PT1974615E

PT1974615E - Formação de um gel à base de proteína

Info

Publication number: PT1974615E
Application number: PT07103954T
Authority: PT
Inventors: Marco Luigi Federico Giuseppin; Wybren Bakker
Original assignee: Cooperatie Avebe U A
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2010-03-22
Also published as: EP1974615A1; DE602007003805D1; EP1974615B1; PL2083634T3; DK2083634T3; DK1974615T3; US20100003394A1; EP2083634B1; US9968118B2; EP1920662A1; US9102749B2; US8465911B2; WO2008069650A1; CA2669096C; EP2083634A1; CA2669090C; ATE451842T1; PL1974615T3; US20100040591A1; US20130281669A1

Description

ΡΕ1974615 1

DESCRIÇÃO "FORMAÇÃO DE UM GEL À BASE DE PROTEÍNA" A presente invenção tem por objecto um método de formação de um gel, um isolado inibidor da protease da batata nativa submetido a um tratamento térmico, à utilização do referido isolado inibidor da protease, e a um produto alimentar compreendendo o referido gel ou isolado inibidor da protease. 0 suco não diluído do tubérculo da batata é geralmente designado por sumo de batata, enquanto que ao suco diluído se chama água de batata. A preparação do sumo de batata consiste em lavar e raspar as batatas, e em seguida separar o amido e as fibras através de diversas técnicas tais como as peneiras centrífugas, os hidroci-clones e os decantadores. 0 sumo de batata acabado de preparar é uma mistura complexa de substâncias solúveis e insolúveis que contêm proteínas, amido, minerais, glico-alcalóides tóxicos e fenóis reactivos monoméricos e poliméricos.

No entanto, o sumo de batata fresco não é muito estável. A oxidação leva a uma conversão dos compostos fenólicos em quinonas que rapidamente se combinam, tendo como resultado um resíduo polimérico escuro. Durante o 2 ΡΕ1974615 processo de oxidação, poderá ocorrer uma reticulaçâo parcial das proteínas da batata, o que reduz significativamente a solubilidade das proteínas. A complexidade e instabilidade do sumo de batata fazem com que a separação e o isolamento de proteínas modificadas ou ligeiramente desnaturadas seja um processo complicado e exigente do ponto de vista económico.

As proteínas da batata poderão, a título indicativo, ser divididas nas seguintes três classes: (i) a família das patatinas, glicoproteínas de 43 kDa acídicas altamente homólogas (40-50 % em peso das proteínas da batata), (ii) os inibidores da protease de 5-25 kDa básicos (30-40 % em peso das proteínas da batata) e (iii) as outras proteínas que, na sua maioria, são proteínas de elevado peso molecular (10-20 % das proteínas da batata) (Pots et al., J. Sei. Food. Agric. 1999, 79, 1557-1564).

Os inibidores da protease podem ser divididos em diferentes grupos com base no seu peso molecular. Os vários grupos de inibidores da protease são identificados da seguinte forma: o inibidor da protease I (com um peso molecular de cerca de 39 kDa), o inibidor da carboxipepti-dase (com um peso molecular de cerca de 4 100 Da), os inibidores da protease lia e Ilb (com um peso molecular de cerca de 20,7 kDa), e o inibidor da protease A5 (com um peso molecular de cerca de 26 kDa). A proporção destes diferentes grupos de inibidores da protease no total da proteína da batata irá depender da variedade da batata. Os 3 ΡΕ1974615 inibidores da protease existentes na batata apresentam um vasto leque de aplicações potencialmente importantes. Por exemplo, foi demonstrado que os inibidores da protease são úteis para o tratamento da diabetes, para induzir a saciedade nos mamíferos, para diminuir o risco de cancro de pele, para inibir o crescimento de bactérias, e para a prevenção ou tratamento da inflamação e do prurido na pele e no intestino. Consultar, por exemplo, o documento WO-A-99/059623.

Um dos principais inconvenientes da proteína da batata, tal como ela é actualmente utilizada, reside no facto de que a recuperação da proteína da batata sob a forma pura revelou ser muito difícil. A maior parte dos métodos do estado da técnica anterior produzem proteína de batata de baixa pureza, não são selectivos e/ou não têm capacidade para separar as diferentes funcionalidades. O pedido de patente europeia não previamente publicado 06077000.5 (EP-A-1920 662) descreve um processo selectivo e eficaz para o isolamento da proteína da batata nativa e das diferentes fracções de proteína de batata nativa com um elevado grau de pureza. O referido pedido de patente menciona ainda que o isolado de patatina da proteína de batata nativa e o isolado inibidor da protease da batata nativa podem ser utilizados como um agente gelificante num produto alimentar.

Para efeitos de formação do gel, são conhecidos e 4 ΡΕ1974615 aplicados no âmbito da técnica anterior vários tipos de compostos e mecanismos de gelificação da proteína. Entre os exemplos típicos incluem-se a gelificação térmica (por exemplo, a gelatina pode formar um gel após o arrefecimento de uma solução), a gelificação induzida por ácido através de desnaturação e floculação, e a formação do gel por meio da degradação parcial de proteínas utilizando enzimas. Os processos de conversão foram igualmente descritos, por exemplo, por Creusot (na sua tese de doutoramento intitulada "Enzyme-induced aggregation of whey proteins with Bacillus licheniformus protease", Wageningen University, Países Baixos, 2006), em que a formação do gel se dá com recurso a processos de um passo (gel nativo -> gel) ou de dois passos (proteina nativa - pré-agregado - gel). O pedido de patente GB-A-2 131 667 descreve uma dispersão proteica aquosa adequada para a obtenção de um gel por gelificação térmica, em que é feita a dispersão da composição numa fase aquosa com uma força iónica de 0,3 a 0,75 molares e um pH de 4,5 até 5,5, sendo que a referida composição compreende, pelo menos, 70% em peso de um isolado de proteína vegetal substancialmente não desnaturado, e até 30 % em peso de um amido, e o referido isolado de proteína vegetal é formado através da sedimentação de uma dispersão aquosa de micelas de proteína compostas por fracções proteicas anfifílicas.

Em particular em alimentos esterilizados, é importante existir um controlo da formação do gel. As 5 ΡΕ1974615 proteínas actualmente disponíveis mostram uma ampla variedade de comportamentos gelificantes, mas não apresentam uma formação de gel independente do calor. Tal seria desejável no caso de aplicações em alimentos com um elevado teor de proteínas e em alimentos ácidos.

Além disso, é desejável substituir as proteínas animais e/ou proteínas alergérnicas, tais como as proteínas da gelatina, do ovo e do leite/soro de leite, nos produtos de consumo alimentar.

Complementarmente, é desejável dispor de um processo fácil de formação de gel com um nível moderado de processamento.

Nessa mesma conformidade, faz parte do objecto da invenção proporcionar um método de formação de gel que permita um controlo das propriedades do gel, tal como a transparência e/ou a viscosidade.

Um outro objecto da invenção consiste em proporcionar um método para a formação de um gel utilizando uma proteína que apresenta uma formação de gel independente do calor.

Um ou mais dos referidos objectos são atingidos pelo método da presente invenção, no qual é aplicado um isolado específico de proteína de batata nativa. 6 ΡΕ1974615

Assim sendo, num primeiro aspecto, a presente invenção visa um método para a formação de um gel compreendendo os seguintes passos: • preparar uma solução aquosa de um isolado inibidor de protease da batata nativa com um ponto isoeléctrico de mais de 6,0, preferencialmente superior a 7,0, e com um peso molecular de menos de 35 kDa, preferencialmente inferior a 23 kDa; • submeter a solução do inibidor de protease da batata nativa a um tratamento térmico a uma temperatura entre 65 e 121°C durante pelo menos 10 minutos, com uma força iónica inferior a 60 mM e um pH abaixo de 4,5, para proporcionar uma solução de um inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente; e • definir o valor da força iónica da solução do inibidor de protease da batata nativa para mais de 60 mM.

Os passos do método de acordo com a presente invenção poderão ser executados em qualquer ordem, mas é preferível que sejam executados subsequentemente.

Os inventores constataram que este método de formação de gel é independente do calor. Além disso, constataram surpreendentemente que as propriedades do gel são susceptíveis de serem controladas pela força iónica definida. O termo "isolado inibidor da protease", conforme empregue neste contexto, deverá ser entendido como refe- 7 ΡΕ1974615 rindo-se a um isolado inibidor de protease da proteina de batata nativa, o qual poderá ser obtido de acordo com o processo descrito no pedido de patente europeia não pre-viamente publicado 06077000.5. O isolado inibidor da protease engloba uma maioria de inibidores da protease (preferencialmente, mais de 85% de todas as proteínas, tal como medido através de uma análise por electroforese em gel) e uma minoria de outras proteínas. O isolado inibidor da protease da batata nativa apresenta um ponto isoeléctrico superior a 6,0 e um peso molecular inferior a 35 kDa. O termo "inibidor da protease", conforme empregue neste contexto, deverá ser entendido como incluindo diferentes tipos de inibidores da protease e outras proteínas que estão presentes no isolado inibidor de protease da batata nativa. O isolado inibidor de protease da batata nativa a ser utilizado no método da presente invenção poderá ser obtido através do processo descrito no pedido de patente europeia não previamente publicado 06077000.5. O conteúdo do referido pedido de patente é incorporado no presente documento para fins de referência.

De acordo com o processo do pedido de patente europeia não previamente publicado 06077000.5, o sumo da batata é, de preferência, pré-tratado por um catião metálico bivalente com um pH de 7-9, de modo a flocular o material indesejado. Em seguida, os flocos são separados do ΡΕ1974615 sumo de batata por centrifugação. 0 sobrenadante é submetido a uma cromatografia em leito expandido, realizada com um pH de menos de 11 e uma temperatura entre 5 e 35°C, utilizando um adsorvente que se liga à proteína da batata nativa. Por fim, a proteína da batata nativa é eluída a partir do adsorvente utilizando um eluente adequado. Este processo produz um isolado de proteína de batata nativa de elevada pureza com um mínimo de proteína desnaturada e uma solubilidade estável.

Se forem utilizados modos mistos de adsorvência, as proteínas de batata nativa podem ser fraccionadas quer em termos de ponto isoeléctrico quer de peso molecular. Isto permitirá separar as fracções de patatina e do ini-bidor da protease. A adsorvência mista pode ser utilizada em dois modos. 0 primeiro modo é a eluição selectiva, que consiste na ligação de essencialmente toda a proteína da batata e, subsequentemente, em eluir uma primeira fracção de proteína de batata desejada com um tampão apropriado e eluir uma segunda fracção de proteína de batata desejada com um outro tampão apropriado. 0 segundo modo é a adsorção selectiva, que consiste na ligação de uma primeira fracção de proteína de batata desejada numa coluna com um pH elevado, e em ajustar o efluente para um pH mais baixo de maneira a que uma segunda fracção de proteína de batata desejada possa ligar-se numa segunda coluna. Os inibidores da protease são eluídos com um pH de 5,8-12,0, preferencialmente com um pH de 6,0-9,5. 9 ΡΕ1974615

Após a eluição, as proteínas de batata nativa podem ser concentradas por ultrafiltração. Isto poderá reduzir ainda mais a quantidade de compostos indesejados, tais como os glicoalcalóides. No caso dos inibidores da protease, a ultrafiltração é tipicamente realizada com um pH de 3-7, preferencialmente de 3,2-4,5. À parte a ultrafiltração, poderão ser aplicados outros métodos de concentração tais como evaporação, concentração por congelação, ou precipitação isoeléctrica utilizando dióxido de carbono. É preferível que o isolado inibidor da protease de batata nativa a ser utilizado na presente invenção tenha uma concentração de glicoalcalóides de menos de 150 ppm. Os inibidores da protease da batata nativa poderão ser isolados a partir de qualquer espécie de batata. Tipicamente, os inibidores da protease são isolados a partir da Solanum tuberosum.

De acordo com a presente invenção, o isolado inibidor da protease da batata nativa tem um ponto isoeléctrico superior a 6,0, preferencialmente superior a 7,0. Isto irá proporcionar cargas suficientes para obter as propriedades de formação de gel desejadas. Por questões práticas, é preferível que o ponto isoeléctrico não seja superior a 9,0.

As moléculas de proteínas pequenas são geralmente mais estáveis do que as proteínas com um elevado peso molecular. Por conseguinte, é desejável que as moléculas 10 ΡΕ1974615 inibidoras de protease sejam relativamente pequenas. 0 isolado inibidor de protease da batata nativa a ser utilizado no método da presente invenção tem um peso molecular de menos de 35 kDa, preferencialmente de menos de 23 kDa.

Complementarmente, é preferível que as proteínas sejam compactas. Isto é também vantajoso para a estabilidade das proteínas. Assim, os inibidores da protease poderão ter uma ou mais pontes dissulfureto intramole-culares. As pontes dissulfureto ajudam a proporcionar uma configuração proteica forte após o aquecimento. De modo a não quebrar as pontes dissulfureto nos inibidores de protease da batata nativa, não é aconselhável utilizar condições redutoras ao purificar o isolado.

Além disso, é vantajoso que a dependência do pH em relação a carga da proteína seja limitada, de modo a evitar o desdobramento da proteína com um valor baixo de pH. É desejável ter uma carga proteica relativamente baixa com um pH baixo. A carga poderá ser calculada utilizando-se a sequência de aminoácidos da proteína e as ferramentas de modelação de proteínas, tais como o Calculador de Proteína (Scripps Research Institute).

De acordo com o método da invenção, é preparada uma solução a partir do isolado inibidor de protease da batata nativa. Preferencialmente, a concentração de inibidores de protease da batata nativa é de pelo menos 3 % em 11 ΡΕ1974615 peso, com base no peso total da solução, e preferencialmente de pelo menos 4 % em peso. É utilizada, de preferência, uma solução aquosa para aplicações alimentares. Os solventes orgânicos poderão ser considerados no caso de aplicações não alimentares. A solução do inibidor de protease da batata nativa é submetida a um tratamento térmico. Durante o tratamento térmico, é induzida uma pequena alteração de configuração nas moléculas inibidoras da protease. A actividade inibidora da protease, e.g. do inibidor de tripsina é desse modo substancialmente reduzida. 0 tratamento térmico envolve o aquecimento até uma temperatura entre os 65-121°C, preferencialmente até uma temperatura entre os 85-100°C, um tratamento de UHT (Temperatura Ultra Elevada) em que são usadas temperaturas acima dos 121°C. Durante um tratamento de UHT, tipicamente a temperatura não será superior a 175°C, preferencialmente não superior a 160°C, por um curto período de tempo que é normalmente de 0,5 a 10 segundos, preferencialmente de 1 a 5 segundos, e mais preferencialmente de 1 a 2 segundos. Um tratamento de UHT típico é conhecido dos especialistas nesta matéria. Se a temperatura se situar abaixo dos 65°C, então a alteração de configuração será insuficiente. Se a temperatura se situar acima dos 121°C, as moléculas de proteínas degradar-se-ão a menos que seja utilizado um tratamento de UHT. A solução do inibidor de protease da batata nativa é aquecida durante pelo menos 10 minutos. Preferencialmente, a solução do inibidor de protease da 12 ΡΕ1974615 batata nativa é aquecida durante 15 a 60 minutos, mais preferencialmente 20 a 45 minutos. O tratamento térmico é levado a cabo com uma força iónica inferior a 60 mM e um pH inferior a 4,5. Preferencialmente, o pH situar-se-á entre 3,0 e 4,5. Durante este tratamento, não ocorre qualquer formação de gel. O inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente e assim obtido é um produto intermediário do gel final. Desse modo, um dos aspectos da invenção relaciona-se com um inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente, e que é susceptivel de ser obtido através do método da presente invenção. O referido inibidor da protease compreende um isolado inibidor de protease da batata nativa que apresenta um ponto isoeléctrico de mais de 6,0, preferencialmente superior a 7,0, e um peso molecular de menos de 35 kDa, preferencialmente inferior a 23 kDa. O tratamento térmico consiste no aquecimento até uma temperatura entre 65-121°C durante pelo menos 10 minutos, com uma força iónica inferior a 60 mM e um pH inferior a 4,5. Em alternativa, a solução poderá ser tratada por meio de um tratamento de UHT, atingindo-se temperaturas acima dos 121°C, com um pH inferior a 4,5, preferencialmente entre 3,0 e 4,5. Este inibidor da batata nativa tratado termicamente poderá ser utilizado, com vantagem, como um agente gelificante. 13 ΡΕ1974615

Por conseguinte, num aspecto, a invenção relaciona-se com a utilização do inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente, como um agente gelificante, por exemplo em produtos alimentares e produtos da indústria farmacêutica. A solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente poderá ser utilizada como tal, ou depois de adicionalmente concentrada, ou como um pó submetido a secagem por congelação, secagem instantânea ou secagem por pulverização.

Para que se forme um gel, a força iónica da solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente deverá ser ajustada para um valor acima de 60 mM. Num modo de realização da invenção, a força iónica é definida por meio da adição de pelo menos um sal à solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente. Num outro modo de realização, a força iónica é definida para um valor acima de 60 mM, adicionando-se a solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente a uma composição (tal como uma composição alimentar) compreendendo, pelo menos, um sal. Ainda num outro modo de realização, a força iónica é definida para um valor acima de 60 mM começando por se adicionar à solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente uma quantidade de sal e, subsequentemente, adicionar esta solução do inibidor de protease a uma composição contendo uma porção de sal.

Preferencialmente, a força iónica é definida para 14 ΡΕ1974615 um valor entre 60-400 mM. Contudo, para aplicações técnicas e aplicações do tipo do molho de soja, poderá ser utilizada uma força iónica de até 3000 mM, ou mesmo de até 4000 mM. Definir a força iónica para um valor acima de 60 mM tem como resultado a formação de um gel. O referido gel é normalmente designado por gel ionogénico, em contraste com um gel que seja induzido termicamente ou um gel induzido por um ácido. A força iónica poderá ser definida para mais de 60 mM quando à temperatura ambiente, mas também em temperaturas elevadas tais como 65-121°C ou, no caso de um tratamento de UHT, a temperaturas acima dos 121°C.

As caracteristicas vantajosas do inibidor de protease da batata nativa, associadas à aplicação de um sal compatível com alimentos, proporcionam uma via alternativa de formação instantânea de geles em produtos alimentares. Isto evita o recurso ao aquecimento ou arrefecimento dos produtos para formar os geles, ou uma viscosidade acrescida com base no teor de proteína. A formação do gel dependerá significativamente da concentração do sal, do pH e da concentração da proteína empregues.

Em princípio, qualquer tipo de sal, contendo catiões mono- ou bivalentes, poderá ser utilizado para definir o valor da força iónica para mais de 60 mM, quer seja adicionando-o à solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente, ou numa composição à qual seja adicionada a solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente. Citam-se como exemplos 15 ΡΕ1974615 os sais que contêm catiões de sódio, potássio e cálcio. São igualmente possíveis algumas combinações de sais diferentes. 0 efeito parece ser mais acentuado no caso do catião de cálcio. No entanto, o catião de sódio apresenta vantagens em combinação com proteinas de soja e de leite, visto que aquele tende a precipitar-se na presença de cálcio.

Uma vantagem importante da presente invenção reside no facto de as propriedades do gel, tal como a transparência e/ou a viscosidade, poderem ser controladas mediante a força iónica definida. Nessa perspectiva, ao alterar a força iónica, por exemplo alterando a quantidade de sal adicionada, é possivel preparar um gel claro, um gel opaco, ou um gel leitoso, e ao mesmo tempo influenciar a viscosidade do gel. A carga positiva numa gama alargada de valores de pH revela-se importante para os fins de uma formação eficaz de coacervados. Coacervados são complexos que se formam entre proteínas de carga positiva e um polissacarídeo de carga negativa (e.g. F. Weinbreck, "Whey protein/ polysaccharide coacervates: structure and dynamics", Tese de Doutoramento, Utrecht University, 2004) . As proteínas do soro de leite, com um ponto isoeléctrico de 5,2, têm uma gama de valores de pH limitada até um pH de 5,2, no qual uma carga positiva permitirá a formação de complexos com polissacarídeos de carga negativa. Com um ponto isoeléctrico mais elevado do isolado inibidor da protease, o pH eficaz para que ocorra a formação de coacervação poderá ser 16 ΡΕ1974615 aumentado para valores de pH 6,0 até 7,0. Os inibidores de protease pré-tratados termicamente podem ser utilizados para coacervar os compostos termolábeis, tais como aroma-tizantes, ácidos gordos, lipidos e enzimas.

Num modo de realização especial, a solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente é submetida a secagem por congelação, secagem instantânea ou secagem por pulverização para se obter um pó inibidor da protease da batata nativa inactivado. Este pó seco é estável e pode ser armazenado durante longos períodos de tempo.

Aquando do processamento do pó, o pó inibidor de protease da batata nativa inactivado poderá ser dissolvido a fim de formar uma solução com uma força iónica de menos de 60 mM e um pH de menos de 4,5. A dissolução do pó poderá ser efectuada à temperatura ambiente. Ocorrerá a formação de um gel após a força iónica da solução ter sido definida para mais de 60 mM.

Num passo opcional, o tempo de formação do gel poderá ser reduzido mediante o aquecimento até uma temperatura entre 65 e 121°C, preferencialmente entre 85 e 100°C, ou um tratamento de UHT a temperaturas superiores a 121°C, após se ter definido a força iónica para mais de 60 mM. A formação de gel de acordo com o método da 17 ΡΕ1974615 presente invenção é reversível. Se o gel for diluído até a força iónica ser inferior a 60 mM, o gel dissolver-se-á outra vez lentamente.

Num outro aspecto, a invenção relaciona-se com um gel susceptível de ser obtido de acordo com o método da invenção. Constatou- se que o referido gel possui uma estrutura pequena e regular. A sua clareza poderá ser controlada pelo sal e pela concentração do isolado do inibidor da protease. A invenção diz ainda respeito a um produto alimentar compreendendo o gel ou o inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente que é susceptível de ser obtido através do método da invenção. Mais concretamente, isto envolve produtos alimentares com forças iónicas de mais de 60 mM. O produto alimentar pode apresentar-se sob a forma de uma bebida, preferencialmente uma bebida com elevado teor proteico ou uma bebida desportiva. Os geles moles podem ser utilizados quer como viscosificante, quer como fortificante proteico.

Exemplos

Exemplo 1: Formação de gel induzida por sal numa solução do inibidor da protease tratada termicamente

Os geles foram formados utilizando três vias. Como material inicial, foi utilizado um concentrado do 18 ΡΕ1974615 isolado inibidor da protease com uma concentração correspondente a 20 °Brix e um pH de 3,5. O ponto isoeléctrico mínimo é de 6,0. O concentrado é diluído até se obter uma solução com 3% em peso de proteína, num volume de 1600 ml. O pH foi ajustado para os valores indicados na Tabela 1. O diagrama de fluxo do processo das três vias de processamento é apresentado na Figura 1. A Via A é um tratamento térmico a uma temperatura entre 65 e 90°C durante 30 minutos, com um pH de 3,0-4,5 e na presença de mais de 60 mM NaCl. Este tratamento conduz à formação de um gel.

Na Via B, com uma força iónica de menos de 60 mM, um tratamento térmico de 30 minutos num banho-maria a 90°C não conduz à formação de um gel. A actividade do inibidor da protease, tripsina, é no entanto reduzida para menos de <10 % da actividade original. O líquido é arrefecido até à temperatura ambiente. A formação do gel é induzida na Via B através do aumento da força iónica para um valor acima de 60 mM após o tratamento térmico.

Uma parte da solução do inibidor de protease tratada termicamente, obtida na Via B (970 ml), é separada e submetida a secagem por congelação (Via C) . Obtém-se assim um isolado inibidor de protease inactivado seco. Após a dissolução do pó, obtém-se uma solução transparente que poderá formar um gel à temperatura ambiente depois de se definir a força iónica para um valor acima de 60 mM por 19 ΡΕ1974615 adição de NaCl. Nestes ensaios experimentais, a força iónica foi aumentada até 200 mM. A gelificação ocorre à temperatura ambiente ou a uma temperatura elevada.

Tabela 1: Fórmula para as três vias de formação de gel

Formação de gel induzida por sal frio Formação de gel induzida por sal aquecido Seco por congelação Concentrado Seco por congelação Amostra 1 2 3 4 5 6 Via no Esquema C C B B C C Isolado inibidor da protease (% em peso) 4 8 4 8 4 8 NaCl (% em peso) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Água (% em peso) 95,4 91,4 95,4 91,4 95,4 91,4 PH 3,5 3,0 3,5 3,0 3,5 3,0 Carga da resistência do gel (g)* 40 26 220 220 205 235 * A resistência do gel foi medida utilizando um analisador de textura Stevens-LFRA, Condições: distância 40 mm, velocidade 2,0 mm/s. O tempo de formação do gel e a resistência do gel depende da concentração de proteína, da concentração de sal e do pH. Uma concentração elevada de sal e proteína fará aumentar a velocidade de formação do gel. As Amostras 1 e 2 foram medidas após 17 horas. Sob as referidas condições, formou-se um gel relativamente fraco. No entanto, o aquecimento até aos 30-80°C aumenta a formação de gel e a resistência, após a adição de sal, para os níveis de resistência do gel obtidos através da Via C. O tempo de obtenção de um gel induzido por sal à 20 ΡΕ1974615 temperatura ambiente pode ser controlado de alguns minutos até várias horas.

Este exemplo mostra que um isolado inibidor da protease poderá ser inactivado termicamente de modo a formar um pó de gelificação pré-activado. A gelificação poderá ser induzida por sal à temperatura ambiente, bem como a temperaturas elevadas. O Exemplo 1 também mostra que poderá ser obtida uma solução do inibidor de protease pré-activada estável, que irá formar geles após a adição de sal. Em alternativa, a solução do inibidor de protease pré-activada poderá ser adicionada a uma mistura alimentar ou outra mistura rica em sal. As condições de processamento podem ser optimizadas a fim de obter a viscosidade ou resistência do gel desejada atempadamente.

Exemplo 2: Fortificação e estruturação de uma bebida desportiva.

Misturou-se uma bebida desportiva, que apresentava um pH de 3,5, com o pó inibidor da protease inactivado termicamente que foi obtido após secagem por congelação na Via C do Exemplo 1. No total, adicionou-se 4% em peso de proteina à bebida. A viscosidade do liquido foi aumentada, mas não ocorreu a formação de um gel sólido. A bebida era uma solução transparente e sem sabor amargo por adição de proteina. Esta bebida é muito adequada enquanto bebida de 21 ΡΕ1974615 elevado teor proteico, com um perfil de aminoácidos equilibrado.

Exemplo 3: Formação de gel instantânea com iões de potássio, sódio e cálcio

Os geles foram produzidos utilizando-se o procedimento A, B e C de acordo com a Figura 1. A seguir ao sódio, foram utilizados iões de potássio e iões de cálcio para formar geles e geles induzidos por sal. Constatou-se que os niveis eficazes dos iões de cálcio eram bastante inferiores. Com niveis elevados de cálcio, formou-se um coágulo leitoso. Os resultados são apresentados na Tabela 2 .

Tabela 2: Propriedades das soluções de proteínas após um tratamento térmico a 90°C durante 30 minutos, com um pH de 3,5 e uma dosagem de 4% em peso de proteína.

Concentração (nM) Aspecto Carga da resistência do gel (g)* NaCl 50 Liquido viscoso 93 100 (fel opaco forte 276 150 Efesta viscosa leitosa 39 KC1 50 (fel claro 141 100 (fel forte cpaco 180 150 Basta leitosa viscosa 43 CaCl2 50 (fel claro 369 100 Basta leitosa viscosa 50 150 leite 32 * A resistência do gel foi medida utilizando um analisador de textura Stevens-LEBA, Condições: distância 40 itm, velocidade 2,0 nm/s. 22 ΡΕ1974615

Exemplo 4: Aspecto dos geles do isolado inibidor da protease tratado termicamente. A solução do isolado inibidor de protease da batata nativa foi aquecida a uma temperatura de 90 °C durante 30 minutos enquanto o pH foi ajustado com NaOH ou HCl. O aspecto do gel foi classificado em 6 categorias utilizando os códigos descritos na legenda. A Tabela 3 mostra as várias condições que podem ser empregues para obter a propriedade de viscosidade e o gel desejados. Mesmo com baixas concentrações proteicas, as condições podem ser ajustadas a fim de se obter um gel claro.

Legenda da Tabela 3

Aspecto do gel 1= Liquido claro 2= Liquido viscoso claro 3= Gel claro 4= Gel opaco 5= Pasta leitosa 6= Liquido leitoso ΡΕ1974615 23

Lisboa, 15 de Março de 2010

Claims

ΡΕ1974615 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de formação de um gel, compreendendo os seguintes passos - preparar uma solução aquosa de um isolado inibidor de protease da batata nativa com um ponto isoeléctrico de mais de 6,0, preferencialmente superior a 7,0, e com um peso molecular de menos de 35 kDa, preferencialmente inferior a 23 kDa; - submeter a solução do inibidor de protease da batata nativa a um tratamento térmico a uma temperatura entre 65 e 121°C durante pelo menos 10 minutos, com uma força iónica inferior a 60 mM e um pH abaixo de 4,5, para proporcionar uma solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente; e - definir o valor da força iónica da solução do inibidor de protease da batata nativa para mais de 60 mM.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a força iónica da solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente é definida para mais de 60 mM através da adição de, pelo menos, um sal.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a força iónica da solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente é definida para mais de 60 mM, adicionando-se a solução do inibidor de protease da 2 ΡΕ1974615 batata nativa tratada termicamente a uma composição contendo pelo menos um sal.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o isolado inibidor de protease da batata nativa tem uma concentração de glico-alcalóides de menos de 150 ppm.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o inibidor de protease da batata nativa é isolado a partir de Solanum tuberosum.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o isolado inibidor de protease da batata nativa tem um ponto isoeléctrico de 6,0-9,0.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a concentração de inibidor de protease da batata nativa na solução é de pelo menos 3% em peso, com base no peso total da solução, e preferencialmente de pelo menos 4% em peso.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o tratamento térmico envolve o aquecimento até uma temperatura de 85-100°C durante pelo menos 10 minutos, ou um tratamento de UHT a temperaturas acima de 121 °C. 3 ΡΕ1974615
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o tratamento térmico é realizado com um pH de 3,0-4,5.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a força iónica da solução do inibidor de protease da batata nativa é definida para 60-4000 mM, preferencialmente para 60-400 mM.
11. Método de acordo com as reivindicações 2 a 10, em que pelo menos um sal compreende um catião seleccio-nado do grupo composto por iões de sódio, potássio e cálcio.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a transparência e/ou a viscosidade do gel é controlada pela força iónica definida.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente é submetida a secagem por congelação, secagem instantânea ou secagem por pulverização, e subsequentemente dissolvida em água antes de ajustar a força iónica para mais de 60 mM.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, compreendendo o passo adicional de aquecer a solução do inibidor de protease da batata nativa com uma força iónica 4 ΡΕ1974615 superior a 60 mM e a uma temperatura entre 65 e 121 °C, preferencialmente a uma temperatura entre 85 e 100°C.
15. Gel susceptivel de ser obtido por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Método de formação de um inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente, compreendendo os seguintes passos - preparar uma solução aquosa de um isolado inibidor de protease da batata nativa com um ponto isoeléctrico de mais de 6,0, preferencialmente superior a 7,0, e com um peso molecular de menos de 35 kDa, preferencialmente inferior a 23 kDa; - submeter a solução do inibidor de protease da batata nativa a um tratamento térmico a uma temperatura entre 65 e 121°C durante pelo menos 10 minutos, com uma força iónica inferior a 60 mM e um pH abaixo de 4,5, para proporcionar uma solução do inibidor de protease da batata nativa tratada termicamente.
17. Inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente, susceptivel de ser obtido pelo método descrito na reivindicação 16.
18. Inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente, de acordo com a reivindicação 17, sob a forma de uma solução. 5 ΡΕ1974615
19. Inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente, de acordo com a reivindicação 17, sob a forma de um pó.
20. Utilização de um inibidor de protease da batata nativa tratado termicamente, de acordo com as reivindicações 17 a 19, enquanto agente gelificante, agente de coacervação ou agente viscosificante, por exemplo em produtos alimentares e produtos da indústria farmacêutica.
21. Produto alimentar compreendendo um gel de acordo com a reivindicação 15 ou um inibidor de protease da batata nativa de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19.
22. Produto alimentar de acordo com a reivindicação 21 sob a forma de uma bebida, preferencialmente uma bebida de elevado teor proteico ou uma bebida desportiva. Lisboa, 15 de Março de 2010 ΡΕ1974615 1/1 ittVsswwy.v.TOTOSsww «UlDKCtZSd& /^jawsaaii-a fcttH£S£-a\ / · JS isàiL^ \ ( . SS-SITC > X S-I«mMKiCÍ / f "'"V /lia&sa-HDía ιΜιεοκΛ / »más..SST ’ X \ ^jsMStCS / \ 3#=pH^t,5 / /”·...................V / SKíjsaipsi: ^ , ψ* í.>xí?*>;ç&;í víj \ V pHff jraiwasEíçStl· / A ________ C Ffr iidibkkc de justes» tstórcsdte Fâ gHÍí&CKOÍB /ISisss^sitr «sa. \ / i£j5i i ísm^«x~ X ( Sifi axabsiayi ) \ «SSssdiS HaQ / \ 3vfesHCS / 9 ψ ......................... '! IsaiíKbx' d» gaiochas» iaacSixíjÍG: \ lafciiK· & justes» istórcsác Gsrcisiisdc : Safcçto Snssparwite fotaçle SrasspaieDíe ; Gkss«ritf&Ji& Gsci, ssKEÍtittiri& -i; ;---:-......~, .......wv.fswwww / Αώ^3·5 de \ / de 7 / dvi-iSSiaK-Niv; N / Síf-iSií rfNsCS \ &KSp*£3Ííli:L· / % ^íffisspwa&icB V &EO^OSadB / \ ÈfflJíMSiB •i / X....................... / Lsssc ^ 17 kcsss

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