CN101213198B

CN101213198B - 作为HIV抑制剂的1-[2′,3′-二脱氧-3′C-(羟甲基)-β-D-赤型环戊二烯并呋喃糖基]胞嘧啶衍生物

Info

Publication number: CN101213198B
Application number: CN2006800244086A
Authority: CN
Inventors: 周晓雄; C·萨尔伯格
Original assignee: Medivir AB
Current assignee: Medivir AB
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2006-07-05
Publication date: 2011-08-03
Anticipated expiration: 2026-07-05
Also published as: AU2006268743C1; EP1899352B1; ZA200710662B; ES2373743T3; HRP20110830T1; CY1112164T1; DK1899352T3; PL1899352T3; JP5174660B2; JP2008545002A; EP2336135A2; MX2008000221A; US8143396B2; PT1899352E; EP1899352A1; AU2006268743B2; HK1122798A1; AU2006268743A1; CA2610210A1; CN101213198A

Abstract

式(I)化合物及其药学上可接受的盐，具有在治疗或预防HIV，尤其是使专性链末端磷酸核苷或磷酸核苷酸被ATP-或焦磷酸-介导的切除从新生DNA链切除的逆转录酶突变体中的用途，其中：R¹独立为H₁-OR³、NHR⁴；C₁-C₄烷基；或者，当n是2时，相邻的R¹一起构成烯键；R²是H；或当偕位R¹是C₁-C₄烷基时，R²也可为C₁-C₄烷基；或当偕位R¹是-OR³时，R²也可为-C(＝O)OH或其药学上可接受的酯；R³独立为H，或其药学上可接受的酯；R⁴独立为H，或其药学上可接受的酰胺；R⁵和R⁶是H或胺前药部分，n是1、2或3。

Description

作为HIV抑制剂的1-[2′,3′-二脱氧-3′C-(羟甲基)-β-D-赤型环戊二烯并呋喃糖基]胞嘧啶衍生物

技术领域

本发明涉及新的双环四氢呋喃衍生物及其在治疗逆转录病毒例如HIV，尤其是药物逃避突变中的用途。

背景技术

不像其它HIV抗病毒药，例如，在它们的给药形式中的蛋白酶抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂、核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)在药理学上是无活性的，且需要经宿主细胞激酶的磷酸化作用产生活性三磷酸代谢物。该三磷酸形式类似天然存在的病毒逆转录酶的三磷酸脱氧核苷酸底物并为HIV-1 RT结合和合并成病毒DNA而竞争。

批准用来治疗HIV的所有NRTI和在专利或学术文献中提出的其它所有NRTI中的大部分都在核苷的核糖部分上缺乏3′-羟基官能团。实例包括齐多夫定(AZT)、司他夫定(d4T)、拉米夫定(3TC)、扎西他滨(ddC)、阿巴卡韦(ABC)、去羟肌苷(ddl)和替诺福韦(TNF)(后者典型地作为disoproxil富马酸盐前药给药)。一经磷酸化作用，这类核苷或核苷酸类似物经逆转录酶共价连结到新生DNA链中，但核苷或核苷酸中3′-羟基官能团的缺乏阻止其它核苷酸的进一步连接。因此，这些NRTI末端病毒DNA链延长，从而导致对HIV复制的抑制(Mitsuya等1990，Jacob Molina等1993，Reardon 1993)。

当前所有抗逆转录病毒治疗(ART)的基础都采用NRTI。然而NRTI只能延缓HIV在血液中的繁殖，目前已经不能根治患者的HIV。HIV通过将其DNA插入涉及人免疫学记忆的潜伏的宿主细胞起作用。这种感染方式暗示，患者被迫终生接受HIV抗病毒药，以防止然而，因为RT前-和后-移位中间体是瞬时和短暂的，并不易于经实验获取，在2002年底前，这难以被理解。

对RT移位理论的最新理解指出，RT催化的DNA聚合以图3中所示的详细的级联方式发生，这采用自Sarafianos等(2003)。这些步骤是

1)通过游离酶E定位3′-引物端的P位(引物位)与DNA底物结合。

2)接近N位(dNTP位)的dNTP结合形成″开放的″三元复合物。

3)经酶构象变化形成″封闭的″三元复合物。

4) dNTP的3′-OH引物末端和α磷酸间的磷酸二酯键形成伴随着焦磷酸(PPi)的释放，在N位形成前移位的RT复合物。

5)通过形成后移位的复合物，引物末端从N位移位到P位，该复合物是下一个dNTP结合和继续DNA合成的先决条件。

如果DNA链终止剂核苷(NRTI)三磷酸(典型地，在脱氧核糖部分上缺乏3′-羟基官能团的核苷类似物)被采用，它模拟其天然dNTP配对物并结合到RT。在类似的化学过程后，结合的NRTI在聚合的N位形成前移位复合物。由于在NRTI′s脱氧核糖部分上缺乏3′-羟基引物，这终止了更多的DNA合成。

相反，与TAM相关的RT突变采用与野生型RT不同的核苷酸结合机理。具体地，新机理导致释放(切除)结合于引物末端的NRTI，取消NRTI的链终止活性。该新机理取决于前移位状态(在N位)下的复合物的积聚和ATP或焦磷酸供体的有效性间的相互作用，这在感染部位，即正常淋巴细胞中通常是丰富的。

ATP或焦磷酸通常不参与病毒DNA-聚合反应，表达涉及TAM的耐药表型的RT结构促使它们进入与新结合的NRTI相邻的位置。前-和后-移位动力学类型间的平衡所产生的机理确保从引物末端到N位的自由通道，且还在结合NRTI链终止剂和释放焦磷酸后同时在P位结合焦磷酸供体ATP。当此发生时，ATP(或焦磷酸)进攻连接结合结束治疗后的HIV效价反弹。

然而，事实上，对给定患者的特定HIV药物的有效给药期受到出现的″逃避突变体″出现的显著限制。逃避突变体是包含不连续的突变簇的病毒，它产生耐药性并使其在药物的存在下增殖。由于患者摄入的特定抗病毒药的选择性压力，逃避突变体出现在患者中。因而，药物的有效给药期取决于逃避突变体的出现和增殖有多快。

在一贯开出HIV抗病毒药处方的国家中，HIV新病例的原发感染往往不带有野生型HIV，而带有已经部分或以多种方式抵抗目前的抗病毒药的HIV毒株，这正变得越来越明显。换句话说，在受感染患者中原位产生的逃避突变体也可通过横向或垂直传播被传播给初次感染的患者。这依次表明，即使以其它方式被分类为初次治疗的某些患者，也已经感染对常规一线治疗抵抗的病毒。

多种因素归因于药物逃避突变体的选择，包括总HIV池大小、RT加工能力和病毒基因复制的失真、病毒适应性和靶细胞的多种有效性。到二十世纪九十年代后期，来自基于齐多夫定(AZT)或司他夫定(d4T)的长期联合使用的证据表明，RT中的特定突变簇始终在产生。这些突变簇是目前称为胸苷类似物突变(TAMs)的原型。TAMs的存在增加进一步选择突变的可能性，并导致不明显属于胸苷类似物家族的更高级的NRTI抗性表型的发展。这类表型目前被称为核苷类似物突变(NAM)和多重耐药性(MDR)HIV。

NRTI耐药性的假说

AZT是被广泛采用的第一种抗逆转录病毒药，并不令人惊讶地首先产生逃避突变体(Larder等，1989)。然而，由于遍及典型患者分离株的HIV基因组的大量突变，采用带有特定TAM的重组RT酶不可能在体外产生耐药性表型。因而，并未明确阐明TAM赋予耐药性的机理。焦磷酸供体已经使对TAM耐药性背后的机理的各种假想模型和理论预言基于对亲核进攻的参与(Boyer等，2002和Meyer等，2002)。RT移位理论大概是理解涉及TAM的耐药性机理的关键步骤。在DNA末端的NRTI的磷酸二酯键，导致经焦磷酸解(pyrophosphorolysis)除去NRTI。当焦磷酸供体是ATP时，NRTI作为二核苷四磷酸产物被释放。图4图示在AZT-终止的DNA中的这种″引物拯救″(采自ClinicCareOptions^TM)。

目前认为，两种不同的机理涉及到NRTI的表型耐药性(Sluis-Cremer等，2000)。第一种，称为″引物拯救″活性，以上刚刚被描述。这里，链末端核苷酸经ATP依赖的或焦磷酸依赖的焦磷酸解作用从引物末端的3′端除去。然而，存在称为″有区别的突变体″的另一簇耐药性表型。这些突变体具有伴随增强的区别NRTI和天然dNTP的能力的RT。这种情况下，该机理产生能优先选择正确底物(即天然dNTP)的RT，从而避免经NRTI的链终止并确保病毒基因组的繁殖。

HIV中的突变的产生

逆转录病毒，例如HIV，具有快速的遗传差异性能力。这是一个有力的无效过程，但它给与有机体明确的适应优势。当有机体处于选择压力下，HIV所采用的复制机制特别易出错误，产生大量突变并有可能导致突变积聚。

一般说来，病毒复制所产生的大量突变生成更少活力的酶。这里，第二种且尤其是第三种突变的积聚的可能性更小，因为第二个突变必须积聚于其中的更少活力的突变体的群体池会被更快繁殖的野生型有机体稀释。

通过两种可能的途径可产生和发展更加有活力的病毒突变体。第一种途径出现在快速产生高度耐药性变异的时候，该变异已经存在于整个病毒群体中。最频繁地，这是给予对选择性压力的表型耐药性的单点突变。在药物逃避突变的上下文中，实例包括被非核苷逆转录酶抑制剂奈韦拉平快速介导的K103。

第二种途径出现于在选择性压力存在下出现连续的病毒复制的时候。这产生随后可发展的累积的突变积聚。在这种情况下，突变积聚的可能性涉及正在出现的病毒复制量。即，会出现更高的病毒负荷(例如，＞200,000个拷贝/ml)、双重突变的积聚。然而，三重突变的积聚是很少的，只可能因为典型地涉及几种不同的药物的复合治疗方案而出现，这对患者的坚持是个挑战。因此，即使是勤勉的患者要确保所有活性成分在每天″24小时低谷(trough)水平″的全部24小时期间以超过必需抑制浓度的水平存在于血液中也是极为困难的。这里，由于一种或多种药物的给药/24小时低谷水平的疏忽，临时除去药物治疗的任一种选择性压力会产生无法控制的病毒复制，从而产生和确立许多新的突变体。当一旦再次施加选择性压力(即恢复复合药物治疗)时，已经积聚了产生更好耐药性的另一个点突变的几个突变体可以类似于第一种途径(参见上文)中所见到的方式发展。

以上讨论集中于与例如，缺失或添加突变相对的点突变的积聚。然而，这里可适用类似于对三重突变所描述的模式。即，大部分缺失/添加突变最初涉及单一核苷酸。这具有完全改变编码蛋白的下游氨基酸序列的作用，如果该变化发生在编码区域内并产生被截短的和/或失活的蛋白。为通过缺失或添加一种单一氨基酸保持阅读框并改变最终蛋白，必须缺失/添加三种核苷酸。既然失活的酶降低HIV有机体活力，尤其是，如果受影响的酶是RT，缺失/添加本身不会积聚，但必须同时出现。换句话说，三重突变的等同物必须出现在单一事件中，这是极为罕见的(参见Boyer等(2004)J Virol 78(18)：9987-9997，其通过全文引用结合到本文中)。

作为三重突变体积聚/引入的过程的结果，并非直到较近期才确定，HIV病毒在RT中表现出的三种突变，其特别地对多种药物产生有效的耐药性。例如，在美国，正是在1992年FDA批准了使用联合药物治疗(ddC和AZT)。同样直到1995年9月，临床试验才表明，AZT与ddC或ddl的联合治疗比单独的AZT更加有效。采用多种药物只是采用联合治疗的结果，但在剂量方案方面，实际上不能保证各种药物的充分的24小时低谷水平，该结果已经产生目前西方世界已知的特别有问题的多重耐药性HIV病毒株。

引物拯救突变

最初描述的TAM引物拯救突变体包括在RT的氨基酸位M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y/F和K219Q/E的一组六种药物耐药表型中的各种排列(Larder和Kemp，1989，Schinazi等，2000)。早期资料指出发展多种TAM引物拯救突变体的两种特殊的突变途径，二者通过未知因素出现。第一种途径导致在密码子210(210W)的氨基酸取代并优先与在密码子41(41L；大于98％)和215(215Y；大于94％)的突变及在密码子67(67N)的取代相关。第二种途径在密码子219 (219K/E)产生突变，这优先与在密码子67(67N)和70(70R)的突变相关(Yahi等，1999)。因此，有两种表型模式：(1)L21 OW，M41L，T215Y/F，±D67N，其给予对AZT和d4T的高水平的病毒耐药性和(2)K219K/E，D67N，K70R，其给予对AZT和d4T的中等水平的病毒耐药性。

Marcelin等(2004)总结病毒学失败患者的涉及TAM引物拯救的突变的普遍性。这里，研究1098 RT序列，得到如图1和图2中所示的两种基因模式。虽然在治疗前可能已经表现出不同的遗传背景，但与个体的药理学差异相结合时，所采取的抗逆转录病毒治疗的顺序和组合物不仅对AZT和d4T也对其它NRTI产生病毒耐药性。取决于所出现的突变方式，耐药性包括阿巴卡韦(ABC)、去羟肌苷(ddl)、替诺福韦(TNF)、拉米夫定(3TC)、恩曲他滨(FTC)和扎西他滨(ddC)。因此，引物拯救相关TAM的出现往往在进一步发展更显著的耐药HIV基因型模式方面起重要作用。从而，预防多种核苷抗性的一个步骤是开发带有避免引物拯救相关TAM积聚的目的的新NRTI。

引物拯救相关TAM突变可伴随着典型地出现于抗逆转录病毒联合治疗(另称为合剂(cocktail)治疗)的其它家族的逃避突变体的发展。如今，合剂″可比韦(combivir)″(AZT+3TC)被最频繁地使用，并被推荐为治疗未接受过治疗的HIV患者的第一线的治疗方案。然而，它产生对这两种药物抵抗的逃避突变体。例如，Miller等(1998)报道，具有M 184V突变的耐3TC的病毒仅在AZT+3TC联合治疗开始的4-12周被选择。额外的与AZT相关的突变及时地逐渐出现，产生特有的M184V、M41 L、D67N、K70R、L210W、T215Y/F和K219Q/E的基因型模式，其目前通常发现于经过治疗的患者中。所报导的在RT的H208、R211和L214位(Sturmer等，2003)和在G333位(Kemp等，1998)的其它突变涉及AZT-3TC双重耐药性，尤其是，使抗AZT的能力增加。因此，引物拯救相关TAM的前后基因型已经被扩展到包括在M184V，M41L，D67N，K70R，H208Y，L210W，R211K，L214F，T215Y/F，K219Q/E和G333E内的排列。

在接受过治疗的患者中通常见到的其它类型的突变是V1181和E44D/A。这些突变与先前暴露于ddl和d4T极为相关。此外，它们往往与包括M41L加T215Y/F或D67N加L210W的特定TAM簇的出现相关。结果是，引物拯救相关TAM对胸苷类似物家族的耐药性增加以及在对AZT+3TC的双重耐药性方面的特殊作用(Montes等，2002，Girouard等，2003)。

作为治疗过程中所采用的一些NRTI的功能，药物逃避突变体的流行增加，并形成包含在M41L、E44D/A、D67N、K70R、V118I、M184V、H208Y、L210W、R211K、L214F、T215Y/F、K219Q/E和G333E内的各种排列的扩展的TAM或NAM谱。该簇对含有AZT和d4T的联合治疗也往往是难医治的，并对整个NRTI类交叉耐药。

在往往与伴随TAM的T69G的氨基酸取代相关的RT指状区中，在位置67(▲67)具有氨基酸缺失的逃避突变体中也发现对抗胸苷类似物，特别是AZT、d4T和TNF的显著抗性(参见Imamichi等2000和2001)。议与特定基因型相关的增强的RT聚合活性被认为导致更加有效的焦磷酸解作用依赖的引物切除(上文已叙述)，引起增加的耐药性。Boyer等，(2004)也已经注意到伴随着TAM的▲67产生增加的能力，与单独TAM相比，促进引物拯救(切除)病毒对AZT和TNF的耐药性。

HIV正随抗逆转录病毒治疗发展而共同进化。当双重和三重核苷类似物合剂被用于HIV的临床治疗，尤其是在治疗初次接受治疗的患者时，新的突变表型出现。需要在一天内摄取多种药物，有些与食物一起，有些不与食物一起的复合治疗方案对患者是个挑战。主要由于获得NAM或MDR的病毒，不能严格遵守这些剂量方案导致24小时低谷的失败已经促使多种耐NRTI的HIV病毒的出现。例如，多个团体(例如，Mas等，2000)已经注意到与AZT使用有关的突变体T69S-XX病毒的出现。这种突变体在核酸给定的氨基酸69和70之间的其RT的编码区域中具有6-bp插入。所生成的双氨基酸插入复合物(典型地SS、SG或AG插入)不仅导致病毒对AZT的耐药性，而且还对包括d4T，3TC，ddl，ddC和ABC的NRTI，以及TNF的几乎全部集合的耐药性。伴随T69S+双氨基酸插入物，尤其是在TAM的存在下，可见到增强的焦磷酸解作用依赖的引物拯救。这种现象典型地与″M41L/T215Y″或″M41L/L210W/R211 K/L214F/T215Y″耐药表型相关，且在多种核苷抗性方面起到重要的表型作用(Meyer等，2003)。

另一类MDR具有在密码子Q151 M处的氨基酸取代。以相对低的频率在临床上观察到这种突变，且它往往与A62V、V75I、F77L和F11 6Y的继发突变一起出现。然而，它对几乎整个类型的NRTI产生显著抗性。此外，已经观察到与TAM，典型地″M41L、L210W和T215Y/F″或″D67N、K70R和K219K/E″基因型相关。它出现于经历过用AZT/ddl和AZT/ddC联合方案的过度治疗的患者。

L74V最常为ddl单一治疗所选择(Martin等，1993)并表现出对ABC和3TC的交叉耐药性。它对产生病毒逃避的作用取决于其它突变的出现。耐药性研究表明，L74V的频繁性显著与典型地在M41L、L21 OW和T215Y/F背景中的TAM相关(Marcelin等，2004)，即使L74V突变被认为对病毒复制产生减少作用并使含有大量TAM的耐AZT病毒敏感(St.Clair等，1991)。HIV-1 RT中的L74V和M184V突变组合是与对ABC和ddl的抵抗有关的最频繁方式(Harrigan等，2000和Miller等，2000)。

尽管高水平的对ABC的抗性典型地需要包含K65R、L74V、Y115F和M184V的多种突变，但单一的突变，M184V常常首先出现。这种突变，目前公认为药物逃避耐药性判别机理中的关键突变，使对ABC的敏感性适当减少(Tisdale等，1997)。全部562位患者随机接受带有ABC或ddl的AZT和3TC的CNA3005研究表明，携带AZT和3TC加ABC分支(arm)中的TAM的患者比例缓慢却稳定增加。48周后，至多56％的患者具有超过和超出快速介导的M 184V突变(Melby等，2001)的至少一种引物拯救相关TAM(1xTAM)，说明预防引物拯救相关耐药性出现的重要性。同样地，在3TC选择性压力下，携带基因型模式67、70、215和219的抗AZT病毒的体外通道导致M 184V突变的选择和赋予对ABC的交叉耐药性(Tisdale等，1997)。这再次强调这个概念：处理预先存在的引物拯救相关TAM和预防引物拯救相关突变体的积聚是避免多种核苷耐药性发展的关键步骤。

已经更加清楚，K65R以极高的的比例快速出现于正接受TNF或ABC治疗的患者中。Valer等(2004)报道，在他们马德里医院中，K65R普遍从1997-2000年间的＜1％增加到2003年的7％和2004年前4个月的12％。在与对ABC、3TC、ddl和ddC的减少的敏感性相关的其它突变存在下，K65R突变体的作用被加强(Parikh等，2003)。目前同时出现的引物拯救相关TAM基因型的K65 R，虽然很少出现，但其对TNF的引物拯救(切除)的影响比对AZT的更加深远(Naeger等，2001)。据报道，TNF是抗携带至多3xTAM的HIV-1活性的，除非TAM簇包括M41L或L210W突变。目前，仍不清楚TAM能够逆转K65R的部分影响的原因，这另外被认为阻止了涉及对TNF和ABC的敏感性的引物切除突变体。

最终，T69D突变最初因其引起ddC耐药性而被鉴别。已经报道，当它出现在与T215Y突变和引物拯救相关TAM基因型的其它突变组合中时，与对ddl的减少的响应相关。

多年来，WHO和DHHS(美国健康和人类健康服务部)已经为治疗从未接受过治疗的患者推荐一线抗逆转录病毒疗法，包括与3TC加奈韦拉平或依法韦仑一起以d4T或AZT给药(Guidelines for the Useof Antiviral Retroviral Agents in HIV-1-Infected Adults and Adolescents，2003年7月14日和2004年3月23日)。然而，大部分HIV感染的患者在他们的初次高活性抗逆转录病毒治疗(HAART)方案中经历过治疗失败，表明这些患者已经感染药物逃避病毒。引物拯救相关TAM耐药性突变体继续在耐药性的发展方面起关键作用。因此，抵制引物拯救相关TAM耐药性突变体作用的药物或治疗方法的开发能加强或延长治疗从未接受过治疗的患者的现有NRTI的使用，并还能用来治疗抢救治疗中携带引物拯救相关耐药性突变体的HIV感染的人群。

预防/抑制引物拯救突变体的药物方案

主要因为目前的治疗方案，引物拯救和有区别的突变往往同时出现在相同突变体基因型中。M 184V突变是不同的突变体家族的代表。然而，如果它与引物拯救相关突变体，例如，M41L、D67N、K70R、L210W、T215Y/F和K219Q/E一起出现，它起到对AZT和3TC的双重耐药性作用(Miller等，1998)。

这些引物拯救和不同的耐药性表型似乎与RT中不同簇的突变相关。例如，涉及AZT的突变包括在M41L、E44D/A、D67N、K70R、V118I、M184V、H208Y、L210W、R211K、L214F、T215Y/F、K219Q/E和G333E之内的各种排列，带6-bp插入物和▲67的MDR T69S突变典型地表现出引物拯救突变体活性。另一方面，在65、74、89、151和184位的突变产生区别NRTI和各dNTP配对物的能力，或者它们可涉及引物-模板复合物的复位(repositioning)。

在最近的文章″Designing anti-AIDS drugs targeting the majormechanism of HIV-1 RT resistance to nucleoside analog drugs″(IJBCB36 (2004)1706-1715，其通过全文引用结合到本文中)中，Sarafianos等推断，引物拯救(切除)机理只能出现在N位的RT移位之前，并进一步推断，它已成为NRTI耐药性性的主要机理。在标题为″StrategiesforInhibition of the Excision Reaction″(参见1711页)的章节中，他们提出战胜这种耐药性机理的三种途径：

1.采用大概通过在或接近ATP-结合位点的结合，干扰ATP的生产的结合(在P位)的新的抗病毒药，从而阻断切除反应，而不影响DNA合成的向前反应。

2.采用能阻断DNA合成但以某种方式抵抗切除的化合物，例如，现有NRTI的硼代(borano)或硫代取代的α磷酸变体。同样地，可按非切除方式设计现有NRTI的变体以复位延长的/终止的模板/引物，3TC介导的M184I/V突变体的差的切除能力暗示这一点。

3.采用基于二核苷酸四磷酸的抑制剂，提供在N和P位的双配位基的结合。

针对NRTI耐药性的预防引物拯救机理所提出的三种途径的每一种都因各种理论缺陷公开受到批评。例如，在第一种途径中，对正常的RT功能，ATP结合并非必需的。因此，基于通过竞争或阻止抑制ATP或焦磷酸结合的对策不会预防耐药性发展，因为潜在的病毒的适应性将不会受这类药物的损害。换句话说，耐药性突变完全不以进化代价出现。出现在正常淋巴细胞中的大量ATP也挑战该途径背后的基本原理。

在提出的第二个途径中，硼代或硫代取代的α磷酸类似物似乎可能会选择已经发现带有3TC和FTC的区别的耐药突变体，和产生HIV耐药性突变体。

所提出第三个途径受到进入大和高注入的四磷酸二核苷酸类的靶细胞的药动学摄取的需要的限制。这对制药和药物传递是个严重的挑战。

值得关注的是，Serafaniano的各个途径(包括本身不抗病毒，但却预示常规NRTI的共同给药的途径1)是以目前产生的NRTI的变体为基础的。即是说，该化合物缺乏3-羟基官能团并因而起到专性链终止剂作用。

作为与上文讨论的″标准″NRTI(即缺乏3′-羟基官能团的那些)的对照，Ohrui等(J Med Chem(2000)43，4516-4525，其通过全文引用结合到本文中)描述了4′-C-乙炔基HIV抑制剂：

式I

这些化合物保留3′-羟基官能团，却仍表现出抗HIV-1活性，包括抗携带A62V、V75L、F77L、F116Y和Q151 M突变的典型的不同的MDR株的活性。假定作用机理经过对核苷磷酸化激酶的亲合。然而，还观察到，由于这些化合物的新戊基醇特性和邻近顺4′取代基的严重位阻，它们可起到DNA链终止剂的作用，这导致3′-羟基的反应性急剧下降。

Kodama等(Antimicrob Agents Chemother(2001)1539-1546，其通过全文引用结合到本文中)描述携带接近所保留的3′-羟基官能团的4′-C-乙炔基的极为类似的一批化合物，它们在细胞培养基中用另外的HIV耐药株试验。由于Kodama等没有制备他们的化合物的三磷盐，他们不能说明作用机理，但从各种依照情况的观察，推断这些化合物实际上起到NRTI的作用。Kodama等稍后报道(摘要388-T，2003 9^thConference on Retroviruses and Opportunistic Infections，其通过全文引用结合到本文中)，在它们的体外4-C-乙炔基核苷的选择性压力下，发现突破携带定位于RT催化位的T165I和M 184V突变的耐药HIV。这种突变体表型显然是不同类型的突变且对3TC具有严重的交叉耐药性。因而暗示空间冲突阻断4-C-乙炔基核苷结合。这已被3TC抑制机理所确定并因而几乎必然地表现不同的耐药机理。因此，在确定突变体促进引物拯救(ATP或焦磷酸介导的切除)方面，Kodama的化合物似乎不可能提供指导。

Chen等(Biochemistry(1993)32：6000-6002，其通过全文引用结合到本文中)对在4′携带叠氮基的结构上相关的系列化合物进行广泛的机械论研究：

式II

Chen论证RT有效地结合两个连续的4′-叠氮基胸苷一磷酸核苷酸，其末端链延长。此外，RT也能结合第一个4′-叠氮基胸苷一磷酸，随后是天然dNTP，然后是第二个4′-叠氮基胸苷核苷酸，这也导致链终止。注意到，这两种都导致4′-叠氮基胸苷一磷酸存在于终止的DNA引物末端，这使人容易想到目前的NRTI的抑制机理。细胞的(即，非病毒)聚合酶α和β各能结合单一4′-叠氮基核苷酸也是显然的。但不是第二个进入宿主DNA的初生链。然后这些细胞聚合酶用其它天然dNTP使宿主DNA链延长，并这样永久地使NRTI核苷酸结合进宿主DNA基因中。因为非天然核苷酸与细胞酶的错参已经清楚暗示致癌作用，所以没有追踪人的这些化合物。同样地，Kodama相应的4′-C-乙炔基化合物的制药开发被终止，照其说法是由于对高级有机体的严重毒性。

EP 341 911描述具有下式的3′-C-羟甲基核苷的大家族，

式III

并提出它们的不仅主要抗疱疹病毒，例如CMV，还抗逆转录病毒的用途。WO92/06201也公开类似的一组化合物和适应症。

US 5,612,319(其通过全文引用结合到本文中)公开抗野生型HIV-1_IIIB和HIV感染的急性狝猴模型中的猿猴同等物SIV-1的2′-3′二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶的逆转录病毒活性。该出版物建议用该化合物作用暴露后的预防药物，尤其是防针刺损伤。暴露后预防意味着立即以活性成分向人们，例如，已经用HIV潜在感染的注射器无意刺到他们自己的医疗人员给药。为了确保快速治疗受可理解惊扰的健康护理专业人员，优选的给药途径是，例如，用作化学和生物战的抗菌药的自我给药的装有弹簧的注射器。

暴露后预防的意图是预防感染以保护自身安全，而不是治疗正在进行的感染。因此，打算用极高剂量的化合物进行短期，例如，24-48小时的治疗。该出版物指出，由于给药的不连续时间期间，瞬时毒性是可以接受的，因为人们正试图预防不能治愈的疾病。描述于US 5,612,319的暴露后预防方法从未有人试验过-事实上据我们所知，2′-3′二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶还完全没对人给药。

在1994年，当提交被授权的US 5,612,319的申请时，如今已知的多重耐药性HIV还没有以任何令人信服的方式出现。今天的多重耐药性HIV具有经多年NRTI治疗的选择性压力所介导的和积聚自这种压力的引物拯救突变。换句话说，存在于这些专利被授权期间的HIV和尤其是RT在结构和机械学上与现今的病毒极为不同。

在本申请的优先权日未出版的国际专利申请PCT/EP2005/057196，公开2′，3′-二脱氧-3′-羟甲基胞嘧啶及其前药在治疗HIV逃避突变体方面的用途。

据认为，2′，3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶被细胞酶磷酸化为相应的5′-三磷酸。多重耐药性HIV的严重突变的RT，尤其是引物拯救相关突变体RT，将该三磷酸作为5′-(2′，3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶)一磷酸结合到新生DNA链中。

常规NRTI起到专性链终止剂的作用，终止N位的DNA合成，并因而对只有多重耐药性HIV才有的上述ATP-或焦磷酸介导的引物拯救(切除)机理敏感。相反，5′-(2′-3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶)一磷酸不起专性链终止剂作用，而是使另外的残基共价连接到5′-(2′，3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶)一磷酸的3′羟甲基官能团上。于是这促进RT经历必需的转变，将自身移位入下一轮聚合的P位。初步的证据表明，所连的这种末端残基是天然核苷酸而不是另外的5′-(2′，3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶)一磷酸。

重要地，资料表明，最后结合的非2′3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶核苷酸不适于通过突变的逆转录酶进一步加入核苷酸中。即，链终止似乎产生本发明的NRTI之外而不是在NRTI上的一种碱。此外，根据2′，3′-二脱氧-3′-羟甲基胞嘧啶的结合，RT表现出成功地移位到P位，以接受下一个引入的核苷酸。该证据表明，与引物拯救相关突变的RT结合的2，3-二脱氧-3′-羟甲基胞嘧啶，实现不适于ATP-或焦磷酸介导的切除的链终止形式。因而，2′，3′-二脱氧-3′-羟甲基胞嘧啶带来对当前药物方案不响应的HIV感染的有效治疗。

因此，以上刚刚讨论的抑制机理从根本上不同于Chen等(见上)的4′-取代核苷的链终止机理，链终止机理允许依照结合的4-取代的化合物结合几种核苷酸。首先，Chen机理大大增加了″通读″风险。即，DNA聚合酶继续遵循编码链和继续将编码残基加到正常终止密码子中，从而在DNA链中错误掺入不正常核苷。然而，既然通读构成物可能仍然是可行的，而不管错参的4′-取代核苷，当病毒DNA链通过病毒聚合酶(即RT)构成时，可能失去抗病毒功效。更重要地，如果4′-取代核苷被细胞(即宿主)聚合酶通读，如Chen描述的那样，其后所生成的构成物代表致畸物(teratogen)并大大增加细胞损伤和癌症的风险。

Chen的化合物又需要加入第二个4′-取代核苷酸，或者直接邻近于第一个错参的4′-取代核苷酸(即，X-X)或被一种天然核苷酸插入(interspersed)(即，X-N-X)。实际上，这意味着，在引物末端的最后位置的核苷酸是非天然的(即，药物)核苷酸。这种情况类似于典型的NRTI(即，缺乏3-羟基的那些)链终止的情况。这里，如上所述的那样，NRTI核苷酸也存在于引物末端的最后位置，其中它对ATP或焦磷酸介导的切除敏感。

为了起到有效RT抑制剂的作用，需要多个单元的Chen的4′-取代核苷酸。因而，该药物的效果取决于阅读链的序列。例如，如果Chen的化合物是胸苷类似物，如果阅读链具有AA或A-N-A序列，那么它会具有最好的亲合性。这里，该药物会有效和收效地终止DNA合成。但如果阅读链的序列不含有AA或A-N-A序列的大量表达(recitals)，则Chen的药物更少可能以给定的浓度终止DNA合成。既然在基因组中，AA双重或A-N-A三重远较单重A罕见，Chen的药物就会远比不具有多个单元需求的其它NRTI更无效。

Mauldin等Bioorganic and Medicinal Chemistry 1998 6：577-585公开许多2′，3′-二脱氧-3′-羟甲基胞嘧啶前药。特别关注的是事实：作者发现，在他们的几乎全部实验中，涉及在醇位的取代基的前药导致抗病毒活性的下降。

本发明的目标是，提供用于治疗HIV，尤其是治疗HIV逃避突变体的2′，3′-二脱氧-3′-羟甲基胞嘧啶的新的前药。

发明简述

根据本发明的第一方面，提供具有式I的新的化合物及其药学上可接受的盐：

其中：

R¹独立为H、-OR³、-NHR⁴；C₁-C₄烷基；

或者，当n是2时，相邻的R¹一起限定烯键；

R²是H；

或当偕位R¹是C₁-C₄烷基时，R²也可为C₁-C₄烷基；

或当偕位R¹是-OR³时，R²也可为-C(＝O)OH或其药学上可接受的酯；

R³独立为H，或其药学上可接受的酯；

R⁴独立为H，或其药学上可接受的酰胺；

R⁵是H、-C(＝O)R⁷，或酰胺-键接的L-氨基酸残基；

R⁶是H；

或R⁵和R⁶一起限定亚胺＝CR⁸R⁸′；

R⁷是C₁-C₆烷基、C₀-C₃烷基环基；

R⁸和R⁸′独立为H、C₁-C₆烷基、C₀-C₃烷基环基；

或R⁸是H和R⁸′是-NR⁹R⁹′；

R⁹和R⁹′独立为H、C₁-C₆烷基、C₀-C₃烷基环基；或R⁹和R⁹与它们所连的N原子一起限定饱和5或6元环；n是1，2或3。

根据本发明的一个实施方案，n是1和该化合物具有通式：

本实施方案中R¹∶R²的优选变量包括

H∶H、H∶OH或其药学上可接受的酯和Me∶Me。

该实施方案的特别优选的变量的R⁵和R⁶为H。

本发明的一个供选择的实施方案的n＝2，从而产生下列通式的化合物：

在该实施方案中，R¹a∶R¹b∶R²a∶R²b的优选的变量包括

H∶H∶H∶H

H∶H.H∶OH或其药学上可接受的酯

H∶H∶H∶NH₂，或其药学上可接受的酰胺

H∶OH或其药学上可接受的酯：∶H∶H

H∶NH₂，或其药学上可接受的酰胺：∶H∶H

Me∶Me∶H∶H

H∶H∶Me∶Me

H∶OH∶H∶OH

H∶C＝C∶H

该实施方案特别优选的R⁵和R⁶变量为H。

具有下列通式的本发明的又一个实施方案的n等于3∶

R¹a∶R²a∶R²a∶R²b∶R¹c∶R²c的优选变量包括

H∶H∶H∶H∶H∶H

H∶H∶Me∶Me∶H∶H

H∶H∶OH∶H∶H∶H

H∶H∶OH∶COOH∶H∶H

H∶H∶H∶H∶H∶NH₂

或其药学上可接受的酯或酰胺。

该实施方案特别优选的R⁵和R⁶变量为H。

本发明的某些实施方案具有修饰的碱，即R⁵和/或R⁶不是氢。一个这样的实施方案是亚胺，其中R⁵和R⁶一起定义为亚胺＝CR⁸R⁸。R⁸和R⁸′典型地各自为相同的烷基，但不对称的R⁸/R⁸′变量也在本发明的范围内。该实施方案中的代表性亚胺包括：

＝CHN(CH₃)₂

＝CHN(ipr)₂

＝CH N(pr)₂

作为选择，R⁸和R⁸′可一起限定环状基团，例如，吡咯烷、哌啶、哌嗪、N-甲基哌嗪或吗啉，因而典型的亚胺包括：

＝CHN(CH₂)₄

＝CHN(CH₂)₅

＝CHN(CH₂)₆

＝CHN(CH₂CH₂)₂O

普遍优选，R⁵和R⁶是H。

其中R⁵和R⁶不是H的本发明其它实施方案包括酰胺，例如，L-氨基酸酰胺，例如，lle、Val、Leu或Phe酰胺。作为选择的酰胺包括烷基酰胺例如，C₁-C₆烷基酰胺，例如，其中R⁵是C(＝O)CH₃、C(＝O)CH₂CH₃或C(＝O)C(CH₃)₃的那些酰胺。其它酰胺包括C(＝O)C₀-C₃烷基芳基酰胺，例如，C(＝O)Ph或C(＝O)Bz。

通常优选的实施方案包括式I化合物，所述化合物指

2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，10-三氧杂环戊二烯并-环癸烯-6，9-二酮；或

2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，11-三氧杂-环戊二烯并环十一碳烯-6，10-二酮；

或其药学上可接受的盐。一经体内水解，这些化合物释放无毒副产物，例如，琥珀酸或戊二酸。

尽管不希望囿于理论，但仍认为本发明的化合物或其活性代谢物具有抑制逆转录病毒，例如，HIV-1、HIV-2、HTLV和SIV的逆转录酶的活性。

因此，本发明另一方面提供人或动物的逆转录病毒感染的预防或治疗方法，包括给予式I化合物或其药学上可接受的盐。典型的给药是口服。

本发明的又一方面提供式I化合物或其药学上可接受的盐在治疗或预防人或动物的逆转录病毒感染的药物的制备方面的用途。该药物一般呈适于口服的形式。

本发明的另一实施方案提供抑制HIV引物拯救突变体出现或传播的方法，该突变体能够除去结合到HIV引物/模板复合物的链终止NRTI核苷酸，其中的除去受到ATP依赖的或焦磷酸依赖的切除机理的影响。该方法包括同时或相继给予感染HIV的个体有效量的本发明化合物和至少一种诱发引物拯救突变体的链终止剂NRTI。

常规的NRTI起到专性的链终止剂的作用，终止N位的DNA合成，并因而对只有多重耐药性HIV才有的上述ATP-或焦磷酸介导的引物拯救(切除)机理敏感。相反，初步证据表明，本发明化合物未起到专性链终止剂的作用，而是使另外的残基共价连至5′-(2′，3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶)一磷酸的3′羟甲基官能团上。这因而促进RT经过必需的转变，为下一轮聚合而自身移位进入P位。基于下述模板的序列的初步证据表明，该所附末端残基是天然核苷酸。

通常能被治疗或预防的根据本发明的多重耐药性HIV典型地具有携带包含下列之一的基因模式的RT

(a)M41，±D67，L210和T215；

(b)D67，K70和K219；

(c)T69S-XX或

(d)▲67

其中XX表示加到RT序列中的任何两个天然氨基酸和▲67表示在密码子67的氨基酸缺失。

尽管以上4个基因模式被认为表示切除药物逃避表型的必要基础，显然采用本发明所治疗或预防的突变体典型地会包括在RT基因和其它地方的额外的突变，在RT基因中往往有至少三种突变。

一般，但不排他地，簇M41、±D67、L210和T215往往会包含M41L、±D67N、L210W和T215Y或T215F。

任选地，上述各簇可进一步包括在位置E44、K70、V118、H208、R211K、L214、K219或G333的至少一处的额外突变。

上述各簇可进一步包含在位置▲67、T69、E203、L210、D218、H221、D223或L228的至少一处的额外突变。

一般，但不排他地，簇D67、K70和K219包含D67N、K70R和K219Q或K219E。

任选地，簇D67、K70和K219可进一步包括在位置M41、E44、V118、H208、L210、R211K、L214、T215或G333的至少一处的额外突变。

此外，簇D67、K70和K219任选进一步包括在位置▲67、T69、E203、L210、D218、H221、D223或L228的至少一处的额外突变。

一般，但不排他地，簇T69S-XX可进一步包括在位置M41、E44、D67、K70、V118、H208、L210、R211K、L214、T215、K219或G333的至少一处的额外突变。

任选地，簇T69S-XX可进一步包括在位置▲67、T69、E203、L210、D218、H221、D223或L228的至少一处的额外突变。

一般，但不排他地，簇▲67可进一步包括在位置M41、E44、D67、K70、V118、H208、L210、R211K、L214、T215、K219或G333的至少一处的额外突变。

任选地，簇▲67可进一步包括在位置T69、T69S+XX、E203、L210、D218、H221、D223或L228的至少一处的额外突变。

任选地，逆转录酶可进一步携带在位置K65、L74、M184或Q151，尤其是K65R、L74V或M184V或Q151M的至少一处的有区别的突变。

典型地，不同的突变体的簇可在位置A62、V75、F77、Y115或F116与至少一个额外的突变相连。

能被本发明处理的HIV株是多重耐药性HIV株，它们的RT具有促进链终止NRTI核苷酸的ATP-或焦磷酸-介导的引物拯救(切除)的突变，这种突变出现在以前曾用选自以下的至少一种抗病毒药治疗HIV的患者中：齐多夫定(AZT、ZDV)、司他夫定(d4T)、扎西他滨(ddC)、去羟肌苷(ddl)、阿巴卡韦、(ABC)、拉米夫定(3TC)、恩曲他滨(FTC)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(BMS 200475)、阿洛夫定(FLT)、替诺福韦disoproxil富马酸盐(TNF)、amdoxavir(DAPD)、D-d4FC(DPC-817)、-dOTC(SPD754)、SPD-756、racivir、D-FDOC或GS7340。

作为选择，HIV株是在已经接受这样的耐药或多重耐药性HIV株的患者中发现的那些株，它们直接或间接地来自经选自上述NRTI抗病毒药的至少一种抗病毒药持续治疗使自身介导出耐药或多重耐药性HIV株的另一个体。与野生型相比，在病毒RT中，多重耐药性HIV株往往含有至少三种突变。

因此，显然，本发明的方法和组合物可用作目前的抗逆转录病毒治疗，例如，HAART的一种补充，或者在某些情况下，作用拯救或抢救治疗。这是一种典型的情况，其中多重耐药性HIV已经被患者的早期抗逆转录病毒药物治疗史引入现有患者中。作为选择，本发明的方法和组合物将典型地在已经出现突变的多重耐药性株的原发HIV感染的那些患者中组成一线治疗。下列抗病毒药往往诱导具有RT引物拯救突变的这类多重耐药性HIV株，其促进链终止NRTI核苷酸的ATP-或焦磷酸-介导的切除：

齐多夫定、拉米夫定或组合剂型可比韦或Trizivir；

拉米夫定、阿巴卡韦或组合剂型Epzicom；

替诺福韦、恩曲他滨或组合剂型Truvada。

尽管这些药物常常诱导这类多重耐药性HIV株，但该药品名单不是唯一的。

因此，为预防具有RT引物拯救突变的一种或多种多重耐药性HIV株的出现，而这种突变促进链终止NRTI核苷酸的ATP-或焦磷酸-介导的切除，显然应给予本发明化合物。甚至与诱导这类突变的NTRI药物同时给药的时候，也会产生预防作用。

本发明的第三方面提供包含式I化合物和至少一种链终止剂NRTI的呈单位剂型的药用组合物，其中持续给予NRTI诱导HIV RT引物拯救突变并恢复DNA合成，这种突变促进从引物/模板复合物的3′-末端结合的NRTI一磷酸的ATP依赖或焦磷酸依赖性切除。

本发明的药用组合物和本发明的方法的优选实施方案包括其中的NRTI选自齐多夫定(AZT、ZDV)、司他夫定(d4T)、扎西他滨(ddC)、去羟肌苷(ddl)、阿巴卡韦、(ABC)、拉米夫定(3TC)、恩曲他滨(FTC)、阿德福韦(ADV)、恩替卡韦(BMS 200475)、阿洛夫定(FLT)、替诺福韦disoproxil富马酸盐(TNF)、amdoxavir(DAPD)、D-d4FC(DPC-817)、-dOTC (SPD754)、SPD-756、racivir、D-FDOC或GS7340及其组合的那些组合物和方法。

特别优选的实施方案包括其中的NRTI选自：齐多夫定、司他夫定、去羟肌苷、拉米夫定、阿巴卡韦、替诺福韦、恩曲他滨或其组合的那些实施方案。

使用HIV药物，尤其是HIV逆转录酶抑制剂的经验进一步强调，非最佳的药动学和复方剂量方案很快导致不经意的依从性失败。这依次意味着，在一日的大部分时间内，HIV方案中的各种药物的24小时低谷浓度(最小血浆浓度)往往下降至低于IC₉₀或ED₉₀。认为，至少IC₅₀和更实际地，IC₉₀或ED₉₀的24小时低谷水平对减缓药物逃避突变体的发展是重要的。

典型地以与所期望的持续和延长的抗逆转录病毒治疗相当的剂量，给予患者本发明化合物。因而，该治疗方案旨在确保限定的药物水平，还要避免毒性，尽管暴露后预防治疗需要耐受一些短暂的毒性，但以高剂量快速使用式I化合物是可以接受的。式I化合物的典型给药量介于1-25mg/kg/日，优选少于10mg/kg/日，优选介于0.05-0.5mg/kg/日。适当剂量将取决于适应症和患者，并易于通过常规的动物药物代谢和药动学(DMPK)或临床试验和in silico预测软件确定。

本发明的单位剂量药用组合物具有相应量的式I化合物，典型地针对60kg或75kg成人划分，并对QD、BID或TID剂量方案任选分成一次、两次或三次。如果治疗剂量介于0.05-0.5mg/kg/日，那么临床QD剂量/人/日对60 kg成人为3mg-30mg或对75kg成人为3.75-37.5mg。在本发明的联合剂量单位药用组合物方面，额外的常规NRTI剂量和方案限制可以以QD、BID或TID给药为条件。

本发明包括药学上可接受的盐，例如，有机酸尤其是羧酸的盐，包括但不限于乙酸盐、三氟乙酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、泛酸盐、羟乙磺酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、丁酸盐、二葡糖酸盐、环戊酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸、草酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、烟酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐(proprionate)、酒石酸盐、乳糖酸盐、新戊酸盐(pivolate)、樟脑酸盐、十一酸盐和琥珀酸盐。还包括的盐为有机磺酸例如，甲磺酸盐、乙磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、樟脑磺酸盐、2-萘磺酸盐、苯磺酸盐、对-氯代苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。可接受的盐还包括来自无机酸的那些，例如，氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、半硫酸盐、硫氰酸盐、过硫酸盐、磷酸和磺酸。

本发明延伸到为式I化合物的水合物、溶剂合物、复合物和其它物理形式的活性剂。

尽管所述活性剂可能单独给药，但优选它作为药物制剂的一部分存在。这类制剂将包含与一种或多种可接受的载体/赋形剂和任选的其它治疗成分在一起的式I化合物活性剂。在与制剂的其它成分相容的意义上，载体必须是可接受的，且对接受者无害。

制剂包括适于直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)给药的那些。制剂优选口服制剂。制剂可方便地以单位剂型，例如片剂和持续释放胶囊存在，并可通过制药领域熟知的任何方法制备。

这类熟知的方法包括使式I化合物活性剂与载体混合的步骤。一般说来，通过使活性剂均匀紧密地与液体载体或细分散的固体载体或二者混合，如需要再使产品成形，制备制剂。本发明延伸到药用组合物的制备方法，它包括使式I化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体或溶媒结合或混合。如果该药物制剂的制备涉及多种药物赋形剂的紧密混合且活性成分呈盐的形式，那么往往优选采用非碱性，即，酸性或中性的赋形剂。

本发明的口服制剂可为各含有预定量的活性剂的不连续单元，例如，胶囊、扁囊剂或片剂。作为选择，它们可为散剂或颗粒剂；为含呈含水液体或非含水液体形式的活性剂的溶液剂或混悬剂，或为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂，为大丸剂等。

针对口服组合物(例如，片剂和胶囊)，术语″适当的载体″包括媒介物例如，常用赋形剂，例如，粘合剂例如，糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填料和载体，例如，玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、白陶土、甘露醇、磷酸氢钙、氯化钠和海藻酸；和润滑剂，例如，硬脂酸镁、硬脂酸钠和其它硬脂酸金属、甘油硬脂酸酯硬脂酸、硅酮流体、滑石粉腊、油和胶态二氧化硅。也可采用矫味剂，例如，薄荷油、冬青油、樱桃调味剂等。希望加入着色剂使剂型易于鉴别。也可用本领域熟知的方法对片剂包衣。

可通过任选与一种或多种辅剂一起挤压或模压制备片剂。可通过在合适的机器中挤压任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式的活性剂，例如，粉末或颗粒，制备压制片剂。可通过在合适机器中模压用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物的混合物，制备模压片剂。可任选对片剂包衣或刻痕和配制，以使活性剂缓释或控释。

适于口服的其它制剂包括包含于矫味基质，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性剂的锭剂；包含于惰性基质例如，明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性剂的锭剂；和包含于适用液体载体中的活性剂的漱口液。

用于本文的′C₁-C₆烷基′(也简称为C₁-C₆alk，或用于化合物表达式例如，C₁-C₆烷氧基等)意指包括直链和支链脂族碳链，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、庚基和它们的任何简单异构体。烷基可具有不饱和键。此外，C₁-C₆烷基中的任何C原子可任选被一个、两个或如果价允许，三个卤素取代，和/或被杂原子S、O、NH取代或亚烷基链被杂原子S、O、NH间断。如果杂原子定位于链末端，那么，它适宜被一个或两个氢原子取代。C₁-C_n烷基与调整为需要的碳原子数的C₁-C₆烷基的意义相对应。

用于本文的′C₀-C₃烷基芳基′指包括稠合到C₃-C₇环烷基的芳基部分，例如，苯基、萘基或苯基，例如，茚满基，其中的芳基直接连接(即，C₀)或经上面如对C₁-C₃亚烷基定义的中间物甲基、乙基、丙基或异丙基连接。除非另有说明，芳基和/或它所稠合的环烷基部分任选被选自卤代基、羟基、硝基、氰基、羧基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷酰基、氨基、叠氮基、氧代、巯基、硝基C₀-C₃烷基碳环基、C₀-C₃烷基杂环基的1-3个取代基取代。″芳基″具有相应的意义，即其中的C₀-C₃烷基键不存在。

用于本文的′C₀-C₃烷基C₃-C₇环烷基′指包括C₃-C₇环烷基，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基，其中的环烷基直接连接(即C₀烷基)或经上面如对C₁-C₃亚烷基定义的中间物甲基、乙基或丙基连接。环烷基可含有不饱和键。除非另有说明，环烷基部分任选被选自卤代基、羟基、硝基、氰基、羧基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷酰基、氨基、叠氮基、氧代、巯基、硝基、C₀-C₃烷基碳环基、C₀-C₃烷基杂环基的1-3个取代基取代。

用于本文的′C₀-C₃烷基碳环基′指包括C₀-C₃烷基芳基和C₀-C₃烷基C₃-C₇环烷基。除非另有说明，芳基或环烷基任选被选自卤代基、羟基、硝基、氰基、羧基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基，C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷酰基、氨基、叠氮基、氧代、巯基、硝基、C₀-C₃烷基碳环基和/或C₀-C₃烷基杂环基的1-3个取代基取代。″碳环基″具有相应的意义，即其中的C₀-C₃烷基键不存在。

用于本文的′C₀-C₃烷基杂环基′指包括含有单环、饱和或不饱和、杂原子的环，例如，哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡唑基、咪唑基、

唑基、异唑基、噻嗪基(thiazinolyl)、异噻嗪基(isothiazinolyl)、噻唑基、

二唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、四唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡唑基，或稠合到苯环的任何这类基团，例如，喹啉基、苯并咪唑基、苯并

唑基、苯并异

唑基、苯并噻嗪基、苯并异噻嗪基、苯并噻唑基、苯并

二唑基、苯并-1，2，3-三唑基、苯并-1，2，4-三唑基、苯并四唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并吡啶基、苯并嘧啶基、苯并哒嗪基、苯并吡唑基等，其中的环直接连接，即(C₀)或经上面如对C₁-C₃亚烷基定义的中间物甲基、乙基、丙基或异丙基连接。具有芳族特性的任何这类非饱和环本文在中可称为杂芳基。除非另有说明，杂环和/或其所稠合的苯基部分任选被选自卤代基、羟基、硝基、氰基、羧基、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆烷氧基C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷酰基、氨基、叠氮基、氧基、巯基、硝基、C₀-C₃烷基碳环基、C₀-C₃烷基杂环基的1-3个取代基取代。″杂环基″和″杂芳基″具有相应的意义，即其中的C₀-C₃烷基键不存在。

因此，典型地，上面定义范围内的杂环基和碳环基部分是有5个或尤其是6个环原子的单环，或包含稠合到4、5或6元环的6元环的双环结构。

典型的这类基团包括C₃-C₈环烷基、苯基、苄基、四氢萘基、茚基、茚满基、杂环基，例如选自氮杂环庚烷基(azepanyl)、氮杂环辛烷基(azocanyl)、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、二氢吲哚基、吡喃基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、噻喃基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡咯基、

唑基、异

唑基、噻唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、四唑基、吡唑基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并

唑基、苯并异

唑基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、喹唑啉基、四氢喹唑啉基和喹喔啉基，它们中的任一个可任选如本文所述的那样被取代。

从而，饱和的杂环部分包括基团，例如，吡咯啉基、吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、吡喃基、噻喃基、哌嗪基、二氢吲哚基、氮杂环丁烷基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、四氢呋喃基、六氢嘧啶基、六氢哒嗪基、1，4，5，6-四氢嘧啶胺、二氢-

唑基、1，2-噻嗪烷基(thiazinanyl)-1，1-二氧化物、1，2，6-噻二嗪烷基(thiadiazinanyl)-1，1-二氧化物、异噻唑烷基-1，1-二氧化物和咪唑烷基-2，4-二酮，而不饱和的杂环包括带芳族性质的基团，例如，呋喃基、噻吩基、吡咯基、

唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异唑基、异噻唑基、

二唑基、三唑基、四唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、中氮茚基、吲哚基、异吲哚基。在各种情况下，杂环可与苯环稠合形成双环系统。

式I化合物包括某些药学上可接受的酯或酰胺。从而，代表性的酯包括羧酸酯，其中，酯基的羧酸部分的非羰基部分选自直链或支链烷基(例如，甲基、正丙基、叔丁基或正丁基)、环烷基、烷氧基烷基(例如，甲氧基甲基)、芳烷基(例如，苄基)、芳氧基烷基(例如，苯氧基甲基)、芳基(例如，任选被例如，卤素、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基或氨基取代的苯基)；磺酸酯，例如，烷基-或芳烷基磺酰基(例如，甲磺酰基)；氨基酸酯(例如，L-异戊氨酰或L-异亮氨酰)；和单、双或三-磷酸酯。在这类酯中，除非另有说明，存在的任何烷基部分有利地含有1-18个碳原子，特别是1-6个碳原子，更特别是1-4个碳原子。存在于这类酯中的任何环烷基部分有利地含有3-6个碳原子。存在于这类酯中的任何芳基部分有利地包含任选如上述碳环基的定义所示被取代的苯基。

药学上可接受的酯因而包括C₁-C₂₂脂肪酸酯，例如，乙酰基、叔丁基或长链直链或支链的不饱和或ω-6单不饱和脂肪酸，例如，棕榈酰、硬脂酰等。

作为选择的芳基或杂芳基酯包括苯甲酰、吡啶甲酰等，它们的任一个可如上述碳环基中的定义那样被取代。优选的药学上可接受的酯包括脂族L-氨基酸酯，例如，亮氨酰、异亮氨酰和特别是异戊氨酰。优选的其它氨基酸酯包括描述于WO99 09031的2-O-AA-C₃-C₂₂脂肪酸酯，其中AA是脂族氨基酸酯，特别是衍生自L-乳酸和L-异戊氨酰的那些。

药学上可接受的酰胺包括衍生自任选包含1-3个不饱和现象和/或任选被在上面碳环基中所定义的取代基取代的C₁-C₂₂支链或直链氨基烷基或苯胺或苄基胺的那些酰胺。优选的酰胺包括由胺与C₁-C₄直链或支链链烷酸反应而形成的那些。具有胺官能团的药学上可接受的其它酰胺对应于上述酯所优选的羧酸的酰胺。

合成

本发明化合物典型地由类似于Svansson L.等in J.Org.Chem(1991)VoI 56：2993-2997制备的区别保护的二-4，5-羟甲基四氢呋喃衍生物合成，如流程1中概述：

在流程1中，采用J Org Chem 1987，52，2596中所示的Sharpless氧化容易地制备手性环氧醇1。Rs是常规的羟基保护基，例如，下面所讨论的那些，例如，对溴代苄基。例如，-50℃下，在二甲醚中，环氧醇1被烯丙基溴化镁在C-3位区域选择地烷基化。例如，任选在非所要的区域异构体的邻近羟基用氧化剂例如高碘酸钠裂解的鉴别步骤后，用硅胶层析法分离所希望的异构体2。用其它羟基保护基保护2中的伯羟基，例如，℃下，用在嘧啶中的苯甲酰氯苯甲酰化，产生区别保护的3。如描述于Tet.Lett 1976 17 1973中的那样，采用催化量的四氧化锇和N-甲基吗啉N-氧化物作为再氧化剂，使烯键顺-羟基化(Cis-hydroxylation)，生成相应的二醇，它依次被氧化剂，例如，在有机溶剂例如含水四氢呋喃中的高碘酸钠裂解。用醇/酸例如0.5％w/w甲醇的盐酸溶液解封(deblocked)这样制得的不稳定呋喃糖，得到区别保护的二-4，5-羟甲基四氢呋喃中间体4。

希望处理保护基Rs和Rs1(即去保护，再用其它羟基保护基再保护)，从而在稍后步骤中，最容易地选择性去除所选择的一个保护基而不是其它的保护基。因此，如以下的流程2和3中所示，选择4中的特别保护基，以便能选择性地去除一个这样的保护基并使因此暴露的羟基官能团酰基化。已知许多这类成对的可特别选择的羟基保护基，例如，公开于Greene，″Protective Groups In Organic Synthesis，″(John Wiley&Sons，New York(1981))中的O-保护基。

因此，羟基-保护基包括醚，例如，甲醚或取代的甲醚，例如，甲氧基甲基(MOM)、苄氧基甲基、叔丁氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2，2，2-三氯代乙氧基甲基、二(2-氯代乙氧基)甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、四氢吡喃基(THP)、3-溴代四氢吡喃基、四氢噻喃基、4-甲氧基四氢-吡喃基、4-甲氧基四氢噻喃基S，S二氧化物(dixido)、四氢呋喃基和四氢噻吩基。乙基醚包括1-乙氧基乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-(异丙氧基)乙基、2，2，2-三氯代乙基和2-(苯基氢硒基)乙基。其它醚包括叔丁基、烯丙基、肉桂基，对氯代苯基和苄基醚，例如，未取代苄基、对甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对卤代苄基和对氰基苄基。其它醚包括3-甲基-2-吡啶甲基(picolyl)N-氧化物(oxido)、二苯基甲基、5-二苯并环庚基、三苯基甲基、α萘基二苯基甲基、对甲氧基苯基二苯基甲基、对(对′-溴代苯甲酰甲基氧基)苯基二苯基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)呫吨基、9-(9-苯基-10-氧代)蒽基(三苯甲酮(tritylone))和苯并异噻唑基S，S二氧化物(dioxodo)。甲硅烷基醚包括三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、(三苯基甲基)二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基、甲基二叔丁基甲硅烷基、三苄基甲硅烷基、三-对-二甲苯基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基和三戊基甲硅烷基(tripenylsilyl)。备选的羟基保护基包括酯，例如，甲酸酯、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯代乙酸酯、二氯代乙酸酯、三氯代乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、对氯代苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2，6-二氯-4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2，4-二(1，1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯代二苯基乙酸酯、对-(P)-苯基乙酸酯、丙酸3-苯基酯、3-苯甲酰丙酸酯、异丁酸酯、单琥珀酸酯、4-氧代戊酸酯(levinulate)、新戊酸酯、金刚烷二甲酸酯(adamantoate)、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯(惕各酸酯)和苯甲酸酯，例如，未取代或邻-(二溴代甲基)-、邻-(甲氧基羰基)-、对苯基-、2，4，6-三甲基-(5-甲基邻苯二甲酸酯)或对-(P)-苯甲酸酯，或α-萘甲酸酯。碳酸酯羟基保护基包括甲基、乙基、2，2，2-三氯代乙基、异丁基、乙烯基、烯丙基、肉桂基、对硝基苯基、苄基，例如，未取代的对甲氧基-、3，4-二甲氧基-、邻硝基-或对硝基苄基或S-苄基硫代碳酸酯。各种羟基保护基包括N-苯基氨基甲酸酯，N-咪唑基氨基甲酸酯、硼酸酯、硝酸酯、N，N，N，N-四甲基二氨基磷酸酯(phosphorodiamidate)和2，4-二硝基苯基次磺酸酯。Greene提供大量反应性图，以帮助选择补充的各对不同的保护基。

典型的羟基保护基包括实施例中的那些和醚，例如，叔丁基和其它低级烷基醚，例如，异丙基、乙基和特别是甲基、苄基和三苯基甲基；四氢吡喃基醚；取代的乙基醚，例如，2，2，2-三氯代乙基；甲硅烷基醚，例如，三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基；和使羟基与羧酸反应制备的酯，例如，乙酸酯、丙酸酯、苯甲酸酯等。

然后，使区别保护的二-4，5羟基甲基四氢呋喃4如流程2中所示的那样再与甲硅烷基化的、任选N-保护的4-氨基-嘧啶酮缩合，接着酰基化和环化。作为选择，如流程3中所示，首先使4双环化，然后缩合。

式I

流程2表示用甲硅烷基化的4-氨基-嘧啶-2-酮特别保护中间体4的Vorbr

ggen缩合(Chem Ber.1981，114，1234)，其中的4-氨基官能团如Greene，″Protective Groups In Organic Synthesis，″(John Wiley&Sons，New York(1981))中所示的那样，任选用常规氨基保护基保护。这类基团的实例包括：1)酰基，例如，甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二酰基和对甲苯磺酰基；2)芳族氨基甲酸酯基，例如，苄氧基羰基(Cbz或Z)和取代的苄氧基羰基，和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)；3)脂族氨基甲酸酯基，例如，叔丁氧基羰基(Boc)、乙氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基和烯丙氧基羰基；4)环烷基氨基甲酸酯基，例如，环戊氧基羰基和金刚烷氧基羰基；5)烷基，例如，三苯基甲基和苄基；6)三烷基甲硅烷基例如，三甲基甲硅烷基；和7)含硫代的基团，例如，苯基硫代羰基和二硫琥珀酰基。当然，要选择氨基保护基，以使去保护条件与不同的羟基保护基的去除顺序一致。作为选择，Rs²是用于R⁵和R⁶所定义的酰胺和亚胺的合成子。在许多情况下，4-氨基官能团完全无需保护基，并因此Rs²是H。

反应混合物含有TBDMSOTf和CH₂Cl₂和所需要的异构体5经层析法，例如，HPLC分离，这在Vorbr

ggen缩合反应中是常规的。5中的羟基保护基之一再被选择性地除去，以显现羟基官能团。在流程2的化合物6中，首先除去Rs，从而羟基保护基的区别对可以为，例如，对于Rs，用四氢呋喃中的TBAF选择性地除去的TBDP(叔丁基．硅烷基、)，和对于Rs¹，用乙酸随后除去的MMTR(4-甲氧基-苯基-二苯基甲基)。然而，很显然，保护基的其它排列会实现相同目标。Greene提供关于不同的保护基的大量反应图，以帮助这类选择。此外，经4的适当处理的Rs和Rs¹位的交换会生成中间体，其中的4-羟甲基官能团未被掩蔽，因而首先被酰基化。

用活化的、ωω-二羧酸HOOC-A-COOH酰化6中的未掩蔽羟基官能团，其中的A对应于如上定义的-(CR¹R²)_n-，生成7。结果，R¹或R²含有潜在的反应性基团，例如，OH、NH₂或COOH，这些如同上文在Greene中所述的那样被常规性地保护。

用于酰化的活化的酸可包括，例如，酰基卤、酸酐、活化酸酯或在偶合剂存在下的酸，例如，二环己基碳二亚胺。代表性的活化酸衍生物包括酰基氯、衍生自烷氧基羰基卤化物例如异丁氧基碳酰氯等的酐、N-羟基琥珀酰胺衍生的酯、N-羟基苯邻二甲酰亚胺衍生的酯、N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰胺衍生的酯、2，4，5-三氯酚衍生的酯等。其它的活化酸包括具有式HCOOHACOOX的那些，例如，其中X是COCH₃、COCH₂CH₃或COCF₃或苯并三唑。

然后除去化合物7的保护基Rs¹，释放8的4个羟甲基，为双环四氢呋喃环系统的第二个环的环化作准备。它原则上如上所述通过酰化进行。

然后处理化合物8的基团Rs²制备所需要的式1化合物。例如，可除去作为Rs²的氨基保护基，生成在R⁵&R⁶上的游离胺和/或如下所述般转化为酰胺或亚胺的胺官能团。

式1化合物的供选择的合成流程表示于图3中：

式I

在流程3中，上述区别保护的四氢呋喃4首先被双环化，再经Vorbr

ggen缩合。通过对第一个补充保护基的Rs/Rs¹对的去保护进行双环化。在这种情况下，四氢呋喃的4-羟甲基官能团首先被释放，以备酰化，但带有适当选择的Rs/Rs¹保护基的该通用方法也可作为环化的第一步，通过去除和酰化5羟甲基官能团进行。

在这些情况下，首先选择4-或5-去保护是重要的，其中ωω-二羧酸HOOC-A-COOH中的A是不对称的，即，在式I化合物中，其中m是2或3和其中在亚甲基链节中的R¹/R²是不相同的。例如，其中A是-CH(OH)CH₂-(即在式1中，n是2，第一个亚甲基中的R¹是OH，而R²是H，第二个亚甲基中的R¹和R²都是H)，那么，通过首先去保护的Rs和采用活化酸PG-OC-CH₂-CH(OH)-COOH，可确保邻近连接四氢呋喃中间体的4羟甲基官能团的酯键的R¹羟基的定位，其中的PG是常规的羧基保护基，它的选择当然要使它的去除条件与打算去除RS¹的一致。Greene提供大量的反应图，以帮助这类选择。

在Greene的上述文献中，评述了大量羧基保护基，并典型地包括酯，例如，甲基或取代的甲基酯，例如，甲氧基甲基、甲硫基甲基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、甲氧基乙氧基乙基、苄氧基甲基、苯甲酰甲基包括对溴代、α甲基或对甲氧基苯甲酰甲基、二酰基甲基或N-苯二酰亚氨基甲基。乙基酯包括未取代的乙基和2，2，2-三氯代乙基、2-卤代乙基、ω-氯代烷基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2-甲基三乙基(thiethyl)、2-(对硝基苯基亚磺酰)乙基、2-(对甲苯磺酰)乙基和1-甲基-1-苯乙基。其它酯包括叔丁基、环戊基、环己基、烯丙基、肉桂基和苯基，包括间甲硫基苯基。苄基酯包括未取代的苄基、三苯基甲基、二苯基甲基包括二(邻硝基苯基)甲基、9-蒽基甲基、2-(9，10-二氧代)蒽基甲基、二苯并环庚基、2，4，6-三甲基苄基、对溴代苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基、对甲氧基苄基、胡椒基、4-吡啶甲基和对-(P)-苄基。甲硅烷基酯包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基和苯基二甲基甲硅烷基。活化的酯包括S-叔丁基、S-苯基、S-2-吡啶基、N-羟基哌啶基、N-羟基琥珀酰亚氨酰基(succinimidoyl)、N-羟基苯二酰亚氨酰基和N-羟基苯并三唑基。各种酯羧基保护基包括O-酰基肟、2，4-二硝基苯基亚磺酰、2-烷基-1，3-

唑啉、4-烷基-5-oxox-1，3-

唑烷和5-烷基-4-氧代-1，3-二氧戊环。甲锡烷基酯包括二乙基甲锡烷基和三正丁基甲锡烷基。非酯羧基保护基包括酰胺，例如，N-N-二甲基、吡咯烷基、哌啶基、邻硝基苯基、7-硝基吲哚基、8-硝基四氢喹啉基和对-(P)苯磺酰胺。非酯羧基保护基还包括酰肼，例如，N-苯基酰肼或N，N′-二异丙基酰肼。

针对区别保护的四氢呋喃衍生物的供选择的流程示于流程4中：

式I

流程4被广泛报道于学术文献中。尿苷类似物前体的制备表示于Sanghvi等Synthesis 1994，1163，Sanghvi等Tett Lett 35卷，4697页(1994)和Haly&Sanghvi Nucleosides&Nucleotides 15卷，1383(1996)中。尿苷向胞嘧啶类似物的转化表示于Kozlov，Nucleosides&Nucleotides 17卷，2249(1998)中。

不需要碱i的转化的区别保护的四氢呋喃的备选途径示于流程5中：

式I

a：TrCI，吡啶，b：i)MsCI，Pyr ii)1N NaOH，THF，c)i)EtAlCN，65C，ii)甲苯/THF，d)i)MsCl，Et₃N，ii)EtOAc，f)i)NaBH₄ ii)EtOH，α/β1∶3-4，g)i)DIBAL，ii)硅胶EtOAc，差向异构α/β93∶7，g)i)NaBH₄，ii)EtOH/CH₂Cl₂。

尽管已经用TrO保护基和R⁵R⁶＝H说明流程5，显然，胺和羟基保护基的其它变量遵循该途径。

现在参看全部流程，类似于Mauldon等，Bioorg Med Chem 6(1998)577-585中的程序，典型地通过室温下，典型地在DMF中，使式1化合物，其中R⁵和R⁶是或者相应的中间体5(任选去保护)与式(CH₃O)₂CHNR⁸R⁸′化合物缩合，制备其中的R⁵和R⁶一起限定＝CR⁸R⁸′的亚胺。一般在室温下，由中间体二烷基甲酰胺和硫酸二甲酯制备适当的甲酰胺缩醛(formamide acetals)。中间体盐与甲醇钠的反应提供半缩醛，再如上所述将其缩合。

典型地在H₂O/1，4-二氧杂环己烷中，通过用适当的ROOR使式I的N-4未保护的化合物或相应的中间体5进行Akiyama酰化(ChemPharm Bull 1978，26，981)，制备其中R⁵是酰胺的式I化合物。用常规肽偶合条件，使其中R⁵是氨基酸残基的化合物与N-保护的氨基酸残基偶合。

实施方案详述

参照下列实施例和图，现在将只通过举例的方式，描述本发明方法和化合物的各种实施方案；其中

图1是大鼠口服本发明化合物后，对体内代谢物随时间推移的血浆浓度图；

图2描述相对于常规NRTI的抑制作用，本发明的母体化合物对具有引物拯救表型的典型的TAM株的抑制作用，如在生物实施例2a中进一步讨论的；

图3描述相对于常规NRTI的抑制作用，本发明的母体化合物对具有引物拯救表型的M 184V+TAM的抑制作用，如在生物实施例2b中进一步讨论的；

图4描述相对于常规NRTI的抑制作用，本发明的母体化合物对T69S+XX+TAM的抑制作用，如在生物实施例2c中进一步讨论的；

图5描述相对于齐多夫定和拉米夫定的抑制作用，本发明的母体化合物对TAM株的抑制作用，如在生物实施例3中进一步讨论的。

实施例1

2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，10-三氧杂环戊二烯并-环癸烯-6，9-二酮

a)N-(1-{5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-4-[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲氧基甲基]-四氧呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基)-2，2-二甲基-丙酰胺

氮气下，向以上流程4中制备的0.75g(1mmol)4-氨基-1-{5-(叔丁基-硅烷氧基甲基)-4-[(4-甲氧基苯基)-二苯基-甲氧基甲基]-四氢呋喃-2-基}-1H-嘧啶-2-酮的二氧杂环己烷(25ml)溶液中加入二碳酸二叔丁酯(0.44g，2mmol)的二氧杂环己烷(2ml)溶液。室温下搅拌反应混合物48小时。在硅胶上蒸发反应混合物和在硅胶柱纯化残余物，用乙酸乙酯/己烷2∶1作为洗脱液，得到0.42g(49％)上述产物。

质子NMR(CDCl3)：8.33(d，1H)，7.64-7.59(m，4H)，7.45-7.18(m，18H)，6.91(d，1H)，6.79-6.77(m，2H)，6.10-6.08(m，1H)，4.08-4.06(m，1H)，3.98-3.96(m，1H)，3.77(s，3H)，3.59(dd，1H)，3.19-3.16(m，1H)，3.02-2.98(m，1H)，2.57-2.53(m，2H)，2.72-2.25(m，1H)，1.50(s，9H)，1.08(s，9H).

b)(1-{5-羟甲基-4-[(4-甲氧基苯基-二苯基-甲氧基甲基]-四氢呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-氨基甲酸叔丁酯

向以上化合物(0.33g，0.4mmol)的四氢呋喃(10ml)溶液中加入TBAF (0.19g，0.6mmol)的四氢呋喃(1ml)溶液。室温下搅拌反应混合物3小时。在硅胶上蒸发反应混合物和用采用乙酸乙酯/己烷2∶1作为洗脱液的硅胶柱纯化残余物。蒸发适当流分，得到0.20g(80％)(1-{5-羟甲基-4-[(4-甲氧基苯基-二苯基-甲氧基甲基]-四氢呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-氨基甲酸叔丁酯。

质子NMR(CDCl3)：8.22(d，1H)，7.40-7.38(m，4H)，7.38-7.23(m，10H)，6.85-6.82(m，1H)，6.03-6.00(m，1H)，4.04-3.94(m，2H)，3.85-3.81(m，1H)，3.80(s，3H)，3.29(dd，1H)，3.11(dd，1H)，2.35-2.22(m，3H)，1.52(s，9H).

c)琥珀酸单-{5-(4-叔丁氧基羰基氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-3-[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲氧基甲基]-四氢-呋喃-2-基-甲基}酯

向以上化合物(200mg，0.33mmol)和4-二甲基氨基吡啶(98mg，0.8mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入琥珀酸酐(80mg，0.8mmol)。在反应混合物被加到二氯甲烷和饱和氯化铵的混合物中后，室温下彻夜搅拌反应混合物。用水洗涤有机相并干燥。蒸发溶剂得到222mg(94％)上述化合物。

质子NMR(CDCl₃)：8.02(d，1H)，7.38-7.36(m，4H)，7.30-7.15(m，9H)，6.84-6.81(m，2H)，5.89-5.87(m，1H)，4.58(dd，1H)，4.26(dd，1H)，4.13-4.08(m，1H)，3.79(s，3H)，3.24(dd，1H)，3.05(t，1H)，2.80-2.60(m，4H).2.31-2.26(m，1H)，2.17-2.12(m，2H)，1.51(s，9H).

d)琥珀酸单-[5-(4-叔丁氧基羰基氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-3-羟甲基-四氧呋喃-2-基-甲基]酯

室温下，搅拌以上化合物(222mg，0.31mmol)的乙酸(10ml)和水(5ml)溶液3小时。用442的M+1离子的LC/MS表明原料完全转化为所需要的去保护的化合物。蒸发反应混合物至干，经用乙腈/水1∶1.5作为洗脱液洗脱的C-8反相柱纯化残余物，得到100mg(73％)所需上述化合物。

质子NMR(CDCl₃)：8.18(d，1H)，7.23(d，1H)，5.93(宽s，1H)，4.66-4.63(m；1H)，4.33(d，1H)，4.15(宽s，1H)，3.66(宽s，2H)，2.80-2.59(m，4H)，2.37(宽s，2H)，2.28-2.44(m，1H)，1.51(s，9H).

e)[1-(6，9-二氧代-十氢-1，5，10-三氧杂-环戊二烯并环癸烯-2-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-氨基甲酸叔丁酯

向以上化合物(74mg，0.168mmol)、HOBT(27mg，0.2mmol)和三乙胺(0.14ml，1mmol)的二氧甲烷(65ml)和DMF(2ml)溶液中加入EDAC(39mg，0,2mmol)。在将反应混合物倾入二氯甲烷(100ml)和含水柠檬酸(100ml)后，室温下搅拌反应混合物48小时。用碳酸氢钠溶液和盐水洗涤有机相。有机相经硫酸钠干燥，并蒸发至残余物，经采用乙酸乙酯作为洗脱液的硅胶柱纯化，得到22mg(31％)以上所示的化合物。

质子NMR(CDCl₃)：7.75(d，1H)，7.36(宽s，1H)，7.25(d，1H)，6.02-5.99(m，1H)，4.58(dd，1H)，4.36-4.28(m，2H)，4.14(t，2H)，2.64(s，4H)，2.58-2.55(m，1H)，2.29-2.25(m，2H)，1.52(s，9H).

f)2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，10-三氧杂-环戊二烯并环癸烯-6，9-二酮

向以上化合物(22mg，0.052mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氟乙酸(2ml)。室温下搅拌反应混合物1小时并蒸发至干。与甲苯共蒸发两次，小心干燥后，得到12.7mg作为双-三氟乙酸盐的标题化合物。LC/MS确认带324(M+1)和647(2M+1)特征离子的结构，254nm HPLC纯度超过90％。

实施例2

7-氨基-2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，10-三氧杂环戊二烯并环癸烯-6.9-二酮

a) 2-叔丁氧基羰基氨基-琥珀酸4-{5-(4-叔丁氧基羰基氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基]-3-[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲氧基甲基]-四氢-呋喃-2-基-甲基}酯

向(1-{5-羟甲基-4-[(4-甲氧基苯基-二苯基-甲氧基甲基]-四氢呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-氨基甲酸叔丁酯[98mg，0.4mmol，实施例1中所述的]和4-甲基氨基吡啶(98mg，0.8mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入N-BoC-(S)-asp酐[172mg，0.8mmol(如J.Med.Chem.1971，24-30页中所述制备)]。在反应混合物倾入乙酸乙酯(150ml)和饱和氯化铵(100ml)后，室温下彻夜搅拌反应混合物。用水洗涤有机相，经硫酸钠干燥，蒸发，得到371mg上述粗产物，无需任何纯化而用于下一步骤。

质子NMR(CDCl3)：7.76(d，1H)，7.38-7.20(m，12H)，7.08(d，1H)，6.83(d，2H)，6.13(d，1H)，5.80(d，1H)，4.83(t，1H)，4.61-4.58(m，1H)，4.14-4.06(m，2H)，3.79(s，3H)，3.25-3.23(m，1H)，3.17-3.12(m，1H)，3.00(t，1H)，2.80-2.76(m，1H)，2.26-2.15(m，3H)，1.56(s，9H)，1.4(s，9H)，

b)2-叔丁氧基羰基氨基-琥珀酸4-[5-(4-叔丁氧基羰基氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-3-羟甲基-四氧呋喃-2-基-甲基]酯

室温下，彻夜搅拌以上化合物(330mg，0.40mmol)的乙酸(10ml)和水(5ml)溶液。蒸发反应混合物至干，残余物经用乙腈/水1∶1.5作为洗脱液洗脱的C-8反相柱纯化，得到72mg(32％)所需化合物。LC/MS确认带557(M+1)的分子离子的正确结构。

c)[1-(7-叔丁氧基羰基氨基-6，9-二氧代-十氢-1，5，10-三氧杂-环戊二烯并环癸烯-2-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基)-氨基甲酸叔丁酯

向以上化合物(72mg，0.13mmol)、HOBT(20mg，0.16mmol)和三乙胺(0.07ml，0.5mmol)的二氯甲烷(50ml)和DMF(1ml)溶液中加入EDAC(31mg，0.16mmol)。在反应混合物被倾入二氯甲烷(100ml)后，室温下搅拌反应混合物24小时，并用柠檬酸溶液、碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。有机相经硫酸钠干燥，并蒸发至残余物，经采用乙酸乙酯作为洗脱液的硅胶柱纯化，得到26mg(37％)以上所示的化合物。LC/MS得到确切的539M+1离子和537M-1离子。

质子NMR(CDCl3)：7.73(d，1H)，7.40(宽s，1H)，7.24(d，1H)，6.02-6.00(m，1H)，5.26-5.24(m，1H)，4.87-4.85(m，1H)，4.64-4.55(m，2H)，4.20-4.18(m，1H)，4.06(t，1H)，3.84(t，1H)，3.00-2.90(m，1H)，2.76-2.66(m，1H)，2.57-2.52(m，1H)，2.31-2.17(m，2H)，1.52(s，9H)，1.45(s，9H).

d)7-氨基-2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，10-三氧杂环戊二烯并环癸烯-6，9-二酮

向以上化合物的(26mg，0.05mmol)二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氟乙酸(2ml)。室温下搅拌反应混合物2小时，并蒸发至干。与甲苯共蒸发两次，小心干燥后，得到24mg作为双三氟乙酸盐的标题化合物。LC/MS确认带有339(M+1)、677(2M+1)和337(M-1)特征离子的结构。

实施例3

2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，11-三氧杂环戊二烯并环十一碳烯-6，10-二酮

a)己二酸单-{5-[4-叔丁氧基羰基氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基]-3-[(4-甲氧基-苯基)-二苯基-甲氧基甲基]-四氧呋喃-2-基-甲基}酯

向(1-{5-羟甲基-4-[(4-甲氧基苯基-二苯基-甲氧基甲基]-四氢呋喃-2-基}-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基]-氨基甲酸叔丁酯[730mg，1.19mmol，实施例1中所述的]和4-甲基氨基吡啶(350mg，2.86mmol)的二氯甲烷(80ml)溶液中加入戊二酐(327mg，2.86mmol)。在反应混合物倾入二氯甲烷后，室温下彻夜搅拌反应混合物。用稀氯化铵溶液、稀柠檬酸溶液、水和盐水洗涤有机相，经硫酸钠干燥，蒸发，得到819mg(95％)上述粗产物，其无需任何纯化而用于下一步骤。

b)己二酸单-[5-[4-叔丁氧基羰基氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基]-3-羟甲基-四氧呋喃-2-基-甲基]酯

室温下，搅拌以上化合物(1.09g，1.5mmol)的乙酸(50ml)和水(25ml)溶液2.5小时。蒸发反应混合物至干，残余物经用EtOAc/MeOH 9∶1作为洗脱液洗脱的硅胶柱纯化，得到435mg(64％)所希望的化合物。

c)[1-(6，10-二氧代-十氢-1，5，11-三氧杂-环戊二烯并环十一碳烯-2-基)-2-氧代-1，2-二氢-嘧啶-4-基}-氨基甲酸叔丁酯

向以上化合物(395mg，0.87mmol)、HOBT(235mg，1.74mmol)和DMAP(213mg，1.74mmol)的DMF(120ml)溶液中加入EDAC(334mg，1.74mmol)。在蒸发溶剂后，室温下搅拌反应混合物48小时。将二氯甲烷加入反应残余物，用稀氯化铵溶液、稀柠檬酸溶液、水和盐水洗涤，经硫酸钠干燥，蒸发，得到350mg粗产物。LC/MS表示所需产物带有438(M+1)、496(M+乙酸盐)、875(2M+1)和436(M-1)的离子。经用乙腈/水1∶1和乙腈/水1∶1.25洗脱的C-8反相柱的两次纯化，蒸发和冻干后，得到31mg的标题化合物，经HPLC在220nM确定纯度为约50％。

d)2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，11-三氧杂-环戊二烯并环十一碳烯-6，10-二酮

于±0℃下，向以上化合物(31mg)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入三氟乙酸(2ml)。于±0℃下，搅拌反应混合物2小时，再于室温下，搅拌2小时。随后，蒸发反应混合物至干燥，最后与甲苯共蒸发，得到粗产物，经用乙腈/水1∶2洗脱的C-8反相柱纯化。加入TFA后，蒸发适当的馏分，得到31mg作为三氟乙酸盐的标题化合物。LC/MS确认结构带有338(M+1)，396(M+乙酸盐)和675(2M+1)的特征离子，220 nM处的纯度约为70％。

生物学实施例1A：

大鼠药动学

使实施例1化合物溶解于MQ级水(3mg/ml)，使成双大鼠口服。剂量为15mg/kg，于0、15和30分钟、1、2、4和6小时时取血样。用质谱法测量血浆的复原(作为代谢物2′，3′-二脱氧-3′-C-羟甲基-β-D-赤型(erythro)环戊二烯并呋喃糖基胞嘧啶)，检测为钠加合物m/z 264(M+Na)⁺。

如图1中可见，4uM左右剂量时，本发明化合物提供具有高峰浓度的代谢物2′，3′-二脱氧，3′-C-羟甲基-β-D-赤型环戊二烯并(pento)呋喃糖基胞嘧啶的充分血浆浓度。由于大鼠不能被HIV感染，不能直接用该实施例测定这种制剂的抗逆转录病毒活性，但引起注意的是，人H9细胞中的代谢物2′，3′-二脱氧，3′-C-羟甲基-β-D-赤型环戊二烯并呋喃糖基胞嘧啶的ED₅₀典型地约为0.01uM。这依次意味着血浆高峰浓度超过ED₅₀的几百倍。与QD或BID给药的ED₅₀比较，其它药学参数如AUC和清除率与达到24小时低谷水平极为相符。

生物学实施例1B

渗透性

该实施例测量抑制剂经人胃肠道细胞的传输。试验采用熟知的具有通道号40-60之间的Caco-2细胞。

尖端(Apical)至基底外侧的转运

一般说来，在2-4孔中试验每一种化合物。基底外侧和尖端孔会分别容纳1.5mL和0.4mL转运缓冲液(TB)，试验物质的标准浓度为10μM。而且，所有的试验溶液和缓冲液会含有1％DMSO。实验前，用含有10％血清的培养基预先涂布转运板30分钟，以避免非特异性结合到塑性材料上。在过滤器载体上培养21-28日后，将细胞备用于渗透性实验。

1号转运板包括3排孔，每排4个孔。第1排指定为洗涤，第2排为″30分钟″和第3排为″60分钟″。2号转运板包括3排孔，每排4个孔，第4排指定为″90分钟″，第5排120分钟″和余下的那排未指定。

移出尖端孔的培养基，将插入物转移到无插入物的2个板中的转运板(1号板)中的洗涤排(1号排)中，已经用1.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM HEPES，pH7.4)在1-5排中制备插入物。在A→B筛选中，基底外侧孔中的TB也含有1％牛血清白蛋白。

将0.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM MES，pH 6.5)加至插入物中，37℃下，在多混合震动器中，使各细胞单层在转运缓冲液系统中平衡30分钟。在被平衡到缓冲液系统后，用EVOM chop stick仪器测量各孔中的经上皮的电阻值(TEER)。TEER值通过介于400-1000Ω每孔(取决于所用的通道数)。

从尖端侧移去转运缓冲液(TB，pH 6.5)，将插入物转移到30分钟排(2号)中并将包含试验物质的新鲜的425μL TB(pH 6.5)加到尖端(供体)孔。37℃下，在多混合震动器中，用约150-300rpm的低摇晃速度培养各板。

在第2排中培养30分钟后，每30分钟将插入物移至新的预热过的基底外侧(受体)孔中；第3排(60分钟)、第4排(90分钟)和第5排(120分钟)。

约2分钟后和在实验结束时，从尖端溶液取出25μL样品。这些样品代表从实验开始至结束的供体样品。

在各预定的时间点从基底外侧(受体)孔取出300μL，测量实验结束时的TEER的端值(post value)。对于收集的所有样品，将乙腈在样品中的最终浓度加到50％。于-20℃贮存所收集的样品，直到用HPLC或LC-MS分析。

基底外侧至尖端的转运

一般说来，在2-4孔中试验每一种化合物。基底外侧和尖端孔会分别容纳1.55mL和0.4mL TB，试验物质的标准浓度为10μM。而且，所有的试验溶液和缓冲液会含有1％DMSO。实验前，用含有10％血清的培养基预先涂布转运板30分钟，以避免非特异性结合到塑性材料上。

在过滤器载体上培养21-28日后，细胞为渗透性实验而准备。移去来自尖端孔的培养基，将插入物转移至无插入物的新板(转运板)的洗涤排(1号)中。

转运板包括3排孔，每排4个孔。第1排指定为″洗涤″和第3排是″实验排″。先前已经用洗涤的第1排中的1.5mL TB(pH7.4)和在实验的第3排(供体侧)中含有试验物质的1.55mL TB(pH7.4)制备转运板。

将0.5mL转运缓冲液(HBSS，25mM MES，pH6.5)加到第1排中的插入物中。37℃下，在多混合震动器中，各细胞单层在转运缓冲液系统中平衡30分钟。在被平衡到缓冲液系统后，经EVOM chop stick仪器测量各孔中的TEER值。

从尖端侧移去转运缓冲液(TB，pH6.5)，将插入物转移到第3排，向插入物加入400μL新鲜TB，pH 6.5。30分钟后，从尖端(受体)孔抽取250μL并用新鲜转运缓冲液置换。其后，每30分钟抽取250μL样品并用新鲜转运缓冲液置换，直到于120分钟时实验结束，最后，在实验结束时，测量TEER的端值。约2分钟后和在实验结束时，从基底外侧(供体)格取25μL样品。这些样品代表实验开始和结束时的供体样品。

对于收集的所有样品，将乙腈在样品中的最终浓度加到50％。于-20℃贮存所收集的样品，直到用HPLC或LC-MS分析。

计算

确定所吸收的累积分数，FA_cum对时间。由下式计算FA_cum：

{FA}_{cum} = Σ \frac{C_{RI}}{C_{DI}}

其中的C_Ri是间隔i端的受体浓度，C_Di是间隔i开始时的供体浓度。应获得线性关系。

渗透性系数(P_app_＞cm/s)的确定由下式计算：

P_{app} = \frac{(k \cdot V_{R})}{(A \cdot 60)}

其中k是定义为斜率的转运速度(分钟^-1)，通过作为时间(min)函数的吸收的累积分数(FA_cum)的线性回归得到，V_R是受体格中的体积(mL)，和A过滤器的面积(cm²)。

参比化合物

人吸收类别	标记物	人吸收％
			被动转运
低(0-20％)	甘露糖醇氨甲蝶呤	1620
			中(21-75％)	阿昔洛韦	30
高(76-100％)	普萘洛尔咖啡因	90100
			主动转运
氨基酸转运蛋白	L-苯丙氨酸	100
			主动外流
PGP-MDR1	地高辛	30

生物学实施例2

PhenoSense HIV试验中抑制TAM引物拯救相关耐药性HIV的活性

通过市售的PhenoSense HIV试验(描述于Petropoulos，CJ等，(2000)Antimicrob.Agents Chemother.44：920-928并被ViroLogics，Inc实现)确定本发明化合物的敏感性，即作为对分离自带典型的TAM引物拯救突变体耐药基因型的患者血浆样品中的HIV-1的血浆代谢物2′，3′-二脱氧，3′-C-羟甲基-β-D-赤型环戊二烯并呋喃糖基胞嘧啶的测量。通过放大来自患者血浆的HIVpol基因的蛋白酶(PR)-RT片段和将放大产物插入到经修饰的衍生自NL4-3分子克隆的HIV-1载体，进行该试验。

用重组病毒DNA载体和产生鼠科双嗜性白血病病毒包膜蛋白的表达载体，通过共转染293细胞培养物准备病毒储备液(viral stocks)。假型病毒颗粒得自转染细胞培养物，并用来传染新鲜293细胞培养物。重组病毒DNA含有在HIV env基因区域内的荧光素酶基因盒，荧光素酶在靶细胞中的产生取决于一轮病毒复制的完成。通过向细胞加入系列浓度的本发明化合物和参比化合物测量药物敏感性。倘若定量测量药物敏感性，抑制病毒复制的药物以剂量依赖的方式减少荧光素酶信号。

实施例2a

表1概述用于实验的引物拯救相关TAM突变体的主要簇，它们是抗HIV的，并带有AZT相关抗逆转录病毒治疗期间典型地出现的特有的TAM基因型。

表1.在引物拯救相关TAM患者分离物20和21中的特有的基因型

分离物编号	特有的引物拯救相关TAM突变
		20	M41L、D67N、K70R、V118I、L210W、R211K、T215F、K219Q和L228H
21	M41L、D67N、K70S、V118I、L210W、R211K、T215Y、K219N和L228H

结果表示于图2。野生型HIV病毒用作对照。这里，与对照物的平行进行相比，患者分离物20和21株的抑制作用表示为对治疗药物的敏感性减少的倍数变化。下列抗病毒药被试验：AZT、3TC、TNF、ABC、d4T、FTC和本发明化合物，作为血浆代谢物2′，3′-二脱氧，3′-C-羟甲基-β-D-赤型环戊二烯并呋喃糖基胞嘧啶。很显然地，本发明化合物保留对抗带TAM的毒株的活性。结果表明，对分离物20株的敏感性只有1.0倍减少，而对分离物21株的敏感性少于1.0倍减少。这意味着，本发明化合物以类似于其抑制野生型HIV RT的效能的效能水平，保留抑制患者的引物拯救相关突变体HIV RT的活性。相反，其它药物，与对野生型的相比，特别是AZT(敏感性减少451倍)，还有3TC、TFN、ABC、d4T和FTC失去抑制来自这些患者的病毒的效能。换句话说，来自这些患者的病毒表现出耐药性，它大大减少图2中所表示的这些药物的敏感性。

重要的是注意到，患者两种分离物包含于密码子215的不同的氨基酸转换；分离物20中T到F和分离物21中T到Y。这是引物拯救相关TAM耐药性突变体的典型特点。

实施例2b

表2概括带基因背景M184V(不同的突变体)的引物拯救相关突变体HIV，它典型地通过极常采用的抗逆转录病毒治疗AZT+3TC(可比韦)选择。

表2.TAM-引物拯救相关患者分离物19中的基因型改变

分离物编号	特有的引物拯救相关TAM突变
		19	M41L，D67N，K70R，V118I，M184V，L210W，T215F，K219E和L228H

如图3所示，通过血浆代谢物2′，3′-二脱氧，3′-C-羟甲基-β-D-赤型环戊二烯并呋喃糖基胞嘧啶测量的本发明化合物再次保留抑制这种耐药病毒的活性，表明与对野生型HIV的相比，敏感性只有1.78倍的不同。对耐药性病毒，3TC和AZT都失去活性，并表现出减少的效能(即病毒敏感性显著减少)(图3)。

实施例2c

用抗逆转录病毒药持续挑战患者导致MDR的出现。在RT指形区的氨基酸68和70之间带有6-bp插入物的T69S突变常见于与各种形式的TAM结合在一起，并归因于增强的引物拯救活性。如表3中所述，选择与TAM结合的MDR(带不同形式的氨基酸插入物(s))簇。

表3.引物拯救相关患者分离物31、32和35中的基因型改变

分离物编号	特有的引物拯救相关TAM突变
		31	在TAMs A62V、D67E和R211 K的基因背景中的T69S+双氨基酸插入SG
32	在TAMs A62V、D67G、V751和T215I的基因背景中的T69S+双氨基酸插入VG
		35	在TAMs A62V、R211K、T215Y和L228H的基因背景中的T69S+双氨基酸插入VA

如图4中所示，本发明化合物抑制这些患者的分离物，与目前用于常规抗逆转录病毒治疗的6种对照抗病毒药相比，在药物敏感性方面产生最小的改变。

值得注意的是，针对患者分离物32和35，观察到对AZT的敏感性的显著的(500-1000倍)减少，尽管本发明化合物各表现出2.79和4.29倍的变化。这与本发明化合物显示的不同于常规NRTI表现的专性DNA链终止剂的抑制机理相一致。

实施例2d

分离物4表示在R211S和K219E的突变组成的非原发的TAM背景中带有K65R+M184V基因型的其它有区别的突变体。该分离物引起典型的对阿巴卡韦、3TC和最近批准的核苷FTC的交叉耐药性，但保留其对胸苷类似物，例如，AZT和d4T的敏感性。该分离物不带典型的引物拯救突变，但本发明化合物仍抑制该病毒表型，3.88的FC值说明了这一点。该值可比得上胸苷类似物、AZT(FC＝1.11)和d4T(FC＝0.71)，但发现3TC(FC＞200)、FTC(FC＞40)和一定程度上的ABC(FC＞9.0)有显著的耐药性。该实验数据表明，本发明化合物不仅带有抑制″引物拯救″突变体的独特的性质，而且还能抑制来自不同家族的HIV突变体。因此，这与3TC和FTC所采用的抑制机理及4′-C-乙炔基化合物的可能的机理(其中在催化区域中的密码子T165R中，M184V与一个额外的氨基酸一起的改变归因于对4-C-乙炔基核苷的交叉耐药性(Kodama 2002))形成对照。

生物学实施例3

2′，3′-二脱氧-3-C-羟甲基-胞嘧啶抑制PBMC中引物拯救相关耐药性HIV的活性。

在PBMC培养基中，测试本发明化合物抑制其它TAM引物拯救相关耐药性HIV分离物的病毒耐药性能。通过用PHA-刺激的供体PBMC共培养被感染患者PBMC，产生HIV-1分离物并发展到高滴定度(Virology Manual for ACTG HIV Laboratories)。为药物敏感性试验验，收集无细胞上清液，对其测序并于-70℃分等分试样贮存。

用经修饰的一致同意的ACTG/DOD方法(Virology Manual forACTG HIV laboratories)进行体外药物敏感性试验。于37℃，潮湿的5％CO₂氛围下，用病毒储备液预感染PBMC4小时，随后培养4小时。用培养基洗涤感染的细胞两次，并移液到带8个系列药物稀释的微量滴定板中。各孔含有100,000个预感染的PBMC，用细胞培养基稀释所有药物。对每种单一药物，选择将药物稀释到超过50％抑制浓度(IC₅₀)。在各个板上共培养含有细胞和病毒的对照孔。于37℃下，在5％CO₂降压气氛下培养7日后，用对上清液的p24抗原检验确定病毒生长(Abbott Laboratories，Chicago，USA)。与不含药物的对照孔相比，计算病毒生长抑制百分率并表示为与对照孔相比的倍数改变表达(化合物敏感性的减少)。参比化合物AZT的处理与本发明化合物平行进行。

选择一簇有代表性的引物拯救相关突变体病毒，其包含引物拯救相关TAM耐药RT突变的基本特点。在位置M41L，D67N，K70R，L210W，T215Y/F和K219Q/E(与或不与不同的突变体M 184V的各种组合)具有突变的毒株如表4中所示般采用。

表4.9位患者分离物中的TAM引物拯救相关基因型

分离物编号	特有的引物拯救相关TAM突变
		1295	M41L，D67N，K70R，V75M，V118I，M184V，L210W，R211K，T215Y and K219E
7086	D67N，T69N，K70R，V118I，L210W，T215V和K219Q
		J12840	M41L，D67N，V118I，M184V，L210W，R211N，T215Y
J10308	M41L，D67N，M184V，L210W，R211S，T215Y
		7141	M41L，D67N，M184V，H208Y，R211K，T215Y，K219N
J14007	D67N，T69N，K70R，M184V，H208Y，R211K，T215F，K219Q，L228H
		VA206	D67N，M184V，L210W，R211K，T215Y
VA286	M41L，E44D，D67N，L74V，V118I，M184I，E203K，H208Y，L210W，R211K，T215Y

这些选择的引物拯救突变体的大部分产生显著的对AZT敏感性的抗性，FC值下降数百倍。带有T215V氨基酸突变的分离物7086(FC＝3.0)例外。FC值的完整的报告表示于图5。这里，2′，3′-二脱氧-3′-C-羟甲基胞嘧啶以只有2.7的最高FC值抑制所有的8种分离物。

本申请涉及的所有参考文献，包括专利和专利申请，尽可能地通过最完整程度的引用而结合到本文中。

除非文中另有需要，贯穿本说明和随后的权利要求书中的词′包括′和变体例如′包含′和′含有′，应被理解为暗示包含所述的整数、步骤、整数群或步骤组，但不排除其它任何整数、步骤、整数群或步骤组。

Claims

1.一种式I化合物或其药学上可接受的盐，

其中：

R¹独立为H、-NH₂；

R²是H；

R⁵是H；

R⁶是H；

n是2或3。

2.根据权利要求1的化合物，其中n是2。

3.根据权利要求2的化合物，其中第一个R¹是H；而第二个R¹是-NH₂。

4.根据权利要求3的化合物，所述化合物具有下式结构：

其中R⁵和R⁶如权利要求1中所定义和R₁ ^*为权利要求1定义的所述R¹。

5.根据权利要求2的化合物，所述化合物为以下结构式化合物：

或其药学上可接受的盐。

6.根据权利要求1的化合物，其中n是3。

7.根据权利要求6的化合物，所述化合物指2-(4-氨基-2-氧代-2H-嘧啶-1-基)-八氢-1，5，11-三氧杂-环戊二烯并环十一碳烯-6，10-二酮或其药学上可接受的盐。

8.一种药用制剂，它包含与药学上可接受的载体或赋形剂在一起的根据权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐。

9.根据权利要求1-7中任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防HIV感染的药物中的用途。

10.根据权利要求9的用途，其中所述HIV是多重耐药性HIV。

11.根据权利要求10的用途，其中所述多重耐药性HIV的逆转录酶带有至少一种突变，所述突变使得专性链末端磷酸核苷或磷酸核苷酸经ATP-或焦磷酸-介导的切除从新生DNA链中被切除。

12.根据权利要求11的用途，其中所述逆转录酶带有至少一种下列的基因模式：

(a)M41，±D67，L210和T215；

(b)D67，K70和K219；

(c)T69S-XX；或

(d)67位的缺失。

13.根据权利要求12的用途，其中所述逆转录酶带有至少3种突变。