PT1797112E - Inibidores do vírus da hepatite c - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "INIBIDORES DO VÍRUS DA HEPATITE C"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a péptidos e à sua utilização no tratamento ou na prevenção de infecções com o virus da hepatite C (VHC).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os virus precisam de infectar as células hospedeiras para se replicarem, produzir uma infecção que alastre e provocar uma doença. Para uma infecção com vírus que possuem um invólucro é necessário ocorrer a ligação do virão a uma ou várias estruturas na superfície celular (Flint e McKeating, 2000) . O passo inicial pode consistir numa ligação não específica de baixa afinidade (Barth et al., 2003). Subsequentemente, o vírus liga-se com uma afinidade elevada aos receptores primários e depois, em alguns casos, aos receptores secundários e aos co-receptores (Bartosch et ai., 2003; Hsu et al., 2003; Roccasecca et al., 2003; Cormier et al., 2003; Pohlmann et al., 2003; Zhang et al., 2004). Os passos de ligação à superfície celular podem estar associados a diversos rearranjos estruturais nas proteínas de superfície do virão e a alterações nas interacções proteína-proteína entre as proteínas da superfície virai (Jardetsky e Lamb, 2004; Modis et al., 2004; Bressanelli et al., 2004; Gibbons et al, 2004). Os passos finais podem expor o péptido de fusão, um domínio hidrofóbico de uma glicoproteína virai que é capaz de interagir com as membranas celulares (Flint et al., 1999; Allison et al., 2001). Em alguns casos, a ligação do vírus aos receptores da superfície celular dá início à absorção dos vírus através de vias endocíticas, ou vias vesiculares semelhantes (Garry e Dash, 2003; Jardetsky 2 e Lamb, 2004) . A exposição a condições mais acídicas nas vesículas pode desencadear alterações conformacionais nas proteínas da superfície virai, incluindo as expostas ao péptido de fusão (Kuhn et al., 2002; Lescar et al., 2001). Para a maioria dos vírus, a ligação ao receptor celular consiste principalmente na função de uma proteína da superfície virai, ao passo que a fusão das membranas virai e celular consiste principalmente na função de uma outra proteína da superfície virai. Como exemplo de um vírus com uma proteína diferente de ligação ao receptor e de fusão refere-se o VIH. A proteína de ligação ao receptor de VIH é uma glicoproteína de superfície (SU; gpl20) e a proteína de fusão é uma glicoproteína transmembranar (TM; gp41) (Kwong et al., 1998; Gallaher et al., 1987; 1989). A maioria dos vírus com proteínas de fusão de classe I, em que o péptido de fusão está localizado no terminal amino ou próximo deste, por exemplo, retrovírus, ortomixovírus, paramixovírus, arenavírus e coronavírus, utilizam apenas uma proteínas para a ligação ao receptor e uma outra para a fusão (Wilson et al., 1981; Gallaher et al., 1996; 2001). Os alfavírus, que possuem uma proteína de fusão de classe II, com um péptido de fusão interno, também utilizam principalmente uma proteína para a ligação ao receptor e uma outra proteína para a fusão das membranas virai e celular (Straus e Straus, 1994). A proteína (E) do invólucro codificada por membros dos género flavivírus da família Flaviviridae possui um péptido de fusão interno, o qual serve para a ligação ao receptor e para a função de fusão (Allison et al., 2001). 0 vírus da hepatite C codifica duas glicoproteínas do invólucro, EI (gp35) e E2 (gp70), as quais possuem domínios de ancoragem transmembranares no terminal C (Flint e McKeating, 2000) . A E2 interage com diversas proteínas da superfície das células (CD81, SR-BI e L-SIGN) o que sugere que é a proteína de ligação ao receptor do VHC (McKeating, 3 2004) . A função da EI é menos clara e pode actuar como acompanhante da E2 (Flint et ai., 1999; Garry e Dash, 2003) . Os péptidos sintéticos que correspondem à E2 do vírus da hepatite C podem bloquear infecções mediadas pelo vírus da hepatite C. Determinações estruturais da E2 do vírus da hepatite C permitiram identificar diversas características, até então desconhecidas, da E2 do vírus da hepatite C para o desenvolvimento de fármacos e de vacinas. A família dos flavivírus compreende diversos patogénios humanos e de animais importantes. O vírus da hepatite C (VHC) constitui a causa virai principal de hepatite crónica, cirrose, insuficiência hepática e carcinoma hepatocelular (Poynard et al., 2003). Apenas nos Estados Unidos, estima-se que cerca de 4 milhões de pessoas estejam infectadas com o VHC. Este número representa um número cerca de quatro vezes superior ao número de pessoas infectadas com VIH. Nos Estados Unidos, em cada ano, ocorrem entre 30000 e 50000 novas infecções com VHC e morrem cerca de 15000 a 20000 pessoas. Além do mais, prevê-se que este número aumente dramaticamente devido à porção substancial de indivíduos infectados com VHC que apresentam uma fraca resposta ou mesmo nenhuma aos únicos fármacos aprovados para terapêutica (isto é, tratamento com interferões e/ou ribavirina). A infecção com o VHC propaga-se principalmente através da partilha de agulhas no grupo dos toxicodependentes, embora haja algum risco a partir de acidentes com agulhas, de produtos sanguíneos anteriores a 1992, diálise sanguínea crónica e contacto sexual frequente. Os tratamentos actuais para o VHC utilizando ribavirina e interferão custam aproximadamente entre $8000 e $20000 por ano, e apresentam apenas um sucesso parcial em cerca de metade dos pacientes tratados. No total, cerca de 80% dos portadores do VHC padecem de hepatite crónica e cirrose, e entre estes 25% irão desenvolver doenças terminais de fígado ou carcinoma hepatocelular (HCC) 4 (Colombo, 2000) . A doença de etapa final com VHC constitui a indicação mais frequente para os transplantes hepáticos, sendo o seu custo entre $250000 e $300000. Assim, são extremamente necessários melhores fármacos para tratar infecções com VHC e uma vacina eficaz para a prevenção de infecções com VHC.

DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a composições, tais como definidas nas reivindicações, que compreendem péptidos ou derivados de péptidos e a métodos que utilizam tais composições para o tratamento, para a prevenção ou para a inibição de infecções com o virus da hepatite C (VHC) e com virus associados a este. O inventor concluiu que a glicoproteina E2 codificada pelo VHC (bem como os análogos de virus associados a este) apresenta domínios que ainda não foram descritos, os quais são importantes para a(s) interacção(ões) e para os rearranjos de E2 com E2 e/ou El, para interacções com afinidade elevada com receptores celulares ou para interacções proteína-proteína E2 e E1-E2 que ocorrem antes da fusão virão:membrana celular. Assim, a presente invenção proporciona péptidos e métodos para o tratamento e para a profilaxia de doenças induzidas pelo VHC e por vírus associados a este. A presente invenção diz que a glicoproteina E2 do invólucro do VHC apresenta diversos domínios que podem ser o alvo de péptidos sintéticos para bloquear a infecção e a patogénese. As regiões E2 de VHC são importantes para a ligação do VHC aos seus receptores de afinidade reduzida ou elevada, para rearranjos de E2 ou para interacções proteína-proteína de E2 que ocorrem antes da fusão virão:membrana celular. A presente invenção também diz respeito e proporciona péptidos sintéticos, tais como definidos nas reivindicações, os quais podem inibir a 5 ligação ao receptor e outros passos pré-fusão mediados por E2 de VHC.

As características da glicoproteína 2 do invólucro do vírus da hepatite C aqui identificadas proporcionam linhas de orientação para o desenvolvimento de vacinas e/ou de fármacos para a prevenção ou para o tratamento de infecções com o vírus da hepatite C. 0 alvo dos péptidos é a E2, que a proteína de ligação ao receptor de VHC. Embora tenham sido já desenvolvidas proteínas, tais como CD4 solúvel, quemocinas e anticorpos que bloqueiam a infecção por serem direccionadas às interacções de ligação do receptor virão, não foram ainda descritos os miméticos peptídicos de proteínas da superfície virai que bloqueiam estes e outros passos pré-fusão. Antes de se encontrarem disponíveis os dados de estrutura obtidos por raios X (Qureshi et al., 1990; Wild, et al., 1993; 1994), foram desenvolvidos diversos inibidores de VIH-1 potentes com base no modelo de proteínas de fusão para o VIH-1 de 'Gallaher TM' (Gallaher et al., 1989). Um destes inibidores, o péptido FUZEON® (também designado por enfuvirtida, DP178; T20) demonstrou reduzir substancialmente a carga de VIH-1 em pacientes com SIDA, em ensaios clínicos (Lalezari, et al., 2003). Os fármacos de péptidos, os quais constituem o objecto da presente invenção, também foram desenvolvidos na ausência de dados estruturais por raios X. O FUZEON® é dirigido à proteína de fusão do VIH e às etapas da entrada de VIH que implicam a fusão entre as membranas virai e celular. Há determinados péptidos inibidores da E2 do vírus da hepatite C humana que são dirigidos a etapas diferentes do ciclo de replicação virai do que os que são o alvo do FUZEON® e por outros inibidores peptídicos virais conhecidos. Os fármacos de péptidos à base de E2 deverão ter um desenvolvimento relativamente fácil, com base na identificação da requerente dos domínios E2 que podem ser o alvo de péptidos sintéticos para bloquear a infecção e a patogénese. Uma vez 6 que tenha sido descrito um inibidor peptídico eficaz será possível desenvolver um fármaco não peptídico.

De um modo mais específico, a presente invenção proporciona composições para o tratamento ou para a prevenção de infecção com o vírus da hepatite C. A invenção diz respeito à descoberta, tal como aqui descrita, dos domínios da E2 do vírus da hepatite C, os quais podem ser o alvo de péptidos sintéticos para bloquear as infecções e a patogénese. Os péptidos ou os derivados de péptidos podem inibir a ligação ao receptor do vírus da hepatite C, os rearranjos estruturais da E2 ou as interacções proteína-proteína, ou outros passos pré-fusão. A presente invenção proporciona a usa utilização para o tratamento e para a profilaxia de doenças induzidas pelo vírus da hepatite C.

De acordo com diversas variantes, a invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem um ou vários péptidos seleccionados entre o conjunto constituído por uma qualquer das sequências compreendidas entre a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42.

Um aminoácido homólogo é um aminoácido com uma semelhança química ou funcional em relação a um outro aminoácido. com conjuntos de aminoácidos homólogos refere-se: os aminoácidos não polares: alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos neutros polares: glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos hidrofóbicos: leucina, isoleucina, valina, metionina, alanina, fenilalanina; os aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina; os aminoácidos ácidos e as suas amidas: ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina; os aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano, fenilalanina, histidina; os álcoois de aminoácidos: serina, treonina; e os aminoácidos pequenos: glicina, prolina. 7

Tais péptidos também podem compreender, por exemplo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, um ou vários D-aminoácidos.

De acordo com diversos aspectos desta variante, a invenção proporciona composições que compreendem um ou vários péptidos que possuem um ou vários dos seguintes traços: A) péptidos que possuem a sequência de aminoácidos seleccionado entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, em que a extremidade do terminal N do péptido termina num grupo amino e a extremidade do terminal C termina num grupo carboxilo; B) péptidos que possuem a sequência de aminoácidos seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, em que a extremidade no terminal N do péptido termina num radical seleccionado entre o conjunto constituído por: um grupo acetilo, um grupo hidrofóbico, um grupo carbobenzoxilo, um grupo dansilo, um grupo t-butoxicarbonilo ou um grupo veicular macromolecular, seleccionado entre um conjugado de lipidos, um polietileno-glicol ou um carbo-hidrato e/ou em que a extremidade no terminal C do péptido termina num radical seleccionado entre o conjunto constituído por um grupo amidogénio, um grupo hidrofóbico, um grupo t-butoxi-carbonilo, ou um grupo macromolecular, seleccionado entre um conjugado de lipidos, polietileno-glicol ou um carbo-hidrato; C) péptidos que possuem a sequência de aminoácidos seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, com a excepção de existir pelo menos uma ligação que liga resíduos de aminoácidos adjacentes que é uma ligação não peptídica; D) péptidos que possuem a sequência de aminoácidos seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, com a excepção de existir pelo menos um resíduo aminoácidos que possui a configuração de isómero D. A presente invenção também proporciona anticorpos purificados que reagem de forma especifica com um ou vários dos péptidos descritos antes. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas para o tratamento ou para a prevenção de infecções com o VHC, nas quais a composição compreende um ou vários dos péptidos e/ou dos anticorpos, conforme descritos antes. Há outros aspectos da invenção, os quais são descritos nas reivindicações.

Abreviaturas

VHC - virus da hepatite C HSA - soro de albumina humana

DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS

Figura 1: alinhamento das sequências do péptido E2 de proteina a partir de duas estirpes do virus da hepatite C que mostra as localizações dos péptidos activos. Foram alinhadas sequências E2 obtidas a partir de H77, uma estirpe de genótipo la do VHC e uma estirpe lb um genótipo J4 de VHC. 0 símbolo designa aminoácidos iguais e o símbolo Designa um aminoácido semelhante nas duas sequências. As barras colocadas por cima ou em baixo da sequência de péptido indicam as localizações dos péptidos, as quais são numeradas de acordo com o apresentado nos quadros 7 e 8, e que inibem as infecções com um pseudotipo de VHC.

Figura 2: especificidade dos péptidos inibitórios de E2 de VHC. Os péptidos de E2, numerados de acordo com o descrito nos quadros 7 e 8, foram adicionados a pseudotipos que contêm as proteínas nucleares de VIH e de EI e E2 de VHC, da superfície do vírus da leucemia de murinos e de glicoproteínas transmembranares (SU e TM) ou de glicoproteína do vírus de estomatite vesicular (G) . Os 9 sobrenadantes também foram tratados com o veículo DMSO por si só ou com um Acm (anticorpo monoclonal) para E2 de VHC, o qual é conhecido para neutralizar as infecções com o pseudotipo. 0 péptido tratado e os pseudotipos de controlo foram adicionados às células, as quais foram mantidas a incubar a 37°C durante 72 horas. Os lisados de células foram então testados quando a actividade de luciferase conforme descrito (Hsu et al., 2003).

Figura 3: estruturas de glicoproteínas E2 de hepacivírus que apresentam as localizações dos péptidos activos, numerados de acordo com o descrito nos quadros 7 e 8. Construiu-se um modelo bidimensional da proteína E2 do invólucro de VHC utilizando uma ferramenta informática de proteómica e efectuou-se a comparação com outras proteínas de ligação ao receptor de outros vírus de ARN. Estão indicadas as sequências que proporcionaram uma redução superior a 70% em termos de capacidade de infecção do pseudotipo de VHC.

Figura 4: modelo que ilustra o local de pré-fusão da acção dos péptidos E2 de VHC. Painel A. Perturbação dos péptidos E2 das interacções E1-E2 ou das interacções E2-E2 em virões de VHC. Painel B: perturbação de E2 de VHC de interacções entre virão de VHC-receptor.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a composições e às utilizações de tais composições para a prevenção ou para o tratamento de infecções com o VHC. Em teoria, prevê-se que as composições e utilizações apresentadas sejam efectuadas por meio da inibição da fusão entre o invólucro do virão e a membrana celular, processo este que transporta o genoma virai para o citoplasma celular.

De acordo com várias variantes, a invenção proporciona a identificação e a sequência de péptidos que inibem o VHC, que representam porções específicas da glicoproteína E2 do 10 VHC. Crê-se que estas proteínas de péptidos E2 actuem por meio de interferência com a ligação ao receptor ou com o seu bloqueio. Tais péptidos incluem os péptidos representados pelas SEQ ID NOs: 1 a 42 e seus derivados, conforme a seguir descrito.

De acordo com aspectos particulares desta variante da invenção, as composições que compreendem os péptidos que correspondem à glicoproteína E2 do invólucro do VHC são úteis em intervalos grandes de doses (conforme ilustrado no exemplo 1, estes péptidos são eficazes na inibição da fusão do VHC com células).

Para melhor clarificar a invenção, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a descrição da presente invenção irá ser dividida nas seguintes subsecções. (i) Péptidos da invenção (ii) Utilizações da invenção (incluindo composições e utilizações dos péptidos)

Quadro 1: péptido 1 inibidor de E2 do VHC PROTEÍNA SEQUÊNCIA* HCV E2 a X-LVGLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINS-Z(SEQ ID NO:1) HCV E2 b X-FTSLFSSGASQKIQLVNTNGSWHINR Z (SEQ ID NO:7) HCV E2 a X-LAGLFTSGAKQNIQLINTNGSWHINR-Z (SEQ ID NO:8) HCV E2 b X-FTSFFTRGPSQNLQLVNSNGSWHINS-Z (SEQ ID NO:9) HCV E2 a X-LANLFSSGSKQNLQLINSNGSWHINR-Z (SEQ ID NO:10) HCV E2 as X-LTSFFNPGPQRQLQFVNTNGSWHINS-Z (SEQ ID NO:11) HCV E2 a X-FASLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINR-Z (SEQ ID NO:12)

Quadro 2: péptido 2 inibidor de E2 do VHC PROTEÍNA SEQUÊNCIA* HCV E2 la X-CNESLNTGWLAGLFYQH-Z (SEQ ID NO:2) HCV E2 lb X-CNDSLHTGFLAALFYTH-Z (SEQ ID NO:13) HCV E2 2a X-CNDSLNTGFIASLFYTY-Z (SEQ ID NO:14) HCV E2 3b X-CNDSLNTGFIAGLFYYH-Z (SEQ ID NO:15) 11 HCV E2 4a X-CNDSLNTGFLASLFYTH-Z (SEQ ID NO:16) HCV E2 5a X-CNDSLQTGFIAGLMYAH-Z (SEQ ID NO:17) HCV E2 6a X-CNDSLQTGFLASLFYTH-Z (SEQ ID NO:18)

Quadro 3: péptido 3 inibidor de E2 do VHC PROTEÍNA SEQUÊNCIA* HCV E2 la X-YSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGF-Z (SEQ ID NO:3) HCV E2 lb X-YSWGENETDVMLLNNTRPPQGNWFOCTWMNSTGF-Z (SEQ ID NO:19) HCV E2 2a X-YTWGENETDVFILNSTRPPGGSWFGGTWMNSTGF-Z (SEQ ID NO:20) HCV E2 3b X-YRFGVNESDVFLLTSLRPPQGRWFGCVWMNSTGF-Z (SEQ ID NO:21) HCV E24a X-YTWGENETDVFLLNSTRPPHGAWFGCVWMNSTGF-Z (SEQ ID NO:22) HCV E2 5a X-YNWGSNETDILLLNNIRPPAGNWFGCTWMNSTGF-Z (SEQ ID NO:23) HCV E2 6a X-YTWGENETDVFMLESLRPPTGGWFGCTWMNSTGF-Z (SEQ ID NO:24)

Quadro 4: péptido 4 inibidor de E2 do VHC PROTEÍNA SEQUÊNCIA* HCV E2 la X-DYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGV-Z (SEQ ID NO: 4) HCV E2 lb X-DYPYRLWHYPCTLNFSIFKVRMYVGGV-Z (SEQ ID NO:25) HCV E2 2a X-DYPYRLWHYPCTINYTIFKIRMYVGGV-Z (SEQ ID NO: 26) HCV E2 3b X-DYPYRLWHYPCTVNFSIFKVRMFVGGH-Z (SEQ ID NO:27) HCV E2 4a X-DYPYRLWHFPCTANFSVFNIRTFVGGI-Z (SEQ ID NO:28) HCV E2 5a X-HYPYRLWHYPCTVNYTIFKVRMFIGGL-Z (SEQ ID NO: 29) HCV E2 6a X-DYAYRLWHYPCTVNFTLHKVRMFVGGT-Z (SEQ ID NO:30)

Quadro 5: péptido 5 inibidor de E2 do VHC

PROTEÍNA SEQUÊNCIA* 12 HCV E2 la X-ALSTGLIHLHQNIVDYQYLYGYGSSJASWAIKWEY-Z (SEQ ID NO: 5) HCV E2 lb X-ALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAFVSFAIKWEY-Z (SEQ ID NO:31) HCV E2 2a X-AL5TGLLHLHQNIVDVQNIVDQYGLSPALTKVIVRWEW-Z (SEQ ID NO:32) HCV E2 3b X-RLSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAWGWALKWEF-Z (SEQ ID NO:33) HCV E2 4a X-ALSTGLMLHQNIVDVQYLYGVGSAVVSWALKWEY-Z (SEQ ID NO:34) HCV E2 5a X-ALSTGLWLHQNWDTQYLYGLSSSIVSWAVKWEY-Z (SEQ ID NO:35) HCV E2 6a X-ALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVSTNVTSWVVKWEY-Z (SEQ ID NO:3 6)

Quadro 6: péptido 6 inibidor de E2 do VHC PROTEÍNA SEQUÊNCIA* HCV E2 la X-VVLLFLLLADARVCSCLWMNIILLISQAEA-Z (SEQ ID NO: 6) HCV E2 lb X-ILLLFLLLADARVCACLWMIvILLIAQAEA-Z (SEQ ID NO:37) HCV E2 2a X-VVLLFLLLADARVCACLWMLILLGQAEA-Z (SEQ ID NO:38) HCV E2 3b X-VVLVFLLLADARVCVALWMMLLISQAEA-Z (SEQ ID NO:39) HCV E2 4a X-VVLAFLLLADARVSAYLWMMFMVSQVEA-Z (SEQ ID NO:4 0) . HCV E2 5a X-IMLVFLLLADARICTCLLILLL1CQAEA-Z (SEQ ID NO:41) HCV E2 6a X-IVLMFLVLADARICTCLWLMLLISTVEA-Z (SEQ ID NO:42) 13 Nos quadros 1 a 6, os símbolos "X" e "Z" representam respectivamente, para cada péptido, o radical do terminal N e C. Tal como descrito antes, o radical do terminal N pode ser um grupo amino ou pode ser seleccionado entre o conjunto constituído por um grupo acetilo, um grupo hidrofóbico, um grupo carbobenzoxilo, um grupo dansilo, um grupo t-butoxicarbonilo ou um grupo macrocelular veicular e/ou o radical no terminal C do péptido pode ser um grupo carboxi ou podem ser um radical seleccionado entre o conjunto constituído por um grupo amidogénio, um grupo hidrofóbico, um grupo t-butoxicarbonilo ou um grupo macromolecular. Péptidos da invenção É possível utilizar de acordo com a invenção, qualquer péptido ou proteína, tal como definido nas reivindicações, que iniba a fusão entre o invólucro do virão E2 do vírus da hepatite C e a membrana celular, incluindo ο E2 do vírus da hepatite C que infecta os seres humanos bem como hospedeiros não humanos. De acordo com a invenção, estes inibidores são péptidos associados a diversos domínios que interactuam com a membrana de E2 do vírus da hepatite C, conforme aqui definido.

De acordo com a presente invenção, os péptidos inibidores de E2 do vírus da hepatite C são idênticos ou homólogos às sequências de aminoácidos aqui definidas. microrganismo

Os péptidos podem ser produzidos a partir de proteínas virais que ocorrem naturalmente ou a partir de proteínas virais recombinantes ou então podem ser produzidos utilizando técnicas convencionais de ADN recombinante (v.g., a expressão do péptido por um microrganismo que contém moléculas de ácido nucleico recombinante que codificam o péptido desejado, sob o controlo de um promotor transcripcional adequado, e também a colheita do péptido desejado a partir do microrganismo referido). De 14 preferência, os péptidos da invenção podem ser sintetizados de acordo com qualquer metodologia conhecida na especialidade, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, a síntese de fase sólida de Merrifield (Clark-Lewis et ai., 1986).

Como E2IP refere-se aqueles que contêm, enquanto sequências primárias de aminoácidos, a sequência de aminoácido do péptido 1 inibidor do E2 do vírus da hepatite C: LVGLLTPGAKQNIQLINGSWHWS, SEQ ID NO:1; do péptido 2 inibidor do E2 do VHC: CNESLNTGWLAGLFYQH, SEQ ID NO: 2; do péptido 3 inibidor do E2 do VHC: YSWGANDTDVFVLNN-TRPPLGNWFCCTWMNSTGF, SEQ ID N0:3; do péptido 4 inibidor do E2 do VHC: DYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGV, SEQ ID NO:4; do péptido 5 inibidor do E2 do VHC: X-ALSTGLIHLHQNIVDV-QYLYGVGSSIASWAIKWEY, SEQ ID NO:5; do péptido 6 inibidor do E2 do VHC: VVLLFLLLADARVCSCLWMNELISQAEA, SEQ ID NO:6.

Além disso, conforme salientado antes, de acordo com uma qualquer variante da invenção o radical do terminal N dos péptidos pode ser um grupo amino (conforme é tipicamente encontrado em proteínas/péptidos que ocorrem naturalmente) ou pode ser seleccionado entre o conjunto constituído por um grupo acetilo, um grupo hidrofóbico, um grupo carbobenzoxilo, um grupo dansilo, um grupo t-butoxi-carbonilo ou um grupo veicular macrocelular e/ou o radical do terminal C dos péptidos pode ser um grupo carboxi (conforme é tipicamente encontrado em proteínas/péptidos que ocorrem naturalmente) ou então pode ser um radical seleccionado entre o conjunto constituído por um grupo amidogénio, um grupo hidrofóbico, um grupo t-butoxicarbonilo ou um grupo macrocelular.

Utilidade da invenção

Os péptidos inibidores de E2 do vírus da hepatite C de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para inibir infecções com o vírus da hepatite C e podem, 15 consequentemente, ser utilizados para o tratamento de infecções com o vírus da hepatite C e também para a profilaxia contra infecções com o vírus da hepatite C. os péptidos da invenção podem ser administrados aos pacientes utilizando qualquer veículo farmacêutico estéril e biocompatível, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, soluto salino, soluto salino tamponado, dextrose e água. Os métodos para a administração dos péptidos aos pacientes são bem conhecidos dos especialistas na matéria, incluindo, mas sem que isso constitua qualquer limitação, as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral e intranasal. Além do mais, poderá ser desejável introduzir as composições farmacêuticas da invenção no sistema nervoso central utilizando qualquer via adequado, incluindo injecções intraventricular e intratecal. A presente invenção proporciona composições, em particular composições farmacêuticas, que compreendem péptidos inibidores de E2 do vírus da hepatite C tal como aqui definidos (conforme descrito supra), as quais são administradas por via de liposomas, micropartículas ou microcápsulas. De acordo com diversas variantes, a invenção compreende a utilização de tais composições para se obter uma libertação prolongada de péptidos inibidores de E2 do vírus da hepatite C. Há outras variantes que compreende a administração de FIP ou de seus derivados, ligados a um veículo molecular (v.g., HSA) .

De acordo com diversas variantes, a presente invenção proporciona a administração dos péptidos e/ou de anticorpos específicos desses péptidos inibidores de E2 do vírus da hepatite C a pacientes humanos que padecem de infecções com o vírus da hepatite C. De acordo com diversas variantes, os péptidos e/ou os anticorpos foram já normalmente purificados substancialmente. Tal com aqui utilizado o termo "purificado substancialmente" designa um péptido, um 16 análogo de um péptido ou um anticorpo que apresenta uma pureza superior a cerca de 80%. Mais preferencialmente, o termo "purificado substancialmente" designa um péptido, um análogo de um péptido ou um anticorpo que apresenta uma pureza superior a cerca de 90% ou superior a cerca de 95%. Ainda mais preferencialmente, o termo designa um péptido, um análogo de um péptido ou um anticorpo que apresenta uma pureza superior a 99%. Ao nivel funcional, o termo "purificado substancialmente" designa que está isento de contaminantes até um nivel tal que o torna adequado para os propósitos aqui descritos. Outras variantes proporcionam a administração profiláctica dos péptidos a pacientes em risco de infecções com o vírus da hepatite C.

Os métodos para a identificação da estrutura das proteínas E2 truncadas do vírus da hepatite C compreendem a ligação ao receptor do vírus da hepatite C, os rearranjos estruturais de E2 ou a interacções proteína-proteína ou então a outros passos pré-fusão efectuados pelos membros da família dos Flaviviridae.

De acordo com outras variantes, a invenção proporciona um péptido que satisfaz uma fórmula estrutural selecciona entre um ou várias das fórmulas estruturais seguintes.

Os E2IP da invenção são aqueles que compreendem, enquanto sequências primárias de aminoácidos as sequências de aminoácidos do péptido 1 inibidor de E2 do vírus da hepatite C: LVGLLTPGAKQNIQLINGSWHWS (SEQ ID NO:1); do péptido 2 inibidor do E2 do VHC: CNESLNTGWLAGLFYQH (SEQ ID NO:2); do péptido 3 inibidor do E2 do VHC: YSWGANDTDVFVLNN-TRPPLGNWFCCTWMNSTGF (SEQ ID NO:3); do péptido 4 inibidor do E2 do VHC: DYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGV (SEQ ID NO:4); do péptido 5 inibidor do E2 do VHC: X-ALSTGLIHLHQNIVDV-QYLYGVGSSIASWAIKWEY (SEQ ID NO:5); do péptido 6 inibidor do E2 do VHC: VVLLFLLLADARVCSCLWMNELISQAEA (SEQ ID NO:6).

De acordo com diversas variantes da presente invenção, qualquer um dos péptidos aqui descritos podem conter um 17 grupo amino na extremidade do terminal amino ou pode ser modificado para conter qualquer um dos grupos seguintes: um grupo acetilo, um grupo hidrofóbico ou um grupo veicular macrocelular. De igual modo, o terminal carboxi de qualquer um dos péptidos pode conter um grupo carboxilo ou então pode ser modificado para conter qualquer um dos grupos seguintes: um grupo amidogénio, um grupo hidrofóbico ou um grupo veicular macrocelular. De acordo com outros aspectos desta variante da invenção, o grupo terminal amino é um grupo hidrofóbico, um grupo carbobenzoxilo, um grupo dansilo, um grupo t-butoxicarbonilo, um conjugado de lípidos, um grupo polietileno-glicol ou um carbo-hidrato. De acordo com um qualquer aspecto desta variante, o grupo terminal carboxi pode ser um grupo t-butoxicarbonilo, um conjugado de lipidos, um grupo polietileno-glicol ou um carbo-hidrato.

Além do mais, há aspectos desta variante que incluem péptidos em que pelo menos uma ligação de liga resíduos aminoácidos adjacentes é uma ligação não peptídica. Em particular, de acordo com aspectos preferidos desta variante, a ligação não peptídica é uma ligação imido, éster, hidrazina, semicarbazóide ou azo.

De acordo com outros aspectos desta variante, a invenção proporciona péptidos em que pelo menos um aminoácido é um isómero D de aminoácido.

De acordo com outros aspectos desta variante, a invenção proporciona péptidos em que tenha sido efectuada pelo menos uma substituição de aminoácido de tal forma que um primeiro resíduo aminoácido seja substituído por um segundo resíduo aminoácido diferente. Estas substituições podem ser conservadoras ou não conservadoras, desde que o péptido seja ainda funcional de acordo com a presente invenção.

Tal como salientado supra, os péptidos de acordo com a invenção deverão compreender pelo menos 3 aminoácidos 18 contíguos de uma das SEQ ID NOs indicadas antes e deverão ser um segmento funcional.

De acordo com outras variantes, a invenção proporciona composições que compreendem um ou vários dos péptidos e7ou dos anticorpos aqui descritos, por si sós ou com um composto veículo. De preferência, o veículo é um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Por exemplo, é possível utilizar um ou vários péptidos da presente invenção e/ou um ou vários anticorpos específicos para os péptidos da presente invenção em combinação com um ou vários péptidos ou anticorpos dirigidos a inibição do passo de fusão à membrana mediado pela proteína 1 do invólucro do vírus da hepatite C. tais péptidos encontram-se descritos no pedido de patente de invenção internacional n° WO 2004/044220.

Os péptidos de E2 e EI de VHC e/ou os anticorpos podem actuar de um modo sinérgico (isto é, podem ser activos em concentrações mais baixas em combinação do que quando utilizados por si sós) ou então podem actuar de um modo completar ou suplementar.

EXEMPLOS

Exemplo 1: IDENTIFICAÇÃO DE PÉPTIDOS E2 DO VÍRUS DE HEPATITE QUE INIBIBEM AS INFECÇÕES MEDIADAS PELAS PROTEÍNAS DO INVÓLUCRO DO VHC A associação selectiva de um vírus com a célula alvo é normalmente determinada por uma interacção entre as glicoproteínas da superfície virai e o receptor ou receptores específicos sobre a superfície da célula. A ligação ao receptor constitui um passo essencial para o início de uma infecção e precede outros passos, tais como a fusão entre o vírus e as membranas celulares. As interacções virão:receptor podem definir o alcance do hospedeiro e o tropismos celular ou tecidual de um vírus e podem determinar a sua patogenicidade. O VHC codifica duas 19 glicoproteínas da superfície putativa, EI e E2, sobre as quais de crê que possuam domínios transmembranares no terminal carboxilo que os fixam ao invólucro do vírus. Estudos de expressão in vitro revelaram que a El e a E2 se associam para formar heterodímeros, os quais se acumulam no retículo endoplásmico (RE), que constitui o local previsto para a agregação do VHC (Flint et al., 2004) . Há diversas evidências que sugerem que a E2 é o receptor de ligação de proteínas (Flint e McKeating, 2000). Foi sugerido que a El é a proteína de fusão do VHC (Flint et al., 1999; Garry e Dash, 2003). No entanto, há outros estudos que indicam que a E2 apresenta uma estrutura de proteína de fusão virai de classe II e representa a proteína de fusão do VHC (Yagnik et al.r 2000), sendo possível que a El e a E2 do VHC desempenhem um papel na fusão à membrana. A falta de sistemas in vitro para a propagação do VHC tem impedido os estudos biológicos e fisioquímicos sobre os virões e sobre os seus mecanismos de penetração nas células, permanecendo ainda desconhecidos os receptores celulares. Foi já descrita a existência de VHC purificado a partir do plasma em associação com lipoproteínas do plasma, o que indica que o vírus pode utilizar o receptor lipoproteico de baixa densidade (LDLR) para permitir a entrada nas células (Agnello et al., 1999). Foram já descritas versões solúveis truncadas de E2 que se ligam especificamente a células humanas, as quais foram utilizadas para identificar as interacções com CD81 (Piled et al., 1998; Roccasecca et al., 2003; Cormier et al., 2004), com receptores de depuração de tipo 1 de classe B (SR-B1) (Scarselli et al., 2002), e de nonitegrina que se liga à molécula 3 de adesão intercelular específica de células dendríticas (DC-SIGN) (Pohlmann et al., 2003). Os resultados sugerem que a E2 podem constituir um alvo para o desenvolvimento de fármacos de péptidos contra infecções com o vírus da hepatite C. 20

Materiais e métodos

Para ultrapassar a ausência de um sistema convencional de cultura de células para a propagação do VHC, foram gerados pseudotipos de vírus infecciosos que expressam as glicoproteínas do invólucro do VHC (Hsu et al., 2003). Os pseudotipos com proteínas nucleares de VIH e proteínas do invólucro do VIH foram gerados por co-transfecção de células 293-T com quantidades iguais de plasmídeos que expressam a estirpe H77 de EI e E2 do VHC e o genoma pró-viral deficiente no invólucro do VHC, pNL4.3.Luc.RE (Pohlmann et al., 2003) . Os péptidos de um conjunto de péptidos 18mer, com sobreposição de 7 a 10 aminoácidos e que representam a sequência total de aminoácidos da estirpe H77 de E2 do VHC (genótipo la) e a sequência total de aminoácidos da estirpe J4 do VHC (genótipo lb) foram solubilizados em DMSO a 20% e diluídos (concentração final de DMSO < 2%) . Manteve-se os péptidos a incubar a 37°C antigénio p24-sobrenadantes virais normalizados do pseudotipo de VHC. A concentração média dos péptidos era de -25 μΜ, embora as concentrações reais de alguns péptidos em solução fossem de 10 μΜ ou inferiores, devido à fraca solubilidade em DMSO. Tratou-se também os sobrenadantes com veículo de DMSO por si só ou com um Acm (anticorpo monoclonal) para a E2 do VHC, que é conhecido para neutralizar as infecções com o pseudotipo. Adicionou-se os péptidos tratados e os pseudotipos de VHC de controlo a células, manteve-se a incubar durante 16 horas, removeu-se os vírus e manteve-se as células a incubar a 37°C durante 72 horas. Testou-se então os lisados de células quanto à actividade de luciferase, conforme descrito (Hsu et al., 2003) .

Resultados e discussão

Testou-se cinquenta péptidos E2 la H77 do VHC num ensaio de inf ect ividade do VHC e nove demonstraram uma 21 inibição superior a 70% em infectividade, tendo diversos demonstrando uma inibição aproximadamente de 95% (quadro 7). De 46 péptidos E2 lb J4 do VHC testados quatro demonstraram uma inibição superior a 70% de infectividade (quadro 8); diversos dos péptidos inibidores estavam a sobrepor-se à sequência de E2, por exemplo, os péptidos 4 e 5 de E2 la H77 do VHC, os 32 e 33 e os 43, 44, 45 e 46 (fig. 1). Tais resultados sugerem que qualquer um dos diversos péptidos alvo de uma região particular poderão ser inibitórios. Uma comparação entre dois conjuntos de péptidos E2, estirpes H77 e J4, demonstram que embora péptidos semelhantes possam ser inibitórios (isto é, os péptidos 32, 33 e 108, 109), há outros péptidos com sequências relativamente semelhantes que não são inibitórios (isto é, os péptidos 4, 5 e 99).

Os péptidos inibidores de E2 seleccionados foram adicionados a pseudotipos que contêm as proteínas nucleares do VHC e a glicoproteínas de leucemia de murino, glicoproteínas de superfície de vírus e glicoproteínas transmembranares (MuLV, SU e TM) ou glicoproteínas do vírus da estomatite vesicular (VSV G). Tais péptidos inibiram os pseudotipos com EI e E2 do VHC (fig. 2A) , mas nenhum deles inibiu de um modo significativo os pseudotipos de MuLV ou de VSV (figs. 2B e 2C) . os resultados indicam que estes péptidos inibidores de E2 do VHC são específicos para a inibição de infecções com VHC. Os resultados também demonstraram o potencial dos péptidos E2 enquanto fármacos anti-VHC.

Quadro 7. Identificação de péptidos inibidores de E2 do VHC (estirpe H77) que ini bem a infectividade com VHC. Péptido la H77 de VHC Unidades de luciferaset Percentagem de inibição 1 250.376 1—1 2 447.336 0,2 22 Péptido la H77 de VHC Unidades de Percentagem de luciferaset inibição 3 447.906 0, 05 4 10.620 97,6 5 48.000 89,3 6 503.446 -12,3 7 381.340 14, 9 8 113.650 74,6 9 501.126 -11, 8 10 334.196 25,4 11 360.410 19,6 12 417.706 6, 8 13 313.323 31,1 14 279.626 37, 6 15 253.410 43,5 16 403.430 10,0 17 254.516 43,2 18 435.026 2, 9 19 301.406 32,7 20 231.373 48,4 21 242.223 45, 9 22 245.900 45,2 23 367.916 17, 9 24 391.886 19, 7 25 480.280 7,2 26 216.706 51, 6 27 575.206 -28,4 28 394.780 11, 9 29 297.353 33, 6 30 655.040 -46,2 31 419.263 6,4 32 85.086 00 Η* O 33 22.406 95, 0 34 354.696 21,8 23 Péptido la H77 de VHC Unidades de luciferaset Percentagem de inibição 35 153.553 66, 7 36 535.016 -19, 5 37 585.553 -30,7 38 345.110 23, 0 39 400.756 11, 6 40 442.346 1,3 41 434.743 3, 0 42 353.516 19,1 43 32.283 92,8 44 91.266 79, 6 45 24.703 94,5 4 6 103.040 77,0 47 195.320 56,4 48 290.786 35, 1 49 307.310 31,4 50 58.790 87, 9 Virus por si só 448.123 Vírus mais anti-E2 2/69a 10.309 97, 6 Vírus mais anti-E2 9/27 3.567 99,2 t Os números representam o número de unidades de luciferase (lúmenes) produzidos após infecção com o VHC ou com o pseudotipo MLV na presença do péptido numa concentração de ~25 μΜ. Os resultados com uma inibição superior a 70% estão indicados a neqrito.

Quadro 8. Identificação de péptidos inibidores de E2 do VHC _(estirpe J4) que inibem a infectividade com VHC._ Péptido lb J4 de VHC Unidades de luciferaset Percentagem de inibição 54 372.393 17, 9 81 480.623 -7,3 82 173.156 61,4 24 Péptido lb J4 de VHC Unidades de Percentagem de luciferaset inibição 83 518.993 -15, 8 84 392.023 12,5 85 112.260 74,9 51 237.086 47, 1 86 398.110 11,2 87 399.700 10,8 88 412.776 7, 9 899 449.293 -0,3 90 423.326 5,5 91 160.883 69, 1 92 372.400 16,9 93 409.220 9,7 94 311.736 30,4 95 538.110 -20, 1 96 544.596 -21,5 97 218.673 51,2 98 467.636 -4,4 99 111.043 75,2 100 518.190 -15, 6 101 502.096 -12, 0 102 377.216 15, 8 103 305.690 31,8 104 419.876 6,3 105 552.170 -23,2 106 193.533 60,4 107 402.976 11, 1 108 40.853 90, 9 109 96.893 79,4 110 602.506 -34,5 111 632.613 -39, 2 112 527.950 -17, 8 113 570.553 -27,3 25 Péptido lb J4 de VHC Unidades de luciferaset Percentagem de inibição 114 270.190 39, 7 115 475.713 -6, 2 116 394.096 12, 1 117 359.236 19, 8 119 69.220 84, 6 120 463.243 -3,4 121 338.200 24,5 t Os números representam o número de unidades de luciferase (lúmenes) produzidos após infecção com o VHC ou com o pseudotipo MLV na presença do péptido numa concentração de ~25 μΜ. As amostras foram comparadas com os controlos descritos no quadro 7. Os resultados com uma inibição superior a 70% estão indicados a negrito.

Quadro 9. Sequência e localização dos péptidos apresentados no quadro 7. Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposição IP E2 do VHC 1 379-396 AGVDAETHVTGGSAGRTT (SEQ ID NO 43) 2 386-403 HVTGGSAGRTTAGLVGLL (SEQ ID NO 44) 3 393-410 GRTTAGLVGLLTP GAKQN (SEQ ID NO 45) HCV E2IP 1 4 399-417 VGLLTPGAKQMQLINTN (SEQ ID NO 46) HCV E2IP 1 5 407-424 AKQNIQLINTNGSWHINS (SEQ ID NO 47) HCV E2IP 1 6 414-431 INTNGSWHINSTALNCNE (SEQ ID NO 48) HCV E2IP 1 26 Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposição IP E2 do VHC 7 421-438 HINSTALNCNESLNTGWL (SEQ ID NO 49) HCV E2IP 1/2 8 428-445 NCNESLNTGWLAGLFYQH (SEQ ID NO 50) HCV E2IP 2 9 442-459 FYQHKFNSSGCPERLASC (SEQ ID NO 51) HCV E2IP 2 10 4 4 9 — 4 6 6 SSGCPERLASCRRLTDFA (SEQ ID NO 52) 11 456-473 LASCRRLTDFAQGWGPIS (SEQ ID NO 53) 12 463-480 TDFAQGWGPISYANGSGL (SEQ ID NO 54) 13 470-487 GPISYANGSGLDERPYCW (SEQ ID NO 55) 14 477-494 GSGLDERPYCWHYPPRPC (SEQ ID NO 56) 15 486-501 PYCWHYPPRPCGIVPAKS (SEQ ID NO 57) 16 491-508 PRPCGIVPAKSVCGPVYC (SEQ ID NO 58) 17 501-515 PAKSVCGPVYCFTPSPW (SEQ ID NO 59) 18 505-522 PVYCFTPSPVWGTTDRS (SEQ ID NO 60) 19 512-529 SPVWGTTDRSGAPTYSW (SEQ ID NO 61) HCV E2IP 3 20 526-543 TYSWGANDTDVFVLNNTR (SEQ ID NO 62) HCV E2IP 3 21 533-550 DTDVFVLNNTRPPLGNWF (SEQ ID NO 63) HCV E2IP 3 22 540-557 NNTRPPLGNWFGCTWMNS (SEQ ID NO 64) HCV E2IP 3 27 Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposição IP E2 do VHC 23 547-564 GNWFGCTWMNSTGFTKVC (SEQ ID NO 65) HCV E2IP 3 24 554-571 WMNSTGFTKVCGAPPCVI (SEQ ID NO 66) HCV E2IP 3 25 561-578 TKVCGAPPCVIGGVGNNT (SEQ ID NO 67) 26 568-585 PCVIGGVGNNTLLCPTDC (SEQ ID NO 68) 27 575-592 GNNTLLCPTDCFRKHPEA (SEQ ID NO 69) 28 582-599 PTDCFRKHPEATYSRCGS (SEQ ID NO 70) 29 589-606 HPEATYSRCGSGPWITPR (SEQ ID NO 71) 30 596-613 RCGSGPWITPRCMVDYPY (SEQ ID NO 72) HCV E2IP 4 31 603-620 ITPRCMVDYPYRLWHYPC (SEQ ID NO 73) HCV E2IP 4 32 610-627 DYPYRLWHYPCTINYTIF (SEQ ID NO 74) HCV E2IP 4 33 617-634 HYPCTINYTIFKVRiVIYVG (SEQ ID NO 75) HCV E2IP 4 34 624-641 YTIFKVRMYVGGVEHRLE (SEQ ID NO 76) HCV E2IP 4 35 631-648 MYVGGVEHRLEAACNWTR (SEQ ID NO 77) HCV E2IP 4 36 638-655 HRLEAACNWTRGERCDLE (SEQ ID NO 78) 37 645-662 NWTRGERCDLEDRDRSEL (SEQ ID NO 79) 38 652-669 CDLEDRDRSELSPLLLST (SEQ ID NO 80) 28 Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposição IP E2 do VHC 39 659-676 RSELSPLLLSTTQWQVLP (SEQ ID NO 81) 40 666-683 LLSTTQWQVLPCSFTTLP (SEQ ID NO 82) 41 673-690 QVLPCSFTTLPALSTGLI (SEQ ID NO 83) HCV E2IP 5 42 680-697 TTLPALSTGLIHLHQNIV (SEQ ID NO 84) HCV E2IP 5 43 687-704 TGLIHLHQNIVDVQYLYG (SEQ ID NO 85) HCV E2IP 5 44 694-711 QNIVDVQYLYGVGS SIAS (SEQ ID NO 86) HCV E21P 5 45 701-718 YLYGVGSSIASWAIKWEY (SEQ ID NO 87) HCV E21P 5 46 708-725 SIASWAIKWE YWLLFLL (SEQ ID NO 88) HCV E2IP 5/6 47 715-732 KWEYWLLFLLLADARVC (SEQ ID NO 89) HCV E21P 5/6 48 722-739 LFLLLADARVCSCLWMML (SEQ ID NO 90) HCV E21P 6 49 729-746 ARVGSCLWMMLLISQAEA (SEQ ID NO 91) HCV E21P 6 50 756-773 WMMLLISQAEAALENLVI (SEQ ID NO 92) HCV E2IP 6 A numeração diz respeito à numeração obtida a partir do n° de adesão ao Genbank NP_671491

Quadro 10. Sequência e localização dos péptidos apresentados no quadro 7. 29 Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposiçã o IP E2 do VHC 54 (379-396) AGVDGE T Η T T GRVAGHTT (SEQ ID NO 93) 80 (386-403) HTTGRVAGHTTSGFTSLF (SEQ ID NO 94) HCV E2IP 1 81 (393-410) GHTTSGFTSLFSSGASQK (SEQ ID NO 95) HCV E2IP 1 82 (400-417) TSLFSSGASQKIQLVNTN (SEQ ID NO 96) HCV E2IP 1 83 (407-424) ASQKIQLVNTNGSWHINR (SEQ ID NO 97) HCV E2IP 1 84 (421-438) HINRTALNCNOSLQTGFF (SEQ ID NO 98) HCV E2IP 1/2 85 (428-445) NCNDSLQTGFFAALFYAH (SEQ ID NO 99) HCV E21P 2 51 (435-452) TGFFAALFYAHKFNSSGC (SEQ ID NO 100) HCV E2IP 2 86 (442-459) FYAHKFNSSGCPERMASC (SEQ ID NO 101) HCV E21P 2 87 (449-466) SSGCPERMASCRPIDWFA (SEQ ID NO 102) 88 (456-473) MASCRPIDWFAQGWGPIT (SEQ ID NO 103) 89 (463-480) DWFAQGWGPITYTKPNSS (SEQ ID NO 104) 90 (477-494) PNS SDQRPYCWHYAPRPC (SEQ ID NO 105) 91 (484-501) PYCWHYAPRPCGWPASQ (SEQ ID NO 106) 92 (491-508) PRPCGWPASQVCGPVYC (SEQ ID NO 107) 30 Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposiçã o IP E2 do VHC 93 (498-515) PASQVCGPVYCFTPSPW (SEQ ID NO 108) 94 (505-522) PVYCFTPSPVWGTTDRS (SEQ ID NO 109) 95 (512-529) SPWVGTTDRSGVPTYSW (SEQ ID NO 110) HCV E2IP 3 96 (519-536) TDRSGVPTYSWGENETDV (SEQ ID NO 111) HCV E2IP 3 97 (526-543) TYSWGENETDVMLLNNTR (SEQ ID NO 112) HCV E2IP 3 98 (533-550) E T D VML LNN TRPPQGNWF (SEQ ID NO 113) HCV E2IP 3 99 (540-557) NNTRPPQGNWFGCTWMNS (SEQ ID NO 114) HCV E21P 3 100 (554-571) WMNSTGFTKTCGGPPCNI (SEQ ID NO 115) HCV E2IP 3 101 (561-578) TKTCGGPPCNIGGVGNRT (SEQ ID NO 116) 102 (568-585) PCNIGGVGNRTL ICPTDC (SEQ ID NO 117) 103 (575-592) GNRTLICPTDCF RKHPEA (SEQ ID NO 118) 104 (582-599) PTDCFRKHPEATYTKCGS (SEQ ID NO 119) 105 (589-606) HPEATYTKCGSGPWLTPR (SEQ ID NO 120) 31 Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposiçã o IP E2 do VHC 106 (586-613) KCGSGPWLTPRCLVDYPY (SEQ ID NO 121) HCV E2IP 4 107 (603-620) LTPRCLVDYPYRLWHYPC (SEQ ID NO 122) HCV E21P 4 108 (610-627) DYPYRLWHYPCTLNFSIF (SEQ ID NO 123) HCV E21P 4 109 (617-634) HYPCTLNFSIFKVRMYVG (SEQ ID NO 124) HCV E2IP 4 110 (631-648) MYVGGVEHRLNAACNWTR (SEQ ID NO 125) HCV E2IP4 111 1 (638-655) HRLNAACNWTRGERCNLE (SEQ ID NO 126) 112 (645-662) NWTRGERCNLEDRDRSEL (SEQ ID NO 127) 113 (652-669) CNLEDRDRSELSPLLLST (SEQ ID NO 128) 114 (659-676) RSELSPLLLSTTEWQILP (SEQ ID NO 129) 115 (666-683) LLSTTEWQILPCAFRTLP (SEQ ID NO 130) 116 (673-690) QILPCAFTTLPALSTGLI (SEQ ID NO 131) HCV E21P 5 117 (680-697) TTLPALSTGLIHLHQNIV (SEQ ID NO 132) HCV E21P 5 118 (694-711) QNIVDVQYLYGVGSAFVS (SEQ ID NO 133) HCV E21P 5 119 (708-725) AFVSFAIKWEYILLLFLL (SEQ ID NO 134) HCV E21P 5/6 120 (722-739) LFLLLADARVCACLWMML (SEQ ID NO 135) HCV E2IP 6 32 Péptido la H77 de VHC Localização do péptido* Sequência de aminoácido Sobreposiçã o IP E2 do VHC 121 (729-746) ARVCAC LWMMLLIAQAEA (SEQ ID NO 136) HCV E2IP 6 A numeração diz respeito à numeração obtida a partir do n° de adesão ao Genbank BAA01583

Os péptidos dos quadros 7 a 10 são um conjunto de péptidos sobrepostos que representam a E2 de duas estirpes do VHC (H77 e J4) . As SEQ ID NOs 1 a 6 representam as versões longas das "sequências" sublinhadas a amarelo nos quadros 7 a 10. As bases para a concepção das SEQ ID NOs 1 a 6 compreendem o facto de o péptido inibidor poder incluir sequências de flanqueamento e que o péptido óptimo final pode ser um fragmento do seu péptido mais longo. As SEQ ID NOs 7 a 42 são variantes das SEQ ID NOs 1 a 6 que representam sequências análogas obtidas a partir de proteínas E2 de outros genótipos principais do VHC.

EXEMPLO 2: Modelo informático proteómico de E2 do VHC

Uma vez que o VHC não pode ser propagado em cultura de células, encontram-se disponíveis números insuficientes de virões para efectuar as análises estruturais. Assim, a não foi determinada a estrutura molecular de E2 do VHC e é ainda presentemente desconhecida. Na ausência de uma estrutura cristalográf ica por raios X da E2 do VHC, é possível obter dados estruturais úteis utilizando análises computacionais desenvolvidas recentemente auxiliadas por comparações com outras glicoproteínas virais com estrutura conhecida. Um tal modelo de E2 do VHC podem ser útil para definir mecanismos de acção potenciais dos péptidos inibidores de E2.

Materiais e métodos 33

Foram utilizados os subtipos mais comuns representativos do virus da hepatite C para efectuar as comparações estruturais e de sequências. As estirpes examinadas foram uma estirpe H77 do protótipo do HVC humano (subtipo 1, número de adesão ao Genbank NP_751921), uma estirpe HC-J4 (subtipo Ib, n° de adesão ao Genbank BAA01583), uma estirpe NDM59 (subtipo 2a, número de adesão ao Genbank AF169005), uma estirpe TrKj (subtipos 3b, n° de adesão ao Genbank D49374), uma estirpe ED43 (subtipo 4a, n° de adesão ao Genbank Y11604), uma estirpe EUH1480 (subtipo 5a, n° de adesão ao Genbank Y13184), uma estirpe euhk2 (subtipo 6a, n° de adesão ao Genbank Y12083).

Os métodos para se obter os modelos gerais de glicoproteinas de superfície foram já descritos antes (Gallaher et al., 1989). 0 PRSS3, um programa obtido a partir de rdf2 (Pearson e Lipman, 1988), o qual utiliza o algoritmo de alinhamento de sequências de Smith-Waterman (Smith e Waterman, 1981), foi utilizado para determinar a importância dos alinhamentos de proteínas. 0 PRSS3 é uma parte do conjunto FASTA de programas de análise de sequências disponibilizado por um domínio ftp anónimo, disponível em ftp.virginia.edu. Foram utilizados os parâmetros por defeito para o PRSS3, incluindo a matriz de resultados blosum50, uma penalização de abertura de intervalos de 12, e uma penalização de extensão de intervalos de 2. Utilizou-se o MacMolly (Soft Gene GmbH, Berlim) para localizar áreas com uma similaridade de sequência limitada e para efectuar as análises de Chou-Fasman e de Robson-Garnier (Biou et al., 1988; Chou e Fasman, 1974). 0 PHDsec (Columbia University Bioinformatics Center, http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein/) foi o método preferido para a previsão da estrutura secundária (Rost e Liu, 2003) . 0 PHDsec prevê a estrutura secundária a partir de alinhamentos múltiplos de sequências por meio de um sistema de redes neurais e apresenta uma precisão média 34 esperada de 72% para as três estruturas, hélice, cadeia e ansa. Foram identificados os domínios com uma propensão significativa para realizarem hélices transmembranares utilizando TMpred (ExPASy, Swiss Institute of Bioinformatics, http://www.ch.embnet.org/sofWare/TMPREDjform.html). 0 TMpred tem por base uma análise estatística de TMbase, que é uma base de dados de glicoproteínas transmembranares que ocorrem naturalmente (Hofmann e Stoffel, 1993). As sequências com uma propensão para se repartires na bicamada de lípidos foram identificadas utilizando a versão 2.2a de 'Membrane Protein eXplorer', disponibilizado por Stephen White laboratory, utilizando os parâmetros por defeito (White et al., 2003).

Resultados e discussão

Desenvolveu-se um modelo bidimensional da E2 do VHC com base na aplicação de análises computacionais de proteómica e por comparação com estruturas conhecidas de outras proteínas virais de invólucro de ligação ao receptor (fig. 3) . As estruturas secundárias de E2 do VHC apresentadas na fig. 3 estão em conformidade com o algoritmo de alinhamento de estruturas secundárias PHDsec e também são normalmente consistentes com as previsões de Chou-Fasman e de Robson-Garnier. Uma característica importante do modelo de E2 consiste na predominância de estruturas de folha beta em dois terços do terminal amino da molécula e de estruturas alfa em hélice na terça parte do terminal carboxilo da molécula. As ligações dicisteína foram previstas com base em comparações com glicoproteínas de invólucros de retrovírus. Em cisteínas adjacentes a proteínas de invólucro retroviral que estejam separadas por mais de 15 aminoácidos, estas encontram-se normalmente ligadas entre si de um modo covalente. Em conjuntos de quatro cisteínas que estejam separadas entre si por menos de 15 aminoácidos, estes encontram-se ligados de um modo 35 covalente a uma cisteína não adjacente do conjunto. As duas primeiras hélices alfa previstas na terça parte do terminal carboxilo de E2 formam uma prevista estrutura análoga em stem relativamente à região stem de outras proteínas de invólucro de flavivírus (Allison et al., 1999). A estrutura ilustrada do domínio transmembranar foi prevista recorrendo ao algoritmo TMPRED.

Os péptidos inibidores de E2 do VHC mapeiam regiões no modelo de E2 do VHC que correspondem a uma região do terminal amino, um conjunto de cisteína, à região stem, e ao domínio transmembranar (regiões a sombreado na fig. 3) . Estes domínios de E2 do VHC podem estar implicados na ligação ao receptor do vírus da hepatite C, a rearranjos estruturais de E2 ou a interacções proteína-proteína ou ainda a outros passos pré-fusão. Os péptidos inibidores de E2 do VHC podem ser utilizados para interferir com estes passos iniciais de uma infecção com o VHC, conforme ilustrado na fig.4.

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<210> 1 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 1

Lsti Vsl Sljjf Lstí Thy Par© Ala Gin Asft Ilê 61¾ tetí lié 1 " 5 10 .15 .ftsfl: Thr hsti 61y S«y frp Sís 11« .Asm S«r 20

<210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 2 38

Cys Asa Se? Asa ?hr <sly frp Ma Siy Leu Pfeè tyx Gin é 5 10 lã

His

<210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 3

Tyr Se? ttp Sly Ala Asm Asp Thr Asp Vai Phe Vai Leu Asm Asr$ 1 5 10 15

Ar g ?ro ?co Leu 61 y Asís tfcp 8he Siy Cys Xhr Trp Mefc Asn Ser Wu* 20 25 30

Siy rhe

<210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 4

Asp ryx Frc Tyx Arg L«is fsp His Xpr Pko Cys Thr lie Asm fys fhr 1 5 ' 10 lt>

Ha ASe tyg vai Aeg Met Tyr Vai CfLy Ciy Vai 20 25

<210> 5 <211> 35 <212> PRT <213> Sequência artificial

39 <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 5 Ala S,®u Ser fhr Sly teu I 5 11® Gin fyr teu Tyr flly Vai acs eiy trp· 01« Tyr 3S <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 6 Vai Vai Leu Laa Phe teu 1 5 teu Leu Τΐρ· !4&t íSet te» teu 20: Ile <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 7 Pise thr Ser Leu Phe Ser 1 5 Ser Asfi Tísr Asm Gly Ser Trp T!:Á His <210> 8 <211> 26 <212> PRT

His teu His íSlsi Asn Sla Vai Asp Vai 10 13 S®x ter 11® Ala Ser- Trp Ala II® Ly.s 2S 30 &çu Alo Asp Ala Arg Vel Cya Ser Cys 1.0 IS Ser Gin Ala Gíu Ala 25 í;.ly Ala Ser Gls Lya He <31» teu Vai 1Q 15 íle A*m Arg ‘“i? S«s| 40 <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 8 feea Me Sly Pisa fhx Sar Giy Ma bys Gin Asn lie Gin t*eu He 1 s 1Õ 15 As» tfsi: Ãsn Sl.y Ser Txp sás tie As» teq as as <210> 9 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 9 Pft* Thr Se.r Phé Phe Shar ftrg Qiy Frõ Ser Gin ftsp &e« Gin I-eu Vsl I & XO 15 As» Sei "As» Cly Ser Trp ais Ile ftsri Sêr 20 as <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 10 Íí«u Ma Asr: Ffta Ser Ser Sly Ser fys 61«. As» Xisa SIn lie 1 5 l<3 IS Asft Ser aso Sly Ser frp Sis íle ASft Mg 20 as <210 > 11 <211> 26 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> 41 41 <223> <4 Ο 0> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> <210 > <211> <212> <213> <22 0> <223> <4 Ο 0> <210> <211> <212> <213> <22 0> <223> <4 Ο 0> Péptido sintético 11

Jtóu Thr S«r Fhe hm 61 y Pxo 61« Mg Gin hm 61» Ete Vai 1 5 12 15·

Asn Thr Asn 61y Ser Trp Kis Ila Asn Ser 2C- 25 12 26

PRT

Sequência artificial Péptido sintético 12

Phe Ala Ser Leu &*u Tltt Frís Gly Alá hy» Si« As» .lie Gin l-ew Ile

1 5 ' 10 IS

Asn 'íhr Asrs Sly Ser Trp Sís Ilé A&n Arg 20 23 13 17

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Sequência artificial Péptido sintético 13

CyS ÂSR Â&p Ser 5,.«y K.í s. Tbr Fhs JUeu Ma Ale teu Phs Tys Thx 14 17

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PRT Vírus da hepatite C 137

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355 MG

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<213> Vírus da hepatite C 83<400> 138

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Trp M®t Met Leu IXe Ms Slis 355 360 85

REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pelo requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • US 3050000 A [0004] • WO 2004044220 A [0041]

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Lisboa, 18/10/2010

Claims (16)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica que compreende um ou vários péptidos seleccionados entre o conjunto constituído por um péptido que compreende uma sequência seleccionada entre a SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42.

2. Composição farmacêutica que compreende pelo menos um péptido seleccionado entre um ou vários dos seguintes: a) um péptido constituído pela sequência de aminoácidos seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, em que o radical do terminal N é um grupo amino e o radical do terminal C é um grupo carboxilo; b) um péptido constituído pela sequência de aminoácidos seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, em que o radical grupo amino do terminal N é substituído por um radical do terminal N seleccionado entre o conjunto constituído por: um grupo acetilo, um grupo hidrofóbico, um grupo carbobenzoxilo, um grupo dansilo, um grupo t-butoxicarbonilo ou um grupo que é um veículo macromolecular, seleccionado entre um conjugado de lípidos, um polietileno-glicol ou um hidrato de carbono e/ou em que o grupo carboxilo do terminal C é substituído por um radical no terminal C seleccionado entre o conjunto constituído por um grupo amidogénio, um grupo hidrofóbico, um grupo t-butoxi-carbonilo, ou um grupo macromolecular, seleccionado entre um conjugado de lípidos, polietileno-glicol ou um hidrato de carbono; c) um péptido constituído pela sequência seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, em que há pelo menos uma ligação que liga resíduos aminoácidos adjacentes que é uma ligação não peptídica; d) um péptido constituído pela sequência seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, em que 2 há pelo menos um resíduo de aminoácido que apresenta a configuração de isómero D.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que o radical terminal no aminoácido do terminal amino é um grupo acetilo, um grupo hidrofóbico, um grupo carbobenzoxilo, um grupo dansilo, um grupo t-butoxicarbonilo ou um grupo que é um veículo macrocelular seleccionado entre um conjugado de lípidos, um polietileno-glicol ou um hidrato de carbono e/ou o radical terminal no aminoácido do terminal C é um grupo hidrofóbico, um grupo t-butoxicarbonilo ou um grupo macrocelular seleccionado entre um conjugado de lípidos, um polietileno-glicol ou um hidrato de carbono.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que a composição compreende um péptido constituído por uma sequência seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 42, em que o radical terminal no aminoácido do terminal amino é um grupo que é um veículo macrocelular seleccionado entre um conjugado de lípidos, um polietileno-glicol ou um hidrato de carbono e/ou o radical terminal no aminoácido do terminal C é um grupo que é um veículo macrocelular seleccionado entre um conjugado de lípidos, um polietileno-glicol ou um hidrato de carbono.

5. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menos uma ligação é uma ligação não peptídica, seleccionada entre o conjunto constituído por uma ligação imido, uma ligação éster, uma ligação hidrazina, uma ligação semicarbazóide ou uma ligação azo.

6. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que pelo menos um aminoácido é um isómero D de um aminoácido. 3

7. Composição de acordo com a reivindicação 2, em que o radical terminal no grupo aminoácido do terminal N é um grupo amino e o radical terminal no aminoácido do terminal C é um grupo carboxilo.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um péptido é seleccionado entre o conjunto de péptidos constituído por uma sequência seleccionada entre as SEQ ID NO: 7 a 42.

9. Medicamento utilizável no tratamento ou na prevenção de infecções com o vírus da hepatite C num paciente, em que o medicamento compreende uma composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 8.

10. Utilização de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou para a prevenção de infecções com o vírus da hepatite C num paciente.

11. Anticorpo substancialmente purificado que é preparado utilizando, como imunogéneo, um péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

12. Medicamento utilizável no tratamento ou na prevenção de infecções com o vírus da hepatite C num paciente, em que o medicamento compreende um ou vários péptidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e/ou um anticorpo de acordo com a reivindicação 11, o qual compreende ainda um ou vários péptidos e/ou um ou vários anticorpos com o objectivo de inibir o passo de fusão à membrana mediado pela proteína 1 do invólucro do vírus da hepatite C. 4

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11 utilizável no tratamento ou na prevenção de infecções com o virus da hepatite C num paciente.

14. Utilização de uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e/ou de um anticorpo de acordo com a reivindicação 11 na preparação de um medicamento para o tratamento ou para a prevenção de infecções com o virus da hepatite C num paciente.

15. Péptido constituído por uma sequência seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 6.

16. Péptido constituído por uma sequência seleccionada entre qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a 42. Lisboa, 18/10/2010