PT1899352E - Derivados de 1 - [2¿, 3¿-didesoxi-3¿ c- (hidroximetil) - beta-d-eritro-pentofuranozil] citosina como inibidores de vih - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"DERIVADOS DE 1 - [2', 3'-DIDESOXI-3' C- (HIDROXIMETIL) -BETA—D—ERITRO—PENTOFURANOZIL] CITOSINA COMO INIBIDORES DE VIH"

Campo Técnico

Esta invenção refere-se a derivados novos de tetrahidrofurano biciclico e sua utilização no tratamento de retrovirus tais como VIH, especialmente mutações de fuga de fármacos.

Antecedentes da Técnica

Diferentemente de outros antivirais de VIH, tais como inibidores de proteases ou inibidores de transcriptase reversa de não nucleósidos, os inibidores de transcriptase reversa de nucleósidos (ITRN) são farmacologicamente inactivos na sua forma de administração e requerem fosforilação através das quinases celulares hospedeiras para produzirem os metabolitos de trifosfato activos. Esta forma de trifosfato parece-se com os substratos de trifosfato de desoxinucleótido de ocorrência natural da transcriptase reversa virai e compete pela ligação de VIH-1RT e pela incorporação no ADN virai.

Todos os ITRN aprovados para o tratamento de VIH, e a vasta maioria de todos os outros ITRN propostos na patente ou na literatura académica, não dispõem de uma função 3'-hidroxilo sobre a fracção ribose do nucleósido. Os exemplos incluem zidovudina (AZT), estavudina (d4T), lamivudina (3TC), zaicitabina (ddC), abacavir (ABC), didanosina (ddl) e tenofovir (TNF) (o último a ser administrado tipicamente como um pró-fármaco de fumarato de diisoproxilo). Após a fosforilação, tal nucleosideo ou análogo de nucleosídeo é ligado covalentemente pela enzima de transcriptase reversa na cadeia de ADN nascente, mas a falta da função 3'-hidroxilo no nucleosídeo ou no nucleótido evita a união de nucleótidos adicionais. Estes ITRN, portanto terminam o 2 prolongamento do filamento virai de ADN, levando dessa forma à inibição da replicação de VIH (Mitsuya et al 1990, Jacob Molina et al 1993, Reardon 1993) . A base de todas as terapêuticas anti-retrovirais (TAR) é a utilização de ITRN. Os ITRN, no entanto, são capazes somente de retardarem a propagação de VIH na corrente sanguínea e até o momento têm sido incapazes de erradicarem o VIH de pacientes. O VIH opera por meio da inserção do seu ADN nas células hospedeiras latentes envolvidas na memória imunológica. Este modo de infecção implica que os pacientes sejam forçados a tomarem antivirais de VIH durante toda a vida, com a finalidade de prevenir o retorno do título de VIH após o final da terapêutica.

No entanto, na prática, o período de administração eficaz de um fármaco de VIH particular a um determinado paciente é dramaticamente limitado pelo aparecimento de "mutantes de fuga". Um mutante de fuga é um vírus que contém um agrupamento distinto de mutações que produz resistência a fármaco e permite que o mesmo prolifere na presença do fármaco. Os mutantes de fuga aparecem num paciente devido à pressão selectiva do(s) antiviral(ais) particular (es) que o paciente está a tomar. Como consequência, um período de administração efectivo de um fármaco é dependente de quão rapidamente aparecem e proliferam os mutantes de fuga.

Nos países em que se prescreve consistentemente antivirais de VIH, está a tornar-se cada vez mais evidente que a infecção primária nos casos novos de VIH, com frequência, não é com o tipo selvagem de VIH, mas ao contrário, com uma estirpe de VIH que já é parcialmente ou multiplamente resistente aos antivirais actuais. Em outras palavras, os mutantes de fuga que são gerados in situ em pacientes infectados, também podem ser espalhados a pacientes naive por meio da transmissão lateral ou vertical. Isto por sua vez significa que mesmo alguns 3 pacientes que de outra forma seriam classificados como naive de tratamento, já estão infectados com o virus resistente às terapêuticas convencionais de primeira linha.

Factores múltiplos contribuem para a selecção de mutantes de fuga de fármacos, incluindo o tamanho do agrupamento de VIH total, capacidade de processamento e infidelidade na replicação genómica virai, adequação virai e disponibilidades múltiplas de células alvo. No final dos anos 90, a evidência através da utilização prolongada de combinações à base de zidovudina (AZT) ou estavudina (d4T) sugeriu que os agrupamentos de mutações particulares no TR eram gerados consistentemente. Estes agrupamentos de mutações são o protótipo agora conhecido como Mutações de Análogos da Timidina (MAT). A presença de MAT melhorou a possibilidade de selecção de mutações adicionais que levam ao desenvolvimento de fenótipos de resistência aos ITRN mais avançados que não estavam claramente dentro da familia de análogos de timidina. Tais fenótipos são agora conhecidos como Mutação de Análogo de Nucleósido (MAN) e Multirresistência a Fármacos (do inglês Multíple Drug Resistance MDR) de VIH.

Hipótese para a Resistência ao ITRN O AZT foi o primeiro anti-retroviral a ser amplamente utilizado e sem surpresa, foi o primeiro a gerar mutantes de fuga (Larder et al, 1989) . No entanto, em vista do grande número de mutações em todo o genoma de VIH em isolados de pacientes típicos não é possível produzir-se o fenótipo de resistência in vitro utilizando uma enzima TR recombinante contendo o MAT particular. Como consequência, os mecanismos através dos quais os MAT conferem resistência não foram explicados totalmente. Vários modelos hipotéticos e previsões teóricas para o mecanismo atrás da resistência ao MAT foram previstos no envolvimento do ataque nucleofílico através de um dador de pirofosfato (Boyer et al, 2002 e Meyer et al, 2002) . 4

Presumivelmente, a teoria de translocação de TR é uma etapa chave no entendimento do mecanismo de resistência associado ao MAT. Isto, no entanto, foi entendido pobremente até o final de 2002, porque os intermediários de pré- e pós-translocação de TR são transitórios e de vida curta e não são facilmente acedidos experimentalmente. O entendimento moderno da teoria da translocação de TR afirma que a polimerização de ADN catalisada por TR acontece de uma forma em cascata detalhada como foi ilustrado na figura 3, que é adoptada por Sarafianos et al (2003) . Estas etapas são 1) Ligação do substrato de ADN pelas posições da enzima E da extremidade principal 3' no local P (local do iniciador). 2) Ligação de um dNTP próximo do local N (local dNTP) forma um complexo ternário "aberto". 3) Um complexo ternário "fechado" é formado pelas alterações conformacionais da enzima. 4) Formação da ligação de fosfodiéster entre o terminal do iniciador 3'-OH e o alfa fosfato de dNTP é acompanhada pela libertação de pirofosfato (PPi) para formar o complexo de TR pré-translocado no local N. 5) Translocação do terminal do iniciador do local N para o local P através da formação de um complexo pós-translocado que é um pré-requisito para a ligação seguinte de dNTP e a continuação da síntese de ADN.

Se for utilizado um trifosfato de nucleosídeo de terminador de cadeia de ADN (ITRN) (tipicamente um análogo de nucleósido que não possui uma função 3'-hidroxilo na fracção desoxirribose), mimetiza a sua contraparte natural de dNTP e liga-se na TR. Depois do processamento químico análogo, o ITRN incorporado forma um complexo de pré-translocação no local N de polimerização. Isto termina a síntese adicional de ADN devido à falta do iniciador 3'-hidroxilo na fracção de desoxirribose de ITRN. 5

Ao contrário, as mutações de TR relacionadas com MAT utilizam um mecanismo de incorporação de nucleótido diferente, em comparação com o tipo selvagem de TR. Especificamente, o mecanismo novo resulta na libertação (excisão) do ITRN incorporado no terminal do iniciador, anulando a actividade de terminação de cadeia do ITRN. Este novo mecanismo é dependente da interacção entre a acumulação de complexos nos estados pré-translocados (no local N) e a disponibilidade de ATP e de dadores de pirofosfato, que com frequência, são abundantes no local da infecção, isto é, os linfócitos normais. ATP ou pirofosfato normalmente não participa nas reacções de polimerização de ADN virai, mas a estrutura de um TR que expressa um fenótipo resistente relacionado com MAT facilita a sua entrada num local adjacente a um ITRN incorporado recentemente. 0 equilíbrio entre as espécies cinéticas pré e pós-translocação produz um mecanismo para assegurar o livre acesso do terminal do iniciador ao local N e também permite a ligação simultânea do ATP dador de pirofosfato no local P após a incorporação do terminador de cadeia de ITRN e a libertação de pirofosfato. Quando isto ocorre, o ATP (ou pirofosfato) ataca a ligação de fosfodiéster que liga o ITRN incorporado na extremidade do ADN, resultando na retirada do ITRN via a pirofosforolise. Quando o dador de pirofosfato é ATP, o ITRN é libertado como um produto de tetrafosfato de dinucleósido. A figura 4 ilustra este "resgate de iniciador" num ADN terminado por AZT (adoptado da ClinicCareOptions™) .

Acredita-se agora que estejam envolvidos dois mecanismos distintos na resistência dos fenótipos ao ITRN (Sluis-Cremer et al, 2000). 0 primeiro, conhecido como actividade de "resgate de iniciador", é descrito imediatamente acima. Aqui, o nucleótido de terminação de cadeia é retirado da extremidade 3' do terminal do iniciador através de uma pirofosforolise dependente de 6

pirofosfato ou dependente de ATP. Existe, no entanto, outro agrupamento de fenótipos de resistência denominado como "mutantes discriminativos". Estes mutantes têm uma TR com habilidade melhorada para discriminar entre ITRN e dNTP nativos. Neste caso, o mecanismo leva ao TR que é capaz de escolher preferencialmente o substrato correto (isto é, dNTP nativo), dessa forma evitando a terminação de cadeia por um ITRN e assegurando a propagação do genoma virai. Geração de Mutações em VIH

Retrovirus, tais como VIH, têm o potencial de diversificação genética rápida. Embora isto seja um processo energeticamente ineficiente, oferece vantagens claras de adaptação ao organismo. A maquinaria de replicação utilizada pelo VIH é particularmente propensa a erros, gera um grande número de mutações e tem o potencial para levar a acumulação de mutações quando o organismo está sob pressão selectiva.

Geralmente, a grande maioria de mutações geradas pela replicação virai tem como resultado enzimas menos viáveis. Aqui, a acumulação de uma segunda, e especialmente de uma terceira mutação é menos provável, porque o agrupamento de população para o mutante menos viável, dentro do qual a segunda mutação deve ser acumulada, será diluído pela multiplicação mais rápida do organismo do tipo selvagem. Mutantes virais ainda mais viáveis podem aparecer e expandir-se por meio de duas vias possíveis. A primeira ocorre quando existe um crescimento rápido de uma variante altamente resistente que já está presente na população virai total. Com mais frequência, isto é, uma mutação de um só ponto que confere resistência fenotípica a uma pressão selectiva. No contexto de mutações de fuga de fármacos, os exemplos incluem K103 rapidamente induzido pelo inibidor de transcriptase reversa de não-nucleósido nevirapina. A segunda via ocorre quando existe uma replicação virai continuada na presença de pressão selectiva. Isto 7 permite a acumulação progressiva de mutações que podem ser expandidas. Neste caso, a probabilidade de acumulação de mutações está relacionada com a quantidade de replicação de virus que está a ocorrer. Isto é, em cargas virais maiores (por exemplo, >200.000 cópias/ml), podem ocorrer acumulações de mutações duplas. A acumulação de mutações triplas, no entanto, são raras e podem resultar somente como consequência de um regime terapêutico complexo, envolvendo tipicamente vários fármacos diferentes, o que é um desafio para a adesão do paciente. É, portanto extremamente difícil, mesmo para um paciente diligente, assegurar que todos os ingredientes activos estejam presentes no sangue em níveis acima das concentrações inibitórias necessárias durante o período completo das 24 h do "nível durante as 24 h" de cada dia. Aqui, a retirada temporária de quaisquer das pressões selectivas do tratamento com fármaco devido a lapsos na administração/nível durante 24 h de um ou mais fármacos, permite a replicação virai desenfreada, permitindo dessa forma a geração e o estabelecimento de vários mutantes novos. Quando a pressão selectiva é novamente aplicada (isto é, a retomada da terapêutica do fármaco complexo), os poucos mutantes novos que acumularam outra mutação pontualpontual que confere uma melhor resistência a fármaco e pode expandir de uma forma similar a essa vista para a primeira via (veja-se acima). A discussão acima é enfocada na acumulação de mutações pontuaispontuais, ao contrário, por exemplo, da deleção ou adição de mutações. Aqui, no entanto, é aplicável um cenário similar a esse descrito para uma mutação tripla. Isto é, a maioria das mutações de deleção/adição inicialmente envolve um único nucleótido. Isto tem o efeito de alterar completamente a sequência de aminoácido a jusante da proteína codificada se a alteração ocorrer dentro da região de codificação e leva a uma proteína truncada e/ou inactiva. Com a finalidade de conservar a grelha de leitura e para alterar a proteína final por meio da deleção ou adição de um único aminoácido, devem ser deletados/adicionados três nucleótidos. Como as enzimas inactivas reduzem a viabilidade de um organismo de VIH, particularmente se a enzima afectada é TR, as deleções/adições não se acumularão por si próprias, mas devem ocorrer simultaneamente. Em outras palavras, o equivalente de uma mutação tripla deve ocorrer num único evento, o que é altamente incomum (veja-se Boyer et al (2004) J Virol 78 (18): 9987 - 9997).

Como consequência deste processo para a acumulação/introdução de mutante triplo, somente até relativamente recentemente ficou estabelecido que o vírus de VIH que exibia pelo menos três mutações em TR cria resistência particularmente potente a múltiplos fármacos. Por exemplo, nos Estados Unidos, foi em 1992 quando o FDA aprovou a utilização de terapêutica de combinação de fármacos (ddC e AZT) . No entanto, somente em Setembro de 1995 os ensaios clínicos mostraram que a combinação de AZT com ddC ou ddl eram mais efectivas que com o AZT em separado. Somente como resultado da utilização das terapêuticas combinadas, em que foram utilizados fármacos múltiplos, mas em regimes de dosagem efectivamente incapazes de garantir um nível adequado durante 24 h dos respectivos fármacos, que foram geradas as estirpes particularmente problemáticas de vírus de VIH multi-resistente conhecido no mundo ocidental hoje em dia. Mutações de Resgate de Iniciador

O mutante de resgate de iniciador de MAT originalmente descrito era composto de várias permutações dentro de um grupo de seis fenótipos resistentes a fármacos nas posições de aminoácidos M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F e K219Q/E na TR (Larder e Kemp, 1989, Schinazi et al, 2000) . Dados recentes indicaram duas vias mutacionais distintas para o 9 desenvolvimento de mutantes de resgate de iniciador de MAT múltiplo, ocorrendo ambos por factores desconhecidos. A primeira via teve como resultado uma substituição de aminoácido no codão 210 (210W) e era preferivelmente associado a mutações nos codões 41 (41L; mais de 98 %) e 215 (215Y; mais de 94 %) assim como uma substituição no codão 6 7 (6 7N) . A segunda via gerou uma mutação no codão 219 (219K/E), que preferivelmente, era associado a mutações nos codões 67 (67N) e 70 (70R) (Yahi et al, 1999). Havia, portanto dois padrões de fenótipos: (1) L210W, M41L, T215Y/F, ±D67N, que conferiram niveis elevados de resistência virai ao AZT e ao d4T e (2) K219K/E, D67N, K70R, que conferem niveis moderados de resistência virai ao AZT e ao d4T.

Marcelin et al (2004) resumem a prevalência das mutações relacionadas com resgate de iniciador de MAT em pacientes com falhas virológicas. Aqui, 1098 sequências de TR foram investigadas e deram dois padrões genotípicos como foi indicado na figura 1 e na figura 2. Embora antecedentes genéticos diferentes pudessem estar presentes antes da terapêutica, a sequência e a composição da terapêutica anti-retroviral adoptada quando combinada com as diferenças individuais na farmacologia resultaram numa resistência virai não somente ao AZT e ao d4T, mas também a outros ITRN. Dependendo do padrão de mutação presente, a resistência a fármaco incluía abacavir (ABC), didanosina (ddl), tenofovira (TNF), lavibudina (3TC), emtricitabina (FTC) e Zalcitabina (ddC). Por essa razão, a emergência de MAT relacionados com resgate de iniciador, com frequência, desempenha um papel importante no desenvolvimento posterior de padrões genotípicos de VIH bastante resistentes. Portanto, uma etapa na prevenção da resistência a múltiplos nucleósidos é desenvolver um novo ITRN com o objectivo de evitar a acumulação de MAT relacionados com resgate de iniciador. 10

As mutações de MAT relacionados com resgate de iniciador podem evoluir concomitantemente com outras familias de mutantes de fuga que tipicamente emergem de terapêuticas anti-retrovirais de combinação (conhecida de outra forma como terapêutica de coquetel). Actualmente, o coquetel "combivir" (AZT+3TC) é o regime mais frequentemente utilizado e recomendado de terapêutica de primeira linha para o tratamento de pacientes com VIH naive. Isto, no entanto, leva a mutantes de fuga que são resistentes a ambos os fármacos. Por exemplo, Miller et al (1998) relatam que o virus resistente a 3TC com uma mutação M184V foi escolhido somente 4-12 semanas após a iniciação da terapêutica de combinação de AZT+3TC. Com o tempo, mutações adicionais associadas a AZT apareceram gradualmente, dando um padrão genotípico caracteristico de M184V, M41L, D67N, K70N, K70R, L210W, T215Y/F e K 219Q/E que é comumente encontrado em pacientes que passaram por tratamentos hoje em dia. As mutações adicionais na TR nas posições H208, R211, e L214 (Stumer et al, 2003) e na posição G333 (Kemp et al 1998) são relatadas como estando envolvidas na resistência dupla a AZT-3TC, e em particular, para conferir um aumento na habilidade para resistir ao AZT. Portanto, o contexto genotípico do MAT relacionados com resgate de iniciador foi expandido para incluir as mutações dentro de M184V, M41L, DN67, K70R, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E e G333E.

Outros tipos de mutações geralmente vistos nos pacientes que passaram por tratamento são V118I e E44D/A. Estas mutações são fortemente correlacionadas com uma exposição prévia ao ddl e ao d4T. Além disso, com frequência são associados com a presença de agrupamentos de MAT específicos, incluindo o M41L mais T215Y/F ou D67N mais L210W. O resultado é uma resistência de MAT relacionado com resgate de iniciador aumentado à família de análogos de 11 timidina, bem como um papel distinto na resistência dupla a AZT+3TC (Montes et al, 2002, Girouard et al, 2003). A prevalência de mutantes de fuga de fármacos aumenta como uma função do número de ITRN utilizados durante o curso da terapêutica e forma um padrão de MAT ou MAN expandidos que compreende várias permutações dentro de M41L, E44D/A, D67N, K70R, V118I, M184V, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E e G333E. Este agrupamento é também comumente refractário a terapêuticas de combinação que contêm AZT e d4T e de resistência cruzada a classe inteira de ITRN.

Uma resistência significativa a análogos de timidina, notavelmente AZT, d4T e TNF, é também encontrada em mutantes de fuga que têm uma deleção de aminoácido na posição 67 (A67) na região do dedo de TR com frequência associada a uma substituição de aminoácido no T69G concomitante com MAT (veja-se Imamichi et al 2000 e 2001). Uma actividade de polimerização de TR aumentada, que está associada a este genótipo particular, é proposta para produzir numa excisão de iniciador dependente de pirofosforolise mais eficiente (descrita acima), levando à resistência aumentada. Boyer et al, (2004) também observaram que ο A67 concomitante com MAT conferiu uma habilidade aumentada para facilitar a resistência virai de resgate de iniciador (excisão) a AZT e a TNF quando comparado somente com o MAT. 0 VIH está a co-evoluir à medida que a terapêutica anti-retroviral se desenvolve. Novos fenótipos de mutação emergiram quando foram utilizados coquetéis de análogos de nucleósidos triplos e duplos na gestão clinica de VIH, especialmente nos pacientes naive de tratamento. Os regimes terapêuticos complexos, que requerem múltiplos fármacos tomados várias vezes durante o dia, alguns com e alguns sem alimentos, são um desafio para os pacientes. A falha em cumprir exactamente com estes regimes de dosagem o que leva 12 a falhas durante as 24 h, tem facilitado a emergência de vírus de VIH resistentes a ITRN múltiplos, predominantemente como resultado de MAN ou MDR adquiridos por vírus. Por exemplo, vários grupos (por exemplo, Mas et al, 2000) observaram a emergência do vírus mutante T69S-XX associado à utilização de AZT. Este mutante tem uma inserção de 6 pb na região de codificação da sua TR entre os ácidos nucleicos que especificam os aminoácidos 69 e 70. Os complexos de inserção de aminoácidos duplos resultantes (tipicamente, inserções de SS, SG ou AG) não levam somente à resistência virai ao AZT, mas também a quase toda a colecção de ITRN, incluindo d4T, 3TC, ddl, ddC e ABC, e TNF. Um resgate de iniciador dependente de pirofosforolise é visto com a inserção do aminoácido duplo T69S+, particularmente na presença de MAT. Este fenómeno é tipicamente associado aos fenótipos resistentes "M41L/T215Y" ou "M41L/L210W/R211K/L214F/T215Y" e desempenham um papel fenotípico importante na resistência a nucleósidos múltiplos (Meyer et al, 2003).

Outra classe de MDR tem uma substituição de aminoácido no codão Q151M. Esta mutação é observada com frequência relativamente baixa na clínica e com frequência, é apresentada, juntamente com as mutações secundárias de A62V, V75I, F77L e F116Y. Ela confere, no entanto, uma resistência significativa a quase toda a classe de ITRN. Além disso, observaram-se associados a MAT os genótipos "M41L, L210W e T215Y/F" ou "D67N, K70R e K219K/E" tipicamente. Aparecem em pacientes que passaram por tratamentos pesados com regimes de combinação de AZT/ddl e AZT/ddC. L74V é escolhido mais frequentemente pela monoterapêutica ddl (Martin et al, 1993) e apresenta uma resistência cruzada a ABC e a 3TC. O seu efeito na produção de fugas virais é dependente da presença de outras mutações. As pesquisas de resistência sugerem que a 13 frequência de L74V está ligada significativamente com MAT, tipicamente em antecedentes de M41L, L210W e T215Y/F (Marcelin et al, 2004) embora seja considerado que a mutação L74V cause um efeito de diminuição na replicação virai e na ressensibilização de virus resistentes a AZT que contêm uma quantidade de MAT (St. Clair et al, 1991) . Uma combinação de mutações de L74V e M184V no VIH-1 TR é o padrão mais frequente associado à resistência para ambos o ABC e o ddl (Harrigan et al, 2000 e Miller et al, 2000) .

Embora a resistência de nivel elevado a ABC requeira tipicamente mutações múltiplas que compreendem K65R, L74V, Y115F e M184V, uma única mutação, M184V, com frequência aparece primeiro. Esta mutação, agora reconhecida como uma mutação chave no mecanismo de discriminação da resistência ao fuga do fármaco confere uma redução moderada na susceptibilidade de ABC (Tisdale et al, 1997) . Um estudo de CNA3005 no qual um total de 562 pacientes receberam aleatoriamente AZT e 3TC com ABC ou ddl mostrou um aumento baixo, mas constante na proporção de pacientes que portam um MAT no AZT e no 3TC mais o braço de ABC. Na semana 48, até 56 % dos pacientes tiveram pelo menos um MAT relacionado com resgate de iniciador (lxTAM) sobre e acima da indução rápida da mutação M184V (Melby et al, 2001), o que ilustra a importância da prevenção da emergência da resistência relacionada com resgate de iniciador. Da mesma forma, a passagem in vitro de virus resistentes a AZT que contêm o padrão genotípico de 67, 70, 215 e 219 sob a pressão selectiva de 3TC resultou na escolha da mutação M184V e conferiu uma resistência cruzada a ABC (Tisdale et al, 1997). Isto outra vez enfatiza o conceito que tratar o MAT pré-existente relacionado com resgate de iniciador e evitar a acumulação de mutantes relacionados com resgate de iniciador é uma etapa principal para evitar o desenvolvimento de resistência a múltiplos nucleósidos. 14

Tem ficado cada vez mais claro que a mutação K65R aparece rapidamente numa proporção muito elevada de pacientes que estão a receber TNF ou ABC. Valer et al (2004) relataram que o aumento de K65R aumentou em prevalência no seu hospital de Madrid de < 1 % entre 1997 e 2000 a 7 % em 2003 e 12 % nos primeiros quatro meses de 2004. 0 efeito do mutante K65R é exacerbado na presença de outros mutantes associados com a susceptibilidade reduzida a ABC, 3TC, ddl e ddC (Parikh et al, 2003) . No entanto, o aparecimento simultâneo de K65R dos genótipos de MAT relacionados com resgate de iniciador, apesar de ocorrerem claramente, leva a um efeito mais profundo no resgate de iniciador (excisão) de TNF que de AZT (Naeger et al, 2001) . 0 TNF foi relatado como sendo activo contra o VIH-1 com até 3 x MAT, a não ser que o agrupamento de MAT tenha incluído uma mutação M41L ou L210W. Actualmente, não está claro porque os MAT podem reverter alguns dos efeitos do K65R, que de outra forma se considera que impedem os mutantes de excisão de iniciador com relação a susceptibilidade ao TNF e ABC.

Finalmente, a mutação T69D foi inicialmente identificada pelo seu papel em causar a resistência a ddC. Também foi relatado que está associada a uma resposta reduzida a ddl quando ocorre em combinação com a mutação T215Y e outros genótipos de MAT relacionados com resgate de iniciador.

Durante muitos anos, a WHO e o DHHS (US Department of Health and Human Health Service) têm recomendado a terapêutica anti-retroviral de primeira linha nos pacientes naive de tratamento consistindo na administração de d4T ou de AZT em combinação com 3TC mais nevirapina ou efavirenz (Directrizes para a Utilização de Agentes Retrovirais Antivirais em Adultos e Adolescentes Infectados por VIH-1, 14 de Julho de 2003 e 23 de Março de 2004) . Contudo, um número substancial de pacientes infectados por VIH sofrem 15 de falhas no tratamento, enquanto estavam nos regimes de terapêutica anti-retroviral altamente activa (HAART), sugerindo que estes pacientes já estão infectados com o virus de fuga de fármaco. Os mutantes de resistência a MAT relacionados com resgate de iniciador continuam a desempenhar um papel principal no desenvolvimento de resistência a fármacos. Assim, o desenvolvimento de fármacos ou de métodos terapêuticos para neutralizar o efeito dos mutantes de resistência a MAT relacionados com resgate de iniciador poderia potencializar ou prolongar a utilização dos ITRN existentes para o tratamento dos pacientes naive de tratamento e poderia também ser utilizado para tratar a população infectada por VIH que porta mutantes resistentes relacionados com resgate de iniciador numa terapêutica de recuperação.

Estratégias de Fármacos para Prevenir/Inibir Mutantes de Resgate de Iniciador

As mutações de resgate de iniciador discriminativas, com frequência, aparecem juntas no mesmo genótipo mutante, largamente devido a estratégia de terapêutica actual. Uma mutação M184V é representativa da família de mutantes discriminativos. Se, no entanto, ocorre juntamente com os mutantes relacionados com resgate de iniciador, como M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F, e K219Q/E, desempenha um papel na resistência dupla a AZT e 3TC (Miller et al, 1998) .

Estes fenótipos de resgate de iniciador e de resistência discriminativa parecem correlacionar-se com agrupamentos de mutações diferentes em TR. Por exemplo, as mutações associadas a AZT, compostas de várias mutações dentro de M41L, E44D/A, D67N, K70R, V118I, M184V, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y/F, K219Q/E e G333E, e a mutação MDR T69S com inserções de 6 pb e um A67 exibem tipicamente actividades de mutante de resgate de iniciador. Por outro lado, as mutações nas posições 65, 74, 89, 151, e 184 levam à habilidade de discriminar entre ITRN e as respectivas 16 contrapartes de dNTP ou podem estar envolvidas no reposicionamento do complexo de molde de iniciador.

No recente artigo "Designing anti-AIDS drugs targeting the major mechanism of VIH-1 RT resistance to nucleoside analog drugs" (IJBCB 36 (2004) 1706 - 1715), Sarafianos et al concluem que o mecanismo de resgate (excisão) de iniciador poderia ocorrer somente antes da translocação de TR no local N e concluem ainda que se tornou o mecanismo dominante de resistência a ITRN. No capitulo intitulado "Strategies for Inhibition of the Excision Reaction" (veja-se página 1711), propõem três abordagens para derrotar tal mecanismo de resistência: 1. utilização de novos antivirais que interferem com a ligação produtiva de ATP (no local P) , presumivelmente por meio da ligação no, ou próximo do local de ligação ao ATP, bloqueando dessa forma a reacção de excisão, sem afectar a reacção directa da sintese de ADN. 2. utilização dos compostos que podem bloquear a síntese de ADN, mas são de alguma forma resistentes à excisão, tais como variantes de alfa fosfato tio ou borano substituídos dos ITRN actuais. Da mesma forma, os variantes dos ITRN actuais podem ser engenheirados para o reposicionamento do iniciador/molde terminado/extendido num modo não excisável, como é sugerido pela pobre capacidade de excisão dos mutantes M184I/V induzida por 3TC. 3. utilização de inibidores à base de dinucleótido tetrafosfato para proporcionar uma ligação bidentada em ambos os locais N e P.

Cada uma destas três abordagens propostas para prevenir os mecanismos de resgate de iniciador de resistência a ITRN é aberta a críticas por diversas lacunas teóricas. Por exemplo, na primeira abordagem, a ligação de ATP não é requerida para funções de TR normais. Assim, contramedidas com base na inibição de ligação de 17 pirofosfato ou ATP através de competição ou bloqueio não prevenirão o desenvolvimento de resistência, porque a adequação dos virus básicos não será comprometida por tais agentes. Em outras palavras, as mutações de resistência aparecerão sem nenhum custo adicional. A quantidade abundante de ATP presente nos linfócitos normais também desafia o raciocínio atrás desta abordagem.

Na segunda abordagem proposta, parece que os análogos de alfa fosfato borano ou tio-substituidos seleccionariam os mutantes resistentes discriminativos, como tem sido visto com 3TC e FTC, e produziriam mutantes resistentes a VIH. A terceira abordagem proposta é limitada pela necessidade da absorção farmacocinética na célula alvo das espécies grandes altamente carregadas de dinucleótido tetrafosfato. Isto será um desafio farmacêutico e de administração de fármaco severo. É digno de nota que cada uma das abordagens de Serafaniano, incluindo a abordagem 1, que não é antiviral por si mesma, mas pressupõe a co-administração de um ITRN convencional, é baseada em variantes da geração actual de ITRN. Isto é, os compostos que não possuem uma função 3-hidroxilo e, portanto agem como terminadores de cadeia obrigatória.

Ao contrário dos ITRN "clássicos" discutidos acima (isto é, aqueles que não têm uma função 3 '-hidroxilo) , Ohrui et al (J Med Chem (2000) 43, 4516 - 4525) descrevem inibidores de VIH de 4'-C-etinila:

OH

Fórmula I

Estes compostos retém a função 3'-hidroxilo, mas no entanto exibem actividade contra VIH-1, incluindo uma estirpe típica de MDR discriminativo que contém as mutações 18 A62V, V75L, F77L, F116Y e Q151M. 0 mecanismo de acção foi postulado como sendo através de afinidade com a quinase de fosforilação de nucleósido. No entanto, observou-se também que estes compostos podem funcionar como terminadores de cadeia de ADN, devido ao seu carácter de neopentil álcool e do bloqueio estérico severo do substituinte cis 4' vicinal, que resultou numa reactividade fortemente diminuída do 3'-hidroxilo.

Kodama et al (Antimicrob Agents Chemother (2001) 1539 - 1546) descrevem um conjunto muito similar de compostos que contêm um grupo 4'-C-etinilo adjacente e a função 3'-hidroxilo retida que foram ensaiados em cultura de células com estirpes adicionais resistentes a VIH. Como Kodama et al não preparou os trifosfatos dos seus compostos, foram incapazes de esclarecer o mecanismo de acção, mas deduziram, através de várias observações circunstanciais, que os compostos estão na realidade a agir como ITRN. Kodama et al mais tarde relataram (abstract 388-T, 9th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections) que sob a pressão selectiva do seu nucleósido 4-C-etinilo in vitro, encontra-se o VIH resistente a ruptura que contém mutações T1651 e M184V localizado no local catalítico de TR. Este fenótipo mutante é manifestamente um tipo discriminativo de mutação e é muito resistente de maneira cruzada a 3TC. A incorporação do nucleósido de 4-C-etinilo de bloqueio de conflito estérico estava portanto envolvida. Isto foi estabelecido com o mecanismo inibidor de 3TC e, portanto quase certamente representa o mecanismo resistente discriminativo. Parece portanto improvável que os compostos de Kodama proporcionariam orientação em relação à questão dos mutantes que facilitam o resgate de iniciador (excisão mediada por pirofosfato ou ATP).

Chen et al (Biochemistry (1993) 32:6000 - 6002) conduziu investigações mecanísticas extensas numa série 19 estruturalmente relacionada de compostos que contêm um grupo azido em 41:

OH

Fórmula II

Chen demonstrou que o TR incorpora eficientemente dois nucleótidos de 4'-azidotimidina monofosfato, que terminam o alongamento de cadeia. Alem disso, TR também foi capaz de incorporar uma primeira 4'-azidotimidina monofosfato, seguido por um dNTP nativo e então um segundo nucleótido 4'-azidotimidina, que também levou à terminação de cadeia. Notar que ambos estes mecanismos resultaram numa 4'-azidotimidina monofosfato residindo no terminal do iniciador do ADN terminado, que é um mecanismo inibidor muito reminiscente dos ITRN actuais. Também era aparente que cada uma das polimerases α e β celulares (isto é, não virais) seria capaz de incorporar um único 4'-azido nucleótido, mas não um segundo, na cadeia nascente do ADN hospedeiro. Estas polimerases celulares então permitem que a cadeia de ADN hospedeira se alongue com outros dNTP nativos e assim incorpore permanentemente os nucleótidos de ITRN nos genes de ADN hospedeiro. Estes compostos não foram pesquisados em seres humanos por causa da má incorporação de nucleótidos não nativos pelas enzimas celulares que tem clara aplicação em carcinogénese. Da mesma forma, o desenvolvimento farmacêutico dos compostos correspondentes de 4'-C-etinilo de Kodama foi interrompido, alegadamente devido à severa toxicidade em organismos superiores. 0 documento EP 341 911 descreve uma extensa família de 3'-C- hidroximetil nucleósidos da fórmula

HO— R’

Fórmula III 20 e propõe a sua utilização predominantemente contra os virus de herpes, tais como CMV, mas também contra os retrovirus. O documento WO 92/06201 também apresenta um conjunto similar de compostos e indicações. O documento US 5.612.319 revela a actividade retroviral de 2'-3' didesoxi-31-C-hidroximetilcitosina contra VIH-1IIIB do tipo selvagem e o equivalente de simio, SIV-1, num modelo de infecção aguda por VIH de modelo de macaco cynomolgus. Esta publicação propõe a utilização do composto como um agente de profilaxia pós-exposição, especialmente contra lesões por picada de agulha. A profilaxia de pós-exposição implica que o ingrediente activo seja administrado imediatamente às pessoas, tais como pessoas da área médica que se auto-espetaram não intencionalmente com uma seringa infectada por VIH. Com a finalidade de assegurar o rápido tratamento de um profissional da saúde traumatizado com razão, uma seringa accionada por mola auto-administrada, tais como aquelas utilizadas para antídotos em guerra química e biológica, é uma via preferida de administração. A intenção da profilaxia pós-exposição é evitar que a infecção se estabeleça por si própria, ao invés de tratar uma infecção existente. Como tal, pretendia-se que o tratamento fosse levado a cabo durante um período de tempo curto, tal como de 24 - 48 h, utilizando doses extremamente elevadas do composto. Esta publicação menciona que por causa do período de tempo distinto de administração, a toxicidade transitória é aceitável, porque está a ser feita uma tentativa para evitar uma doença incurável. O método profiláctico pós-exposição descrito no documento US 5.612.319 nunca foi tentado em seres humanos - na realidade, segundo o que é conhecido, 2'-3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilcitosina não era administrada em seres humanos em absoluto. 21

Em 1994, quando a patente US 5.612.319 foi depositada, o VIH multi-resistente como é conhecido hoje ainda não tinha aparecido em nenhuma forma convincente. Hoje em dia, o VIH multi-resistente tem mutações de resgate de iniciador induzidas por e acumuladas de muitos anos de pressão selectiva da terapêutica com ITRN. Em outras palavras, o VIH e especialmente o TR existente, no momento em que essas patentes foram concedidas, era estruturalmente e mecanicamente muito diferente dos vírus de hoje. 0 pedido de patente internacional PCT/EP2005/057196, que não estava publicado na data de prioridade do presente pedido, revela a utilização de 2',3'-didesoxi-3'-hidroximetilcitosina e de pró-fármacos da mesma no tratamento de mutantes de fuga de VIH.

Acredita-se que a 2', 3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilcitosina é fosforilada no correspondente 5'-trifosfato por meio de enzimas celulares. A TR pesadamente mutada do VIH multi-resistente, em particular, a TR mutante relacionada com resgate de iniciador, incorpora este trifosfato como a 5'-(2', 3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilcitosina) monofosfato na cadeia de ADN nascente.

Os ITRN convencionais agem como terminadores de cadeia obrigatória, terminando a síntese de ADN no local N, e são portanto susceptíveis ao mecanismo descrito acima de resgate (excisão) de iniciador mediado por pirofosfato ou ATP único para VIH mult i-resistentes. Ao contrário, a 5'-(2',3'-didesoxi-3'-C- hidroximetilcitosina) monofosfato não age como um terminador de cadeia obrigatória, mais ao contrário, permite que um resíduo adicional seja ligado covalentemente na função 3'-hidroximetilo do 5'-(2', 3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilcitosina) monofosfato. Isto então promove a TR a passar pela alteração de transformação necessária para transferir a mesma ao local P para o ciclo seguinte de polimerização. Evidência preliminar sugere que 22 este resíduo terminal ligado é um nucleótido nativo ao invés de uma 5'- (2' , 3'-didesoxi-3'-C-hidroximetilcitosina) monofosfato.

De maneira muito importante, os dados sugerem que o último nucleótido incorporado não-2',3'-didesoxi-31-C-hidroximetilcitosina não é responsável pela adição posterior de nucleótidos pela transcriptase reversa mutada. Isto é, a terminação de cadeia parece ocorrer numa base além do ITRN da invenção, em vez de no ITRN. Além disso, após a incorporação de 2', 3'-didesoxi-31-hidroximetilcitosina, a TR parece transferir-se com sucesso ao local P para aceitar o nucleótido seguinte que entra. Esta evidência sugere que a 2', 3'-didesoxi-3'-hidroximetilcitosina, juntamente com a TR mutada relacionada com resgate de iniciador, alcança uma forma de terminação de cadeia que não é responsável pela excisão induzida por pirofosfato ou ATP. Como consequência, a 2', 31-didesoxi-3'-hidroximetilcitosina permite o tratamento efectivo de infecções por VIH que não são respondedoras aos regimes actuais de fármacos. 0 mecanismo inibitório discutido imediatamente acima é, portanto fundamentalmente diferente do mecanismo de terminação de cadeia dos nucleósidos 4'-substituídos de Chen et al (veja-se acima), que permite que vários nucleótidos sejam incorporados após o composto 4-substituído incorporado. Primeiramente, o mecanismo de Chen aumenta dramaticamente o risco de "continuação de leitura". Isto é, a polimerase de ADN continua a seguir o filamento do código e continua a adicionar os resíduos codificados para o codão de parada normal, dessa forma incorporando mal o nucleósido anormal dentro da cadeia de ADN. A eficácia antiviral pode estar perdida, no entanto, quando uma cadeia de ADN virai é construída pela polimerase virai (isto é, TR) porque a construção de continuação de leitura poderá ainda ser viável, não obstante o nucleósido 4'-substituído 23 mal incorporado. Mais importante, se o nucleósido 4'-substituído continuar a ser lido por uma polimerase celular (isto é, hospedeira), como Chen descreve, a construção resultante posteriormente representa um teratogene e aumenta dramaticamente o risco de danos celulares e cancro.

Os compostos de Chen, adicionalmente, requerem a adição de um segundo nucleótido 4'-substituído, imediatamente adjacente ao primeiro nucleótido 4'-substituído mal incorporado (isto é, X-X) ou intercalado por um nucleótido nativo (isto é, X-N-X). Na prática, isto significa que o nucleótido na última posição do terminal do iniciador é o nucleótido não nativo (isto é, fármaco). Isto é uma situação análoga ao caso da terminação de cadeia dos ITRN clássicos (isto é, aqueles que não possuem um grupo 3-hidroxilo). Aqui, o nucleótido de ITRN também reside na última posição do terminal do iniciador em que, como foi discutido acima, é susceptível a excisão mediada por pirofosfato ou ATP. São necessárias unidades múltiplas do nucleótido 4'-substituido de Chen com a finalidade de que trabalhe como um inibidor eficiente de TR. Como consequência, a efectividade do fármaco depende da sequência da cadeia de leitura. Por exemplo, se o composto de Chen é um análogo de timidina, terá a melhor afinidade se a cadeia de leitura tem uma sequência AA ou A-N-A. Aqui, o fármaco seria eficiente e eficaz em terminar a síntese de ADN. Mas, se a sequência da cadeia de leitura não contém recitais abundantes da sequência de AA ou A-N-A, o fármaco de Chen será menos capaz de terminar a síntese de ADN, numa determinada concentração. Como um AA duplo ou um A-N-A triplo é muito menos comum no genoma do que um A simples, o fármaco de Chen será muito menos eficiente do que outros ITRN que não têm um requisito de unidades múltiplas.

Mauldin et al Bioorganic and Medicinal Chemistry 1998 6:577 - 585 apresenta uma quantidade de pró-fármacos de 2', 2 4 3'-didesoxi-3'-hidroximetilcitosina. De particular importância é o fato de que os autores descobriram que as pró-fármacos envolvendo substituintes nas posições de álcool resultaram numa redução na actividade antiviral virtualmente em todos os seus ensaios.

Um objectivo da presente invenção é proporcionar pró-fármacos novas de 2', 3 '-didesoxi-31-hidroximetilcitosina, de utilização no tratamento de VIH, e em particular, no tratamento de mutantes de fuga de VIH.

Breve Descrição da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto da proporcionados compostos novos da fórmula I: R 0, fR1V \—N —N X)—N ^R5 0 No— \=/ R6 sao em que: R1 é independentemente H, -0R3, -NHR4; alquilo Ci-C4; ou, quando n é 2, o R1 adjacente juntos definem uma ligação olefínica; R2 é H; ou quando o RI geminai e alquilo Ci-C4, esse R poderá também ser alquilo Ci~C4; ou quando o RI geminai é -0R3, esse R2 poderá também ser -C(=0) OH ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo; R3 é independentemente H, ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo; R4 é independentemente H ou uma amida farmaceuticamente aceitável do mesmo; e R5 é H; R6 é H; n é 1, 2 ou 3; e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. 25

De acordo com uma forma de realizaçao da invenção, n é 1 e os compostos têm a seguinte fórmula: 25

As variantes favorecidas para R1:R2 nesta forma de realização incluem H:H, H: OH ou um éster farmaceuticamente aceitável dos mesmos, e Me:Me. As variantes particularmente favorecidas desta forma de realizaçao têm H como R5 e R6.

Uma forma de realização alternativa da invenção tem n = 2, produzindo dessa forma compostos da fórmula geral:

O

O

Nesta forma de realização, as variantes favorecidas para R1a:R1b:R2a:R2b incluem Η: Η: Η: H

H:H:H:OH ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo H:H:H:NH2 ou uma amida farmaceuticamente aceitável do mesmo H:OH ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo:H:H H:NH2 ou uma amida farmaceuticamente aceitável do mesmo:H:H Me:Me:Η:H Η:H:Me:Me H:OH:H:OH H: C=C : H

As variantes particularmente favorecidas desta forma de realização têm H como R5 e R6. Uma forma de realização adicional da invenção tem n igual a 3, com a fórmula geral: 26

incluem Η : Η : Η : Η : Η : Η Η:Η:Me:Me:Η:Η Η:Η:ΟΗ:Η:Η:Η Η:Η:OH:COOH:Η:Η Η : Η : Η : Η : Η : ΝΗ2 ou um éster ou amida farmaceuticamente aceitável dos mesmos.

As formas de realização actualmente preferidas incluem os compostos da fórmula I denominados de 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro-1,5, 10- trioxaciclopentaciclodeceno-6,9-diona;ou2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro-1,5,11-ciclopentaciclo-undecenotrioxaciclopentaciclo-undeceno-6,10-diona; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Estes compostos libertam subprodutos inócuos após hidrólise in vivo, como o ácido succínico ou glutárico.

Embora não se deseje estar preso pela teoria, acredita-se que os compostos da invenção, ou metabólicos activos dos mesmos, sejam activos contra a transcriptase reversa ou retrovirus, tais como VIH-1, VIH-2, HTL e VIS.

Um aspecto adicional da invenção proporciona a utilização dos compostos da fórmula I, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos no fabrico de um medicamento para o tratamento ou a profilaxia de infecções retrovirais em seres humanos ou animais. Tipicamente, o 27 medicamento está numa forma adaptada para a administração oral.

Revela-se no presente documento, um método para inibir a emergência ou a propagação de mutantes de resgate de iniciador de VIH que são capazes de retirar um nucleótido de ITRN de terminação de cadeia incorporado num complexo de molde/iniciador de VIH, em que a retirada é efectuada através de um mecanismo de excisão dependente de pirofosfato ou dependente de ATP. 0 método compreende a administração simultânea ou sequencial a um indivíduo infectado por VIH de uma quantidade eficaz do composto da invenção e pelo menos um ITRN de terminador de cadeia que induz mutantes de resgate de iniciador.

Os ITRN convencionais agem como terminadores de cadeia obrigatória que terminam a síntese de ADN no local N, e são, portanto susceptíveis ao mecanismo de resgate (excisão) de iniciador mediado por pirofosfato ou ATP único ao VIH multi-resistente. Ao contrário, evidência preliminar sugere que os compostos da invenção não agem como um terminador de cadeia obrigatória, mas ao contrário, permite que um resíduo adicional seja ligado covalentemente na função 3' -hidroximetilo da 5'-(2', 3'- didesoxi-3 '-C- hidroximetilcitosina) monofosfato. Isto então promove que a TR passe pela alteração transformacional necessária para se deslocar por si mesma ao local P para o ciclo seguinte de polimerização. Evidência preliminar baseada na sequência do molde apresentado a seguir sugere que este resíduo terminal ligado seja um nucleótido nativo. 0 VIH multi-resistente tipicamente capaz de ser tratado ou prevenido de acordo com a invenção, tipicamente terá uma TR que contém um padrão genético que compreende pelo menos um de (a) M41, ±D67, L210 e T215; (b) D67, K70 e K219; (c) T69S-XX ou 28 (d) A67 em que XX representa uma adição na sequência de TR de quaisquer dois aminoácidos naturais e A67 representa a deleção do aminoácido no codão 67.

Apesar de acreditar-se que os quatro padrões genotipicos acima representem a base essencial do fenótipo de fuga de fármaco de excisão, será aparente que os mutantes tratados ou prevenidos pela utilização da invenção tipicamente compreenderão mutações adicionais no gene de TR e em qualquer outro lugar, com frequência, pelo menos três mutações no gene de TR.

Geralmente, mas não exclusivamente, o agrupamento M41, ±D67, L210 e T215 com frequência compreenderão M41L, ±D67N, L210W e T215Y ou T215F.

Opcionalmente, os agrupamentos imediatamente acima podem compreender ainda, pelo menos, uma mutação adicional na posição E44, K70, V118, H208, R211K, L214, K219 ou G333.

Os agrupamentos imediatamente acima podem compreender ainda, pelo menos, uma mutação adicional na posição A67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 ou L228.

Geralmente, mas não exclusivamente, o agrupamento D67, K70 e K219 compreende D67, K70R e K219Q ou K219E.

Opcionalmente, o agrupamento D67, K70 e K219 pode compreender ainda, pelo menos uma mutação adicional na posição M41, E44, V118, H208, L210, R211K, L214, T215, ou G333 .

Além disso, o agrupamento D67, K70 e K219, compreende ainda opcionalmente pelo menos uma mutação adicional na posição A67, T69, E203, L210, D218, H221, D223 ou L228.

Geralmente, mas não exclusivamente, o agrupamento T69S-XX pode compreender ainda pelo menos uma mutação adicional na posição M41, E44, D67, K70, V118, H208, L210, R211K, L214, T215, K219 ou G333.

Opcionalmente, o agrupamento T69S-XX pode compreender ainda pelo menos uma mutação adicional na posição A67, T69, 29 Ε203, L210, D218, Η221, D223 ou L228. Geralmente, mas não exclusivamente, o agrupamento A6 7 pode compreender ainda pelo menos uma mutação adicional na posição M41, E44, D67, K70, VI18, H208, L210, R211K, L214, T215, K219 ou G333.

Opcionalmente, o agrupamento A67 pode compreender ainda, pelo menos uma mutação adicional na posição T69, T69S+XX, E203, L210, D218, H221, D223 ou L228.

Opcionalmente, a transcriptase reversa pode conter ainda pelo menos uma mutação discriminativa na posição K65, L74, M184 ou Q151, particularmente K65R, L74V ou M184V ou Q151M.

Tipicamente, o agrupamento de mutantes discriminativos poderá ser ligado com pelo menos uma mutação adicional na posição A62, V75, F77, Y115 ou F116.

Entre as estirpes de VIH capazes de serem tratadas pela invenção, estão as estirpes de VIH multi-resistentes cuja TR tem mutações que encorajam o resgate (excisão) de iniciador mediado por pirofosfato ou ATP de nucleótidos de ITRN de terminação de cadeia e que surgiram dentro do paciente como resultado de um tratamento prévio de VIH com pelo menos um antiviral seleccionado de zudovudina (AZT, ZDV), estavudina (d4T), zaicitabina (ddC), didanosina (ddl), abacavir, (ABC), lamivudina (3TC), emtricitabina (FTV), adefovir (ADV), entacavir (BMS 200475), alovudina (FLT), tenofovir disoproxil fumarato (TNF), amdoxavir (DAPD), D- d4FC (DPC-817), -dOTC (SPD754), SPD-756, racivir, D-FDOC ou GS7340.

Alternativamente, as estirpes de VIH são aquelas encontradas em pacientes que receberam tal estirpe de VIH resistente ou multi-resistente directamente ou indirectamente de outro indivíduo que induziram eles próprios uma estirpe de VIH resistente ou multi-resistente pelo tratamento sustentado com pelo menos um antiviral da lista acima de antivirais de ITRN. Com frequência, as 30 estirpes de VIH multi-resistentes contêm pelo menos três mutações na TR virai em comparação com o tipo selvagem.

Será aparente portanto que a composição da invenção pode ser utilizada como uma terapêutica adicional às actuais terapêuticas anti-retrovirais, tais como HAART, ou em alguns casos, como uma terapêutica de salvamento ou de resgate. Isto tipicamente será o caso em que o VIH multi-resistente tenha sido induzido no paciente real por aquele histórico de tratamento anterior com fármaco anti-retroviral. Alternativamente, as composições da invenção constituirão uma terapêutica de primeira linha, tipicamente em pacientes cuja infecção primária de VIH ocorreu com uma estirpe multi-resistente já mutada. Os seguintes fármacos antivirais com frequência, induzem tais estirpes de VIH multi-resistentes tendo mutações de resgate de iniciador de TR e encorajam a excisão mediada por pirofosfato ou ATP de nucleótidos de ITRN de terminação de cadeia: zudovudina, lamivudina ou as formas farmacêuticas combinadas Combivir ou Trizivir; lamivudina, abacavir ou a forma farmacêutica combinada de Epzicom; tenofovir, emtricitabina ou a forma farmacêutica combinada Truvada.

Embora estes fármacos induzam frequentemente tais estirpes de VIH multi-resistentes, esta lista de fármacos não é exclusiva. É aparente, portanto que o composto da invenção é administrado com a finalidade de prevenir a emergência de uma ou mais estirpes de VIH multi-resistentes tendo mutações de resgate de iniciador TR que encorajam a excisão mediada por pirofosfato ou ATP de nucleótidos de ITRN de terminação de cadeia. Esta prevenção ocorre mesmo quando os fármacos de ITRN que induzem tais mutações são administrados concomitantemente. 31

Um terceiro aspecto da invenção proporciona uma composição farmacêutica na forma farmacêutica unitária, que compreende o composto da fórmula I e pelo menos um ITRN de terminador de cadeia em que a dosagem sustentada com o ITRN induz mutações de resgate de iniciador de TR de VIH que encorajam a excisão dependente de pirofosfato ou dependente de ATP de monofosfato de ITRN incorporado do terminal 3' do complexo de molde/iniciador e permite a retomada da síntese de ADN.

As formas de realização preferidas da composição farmacêutica da invenção e incluem aquelas em que o ITRN é seleccionado de zudovudina (AZT, ZDV), estavudina (d4T), zaicitabina (ddC), didanosina (ddl), abacavir, (ABC), lamivudina (3TC), emtricitabina (FTV), adefovir (ADV), entacavir (BMS 200475), alovudina (FLT), tenofovir disoproxil fumarato (INF), amdoxavir (DAPD), D- d4FC (DPC-817), -dOTC (SPD754), SPD-756, racivir, D-FDOC ou GS7340 e combinações dos mesmos.

As formas de realização particularmente preferidas incluem aquelas em que o ITRN é seleccionado de zudovudina, estavudina, didanosina, lamivudina, abacavir, tenofovir, emtricitabina ou combinações dos mesmos. A experiência com fármacos de VIH, e inibidores de transcriptase reversa de VIH em particular, têm enfatizado ainda que os regimes de dosagem complexos e farmacocinética sub-óptima resultaram rapidamente em falhas não previstas. Isto por sua vez significa que a concentração durante 24 h (concentração plasmática mínima) para os respectivos fármacos num regime de VIH com frequência cai abaixo do limite inferior CI9o ou EDg0 em grande parte do dia. É considerado que um nível durante 24 h de pelo menos uma CI50, e mais realisticamente a CIg0 ou ED90 é essencial para desacelerar o desenvolvimento de mutantes de fuga de fármacos. 32

Os compostos da invenção são administrados tipicamente ao paciente numa dose comensurada com a expectativa de um tratamento anti-retroviral sustentado e prolongado. 0 regime de tratamento destina-se assim a assegurar um nivel definido de fármaco, e ainda evitar a toxicidade, embora a seja aceitável a utilização de compostos da fórmula I num tratamento de profilaxia pós-exposição de dose elevada, aguda que pode tolerar alguma toxicidade transitória. Os compostos da fórmula I, tipicamente são administrados em intervalos de 1 - 25 mg/kg/dia, preferivelmente, menos de 10 mg/kg/dia, preferivelmente, no intervalo de 0,05 - 0,5 mg/kg/dia. A dosagem apropriada dependerá das indicações e do paciente, e é rapidamente determinada pelo metabolismo e a farmacocinética convencional do fármaco em animal (DMPK) ou em ensaios clínicos e por um programa de computador de previsão in silico.

As composições farmacêuticas de dosagem unitária da invenção têm quantidades correspondentes do composto da fórmula I, tipicamente em escala para adulto de 60 kg ou 75 kg, e opcionalmente são divididos em 1, 2 ou 3 vezes para um regime de dosagem QD, BID ou TID. Se a dosagem terapêutica estiver no intervalo de 0,05 - 0,5 mg/kg/dia, então uma dosagem QD clínica por pessoa por dia seria de 3 mg - 30 mg para um adulto de 60 kg ou 3,75 - 37,5 mg para um adulto de 75 kg. As restrições de dosagem e regimes do ITRN convencional adicional no aspecto da composição farmacêutica de dosagem unitária combinada da invenção podem necessitar de uma dosagem QD, BID ou TID. A presente invenção inclui sais farmaceuticamente aceitáveis, tais como sais de ácidos orgânicos, particularmente, ácido carboxilico, incluindo, mas não limitado a acetato, trifluoroacetato, lactato, gluconato, citrato, tartarato, maleato, malato, pantotenato, isetionato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, digluconato, ciclopentanato, glucoeptanato, 33 glicerofosfato, oxalato, heptanoato, hexanoato, fumarato, nicotinato, palmoato, pectinato, 3-fenil propionato, picrato, pivalato, propionato, tartarato, lactobionato, pivolato, canforato, undecanoato e succinato. Também são incluídos os sais de ácidos sulfónicos orgânicos, como metanossulfonato, etanossulfonato, 2-hidroxietano sulfonato, canforsulfonato, 2-naftalenossulfonato, benzenossulfonato, p-clorobenzenossulfonato e p-toluenossulfonato. Os sais aceitáveis também incluem aqueles de ácidos inorgânicos, tais como cloridrato, bromidrato, iodato, sulfato, bissulfato, hemissulfato, tiocianato, persulfato, ácidos fosfórico e sulfónico. A presente invenção extende-se a agentes activos que são hidratos, solvatos, complexos e outras formas físicas que libertam o composto da fórmula I.

Embora seja possível que o agente activo seja administrado em separado, é preferível apresentá-lo como parte de uma formulação farmacêutica. Tal formulação compreenderá o composto do agente activo da fórmula I, juntamente com um ou mais portadores/excipientes aceitáveis e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos. 0(s) portador(es) deve(m) ser aceitável(eis) no sentido de ser compatível(eis) com os outros ingredientes da formulação e não ser prejudicial(ais) ao recebedor.

As formulações incluem aquelas adequadas para a administração rectal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parentérica (incluindo a subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Preferivelmente, a formulação é uma formulação administrada oralmente. As formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma farmacêutica unitária, por exemplo, comprimidos e cápsulas de libertação sustentada, e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na especialidade de farmácia. 34

Tais métodos bem conhecidos incluem a etapa de colocar o composto do agente activo da fórmula I em associação com o portador. Em geral, as formulações são preparadas colocando-se o agente activo intimamente e uniformemente em associação com portadores líquidos ou portadores sólidos finamente divididos ou ambos, e dando forma então ao produto, se for necessário. A invenção estende-se a métodos para a preparação de uma composição farmacêutica que compreende a colocação de um composto da fórmula I ou o seu sal farmaceuticamente aceitável em conjunto ou em associação com um portador farmaceuticamente aceitável. Se a produção das formulações farmacêuticas envolve a mistura íntima de excipientes farmacêuticos e do ingrediente activo numa forma de sal, e então, com frequência é preferível utilizar-se excipientes que não são de natureza básica, isto é, ácidos ou neutros.

As formulações para a administração oral da presente invenção podem ser apresentadas como unidades distintas, tais como cápsulas, hóstias ou comprimidos, cada um contendo uma quantidade predeterminada do agente activo. Alternativamente, podem ser apresentados como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão do agente activo num líquido aquoso ou num líquido não-aquoso ou numa emulsão líquida óleo-em-água ou uma emulsão líquida água-em-óleo, ou como um bolus, etc.

Com relação às composições para administração oral (por exemplo, comprimidos e cápsulas), o termo "portador adequado" inclui veículos tais como excipientes comuns, por exemplo, agentes de ligação, tais como xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinil pirrolidona (Povidona), metil celulose, etil celulose, carboximetil celulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose, sacarose e amido; cargas e portadores, por exemplo amido de milho, gelatina, lactose, sacarose, celulose microcristalina, caulim, manitol, fosfato di-cálcico, cloreto de sódio e 35 ácido algínico; e lubrificantes como estearato de magnésio, estearato de sódio e outros estearatos metálicos, estearato de glicerol, ácido esteárico, fluido de silicone, talco, ceras, óleos e silica coloidal. Agentes aromatizantes, tais como hortelã pimenta, óleo de gaultéria, aromatizante de cereja ou similares também podem ser utilizados. Pode ser desejável adicionar um agente colorante para fazer com que a forma farmacêutica seja rapidamente identificável. Os comprimidos podem também ser revestidos por métodos bem conhecidos na especialidade.

Um comprimido poderá ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos comprimidos podem ser preparados por meio de compressão do agente activo numa forma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturado com um ligante, lubrificante, diluente inerte, conservante, agente tensioactivo ou dispersante. Os comprimidos moldados podem ser feitos por meio de moldagem numa máquina adequada de uma mistura do composto em pó humidificado com um diluente liquido inerte. Os comprimidos podem também, opcionalmente, ser revestidos ou pontuados e podem ser formulados de modo a proporcionar uma libertação lenta ou controlada do agente activo.

Outras formulações adequadas para a administração oral incluem pastilhas compostas do agente activo numa base aromatizada, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto; as pastilhas moles que compreendem o agente activo numa base inerte como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e colutórios que compreendem o agente activo num portador liquido adequado. "Alquilo Οι-Οε" (também abreviado como alq Ci-C6, ou utilizado em expressões do composto, tais como alquiloxi C1-C6, etc) como é utilizado no presente documento, significa que inclui cadeias de carbono alifáticas de cadeia linear e ramificada tais como metilo, etilo, n- 36 propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, heptilo e quaisquer isómeros simples dos mesmos. 0 grupo alquilo pode ter uma ligação insaturada. Adicionalmente, qualquer átomo de C em alquilo Ci-C6 pode ser substituído opcionalmente por um, dois ou onde a valência permitir, três halogénios e/ou substituído ou a cadeia alquileno interrompida por um heteroatomo S, 0, NH. Se o heteroatomo estiver localizado no terminal da cadeia, então ele é substituído apropriadamente por um ou 2 átomos de hidrogénio. Alquilo Ci-Cn tem o significado correspondente a alquilo Ci-Cô ajustado como for necessário para o número de carbonos. "Alquilarilo C0-C3 como é utilizado no presente documento significa que inclui qualquer fracção arilo como fenilo, naftilo ou fenilo fusionada num cicloalquilo C3-C7, por exemplo, indanilo, cujo arilo é ligado directamente (isto é, Co) ou através de um grupo intermediário metilo, etilo, propilo, ou isopropilo, como foi definido para o alquileno C1-C3 acima. A não ser que seja indicado de outra forma, arilo e/ou a sua fracção cicloalquilo fusionado é opcionalmente substituído com 1,3- substituintes seleccionados de halo, hidroxilo, nitro, ciano, carboxi, alquilo Ci-C6, alcoxilo Ci-C6, alcoxiCi-C6alquiloCi-C6, alcanoilo C1-C6, amino, azido, oxo, mercapto, nitro C0-C3 alquilcarbociclilo, alquileterociclilo C0-C3. "Arilo" tem o significado correspondente, isto é, em que a ligação alquilo C0-C3 está ausente. "alquilCo-C3cicloalquilaC3-C7" conforme utilizado aqui significa que inclui um grupo cicloalquilo C3-C7 como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, cicloexilo ou cicloheptilo, cujo cicloalquilo é ligado directamente (isto é, alquilo C0) ou através de um grupo intermediário metilo, etilo ou propilo, como foi definido para o alquileno C1-C3 acima. 0 grupo cicloalquilo pode conter uma ligação insaturada. A não ser que seja indicado de outra forma, a 37 fracção cicloalquilo opcionalmente é substituída com 1-3 substituintes seleccionados de halo, hidroxi, nitro, ciano, carboxi, alquilo Ci-Cõ, alcoxilo Ci-Cô, alcoxiCi-CgalquiloCi-Ce, alcanoilo Ci-C6, amino, ácido, oxo, mercapto, nitroalquilcarbociclilo C0-C3, alquileterociclilo C0-C3. "Alquilcarbociclilo C0-C3" como é aplicado no presente documento significa que inclui alquilarilo C0-C3 e alquiloCo-C3cicloalquiloC3-C7. A não ser que seja indicado de outra forma, o grupo arilo ou cicloalquilo é substituído opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados de halo, hidroxi, nitro, ciano, carboxi, alquilo C1-C6, alcoxiCi-C6alquiloCi-C6, alcanoilo C1-C6, amino, azido, oxo, mercapto, nitro, alquilcarbociclilo C0-C3 e/ou alquileterociclilo C0-C3. "Carbociclilo" tem o significado correspondente, isto é, em que a ligação alquilo C0-C3 está ausente. "Alquileterocicililo C0-C3" como é aplicado no presente documento significa que inclui um anel que contém heteroatomo monocíclico, saturado ou insaturado, como piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, isozazolilo, tiazinolilo, isotiazinolilo, tiazolilo, oxadiazolilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, tetrazolilo, furanilo, tienola, piridilo, pirimidilo, piridazinilo, pirazolilo, ou qualquer de tais grupos fusionados num anel fenilo como quinolinilo, benzimidazolilo, benzoxazolilo, benzisoxazolilo, benzotiazonolilo, benzisoiazinolilo, benzotiazolilo, benzoxadiazolilo, benzo-1,2,3-triazolilo, benzo-1,2,4-triazolíla, benzotetrazolilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzopiridilo, benzopirimidilo, benzopiridazililo, benzopirazolilo, etc, cujo anel é ligado directamente, isto é, (Co) , ou através de um grupo intermediário metilo, etilo, propilo, ou isopropilo, como foi definido para o alquileno C1-C3 acima. Quaisquer tais anéis não saturados que têm um carácter aromático podem ser denominados como 38 heteroarilo no presente documento. A não ser que seja indicado de outra forma, o anel hetero e/ou a sua fracção fenilo fusionado é substituída opcionalmente com 1-3 substituintes seleccionados de halo, hidroxi, nitro, ciano, carboxi, alquilo Ci-Cô, alcoxilo Ci-Cô, alcoxiCi-CealquiloCi-C6, alcanoilo Ci-C6, amino, azido, oxo, mercapto, nitro, alquilcarbociclilo C0-C3, alquileterociclilo C0-C3. "Heterociclilo" e "heteroarilo" têm o significado correspondente, isto é, em que a ligação alquilo C0-C3 está ausente.

Tipicamente, as fracções heterociclilo e carbociclilo dentro do âmbito das definições acima são portanto um anel monocíclico com 5 ou especialmente 6 átomos no anel, ou uma estrutura de anel bicíclico que compreende um anel fusionado com 6 membros num anel com 4, 5 ou 6 membros.

Tais grupos típicos incluem cicloalquilo C3-C8, fenilo, benzilo, tetrahidronaftilo, indenilo, indanilo, heterociclilo tal como azepanilo, azocanilo, pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piperazinilo, indolinilo, piranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, tiopiranilo, furanilo, tetrahidrofuranilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, piridinilo, pirimidinilo, pirazinilo, piridazinilo, tetrazolilo, pirazolilo, indolilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzimidazolilo, benzoxazolilo, benzisoxazolilo, quinolinilo, tetrahidroquinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidrosoquinolinilo, quinazolinilo, tetrahidroquinazolinilo e quinoxalinilo, quaisquer dos quais pode ser substituído opcionalmente como foi definido no presente documento. A fracção heterociclo saturado inclui, portanto radicais, tais como pirrolinilo, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piranilo, tiopiranilo, piperazinilo, 39 indolinilo, azetidinilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidrofuranilo, hexahidropirimidinilo, hexahidropiridazinilo, 1,4,5,6-tetrahidropirimidinilamina, dihidro-oxazolilo, 1,2-tiazinanil-1,1-dióxido, 1,2,6-tiadiazinanil-1,1-dióxido, isotiazolidinil-1,1-dióxido e imidazolidinil-2,4-diona, ao passo que o heterociclo insaturado inclui radicais com um carácter aromático, tal como furanilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tetrazolilo, tiadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, indolizinilo, indolilo, isoindolilo. Em cada caso, o heterociclo pode ser condensado com um anel fenilo para formar um sistema de anel biciclico.

Os compostos da fórmula I incluem certos ésteres ou amidas farmaceuticamente aceitáveis. Ésteres representativos incluem, portanto os ésteres de ácido carboxilico nos quais a fracção não carbonilo da porção de ácido carboxilico do grupo de éster é seleccionado de alquilo de cadeia linear ou ramificada (por exemplo, metilo, n- propilo, t-butilo, ou n- butilo, cicloalquilo, alcoxialquilo (por exemplo, metoximetilo) , aralquilo (por exemplo, benzilo), ariloxi- alquilo (por exemplo fenoximetilo) , arilo (por exemplo, fenilo, opcionalmente substituído por, por exemplo, halogénio, alquilo Ci-4, ou alcoxilo Ci-4) ou amino; ésteres de sulfonato, tais como alquilo ou aralquilsulfonilo (por exemplo, metanosulfonilo); ésteres de aminoácidos (por exemplo, L-valil ou L-isoleucil) ; e ésteres de mono-, di-, ou tri-fosfato. Em tais ésteres, a não ser que seja especificado de outra forma, qualquer fracção alquilo presente, vantajosamente contém 1 a 18 átomos de carbono, particularmente, 1 a 6 átomos de carbono, mais particularmente, 1 a 4 átomos de carbono. Qualquer fracção cicloalquilo presente em tais ésteres, vantajosamente 40 contém 3 a 6 átomos de carbono. Qualquer fracção arilo presente em tais ésteres é, vantajosamente composto de um grupo fenilo, substituído opcionalmente como foi mostrado na definição de carbocicililo acima. Ésteres farmaceuticamente aceitáveis incluem, portanto ésteres de ácido gordo C1-C22r tais como acetilo, t- butilo ou ácidos gordos monoinsaturados ómega-6 ou insaturados lineares ou ramificados de cadeia longa tais como palmoilo, estearoilo e similares. Ésteres de arilo ou heteroarilo alternativos incluem benzoilo, piridilmetiloilo e similares, quaisquer dos quais pode ser substituído, como foi definido no carbociclilo acima. Os ésteres farmaceuticamente aceitáveis preferidos incluem os ésteres de ácido L-amino alifático como leucil, isoleucilo e particularmente valil. Ésteres de aminoácidos preferidos adicionais incluem os ésteres de ácido gordo 2-O-AA-C3-C22 descritos no documento W099 09031, em que AA é um éster de aminoácido alifático, especialmente aqueles derivados de ácido L-láctico e L-valil.

As amidas farmaceuticamente aceitáveis incluem aquelas derivadas de aminoalquilo de cadeia linear ou ramificada C1-C22 incluindo opcionalmente 1 a 3 insaturações e/ou substituídas opcionalmente com os substituintes definidos em carbocicililo acima ou anilinas ou benzilaminas. As amidas preferidas incluem aquelas formadas da reacção da amina com um ácido alcanóico de cadeia linear ou ramificada C1-C4. Outras amidas farmaceuticamente aceitáveis com funções de amina correspondem às amidas dos ácidos carboxílicos preferidos para os ésteres indicados acima. Síntese

Os compostos da invenção são sintetizados tipicamente a partir de um derivado de bis-4,5- hidroximetiltetrahidrofurano protegido de forma diferente, preparado de forma análoga a Svansson et al em J. Org. Chem (1991) vol 56: 2993 - 2997 como é mostrado no esquema 1 41

No esquema 1, o álcool epoxi quiral 1 é rapidamente preparado utilizando a oxidação Sharpless como foi mostrado em J Org Chem 1987, 52, 2596. Rs é um grupo protector de hidroxilo convencional, como aqueles discutidos abaixo, por exemplo, para-bromobenzilo. 0 álcool epoxi 1 é regiosselectivamente alquilado em C-3, por exemplo, com brometo de alil magnésio em dimetil éter a -50 °C. A cromatografia, por exemplo, com silica gel, separa o isómero 2 desejado, opcionalmente após uma etapa de diferenciação na qual os hidroxilos vicinilos do regioisómero não desejado são clivados com um agente oxidante como periodato de sódio. O grupo hidroxilo primário em 2 é protegido com um outro grupo protector hidroxilo, por exemplo, benzoilação com cloreto de benzoilo em piridina a 0 °C produzindo o 3 diferencialmente protegido. A cis-hidroxilação da ligação olefinica utilizando uma quantidade catalítica de tetróxido de ósmio e N- metilmorfolina N-óxido como re-oxidante, como foi descrito em Tet. Lett. 1976 17 1973 produz o di-álcool correspondente que por sua vez é clivado com um agente oxidante como periodato de sódio num solvente orgânico tal como tetrahidrofurano aquoso. A furanose instável assim produzida é desbloqueada com um álcool/ácido como metanol a 0,5 % p/p em ácido clorídrico para produzir o intermediário 4 de bis-4,5-hidroximetiltetrahidrofurano protegido diferencialmente. 42

Pode ser desejável manipular os grupos protectores Rs e Rsl (isto é, para remover e re-proteger com um grupo protector de hidroxilo adicional, dessa forma para utilizar a facilidade de retirada selectiva de um dos grupos protectores seleccionados e não o outro, em etapas posteriores. Os grupos protectores diferenciais em 4 são portanto seleccionados de modo a possibilitar a retirada selectiva de tal grupo protector e a acilação da função hidroxilo assim exposta como foi mostrado abaixo nos esquemas 2 e 3. Vários pares de grupos protectores de hidroxilo seleccionáveis diferencialmente são conhecidos, por exemplo, os grupos O-protectores revelados em Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", (John Wiley & Sons, Nova Iorque (1981)).

Os grupos protectores de hidroxilo compreendem assim éteres, tais como metil éter ou metil éteres substituídos, por exemplo, metoximetilo (MOM), benziloximetilo, t-butoximetilo, 2-metoxietoximetilo (MEM), 2,2,2-tricloroetoximetilo, bis (2- cloroetoxi)metilo, 2-(trimetilsilil)etoximetilo, teroidropiranilo (THP), 3-bromotetrahidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, 4-metoxitetrahidropiranilo, 4-metoxitetrahidrotiopiranilo S,S dixido, tetrahidrofuranilo e tetrahidrotiofuranilo. Etil éteres incluem 1-etoxietilo, 1- metil-l-metoxietilo, 1-(isopropoxi)- etilo, 2,2,2-tricloroetilo e 2-(fenilselenil)etilo . Outros éteres incluem t-butilo, alilo, cinamilo, p-clorofenilo e benzil éteres, tais como benzilo não substituído, p-metoxibenzilo, o-nitrobenzilo, p-nitrobenzilo, p-halobenzilo e p-cianobenzilo. Outros éteres incluem 3-metil-2-picolil N-oxido, difenilmetilo, 5-dibenzosuberilo, trifenilmetilo, alfa naftildifenilmetilo, p- metoxifenildifenilmetilo, p(p'-bromofenaciloxi) fenildifenilmetilo, 9-antrilo, 9-(9-fenil)xantenilo, 9— ( 9— feni1—10—oxo)antrilo (tritilona) e benzisotiazolol S,S, dioxodo. Silil éteres incluem trimetilsililo (TMS), 43 trietilsililo, isopropildimetilsililo, t-butildimetilsililo (TBDMS), (trifenilmetil)- dimetilsililo, t-butildifenilsililo, metildiisopropilsililo, metil di-t-butilsililo, tribenzilsililo, tri-p-xililsililo, triisopropilsililo e tripenilsilil. Grupos protectores de hidroxilo alternativos incluem ésteres, como formiato, benzoilformiato, acetato, cloroacetato, dicloroacetato, tricloroacetato, trifluoracetato, metoxiacetato, trifenilmetoxi- acetato, fenoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 2,6-tricloro-4-metilfenoxiacetato, 2, 6-dicloro-4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenoxiacetato, 2,4-bis(1,1-dimetilpropil)fenoxiacetato, cloro-difenilacetato, p-(P)-fenilacetato, 3-fenilpropionato, 3-benzoilpropionato, isobutirato, monosuccinato, 4-oxopenatanoato (levinulato), pivaloato, adamantoato, crotonato, 4-metoxicrotonato, (E)-2-metil-2- butenoato (tigloato) e benzoatos, como os (dibromometil )-, o-(metoxi- carbonil)-, p-fenil-, 2,4,6-trimetil-(mesilato) ou p-(P)- benzoatos, ou alfa-naftoato. Os grupos protectores de hidroxil carbonato incluem os metilo, etil, 2,2,2- triclorometilo, isobutilo, vinilo, alilo, cinamilo, p-nitrofenilo, benzilos, tais como p-metoxi-, 3,4-dimetoxi-, -nitro- ou p- nitrobenzilo, ou S-benziltiocarbonato. Grupos protectores de hidroxilo miscelânea incluem N-fenilcarbamato, N-imidazolil carbamato, borato, nitrato, Ν,Ν.Ν.Ν-tetrametilfosforodiamidato e 2,4-dinitro- fenilsulfenato.

Grupos protectores de hidroxilo representativos incluem aqueles nos exemplos, e éteres, tais como t-butilo e outros alquil éteres de cadeia curta, tais como isopropilo, etilo e particularmente metilo, benzilo e trifenilmetilo; tetrahidropiranil éteres; e etil éteres substituídos, por exemplo, 2,2,2-tricloroetilo; silil éteres, por exemplo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo e t-butildifenilsililo; e ésteres preparados pela reacção do 44 grupo hidroxilo com um ácido carboxilico, por exemplo, acetato, propionato, benzoato e similares. 0 bis-4,5 hidroximetiltetrahidrofurano 4 protegido diferencialmente é então condensado com uma 4-amino-pirimidona sililada, opcionalmente N-protegida, como é mostrado no esquema 2, seguido pela acilação e ciclização. Alternativamente, 4 é primeiramente biciclizado e então é condensado como é mostrado no esquema 3.

0 esquema 2 mostra uma condensação de Vorbruggen (Chem Ber. 1981, 114, 1234) do intermediário 4 protegido diferencialmente com 4-amino-pirimidino-2-ona sililada, em que a função 4-amino é opcionalmente protegida com um grupo protector amino convencional como foi mostrado em Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," (John Wiley & Sons, Nova Iorque (1981)). Os exemplos de tais grupos 45 incluem: 1) grupos acilo, tais como formilo, trifluoracetilo, ftalilo, e p-toluenosulfonilo; 2) grupos carbamato aromáticos como benziloxicarbonilo (CBZ ou Z) e benziloxicarbonilo substituídos, e 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); 3) grupos carbamato alifáticos, tais como terc- butiloxicarbonila (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, e aliloxi-carbonilo; 4) grupos alquil carbamato cíclicos, tais como ciclopentiloxicarbonilo e adamantiloxicarbonilo; 5) grupos alquilo como trifenilmetilo e benzilo; 6) trialquilsililo como trimetilsililo; 7) grupos que contêm tiol como feniltiocarbonilo e ditiasuccinoilo. 0 grupo protector amino é, claro, seleccionado de tal forma que as suas condições de desprotecção são harmonizadas com a sequência de retirada dos grupos protectores de hidroxilo. Alternativamente, Rs2 é um sintão para as amidas e iminas definidas para R5 e R6. Não é requerido de forma alguma nenhum grupo protector para a função amino e portanto Rs e H.

Como é convencional na condensação de Vorbruggen, a mistura da reacção contém TBDMSOTf e CH2C12 e o isómero desejado 5 é separado com cromatografia, por exemplo, HPLC. Um dos grupos protectores hidroxilo em 5 é então retirado selectivamente para descobrir a função hidroxilo. No esquema 2, composto 6, o Rs é o que é retirado primeiro, e o par diferencial de grupos protectores hidroxilo pode portanto, por exemplo, ser TBDP (terc-butil-silanilo) retirado selectivamente com TBAF em tetrahidrofurano para Rs, e o MMTR (4-metoxi-fenildifenilmetilo) posteriormente retirado com ácido acético para Rs1. No entanto, fica rapidamente aparente que outras permutações de grupos protectores alcançarão o mesmo objectivo. Greene proporciona gráficos de reactividade extensos sobre diversos grupos protectores para facilitar tal selecção. Adicionalmente, trocando-se as posições de Rs e Rs1 por 46 meio de manipulação apropriada de 4 isto produzirá um intermediário no qual a função hidroximetilo é desmascarada e acilada primeiro. A função hidroxilo desmascarada em 6 é acilada com um ácido ωω-dicarboxílico HOOC-A-COOH activado, em que A corresponde a -(CR1R2)n- como foi definido acima, para produzir 7. No caso de R1 ou R2 conter um grupo potencialmente reactivo como OH, NH2 ou COOH, estes são convencionalmente protegidos como foi descrito no trabalho de Greene. 0 ácido activado utilizado na acilação pode compreender, por exemplo, o haleto de ácido, anidrido de ácido, éster de ácido activado ou o ácido na presença de reagente de acoplamento, por exemplo, dicicloexilcarbodiimida. Derivados de ácidos activados representativos incluem o cloreto de ácido, anidridos derivados de haletos de alcoxicarbonilo, tais como cloreto de isobutiloxicarbonilo e similares, ésteres derivados de N-hidroxisuccinamida, ésteres derivados de N-hidroxiftalimida, ésteres derivados de N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxamida, ésteres derivados de 2,4,5-triclorofenol e similares. Outros ácidos activados incluem aqueles da fórmula HCOOHACOOX em que X, por exemplo, é COCH3, COCH2CH3 ou que COF3 ou benzotriazol. 0 grupo protector Rs1 no Composto 7 é retirado em seguida para libertar até 4 grupos hidroximetilo de 8 na preparação para a ciclização do segundo anel do sistema de anel biciclico de tetrahidrofurano. Isto prossegue via acilação, como foi descrito em principio acima. 0 grupo Rs2 do Composto 8, é então manipulado para produzir os compostos da fórmula 1, como for necessário. Por exemplo, um grupo protector de amino como Rs2 pode ser retirado para produzir a amina livre em R5 & R6.

Um esquema alternativo de síntese para os compostos da fórmula 1 é como foi mostrado na figura 3: 47

fórmula 1

No esquema 3, o tetrahidrofurano 4 protegido diferencialmente descrito acima é primeiramente biciclizado e então é condensado conforme Vorbriiggen. A biciclização prossegue através da desprotecção de um primeiro par Rs/Rs1 de grupos protectores complementares. Neste caso a função 4- hidroximetilo do tetrahidrofurano é que é libertada primeiramente pronta para a acilação, mas esta metodologia geral, com a escolha apropriada de grupos protectores Rs/Rs1 também pode prosseguir através da retirada e acilação da função hidroximetilo 5 como a primeira etapa para a ciclização. A escolha da desprotecção 4 ou 5 primeiramente é significante naqueles casos em que A no ácido (000-dicarboxilico H00C-A-C00H é assimétrico, isto é, nos compostos da fórmula I em que m é 2 ou 3 e em que R1/R2 dos vários meridianos de metileno não é idêntico. Por exemplo, em que A é -CH(0H)CH2~ (isto é, na fórmula 1, n é 2, R1 no primeiro grupo metileno e OH enquanto R é H, ambos o R e o R2 no segundo grupo metileno são H), então a localização 48 do grupo hidroxilo R1 adjacente a ligação éster da função hidroximetilo 4 do intermediário de tetrahidrofurano pode ser assegurado pela desprotecção do Rs primeiro utilizando o ácido PG-OC-CH2-CH (OH)-COOH activado, em que PG é um grupo protector de carboxilo convencional, que é, claro, seleccionado de tal forma que as suas condições de retirada são harmonizadas com a retirada pretendida de RS1. Greene proporciona gráficos de reactividade extensos para facilitar tal selecção.

Grupos protectores de carboxilo são extensamente revistos neste trabalho de Greene e compreendem tipicamente ésteres tais como metil ou ésteres de metil substituídos, por exemplo, metoximetilo, metiltiometilo, tetrahidropiranilo, tetrahidrofuranilo, metoxietoxietilo, benziloximetilo, fenacilo, incluindo p-bromo, alfa metil ou p- metoxifenacilo, diacilmetilo, ou N-ftalimidometilo. Ésteres de etilo incluem etilo não substituído e 2,2,2-tricloroetilo, 2- haloetilo, ω-cloralquilo, 2-( trimetilsilil) etilo, 2- metiltietilo, 2-(p-nitrofenilsulfenil)etilo, 2-(p-toluenosulfonil)etilo e 1-metil-l-fenetilo. Outros ésteres incluem t-butilo, ciclopentilo, cicloexilo, alilo, cinamilo e fenilo, incluindo m-metiltiofenil. Ésteres de benzilo incluem benzilo não substituídos, trifenilmetilo, difenilmetilo incluindo bis (o- nitrofenil)metilo, 9-antrilmetilo, 2-(9,10-dioxo) antrilmetilo, dibenzosuberilo, 2,4,6-trimetilbenzilo, p- bromobenzilo, o-nitro- benzilo, p-nitrobenzilo, p-metoxibenzilo, piperonilo, 4-picolilo e p-(P)-benzilo. Ésteres de sililo incluem trimetilsililo, trietilsililo, t-butildimetilsililo, i-propildimetilsililo e fenildimetilsililo. Ésteres activados incluem S-t-butilo, S-fenilo, S-2-piridilo, N-hidroxipiperidinilo, N-hidroxisuccinimidoilo, N-hidroxi- ftalimidoilo, e N-hidroxibenzotriazolilo. Grupos protectores de carboxi éster miscelânea incluem O-acil oximas, 2,4- 49 dinitrofenilsulfenilo, 2-alquil-l,3-oxazolinas, 4-alquil-5-oxox-1,3-oxazolidinas e 5-alquil-4-oxo-l,3-dioxolanos. Ésteres de estanilo incluem dietilestanilo e tri-n-butilestanilo. Grupos protectores de carboxilo não ésteres incluem amidas, tais como N-N-dimetilo, pirrolidinilo, piperidinilo, o-nitrofenilo, 7-nitroindolilo, 8-nitrotetrahidroquinolilo e p(P)benzeno- sulfonamida. Grupos protectores de carboxilo não éster aios incluem hidrazidas, tais como N-fenilidrazida ou N-N'-di- isopropilidrazida.

Um esquema alternativo em relação a derivados de tetrahidrofurano protegidos diferencialmente é mostrado no esquema 4:

,0 p

O

0 esquema 4 é relatado extensamente na literatura académica. A preparação de precursores de análogo de uridina é mostrada em Sanghvi et al Synthesis 1994, 1163,

Sanghvi et al Tett Lett vol 35 p 4697 (1994) e Haly & Sanghvi Nucleosides & Nucleotides Vol 15 1383 (1996). A 50 conversão de uridina em análogos de citosina é mostrada em Koziov, Nucleosides & Nucleotides vol 17 2249 (1998).

Uma via alternativa para tetrahidrofuranos protegidos diferencialmente que não requer a conversão da base i é mostrada no esquema 5:

fórmula I a: TrCl, piridina, b: i) MsCl, Pyr ii) 1 N NaOH, THF, c) i) EtAlCN, 6 5C, ii) tolueno/THF, d) i) MsCl, Et3N, ii) EtOAc, f) i) NaBH4 ii) EtOH, α/β 1:3-4, g) i) DIBAL, ii) sílica gel EtOAc, epimerizar α/β 93:7, g) i) NaBH4, ii)

EtOH/CH2C12.

Embora o esquema 5 tenha sido ilustrado com um grupo protector TrO e R5R6 = H, ficará aparente que outras variantes para os grupos protectores de amina e hidroxilo serão responsáveis por esta via.

Descrição Detalhada das Formas de Realização 51 Várias formas de realização dos compostos da invenção serão agora descritas, somente para fins de exemplo, com referência aos seguintes exemplos e figuras; nos quais A figura 1 é um gráfico das concentrações plasmáticas ao longo do tempo de metabolitos in vivo após a administração oral de um composto da invenção a um rato; A figura 2 representa a inibição de estirpes típicas de MAT tendo um fenótipo de resgate de iniciador pelo composto parental dos compostos da invenção em relação a inibição de ITRN convencionais, conforme é discutido adicionalmente no exemplo biológico 2a; A figura 3 representa a inibição de M184V + MAT tendo um fenótipo de resgate de iniciador pelo composto parental dos compostos da invenção, em relação a inibição de ITRN convencionais, conforme é discutido adicionalmente no exemplo biológico 2b; A figura 4 representa a inibição de T69S + XX + MAT pelo composto parental ITRN convencionais conforme é discutido adicionalmente no exemplo biológico 2c; A figura 5 representa a inibição das estirpes de MAT pelo composto parental dos compostos da invenção, em relação a inibição por zidovudina e lamivudina, conforme é discutido adicionalmente no exemplo biológico 3;

Exemplo 1 2 -(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro-1,5, 10-trioxaciclopenta-ciclodeceno-6,9-diona

O a) Éster terc-butílico do ácido N- (1-(5-(terc-butil-difenil-silaniloximetil)-4- [(4-metoxi-fenil) -difenil- 52 52 2-dihidro- metoximetil] -tetrahidrofuran-2-il) - 2-oxo-l, pirimidino-4-il)-carbâmico

A uma solução de 0,75 g (1 mmol) de 4-amino-l-{5-(terc-butil-silaniloximetil)- 4 -[(4-metoxifenil)-difenil-metoximetil]-tetrahidrofuran-2-il}- 1H -pirimidino- 2 -ona, preparada conforme o esquema 4 anterior, em dioxano (25 ml) e sob azoto, foi adicionada uma solução de dicarbonato de di-terc-butilo (0,44 g, 2 mmol) em dioxano (2 ml). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 48 h. A mistura de reacção foi evaporada sobre sílica gel e o resíduo foi purificado em coluna de sílica gel utilizando-se acetato de etilo/hexanos 2:1 como eluente para produzir 0,42 g (49 %) do produto representa acima.

Protão RMN (CDC13) : 8,33 (d, 1H) , 7,64- -7, 59 (m, 4H) , LO Γ- -7, 18 (m, 18H) , 6,91 (d, 1H) , 6,79- -6,77 (m, 2H) , 6 ,10- 6, 08 (m, 1H) , 4, 08 -4, 06 (m, 1H) , 3,98- -3,96 (m r 1H) , 3,77 (s, 3H) , 3,59 (dd, 1H) , 3, 19 -3,16 (m, 1H) , 3, 02 -2,98 (m, \—1 2,57 -2,53 (m, 2H) , 2, 72- -2,25 (m, 1H) , 1, 50 (s, 9H) , 1, 08 (s, 9H) . b) Éster terc-butílico do ácido (1-{5-hidroximetil- 4-[(4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetrahidrofuran-2-il}-2-oxo-l,2-dihidro-pirimidino-4-il]-carbâmico. 53

A uma solução do composto anterior (0,33 g, 0,4 mmol) em tetrahidrofurano (10 ml) foi adicionada uma solução de TBAF (0,19 g, 0,6 mmol) em tetrahidrof urano (1 ml). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 3 h. A mistura de reacção foi evaporada sobre sílica gel e o resíduo foi purificado em coluna de sílica gel utilizando-se acetato de etilo/hexanos 2:1 como o eluente. A evaporação das fracções apropriadas produziu 0,20 g (80 %) de éster terc-butílico do ácido (1—{5— hidroximetil-4-[(4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetrahidrofurano-2-il]- 2-oxo-l,2-dihidro-pirimidino-4-il]-carbâmico.

Protão RMN (CDC13) : 8,22 (d, 1H) , 7,40-7,38 (m, 4H) , 7,38-7,23 (m, 10H), 6,85-6,82 (m, 1H) , 6,03-6,00 (m, 1H) , 4, 04-3, 94 (m, 2H), 3,85-3,81 (m, 1H) , 3,80 (s, 3H) , 3,29 (dd, 1H), 3,11 (dd, 1H), 2, 35-2,22 (m, 3H), 1,52 (s, 9H) . c) Ester mono-{5-(4-terc-butoxicarbonilamino - 2- oxo-2H-pirimidino-l-il)-3-[(4-metoxi- fenil)-difenil- metoximetil ] -tetrahidrofurano-2 - il - metílico} do ácido succinico 54

A uma solução do composto anterior (200 mg, 0,33 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (98 mg, 0,8 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionado anidrido succinico (80 mg, 0,8 mmol) . A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante a noite, depois disso a mistura de reacção foi adicionada numa mistura de diclorometano e cloreto de amónio saturado. A fase orgânica foi lavada com água e seca. A evaporação do solvente produziu 222 mg (94 %) do composto representado anteriormente.

Protão RMN (CDC13) : 8, 02 (d, 1H), 7, 38- •7,36 (m, 4H) 7, 30- -7, 15 (m, 9H) , 6,84- 6,81 (m, 2H) , 5, 89- 5, 87 (m, 1H) 4, 58 (dd, 1H) , 4,26 (dd, 1H) , 4,13-4,08 (m, 1H) , 3, 79 (s 3H :), 3,24 (dd , 1H) , 3,05 (t, 1H), 2, 80-2, . 60 (m, 4H) 2, 31- -2,26 (m, 1H), 2 , 17-2 ,12 (m, 2H), 1, 51 (s , 9H) d) Éster mono-{5-(4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-3-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il- metilico] do ácido succinico

O

Uma solução do composto anterior (222 mg, 0,31 mmol) em ácido acético (10 ml) e água (5 ml) foi agitada a 55 temperatura ambiente durante 3 h. LC/MS indicou uma conversão completa do material de partida no composto desprotegido desejado como um ião M+l de 442. A mistura de reacção foi evaporada até a secura e o resíduo foi purificado sobre uma coluna em fase reversa C-8 eluída com acetonitrilo/água 1:1,5 como eluente para produzir 100 mg (73 %) do composto desejado representado anteriormente.

Protão RMN (CDC13): 8,18 (d, 1H) , 7,23 (d, 1H), 5,93 (cada s, 1H), 4, 66-4, 63 (m, 1H), 4,33 (d, 1H) , 4,15 (cada s, 1H), 3,66 (cada s, 2H), 2, 80-2 , 59 (m, 4H) , 2,37 (cada s, 2H), 2,28-2,44 (m, 1H), 1,51 (s, 9H) . e) Éster terc-butílico do ácido [i- (6,9-dioxo- decahidro-1,5,10-trioxa-ciclopentaciclodecen-2-il)-2-oxo-1,2- dihidro-pirimidino-4-il]-carbâmico

A uma solução do composto anterior (74 mg, 0,168 mmol) , HOBR (27 mg, 0,2 mmol) e trietilamina (0,14 ml, 1 mmol) em diclorometano (65 ml) e DMF (2 ml) foi adicionado EDAC (39 mg, 0,2 mmol). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 48 h, depois disso a mistura de reacção foi deitada em diclorometano (100 ml) e ácido cítrico aquoso (100 ml) . A fase orgânica foi lavada com solução de hidrogeno-carbonato de sódio e salmoura. A fase orgânica foi seca em sulfato de sódio e foi evaporada até um resíduo que foi purificado em coluna de sílica gel utilizando-se acetato de etilo como o eluente, para produzir 22 mg (31 %) do composto mostrado acima.

Protão RMN (CDC13) : 7,75 (d, 1H) , 7,36 (cada s, 1H) , 7,25 (d, 1H) , 6, 02-5, 99 (m, 1H) , 4,58 (dd, 1H) , 4,36- 56 4,28 (m, 2H), 4,14 (t, 2H) , 2,64 (s, 4H) , 2, 58-2, 55 (m, 1H), 2,29-2,25 (m, 2H), 1,52 (s, 9H). f) 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro- 1,5, 10-trioxa-ciclopentaciclodeceno-6,9-diona. A uma solução do composto anterior (22 mg, 0,052 mmol) em diclorometano (2 ml) foi adicionado ácido trifluoracético (2 ml). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 1 hora e foi evaporada até secura. A evaporação conjunta duas vezes com tolueno produziu, após cuidadosa secagem, 12,7 mg do composto capturado como o sal de bis-trifluoracetato. LC/MS confirmou a estrutura com iões caracteristicos de 324 (M+l) e 647 (2M+1) e a pureza através de HPLC estava acima de 90 % a 254 nm. EXEMPLO 2 7-amino-2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il) -_octahidro- 1,5,10-trioxaciclopentaciclodeceno-6,9-diona

O a) Éster 4-(5-(4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo- 2H-pirimidino-l-il]-3-[(4-metoxi-fenil)-difenil-metoximetil]-tetrahidrofuran-2-il-metilico) do ácido 2-terc- butoxicarbonilamino succinico 57

A uma solução de éster terc-butílico do ácido (1 - {5-hidroximetil-4-[(4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetrahidrofuran-2-il}-2-oxo-l,2-dihidro-pirimidino-4-il]-carbâmico [98 mg, 0,4 mmol, descrito no exemplo 1] e 4-metilaminopiridina (a 98 mg, 0,8 mmol) em diclorometano (20 ml) foi adicionado N-Boc-(S)-asp anidrido [172 mg, 0,8 mmol (preparado conforme descrito em J. Med. Chem. 1971, pp 24 -30)] . A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante a noite, depois disso a mistura de reacção foi adicionada em acetato de etilo (150 ml e cloreto de amónio saturado (100 ml) . A fase orgânica foi lavada com água, seca com sulfato de sódio e evaporada para produzir 371 mg de um produto bruto representado acima que foi utilizado sem qualquer purificação na etapa seguinte.

Protão RMN ( CDC13) : 7, 76 (d, 1H), 7 , 38-7 , 20 (m, 12 H) , 7, 08 (d, 1H), 6, 83 (d, 2H) , 6,13 (d, 1H) , 5,80 (d, 1H) , 4, 83 (t, 1H), 4, 61- 4,58 (m, 1H), 4,14- 4,06 (m, 2H) , 3,79 (s, 3H) , 3,25-3, 23 (m, 1H) , 3,17-3,12 (m, 1H), 3,00 (t, 1H) , 2, 80-2, 76 (m, 1H) , 2,2 6-2,15 (m, 3H) , 1,56 (s, 9H) , 1,4 (s, 9H) . b) Éster 4 - [ 5- (4· -terc- -butoxicarbonilamino-2-oxo -2H- pirimidino-l-il) - 3 - hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il- metílico] do ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-succinico 58

Uma solução do composto anterior (330 mg, 0,40 mmol) em ácido acético (10 ml) e água (5 ml) foi agitada a temperatura ambiente durante a noite. A mistura de reacção foi evaporada até a secura e o residuo foi purificado numa coluna em fase reversa C-8 eluido com acetonitrilo/água 1:1,5 como eluente para produzir 72 mg (32 % do produto desejado. LC/MS confirmou a estrutura correcta com um ião molecular de 557 (M+l). c) Éster terc-butílico do ácido [l-(7-terc-butoxicarbonilamino -6,9-dioxo-decahidro- 1,5,10- trioxaciclopentaciclodecen-2-il)-2-oxo-l,2-dihidro-pirimidino- 4-il)-carbâmico

A uma solução do composto anterior (72 mg, 0,13 mmol), HOBT (20 mg, 0,16 mmol) e trietilamina (0,07 ml, 0,5 mmol) em diclorometano (50 ml) e DMF (1 ml) foi adicionado EDAC (31 mg, 0,16 mmol) . A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 24 h, depois disso a mistura de reacção foi deitada em diclorometano (100 ml) e a fase orgânica foi lavada com solução de ácido citrico, solução de bicarbonato de sódio e salmoura. A fase orgânica foi 59 seca em sulfato de sódio e foi evaporada até um resíduo que foi purificado numa coluna de silica gel utilizando acetato de etilo como o eluente para produzir 26 mg (37 %) do composto mostrado acima. LC/MS produziu o ião M+l correcto de 539 e o ião M-l de 537.

Protão RMN (CDC13) : 7,73 (d, 1H) , 7,40 (s largo, 1H) , 7,24 (d, 1H), 6,02-6,00 (m, 1H), 5,26-5,24 (m, 1H), 4,87-4,85 (m, 1H), 4, 64-4,55 (m, 2H) , 4,20-4,18 (m, 1H) , 4,06 (t, 1H), 3,84 (t, 1H), 3, 00-2, 90 (m, 1H), 2, 76-2, 66 (m, 1H), 2,57-2,52 (m, 1H) , 2,31-2,17 (m, 2H) , 1,52 (s, 9H) , 1, 45 (s, 9H) . d) 7-amino-2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il) octahidro-1,5,10-trioxaciclopentaciclodeceno-6,9-diona

h2n o A uma solução do composto anterior (26 mg, 0,05 mmol) em diclorometano (2 ml) foi adicionado ácido trifluoracético (2 ml). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 2 h e foi evaporada até a secura. A evaporação conjunta duas vezes com tolueno produziu, após cuidadosa secagem, 24 mg do composto do titulo como o sal de bis trifluoracetato. LC/MS confirmou a estrutura com iões característicos de 339 (M+l), 677 (2M+1) e 337 (M-l).

Exemplo 3 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro-1,5,_11- ciclopentaciclo-undecenotrioxaciclopentaciclo-undeceno-6,10-diona 2 60

Ο a) Ester mono-{5-[4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il] - 3-[(4-metoxi-fenil)-difenil- metoximetil]- tetrahidrofuran-2-il-metílico} do ácido hexanodióico

A uma solução do éster terc-butílico do ácido {1—{5— hidr ox imet i1 — 4 —[4-metoxifenil-difenil-metoximetil]-tetrahidrofuran-3-il}- 2-oxo-l,2-dihidro-pirimidino-4-il]-carbónico [730 mg, 1,19 mmol, descrito no exemplo 1] e 4-metilaminopiridina (350 mg, 2,86 mmol) em diclorometano (80 ml) foi adicionado anidrido glutárico (327 mg, 2,86 mmol). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante a noite depois disso a mistura de reacção foi deitada em diclorometano. A fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de amónio diluído, solução de ácido cítrico diluído, água e salmoura e seca em sulfato de sódio e evaporada para produzir 819 mg (95 %) de um produto bruto representado anteriormente que foi utilizado sem qualquer purificação na etapa seguinte. 61 b) Éster mono-[5-[4-terc-butoxicarbonilamino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il]-3-hidroximetil-tetrahidrofuran-2-il-metílico] do ácido hexanodioico

Uma solução do composto anterior (1,09 g, 1,5 mmol) em ácido acético (50 ml) e água (25 ml) foi agitada a temperatura ambiente durante 2,5 h. A mistura de reacção foi evaporada até a secura e o resíduo foi purificado numa coluna de sílica gel eluída com EtOAc/MeOH 9:1 como o eluente para produzir 5 mg (64 %) do composto desejado. c) Ester terc-butílico do ácido [1-(6 , 10-dioxo-decahidro- 1,5,1l-trioxa-ciclopentaciclo-undeceno-2-il)-2oxo- 1,2-dihidro-pirimidino-4-il)-carbâmico

A uma solução do composto anterior (395 mg, 0,87 mmol), HOBT (235 mg, 1,74 mmol) e DMAP (213 mg, 1,74 mmol) em DMF (120 ml), foi adicionado EDAC (334 mg, 1,74 mmol). A mistura de reacção foi agitada a temperatura ambiente durante 48 h após o que o solvente foi evaporado. Foi adicionado diclorometano ao resíduo da reacção e ele foi diluído com solução de cloreto de amónio, solução de ácido cítrico diluído, água e salmoura, seco em sulfato de sódio e evaporado para produzir 350 mg de um produto bruto. LC/MS mostrou que o produto desejado tinha iões a 438 (M+l), 496 (M+ acetato), 875 (2M+1) e 436 (M-l). Duas 62 purificações numa coluna em fase reversa C-8 eluida com acetonitrilo/água 1:1 e acetonitrilo/água 1:1,25 produziram, após a evaporação e liofilização, 31 mg do composto titulo com uma pureza de aproximadamente 50 %, conforme determinado por meio de HPLC a 220 nM. d) 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro- 1,5,ll-trioxa-ciclopentaciclo-undeceno-6,10-diona

A uma solução a ± 0 °C do composto anterior (31 mg) em diclorometano (2 ml) foi adicionado ácido trifluoracético (2 ml). A mistura de reacção foi agitada a ± 0 °C durante 2 h e então a temperatura ambiente po durante r outras 2 h. Depois disso a mistura de reacção foi evaporada até a secura e finalmente a evaporação conjunta com tolueno produziu um produto bruto que foi purificado numa coluna em fase reversa diluída com acetonitrilo/água 1:2. As fracções apropriadas foram evaporadas após a adição de TFA e foram obtidos 31 mg do composto do título como o sal de trifluoracetato. LC/MS confirmou a estrutura com iões característicos de 338 (M+l), 396 (M+ acetato) e 675 (2M+1) e a pureza a 220 nM foi de aproximadamente 70 %.

Exemplo Biológico IA:

Farmacocinética de Rato

0 composto do exemplo 1 foi dissolvido em água grau MQ, 3 mg/ml e foi administrado oralmente em duplas de ratos. A dose foi de 15 mg/kg e as amostras de plasma foram colhidas em t 0, 15 & 30 minutos, 1, 2, 4 e 6 h. A recuperação (como o metabolito 2',3'-didesoxi-3'-C-hidroximetil-(β-D-eritropentofuranosilcitosina) no plasma 63 foi medida com espectrometria de massa, detectada como aducto de sódio m/z 264 (M+Na)+.

Conforme pode ser visto na figura 1, o composto da invenção produziu uma concentração substancial no plasma do metabolito 2', 3* -didesoxi, 3' -C-hidroximetil-(β-Ό- eritropentofuranoscitosina com uma concentração de pico nesta dose aproximadamente 4 uM. Como os ratos não podem ser infectados com VIH, a actividade anti-retroviral desta formulação não pode ser medida directamente neste exemplo, mas é notado que o ED5o para o metabolito 2', 3'-didesoxi, 3' -C-hidroximetil-(β-D-eritropentofuranoscitosina é tipicamente aproximadamente 0,01 uM em células H9 de seres humanos. Isto por sua vez significa que a concentração plasmática de pico é várias centenas de vezes superiores ao ED50. Outros parâmetros farmacêuticos, tais como AUC e depuração são consistentes com a obtenção de um nível durante ao longo de 24 h bem superior ao ED50 com dosagem QD ou BID.

Exemplo Biológico 1B Permeabilidade

Este exemplo mede o transporte de inibidores através das células do canal gastro-entérico humano. O ensaio utiliza a células Caco-2 bem conhecidas com um número de passagens entre 40 e 60.

Apical em Transporte Basolateral

Geralmente cada composto será testado em 2-4 poços. Os poços basolateral e apical conterão 1,5 ml e 0,4 ml de solução tampão de transporte (TB), respectivamente, e a concentração padrão das substâncias testadas é de 10 μΜ. Além disso, todas as soluções de teste e tampão conterão 1 % de DMSO. Antes da experiência, as placas de transporte são previamente revestidas com meio de cultura contendo 10 % de soro durante 30 minutos para evitar a ligação não especifica ao material plástico. Após 21 a 28 dias em 64 cultura sobre suportes de filtros, as células estão prontas para as experiências de permeabilidade. A placa de transporte número 1 é composta de 3 fileiras com 4 poços cada. A fileira 1 é denominada de lavagem, a fileira 2 "30 minutos" e a fileira 3 "60 minutos". A placa de transporte n° 2 é composta de 3 fileiras de 4 poços, uma é denominada fileira 4 "90 minutos", fileira 5, "120 minutos" e as fileiras restantes sem denominação. O meio de cultura dos poços apicais é retirado e as inserções são transferidas para uma fileira de lavagem (n° 1) numa placa de transporte (placa n° 1) das duas placas sem inserções, que já tinham sido preparadas com 1,5 ml de tampão de transporte (HBSS, 25 mM de HEPES, pH 7,4) nas fileiras de 1 a 5. Na selecção A ^ B, o TB no poço basolateral também contém 1 % de albumina de soro bovino, 0,5 ml de tampão de transporte (HBSS, 25 mM de MES, pH 6,5) são adicionados nas inserções e as monocamadas das células são equilibradas no sistema de tampão de transporte durante 30 minutos a 37 °C num agitador Polymix. Depois de ser equilibrado para o sistema de tampão, o valor da resistência eléctrica transepitelial (TEER) é medido em cada poço por um instrumento de bastão EVOM. Os valores TEER usualmente estão entre 400 a 1.000 Ω por poço (depende do número de passagens utilizado). O tampão de transporte (TB, pH 6,5) é retirado do lado apical e a inserção é transferida para a fileira de 30 minutos (n° 2) e são adicionados 425 pL de TB (pH 6,5), incluindo a substância de teste, no poço (dador). As placas são incubadas num agitador Polymix a 37 ° C com uma baixa velocidade de agitação de aproximadamente 150 a 300 rpm.

Após 30 minutos de incubação na fileira 2, as inserções serão movidas para novos poços basolaterais previamente aquecidos (receptor) a cada 30 minutos; a fileira 3 (60 minutos), 4 (90 minutos) e 5 (120 minutos). 65

Amostras de 25 pL serão colhidas da solução apical após ~ 2 minutos e no final da experiência. Estas amostras representam amostras do dador do inicio e do final da experiência. 300 pL serão tomados dos poços basolaterais (receptor) a cada ponto de tempo programado e o valor posterior de TEER é medido no final da experiência. Será adicionado acetonitrilo em todas as amostras recolhidas até uma concentração final de 50 % nas amostras. As amostras recolhidas serão armazenadas a -20 ° C até a análise por meio de HPLC ou de LC-MS.

Transporte Basolateral a Apical

Geralmente cada composto será testado em 2-4 poços. Os poços basolateral e apical conterão 1,55 ml e 0,4 ml., respectivamente, e a concentração padrão das substâncias testadas é de 10 pM. Além disso, todas as soluções de teste e tampões conterão 1 % de DMSO. Antes da experiência, as placas de transporte são revestidas previamente com meio de cultura contendo 10 % de soro durante 30 minutos para evitar a ligação não especifica ao material plástico.

Depois de 21 a 28 dias em cultura sobre suportes de filtros as células estão prontas para as experiências de permeabilidade. O meio de cultura dos poços apicais é retirado e as inserções são transferidas para uma fileira de lavagem (n° 1) numa nova placa sem inserções (placa de transporte). A placa de transporte é composta de 3 fileiras de 4 poços. A fileira 1 é denominada de "Lavagem" e a fileira 3 é a "Fileira experimental". A placa de transporte foi preparada previamente com 1,5 ml de TB (pH 7,4) ma fileira de lavagem n° 1 e com 1,55 ml de TB (pH 7,4) incluindo a substância de teste, na fileira experimental n° 3 (lado do dador) . 0,5 ml de tampão de transporte (HBSS, 25 mM, pH 6,5) são adicionados nas inserções na fileira n° 1 e as 66 monocamadas de células são equilibradas no sistema de tampão de transporte durante 30 minutos, a 37 °C num agitador Polymix. Depois de ser equilibrado ao sistema de tampão, o valor TEER é medido em cada poço através de um instrumento de bastão EVOM. O tampão de transporte (TB, pH 6,5) é retirado do lado apical e a inserção é transferida para a fileira 3 e são adicionados 400 pL de TB fresco, pH 6,5, nas inserções.

Depois de 30 minutos, são retirados 250 pL do poço apical (receptor) e substituídos por tampão de transporte fresco. Posteriormente, serão retiradas amostras de 250 pL e substituídas por tampão de transporte fresco a cada 30 minutos até o final da experiência em 120 minutos, e finalmente um valor posterior de TEER é medido no final da experiência. Serão colhidas amostras de 25 pL do compartimento basolateral (dador) após ~ 2 minutos e no final da experiência. Estas amostras representam amostras do dador do início e do final da experiência. A todas as amostras recolhidas será adicionado acetonitrilo até uma concentração final de 50 % nas amostras. As amostras recolhidas serão armazenadas a -20 °C até a análise por meio de HPLC ou LC-MS. Cálculo

Determinação da fracção cumulativa absorvida, contra o tempo. A FAcum é calculada de:

V

Em que Cr± é a concentração do receptor no final do intervalo i e Cdí é a concentração do dador no início do intervalo i. Deverá ser obtida uma relação linear. A determinação dos coeficientes de permeabilidade (Pappr cm/s) são calculados de: 67 ρ - app~ (Â 60) em que k é a taxa de transporte (min-1) definido como a curva obtida por regressão linear da fracção acumulada absorvida (FAcum) como uma função do tempo (min) , VR é o volume da câmara do recebedor (ml), e A é a área do filtro (cm2) .

Os compostos de Referência

Categoria de Absorção em Homens Marcadores % de Absorção em Homens TRANSPORTE PASSIVO Inferior (0 - 20 %) Manitol 16 Metotrexato 20 Moderado (21- 75 %) Aciclovir 30 Elevado (76 -100 %) Propranodiol 90 Cafeína 100 TRANSPORTE ACTIVO Transportador de aminoácido L-Fenilalanina 100 EFLUXO ACTIVO PGP-MDR1 Digoxin 30

Exemplo Biológico 2

Actividade contra VIH resistente relacionado ao resgate de iniciador de MAT no ensaio de VIH fenosenso A susceptibilidade dos compostos da invenção, medida como o metabolito de plasma 2 ,3 -didesoxi, 3'-C-hidroximetil- β-D-eritropentofuranoscitosina sobre isolados de VIH—1 de amostras de plasma de paciente que portam genótipos existentes mutantes tipicos de resgate de iniciador de MAT, é determinada pelo ensaio de PhenoSense HIV disponível comercialmente (descrito em Petropoulos, CJ et al., (2000) Antimicrob. Agents Chemother. 44:920 - 928 e é executado pela Virologics, Inc) . 0 ensaio é executado pela amplificação do segmento TR-(PR) de protease do gene 68 pol de VIH a partir de plasma de paciente e inserindo os produtos de amplificação num vector VIH-1 modificado derivado de um clone molecular NL4-3.

Os estoques virais são preparados através da transfecção conjunta de culturas de células 293 com um vector de ADN virai recombinante e um vector de expressão que produz as proteínas de envelopes de vírus de leucemia murina anfotrópica. As partículas de vírus pseudotipifiçadas são recolhidas das culturas de células transfectadas e são utilizadas para infectar culturas frescas de células 293. 0 ADN virai recombinante contém uma cassete de gene luciferase dentro da região do gene VIH env e a produção de luciferase nas células alvo é dependente da terminação de uma série de replicação de vírus. A susceptibilidade do fármaco é medida pela adição de concentrações em série do composto da invenção e dos compostos de referência às células. Os fármacos que inibem a replicação de vírus reduzem o sinal de luciferase de uma forma dependente da dose, produzindo uma medida quantitativa da susceptibilidade da droga.

Exemplo 2a. 0 Quadro 1 resume um agrupamento principal dos mutantes de MAT relacionados com ao resgate de iniciador, utilizados na experiência que são resistentes a VIH e portam a característica do genótipo de MAT que tipicamente emerge durante a terapêutica anti-retroviral envolvida em AZT.

Quadro 1. Genótipo característico em isolados de pacientes de MAT 20 e 21 relacionados com resgate de iniciador_

Número de Isolado Mutações característlcas de MAT relacionadas com resgate de iniciador 20 M41L, D67N, K70R, V118I, L210W, R211K, T215F, K219Q e L228H 21 M41L, D67N, K70S, V118I, L210W, R211K, T215Y, K219N e L228H

Os resultados sao representados na figura 2. 0 vírus de VIH do tipo selvagem é utilizado como a referência. 69

Aqui, a inibição do isolado do paciente das estirpes 20 e 21 é expresso como o número de alterações na redução da susceptibilidade ao tratamento do fármaco, comparado com corridas execuções da referência. Os seguintes fármacos antivirais foram testados: AZT, 3TC, TNF, ABC, d4T, FTC e o composto da invenção, como o metabolito do plasma 2 ' ,3' — didesoxi, 3'-C-hidroximetϋ-β-D-eritropentof uranosilcitosina. É claramente aparente que o composto da invenção reteve a actividade contra as estirpes que portam MAT. Os resultados mostram somente uma redução de 1,0 vez, na susceptibilidade para a estirpe do isolado 20 e menos de 1,0 vez de redução na susceptibilidade para o isolado da estirpe 21. Isto significa que os compostos da invenção retiveram actividade contra o TR VIH mutante relacionado com resgate de iniciador do paciente num nível de potência semelhante a sua potência, contra o TR de VIH do tipo selvagem. Ao contrário, outros fármacos, notavelmente o AZT (redução de 451 vezes em susceptibilidade), mas também em relação ao 3TC, TFN, ABC, d4T e FTC, perderam potência contra o virus destes pacientes, em comparação com o tipo selvagem. Em outras palavras, o vírus destes pacientes apresentou resistência, isto é, grandes reduções na susceptibilidade, a estes fármacos, conforme é mostrado na figura 2. É importante notar que os dois isolados de pacientes abrigam transições de aminoácidos diferentes no codão 215; T para F no isolado 20 e T para Y no isolado 21. Isto é uma marca distintiva representativa dos mutantes de resistência a MAT relacionados com resgate de iniciador.

Exemplo 2b O quadro 2 apresenta um VIH mutante relacionado com resgate de iniciador com os antecedentes genéticos M184V (um mutante discriminativo), que é tipicamente seleccionado pela terapêutica anti-retroviral muito comummente utilizada de AZT + 3TC (Combivir). 70

Quadro 2. Alterações genotípicas do isolado 19 de paciente relacionado com resgate de iniciador de MAT_

Número de Isolado Mutações características de MAT relacionados com resgate de iniciador 20 M41L, D67N, K70R, V118I, M184V, L210W, T215F, K219E e L228H

Conforme é mostrado na figura 3, os compostos da invenção, conforme medido pelo metabólico de plasma 2',3' — didesoxi, 3' -C-hidroximetil-p-D-eritropentofuranosilcitosina mais uma vez reteve a actividade contra o virus resistente, mostrando somente uma diferença de 1,78 vezes em susceptibilidade em comparação com o VIH do tipo selvagem. Ambos o 3TC e o AZT perderam actividade e mostraram potência reduzida (isto é uma redução pronunciada na susceptibilidade virai) ao virus de resistência (figura 3).

Exemplo 2c 0 desafio continuo de pacientes com agentes anti-retrovirais resultou na emergência do MDR. Uma mutação T69S com uma inserção de 6 pb entre os aminoácidos 68 e 70 na região do dedo de TR, com frequência, é visto em combinação com várias formas de MAT e contribui para uma actividade aumentada do resgate de iniciador. Foi escolhido um agrupamento de MDR (com formas diferentes de inserção de aminoácido) em combinação com MAT, conforme é mostrado no quadro 3.

Quadro 3. Alterações genotipicas nos isolados dos pacientes 31, 32 e 35 relacionados com resgate de iniciador

Número de Isolado Mutações características de MAT relacionadas com resgate de iniciador 31 T69S + inserção dupla de aminoácido SG em antecedentes genéticos de MAT, A62V, D67E e R211K 32 T69S + inserção dupla de aminoácido VG em antecedentes genéticos de MAT, A62V, D67G, V75I e T215I 35 T69S + inserção dupla de aminoácido VA em antecedentes genéticos de MAT, A62V, R211K, T215Y e L228H 71

Conforme é mostrado na figura 4, o composto da invenção inibiu estes isolados de paciente, produzindo a menor alteração na susceptibilidade do fármaco, em comparação com 6 antivirais de referência utilizados actualmente na terapêutica anti-retroviral convencional.

Note-se que uma redução pronunciada (500 a 1000 vezes) na susceptibilidade a AZT foi observada para os isolados 32 e 35 de pacientes, enquanto que o composto da invenção mostrou alterações de 2,79 e 4,29 vezes, respectivamente. Isto é consistente com o composto da invenção, apresentando um mecanismo diferente de inibição em comparação com os terminadores obrigatórios de cadeia de ADN representados pelos ITRN convencionais.

Exemplo 2d O isolado 4 representa um outro mutante discriminativo contendo o genótipo K65R + M184V num antecedente não essencial de MAT consistindo de mutações R211S e K219E. Este isolado provoca uma resistência cruzada típica a abacavir, 3TC e o nucleósido FTC aprovado recentemente, mas retém a sua susceptibilidade a análogos de timidina, tais como AZT e d4T. Este isolado não porta mutações típicas de resgate de iniciador, e, no entanto o composto da invenção ainda inibe este fenótipo virai como foi indicado por um valor FC de 3,88. Este valor é comparável aos análogos de timidina, AZT (FC = 1,11) e d4T (FC = 0,71), enquanto que foi encontrada uma resistência significativa para o 3TC (FC > 200), FTC (FC > 40) e até certo ponto ao ABC (FC > 9,0). Estes dados experimentais demonstram que o composto da invenção não porta somente propriedades únicas contra os mutantes de "resgate de iniciador", mas é também capaz de inibir mutantes de VIH da família discriminativa. Isto, portanto, contrasta com o mecanismo inibitório utilizado pelo 3TC e FTC, assim como o mecanismo parecido dos compostos de Í^C-etinilo nos quais M184V juntamente com uma alteração adicional de aminoácido no codão T165R na 72 região catalítica, contribui para a resistência cruzada ao nucleósido 4-C-etinilo (Kodama 2002).

Exemplo biológico 3

Actividade de 2 ' , 31-didesoxi-3-C-hidroximetilcitosina contra VIH resistente relacionado ao resgate de iniciador em PBMC. O desempenho anti-viral do composto da invenção contra os isolados adicionais de VIH resistentes relacionados com resgate de iniciador de MAT, foi ensaiado numa cultura de PBMC. Os isolados de VIH-1 foram gerados e expandidos até uma titulação elevada pelo cultivo conjunto de PBMC de paciente infectado com PBMC de dador estimulado por PHA (Manual de virologia para laboratórios de VIH ACTG). Os sobrenadantes isentos de células foram recolhidos, sequenciados, e armazenados em alíquotas a -70 °C para ensaios de susceptibilidade de fármacos.

Os ensaios de susceptibilidade de fármacos in vitro foram executados utilizando-se um método de consenso ACTG/DOD modificado (Manual de virologia para os laboratórios VIH ACTG). As PBMCs foram infectadas previamente com estoques virais durante 4 h a 37 °C numa atmosfera humidificada de 5 % de CO2 após 4 h de incubação. As células infectadas foram lavadas duas vezes em meio e pipetadas numa placa de microtitulação com 8 diluições do fármaco em série. Cada poço continha 100.000 PBMC pré-infectadas e todas as diluições de fármacos foram feitas com meio de cultura de célula. As diluições dos fármacos foram escolhidas para cobrir concentração inibitória de 50 % (CI50) para cada fármaco em separado. Os poços de controlo continham células e foram incubados vírus conjuntamente em cada placa.

Depois de uma incubação de 7 dias a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5 % de CO2, o crescimento virai foi determinado utilizando-se um ensaio de antigénio p24 nos sobrenadantes (Abbott Laboratories, Chicago, EUA) . A 73 inibição percentual do crescimento virai em comparação com o poço de controlo, que não continha nenhum fármaco, foi calculada e expressa como número de vezes de alterações (reduções na susceptibilidade dos compostos) comparado com o poço de controlo. 0 composto de referência AZT foi executado em paralelo com o composto da invenção.

Foi escolhido um agrupamento representativo dos vírus mutantes relacionados com resgate de iniciador que abrigam a caracteristica essencial das mutações TR resistentes a MAT relacionados com resgate de iniciador. As estirpes com mutações na posição M41L, D67N, K70R, L210W, T215Y/F e K219Q/E em várias combinações com ou sem o mutante discriminativo M184V foram utilizadas como é indicado no quadro 4.

Quadro 4. Genótipo relacionado com resgate de iniciador de MAT em 9 isolados de paciente

Número de Isolado Mutações característlcas de MAT relacionadas com resgate de iniciador 1295 M41L, D67N, K70R, V75M, V118I, M184V, L210W, R211K, T215Y e K219E 7086 D67N, T69N, K70R, V118I, L210W, T215Y e K219Q J12840 M41L, D67N, V118I, M184V, L210W, R211N, T215Y J10308 M41L, D67N, M184V, L210W, R211S, T215Y 7141 M41L, D67N, M184V, H208Y, R211K, T215Y, K219N J14007 D67N, T69N, K70R, M184V, H208Y, R211K, T215F, K219Q, L228H VA2 06 D67N, M184V, L210W, R211K, T215Y VA2 8 6 M41L, E44D, D67N, L74V, V118I, M184I, E203K, H208Y, L210W, R211K, T215Y A maioria destes mutantes de resgate de iniciador escolhidos conferiu uma resistência pronunciada à susceptibilidade do AZT, reduzindo em algumas centenas de vezes o valor de FC. A excepção foi o isolado 7086 (FC = 3,0), que porta a mutação de aminoácido T215V. Um relatório completo de valores de FC é apresentado na figura 5. Aqui, 74 a 2',3'-didesoxi- 3'-C-hidroximetilcitosina inibiu todos os 8 isolados, com o valor mais alto de FC sendo somente 2,7. 75

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante ou cuidado na sua elaboração, ou IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • EP 341911 A [0045] • WO 9206201 A [0045] • US 5612319 A [0046] [0047] [0048] • EP 2005057196 W [0049] • WO 9909031 A [0110]

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Petropoulos, CJ et al. Antimicrob. Agents Chem-other., 2000, vol. 44, 920-928 [0190]

Claims (18)

1 REIVINDICAÇÕES

em que: R1 é independentemente H, -OR3, -NHR1; alquilo Ci-C4; ou, quando n é 2, o R1 adjacente juntos definem uma ligação olefínica; R2 é H; ou quando o RI geminai é alquilo C1-C4, esse R2 também pode ser alquilo Ci~C4; ou quando o RI geminai é -OR3, esse R2 pode ser -C(=0)0H ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo; R3 é independentemente H, ou um éster farmaceuticamente aceitável do mesmo; R1 é independentemente H ou uma amida farmaceuticamente aceitável do mesmo; R2 é H; R6 é H; n é 1, 2 ou 3; e sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

2. Um composto, de acordo com a reivindicação 1, em que n é 1.

3. Um composto, de acordo com a reivindicação 2, em que R1 é H, OH ou um éster f armaceut icamente aceitável do mesmo. 1 Um composto, de acordo com a reivindicação 1, em que n 2 é 2. 2

5. Um composto, de acordo com a reivindicação 4, em que um primeiro R1 é H; e o segundo R1 é -OH ou -NH2, ou um éster ou amida farmaceuticamente aceitável do mesmo.

6. Um composto, de acordo com a reivindicação 5, com a fórmula: em que R5 reivindicação

definidos na

7. Um composto, de acordo com a reivindicação 4, denominado de 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro-1,5,10-trioxaciclopenta-ciclodeceno-6,9-diona; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

8. Um composto, de acordo com a reivindicação 1, em que n é 3 .

9. Um composto, de acordo com a reivindicação 8, denominado de 2-(4-amino-2-oxo-2H-pirimidino-l-il)-octahidro-1,5,11-ciclopentaciclo- undecenotrioxaciclopentaciclo-undeceno-6,10-diona, ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

10. Uma formulação farmacêutica que compreende um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, juntamente com um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 3

11. Um composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, para utilização como um medicamento.

12. Um composto, de acordo com a reivindicação 11, para utilização no tratamento ou profilaxia de VIH.

13. Um composto, de acordo com a reivindicação 12, em que o VIH é um VIH multi-resistente.

14. Um composto, de acordo com a reivindicação 13, em que a transcriptase reversa do VIH multi-resistente contém pelo menos uma mutação que permite que um fosfato de nucleótido ou nucleósido de terminação de cadeia obrigatória seja clivado da cadeia de ADN nascente através de excisão mediada por pirofosfato ou ATP. 15. 0 composto, de acordo com a reivindicação 14, em que a transcriptase reversa contém pelo menos um dos seguintes padrões genotípicos: (a) M41, ± D67, L210 e T215; (b) D67, K70 e K219; (c) T69S-XX; ou (d) A67 (deleção em 67).

16. Um composto, de acordo com a reivindicação 15, em que a transcriptase reversa contém pelo menos 3 mutações.

17. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecção por VIH.

18. Utilização, de acordo com a reivindicação 17, em que o VIH é um VIH multi-resistente. 4

19. Um composto, de acordo com a reivindicação 11, para utilização no tratamento ou prevenção de infecção por VIH.

20. Um composto para utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o VIH é um VIH multi-resistente.