CN109457044B - 预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记，包含在马铃薯种薯中的表达具有规律性的StGATA4L基因，所述StGATA4L基因具有如SEQ ID:1所示的核苷酸序列。本发明通过分析对比块茎从休眠到萌芽的基因表达谱并结合荧光定量技术，筛选到表达量随贮藏时间的变化非常灵敏的基因StGATA4L。该基因表达量随时间呈线性上升，并且催芽激素赤霉素和抑制发芽激素脱落酸处理不会引起其表达量剧变，即该基因的表达量可以作为检测块茎生理状态并预测萌芽时间的稳定标记；同时，发现块茎成熟收获时该基因起始表达量越低的品种其块茎休眠期越长，即利用该基因的初始表达水平可判断不同品种的休眠期。

Description

预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记。

背景技术

马铃薯利用块茎无性繁殖，除菜用、加工外，也用作种薯。块茎有休眠期，且不同基因型间的休眠期约30～150天不等，休眠过后会自行萌芽。当用作种薯时，需知道块茎萌芽时间，以便与播种季节一致，否则播种处于休眠期的种薯会出苗不齐或烂薯，而播种发芽过久的老化种薯则导致减产10％～30％。种薯在播种前能整齐萌芽，达到最佳生理状态，是保证产量的关键。块茎休眠期长短除受基因型决定外还受多种因素的影响，如种薯级别、生长环境、贮藏条件，这更增加了预判种薯萌芽时间的难度。在生产上常有将种薯贮藏一段时间再拿出来播种，剩余薯块再贮藏或晚贮藏等不同情况，仅凭经验或外观观察难以准确推断萌芽时间。

目前生产上一般通过肉眼观察块茎芽眼部位长出2～3mm的芽来确认块茎休眠解除萌芽，没有预测一批种薯准确发芽时间或休眠期的方法。通过经验判断则因影响块茎萌芽的因素多，往往准确性不高。目前没有准确判断块茎萌芽前生理状态的方法，即在人为观察确认块茎萌芽前(芽眼部位长出2～3mm的芽即认为块茎休眠解除萌芽)，不知道块茎是处于深度休眠期、休眠中期还是休眠末期即将萌芽。这给生产上的种薯调运、催芽以及延迟发芽等技术的使用带来不确定性和困扰，不利于马铃薯种薯质量控制。

不管是生长发育还是外部因素对植物的影响，都必然首先涉及到基因表达变化，即基因表达变化先于外观形态变化，可以作为植物生理状态的指示。研究已发现响应干旱、盐、低温、低磷等逆境的基因，并以这些基因的表达作为植物抗逆境能力的判断依据。

对马铃薯块茎由休眠向萌芽转变过程中的基因表达变化已有一些研究，但目前并未找到能通过检测基因表达量来预测块茎萌芽时间或块茎休眠期的方法。刘柏林(马铃薯块茎休眠与发芽抑制差减cDNA文库构建及相关功能基因克隆[D].硕士学位论文.甘肃:甘肃农业大学，2011)利用差减杂交技术筛选到腺苷二磷酸核糖基化/植物激素响应因子编码基因ARF，在马铃薯块茎的休眠解除过程中，该基因的表达量呈下降上升下降变化趋势，突破芽眼和芽长超过1cm为两个转折点，可以作为块茎解除休眠的内在标记，但要通过检测该基因表达量找到转折点意味着需要连续检测，较为耗时，同时也无法通过检测该基因表达来预测块茎萌芽前的生理状态和萌芽时间。Senning等(Senning M,Sonnewald U,Sonnewald S.Deoxyuridine triphosphatease expression defines the transitionfrome dormant to sprouting potato tuber buds[J].Mol.Breeding,2010,26:525–531)发现脱氧尿苷三磷酸酶编码基因的表达在块茎萌芽前7d前突然升高(块茎第77d萌芽，该基因在第70d突然升高)，认为可作为块茎由休眠向萌芽转变的标记之一。但该基因在这突然升高之前一直处于低水平的平稳表达状态，即不能通过检测该基因的表达来判断块茎向萌芽转变之前的生理状态，也无法预知块茎萌芽时间。同时Senning的试验还表明催芽剂赤霉素处理后9h该基因表达量即升高到萌芽时的表达量，但此时块茎并未发芽，判断受到干扰。即该基因表达仅能作为块茎由休眠向萌芽转折的标记，不能监测块茎生理状态变化，不能用于预测块茎休眠期和萌芽时间，且受催芽剂干扰。

目前没有预测块茎萌芽时间的方法，即面对任一批薯块，不知道它们是处于深度休眠期、休眠中期还是休眠末期即将萌芽的生理状态，不清楚它们还有多少天会萌芽。这给生产上的种薯调运和播种时间的确认、催芽以及延迟发芽等技术的使用带来不确定性和困扰，不利于马铃薯种薯质量控制。因此，需要一种能够预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的稳定的生物标记，并依此建立预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的方法，以便为实际种薯调运和播种提供指导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的稳定的生物标记，并依此建立预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记，包含在马铃薯中的表达具有规律性的StGATA4L基因，所述StGATA4L基因具有如SEQID:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种用于预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的试剂盒，包含反转录系统和扩增系统，所述反转录系统包括反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂，所述扩增系统包括StGATA4L基因扩增引物。

具体地，所述StGATA4L基因扩增引物序列如SEQ ID:2和SEQ ID:3所示。

具体地，SEQ ID:2所示为Forward Primer(上游引物)，SEQ ID:3所示为ReversePrimer(下游引物)。

本发明还提供一种上述所述的预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记，或所述的用于预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的试剂盒在预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期中的应用。

本发明还提供一种预测马铃薯种薯萌芽时间的方法，具体包括：

(1)测定不同品种马铃薯种薯块茎萌芽时的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值，并取平均值Y；

(2)测定待预测马铃薯种薯T1时间点的块茎的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Y1；

(3)测定待预测马铃薯种薯T2时间点的块茎的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Y2；

(4)按D＝(T2－T1)×(Y－Y1)/(Y2－Y1)预测待预测马铃薯种薯萌芽距离T1时间点所需时间D。

具体地，所述平均值Y为2.21。

较佳地，所述T1时间点和所述T2时间点的间隔时间为14～28d。

具体地，所述StGATA4L基因的表达量的测定以基因EF1αL为内参，以费乌瑞它品种休眠时的表达量为对照。

本发明还提供一种预估马铃薯块茎休眠期的方法，包括：

(1)测定待预估马铃薯块茎成熟后的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Y，测定费乌瑞它品种成熟后的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值X和米拉品种成熟后的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Z；

(2)若Y＞X，则对应的马铃薯块茎属于短休眠期材料，休眠期短于所述费乌瑞它品种的休眠期；

若Z＜Y≤X，则对应的马铃薯块茎属于中等休眠期材料，休眠期介于所述费乌瑞它品种和所述米拉品种的休眠期之间；

若Y≤Z，则对应的马铃薯块茎属于长休眠期材料，休眠期长于所述米拉品种的休眠期。

其中所述StGATA4L基因的表达量的测定以基因EF1αL为内参，以费乌瑞它品种休眠时的表达量为对照。

本发明通过分析对比马铃薯块茎从休眠到萌芽的基因表达谱并结合荧光定量技术，筛选到表达量随贮藏时间的变化非常灵敏的基因StGATA4L。该基因表达量随时间呈线性上升，并且催芽激素赤霉素和抑制发芽激素脱落酸处理不会引起其表达量剧变，即该基因的表达量可以作为检测块茎生理状态并预测萌芽时间的稳定标记；同时，发现块茎成熟收获时该基因起始表达量越低的品种其块茎休眠期越长，即利用该基因的初始表达水平可判断不同品种的休眠期。

本发明通过检测多个品种和杂交群体材料的块茎StGATA4L表达量随块茎生理状态的变化模式，由此建立了可以通过检测该基因表达水平来判断任一块茎生理状态，预测萌芽时间和块茎休眠期的方法。该方法简单方便，可准确判断块茎生理状态，为种薯播种和块茎贮藏提供科学依据。同时可以通过检测材料在收获块茎时的基因表达量来初步判断该材料的休眠期，作为筛选耐贮藏材料的指导。

附图说明

图1为StGATA4L基因的表达量随贮藏时间的变化；

图2为不同杂交后代群体块茎成熟后的StGATA4L表达量与块茎休眠的关系。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

实施例1马铃薯块茎RNA的提取与检测

准备马铃薯不同休眠期品种：中薯2号、费乌瑞它、川芋56、米拉、坝薯10号、川芋117，以及来源于10个马铃薯杂交组合群体的27份材料。挑选5-7月份分批新收薯块(根据熟期大致按早、中、晚熟三批收获)，常温下7d后装入密封硬纸盒，在(23±2)℃室内贮藏。每隔7d取样，以80％薯块带2～3mm小芽定义为薯块解除休眠萌芽，所需时间即为该材料的休眠期，在该时间点取样后即结束该材料的取样。取样方式：以顶芽芽眼为中心，用直径3mm，高5mm的硬质管打孔取圆柱体，10个这样的圆柱体混合提取1管RNA。

提取RNA所用的研钵、EP管、枪头、ddH₂O水、1mol/L NaAc均经0.1％DEPC处理24h，121℃20min降解DEPC，研钵、EP管和枪头等在80℃下烘干。DEPC处理水用来配制75％乙醇。RNA提取采用Trizol法，由于块茎含大量淀粉、可溶性糖以及酚类物质，需改进方法以除去这些干扰物质，具体步骤如下：

①研磨：研钵放入4勺液氮和所取样品薯块，液氮挥发完后迅速磨成细粉，迅速装入EP管后加1mL Trizol，剧烈混匀，室温放5-10min。

②4℃12000rpm离心5min，直接倒上清入已加200μL氯仿的新管中，上下颠倒15s混匀，室温放5min。

以下在冰上操作：

③4℃12000rpm离心10min，吸取上清到新管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀。

④4℃12000rpm离心20min，吸取上清到新管，逐渐加入无水乙醇使其终浓度为12％，上下颠倒混匀后迅速离心。

⑤4℃12000rpm离心10min，吸取450μL到新管，加入0.7倍体积异丙醇上下颠倒混匀，并加入0.2倍体积1mol/L NaAc-20℃沉淀1h。

⑥4℃12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL 75％乙醇洗沉淀，4℃、8500rpm离心3min，再加1mL 75％乙醇洗2遍。

⑦倒掉上清，尽量吸掉多余液体，超净台上吹风10min除残留乙醇，加入80μL DEPC处理水，立即放入55℃水浴5min，-80℃60min，重复2次。

⑧4℃12000rpm离心20min，小心吸取上清70μL，注意不接触底部，-80℃冻存备用。

对提取到的RNA纯度及浓度进行检测，RNA完整性用琼脂糖凝胶电泳检测：2μL样品+6μL 1.5×Loading Buffer，1％琼脂糖，Gel Red染料，80V，40min，1×TAE缓冲液。

实施例2反转录和qRT-PCR

将提取到的马铃薯块茎RNA反转录为cDNA，以基因EF1αL为内参，荧光定量检测StGATA4L基因的表达量。统一以品种费乌瑞它贮藏0d时的ΔCt为对照计算表达量。

反转录试剂盒为Fermentas公司的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis试剂盒，反转录PCR体系及反应程序如表1所示，包括反转录酶(Reverse Transcriptase)、反转录体系缓冲液(5×Reaction Buffer)和RNA酶抑制剂(RNase Inhibitor)等。

表1：反转录PCR反应体系及反应程序

将反转录产物进行qRT-PCR反应和融解曲线分析，qRT-PCR反应体系(25μL)如表2所示，扩增StGATA4L基因的Forward Primer(上游引物)具有如SEQ ID:2所示核苷酸序列，Reverse Primer(下游引物)具有如SEQ ID:3所示的核苷酸序列，扩增内参基因EF1αL的Forward Primer(上游引物)具有如SEQ ID:4所示核苷酸序列，Reverse Primer(下游引物)具有如SEQ ID:5所示的核苷酸序列。qRT-PCR反应程序如表3所示，

表2：qRT-PCR反应体系

表3：qRT-PCR扩增反应程序及融解曲线分析

Bio-Rad CFX Connect荧光定量PCR仪检测，采用常规的2^–ΔΔCt法计算表达量，以品种费乌瑞它贮藏0d时的ΔCt值为对照。将3次试验重复所提的3管RNA混合后反转录所得cDNA作3次荧光定量技术重复。用Bio-Rad CFX Manager 3.0和Excel软件计算结果。

实施例3StGATA4L的表达量随块茎生理状态的变化分析和预测方法建立

3.1在品种中的变化规律

不同品种的马铃薯StGATA4L基因的表达量(StGATA4L relative expression)随贮藏时间(storage time)的变化如图1所示，其中FR:费乌瑞它,MR:米拉,BS10:坝薯10号,ZS2:中薯2号,CY56:川芋56,川芋117:CY117。

常温下贮藏，中薯2号、费乌瑞它、川芋56、米拉、坝薯10号、川芋117的休眠期依次增大，中薯2号休眠期最短约有35d，相对不耐贮藏，川芋117休眠期最长，约有105d，较耐贮藏。品种间休眠期不同，但StGATA4L的表达量均随贮藏时间有规律地上升。将表达量以10为底数换算成对数值，则可以看出表达量随时间呈线性升高，虽然不同品种的萌芽时间不同，但萌芽时的表达量相似，在2.16～2.24之间(图1箭头所示)，说明StGATA4L表达量到达一个阀值是块茎萌芽的重要分子标志。

同时发现块茎成熟收获后，休眠期越长的品种该基因表达量越低(图1，圈中所示)，即StGATA4L基因在收获块茎中的表达量与该品种的休眠期存极显著负相关，表达量的对数值与休眠期的相关系数达-0.9909**。StGATA4L表达量到达某一阀值是块茎萌芽的重要分子标志，可以理解为成熟块茎中StGATA4L的起始表达量越低，到达萌芽阀值所需时间越长，所以贮藏时间也更长。即成熟块茎StGATA4L的表达量高低决定休眠期(贮藏)长短，StGATA4L表达量具有标记块茎生理状态的应用潜力。

3.2在杂交后代群体中的变化规律

分批收获杂交群体的实生薯，7d后取样提取RNA，荧光定量检测目的基因StGATA4L的表达量。观察记录各材料的萌芽情况，在萌芽时取样并测定StGATA4L的表达量。结果如表4所示，同地点种植的对照费乌瑞它的休眠期约60d，比前述测定的休眠期多约10d，这可能与材料种植地点不同，生长环境差异造成。27份材料中，16—2—5、16—7—1、16—8—13、16—11—7、16—14—8等5个株系休眠期与费乌相似，约为60-65d，属休眠期较短类型；16—6—12、16—13—14、16—14—1、16—14—2等8个株系的块茎休眠期与坝薯10号、川芋117相似，大于90d属于长休眠耐贮藏材料；其余14份材料的休眠期介于70～85d。

检测这些材料在萌芽时(定义为薯块芽长2～3mm时即为萌芽)的StGATA4L表达量，以费乌0d为对照，将所得表达量换算成以10为底的对数值，数值在2.1152～2.2576范围内(Mean±SD:2.21±0.03)，即不同材料在萌芽时的表达量换算值均相似(表4)。测定任一块茎的StGATA4L表达量，按上述方法换算的数值越接近2.21，越快萌芽。

将各材料块茎成熟时的StGATA4L表达量(StGATA4L relative expression)换算成以10为底的对数值，与各自休眠期(dormancy period)的关系如图2所示，StGATA4L表达量越低的材料，其休眠期越长，即两者呈极显著负相关，相关系数达-0.9605**。即StGATA4L表达量与休眠期的负相关关系不受遗传背景等因素的影响，可以以品种FR的StGATA4L表达量为对照，通过测定材料的StGATA4L表达量预测块茎休眠期，判断其是否耐贮藏。

表4StGATA4L基因在杂交群体材料块茎成熟时和萌芽时的表达量

3.3预测马铃薯种薯萌芽所需时间方法的建立

由于马铃薯块茎StGATA4L表达量的对数值均随时间呈近似直线的变化，所有材料萌芽时的表达量对数值相似，取平均值为2.21，所以只要知道块茎StGATA4L表达量随时间变化直线的斜率和与截距，就能确定这条变化曲线，并由Y值为2.21，计算对应的时间，就可预测块茎萌芽时间。而这条直线的斜率和与截距正是由遗传因素和外界环境综合影响的结果，代表块茎生理状态。由两点确定一条直线可知，只要两次测定一批薯块的StGATA4L的表达量，就可获得代表这批薯块特有的由StGATA4L表达量为纵坐标，时间为横坐标决定的直线，由萌芽时的Y值为2.21，从而计算出萌芽时间，较为准确预测出块茎距离取样测定时间点还有多少天萌芽。计算方式如下：

萌芽所需时间D＝A×(2.21－Y1)/(Y2－Y1)

A为两次测定表达量的时间间隔，以14～28d的间隔较好，若是薯块收获贮藏没多久或本身是长休眠期品种，则两次取样时间间隔宜长些；

Y1为第1次测定StGATA4L表达量并以10为底换算的对数值；

Y2为第2次测定StGATA4L表达量并以10为底换算的对数值。

计算表达量时，以费乌瑞它休眠时的表达量为对照

3.4预估马铃薯块茎休眠期方法的建立

马铃薯StGATA4L表达量与休眠期呈极显著负相关，且不受遗传背景等因素的影响，但表达量与休眠期并不呈完全的线性对应关系，且块茎的休眠期本身受贮藏期间的环境影响，所以可以通过测得块茎成熟后的StGATA4L表达量对数值Y，与费乌瑞它X和米拉Z的比较，若Y＞X，则对应的马铃薯块茎属于短休眠期材料，休眠期短于费乌瑞它品种的休眠期；若Z＜Y≤X，则对应的马铃薯块茎属于中等休眠期材料，休眠期介于费乌瑞它品种和米拉品种的休眠期之间；若Y≤Z，则对应的马铃薯块茎属于长休眠期材料，休眠期长于米拉品种的休眠期。

由于同一品种不同级别薯块(原原种、原种、种薯三级)，其休眠期不同，种薯的休眠期短于原原种；同一品种不同季节种植收获的块茎，其休眠期也存在差异，一般秋季收获的块茎休眠期长于春季收获的块茎。在本实施例中，数据是由春季收获的原原种测得。若Y＞-0.06(X)，则休眠期与费乌接近，属于短休眠期材料，休眠期为70d以下，值越高，休眠期越短；若-1.0(Z)＜Y≤-0.06(X)，则为中等休眠期材料，休眠期为70～90d；若Y≤-1.0(Z)则为长休眠期材料，休眠期为90d以上。

实施例4标记抗干扰能力检验

4.1组织表达特性

以费乌成熟时收获的块茎为对照，EF1αL为内参，检测了目的基因在不同部位的表达。如表5所示，幼叶、成熟叶中StGATA4L表达极低可忽略；在花蕾、叶柄、茎段、根系、幼薯、休眠块茎中仅以低水平表达；但在芽组织能高水平表达，并且芽活性越旺盛表达量越高(芽＞萌芽块茎＞带芽匍匐茎)。由组织表达特性，推测StGATA4L在芽的休眠和萌发中扮演重要角色：随着匍匐茎顶芽的StGATA4L表达下降，芽进入休眠，积累糖分并转化为淀粉逐渐膨大形成的块茎，StGATA4L表达量进一步降低，块茎进入深度休眠状态；随着贮藏时间的增加，StGATA4L表达上升，芽原基逐渐解除休眠并生长萌发，在快速生长的芽中StGATA4L表达量达到高值，并随着芽的分化而下降，在分化成的器官叶、叶柄、茎段和根中不表达或仅以极低水平表达。

表5 StGATA4L在马铃薯植株不同部位的表达量

4.2对激素处理的反应

用4mg/L脱落酸ABA、20mg/L赤霉素GA₃、0.24mg/L 24-表油菜素内酯24-eBL分别浸泡块茎30min，置于25℃放置2d后，取芽眼部位检测了StGATA4L的表达量。结果表明该基因短期内的表达不受上述激素的影响(表6)，即表达量短期内不会有波动，这与块茎实际生理变化相符，不同于前述Senning等(2010)发现的脱氧尿苷三磷酸酶编码基因在用催芽剂赤霉素处理后9h该基因表达量即升高到萌芽时的表达量，但此时块茎并未发芽，即基因表达易受其它因素影响而表现出与块茎实际生理状态不符的情况。

表6各激素处理2天后基因的表达量变化

上述过程说明该基因表达量与块茎萌芽生理状态呈正相关，并且表达量的稳定性好、适用性广，不受遗传背景等因素影响，可以作为预测种薯萌芽时间和初步判断块茎休眠期的有效标记。

实施例5预测马铃薯种薯萌芽所需时间的方法及预估块茎休眠期的方法应用

5.1预测马铃薯种薯萌芽所需时间的方法在费乌瑞它种薯中的应用

按照实施例1至4中的方法，对费乌瑞它种薯进行RNA的提取、反转录和qRT-PCR，测定StGATA4L的表达量，并根据建立的预测马铃薯种薯萌芽时间的方法，预测费乌瑞它种薯的萌芽时间，结果如表7所示。

表7荧光定量测定基因表达的Ct值及相对表达量计算

(注：△CT＝StGATA4L的Ct平均值－EF1aL的Ct平均值；△△CT＝样品的△CT值－对照的△CT值；2^-△△CT即相对表达量＝以2为底的-△△CT指数值，上述方法只需在Excel中代入公式即可获得结果。)

萌芽所需天数D＝A×(2.21－Y1)/(Y2－Y1)

A为两次测定表达量的时间间隔；Y1为第1次测定的相对表达量以10为底换算的对数值；Y2为第2次测定的相对表达量以10为底换算的对数值；计算相对表达量时，以费乌瑞它休眠时的表达量为对照。

两次测定间隔A＝28d，萌芽还需要的天数D＝28×(2.21-0.7625)/(1.7703-0.7625)＝40.22，约合40d。

实际距第1次测定的时间点过了约40～45d薯块芽长达到2～3mm萌芽(因同一批次不同薯块萌芽时间不完全相同)，预测值与实际情况较为一致。

5.2预测马铃薯种薯萌芽所需时间的方法在米拉种薯中的应用

按照实施例1至4中的方法，对米拉种薯进行RNA的提取、反转录和qRT-PCR，测定StGATA4L的表达量，并根据建立的预测马铃薯种薯萌芽时间的方法，预测米拉种薯的萌芽时间，结果如表8所示。

表8荧光定量测定基因表达的Ct值及相对表达量计算

(注：△CT＝StGATA4L的Ct平均值－EF1aL的Ct平均值；△△CT＝样品的△CT值－对照的△CT值；2^-△△CT即相对表达量＝以2为底的-△△CT指数值，上述方法只需在Excel中代入公式即可获得结果。)

萌芽所需天数D＝A×(2.21－Y1)/(Y2－Y1)

A：为两次测定表达量的时间间隔；Y1：为第1次测定的相对表达量以10为底换算的对数值；Y2：为第2次测定的相对表达量以10为底换算的对数值；计算相对表达量时，以费乌瑞它休眠时的表达量为对照。

两次测定间隔A＝28d，距离第1次测定时，萌芽还需要的天数D＝28×(2.21-0.1474)/(1.4610-0.1474)＝43.97，约合44d。

实际距第1次测定的时间点过了约35～40d薯块芽长达到2-3mm萌芽(因同一批次不同薯块萌芽时间不完全相同)，预测值与实际情况稍有偏差，但差异在5d以内。

5.3预测马铃薯种薯萌芽所需时间的方法在16-2-16种薯中的应用

按照实施例1至4中的方法，对16-2-16种薯进行RNA的提取、反转录和qRT-PCR，测定StGATA4L的表达量，并根据建立的预测马铃薯种薯萌芽时间的方法，预测16-2-16种薯的萌芽时间，结果如表9所示。

表9荧光定量测定基因表达的Cq值及相对表达量计算

(注：△CT＝StGATA4L的Ct平均值－EF1aL的Ct平均值；△△CT＝样品的△CT值－对照的△CT值；2^-△△CT即相对表达量＝以2为底的-△△CT指数值，上述方法只需在Excel中代入公式即可获得结果。)

萌芽所需天数D＝A×(2.21－Y1)/(Y2－Y1)

A为两次测定表达量的时间间隔；Y1为第1次测定的相对表达量以10为底换算的对数值；Y2为第2次测定的相对表达量以10为底换算的对数值；计算相对表达量时，以费乌瑞它休眠时的表达量为对照。

两次测定间隔A＝7d，萌芽还需要的天数D＝7×(2.21-1.4138)/(1.6686-1.4138)＝21.87，约合22d。

实际距第1次测定的时间点过了约20-25d薯块芽长达到2～3mm萌芽(因同一批次不同薯块萌芽时间不完全相同)，预测值与实际情较为一致。

5.4预估马铃薯块茎休眠期的方法在16-2-16种薯中的应用

按照实施例1至4中的方法，对16-2-16种薯进行RNA的提取、反转录和qRT-PCR，测定StGATA4L的表达量，并根据建立的预估马铃薯块茎休眠期的方法，预估16-2-16种薯的休眠期，结果如表10所示，获得荧光定量PCR仪测得的Ct值，计算相对表达量为1.1956换算成以10为底的对数值为0.0776，初步估计该材料属短休眠期。实际该材料的休眠期约40～50d，确实属于短休眠期材料，与预估基本相符。

表10荧光定量测定基因表达的Cq值及相对表达量计算

5.5预估马铃薯块茎休眠期的方法在16-14-4种薯中的应用

按照实施例1至4中的方法，对16-14-4种薯进行RNA的提取、反转录和qRT-PCR，测定StGATA4L的表达量，并根据建立的预估马铃薯块茎休眠期的方法，预估16-14-4种薯的休眠期，结果如表11所示，获得荧光定量PCR仪测得的Ct值，计算相对表达量为0.0271换算成以10为底的对数值为－1.5665，初步估计该材料属极长休眠期。实际该材料的休眠期约140～150d，确实属于长休眠期材料，与预估相符。

表11荧光定量测定基因表达的Cq值及相对表达量计算

本发明通过对块茎由休眠到萌芽的基因表达谱分析和荧光定量检测，找到了表达量变化随贮藏时间反应非常灵敏的基因StGATA4L。利用qRT-PCR检测生产上不同休眠期品种的块茎从休眠到萌芽过程中该基因表达量变化，确认该基因表达量随贮藏时间呈线性升高，并且不同品种在萌芽时该基因的表达量相似；同时发现不同休眠期的品种，其成熟收获时，块茎StGATA4L表达量越低，块茎休眠期越长。通过检测多个杂交群体后代株系块茎的StGATA4L表达量，验证上述规律，由此建立了可以通过检测该基因表达量来判断块茎生理状态，预测萌芽时间的方法体系，同时可以作为预测块茎休眠期或筛选耐贮藏材料的生物标记。

本发明提供的StGATA4L生物标记，催芽激素赤霉素和抑制发芽激素脱落酸处理不会引起其表达量剧变，稳定性好，可以作为预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记。另，本发明提供的预测萌芽时间和块茎休眠期的方法。该方法简单方便，可准确判断块茎生理状态，为种薯播种和块茎贮藏提供科学依据。同时可以通过检测材料在收获块茎时的基因表达量来初步判断该材料的休眠期，作为筛选耐贮藏材料的指导。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 绵阳市农业科学研究院

<120> 预测马铃薯种薯萌芽时间和块茎休眠期的生物标记及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 777

<212> DNA

<213> 马铃薯(Solanum tuberosum)

<400> 1

atggatgtct acggacggtt aacgccagaa gtgtttcgga ttgatgatct tcttgatttc 60

tcaaacgaag agatcttttc ctcttctaaa accgccatcg actttgatct caatcaccat 120

taccaaccac ctcctaccga taatattgct gccgccggtt gttactacga tgctcttccc 180

aattccgttg actttaccga taaactctgt gttccgagtg atgatgtagc agagttggag 240

tggctatcga acttcgtgga agatacatcc aataatttcc cttcaaactc cttaacacaa 300

accatgtacc acctcaataa taccaataat actactacaa tattgcacag caaatcaaga 360

agtaaacgtt cacgtaattc aaacactagc tggactactt cctcactcca acaacacaaa 420

tccacaaacc aaaaaaacta caatcaagac gaaaattcag gtatttataa cagagacaaa 480

ttttcatcaa taacttcaaa tattacaccg agaaaatgca cccattgtgc atcagagaaa 540

acaccgcagt ggcgaactgg accattaggc cccaaaacac tgtgtaatgc ttgtggtgta 600

aggtacaaat cgggccggtt ggtacctgaa tatcgtcccg cggcaagccc gacgtttgtg 660

ttgacgcaac attcgaattc tcaccggaaa gtaatggaac tccggcgaca gaaagaggtt 720

attgatcatc aacagcagca gcacggaatg tatggacatc actatccggt ctgctga 777

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttgttact acgatgctct 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattattgga tgtatcttcc ac 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttgtacacc acgctaagga g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcaatgcaa accattcctt g 21

Claims (4)

1.一种预测马铃薯种薯萌芽时间的方法，其特征在于，具体包括：

（1）测定不同品种马铃薯种薯块茎萌芽时的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值，并取平均值Y；

（2）测定待预测马铃薯种薯T1时间点的块茎的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Y1；

（3）测定待预测马铃薯种薯T2时间点的块茎的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Y2；

（4）按D=(T2－T1)×(Y－Y1)/(Y2－Y1)预测待预测马铃薯种薯萌芽时间点距离T1时间点所需时间D。

2.如权利要求1所述的预测马铃薯种薯萌芽时间的方法，其特征在于：所述平均值Y为2.21，所述StGATA4L基因的表达量的测定以基因EF1αL为内参，以费乌瑞它品种休眠时的表达量为对照，且表达量采用2^-△△CT相对表达量进行计算。

3.如权利要求1所述的预测马铃薯种薯萌芽时间的方法，其特征在于：所述T1时间点和所述T2时间点的间隔时间为14~28d。

4.一种预估马铃薯块茎休眠期的方法，其特征在于，包括：

（1）测定待预估马铃薯块茎成熟后的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Y，同时测定费乌瑞它品种成熟后的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值X和米拉品种成熟后的StGATA4L基因的表达量以10为底换算的对数值Z；

（2）若Y＞X，则对应的马铃薯块茎属于短休眠期材料，休眠期短于所述费乌瑞它品种的休眠期；

若Z＜Y≤X，则对应的马铃薯块茎属于中等休眠期材料，休眠期介于所述费乌瑞它品种和所述米拉品种的休眠期之间；

若Y≤Z，则对应的马铃薯块茎属于长休眠期材料，休眠期长于所述米拉品种的休眠期；

其中所述StGATA4L基因的表达量的测定以基因EF1αL为内参，以费乌瑞它品种休眠时的表达量为对照。

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