PT1969133E - Processo para a preparação de (1s)-3-cloro-1-(2-tienil)- propano-1-ol opticamente activo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE (IS)-3-CLORO-l-(2-TIENIL)-PROPANO-l-OL OPTICAMENTE ACTIVO" A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol opticamente activo, por redução enzimática.

Estado da técnica 0 (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol é um precursor directo para a preparação de (IS)-3-metilamino-l-(2-tienil)-propano-l-ol (álcool de "duloxetina"), que, por sua vez, é um componente na síntese da duloxetina. A duloxetina® é uma substância activa farmacêutica, que se encontra momentaneamente sob licença e que pode ser utilizada no dominio das indicações para a depressão e a incontinência. A patente EP-B-0273658 descreve um processo para a preparação da correspondente base de duloxetina por reacção de 2-acetiltiofeno numa reacção de Mannich com formaldeído e dimetilamina, redução do grupo ceto da base de Mannich obtida nestas condições ao composto racémico (S)-3-N,N-dimetilamino-1-(-tieno-2-il)-propano-l-ol, esterificação da função álcool com fluoreto de naftilo e, por fim, a transformação do grupo dimetilamino numa função metilamino. 0 enantiómero pretendido do éter naftilico é obtido por utilização de materiais de partida quirálicos ou por separação de racematos no passo do produto final, por exemplo, através dos sais com ácidos oticamente activos ou por cromatografia numa fase estacionária quirálica. 2 A patente US 5,362,886 descreve um processo análogo, no qual o propanol racémico obtido depois da redução do grupo ceto é misturado com ácido S-mandélico. 0 enantiómero S do álcool, obtido nestas condições, é utilizado nos passos de reacção subsequentes. A patente ep-a-0457559 descreve igualmente um processo análogo ao da patente EP-B-0273658. Neste caso, o grupo ceto da base de Mannich é reduzido ao álcool, na forma do enantiómero S, com o sistema de redução assimétrico LAH-Icb (aluminohidreto de sódio-[(2R, 2S)-(-)-4-dimetilamino-l,2-difenil-3-metil-2-butanol] ). Neste caso, além do custo, há o inconveniente da sensibilidade do sistema de redução LAH-Icb, que é estável apenas durante alguns minutos. W. J. Wheeler e F. Kuo descrevem no Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, Volume XXXVI, n° 3, páginas 213 a 223, um processo para a preparação da duloxetina. Neste caso faz-se reagir cloreto de ácido tiofeno-2-carboxílico, num acoplamento de Stille, com vinil-tri-n-butil-estanano, na presença de quantidades catalíticas de benzil-cloro-bis-(trifenilfosfino)-paládio-(II) em DMPU (dimetilpropilenoureia), obtendo-se l-(tieno-2-il)-propenona de fórmula (V)

O (V) que é transformada em seguida, por tratamento com cloreto de hidrogénio, em 3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ona de fórmula (V) 3

Mediante a utilização de uma oxa-azaborilidina e de BH3, a cloropropanona assim obtida é reduzida em seguida a (S)—3— cloro-1-(tieno-2-il)-propano-l-ol de fórmula (VII)

Ci s

OH (VII) 0 álcool assim obtido é transformado em (S)-3-metilamino-l-(tieno-2-il)-propano-l-ol, por reacção sucessiva com iodeto de sódio e em seguida com metilamina. Por subsequentes reacções sucessivas com hidreto de sódio, 1-fluornaftalina e cloreto de hidrogénio obtém-se a Duloxetina na forma do cloridrato.

Hal = halogéneo. T. Stillger et al. descrevem em Chemie Ingenieur Technik (74) páginas 1035-1039, 2002, processos de regeneração de co-factor acoplado ao substrato para a redução enzimática enantiosselectiva de 5-oxohexanoato de etilo ao (S)—5 — hidroxihexanoato de etilo.

Breve descrição da invenção A invenção resulta, pois, do problema de se descobrir uma via para a redução estereoespecifica de (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol opticamente activo, em que o processo 4 da reacção deverá conduzir ao produto da forma mais quantitativa possível, por uma via com custos favoráveis.

Este problema foi solucionado através da descoberta surpreendente de que podem ser preparados enzimas com a actividade de desidrogenase, do género Thermoanaerobacter, que estão aptos para a catálise estereoespecífica da reacção anterior.

Descrição pormenorizada da invenção

0 objecto da invenção é um processo para a preparação de (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol opticamente activo, de fórmula I

OH

em que, num meio que contém 3-cloro-l-(2-tienil)-propano-1-ona, de fórmula II

(II) 0 este composto é reduzido ao composto de fórmula I por uma álcool-desidrogenase do género Thermoanaerobacter, e o produto formado é isolado numa forma essencialmente pura enantiomericamente.

Os enzimas utilizados de acordo com a invenção, com actividade de desidrogenase, podem ser utilizados no processo de acordo com a invenção como enzimas livres ou imobilizados. 0 processo de acordo com a invenção é realizado vantajosamente a uma temperatura entre 0 e 95°C, de 5 preferência entre 10 e 85°C, especialmente de preferência entre 15 e 75°C. O pH no processo de acordo com a invenção é vantajosamente mantido entre pH 4 e 12, de preferência entre pH 4,5 e 9, especialmente de preferência entre pH 5 e 8.

Entendem-se por produtos enantiomericamente puros ou quirálicos, ou álcoois opticamente activos, no processo de acordo com a invenção, enantiómeros que apresentam um enriquecimento n enantiómero. No processo são de preferência alcançadas purezas enantioméricas de pelo menos 70%p.e. (pureza enantiomérica), de preferência de pelo menos 80%p.e., especialmente de preferência de pelo menos 90%p.e., e muito especialmente de preferência de pelo menos 98%p.e.

Para o processo de acordo com a invenção podem ser utilizadas células em crescimento, que contêm os ácidos nucleicos, os constructos de ácidos nucleicos ou os vectores de acordo com a invenção. Também podem ser utilizadas células inertes ou abertas. Por células abertas entendem-se, por exemplo, células que foram tornadas permeáveis por um tratamento, por exemplo, com solventes, ou células que foram abertas por meio de um tratamento com enzimas, por meio de um tratamento mecânico (por exemplo, prensa francesa ou ultrassons) ou por qualquer outro método. Os extractos brutos assim obtidos são apropriados com vantagem para o processo de acordo com a invenção. Para o processo também podem ser utilizados enzimas purificados ou não purificados. São igualmente apropriados os microrganismos ou enzimas imobilizados que possam, com vantagem, tomar parte na reacção. 6

Se no processo de acordo com a invenção forem empregues organismos ou enzimas livres, estes são então separados convenientemente antes da extracção, por exemplo, por meio de uma filtração ou centrifugação. 0 produto (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol preparado no processo de acordo com a invenção pode, com vantagem, ser obtido da solução aquosa da reacção por meio de extracção ou destilação. A extracção pode ser repetida várias vezes para o aumento do rendimento. Os exemplos de agentes de extracção apropriados são solventes, tais como tolueno, cloreto de metileno, acetato de butilo, éter diisopropilico, benzeno, MTBE ou acetato de etilo, sem que estejam limitados a estes.

Em alternativa, o produto (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol, preparado no processo de acordo com a invenção, pode ser obtido vantajosamente a partir da fase orgânica da solução de reacção por extracção ou destilação e/ou por cristalização. A extracção pode ser repetida várias vezes para o aumento do rendimento. Os exemplos de meios de extracção apropriados são solventes, como tolueno, cloreto de metileno, acetato de butilo, éter diisopropilico, benzeno, MTBE ou acetato de etilo, sem que estejam limitados a estes.

Depois da concentração da fase orgânica, os produtos podem ser obtidos, regra geral, com uma boa pureza química, isto é, uma pureza química superior a 80%. Depois da extracção, a fase orgânica pode ser concentrada com o produto, mas também apenas parcialmente, e o produto pode ser separado por cristalização. Para o efeito, e vantajosamente, a solução é arrefecida a uma temperatura de 0 até 10°C. A cristalização também pode ser realizada directamente a partir da solução orgânica ou a partir de uma solução 7 aquosa. 0 produto separado por cristalização pode ser de novo tomado no mesmo ou num outro solvente, para uma nova cristalização, e ser cristalizado de novo. Caso seja necessário, a pureza enantiomérica do produto ainda pode ser aumentada através de uma cristalização subsequente, realizada vantajosamente pelo menos uma vez.

Nos diferentes modos de tratamento final mencionados, o produto do processo de acordo com a invenção pode ser isolado com rendimentos de 60 até 100%, de preferência de 80 a 100%, especialmente de preferência de 90 a 100%, referidos ao substrato utilizado para a reacção, como por exemplo, a (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ona. O produto isolado é caracterizado por uma elevada pureza química de > 90%, de preferência > 95%, e especialmente de preferência > 98%. Além disso, os produtos têm uma alta pureza enantiomérica, que, caso seja necessário, ainda pode ser aumentada vantajosamente por meio de cristalização. O processo de acordo com a invenção pode ser realizado de forma descontínua, semi-contínua e contínua. A realização do processo pode decorrer vantajosamente em biorreactores, como é descrito, por exemplo, em Biotechnology, Volume 3, 2a edição, Rehm et al. Editores (1993), em especial o capítulo II. A descrição anterior e os exemplos que se seguem servem apenas para uma elucidação da invenção. Estão igualmente abrangidas, de acordo com a invenção, as numerosas transformações possíveis que são evidentes para os peritos na técnica. A vantagem do processo de acordo com a invenção reside nos rendimentos particularmente altos do alcanol opticamente activo de fórmula (I) ou da transformação quase quantitativa da alcanona (II).

Na redução enzimática por meio da álcool-desidrogenase são necessários co-factores, que são consumidos no decurso da reacção, isto é, oxidados. 0 co-factor de maior preferência é a nadph, que é oxidada a nadp.

Uma forma de realização preferida da invenção regenera os co-factores, acoplando-os com uma reacção de oxidação que decorre em simultâneo. É especialmente preferido, para este efeito, o sistema alcanol/cetona, em especial isopropanol/-acetona, visto que este também é catalisado pela álcool-desidrogenase . A NADPH, consumida na reacção do composto (II) ao composto (I), é novamente regenerada pela oxidação enzimática do isopropanol a acetona. Nestas circunstâncias deve ter-se em consideração que exista à disposição isopropanol (chamado álcool de sacrifício) suficiente e que não se formem concentrações demasiado altas de acetona, eventualmente prejudiciais para o enzima.

Parte experimental:

Enzima A álcool-hidrogenase de Thermoanaerobacter spec., utilizada a seguir (a seguir abreviada para ADH-T), pode ser obtida comercialmente e foi adquirida da Firma Julich Fine Chemicals (art.° n° 90112610, Alcohol dehydrogenase T from Thermoanaerobacter spec.). A ADH-T foi utilizada sem purificação ulterior.

Incubação com NADPH 9

Em um mL de tampão NaH2PC>4 50 mM (pH 5) foram incubados a 30°C 10 pmol de NADPH, 10 pmol de 3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ona e ADH-T (0,58 mg de proteína). Decorridos 60 minutos a reacção foi terminada por adição de HC1 concentrado e a proteína desnaturada foi eliminada por meio de centrifugação. O sobrenadante depois da centrifugação foi ensaiado cromatograficamente. Com base nas áreas dos picos do aducto e do produto pode ser calculada a actividade do enzima. É possível, através da utilização de materiais de cromatografia quirálicos, fazer-se uma diferenciação dos dois enantiómeros de (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol.

Incubação com NADP e isopropanol (regeneração do co-factor) O co-factor NADPH é consumido durante a redução. É sabido que a ADH-T realiza a oxidação de isopropanol a acetona e, por consequência, pode regenerar o co-factor consumido. Esta forma de trabalho é vantajosa, visto que a NADPH tem que ser adicionada à mistura reactiva apenas em quantidades catalíticas.

Em um mL de tampão (NaH2P04 50 mM (pH 5) com 10% de 2-propanol) foram incubados a 30°C 0,2 pmol de NADP, 10 pmol de 3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ona e a ADH-T (0,58 mg de proteína). Decorridos 60 minutos a reacção foi terminada por adição de HC1 concentrado e a proteína desnaturada foi eliminada por meio de centrifugação. O tratamento final e a análise foram realizados como foi descrito acima.

Análise de (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol A concentração de 3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ona e de 3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ol são determinadas por meio de HPLC. Em função da escolha das fases estacionárias 10 e móveis, conseguem-se determinar também, além da concentração, os valores de pureza. a) análise não quirálica A quantificação da reacção foi realizada com o seguinte sistema: fase estacionária: fase móvel: gradiente: débito: detecção: tempos de retenção:

Chromolith SpeedROD RP18, 50*4, 6 pm, Merck (Darmstadt) aquecida a 45°C eluente A: KH2PO4 10 mM, pH 2,5 eluente B: acetonitrilo 0-0,5 min, 35% B; 0,5-1,0 min 35 a 80% B; 1,0-1,2 min 80% B; 1,2-1,3 min 80% - 35% B; 1,3-2,0 min 35% B; 1,5 mL/min detecção com uv a 230 e 260 nm 3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ona: cerca de 1,6 min 3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ol: cerca de 1,3 min

Com material autêntico é preparada uma série de padrões, com base na qual pode ser determinada a concentração de amostras desconhecidas. b) análise quirálica fase estacionária: Chiracel OD-H, 250*4, 6 pm, Daicel,

aquecida a 40°C fase móvel: eluente A: n-hexano débito: detecção: eluente B: isopropanol, isocrático com 2,5% B 1,0 mL/min detecção com UV a 230 e 260 nm 11 tempos de retenção: 3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ona: cerca de 9,5 min (IS)-3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ol: cerca de 16,6 min (IR)-3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ol: cerca de 18,3 min

Com material autêntico é preparada uma série de padrões, com base na qual pode ser determinada a concentração de amostras desconhecidas.

Resultados

Reacção sem regeneração do co-factor

Depois de incubação de 60 minutos puderam ser determinados 2,1 mM de (IS)-3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ol no preparado de reacção. A actividade especifica da ADH-T situava-se, no inicio da reacção, em 98 U/g de proteína. O álcool resultante possuía um valor de pureza de 95%.

Reacção com regeneração do co-factor

Neste sistema, a ADH-T também está em condições de catalisar tanto a reacção de redução, como também a de oxidação, por acoplamento ao substrato. Depois de incubação de uma hora foram determinados, no entanto, apenas 0,7 mM de (IS)-3-cloro-l-(tieno-2-il)-propano-l-ol no preparado de reacção. Também a actividade específica do enzima no início da reacção, com 23 U/g, era muito baixa. O álcool resultante possuía um valor de pureza de 94%. A baixa actividade pode ser explicada pelo facto de, provavelmente, não terem existido as condições óptimas para a oxidação do isopropanol. Possivelmente, também a posição de equilíbrio da reacção global é desfavorável. 12

Em alternativa, a regeneração do co-factor também pode ser realizada por adição de um enzima auxiliar, como por exemplo, uma glucose-desidrogenase ou formiato-desidrogenase. Neste caso, em vez do isopropanol, é necessário um outro segundo substrato, como glucose ou formiato. A glucose-desidrogenase oxida a glucose a ácido glucónico e reduz neste caso o co-factor, enquanto a regeneração do co-factor com formiato-desidrogenase conduz a C02 como produto final.

Lisboa, 27 de Outubro de 2010

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de (IS)-3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ol opticamente activo, de fórmula I

em que, num meio que contém 3-cloro-l-(2-tienil)-propano-l-ona, de fórmula II

0 este composto é reduzido ao composto de fórmula I por uma álcool-desidrogenase de Thermoanaerobacter spec., e se isola o produto formado numa forma essencialmente pura enantiomericamente.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar NADPH como co-factor na redução.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se regenerarem os co-factores oxidados na redução.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a regeneração dos co-factores ser realizada pela oxidação enzimática de isopropanol a acetona. Lisboa, 27 de Outubro de 2010