptococcus neofornwns, Infect. Immun. 60:4534-4541; Sanford, J.E., D.M. Lupan, A.M. Schlageter, e T.R. Kozel. 1990, Passive immunication against Cryptococcus neoformans with an isotype-switch family of monoclonal antibodies reactive with cryptococcal polysaccharide, Infect. Immun. 58:1919-1923. Ratos BALB/c (fêmeas, 7 semanas de idade, NCI) foram administrados com anti-ALS que tinha sido absorvido com células esplénicas de rato por uma injeção intraperitoneal (i.p.). Os ratos de controlo receberam soro pré-sangrado que tinha sido absorvido com células esplénicas de rato, soro anti-ALS intacto ou DPBS. respetivamente. Para a pré-absorção, 2 mL de anti-ALS ou soros pré-sangrados foram misturados com 100 pL de células esplénicas de rato (BALB/c, fêmeas com 7 semanas de idade, NCI) (ap. 9 x 106 células por mL) à temperatura ambiente durante 20 minutos. A mistura foi lavada com DPBS estéril quente por centrifugação (Θ300 xg) durante 3 minutos. Este procedimento foi repetido três vezes. O volume de injeção i.p. foi de 0,4 mL por rato. Quatro horas depois, os ratos foram desafiados com C. albicans (estirpe CA-1; 5 x 105 células de levedura hidrófilas por rato por injeção i.v.. Em seguida foram medidos os seus tempos de sobrevivência. Ver Figura 6. 46

Estudos anteriores mostraram que os anticorpos administrados por via intraperitoneal são rapidamente (em poucos minutos) e quase completamente transferidos para o soro (Kozel e Casadevall, observações não publicadas). Como um controlo para os efeitos de administração das preparações de anticorpo, um grupo paralelo de ratos foi tratado com anticorpos isolados de soro pré-imune que foram absorvidos com S. cerevisia transformada com o gene de ALS. Foram medidos o tempo de sobrevivência e os números de levedura por grama de rim. Mais uma vez, reportando à Figura 6, ratos infetados por via intravenosa com 106 blastoporos de mutante nulo de ALSl tinham um tempo de sobrevivência mediano mais comprido quando comparados com os ratos infetados com CAI-12 de Candida albicans ou Candida albicans em que tinha sido suprimido um alelo do ALSl (p=0, 003) .

Estes resultados indicam que as estratégias imunoterapêuticas utilizando as proteínas de ALSl como uma vacina têm um efeito profilático protetor contra a candidíase disseminada.

EXEMPLO VI

Diversidade Funcional e Estrutural na Família de Proteínas Ais de Candida. albicans O isolamento e caracterização do gene de ALSl de C. albicans por complementação heteróloga de S. cereviviae não aderente foram anteriormente descritos (Fu et al., Infect. Immun. 66:1783-1786 (1998)). O ALSl codifica uma proteína da superfície celular que medeia a aderência a células endoteliais e epiteliais. A rutura de ambas as cópias deste gene em C. albicans está associada a uma redução de 35% na 47 aderência a células endoteliais e a sobreexpressão de ALS1 aumenta a aderência em 125% (Fu et al., Mol. Microbiol. 44:61-72 (2002)). O ALS1 é um membro de uma grande família de genes de C. albicans consistindo de pelo menos oito membros inicialmente descritos por Hoyer et al. (Hoyer et al., Trends Microbiol. 9:176-180 (2001), Zhao et al.,

Microbiology 149:2947-2960 (2003)). Estes genes codificam proteínas da superfície celular que são caracterizadas por três domínios. A região N-terminal contém um péptido sinal putativo e é relativamente conservada entre as proteínas Ais. Prevê-se que esta região esteja pouco glicosilada (Zhao et al., Microbiology 14 9:2 947-2 960 (2003), Hoyer et al., Genetics 157:1555-1567 (2001)). A porção central destas proteínas consiste de um número variável de repetições em série (—36 aminoácidos de comprimento) e é seguida de uma região C-terminal rica em serina-treonina que contém uma sequência âncora de glicosilfosfatidilinositol (supra). Embora se saiba que as proteínas codificadas por esta família de genes são expressadas durante a infeção (Hoyer et al., Infect. Immun. 67:4251-4255 (1999), Zhang et al., Genome Res. 13:2005-2017 (2003)), a função das várias proteínas Ais vão foi investigada em pormenor. A expressão heteróloga de proteínas Ais em S. cerevisiae não aderente foi realizada para avaliar a função das proteínas Ais e para evitar a aderência de base elevada mediada pelas várias outras adesinas expressadas pela C. albicans. Este sistema de expressão heterólogo foi extensivamente utilizado para o estudo de genes de C. albicans, incluindo o isolamento e caracterização das adesinas ALS1, ALS5 e EAP1 (Li et al. , Eukaryot Cell 48 2:1266-1273 (2003), Fu et al, Infect. Immun. 66:1783-1786 (1998), Gaur et al., Infect. Immun. 65:5289-5294 (1997)). Como descrito mais abaixo, utilizando este sistema modelo foi demonstrado que as proteínas Ais têm várias funções adesivas e invasivas. Coerente com estes resultados, a modelação de homologia indicou que as proteínas Ais são relacionadas muito de perto em termos de estrutura com os membros de adesina e invasina da superfamília de imunoglobulinas de proteínas. As análises estruturais utilizando CD e espetrometria de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) confirmou que o domínio N-terminal de Alslp é constituído por domínios em folha β antiparalelos, voltas, α-helicoidais e não estruturados coerentes com as estruturas de outros membros da superfamília de imunoglobulinas. Finalmente, os modelos comparativos com base em energia sugerem diferenças nas propriedades físico-químicas chaves dos domínios N-terminais entre as várias proteínas Ais que podem governar as suas diferentes funções biológicas de aderência e invasão.

Para clonar os membros da família de Ais e os expressar em S. cerevisiae, os ALS1, -3, -5, -6, -7 e -9 foram amplificados e expressados com sucesso como descrito abaixo. Resumidamente, para a clonagem e outros passos de cultura foi utilizado a estirpe S150-2B de S. cerevisiae (leu2 his3 trpl ura3) para expressão heteróloga como foi anteriormente descrito (Fu et al., Infect. Immun. 66:2078-2084 (1998)). A estirpe SC5314 de C. albicans foi utilizada para clonagem genómica. Todas as estirpes foram cultivadas em meio definido mínimo (lx caldo de levedura à base de azoto (Difco) , 2% de glucose e 0,5% de sulfato de amónio, suplementado com 100 yg/mL L-leucina, L-triptofano, L-histidina e sulfato de adenina) solidificado com 1,5% de 49 bacto-ágar (Difco), consoante necessário. 0 crescimento de estirpes ura foi suportado pela adição de 80 yg/mL de uridina (Sigma). Os plasmídeos pGK103, contendo ALS5, pYF5, contendo ALS1, e pALSn, contendo ALS9, foram anteriormente descritos (Fu et al. . Infect. Immune. 66:1783-1786 (1998), Gaur et al., Infect. Immune. 65:5289-5297 (1997), Lucinod et al., Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Society for Microbiology, pp. 204, American Society for Microbiology, Sal Lake City, Ut. (2002)). O plasmideo pADHl, obtido de A. Brown (Aberdeen, UK) contém o promotor e finalizador do gene da álcool-desidrogenase (ADH1) de C. albicans, os quais são funcionam na S. cerevisiae (Bailey et al., J. Bacteriol. 178:5353-5360 (1996)). Este plasmideo foi utilizado para a expressão constitutiva dos genes de ALS em S. cerevisiae. Células epiteliais orais e endoteliais vasculares humanas foram obtidos e cultivadas como se segue. A linha de células epiteliais orais FaDu, isolada de um carcinoma faringeo, foi adquirida de American Type Culture Collection (ATCC) e mantida de acordo com o seu protocolo recomendado. As células endoteliais foram isoladas de veias do cordão umbilical e mantidas pela nossa modificação anteriormente descrita do método de Jaffe et al. (Fu et al., Mol. Microbiol. 44:61-72 (2002), Jaffe et al., J. Clin. Invest. 52:2745-2756 (1973)). Todas as culturas de células foram mantidas a 37 °C num ambiente humidificado contendo 5% C02.

Para clonagem dos genes de ALS, as sequências genómicas de membros da familia de ALS foram identificadas por pesquisa com BLAST da base de dados Stanford (disponível na World Wide Web em URL: sequence.stanford.edu/group/candida/search.html). Foram gerados iniciadores de PCR para amplificar especificamente cada uma das grelhas de leitura aberta que incorporou um 50

sitio de enzima de restrição 5' BglII e um 3' Xhol e são mostrados abaixo no Quadro I (SEQ ID NOS :14-19 (ALS 1, 3, 5, 6, 7 e 9 iniciadores mensageiros, respetivamente); SEQ ID NOS :20-25 ((ALS 1, 3, 5, 6, 7 e 9 iniciadores antimensageiros, respetivamente)) . Cada gene foi clonado por PCR utilizando o sistema de PCR de alta fidelidade Expand® (Roche Applied Science). Os ALS3, ALS6 e ALS7 foram amplificados a partir do ADN genómico de C. albicans SC5314, enquanto que os ALS1, ALS5 e ALS9 foram amplificados de plasmideos que tinha sido previamente recuperados de bibliotecas genómicas de C. albicans (Fu et al., Infect. Immune. 66:1783-1786 (1998), Gaur et al.,

Infect. Immune. 65:5289-5297 (1997), Lucinod et al.,

Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Society for Microbiology, pp. 204, American Society for Microbiology, Sal Lake City, Ut. (2002)). Os produtos de PCR foram ligados num pGEM-T-Easy (Promega) para

sequenciação. As grelhas de leitura aberta de ALS verificadas quanto à sequência foram em seguida libertadas a partir de pGEM-T-Easy por co-digestão com BglII-Xhol e ligadas em pADHl, de tal forma que o gene de ALS de interesse estava sob o controlo do promotor de ADH1. A estirpe de S. cerevisiae S150-2B foi transformada com cada uma das construções de sobreexpressão de ALS bem como a construção pADHl vazia utilizando o método de acetato de litio. A expressão de cada gene de ALS em S. cerevisiae foi verificada por análise de transferência de Northern antes de serem realizadas análises fenotípicas. 51

Quadro 1

Iniciadores de PCR utilizados na amplificação de regiões de codificação do gene de ALS para expressão heteróloga em S. cerevevisia Gene de ALS Mensageiro (5' -3') Antimensageiro (5' -3') AGATCTCAGATGCTTCAACAATTTACATT CTCGAGTCACTAAATGAACAAGGACAATA ALSl G GAAGATCTATGCTACAACAATATACATT CCGCTCGAGTTAAATAAACAAOGATAATA ALS3 GTTACTC ATGTGATC ALS5 AGATCTCAACTACCAACTGCTAACA CTCGAGACCATATTATTTGGTACAATC ALS 6 AGATCTCATTCACCGACAATGAAGACA CTCGAGTTGGTACAATCCCGTTTGA ALS 7 AGATCTTCAACAGTCTAATACCTATGA CTCGAGACTTGATTGAATTATACCATATA ALS9 AGATCTCGAATGCTACCACAATTCCTA CTCGAGTCTTAGCACCCTGACGTAGCT A expressão do ARNm de ALS foi detetado por análise de transferência de Northern para cada construção. Apesar da utilização de três conjuntos de iniciadores, a amplificação de ALS 2 e ALS4 a partir do ADN genómico de C. albicans SC5314 foi efetuada sem sucesso. Dada a dificuldade de sequenciação e montagem ao longo das repetições em série dos genes de ALS, é possível que este resultado espelhe erros na montagem da sequência atualmente disponível na base de dados do genoma publicado. A citometria de fluxo confirmou que cada uma das proteínas Ais era expressada na superfície dos respetivos hospedeiros de S. cerevisiae. Resumidamente, a confirmação da expressão na superfície celular de cada uma das construções de Ais foi determinada utilizando imunofluorescência indireta usando dois antissoros policlonais anti-Als diferentes. 0 antissoro A consistia de anticorpos anti-Alslp, gerados por imunização de coelhos com um fragmento N-terminal de 417 aminoácidos da Alslp. 0 antissoro B foi anti-fator de manano 5 de C. albicans de coelho que reconhece componentes 52 da parede celular de C. albicans mas não reage de modo cruzado com S. cerevisiae (Iatron Laboratories).

Para cada estirpe, 107 blastosporos foram isolados a partir de uma cultura de um dia para o outro, bloqueados com 100 pL de soro de cabra e, em seguida, revelados com antissoro policlonal A ou B a uma diluição a 1:25, seguido de anti-IgG de coelho de cabra marcado com isotiocianato de fluoresceina a 1:100. Nas análises de citometria de fluxo foi utilizado um instrumento FACSCaliber (Becton Dickinson) munido de um laser de árgon a emitir a 488 nm. A emissão de fluorescência foi detetada com um filtro passa-banda a 515/40-nm. Foram recolhidos os dados de fluorescência para 10 000 eventos e a distribuição de células com fluorescência acima da linha de base (isto é, S. cerevisiae transformada com o plasmídeo vazio) foi analisada para cada estirpe utilizando o software CELLQUEST (Becton Dickinson).

Como se mostra no Quadro II, os dois antissoros diferentes demonstraram que todas as estirpes que expressam Alsp exibiram pelo menos um aumento de 4 vezes na fluorescência quando comparadas com a S. cerevisiae transformada com o plasmideo vazio. Coerente com a diversidade estrutural prevista entre os membros da família de Ais, os antissoros exibiram diferenças no reconhecimento de estirpes de expressão de Ais individuais. 53

Quadro II

Deteção de proteínas Ais na superfície de S. cerevisiae através de análise por citometria de fluxo Os blastosporos de cada estirpe foram revelados utilizando imunofluorescência indireta com antissoro policlonal anti-Alslp (A) ou antissoro policlonal anti-parede celular de C. albicans (B) e em seguida analisados utilizando citometria de fluxo. Os resultados são expressados como percentagem de células positivas acima do nível de base (S. cerevisiae transformada com plasmídeo vazio), com as vezes de aumento entre parênteses. Percentagem de células acima do nível de base (vezes de aumento) Construção de Ais Antissoro A Antissoro B Plasmídeo vazio (D (D Alslp 47,8 (17) 50,1 (19) Als3p 24,5 (9) 54,0 (20) Als5p 23,5 (8) 28,2 (11) Als6p 12,7 (4) 16,2 (6) Ais 7p 22,1 (8) 15,7 (6) Als9p 11,4 (4) 33,9 (13)

Os clones de S. cerevisiae que expressavam as várias proteínas Ais foram analisados quanto à sua capacidade para aderir a uma variedade de substratos do hospedeiro. Como descrito abaixo, os resultados mostram que as proteínas Ais exibem perfis de aderência específica em relação ao substrato diferentes.

Foram realizados ensaios de aderência fúngica para determinar as propriedades de aderência de estirpes de S. cerevisiae transformadas. Resumidamente, foi utilizada uma modificação do ensaio de aderência anteriormente descrito (8) como se segue. As placas de aderência foram revestidas adicionando 1 mL de uma solução 0,01 mg/mL de gelatina (Sigma), laminina (Sigma) ou fibronectina (Becton Dickinson) a cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços (Costar) e incubando de um dia para o outro a 37 °C. Para as células endoteliais, as células da segunda subcultura foram cultivadas até à confluência nas placas de cultura de tecidos de 6 poços revestidas com uma matriz de 0,2% de gelatina, e para as células epiteliais, as células 54

FaDU foram cultivadas até à confluência (3 dias) em placas de cultura de tecidos de 6 poços revestidas com um 0,1% de matriz de fibronectina. Antes dos ensaios de aderência, os poços foram lavados duas vezes com 1 mL de solução salina equilibrada de Hanks quente (HBSS) . As estirpes de S. cerevisiae a serem testadas foram cultivadas de um dia para o outro em meio definido minimo a 30 °C e em seguida colhidas por centrifugação, lavadas com HBSS (Irvine Scientific) e enumeradas utilizando um hemocitómetro. Foram adicionados trezentos organismos a cada poço de um placa de cultura de tecidos de 6 poços revestidos com o substrato de interesse e incubados durante 30 min a 37 °C em C02. Os organismos não aderentes foram removidos lavando duas vezes de uma maneira padronizada com 10 mL de HBSS. Os poços foram cobertos com ágar de YPD (1% de extrato de levedura (Difco), 2% de bacto-peptona (Difco), 2% de D-glucose, 1,5% de ágar) e o inoculo foi confirmado por cultura quantitativa. As placas foram incubadas durante 48 h a 30 °C, e as colónias foram contadas. A aderência foi expressada como uma percentagem do inoculo inicial. As diferenças na aderência foram comparadas utilizando um ensaio de análise de variância unifatorial, com p < 0,01 considerado significativo.

Houveram diferenças marcantes nos perfis de aderência dos transformantes de S. cerevisiae aos diferentes substratos (Fig. 8). Enquanto as estirpes que expressam as Alslp, Als3p, e Als5p se ligam a todos os substratos testados, a S. cerevisiae que expressa a Als6p aderiu apenas à gelatina e a S. cerevisiae que expressa a Als9p aderiu acima dos niveis de base apenas à laminina. Além disso, existiram diferenças quantitativas na aderência aos vários substratos. Por exemplo, quando comparada com a Als3p, a Alslp confere maior aderência à gelatina mas menos 55 aderência às células epiteliais (p < 0,01, análise de variância unifatorial). Apenas a S. cerevisiae que expressa a Als7p não aderiu a nenhum dos substratos testados. Embora não possam ser descartadas diferenças pequenas nos niveis de expressão da proteina Ais pelos estudos de imunofluorescência mostrados no Quadro II, não é provável que essas diferenças sejam responsáveis pelos padrões de ligação específicos em relação ao substrato encontrados neste estudo. Esperar-se-ia que um tal aumento ou diminuição global na quantidade de proteina Ais expressada na superfície da célula produzisse um aumento ou diminuição proporcional na aderência ao longo de todos os substratos e não resultasse nas diferenças específicas em relação ao substrato que foram observadas.

Como descrito abaixo, a especificidade de ligação ao substrato para as proteínas Ais reside nas sequências N-terminais das proteínas Ais. Resumidamente, a expressão de Als5p em S. cerevisiae conferiu aderência a vários substratos, incluindo gelatina e células endoteliais, enquanto que a expressão de Als6p resultou na aderência apenas à gelatina. Apesar desta diferença acentuada na função, as Als5p e Als6p são mais do que 80% idênticas ao nível dos aminoácidos. As porções de repetição em série e C-terminal destas proteínas são virtualmente idênticas e a maioria das diferenças na sequência concentram-se nas extremidades N-terminais destas duas proteínas. Estes dados indicam que a variabilidade da sequência N-terminal confere especificidade em relação ao substrato. 0 resultado acima foi suportado pelos resultados de estudos que determinam os fenótipos de aderência de construções quiméricas ALS5/ALS6. Resumidamente, as proteínas quiméricas Als5/Als6 foram construídas trocando as extremidades N-terminais de cada uma das proteínas. Os 56 genes quiméricos ALS5/6 foram construídos como se segue. Foi isolado um fragmento BglII-Hpal de ALS5 abrangendo as 2117 pb 5' do gene. 0 pGEM-T-ALS6 foi então digerido com BglII e Hpal para libertar as 2126 pb 5' correspondentes de ALS6 e o fragmento consistindo de pGEM-T-Easy mais as sequências 3' de ALS6 foi isolado e ligado ao fragmento 5' de ALS5 para gerar o plasmídeo pGEM-T-5N6C. Uma abordagem idêntica utilizando o fragmento 5' correspondente de ALS6 e o fragmento 3' de ALS5 foi utilizada para gerar o plasmídeo p-GEM-T-6N5C. Após confirmação da sequência, cada gene quimérico de ALS foi libertado por digestão com BglII-Xhol e subclonado em pADHl como acima. A S. cerevisiae S150-2B foi então transformada com estas construções e a expressão foi verificada através de análise de transferência de Northern antes da caracterização das suas propriedades de aderência. A S. cerevisiae que expressa uma fusão quimérica da extremidade N-terminal de Als5p com a extremidade C-terminal de Als6p aderiu tanto à gelatina como a células endoteliais de uma forma semelhante à Als5p (Fig. 9) . Do mesmo modo, as estirpes que expressam a fusão quimérica da extremidade N-terminal da Als6 à extremidade C-terminal de Als5p aderiu apenas à gelatina, como fez a S. cerevisiae que expressa a Als6p (Fig. 9) . Além disso, as estirpes que expressam a Als5p e a proteína quimérica Als5N6C aglutinaram com esferas revestidas com fibronectina, enquanto que aquelas que expressam a Als6p e a proteína quimérica Als6N5C tiveram pouca ou nenhuma afinidade para estas esferas. Coletivamente, estes dados indicam que os perfis de aderência destas estirpes de S. cerevisiae transformadas foram governados pela porção N-terminal da proteína Ais. 57

Além das diferenças na especificidade de substrato demonstradas entre os membros da familia de proteinas Ais, também foram observadas diferenças noutras funções biológicas. Por exemplo, foi demonstrado que um subconjunto de proteinas Ais medeia a invasão de células endoteliais pela S. cerevisiae. A C. albicans invade células endoteliais induzindo a sua própria endocitose (Filler et al., Infect. Immun. 63976-983 (1995), Belanger et al., Cell Microbiol., no prelo (2002)). Esta endocitose ocorre depois de o organismo aderir às células endoteliais; contudo, os ligandos de C. albicans necessários para este processo são desconhecidos. Além disso, é pouco claro se são necessários ligandos de Candida distintos para a aderência e endocitose. Além de ser não aderente, a S. cerevisiae não sofre endocitose significativa pelas células endoteliais. Por conseguinte, para testar se as proteinas Ais poderiam servir como invasinas bem como adesinas, foi determinada a capacidade de estirpes de S. cerevisiae que expressam proteinas Ais para invadir células endoteliais. A capacidade de proteinas Ais para mediar a invasão de células endoteliais foi determinada utilizando uma modificação de um ensaio de fluorescência diferencial anteriormente descrito (Phan et al., Infect. Immun. 68:3485-3490 (2000)). Resumidamente, células endoteliais foram cultivadas até à confluência em lamelas de vidro de 12 mm de diâmetro revestidas com fibronectina e colocadas numa placa de cultura de tecidos de 24 poços (Corning). As células foram em seguida infetadas com 105 blastosporos de cada estirpe de S. cerevisiae em meio RPMI 1640 (Irvine Scientific). Como um controlo positivo, as células foram infetadas com um número semelhante de blastosporos de C. albicans. Após incubação durante 90 min, as células foram lavadas duas vezes com 0,5 mL de HBSS de uma maneira 58 padronizada e fixadas com paraformaldeido a 3%. Os organismos que permaneceram aderentes à superfície das células endoteliais foram reveladas durante lh com o antissoro anti-C. albicans de coelho (Biodesign), o qual foi conjugado com Alexa 568 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) , que entra em fluorescência no vermelho. Este antissoro reage de forma cruzada com S. cerevisiae a uma diluição 2 vezes superior. As células endoteliais foram em seguida permeabilizadas em Triton X-100 a 0,2% em soro fisiológico tamponado com fosfato durante 10 min, após o que os organismos associados à célula (os organismos internalizados mais os aderentes) foram novamente revelados com o antissoro anti-C. albicans conjugado com Alexa 488, o qual entra em fluorescência no verde. As lamelas foram em seguida observadas sob epifluorescência. O número de organismos que foi internalizado pelas células endoteliais foi determinado subtraindo o número de organismos aderentes (que entram em fluorescência no vermelho) do número de organismos associados à célula (que entram em fluorescência no verde). Foram contados pelo menos 100 organismos em cada lamela e todas as experiências foram realizadas em triplicado em pelo menos três ocasiões separadas.

Foram também realizados ensaios de aderência a esferas de fibronectina para caracterizar ainda melhor as caracteristicas de ligação de certas proteínas Ais. A este respeito, a Als5p foi inicialmente identificado em virtude da capacidade da proteína para induzir a aglutinação de esferas revestidas com fibronectina quando expressada na superfície de S. cerevisiae (Gaur et al., Infect. Immune. 65:5289-5297 (1997)). Por conseguinte, estirpes de S. cerevisiae transformadas com ALS5, ALS6, 5N6C e 6N5C para a fibronectina foram testadas quanto à aderência a esferas utilizando esta metodologia (Gaur et al., Infect. Immune. 59 65:5289-5297 (1997), Gaur et al., Infect. Immun. 67:6040-6047 (1999)). Resumidamente, esferas magnéticas tosiladas (Dynal Biotech) foram revestidas com fibronectina seguindo as instruções do fabricante. A seguir, 10 pL de esferas revestidas (106 esferas) foram misturados com 1 x 108 S. cerevisiae transformadas em 1 mL de tampão Tris-EDTA lx (TE), pH 7,0, e incubados misturando suavemente durante 45 min. Os tubos foram colocados num iman para separar as esferas e S. cerevisiae aderente de organismos não aderentes. O sobrenadante contendo organismos não aderentes foi removido por aspiração e as esferas remanescentes foram lavadas três vezes por ressuspensão em 1 mL de tampão de TE, seguida de separação magnética e aspiração do sobrenadante. Finalmente, as esferas lavadas e organismos aderentes foram ressuspensos em 100 pL de tampão de TE e examinadas microscopicamente quanto à co-aglutinação.

Os resultados mostram que as S. cerevisiae que expressam Alslp, Als3p e Als5p exibiram um aumento significativo da percentagem de organismos associados à célula, refletindo a sua capacidade para aderir às células endoteliais. Além disso, os organismos que expressam Als3p e, numa extensão menor, Alslp e Als5p demonstraram invasão significativa de células endoteliais (Fig. 10).

Além dos estudos funcionais descritos acima, constatou-se também que as proteínas Ais são homólogas às adesinas e invasinas da superfamília de imunoglobulinas. Como um passo inicial na modelação molecular de proteínas Ais foi utilizado um algoritmo de procura baseado no conhecimento para identificar moléculas que partilham semelhança estrutural significativa com membros da família de Ais. Resumidamente, a modelação de homologia e com base em energia foi realizada para comparar na totalidade as 60 características físico-químicas de proteínas Ais. Em primeiro lugar foi utilizado um método baseado no conhecimento (SWISS-MODEL) (Guex et al., Electrophoresis 18:2714-2723 (1997), Schwede et al., Nucleic Acids Res. 31:3381-3385 (2003)) para analisar e comparar alinhamentos estruturais de extensão combinatória de estruturas na base de dados de proteínas Swiss e Brookhaven para proteínas com conformação homóloga (Shindyalov et al., Protein Eng. 11:739-747 (1998)). Esta abordagem incluía o algoritmo BLASTP2 (Altschul et al., Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) para pesquisar semelhanças da sequência primária na base de dados ExNRL-3D. Em paralelo, o algoritmo de alinhamento de sequência dinâmico SIM (Huang et al., Adv. Appl. Math. 12:337-367 (1991)) foi utilizado para selecionar cadeias molde candidatas com a maior identidade de sequência. Subsequentemente, foi utilizado o ProModII para conduzir análises primárias e correspondências refinadas. As proteínas resultantes foram utilizadas como cadeias molde para modelação de homologia de trajetórias da cadeia principal de proteínas Ais.

Modelos robustos dos domínios N-terminais das proteinas Ais (por exemplo aminoácidos 1-480; que precedem as repetições em série iniciais) foram gerados através de abordagens complementares. Os domínios N-terminais de proteínas Ais foram convertidos em conformações putativas em solução por homologia de sequência (Composer (Topham et al. Biochem. Soc. Symp. 57:1-9 (1990)) e métodos de segmentação (Matchmaker (Godzik et al., J. Mol. Biol. 227:227-238 (1992)) e Gene-Fold (Jaroszewski et al., Protein Sei. 7:1431-1440 (1998), Godzik et al., Protein Eng. 8:409-416 (1995), Godzik et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:12098-12102 (1992), Godzik et al., J. Comput. Aided Mol. Des. 7:397-438 (1993)) utilizando o software SYBILO 6.9.1 (Tripos Associates) a funcionar numa estação de trabalho 61

Silicon Graphics (SGI, Inc.) . Os confórmeros e cadeias laterais de aminoácido resultantes de dominios de Ais alvo foram refinados por dinâmica molecular, e as energias da estirpe foram minimizadas utilizando o método do campo de força AMBER95 (Duan et al. , J. Comput. Chem. 24:1999-2012 (2003)) e o minimizador Powell (Powell et al., Math. Program 12:241-254 (1977)).

Estas abordagens otimizam as interações da cadeia lateral onde estão fixas as posições dos átomos da cadeia principal do péptido. As conformações preferidas foram determinadas a partir da dinâmica molecular alargada em solvente aquoso. A seguir, os ângulos de torção de todas as ligações peptidicas foram ajustados a 180 ± 15°, com restrições mínimas. Nalguns casos, a dinâmica molecular foi executada, sem restrições ou com regiões α-helicoidais restringidas aplicando uma penalização de 0,4-kJ aos ângulos 0 e ψ de Ramachandran canónicos. Minimizações finais da energia global foram realizadas para cada modelo após a remoção de todas as restrições e agregados. Os modelos do domínio N-terminal de Ais resultantes foram priorizados com base em três critérios: (i) energia de estirpe mais favorável (mecanismos moleculares); (ii) funções de energia posicionai empírica; e (iii) conservação do arranjo espacial de potenciais pontes de dissulfureto (Godzik et al., J. Mol. Biol. 227:227-238 (1992), Bowie et al., Science 253:164-170 (1991), Eisenberg et al., Methods Enzymol. 277:396-404 (1997), Fischer et al., FASEB J. 10:126-136 (1996), Luthy et al., Nature 356:83-85 (1992)). Os modelos de Ais foram avaliados quanto à validade em relação a cadeias molde de homologia utilizando medições padrão (valores e (Welch et al., Biochemistry 35:7165-7173 (1996), Welch et al., Biochemistry 33:6074-6085 (1994)). Finalmente, as propriedades físico-químicas dos modelos de Ais foram visualizadas por MOLCAD (Heiden et al., J. 62

Comput. Chem. 14:246-250 (1993)), como implementado nas plataformas SYBIL e HINT (Kellog et al., J. Comput. Aided Mol. Des. 5:545-552 (1991)), de tal forma que as propriedades físicas foram projetadas na superfície acessível à água dos domínios N-terminais de Ais.

Estes modelos indicam que os domínios N-terminais de todas as proteínas Ais contêm vários domínios de folha β antiparalelos, coerentes com membros da superfamília de imunoglobulinas. Os resultados estão resumidos abaixo no Quadro III. Estas proteínas consistem tipicamente de domínios de folha β antiparalelos de sete cadeias complexos, a partir dos quais se projetam estruturas em ansa/espiral. Os domínios de folha β estão separados uns dos outros por regiões de interrupção. Esta estrutura é frequentemente referida como um motivo de esferas numa corda. Particularmente notável é que praticamente todas as proteínas Ais deram forma a homólogos de adesina ou invasina conhecidos (Quadro III). Foram observados diferentes padrões de semelhança entre as proteínas Ais analisadas. Por exemplo, todas as proteínas Ais examinadas, exceto a Als7p, partilharam de homologia significativa com a proteína de ligação a colagénio de Staphilococcus aureus. No entanto, os homólogos primários, secundários e terciários específicos variaram para a maioria dos membros da família (Quadro III) . Por exemplo, as Als2p e Als9p partilhavam um homólogo primário, secundário e terciário idêntico. 63

Quadro III

Comparação de homólogos entre as proteínas Ais Os homólogos de cada proteína Ais foram identificados pelo algoritmo baseado no conhecimento descrito e foram ordenados por ordem descendente de correlação estrutural de 1 até 3. NS, não foi identificado um modelo significativo por modelação de homologia (coeficiente de correlação ((r2) d 70%. PDB, código do Banco de Dados de Proteína de acordo com o formato do National Center for

Biotechnology Information.

Proteína Homólogo 1 Homólogo 2 Homólogo 3 Alslp Proteína de ligação Proteína de ligação a Fator a invasina/integrina colagénio de aglutinante de de Yersinia Staphilococcus aureus S. aureus (PDB pseudotuberculose (PDB lcwv)a (PDB ld2p)a 1η67 A)b Als2p Proteína de ligação Proteína de ligação a Proteína da a colagénio de S. invasina/integrina de camada de aureus (PDB ld2p)a Y. pseudotuberculose (PDB lcwv)" superfície de Methanosarcina mazei (PDB 1 LOQA)c Als3p Proteína de ligação Proteína de ligação a Fator a colagénio de S. invasina/integrina de aglutinante de aureus (PDB ld2p)a Y. pseudotuberculose (PDB lcwv)6 S. aureus (PDB 1 n67A)c NS Als4p Proteína de ligação a colagénio de S. aureus (PDB ld2p)a Proteína de ligação a invasina/integrina de Yersinia pseudotuberculose (PDB lcwv)a Y. pseudotuberculose (PDB lcwv)b Als5p Proteína de ligação Proteína da camada de Proteína de a invasina/integrina superfície de M. ligação a de Yersinia pseudotuberculose (PDB lcwv)b mazei (PDB 1LOQA)b colagénio S. aureus (PDB ld2p)c Als6p Proteína de ligação Proteína de ligação a Neuraminidase do a colagénio de S. invasina/integrina de vírus da gripe aureus (PDB ld2p)b Y. pseudotuberculose (PDB I cwv)b tipo B (PDB lnsca)c Als7p Proteína da camada de superfície de M. mazei (PDB 1LOQA)b NS NS Als9p Proteína de ligação Proteína de ligação a Proteína da a colagénio de S. invasina/integrina de camada de aureus (PDB · ld2p)a Y. pseudotuberculose (PDB lcwv)b superfície de M. mazei (PDB 1LOQA)

Foi também determinado que as proteínas Ais contêm regiões hipervariáveis N-terminais que se localizam em estruturas 64 ansa/espiral previstas. A este respeito, apesar das diferenças observadas na aderência especifica em relação ao substrato mediada por proteínas Ais particulares, regiões grandes da sequência nos dominios N-terminais são conservadas ao longo desta familia. No entanto foram encontradas sete regiões de divergência significativa entre as proteínas Ais designadas regiões hipervariáveis (HVRs) 1-7. Estas regiões (constituídas por 8 ou mais aminoácidos) não continham qualquer identidade consenso evidente ao longo das proteínas Ais e menos de 50% de conservação de consenso. Em contraste, as regiões conservadas intermédias (CRs) 1-7, exibiram mais de 30% de identidade consenso e mais de 50% de conservação consenso ao longo das proteínas Ais. Um gráfico de identidade e alinhamento esquemático destas sequências de aminoácidos compreendendo os domínios N-terminais (resíduos 1-420) das proteínas Ais com função conhecida é apresentado na Fig. 11, A e B. Em particular, a modelação de homologia revelou que as HVRs de diferentes proteínas Ais, apesar de se distinguirem em sequência, prevê-se que se ajustem a estruturas ansa/espiral semelhantes que se projetam a partir dos componentes de folha β das CRs. Assim, a presença destas HVRs conservadas indicam que elas estão disponíveis para interagir com os constituintes do hospedeiro.

Além da modelação de homologia e determinações relacionadas descritas acima, determinações empíricas confirmam adicionalmente a estrutura prevista para o domínio N-terminal de Alslp. Para testar as hipóteses geradas pela nossa modelação de homologia, as características estruturais do domínio N-terminal de Alslp foram determinadas utilizando as abordagens complementares de CD e espetrometria de FTIR. Esta proteína, abrangendo os aminoácidos 17-432 da Alslp, foi produzida em S. cerevisiae 65 e foi anteriormente descrita por Fu, et ai., Molecular Microbiology, 44:61-72 (2002).

Resumidamente, os espetros de dicroismo circular foram registados com um espetropolarimetro AVIV 62DS (Aviv Biomedical Inc.) munido com um controlador termoelétrico de temperatura. As soluções aquosas de Alslp (10 μΜ em soro fisiológico tamponado com fosfato) foram varridas utilizando células de quartzo desmontáveis com percurso ótico de 0,1 mm a uma velocidade de 10 nm/min de 260 a 185 nm e um intervalo de amostragem de 0,2 nm. Os espetros de tampão sem péptido foram subtraídos das soluções de amostra para minimizar os artefactos de dispersão de luz e os espetros finais foram uma média de 8 varrimentos registados a 25 °C. O instrumento foi rotineiramente calibrado com ácido (+)-10-canforsulfónico (1 mg/mL numa célula com comprimento de percurso de 1 mm) (Johnson et al., Proteins 7:205-214 (1990)) e a elipticidade foi expressada como a elipticidade residual média (l)MRE (graus-cm2 dmol-1). A concentração de proteína foi determinada por absorvância a 280 nm com base na composição de aminoácidos aromáticos do domínio de Alslp expressado (Pace et al, . Protein Sei 4:2411-2423 (1995)). Os espetros de CD foram desconvolucionados em hélices, folhas β, voltas e estruturas desordenadas utilizando Selcon (Sreerama et al, Protein Sei. 8:370-380 (1999)) através da interface Dichroweb baseada na internet (Lobley et al., Bioinformaties 18:211-212 (2002)) (cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html).

Os espetros de infravermelho de auto-películas de Alslp foram registados a 25 °C num espetrómetro de FTIR Bruker Vector 22 (Bruker Optics) munido com um detetor de sulfato de triglicina deuterado a um ganho de 4, calculando a média de 256 varrimentos e a uma resolução de 2 cm-1. Espalhou-se 66 cinquenta microgramas da proteína em 50 pL de soro fisiológico tamponado com fosfato sobre a superfície de um cristal de amostra de refletância total atenuado com germânio 50 x 20 x 2-mm (Pike Technologies) e deixou-se secar. A auto-película de proteína seca foi então hidratada com D20 durante 1 h antes de registar os espetros de infravermelho. As bandas de amida I dos espetros de infravermelho foram analisadas quanto às conformações secundárias através do calcula das áreas de picos de componentes com um software de ajuste de curva (GRAMS/32, Versão 5; Galactic) . Os limites de frequência para as várias conformações foram como se segue: hélice a (1662— 1645 cm-1), folha β (1637-1613 e 1710-1682 cm-1), ansas de volta β (1682-1662 cm-1) e estruturas desordenadas (1645— 1637 cm-1) (50-52) .

Os resultados de dicroísmo circular do domínio N-terminal de Alslp são mostrados na Figura 12A e revelam um mínimo dicróico a 217 nm e um máximo dicroico positivo forte próximo de 200 nm. Estas características são típicas de uma proteína possuindo uma componente de folha β antiparalela dominante. A desconvolução dos espetros de CD indicou que a proteína assumia conformações de 50,1% de folha β, enquanto outras contribuições de classe estrutural incluem estruturas desordenadas (26,9%), estruturas em volta (19,3%) e hélice α (3,7%).

Como se mostra na Figura 12B, as medições de FTIR de uma auto-película da Alslp hidratada corroboram fortemente que a amostra tem uma conformação de folha β dominante. Estes espetros revelaram bandas fortes de amida I a frequência baixa com picos centrados a 1634 e 1628 cm-1 e uma banda fraca a frequência alta centrada a 1685 cm-1. Esta divisão de frequência dos espetros de infravermelho da amida I de 67 proteínas em componentes de frequência alta e baixa foi demonstrada ser típica do efeito de acoplamento do dipolo de transição entre as folhas β antiparalelas intermoleculares (Halverson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:6701-6703 (1991)). O ajuste de curva dos espetros indicou que a construção da proteína é ~57,2% de folha β antiparalela. Outras conformações estruturais secundárias a partir do ajuste de curva dos espetros de IR incluem estruturas desordenadas (20,5%), componentes de volta (13,3%) e hélice cx (9,0%).

Tomados em conjunto, os dados de FTIR e CD corroboram ainda que a extremidade N-terminal da Alslp contém domínios de estrutura de folha β antiparalela predominantes contendo componentes menores de hélice α e volta, interrompidos por reqiões menos estruturadas.

Os modelos tridimensionais indicam ainda diferenças físico-química entre os domínios N-terminais de Ais. A este respeito, os modelos moleculares indicaram diferenças nos atributos físico-químicos previsto para os domínios N-terminais de proteínas Ais que provavelmente influenciam as suas interações com células hospedeiras e vários substratos. Como se mostra na Figura 13, as proteínas Ais podem ser separadas em três grupos distintos com base nas distribuições de hidrofobicidade, carga e potencial de ligação de hidrogénio na superfície. As Alslp, Als3p e Als5p partilham, cada, de padrões semelhantes destas propriedades e são assim consideradas o grupo A de Ais. Em contraste, as propriedades físico-químicas previstas para os domínios N-terminais das Als6p e Als7p (grupo B de Ais) têm diferenças marcantes daquelas do grupo A de Ais (Fig. 13). Enquanto o potencial catiónico nos membros do grupo A de Ais está tipicamente segregado das suas facetas neutra ou aniónica, a carga positiva está amplamente distribuída 68 sobre toda a superfície dos membros do grupo B de Ais, Als6p e Als7p. Finalmente, as extremidades N-terminais de Als2p, Als4p e Als9p parecem constituir um terceiro grupo de proteínas Ais (o grupo C de Ais) que difere estruturalmente das proteínas do grupo A ou B de Ais. As proteínas do grupo C de Ais pareciam ser mais semelhantes às proteínas do grupo A de Ais do que às do grupo B de Ais em termos de distribuição hidrófoba ou eletrostática.

Na C. albicans foram identificadas várias proteínas com função adesiva. Foi demonstrado que a Hwplp medeia a aderência às células epiteliais bucais atuando como um substrato para a transglutaminase de mamífero (5) . A EAP1 foi recentemente identificada por expressão heteróloga em S. cerevisiae e medeia a aderência a poliestireno e células epiteliais renais in vitro (7). Dos oito membros da família de proteínas Ais, apenas as Alslp e Als5p foram estudadas de uma perspetiva funcional. Foi demonstrado que a expressão heteróloga de Alslp medeia a ligação às células endoteliais vasculares e células epiteliais humanas, uma observação que foi confirmada em C. albicans através de estudos de rutura de gene (Fu et al., Mol. Microbiol. 44:61-72 (2002), Fu et al., Infect. Immune. 66:1783-1786 (1998)). A expressão heteróloga de ALS5 em S. cerevisiae confere aderência a colagénio, fibronectina, albumina de soro bovino e laminina (Gaur et al., Infect. Immune. 65:5289-5297 (1997), Gaur et al., Infect. Immun. 67:6040- 6047 (1999), Gaur et al., Cell Commun. Adhes. 9:45-57 (2002)). Não foi realizada qualquer comparação em grande escala das especificidades das adesinas de C. albicans em relação ao substrato. Neste estudo, nós comparamos as propriedades adesivas de um grupo estruturalmente diverso de membros da família de proteínas Ais. Os nossos dados demonstram que as proteínas Ais compreendem uma família 69 variada de proteínas de superfície com um espetro de especificidades sobreposto para aderência a uma variedade de substratos humanos (Fig. 8) . Além disso, os resultados de experiências de troca do presente domínio indicam que os domínios N-terminais de proteínas Ais conferem a especificidade dos seus perfis de aderência ao substrato.

Além de mediar a aderência, os nossos dados sugerem que as proteínas Ais também podem atuar como invasinas. Curiosamente, enquanto as S. cerevisiae que expressam tanto a Alslp como a Als3p demonstraram aderência semelhante às células endoteliais, a S. cerevisiae que expressa a Als3p sofreu internalização a uma velocidade muito maior. Estes resultados indicam que a endocitose não é somente uma extensão da aderência mas, antes pelo contrário, um processo distinto que pode ser influenciado pela interação ligando-recetor. É provável que as diferenças nas sequências N-terminais das proteínas Ais medeiam estas funções distintas, como é o caso com a aderência.

As propriedades físico-químicas dos domínios proteicos como distribuídas no espaço tridimensional são caracteristicas estruturais cruciais que governam as interações recetor-ligando (Eisenberg et al, J. Mol. Biol. 179:125-142 (1984), Waring et al., Protein Peptide Lett. 3:177-184 (1996), Hancock et al., Lancet 349:418-422 (1997)). As proteínas Ais partilham caracteristicas conformacionais típicas de outras adesinas e invasinas da superfamília de imunoglobulinas. No entanto, proteínas Ais particulares diferem quanto ao seu homólogo primário, uma observação coerente com os dados experimentais indicando que os membros da família Ais exibem perfis de ligação ao substrato diferentes. Coletivamente, estes padrões de homologias de Ais indicam que, apesar dos membros das proteínas Ais partilharem de uma semelhança global em 70 termos de estrutura e dobragem prevista, existem diferenças estruturais entre as várias proteínas de Ais que são responsáveis pelas suas diferenças na função.

Os resultados descritos acima referentes às determinações estruturais dos membros da família de Ais corroboram a modelação de homologia, a qual indica que as regiões N-terminais de Alslp são constituídas predominantemente por domínios de folha β antiparalelos contendo estruturas em ansa/espiral, com quantidades menores de regiões relativamente não estruturadas. Estas características são motivos indicativos de membros da superfamília de imunoglobulinas. Estes resultados mostram uma correlação preditiva significativa com os estudos de dicroísmo circular da Als5p (Hoyer et al., Yeast 18:49-60 (2001)), indicando que o domínio N-terminal de Als5p é caracterizado por um predomínio relativo de folhas β antiparalelas e regiões em ansa/espiral. Assim, é muito provável que todos os membros da família de proteínas Ais exibam esta estrutura global. Em particular, os resultados estruturais acima também são coerentes com os modelos de homologia que indicam que muitas das HVRs correspondem às estruturas flexíveis em ansa/espiral que se projetam a partir dos domínios de folha β nas extremidades N-terminais de diferentes proteínas Ais. Coletivamente, estes resultados indicam que estas estruturas são intrínsecas para ligação específica ao substrato pelas proteínas Ais (Fig. 14) . Coerente com os resultados acima, as regiões análogas de lectina de ligação a manose, α-aglutinina e outros membros da superfamília de imunoglobulinas parecem conferir especificidade de ligação ao substrato (Zhao et al., Hybrid Hybridomics 21:25-36 (2002), Wojciechowicz et al., Mol. Cell. Biol. 13:2554-2563 (1993)). Além disso, mutações destas regiões de ansa variável alteram significativamente a ligação ao substrato nestas proteínas homólogas (Renz et 71 al., J. Cell Biol. 125-1395-1406(1994), Viney et al., J. Immunol. 157:2488-2497 (1996)).

Os resultados de modelação tridimensional indicam ainda que os dominios N-terminais de proteinas Ais particulares possuem assinaturas moleculares caracteristicas que se relacionam com os seus perfis de aderência. Estas assinaturas incorporam parâmetros tais como área superficial, hidrofobicidade e carga eletrostática, originando configurações que distinguem relações estruturais entre as proteinas Ais. Por exemplo, as proteinas Ais que se ligam a vários substratos, tais como os membros do grupo A de Ais (Alslp, Als3p e Als5p) , têm perfis N-terminais previstos semelhantes em termos de volume estérico, distribuição hidrófoba e potencial eletrostático. No entanto, mesmo neste grupo, existem diferenças fisico-quimicas especificas que podem governar diferenças funcionais dentro do grupo (Fig. 13). Em contraste, as proteinas Ais com capacidade adesiva reduzida têm caracteristicas superficiais que se prevê serem distintas das proteinas do grupo A de Ais em várias propriedades fisico-quimicas, incluindo hidrofobicidade e potencial eletrostático. É muito provável que os efeitos agregados das diferenças nestas caracteristicas estruturais confiram as propriedades funcionais especificas das diferentes proteinas Ais.

Foi demonstrada uma variabilidade genética extensa dentro da familia de genes de ALS. Foram observadas variações de sequência em genes de ALS especificos de diferentes isolados de C. albicans (Zhang et al., Genome Res. 13:2005-2017 (2003), Hoyer et al., Yeast 18:49-60 (2001)), e nem todos os membros da familia ALS estão presentes em todos os isolados. Foram mesmo encontradas divergências de sequência significativas entre dois alelos diferentes num único 72 isolado (Zhao et al., Microbiology 149:2947-2960 (2003), Zhang et al., Genome Res. 13:2005-2017 (2003)). Este grau de variabilidade genética sugeriria que estas proteínas podem sofrer rearranjo ou mutação a uma frequência relativamente alta. Um tal mecanismo proporcionaria o organismo com capacidade para gerar o elevado grau de diversidade estrutural e funcional demonstrado neste estudo. O apoio indireto para esta hipótese é proporcionado por um estudo recente da variação alélica de ALS7, que sugeriu que este gene é hipermutável e que estas mutações estão sujeitas a pressão seletiva (Zhang et al., Genome Res. 13:2005-2017 (2003)) .

Coletivamente, os resultados acima indicam uma analogia entre anticorpos e proteínas Ais ao nível estrutural e funcional. Por exemplo, a modelação de homologia destaca as semelhanças nas configurações estruturais destas famílias, com hipervariabilidade direcionada para domínios localizados dentro de uma estrutura, de outro modo, estável (por exemplo, as HVRs de proteínas Ais e regiões Fab em imunoglobulinas). Além disso, como com os anticorpos, a variabilidade genética da família de genes de ALS pode proporcionar a oportunidade para a Candida exibir uma matriz variada de proteínas com um espetro de especificidade em aderência e invasão. A disponibilidade de um tal grupo de proteínas relacionadas é provável que melhore a capacidade do organismo para colonizar e invadir nichos anatómicos e fisiológicos diferentes durante a infeção.

EXEMPLO VII 73

Vacinação com rAlslp-N melhora a sobrevivência durante a candidiase disseminada em murideo melhorando a imunidade não humoral, mediada por células

Este exemplo mostra que a imunização de ratos BALB/c com a extremidade N-terminal recombinante de Alslp (rAlslp-N) melhorou a sobrevivência durante o desafio subsequente com um inoculo letal de C. albicans. A dose de proteção de 20 yg de rAlslp-N aumentou significativamente a estimulação de esplenócitos Thl pela Candida e aumentou a hipersensibilidade de tipo retardada in vivo. Em contraste, os títulos de anticorpo não correlacionaram com a proteção. Finalmente, a vacina não foi protetora em ratos com deficiência em células T mas foi protetora em ratos com deficiência em células B. Estes dados indicam que o mecanismo de ação da vacina de rAlslp-N é a estimulação de imunidade mediada por células, em vez de humoral, contra a C. albicans. A C. albicans utilizada no estudo foi a SC5314, um isolado clínico bem caracterizado que é extremamente virulento em modelos animais (Spellberg et al., Infect Immun. 71:5756-5764 (2003)) foi fornecido por W. Fonzi (Georgetown University). O organismo foi subcultivado três vezes em série em caldo de peptona dextrose de levedura (Difco) antes da infeção.

As estirpes de ratos utilizadas no estudo foram ratos BALB/c fêmeas obtidas de National Câncer Institute (Bethesda, MD). Para explorar o impacto da idade na eficácia da vacina, foram utilizados ratos juvenis (8-10 semanas) e reprodutores retirados (L 6 meses) . Os ratos fêmeas com deficiência em células B portadores de uma supressão homozigótica dos locais igh (C.129B6-IgH-Jhdtml 74

Dhu) , ratos glabros com deficiência em células T (C.Cg/AnBomTac-FoxnlnuN20) e BALB/c de tipo selvagem de ninhada congénica foram obtidos de Taconic Farms (Germantown, NY). Os ratos foram alojados em gaiolas filtradas com alimentação irradiada e água autoclavada ad libitum. Para as experiências de sobrevivência, os ratos foram imunizados com doses variáveis de antigénio (ver abaixo) e subsequentemente infetados através da veia da cauda com o inoculo apropriado de blastosporos de C. albicans SC5314 ou controlo de PBS (Irvine Scientific, Irvine, CA). Os resultados de estudos de sobrevivência repetidos foram combinados se os conjuntos de dados individuais não apresentassem qualquer heterogeneidade estatística (ver abaixo). Todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo comité institucional de utilização e tratamento dos animais, seguindo as diretrizes dos National Institutes of Health para o alojamento e tratamento de animais.

Os procedimentos de imunização com rAlslp-N descritos abaixo foram realizados como se segue. Resumidamente, a rAlslp-N (aminoácidos 17 a 432 de Alslp) foi produzida em S. cerevisiae e purificada por filtração em gel e purificação de afinidade em matriz de Ni-NTA (Fu et al., Molec. Microbiol. 44:61-72 (2002)). A quantidade de proteína foi quantificada pelo ensaio de Lowry modificado. Um grau elevado de pureza (~ 9 0 %) foi confirmado por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida bem como por dicroísmo circular e FTIR, como descrito acima. Os ratos foram imunizados por injeção intraperitoneal (ip) de rAlslp-N misturado com adjuvante completo de Freund (CFA, Sigma-Aldrich) no dia 0, reforçados com outra dose do antigénio com adjuvante incompleto de Freund (IFA, Sigma-Aldrich) no dia 21, e infetados duas semanas depois do reforço. 75

Os títulos de anticorpo resultantes foram determinados por ELISA em placas de 96 poços. Resumidamente, os poços foram revestidos com 100 pL por poço de 5 pg/mL de rAlslp-N em PBS. Os soros de rato foram incubados durante 1 h à temperatura ambiente, seguindo-se um passo de bloqueio com soro fisiológico tamponado com tris (TBS) (TrisHCl 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15 M) contendo 3% de albumina de soro bovino. Os poços foram lavados 3 vezes com TBS contendo 0,05% de Tween 20, seguida de outras 3 lavagens com TBS. Foi adicionado anticorpo secundário anti-rato de cabra conjugado com peroxídase de rábano silvestre (Sigma) a uma diluição final de 1:5000 e a placa foi ainda incubada durante lh à temperatura ambiente. Os poços foram lavados com TBS e incubados com substrato contendo tampão de citrato 0,1 M (pH 5,0), 50 mg/mL de o-fenilenodiamina (Sigma) e 10 pL de H2O2 a 30%. Deixou-se desenvolver a cor durante 30 min após o que a reação foi terminada adicionando H2SO4 a 10% e a densidade ótica (OD) foi determinada a 490 nm num leitor de placas microtitulo. Os poços de controlo negativo receberam apenas diluente e a absorvância de base foi subtraída dos poços de ensaio para obter as leituras de OD finais. O titulo de ELISA foi tomado como o reciproco da última diluição de soro que deu uma leitura de OD positiva (isto é, > OD média das amostras de controlo negativo + 2 desvios padrão).

Outros métodos descritos abaixo foram realizados como se segue. Resumidamente, foram realizados os perfis de citocinas induzidos por C. albicans para determinar o efeito da vacina de rAlslp-N na imunidade mediada por células e nos perfis de citocinas in vivo. Os ratos foram imunizados como descrito acima. Duas semanas após o reforço final, os esplenócitos foram colhidos e cultivados em meio 76 completo a uma densidade de 4 x 106 células/mL como anteriormente descrito (Spellberg et ai., Infect. Immun. 71 :5756-5764 (2003)). Para estimular a produção de citocinas, os esplenócitos foram co-cultivados com tubos germinativos de C. albicans SC5314 morta termicamente. Nós utilizamos C. albicans morta termicamente em vez de rAlslp-N na estimulação dos esplenócitos para imitar a situação in vivo durante a infeção. As células de C. albicans foram pré-germinadas em RPMI-1640 com glutamina (Gibco BRL) durante 90 minutos para induzir expressão de Alslp (Fu et al., Molec. Microbiol. 44:61-72 (2002)). Os tubos germinativos de C. albicans resultantes foram mortos termicamente por incubação durante 90 minutos a 60°C (Ibrahim et al., Infect. Immun. 63:4368-74 (1995)). Os fungos mortos termicamente foram adicionados às culturas de esplenócitos a uma densidade de 2 x 107 pseudo-hifas/mL (proporção de cinco fungos para um leucócito). Após 48 h, os esplenócitos foram retratados quanto às frequências de Thl (CD4+IFN-+IL-4-), Th2 (CD4+IFN- -IL-4+) ou CD4+IL-10+ por deteção de citocina intracelular e citometria de fluxo, como anteriormente descrito (Spellberg et al. , Infect. Immun. 71:5756-5764 (2003)). A citometria de fluxo tricolor foi realizada num instrumento FACScan da Becton-Dickinson calibrado com esferas de CaliBRITE (Becton Dickinson, San Jose, CA) utilizando o software FACSComp de acordo com as recomendações do fabricante. Durante a aquisição de dados, os linfócitos CD4+ foram retidos por concatenação de dispersão frontal e lateral, e propriedades de fluorescência de FITC-anticorpo anti-CD4. Os dados para cada amostra foram adquiridos até serem analisados 10 000 linfócitos CD4+. Os resultados são apresentados como a mediana ± 25° e 75° quartis de percentagem de todos os linfócitos retidos que eram células Thl ou Th2. 77 A tumefação da planta da pata foi determinada pelo método de Oomura et al (41). Resumidamente, os ratos foram imunizados com a dose apropriada de rAlslp-N ou CFA sozinho como descrito acima. Duas semanas após o reforço, os tamanhos de base da planta da pata dos ratos imunizados foram medidos utilizando um paquímetro digital eletrónico. Foram injetados cinquenta yg de rAlslp-N em 25 yL de PBS nas plantas das patas direitas e injetado PBS sozinho nas plantas das patas esquerdas dos ratos imunizados. Vinte e quatro horas depois as plantas das patas foram novamente medidas. A tumefação da planta da pata específica para o antigénio foi calculada como: (espessura da planta da pata direita ás 24 h - espessura da planta da pata direita de base) - (espessura planta da pata esquerda às 24 h -espessura planta da pata esquerda de base).

Foi utilizado o teste não paramétrico de Mantel-Cox para determinar diferenças nos tempos de sobrevivência dos ratos. Os títulos de anticorpo, frequência de linfócitos Thl ou Th2 e tumefação da planta da pata foram comparados pelo teste de Steel para comparações múltiplas não paramétricas (Rhyne et al., Biometrics 23:539-49 (1967) ou o teste U de Mann Whitney para comparações não emparelhadas, consoante apropriado. As correlações foram calculadas com o teste da soma dos números de ordem de Spearman. Para determinar se existia heterogeneidade em estudos de sobrevivência repetidos, foi utilizado o teste de KLolmogorov-Smirnov. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.

Para determinar a dose mais eficaz do imunogénio rAlslp-N foi avaliada um gama de dose de 107 vezes (20 pg até 200 yg por rato). Ratos BALB/c reprodutores retirados fêmeas foram imunizados com rAlslp-N mais adjuvante (CFA/IFA) ou adjuvante sozinho. Os ratos imunizados foram sangrados 2 78 semanas após o reforço para determinar os títulos de anticorpo anti-rAlslp-N (ver abaixo) . Os ratos foram subsequentemente infetados com um inoculo letal de C. albicans (2 x 105 blastosporos). Os dados de sobrevivência de experiências repetidas foram combinados, uma vez que as experiências individuais demonstraram nenhuma heterogeneidade estatística (p.> 0,05 pelo teste de Kolmogorov-Smirnov) . A dose de 20 yg de rAlslp-N resultou numa sobrevivência a longo prazo de 25% dos ratos infetados e num aumento significativo da sobrevivência global em comparação com o adjuvante sozinho (p = 0,044 pelo teste de Mantel-Cox, Figura 1) . Nem as doses 10 vezes superiores (Figura 15) nem inferiores (dados não apresentados) aumentaram significativamente a sobrevivência em comparação com o adjuvante sozinho. Estes resultados indicam que uma dose intermédia da vacina de rAlslp-N induz proteção contra a candidíase disseminada em murídeo.

As observações acima estabeleceram uma dose de proteção para a vacina de rAlslp-N. A seguir, a eficácia da vacina foi avaliada num modelo mais rapidamente letal de ratos infetados com 106 blastosporos (sobrevivência mediana 3 vs. 11 dias para 106 vs. 2 x 105 inóculos em ratos não vacinados, respetivamente). Mais uma vez os dados de estudos repetidos foram combinados, já que os resultados das experiências individuais não demonstraram qualquer heterogeneidade estatística (p > 0,05 pelo teste de Kolmogorov-Smirnov). Quando administrada como uma dose de 20 yg + CFA em ratos BALB/c infetados com 106 blastosporos de C. albicans, a vacina de rAlslp-N mais do que duplicou a sobrevivência mediana e resultou num aumento significativo na sobrevivência global contra controlos não vacinados (p = 0,001 pelo teste de Mantel-Cox, Fig. 16A). Para determinar se a idade dos ratos influenciava a sua resposta à vacina 79 de rAlslp-N, nós testamo-la em ratos juvenis. Foi encontrado uma beneficio na sobrevivência semelhante quando os ratos juvenis foram vacinados e infetados com o mesmo inoculo elevado (p = 0,02 pelo teste de Mantel-Cox, Fig. 16B) .

Embora a dose de 200 yg de rAlslp-N tenha resultado numa proteção inferior em comparação com a dose de 20 yg, apenas a dose de 200 yg de antigénio induziu um aumento significativo nos títulos de anticorpo anti-Alslp no soro (P < 0,005 para a dose de 200 yg vs. todos os outros grupos, Figura 17). Não foi detetado qualquer aumento significativo nos titulos de anticorpo anti-Alslp na dose de proteção de antigénio intermédia (p = 0,1 para 20 yg vs. adjuvante). Quando os titulos de anticorpo anti-Alslp no soro de ratos individuais foram representados graficamente contra o tempo de sobrevivência de cada rato, não foi encontrada qualquer correlação entre o titulo de anticorpo e a sobrevivência (R2 = 0,03, p > 0,05 pelo teste da soma dos números de ordem de Spearman) . De facto, os ratos imunizados com a dose mais elevada de antigénio (200 yg) tinha titulos de anticorpo anti-rAlslp-N em excesso de 1: 100 000, mas tinha durações de sobrevivência que não eram diferentes de ratos imunizados com doses menores de antigénio cujos títulos estavam no limite de deteção inferior (~ 1:100). Estes resultados indicam que a proteção induzida pela vacina de rAlslp-N não parece correlacionar com os títulos de anticorpo.

Uma vez que a imunidade humoral não correlaciona com a proteção induzida pela rAlslp-N, nós examinamos a resposta imunológica mediada por células induzida pelas doses de proteção e não proteção de rAlslp-N. Os ratos foram imunizados com 0,2, 20 ou 200 yg de rAlslp-N, ou adjuvante 80 sozinho, como acima. Duas semanas após o reforço, os esplenócitos foram colhidos e cultivados na presença de C. Albicans pré-germinada, morta termicamente, que se sabe que expressam Alslp (Fu et al., Molec. Microbiol. 44:61-72 (2002)). Após 48 h de cultura, os esplenócitos foram colhidos para deteção intracelular de citocinas por citometria de fluxo. Apenas os linfócitos de ratos imunizados com a dose de proteção de 20 yg de antigénio desenvolveram uma frequência significativamente aumentada de células Thl em comparação com os ratos administrados com adjuvante sozinho (p = 0,03, Fig. 18). Não foram detetadas quaisquer diferenças significativas na frequência de Th2 (Fig. 18) ou na frequência de linfócitos T IL-10+ (dados não apresentados) entre os ratos imunizados com adjuvante ou qualquer uma das doses de antigénio.

Para confirmar que a imunidade de Tipo 1 era estimulada pela r-Alslp-N in vivo, a hipersensibilidade de tipo retardada foi testada pela tumefação da planta da pata. Apenas ratos vacinados com a dose de proteção de 20 yg de rAlslp-N desenvolveram uma reação de hipersensibilidade de tipo retardada significativamente aumentada em comparação com o controlo e esta resposta foi também significativamente maior do que a induzida pelas doses de não proteção de 0,2 e 200 yg (Fig. 19, p < 0,05 para todas as comparações contra a dose de 20 yg, pelo teste não paramétrico de Steel). Coletivamente, estes resultados indicam que uma dose de proteção do antigénio rAlslp-N induziu uma polarização de Thl significativa e reação de hipersensibilidade de tipo retardada.

Para definir o papel de anticorpos e células T na proteção mediada por vacina, ratos com deficiência em células B, glabros com deficiência em células T ou BALB/c de tipo selvagem congénicos de controlo foram imunizados com 20 yg 81 de rAlslp-N mais adjuvante ou adjuvante sozinho, e infetados com um inoculo letal (8 x 105 blastosporos) de C. albicans. Os ratos com deficiência em células B tenderam a ser mais resistente à infeção, enquanto que os ratos com deficiência em células T foram mais suscetíveis, do que os ratos de controlo de tipo selvagem administrados com adjuvante sozinho (p = 0,065 e 0,01 para ratos com deficiência em células B e com deficiência em células T contra tipo selvaqem tratados com adjuvante, respetivamente, Fig. 20). Finalmente, a vacina de rAlslp-N manteve a sua eficácia em ratos com deficiência em células B (p = 0,04 para a vacina de rAlslp-Ndo contra adjuvante sozinho, Fig. 6) mas foi ineficaz em ratos com deficiência em células T (p = 0,4 para vacinado com rAlslp-N contra adjuvante sozinho, Fig. 20). Estes resultados indicam que a vacina de Alslp é eficaz em ratos com deficiência em células B mas não em ratos glabros com deficiência em células T.

Acima são descritos os resultados que mostram que a imunização com a extremidade N-terminal desta proteína melhorou a sobrevivência de ratos BALB/c juvenis e maduros durante a candidíase hematologicamente disseminada. Em particular posterior, uma dose intermédia de rAlslp-N (20 yg) proporcionou maior proteção em comparação com doses menores e uma dose maior (200 yg) . Não obstante, a dose de não proteção de 200 yg de rAlslp-N foi imunogénica, já que induziu títulos 100 vezes maiores de anticorpo do que a dose de proteção de 20 yg. A curva de eficácia dose-resposta em forma de U invertido, com menor proteção à dose mais elevada de rAlsl p-N faz lembrar os estudos clássicos de Parish et al., que descreveram pela primeira vez a relação inversa entre a 82 indução de imunidade humoral e mediada por células por uma determinada dose de antigénio. No contexto dos dados seminais de Parish, uma curva de eficácia dose-resposta em forma de U invertido poderia ser explicada se: 1) a eficácia da vacina dependesse da imunidade mediada por células e, 2) as doses intermédias de rAlslp-N estimulassem maior imunidade mediada por células em comparação com a dose alta, estimulante de anticorpo. Nós, por isso, admitidos a hipótese que a curva de eficácia dose-resposta em forma de U invertido observada com a vacina de rAlslp-N era devido a uma maior indução da imunidade mediada por células pelas dose intermédias de proteção de antigénio. A fim de testar esta hipótese, foi determinada a capacidade de doses altas, intermédias e baixas de antigénio para estimular células Thl e a hipersensibilidade de tipo retardada. Para estimular a produção de citocinas a partir de esplenócitos, nós ativamos especificamente as células por exposição a C. Albicans termicamente morta, em vez de rAlslp-N, para imitar a situação in vivo durante a infeção. Apenas a dose de proteção de 20 yg aumentou significativamente a frequência de linfócitos esplénicos Thl estimulados por C. albicans. A frequência de células Thl observadas em esplenócitos estimulados por C. Albicans ex vivo foi semelhante à detetada in vivo durante a candidiase disseminada em ratos (59), realçando a relevância desta abordagem.

Para determinar se as células Thl ex vivo detetadas eram de significância funcional in vivo, nós comparamos a hipersensibilidade de tipo retardada induzida pelas diferentes doses de imunização com rAlslp-N. Em concordância com a frequência de células Thl, apenas a dose de proteção de 20 yg de rAlslp-N estimulou uma reação de 83 hipersensibilidade de tipo retardada in vivo significativa. Estes resultados são coerentes com a hipótese de que a proteção induzida pela vacina era devida à indução de imunidade mediada por células de Tipo 1'. Surpreendentemente, apesar da indução de titulos acentuadamente elevados de anticorpo pela dose de 200 yg de rAlslp-N, nós não encontramos um aumento em linfócitos esplénicos Th2 em ratos vacinados com esta dose. Uma explicação possivel é que as células Th2 foram ativadas em gânglios linfáticos periféricos em vez do baço. Alternativamente, outras populações de células T (por exemplo células NKT) podem ter sido responsáveis por induzir os titulos elevados de anticorpo observados em resposta à dose de 200 yg de rAlslp-N. A falta de correlação entre o titulo de anticorpo e a proteção não excluíram completamente um papel dos anticorpos na mediação da proteção induzida pela vacina. Por exemplo, os títulos de ELISA são o resultado da enumeração de anticorpos com uma variedade de especificidades e afinidades. Por conseguinte, a possibilidade de que tenham sido gerados pequenos subconjuntos de anticorpos que não participam na proteção mediada pela vacina não pode ser excluída medindo o título de anticorpo. Para confirmar o papel da imunidade mediada por célula e não humoral na proteção mediada pela vacina de rAlslp-N, nós testamos a eficácia da vacina em ratos com deficiência em células B e células T. Os ratos com deficiência em células B tenderam a ser mais resistentes à candidíase disseminada do que os controlos de tipo selvagem, e a eficácia da vacina não foi anulada em ratos com deficiência em células B. Em contraste, os ratos com deficiência em células T foram mais suscetíveis à candidíase disseminada do que foram os controlos de tipo selvagem, e a eficácia da vacina foi perdida em ratos com 84 deficiência em células T. Por conseguinte, as nossas observações confirmam que a eficácia da vacina de rAlslp-N é dependente da indução de imunidade mediada por células T, e não principalmente humoral. Além disso, uma vez que os ratos com deficiência em células B não foram mais suscetíveis à candidíase disseminada do que os ratos de tipo selvagem congénicos, o anticorpo não é um efetor dominante contra a candidíase disseminada neste modelo.

Em suma, relatamos que a nova vacina de rAlslp-N medeia a proteção contra candidíase disseminada experimental induzindo imunidade mediada por células em vez de humoral. Por conseguinte, a melhoria do efeito protetor modesto da vacina de rAlslp-N pode ser conseguida com ativação adicional da imunidade mediada por células utilizando adjuvantes e/ou citocinas otimizados, ou uma via de imunização alternativa. De facto, nos estudos em curso nós já encontramos um aumento acentuado na eficácia administrando rAlslp-N por via subcutânea em comparação com a via intraperitoneal.

EXEMPLO VIII A vacina de rAlslp-N anti-Candida albicans reduz a carga fúngica e melhora a sobrevivência em ratos imunocompetentes e imunocomprometidos

Este exemplo descreve a melhoria de eficácia da vacina de rAlslp-N descrita no exemplo VII quando administrada por uma via subcutânea (SQ) em ratos imunocompetentes e imunocomprometidos. Inicialmente, a eficácia da vacina de rAlslp-N em ratos imunocompetentes. A rAlslp-N, abrangendo os aminoácidos 19-433 da proteína completa, foi produzida em S. cerevisiae e purificada como descrito acima. A 85 preparação de controlo foi analogamente purificada de S. cerevisiae transformada com um plasmídeo vazio. Ratos BALB/c reprodutores retirados (25-30 g) foram imunizados por injeção SQ de rAlslp-N (20 yg) ou preparação de controlo misturada com adjuvante completo de Freund (CFA) no dia 0, seguida de uma dose de reforço em adjuvante incompleto de Freund (1FA) no dia 21. Duas semanas após o reforço, a imunogenicidade da vacina foi confirmada avaliando a intensidade da reação de tumefação da planta da pata como um marcador de hipersensibilidade de tipo retardada (DTH), como anteriormente descrito. Os ratos vacinados tiveram aumentos acentuados na DTH específica de rAlslp-N (Fig. 21). A eficácia da vacina de rAlslp-N foi avaliada determinando o impacto da vacinação com rAlslp-N na sobrevivência de ratos BALB/c infetados (Fig. 22A) . Ratos vacinados ou de controlo foram infetados através da veia da cauda com inóculos rapidamente letais (2,5-5 x 105 blastosporos) de C. albicans. Mostramos anteriormente que ratos infetados com tais inóculos morrem de choque sético irresistível (Spellberg et al., J. Infect. Dis. No prelo (2005)). A vacinação prolongou acentuadamente o tempo até à morte (p < 0,05 para ambos os inóculos pelo teste de Mantel-Cox) e melhorou a sobrevivência aos 30 dias (50-57% vs. 0%, p < 0,05 para ambos os inóculos pelo teste Exato de Fisher).

Em seguida foi determinado o impacto da vacinação na carga fúngica tecidular durante a candidíase hematologicamente disseminada. Catorze dias após o reforço, ratos BALB/c vacinados e de controlo foram infetados através da veia da cauda com 5 x 105 blastosporos de C. albicans SC5314. Seis dias após infeção, antes do início das primeiras mortes no braço de controlo, os rins foram colhidos, homogeneizados e 86 cultivados quantitativamente em ágar de dextrose de Sabouraud (Difco) (18). A vacinação SQ com rAlslp-N resultou numa diminuição mediana de 1,5 log CFU/g na carga fúngica renal em comparação com o controlo (p = 0,01 pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon, Fig. 22B). A eficácia da vacina de rAlslp-N foi também avaliada em ratos imunocomprometidos. Tendo demonstrado a eficácia em ratos imunocompetentes, foi também avaliado o potencial da vacina de rAlslp-N para induzir imunidade e proteger ratos neutropénicos da candidiase disseminada. Os ratos BALB/c vacinados foram tornados neutropénicos pela administração de ciclofosfamida (200 mg/kg ip no dia -2 e 100 mg/kg ip no dia +9 relativamente à infeção, resultando em aproximadamente 12 dias de neutropenia, como descrito (Sheppard et al., Antimicrob. Agents. Chemother. 48:1908-11 (2004)). A reação de tumefação da planta da pata foi realizada 2 dias após a primeira dose de ciclofosfamida. Os ratos neutropénicos vacinados desenvolveram reações DTH de grandeza semelhante aos ratos imunocompetentes (Fig. 23A vs. 1, experiências realizadas em paralelo). Nos ratos neutropénicos infetados através da veia da cauda com 2,5 x 104 blastosporos de C. albicans, a vacinação também resultou em melhorias significativas mo tempo até à morte (p = 0,007 pelo teste de Mantel-Cox vs. Controlo), tempo de sobrevivência mediano (> 21 vs 12 d, p = 0,008 pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon) e a sobrevivência global (88% vs. 38%, p = 0,005 pelo teste Exato de Fisher) (Fig. 23B).

Para determinar a eficácia da vacinação com rAlslp-N na infeção da mucosa, a vacina foi testada num modelo de candidiase orofaringea em murideo (OPC) (Kamai et al., Infect. Immun. 70:5256-8 (2002) e Kamai et al., Antimicrob. 87

Agents Chemother. 45:3195-97 (200 1)). Os ratos vacinados foram tratados com acetato de cortisona (225 mg/kg SQ nos dias -1, 1 e 3 relativamente à infeção) e infetados por via sublingual como descrito. As linguas foram excisadas no dia 5 após infeção. Uma vez que as unidades formadoras de colónias de linguas homogeneizadas não conseguem distinguir entre infeção invasiva e colonização aderente à superfície, avaliamos a extensão da invasão por histopatologia. Um observador cego (BJS) pontuou cada secção analisando ao longo de todo o comprimento das linguas e quantificando a gravidade das lesões fúngicas por campo de alta potência 40x (0 = sem lesão, 1+ = inflamação ligeira da mucosa, 2+ = inflamação significativa restringida ao epitélio, 3+ = inflamação a alargar-se por toda a camada epitelial, 4+ = inflamação a alargar-se para o subepitélio). Para evitar erros da amostragem foram pontuadas duas secções de cada lingua, separadas por pelo menos cinco secções intermédias de tecido. Todos os ratos de controlo desenvolveram invasão fúngica acentuada das suas linguas num grande número de localizações, enquanto apenas dois ratos vacinados desenvolveram quaisquer lesões na lingua. No total, o número mediano (75 , 25 quartil) de lesões por lingua nos ratos de controlo foi de 6,5 (8, 5,75) em comparação com 1 (2,5, 0) para ratos vacinados (p = 0,03 pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon) . A avaliação semi-quantitativa da gravidade da infeção demonstrou uma redução significativa em ratos vacinados em comparação com controlos (Fig. 24, p = 0,03 pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon).

Para determinar a eficácia da vacinação com rAlslp-N ou rAls3-p-N na infeção da mucosa, estas duas vacinas num modelo de colonização vaginal em murideo (Clemons et al., Infect. Immun. 72: 4878-80 (2004); Fidel. Int Rev Immunol. 88 21: 515-48 (2002) e Wozniak et al., Infect Iinmun. 70: 5790-9 (2002)). Os ratos vacinados foram tratados com estrogénio (30 yg, administrado SQ) no dia -3 relativamente à infeção e, em seguida, desafiados na vagina com 10 yL de soro fisiológico tamponado com fosfato contendo 106 blastosporos de C. albicans. As vaginas foram excisadas no dia 3 após inoculação, homogeneizadas e foram aplicadas diluições sucessivas em placas YPD. As unidades formadoras de colónias (CFU) foram contadas 24-48 h após incubação das placas a 30-35°C. As vaginas recolhidas de ratos vacinados com rAls3p-N, mas não as recolhidas a partir de ratos vacinados com rAlslp-N, tinham CFU inferiores às vaginas recolhidas a partir de ratos de controlo (isto é, ratos vacinados com CFA sozinho) (Fig 25, p=0,01 pelo teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon).

Tendo em consideração a incidência crescente de candidemia e a sua taxa de mortalidade persistentemente alta, o desenvolvimento de uma vacina contra a Candida spp. é de grande importância. Os resultados descritos acima mostram que a vacinação SQ com rAlslp-N resultou numa melhoria acentuada na sobrevivência e em reduções significativas na carga fúngica durante a candidiase hematologicamente disseminada, de outro modo rapidamente fatal, em ratos imunocompetentes e imunocomprometidos. De interesse são os resultados da carga fúngica renal de ratos vacinados particulares que demonstram que aproximadamente metade dos ratos tinham cargas fúngicas renais inferiores a 5 log CFU/g. Constatamos anteriormente que o limiar de carga fúngica renal indicativa de uma infeção fatal é de 5 log CFU/g; ratos com cargas fúngicas renais acima deste nivel tipicamente morrem da infeção, enquanto que ratos com cargas fúngicas renais abaixo deste nível sobrevivem à infeção (Spellberg et al., J. Infect. Dis. No prelo (2005) e (Spellberg et al., Infect. Immun. 71:5756-5764 (2003)). 89

Por conseguinte, as mortes importantes no grupo vacinado refletem provavelmente uma carga fúngica alta apesar da vacinação. As variações de rato para rato na carga fúngica tecidular podem refletir a complexidade das interações hospedeiro-agente patogénico e/ou sensibilidade variável à vacina.

Em resumo, a vacina de rAlslp-N pode ser utilizada para o tratamento, redução da gravidade e/ou prevenção de candidiase disseminada crescentemente comum e extremamente letal. A vacina é eficaz em ratos imunocompetentes e a eficácia é retida mesmo em hospedeiros neutropénicos e tratados com corticosteróides. Finalmente, a vacina pode proteger contra a candidiase mucocutânea incluindo a candidiase vaginal e orofaringea.

EXEMPLO IX

Eficácia das Vacinas de ALS Contra Infeções por 5. aureus

Este Exemplo mostra que as proteínas Ais de C. albicans melhoram a sobrevivência de modelos animais infetados com S. aureus.

As adesinas Ais de C. albicans foram identificadas como sendo significativamente homólogas às adesinas em S. aureus. Esta característica foi utilizada para conceber e implementar uma vacina eficaz contra S. aureus utilizando as adesinas Ais. Resumidamente, a família ALS de C. albicans é constituída por pelo menos 9 genes (Hoyer et al., Genetics 157:1555-67 (2001); Hoyer LL., Trends

Microbiol. 9:176-80 (2001)). Como descrito anteriormente, o funcionamento das proteínas Ais como adesinas para substratos biologicamente relevantes (Fu et al., Molec. 90

Microbiol. 44:61-72 (2002); Gaur e Klotz, Infect. Iinmun. 65:5289-94 (1997); Zhao et al., Microbiology 150:2415-28 (2004); Oh et al., Microbiology 151:673-81 (2005); Zhao et al. Microbiology 151:1619-30 (2005)); Hoyer et al., Mol.

Microbiol. 15:39-54 (1995)). Em particular, as extremidades N-terminais de Alslp e Als3p são significativamente homólogas às proteínas de superfície expressadas pelo agente patogénico S. aureus, incluindo a proteina de ligação a colagénio e o fator aglutinante (Quadro IV; Sheppard et al. J. Biol. Chem. 279:30480-89 (2004)).

Quadro IV. Homologia de proteínas Ais com várias adesinas e invasinas patogénicas Proteína Homólogo 1 Homólogo 2 Alslp Proteína de ligação a colagénio de S. aureus: ^ 95% homologia Fator aglutinante de S. aureus: ^ 90% homologia Als3p Proteína de ligação a colagénio de S. aureus: A 95% homologia Fator aglutinante de S. aureus: r 80% homologia Als5p Proteína de ligação a invasina/integrina de Y. pseudo tubérculo se Proteína da camada de superfície de M. mazei O cálculo de homologia proporcionado acima no Quadro IV tem em consideração as caracteristicas de alinhamento da sequência e a estrutura tridimensional da superfície. A homologia da Alslp foi calculada como sendo superior a 95% ou 90% em comparação com a proteina de ligação a colagénio ou o fator aglutinante de S. aureus (r2 > 90%; Sheppard et al., supra). Analogamente, a homologia de Als3p foi calculada como sendo superior a 95% ou 80% em comparação com a proteina de ligação a colagénio ou o fator aglutinante de S. aureus (r2 > 90%) . A fim de corroborar as observações acima foram utilizados métodos de homologia e segmentação para modelar a congruência estrutura-função entre a Alslp e o fator aglutinante A de S. aureus (código ClfA - PDB: cl n67A) . Estes métodos avaliaram as homologias especificas na 91 estrutura primária, análises da conformação 3-D e do padrão foram realizadas para procurar motivos funcionais análogos. Por exemplo, os métodos BLASTP, PROSITE e JALVIEW foram utilizados para analisar semelhanças e diferenças nas sequências primárias de ALS contra ClfA (Yount et al. Antimicrob. Agents Chemother. 48:4395-4404 (2004) e Yount e Yeaman. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101:7363-7368 (2004)). Em seguida foram utilizadas aplicações baseadas na internet incluindo 3-D PSSM para priorizar os homólogos potenciais de ALS para análise posterior (Sheppard, et al. J. Biol. Chem. 279:30480-30489 (2404)). Juntamente com os dados resultantes, a aplicação PHYRE (Kelley, L., R. Bennett-Lovsey, A. Herbert e K. Fleming; website é como se segue: http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/) foi utilizada para conduzir o mapeamento da topologia e para identificar motivos tridimensionais partilhados pelas proteínas com maior homologia estrutural ou funcional com as proteínas Ais selecionadas a fim de identificar motivos funcionais partilhados putativos. Os métodos acima estão extensivamente disponíveis no domínio público e utilizados numa variedade de aplicações em proteómica e biologia estrutural. Com base nos resultados do método de homologia e segmentação acima foi gerado um consenso de homologias de sítios funcionais entre a Alslp e o ClfA e localizados em resíduos específicos do modelo de Alslp construído no ClfA. Várias descobertas particulares surgiram destas análise de modelação como definidas abaixo.

Primeiro, foi identificada homologia significativa entre as regiões N-terminais de Asllp e ClfA na estrutura secundária e conservação de aminoácidos, particularmente na região abrangida pelos aminoácidos 30 - 300 (isto é, as extremidades N-terminais de ambas as proteínas). 92

Segundo, o mapeamento consenso de sítios funcionais homólogos com base em determinantes de adesina de ClfA estabelecidos convergiu para um motivo topológico específico na Alslp. Este motivo topológico é mostrado na Figura 26 como uma fenda formada pela inflexão de facetas adjacentes de dois domínios de folha β.

Terceiro, coerente com a homologia da estrutura primária, o motivo fenda funcional previsto no Alslp localiza-se em resíduos específicos provenientes de regiões hipervariáveis na região N-terminal abrangendo os resíduos de aminoácido 30 - 300.

Estes resultados proporcionaram uma base estrutural para funções biológicas congruentes, bem como respostas imunológicas à Alslp e ClfA. Estes resultados também corroboram ainda o nosso modelo global de estrutura-atividade da Alslp, e facilitam ainda abordagens direcionadas para análise mutacional e mapeamento de epítopo. Finalmente, estes resultados indicam que a Alslp e o ClfA são adesinas de estrutura e função análogas presentes em diferentes agentes patogénicos microbianos.

Foi também identificado um anticorpo monoclonal contra 5. aureus que pode reduzir as infeções provocadas por C. albicans. Como com as observações estruturais acima, esta característica também foi utilizada para conceber e implementar uma vacina eficaz contra S. aureus utilizando adesinas Ais.

Resumidamente, um anticorpo anti-estafilocócico humanizado (Aurexis®) que se sabe que reconhece a adesina de superfícies em S. aureus encontra-se atualmente em ensaios clínicos. Este anticorpo monoclonal também reage de modo 93 cruzado com membros da família de Ais. Foram descritos os resultados favoráveis de um ensaio clínico de fase II do Aurexis® para o tratamento de infeções sanguíneas estafilocócicas (Inhibitex Inc., 2045; acedido em 19 de Setembro de 2005 em http://phx.corporate-ir.net/phoenix.zhtml?c=176944&p=irol- newsArticle&ID=707322&highlight=). Resumidamente, neste relatório, doentes com S. aureus conhecido no sangue foram administrados com o anticorpo Aurexis® como tratamento para a infeção ativa (isto é, isto não é uma estratégia de vacina ativa ou um estudo de profilaxia). Nove doentes gue receberam placebo experimentaram infeções sanguíneas provocadas por Candida, enquanto apenas três doentes no ramo de Aurexis® experimentaram infeções sanguíneas pela Candida. O reconhecimento da diminuição na infeção sanguínea por Candida nos doentes tratados com um anticorpo contra o S. aureus combinada com as observações de homologia e estruturais acima indicam que existem epítopos imunogénicos partilhados entre a Candida e o S. aureus e que estes epítopos imunogénicos pode ser visados para benefício terapêutico utilizando respostas imunológicas, anticorpos ou mecanismos efetores gerados contra uma espécie para o tratamento de outra espécie. Por conseguinte, os dados acima no seu conjunto apoiam que as respostas imunológicas a adesinas de superfície em S. aureus reagem de modo cruzado com Candida spp.

Seguindo a estratégia acima foram concebidas vacinas de adesina Ais ilustrativas e demonstrado que melhoram a sobrevivência e ratos infetado com S. aureus. As adesinas Ais ilustrativas utilizadas para vacinar foram rAlslp-N ou rAls3p-N, as quais foram produzidas e utilizadas como descrito acima. Resumidamente, para determinar se estas vacinas de Ais contra Candida, rAlslp-N e rAls3p-N, podem 94 mediar proteção cruzada entre espécies contra o S. aureus, ratos BALB/c fêmeas foram vacinados com o regímen anteriormente descrito (adjuvante completo de Freund + 20 yg de rAlslp-N ou rAls3p-N no dia 0, seguido de uma dose de reforço em adjuvante incompleto de Freund às 3 semanas, ambas administradas por via subcutânea). Duas semanas após vacinação, os ratos foram infetados através da veia da cauda com uma dose letal da estirpe 67-0 de S. aureus, a qual é resistente a meticilina e conhecida como sendo virulenta em modelos animais. Os resultados que mostram a sobrevivência de ratos são mostrados na Figura 26. Como indicado, ambas as vacinas de rAlslp-N e rAls3p-N mediaram uma sobrevivência de longo prazo melhorada nestes ratos infetados (Figura 27). Adicionalmente, o mecanismo de proteção é provavelmente um aumento de Thl em vez de Th2 uma vez que não foi observada qualquer correlação entre os títulos de Ab e a sobrevivência de ratos vacinado com rAlslp-N ou rAls3p-N (Figura 28).

EXEMPLO X A Vacina de rAlslp-N Anti-Candida Medeia uma Gama Larga de Proteção Contra a Candidiase Disseminada

Este Exemplo mostra que a vacina de rAlsl-N protege ratos não consanguíneos de candidiase disseminada e protege ratos BALB/c contra outras estirpes virulentas de C. albicans e Candida não-albicans.

Os presentes estudos foram realizados para ilustrar a amplitude de proteção induzida pela rAlslp-N, avaliando especificamente a sua eficácia em ratos não consanguíneos, em associação com um segundo adjuvante diferente do 95 adjuvante de Freund, contra outras estirpes de C. albicans, e contra espécies não-albicans de Candida. A vacinação com rAlslp-N protegeu ratos não consanguineos da candidiase disseminada. Resumidamente, ratos CDI não consanguineos foram obtidos de National Câncer Institute (Bethesda, MD) . Todos os procedimentos envolvendo ratos foram aprovados pelo comité institutional de utilização e tratamento de animais, seguindo as diretrizes dos National Institutes of Health para o alojamento e tratamento de animais. Os ratos foram vacinados com rAlslp-N + adjuvante de Freund como previamente descrito acima e, por exemplo, em Ibrahim et al., Infect. Immun. 73:999-1005 (2005); Spellberg et al., Infect. Immun. 73:6191-93 (2005). A rAlslp-N (aminoácidos 17 a 432 da Alslp) foi produzida em S. cerevisiae e purificada por filtração em gel e purificação de afinidade em matriz de Ni-NTA. Um grau elevado de pureza («90%) foi confirmado por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida bem como por dicroismo circular e FTIR, como descrito acima e, por exemplo, em Sheppard et al., J Biol Chem 279:30480-89 (2004). Os ratos foram imunizados por injeção SQ de rAlslp-N (20 yg) misturada com Adjuvante Completo de Freund (CFA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) no dia 0, seguida de uma dose de reforço em Adjuvante Incompleto de Freund (IFA; Sigma-Aldrich) no dia 21. Os ratos de controlo foram imunizados com CFA/1FA sozinho. Catorze dias após o reforço, os ratos imunizados foram infetados através da veia da cauda com C. albicans SC5314, como descrevemos anteriormente Ibrahim et al., (2005) supra; e Spellberg et al. (2005), supra. De forma semelhante às nossas observações anteriores em ratos BALB/c, a vacina de rAlslp-N melhorou acentuadamente a sobrevivência de ratos CDI infetados (Figura 29A). 96

Uma vez que o adjuvante de Freund é considerado demasiado tóxico para ser utilizado em humanos, realizamos uma dose resposta da vacina de rAlslp-N em alúmen (2% de hidrogel de Al, Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca), o único adjuvante de vacina atualmente aprovado pela US Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado em humanos. A vacinação com alúmen foi realizada num plano idêntico ao adjuvante de Freund, com imunização no dia 1, reforço no dia 21 e infeção 2 semanas depois. Nós constatamos que as doses mais altas de rAlslp-N combinadas com alúmen resultaram em melhorias significativas na sobrevivência de ratos com candidiase disseminada (Figura 29B). Parece também existir uma relação dose resposta, com tendência para melhorar a sobrevivência às doses mais elevadas de rAlslp-N quando combinadas com alúmen.

Foi também mostrado que a vacina de rAlslp-N melhora a sobrevivência de ratos BALB/c infetados com várias estirpes de C. albicans. As vacinas particularmente úteis utilizam um imunogénio que pode ativar o sistema imunitário para reconhecer várias estirpes do agente patogénico alvo. Através da análise da sequência de ADN, determinamos que a sequência de aminoácidos prevista da região N-terminal de Alslp era 99,9% conservada contra um grupo diverso de isolados clínicos de C. albicans de infeções da corrente sanguínea (5 estirpes), urina (5 estirpes) e orofaríngea (10 estirpes) (dados não apresentados). Estes resultados indicaram que a vacina de rAlslp-N pode ser eficaz contra uma grande matriz de estirpes de C. albicans. Para confirmar, a amplitude de proteção da vacina de rAlslp-N contra outras estirpes de C. albicans, os ratos foram vacinados com rAlslp-N + adjuvante de Freund como acima, e infetados com um dos vários isolados clínicos de C. albicans (Ibrahim et al., Infect Immun 63:1993-98 (1995)). 97

Como se mostra na Figura 30, a vacina de rAlslp-N melhorou significativamente a sobrevivência de ratos infetados com cada uma destas estirpes.

Foi também mostrado que a vacina de rAlslp-N reduz a carga fúngica tecidular em ratos infetados com várias espécies não-albicans de Candida. Resumidamente, a familia de genes de ALS está presente noutras espécies de Candida, incluindo C. dubliniensis e C. tropicalis (Hoyer et al., Genetics 157:1555-67 (2001)). Analogamente, um análogo de adesina dos membros da familia de Ais foi descrito em C. glabrata (Cormack et al., Science 285:578-82 (1999); Frieman et al., Mol Microbiol 46:479-92 (2002)). Para confirmar a eficácia da rAlslp-N contra espécies não-albicans, ratos BALB/c foram vacinados com rAlslp-N + adjuvante de Freund como acima e infetados através da veia da cauda com C. glabrata 31028 (um isolado sanguíneo clínico do laboratório de microbiologia do Harbor-UCLA Medicai Center), C. krusei 91-1159, (generosamente proporcionado por Michael Rinaldi, San Antonio, Texas), C. parapsilosis 22019 (isolado sanguíneo clínico do Harbor-UCLA Medicai Center) ou C. Tropicalis 4243 (isolado sanguíneo clínico do Harbor-UCLA Medicai Center). Como se mostra na Figura 31, a vacina de rAlslp-N reduziu a carga fúngica renal de ratos infetados com cada uma destas espécies.

Em resumo, a vacina de rAlslp-N é capaz de prevenir e/ou reduzir a gravidade de uma candidíase disseminada crescentemente comum e extremamente letal. A vacina é eficaz em ratos consanguíneos e não consanguíneos, quando misturada com alúmen como um adjuvante, contra várias estirpes de C. albicans e contra várias espécies não-albicans de Candida. Estes resultados corroboram ainda mais 98 que as vacinas de ALS da invenção são eficazes contra uma grande variedade de infeções por Candida e outras.

EXEMPLO XI A Vacina de rAls3p-N Anti-Candida é Tão Eficaz quanto a rAlslp-N Contra a Candidiase Disseminada e Mais Eficaz Contra a Candidiase da Mucosa

Este Exemplo compara a eficácia de rAls3p-N com as vacinas de rAlslp-N em modelos de candidiase hematologicamente disseminada, orofaringea e vaginal em murideo.

Dos membros da familia ALS, os genes ALS1 e ALS3 codificam adesinas com a matriz mais larga de afinidade para o substrato. Quando comparados uns com os outros, a Alslp mediou uma maior aderência a células endoteliais e gelatina, mas uma menor aderência a células epiteliais (Sheppard et al., J Biol Chem 279:30480-89 (2004)). As suas diferenças nas qualidades de aderência sugeriram que a rAls3p-N pode ter eficácia diferente como uma vacina imunogénica em comparação com a rAlslp-N. s upra;

As vacinas e vacinações foram realizadas como descrito acima. Resumidamente, as rAlslp-N e rAls3p-N (aminoácidos 17 a 432 da Alslp ou Als3p) foram produzidas em S. cerevisiae e purificadas por filtração em gel e purificação de afinidade em matriz de Ni-NTA, como descrito acima e em Ibrahim et al., (2005), supra; Spellberg et al., (2005), supra). A quantidade de proteína foi quantificada pelo ensaio de Lowry modificado. Um grau elevado de pureza («90%) foi confirmado por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida bem como por dicroísmo circular e FTIR, como descrito acima e em Ibrahim et al., (2005), 99

Spellberg et al., (2005), supra). Os ratos foram imunizados por injeção subcutânea (SQ) de 20 yg de rAlslp-N ou rAls3p-N misturada com Adjuvante Completo de Freund (CFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) no dia 0, reforçados com outra dose do antigénio com Adjuvante Incompleto de Freund (IFA, Sigma-Aldrich) no dia 21 e infetados duas semanas após o reforço.

As análises estatísticas foram realizadas como se segue. O teste não paramétrico de Mantel-Cox foi utilizado para determinar diferenças nos tempos de sobrevivência dos ratos. Os títulos de anticorpo e tumefação da planta da pata foram comparados pelo teste de Steel para comparações múltiplas não paramétricas Rhyne et al. , Biometrics 23:539-49 (1967), ou o teste U de Mann Whitney para comparações não emparelhadas, consoante apropriado. As correlações foram calculadas com o teste dos números de ordem de Spearman. Para determinar se existia heterogeneidade em estudos de sobrevivência repetidos foi utilizado o teste de Kolmogorov-Smirnov. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.

Foi demonstrado que a vacinação com rAls3p-N estimula um matriz mais alargada de respostas de anticorpo em comparação com a rAlslp-N. A este respeito, os resultados apresentados na Figura 32 mostram que ratos vacinados com CFA + rAlslp-N ou rAls3p-N desenvolveram títulos de anticorpo significativamente maiores do que ratos que receberam CFA sozinho. Digno de nota, os ratos vacinados com rAls3p-N geraram anticorpos anti-rAlslp-N em títulos equivalentes aos ratos vacinados com rAlslp-N (Fig. 32, cimo) . Em contraste, os ratos vacinados com rAlslp-N geraram títulos menores contra a rAls3p-N do que os ratos vacinados com rAls3p-N (Fig. 32, fundo) . No entanto, tanto 100 a rAlslp-N como a rAls3p-N resultaram em respostas de hipersensibilidade de tipo retardada in vivo semelhantes como se mostra na Figura 33.

Foi também demonstrado que as vacinas de rAlslp-N e rAls3p-N medeiam uma eficácia semelhante contra a candidiase disseminada. Resumidamente, para corroborar ainda mais que a vacina de rAls3p-N era tão eficaz quanto a rAlslp-N contra a candidiase hematologicamente disseminada, os ratos foram vacinados com CFA, CFA + rAlslp-N ou CFA + rAls3p-N, e subsequentemente infetados através da veia da cauda com C. albicans. Os resultados mostrados na Figura 34 demonstram que as vacinas de rAlslp-N e de rAls3p-N resultaram numa melhoria significativa da sobrevivência.

Foi também determinada a correlação dos títulos de anticorpo anti-Alsp e das reações de hipersensibilidade de tipo retardado com a sobrevivência em ratos vacinados posteriormente infetados com C. albicans. Resumidamente, os títulos de anticorpo foram determinados por ELISA em placas de 96 poços, como descrevemos anteriormente e em Ibrahim et al., (2005), supra; Spellberg et al., (2005), supra. Os poços foram revestidos com 100 yL por poço de 5 pg/mL de rAlslp-N ou rAls3p-N em PBS. Os soros dos ratos foram incubados durante 1 h à temperatura ambiente, seguindo-se um passo de bloqueio com soro fisiológico tamponado com tris (TBS) (TrisHCl 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,1 M) contendo 3% de albumina de soro bovino. Os poços foram lavados 3 vezes com TBS contendo 0,05% de Tween 20, seguidas de outras 3 lavagens com TBS sem Tween. Foi adicionado anticorpo secundário anti-IgG de rato de cabra conjugado com peroxídase de rábano silvestre (Sigma-Aldrich) a uma diluição final de 1:5000 e a placa foi ainda incubada durante 1 h à temperatura ambiente. Os poços foram lavados 101 com TBS e incubados com substrato contendo tampão de citrato 0,1 M (pH 5,0), 50 mg/mL de o-fenilenodiamina (Sigma) e 10 pL de H2O2 a 30%. A cor foi deixada desenvolver durante 30 min após o que a reação foi terminada adicionando H2SO4 a 10% e a densidade ótica (OD) foi determinada a 490 nm num leitor de placa de microtitulo. Os poços de controlo negativo receberam anticorpo irrelevante, e a absorvância de base foi subtraída dos poços de ensaio para obter as leituras de OD finais. O titulo de ELISA foi tomado como o reciproco da última diluição de soro que deu uma leitura de OD positiva (isto é, > OD média de amostras de controlo negativo + (desvio padrão * 2)).

As reações de hipersensibilidade de tipo retardado foram avaliadas medindo a tumefação da planta da pata. Resumidamente, os ratos foram imunizados com rAlslp-N, rAls3p-N ou CFA sozinho. Duas semanas após o reforço foram medidos os tamanhos de base da planta da pata de ratos imunizados utilizando um paquímetro digital eletrónico. Injetou-se cinquenta pg de rAlslp-N ou rAls3p-N em 25 pL de PBS nas plantas das patas direitas e injetou-se PBS sozinho nas plantas das patas esquerdas dos ratos imunizados. Vinte e quatro horas depois as plantas das patas foram novamente medidas. A tumefação da planta da pata específica para o antigénio foi calculada como: (espessura da planta da pata direita às 24 h - espessura da planta da pata direita de base) - (espessura da planta da pata esquerda às 24 h -espessura da planta da pata esquerda de base).

Os ratos vacinados foram sangrados para determinação do título e foram sujeitos a testes de tumefação da planta da pata dois dias antes da infeção. Ratos vacinados que não sobreviveram à infeção tinham, mesmo assim, uma gama larga de títulos de anticorpo como se mostra na Figura 35. Muitos 102 desses ratos tinham títulos de anticorpo anti-rAlslp-N e anti-rAls3p-N de á 1 :50 000 (>4,5 logio) . Como uma consequência, os títulos de anticorpo não correlacionaram significativamente com a sobrevivência. Em contraste, a intensidade das reações de tumefação da planta da pata correlacionaram com a sobrevivência (Fig. 35, p = 0,6 & p = 0,009 pelo teste de correlação de números de ordem de Spearman). A vacina de rAls3p-N também exibiu mais eficácia do que a rAlslp-N em dois modelos de candidíase da mucosa. Uma vez que a Als3p mediou uma maior adesão a células epiteliais em comparação com a Alslp, esta observação indica que a rAls3p-N pode exibir uma eficácia única em modelos de infeção da mucosa. A eficácia da rAlslp-N comparou com a da rAls3p-N avaliada num modelo de infeção orofaríngea, tratado com esteroide e num modelo de vaginite candidíase.

Resumidamente, os estudos de vacina no modelo de candidíase orofaríngea em murídeo (OPC) acima foram realizados como anteriormente descrito e como descrito em Spellberg et al., (2005), supra; Kamai et al., Antimicrob Agents Chemother 45:3195-57 (2001), e Kamai et al., Infect Immun 70:5256-58 (2002). Os ratos vacinados foram imunocomprometidos por tratamento com acetato de cortisona (225 mg/kg SQ nos dias -1, 1 e 3 relativamente à infeção) . No dia da infeção, os ratos foram anestesiado por injeção intraperitoneal com 8 mg de xilazina e 110 mg de cetamina por kg. Zaragatoas uretrais de alginato de cálcio foram saturadas com C. albicans colocando-as numa suspensão de 106 organismos por mL em HBSS a 30°C. As zaragatoas saturadas foram colocadas por via sublingual na cavidade oral dos ratos durante 75 min. Após 5 dias de infeção, a língua e tecido do hipoglosso foram excisados, pesados, homogeneizados e, 103 em seguida, cultivados quantitativamente para determinar a carga fúngica oral. A eficácia da vacina contra a candidiase vaginal em murideo foi realizada vacinando ratos BALB/c fêmeas foram tratadas com 30 yg de valerato de estradiol subcutâneo dissolvido em óleo de amendoim (ambos da Sigma-Aldrich) no dia -3 relativamente à infeção para induzir pseudoestro. No dia de infeção, os ratos foram sedados por administração ip de 100 mg/kg de cetamina. Os ratos sedados foram infetados por via intravaginal com 106 blastosporos de C. albicans em 10 yL de HBSS. No dia 3 após infeção, as vaginas e aproximadamente um centímetro de cada trompa uterina foram dissecadas em bloco, homogeneizadas e cultivadas quantitativamente.

Como se mostra na Figura 36, em ratos tratados com cortisona com candidiase orofaríngea, a vacina de rAlslp-N mediou uma tendência forte para reduzir a carga fúngica da língua (p = 0,054). A grandeza global do benefício foi < 0,3 log CFU/grama (Fig. 36). Em comparação, a vacina de rAls3p-N mediou uma diminuição > 0,6 log CFU/grama na carga fúngica da língua que foi estatisticamente significativa (p = 0,005, Fig. 36). Analogamente, num modelo vaginite candidiase não imunocomprometido, a vacina de rAls3p-N mediou uma diminuição de 0,7 log CFU/grama na carga fúngica vaginal em comparação com o CFA sozinho (p = 0,02) como se mostra na Figura 37. Em comparação, a rAlslp-N não mediou qualquer benefício no modelo de vaginite, e a rAls3p-N foi significativamente mais eficaz do que a rAlslp-N (p = 0,01) .

Os resultados acima indicam que uma vacina com base em rAls3p-N, a qual é 85% homóloga com a rAlslp-N ao nível dos 104 aminoácidos, era igualmente eficaz contra a candidiase disseminada, mas foi mais eficaz do que a rAlslp-N contra a infeção da mucosa. A maior eficácia da rAls3p-N foi observada tanto num modelo de candidiase orofaringea tratado com esteroide como num modelo imunocompetente de vaginite candidiase. Os resultados acima também mostram um resultado á 50% na sobrevivência a longo prazo num modelo de choque sético por Candida em murideo sem qualquer terapia antifúngica auxiliar que é encorajante, e corrobora ainda mais o beneficio terapêutico de todas as vacinas de ALS da invenção.

Os titulos de anticorpo não correlacionaram com o efeito protetor de qualquer uma das vacinas durante a candidiase disseminada, mas a indução de hipersensibilidade de tipo retardada in vivo correlacionou com a proteção. Estes dados também corroboram ainda mais que o mecanismo de proteção induzido pela vacina era a indução de imunidade mediada por células de Tipo 1 contra o fungo. A rAls lp-N e a rAls3p-N induziram titulos equivalentes de anticorpo contra a rAlslp-N, mas a de rAls3p-N induziu titulos significativamente maiores de anticorpos anti-rAls3p-N do que a rAlslp-N. Estes dados indicaram que, apesar do seu grau de homologia de sequência de aminoácidos elevado (85%), o sistema imunitário humoral pode distinguir entre rAlslp-N e rAls3p-N. Os resultados acima corroboram ainda mais que, independentemente das diferenças nas caracteristicas de aderência a célula epiteliais das Alslp e Als3p, as vacinas de rAlslp-N e rAls3p-N eram igualmente eficazes na proteção contra a candidiase hematologicamente disseminada (isto é, endovascular).

Em suma, a vacina de rAls3p-N anti-Candida induziu respostas mediadas por células equivalentes mas respostas com base em anticorpo mais alargadas do que a vacina de 105 rAlslp-N. Os imunogénios resultaram num grau equivalente de proteção contra a candidíase hematologicamente disseminada, mas a rAls3p-N mediou uma maior proteção contra a candidiase orofaringea e vaginal.

Lisboa, 12 de outubro de 2012

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Vacina compreendendo um membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida possuindo atividade de adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, para ser utilizado num método de tratamento ou prevenção de uma infeção por Staphilococcus aureus num corpo humano ou animal.

2. Vacina para ser utilizada de acordo com a reivindicação 1, em que o referido membro da família de proteínas Ais compreende uma proteína Ais derivada de uma estirpe de Candida selecionada do grupo consistindo de Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida parapsilosis.

3. Vacina para ser utilizada de acordo com a reivindicação 1, em que o referido membro da família de proteínas Ais é selecionado de Alslp ou Als3p.

4. Vacina para ser utilizada de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fragmento imunogénico compreende um fragmento da região N-terminal de um membro da família de proteínas Ais.

5. Vacina para ser utilizada de acordo com a reivindicação 1, em que a referida administração compreende imunização ativa, imunização passiva ou uma associação das mesmas.

6. Vacina para ser utilizada de acordo com a reivindicação 4, em que o fragmento imunogénico é um 2 fragmento da região N-terminal da referida proteína Als3 ou Alsl de Candida.

7. Vacina para ser utilizada de acordo com a reivindicação 6, em que o fragmento imunogénico compreende uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 2. Vacina para ser utilizada de acordo com a reivindicação 6, em que o fragmento imunogénico compreende uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 1.

9. Membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida possuindo atividade de adesão celular, ou um fragmento imunogénico do mesmo, para ser utilizado num método de tratamento ou prevenção de uma infeção por Staphilococcus aureus num corpo humano ou animal.

10. Membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida para ser utilizado de acordo com a reivindicação 9, em que o referido membro da família de proteínas Ais compreende uma proteína Ais derivada de uma estirpe de Candida selecionada do grupo consistindo de Candida albicans, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida glabrata e Candida parapsilosis.

11. Membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida para ser utilizado de acordo com a reivindicação 9, em que o referido membro da família de proteínas Ais é selecionado de Alslp ou Als3p. 3

12. Membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida para ser utilizado de acordo com a reivindicação 9, em que o referido fragmento funcional compreende um fragmento da região N-terminal de um membro da família de proteínas Ais.

13. Membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida para ser utilizado de acordo com a reivindicação 12, em que o fragmento imunogénico é um fragmento da região N-terminal da referida proteína Als3 ou Alsl de Candida.

14. Membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida para ser utilizado de acordo com a reivindicação 13, em que o fragmento imunogénico compreende uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 2.

15. Membro da família de proteínas Ais isolado de origem em Candida para ser utilizado de acordo com a reivindicação 13, em que o fragmento imunogénico compreende uma sequência de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 1. Lisboa, 12 de outubro de 2012