ES2349153T3

ES2349153T3 - Inhibidores del virus de la hepatitis c.

Info

Publication number: ES2349153T3
Application number: ES05814026T
Authority: ES
Inventors: Robert F. Garry; Jane A. Mckeating
Original assignee: Rockefeller University; Tulane University
Current assignee: Rockefeller University; Tulane University
Priority date: 2004-09-29
Filing date: 2005-09-26
Publication date: 2010-12-28
Anticipated expiration: 2025-09-26
Also published as: DE602005022463D1; US20080241156A1; US20060069027A1; WO2006039326A2; CA2582095A1; US7381705B2; AU2005292135A1; AU2005292135B2; JP2008514717A; ATE474587T1; JP4980915B2; PT1797112E; WO2006039326A3; EP1797112A2; EP1797112A4; PL1797112T3; EP1797112B1

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en un péptido que consiste en por la secuencia de una cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº: 42.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a péptidos y usos de los mismos en el tratamiento o prevención de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los virus deben infectar las células huésped para replicarse, producir una infección que se disemine y causar enfermedad. La infección por virus con cubierta requiere la unión del virión a una o más estructuras sobre la superficie de la célula (Flint y McKeating, 2000). La etapa inicial puede ser una unión inespecífica de baja afinidad (Barth y col., 2003). Posteriormente, el virus se une a los receptores primarios con alta afinidad y, después, en algunos casos, a los receptores secundarios o co-receptores (Bartosch y coI., 2003; Hsu y col., 2003; Roccasecca y coI., 2003; Cormier y coI., 2003; Pohlmann y coI., 2003; Zhang y coI., 2004). Las etapas de unión a la superficie celular se pueden asociar con una variedad de reorganizaciones estructurales sobre las proteínas de superficie del virión y cambios en las interacciones proteína-proteína entre las proteínas de la superficie viral (Jardetsky y Lamb, 2004; Modis y coI., 2004; Bressanelli y coI., 2004; Gibbons y col., 2004). Las últimas etapas pueden exponer el péptido de fusión, un dominio hidrófobo de una glicoproteína viral que es capaz de interaccionar con las membranas celulares (Flint y coI., 1999; Allison y coI., 2001). En algunos casos, la unión del virus a los receptores de la superficie celular desencadena la captación del virus por vías endocítica o vesicular similar (Garry y Dash, 2003; Jardetsky y Lamb, 2004). La exposición a condiciones más ácidas en las vesículas puede desencadenar cambios conformacionales en las proteínas de la superficie viral, incluidas las que exponen el péptido de fusión (Kuhn y coI., 2002; Lescar y col., 2001). Para la mayoría de los virus, la unión al receptor celular es, principalmente, la función de una proteína de la superficie viral, mientras que la fusión de las membranas celular y viral es, principalmente, la función de otra proteína de la superficie viral. Un ejemplo de un virus con proteínas distintas de unión al receptor y de fusión es el VIH. La proteína de unión al receptor del VIH es la glicoproteína de superficie (SU; gp120) y la proteína de fusión es la glicoproteína transmembrana (TM; gp41) (Kwong y coI., 1998; Gallaher y coI., 1987; 1989). La mayoría de los virus con proteínas de fusión de clase I en las que el péptido de fusión se localiza en, o cerca de, el extremo amino, por ejemplo retrovirus, ortomixovirus, paramixovirus, arenavirus y coronavirus, usan una proteína para la unión al receptor y otra para la fusión (Wilson y coI., 1981; Gallaher y col., 1996; 2001). Los alfavirus, que tienen una proteína de fusión de clase II con un péptido de fusión interno, también usan una proteína principalmente para la unión al receptor y otra para la fusión de las membranas viral y celular (Straus y Straus, 1994). La proteína de la cubierta (E) codificada por los miembros del género flavivirus de Flaviviridae, tiene un péptido de fusión interno pero sirve tanto la función de unión al receptor y de fusión (Allison y col., 2001).

El virus de la hepatitis C codifica dos glicoproteínas de cubierta, E1 (gp35) y E2 (gp70), ambas con dominios de anclaje transmembrana (Flint y McKeating, 2000). La E2 interacciona con varias proteínas de superficie celular (CD81, SR-BI y L-SIGN), lo que sugiere que es la proteína de union al receptor del VHC (McKeating, 2004). La función de la E1 está menos clara y puede actuar para acompañar a la E2 (Flint y coI., 1999; Garry y Dash, 2003). Los péptidos sintéticos correspondientes a la E2 del virus de la hepatitis C pueden bloquear la infección mediada por el virus de la hepatitis C. Las determinaciones estructurales de la E2 del virus de la hepatitis C permiten la identificación de varias características hasta ahora desconocidas de la E2 del virus de la hepatitis C para el desarrollo de fármacos y de vacunas.

La familia de Flavivirus incluye una variedad de patógenos humanos y animales importantes. El virus de la hepatitis C (VHC) es la principal causa viral de hepatitis crónica, cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular (Poynard y coI., 2003). Solo en Estados Unidos, aproximadamente 4 millones de personas están infectadas con el VHC. Esto es aproximadamente cuatro veces el número de infectados por el VIH. En EE.UU. cada año se producen 30-50.000 nuevas infecciones con el VHC y aproximadamente 15-20.000 personas mueren. Además, cabe esperar que estas cifras aumenten espectacularmente dado que una porción considerable de individuos infectados por el VIH muestran poca o ninguna respuesta a las únicas terapéuticas aprobadas actualmente (es decir, tratamiento con interferones y/o con ribavirina). La infección por VHC se transmite principalmente al compartir aguja los usuarios de drogas, aunque hay algún riesgo derivado de las punciones accidentales con agujas, productos hemoderivados antes de 1992, diálisis sanguínea crónica y contactos sexuales frecuentes. Los tratamientos actuales para el VHC usando ribavirina e interferón cuestan 8.000-20.000 $ al año y solo son parcialmente satisfactorios en aproximadamente la mitad de los pacientes tratados. En general, aproximadamente un 80% de los portadores del VHC sufren inflamación hepática crónica y cirrosis, de éstos el 25% desarrollará hepatopatía terminal o carcinoma hepatocelular (CHC) (Colombo, 2000). La enfermedad terminal por VHC es la indicación más frecuente para transplantes de hígado y esto cuesta de 250.000 $ a 300.000 $. Es urgente encontrar mejores fármacos para tratar la infección por VIH y una vacuna eficaz para prevenir la infección por el VHC.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a las composiciones tal como se han definido en las reivindicaciones, que comprenden péptidos o derivados peptídicos y usos de estas composiciones para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis C (VHC). La presente invención se hace posible por el descubrimiento de los inventores de que la glicoproteína E2 codificada por el VHC (y análogo(s) de virus relacionados) tiene dominios no descritos anteriormente que son importantes para la(s) interacción(es) y reorganización(es) de E2 con E2 y/o E1. Para interacciones de alta afinidad con receptores celulares o para interacciones proteína-proteína de E2 y E2-E1 que se producen antes de la fusión virión:membrana celular. Por tanto, la presente invención proporciona péptidos y procedimientos para el tratamiento y profilaxis de enfermedades inducidas por el VHC y virus relacionados.

La presente invención enseña que la glicoproteína E2 de la cubierta del VHC tiene varios dominios que pueden ser el objetivo de péptidos sintéticos para bloquear la infección y la patogenia. Las regiones de la E2 del VHC son importantes para la unión del VHC a sus receptores celulares de alta o baja afinidad, para reorganizaciones de E2 o para interacciones proteína-proteína de E2 que se producen antes de la fusión virión:membrana celular. La presente invención también instruye y proporciona péptidos sintéticos tal como se definen en las reivindicaciones que pueden inhibir la unión al receptor y otras etapas pre-fusión mediadas por la E2 del VHC.

Las características de la glicoproteína 2 de la cubierta del virus de la hepatitis C identificada en la presente memoria descriptiva proporcionan sorprendentes guías para el desarrollo de vacunas y/o fármacos para prevenir o tratar infecciones por el virus de la hepatitis

C. A diana para los péptidos es la E2, la proteína de unión al receptor del VHC. Aunque se ha desarrollado proteínas, tales como CD4 solubles, quimioquinas y anticuerpos, que bloquean la infección apuntando a las interacciones de unión al receptor del virión, no se han descrito mímicos peptídicos de las proteínas de la superficie viral que bloquean esta u otras etapas prefusión. Antes de la disponibilidad de datos estructurales de rayos X (Qureshi y coI., 1990; Wild, y coI., 1993; 1994), se desarrollaron varios potentes inhibidores del VIH-1 sobre la base del modelo de proteína de fusión de Gallaher HIV-1 TM (Gallaher y coI., 1989). Uno de estos inhibidores, en estudios clínicos se ha demostrado que el péptido FUZEON@ (también conocido como enfuvirtida, OP178; T20) reduce considerablemente la carga del VIH-1 en pacientes con SIDA (Lalezari, y coI., 2003). Los fármacos peptídicos, que son el objeto de la presenta invención, también se desarrollaron sin los beneficios de los datos estructurales de los rayos X. FUZEON® apunta a la proteína de fusión del VIH y a las etapas en la entrada del VIH que implican fusión entre la membrana del virus y de la célula. Ciertos péptidos inhibidores de la E2 del virus de la hepatitis C apuntan a diferentes etapas en el ciclo de replicación viral que están dirigidas por FUZEON® y otros inhibidores de péptidos virales conocidos. Los fármacos peptídicos basados en E2 deberían ser relativamente fáciles de desarrollar sobre la base de la identificación de los autores de dominios de E2 que pueden ser dianas de péptidos sintéticos para bloquear la infección y la patogenia. Una vez que se describe un inhibidor peptídico eficaz se puede desarrollar un fármaco no peptídico.

Más específicamente, la presente invención proporciona composiciones para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis C. La invención está relacionada con el descubrimiento, como se describe en la presente memoria descriptiva, de los dominios de E2 del virus de la hepatitis C que pueden ser dianas de péptidos sintéticos para bloquear la infección y la patogenia. Los péptidos o derivados peptídicos pueden inhibir la unión al receptor del virus de la hepatitis C, las reorganizaciones estructurales de E2 o las interacciones proteína-proteína u otras etapas pre-fusión. La presente invención proporciona usos para el tratamiento y la profilaxis de enfermedades inducidas por el virus de la hepatitis C.

Varias formas de realización de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más péptidos seleccionados del grupo constituido por la secuencia de una cualquiera de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº: 42.

Un aminoácido homólogo es un aminoácido con similitud química o funcional con otro aminoácido. Los grupos de aminoácidos homólogos son: aminoácidos no polares: alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; aminoácidos polares neutros: glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; aminoácidos hidrófobos: leucina, isoleucina, valina, metionina, alanina, fenilalanina; aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina; aminoácidos ácidos y sus amidas: ácido aspártico, asparagina; ácido glutámico, glutamina; aminoácidos aromáticos: tirosina, triptófano, fenilalanina, histidina; alcoholes de aminoácidos: serina, treonina y aminoácidos pequeños: glicina, prolina. Por ejemplo, y no a modo de limitación, dichos péptidos pueden también comprender uno o más Daminoácidos.

Varios aspectos de esta forma de realización de la invención proporcionan composiciones que comprenden uno o más péptidos que tienen uno o más de los rasgos siguientes:

A) Péptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de una o más SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 42, en los que el extremo N-terminal del péptido termina en un grupo amino y el extremo C termina del péptido termina en un grupo carboxilo.

B) Péptidos que tienen la secuencia de cualquiera entre SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 42, en las que el extremo N terminal termina en un resto seleccionado del grupo constituido por: un grupo acetilo, un grupo hidrófobo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butoxicarbonilo o un grupo transportador macromolecular, seleccionado de entre un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono y/o en los que el extremo C terminal del péptido termina en un resto seleccionado del grupo constituido por un grupo amido, un grupo hidrófobo, un grupo t-butiloxicarbonilo o un grupo macromolecular seleccionado de entre un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono.

C) Péptidos que tienen la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº: 42, a excepción de que al menos uno de los enlaces que une residuos de aminoácidos adyacentes es un enlace no peptídico.

D) Péptidos que tienen la secuencia de cualquiera de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº: 42, a excepción de que al menos un residuo de aminoácido está en la configuración de D-isómero.

La presente invención también proporciona anticuerpos purificados que reaccionan de

forma específica con uno o más de los péptidos descritos en lo que antecede. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas para tratar o

prevenir infecciones por VHC en las que la composición comprende uno o más de los péptidos

y/o anticuerpos como se ha descrito en lo que antecede. Otros aspectos de la invención son como se define en las reivindicaciones.

Abreviaturas

VHC-virus de la hepatitis C HSA-seroalbúmina humana

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Alineaciones de las secuencias peptídicas de la proteína E2 de dos cepas del virus de la hepatitis C que muestra las localizaciones de los péptidos activos. Se alinearon las secuencias de E2 de H77, una cepa del VHC de genotipo 1a, y J4 una cepa del VHC de genotipo 1b. A ":" indica un aminoácido idéntico y a "." indica un aminoácido químicamente similar en las dos secuencias. Las barras por encima o por debajo de la secuencia peptídica indican las localizaciones de los péptidos, numerados como en las Tablas 7 y 8, que inhiben la infección por un seudotipo de VHC.

Figura 2. especificidad de los péptidos inhibidores de E2 del VHC. Los péptidos de E2, numerados como en las Tablas 7 y 8, se añadieron a los seudotipos que contienen las proteínas del núcleo de VIH y VHC E1, E2, glicoproteínas transmembrana y de superficie del virus de la leucemia murina (SU y TM) o la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (G). Los sobrenadantes también se trataron con vehículo DMSO solo o con un AcMo (anticuerpo monoclonal) contra la E2 del VHC que se sabe que neutraliza la infectividad del seudotipo. El péptido tratado y los seudotipos control se añadieron a las células, que se incubaron a 37ºC durante 72 horas. Los lisados celulares se analizaron después para determinar la actividad luciferasa como se ha descrito (Hsu y coI., 2003).

Figura 3: Estructuras de la glicoproteína E2 de hepacivirus que muestran la localización de péptidos activos, numerados como en la Tablas 7 y 8. Se construyó un modelo bidimensional de la proteína 2 de la cubierta del VHC usando una herramienta computacional de proteómica y comparaciones con las proteínas de unión al receptor de otros virus de ARN. Se indican las secuencias que tuvieron como resultado una reducción mayor del 70% en la infectividad del seudotipo.

Figura 4. Modelo que representa el sitio de acción pre-fusión de los péptidos de E2 del VHC. Panel A. Alteración de los péptidos E2 de VHC de las interacciones E—E2 o interacciones E2-E2 en los viriones de VHC. Panel B: Alteración de E2 del VHC de las interacciones virión del VHC-receptor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a composiciones y usos de dichas composiciones para prevenir o tratar la infección por VHC. Se ha indicado la teoría de que las composiciones y usos divulgados actualmente funcionan inhibiendo la fusión entre la cubierta del visión y una membrana celular, el procedimiento que libera el genoma viral en el citoplasma de la célula

Varias formas de realización de la invención proporcionan la identificación y secuencia de los péptidos inhibidores de VHC que representan porciones específicas de la glicoproteína E2 del VHC. Se cree que estas proteínas peptídicas inhibidoras funcionan interfiriendo y bloqueando la unión al receptor. Estos péptidos incluyen los representados por las SEC IND Nº

5 1-42 y sus derivados, tal como se describe más adelante. En aspectos concretos de esta forma de realización de la invención, las composiciones que comprenden péptidos correspondientes a la glicoproteína 2 de la cubierta del VHC son útiles en una amplia gama de dosis (como se muestra en el Ejemplo 1, estos péptidos son eficaces en la inhibición de la fusión de VHC con las células).

10 Para fines de claridad de la divulgación, y no a modo de limitación, la descripción de la presente invención se dividirá en las subsecciones siguientes:

(i): Péptidos de la invención

(ii): Utilidades de la invención (incluidas composiciones y usos de los péptidos).

15 Tabla 1: Péptido 1 inhibidor de la E2 del VHC

PROTEÍNA: SECUENCIA *

E2 a de VHC: X-LVGLLTPGAKQNIQLlNTNGSWHINS-Z (SECC ID Nº 1)

E2 b de VHC: X-FTSLFSSGASQKIQLVNTNGSWHINR Z (SEC ID Nº 7)

E2 a de VHC: X-LAGLFTSGAKQNIQLlNTNGSWHINR-Z (SEC ID Nº 8)

E2 b de VHC: X-FTSFFTRGPSQNLQLVNSNGSWHINS-Z (SEC ID Nº 9)

E2 a de VHC: X-LANLFSSGSKQNLQLlNSNGSWHINR-Z (SEC ID Nº 10)

E2 as VHC: X-LTSFFNPGPQRQLQFVNTNGSWHINS-Z (SEC ID Nº 11)

E2 a de VHC: X-FASLLTPGAKQNIQLlNTNGSWHINR-Z (SEC ID Nº12)

Tabla 2: Péptido 2 inhibidor de la E2 del VHC

PROTEÍNA: SECUENCIA *

E2 1a VHC: X-CNESLNTGWLAGLFYQH-Z (SEC ID Nº 2)

E2 1b VHC: X-CNOSLHTGFLAALFYTH-Z (SEC ID Nº 13)

E2 2a VHC: X-CNOSLNTGFIASLFYTY-Z (SEC ID Nº 14)

E2 3b VHC: X-CNOSLNTGFIAGLFYYH-Z (SEC ID Nº 15)

E2 4a VHC: X-CNOSLNTGFLASLFYTH-Z (SEC ID Nº 16)

E2 5a VHC: X-CNOSLQTGFIAGLMYAH-Z (SEC ID Nº 17)

E2 6a VHC: X-CNOSLQTGFLASLFYTH-Z (SEC ID Nº 18)

8 Tabla 3: Péptido 3 inhibidor de la E2 del VHC

PROTEÍNA: SECUENCIA *

E2 1a VHC: X-YSWGANOTOVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGF-Z (SEC ID Nº 3)

E2 1b VHC: X-YSWGENETOVMLLNNTRPPQGNWFOCTWMNSTGF-Z (SEC ID ºN19)

E2 2a VHC: X-YTWGENETOVFILNSTRPPGGSWFGGTWMNSTGF-Z (SEC ID Nº 20)

E2 3b VHC: X-YRFGVNESOVFLLTSLRPPQGRWFGCVWMNSTGF-Z (SEC ID Nº 21)

E2 4a VHC: X-YTWGENETOVFLLNSTRPPHGAWFGCVWMNSTGF-Z (SEC ID Nº 22)

E2 5a VHC: X-YNWGSNETOILLLNNIRPPAGNWFGCTWMNSTGF-Z (SEC ID Nº 23)

E2 6a VHC: X-YTWGENETOVFMLESLRPPTGGWFGCTWMNSTGF-Z (SEC ID Nº 24)

Tabla 4: Péptido 4 inhibidor de la E2 del VHC

PROTEÍNA: SECUENCIA *

E2 1a VHC: X-OYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGV-Z (SEC ID Nº 4)

E2 1b VHC: X-OYPYRLWHYPCTLNFSIFKVRMYVGGV-Z (SEC ID Nº 25)

E2 2a VHC: X-OYPYRLWHYPCTINYTIFKIRMYVGGV-Z (SEC ID Nº 26)

E2 3b VHC: X-OYPYRLWHYPCTVNFSIFKVRMFVGGH-Z (SEC ID Nº 27)

E2 4a VHC: X-OYPYRLWHFPCTANFSVFNIRTFVGGI-Z (SEC ID Nº 28)

E2 5a VHC: X-HYPYRLWHYPCTVNYTIFKVRMFIGGL-Z (SEC ID Nº 29

E2 6a VHC: X-OYAYRLWHYPCTVNFTLHKVRMFVGGT-Z (SEC ID Nº 30)

Tabla 5: Péptido 5 inhibidor de la E2 del VHC

PROTEÍNA: SECUENCIA *

E2 1a VHC: X-ALSTGLlHLHQNIVOYQYLYGYGSSJASWAIKWEY-Z (SEC ID Nº 5)

E2 1b VHC: X-ALSTGLlHLHQNIVOVQYLYGVGSAFVSFAIKWEY-Z (SEC ID Nº 31)

E2 2a VHC: X-AL5TGLLHLHQNIVOVQNIVOQYGLSPALTKVIVRWEW-Z (SEC ID Nº 32)

E2 3b VHC: X-RLSTGLlHLHQNIVOVQYLYGVGSAWGWALKWEF-Z (SEC ID Nº 33)

E2 4a VHC: X-ALSTGLMLHQNIVOVQYLYGVGSAVVSWALKWEY-Z (SEC ID Nº 34)

E2 5a VHC: X-ALSTGLWLHQNWOTQYLYGLSSSIVSWAVKWEY-Z (SEC ID Nº 35)

E2 6a VHC: X-ALSTGLlHLHQNIVOVQYLYGVSTNVTSWVVKWEY-Z (SEC ID Nº 36)

Tabla 6: Péptido 6 inhibidor de la E2 del VHC

PROTEÍNA: SECUENCIA *

E2 1a VHC: X-VVLLFLLLAOARVCSCLWMNIILLlSQAEA-Z (SEC ID Nº 6)

E2 1b VHC: X-ILLLFLLLAOARVCACLWMlvILLlAQAEA-Z (SEC ID Nº 37)

PROTEÍNA: SECUENCIA *

E2 2a VHC: X-VVLLFLLLAOARVCACLWMLlLLGQAEA-Z (SEC ID Nº 38)

E2 3b VHC: X-VVLVFLLLAOARVCVALWMMLLlSQAEA-Z (SEC ID Nº 39)

E2 4a VHC: X-VVLAFLLLAOARVSAYLWMMFMVSQVEA-Z (SEC ID Nº 40).

E2 5a VHC: X-IMLVFLLLAOARICTCLLlLLLlCQAEA-Z (SEC ID Nº 41)

E2 6a VHC: X-IVLMFLVLAOARICTCLWLMLLlSTVEA-Z (SEC ID Nº 42)

* En las tablas 1-6, la “X” y la “Z” en cada péptido representan, respectivamente, el resto en N y en C termina. Como se ha descrito en lo que antecede, el resto en N-terminal puede ser un grupo amino o puede seleccionarse del grupo constituido por un grupo acetilo, un grupo hidrófobo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo o un grupo transportador macromolecular y/o el resto en C terminal del péptido puede ser un grupo carboxi o puede ser un resto seleccionado del grupo constituido por: un grupo amido, un grupo hidrofóbico, un grupo tbutiloxicarbonilo o un grupo macromolecular .

Péptidos de la invención

Cualquier péptido o proteína como se ha definido en las reivindicaciones que inhibe la

5 fusión entre la E2 de la cubierta del virión del virus de la hepatitis C y una membrana celular, incluidos los de la E2 del virus de la hepatitis C que infectan huéspedes humanos así como no humanos, se pueden usar de acuerdo con la invención. En la invención, estos inhibidores son péptidos relacionados con varios dominios interactivos de membrana de la E2 del virus de la hepatitis C como se define en la presente memoria descriptiva.

10 Los péptidos inhibidores de la E2 del virus de la hepatitis C son, de acuerdo con la presente invención, idénticos u homólogos a las secuencias de aminoácidos tal como se define en la presente memoria descriptiva. Los péptidos pueden producirse a partir de proteínas virales naturales o recombinantes,

o pueden producirse usando técnicas de AND recombinante estándar (p. ej., la expresión de

15 péptidos por un microorganismo que contiene una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica el péptido deseado bajo el control de un promotor de la transcripción adecuado, y la recogida del péptido deseado a partir de dicho microorganismo). Preferentemente, los péptidos de la invención pueden sintetizarse usando cualquier metodología conocida en la técnica, incluida, entre otras, la síntesis en fase sólida de Merrifield (Clark-Lewis y coI., 1986).

20 Los E21P son los que contienen, como secuencias de aminoácido principales la secuencia de aminoácidos del péptido 1 inhibidor de la E2 del virus de la hepatitis C: LVGLLTPGAKQNIQLlNGSWHWS SEC ID Nº 1; péptido 2 inhibidor de E2 del VHC CNESLNTGWLAGLFYQH SEC ID Nº 2; péptido 3 inhibidor de E2 del VHC, YSWGANOTOVFVLNNTRPPLGNWFCCTWMNSTGF SEC ID Nº 3; o péptido 4 inhibidor de E2 del VHC , OYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGV SEC ID Nº 4; péptido 5 inhibidor de E2 del VHC , X-ALSTGLlHLHQNIVOVQYLYGVGSSIASWAIKWEY SEC ID Nº 5; péptido 6 inhibidor de E2, VVLLFLLLAOARVCSCLWMNELlSQAEA, SEC ID Nº 6.

Además, como se ha indicado en lo que antecede, en cualquier forma de realización de la invención, el resto en N-terminal puede ser un grupo amino (como se encuentra normalmente en las proteínas/péptidos naturales) o puede seleccionarse del grupo constituido por un grupo acetilo, un grupo hidrófobo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo o un grupo transportador macromolecular y/o el resto en C terminal del péptido puede ser un grupo carboxi (como se encuentra normalmente en las proteínas/péptidos naturales) o puede ser un resto seleccionado del grupo constituido por: un grupo amido, un grupo hidrofóbico, un grupo t-butiloxicarbonilo o un grupo macromolecular. .

Utilidad de la invención

Los péptidos inhibidores de E2 del virus de la hepatitis C de la presente invención se pueden utilizar para inhibir la infección por el virus de la hepatitis C y, de acuerdo con esto, se pueden usar en el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C y también en la profilaxis contra la infección por el virus de la hepatitis C. Los péptidos de la invención se pueden administrar a pacientes en cualquier transportador farmacéutico estéril y biocompatible, incluidos, entre otros, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua.

Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para administrar péptidos a pacientes; incluyen, entre otros, intradérmicos, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, oral e intranasal. Además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención en el sistema nervioso central por cualquier vía, incluida la vía intraventricular e intratecal.

La presente invención proporciona composiciones, especialmente composiciones farmacéuticas, que comprenden péptidos inhibidores de la E2 del virus de la hepatitis C como se ha definido en la presente memoria descriptiva (como se ha descrito en lo que antecede) administradas mediante liposomas, micropartículas o microcápsulas. Varias formas de realización de la invención contemplan el uso de dichas composiciones para alcanzar una liberación sostenida de los péptidos inhibidores de E2 del virus de la hepatitis C-Otras formas de realización contemplan la administración de FIP, o derivados del mismo, unido a un transportador molecular (p. ej., HSA).

Varias formas de realización de la presente invención proporcionan la administración de péptidos inhibidores de E2 del virus de la hepatitis C y/o anticuerpos específicos para estos péptidos a sujetos humanos que sufren infección por el virus de la hepatitis C. En cualquier forma de realización, normalmente los péptidos y/o anticuerpos están sustancialmente purificados. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un péptido, análogo peptídico o anticuerpo que tiene una pureza superior al 80%. Más preferentemente, “sustancialmente purificado” se refiere a un péptido, análogo peptídico o anticuerpo que tiene una pureza superior al 90% o superior al 95%. Más preferentemente se refiere a un péptido, análogo peptídico o anticuerpo que tiene una pureza superior al 99%. Funcionalmente, “sustancialmente purificado” significa que está libre de contaminantes hasta un grado que lo convierte en adecuados para los fines proporcionados en la presente memoria descriptiva. Otras formas de realización proporcionan la administración profiláctica de los péptidos a los que están en riesgo de infección por el virus de la hepatitis C.

Los procedimientos para identificar la estructura de las proteínas E2 del virus de la hepatitis C truncadas implica la unión al receptor del virus de la hepatitis C, reorganizaciones estructuras de E2 o interacciones proteína-proteína u otras etapas pre-fusión mediante miembros de la familia Flaviviridae.

Otras formas de realización de la invención proporcionan un péptido que tiene una fórmula seleccionada de uno o más de los siguientes.

Los E21P de la invención son los que contienen, como secuencias de aminoácido principales la secuencia de aminoácidos del péptido 1 inhibidor de la E2 del virus de la hepatitis

C: LVGLLTPGAKQNIQLlNTNGSWHINS (SEC ID Nº 1); péptido 2 inhibidor de la E2 del VHC: CNESLNTGWLAGLFYQH (SEC ID Nº 2); péptido 3 inhibidor de la E2 del VHC YSWGANOTOVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGF (SEC ID Nº 3) o péptido 4 inhibidor de la E2 del VHC: X-OYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGV (SEC ID Nº 4); péptido 5 inhibidor de la E2 del VHC ALSTGLlHLHQNIVOVQYLYGVGSSIASWAIKWEY (SEC ID Nº 5); péptido 4 inhibidor de VHC: VVLLFLLLAOARVCSCLW-MMLLlSQAEA (SEC ID Nº 6).

De acuerdo con varias formas de realización de la presente invención, cualquiera de los péptidos descritos en la presente memoria descriptiva pueden comprender un grupo amino en el extremo amino terminal o pueden modificarse para comprender cualquiera de los siguientes: un grupo acetilo, un grupo hidrófobo o un grupo transportador macromolecular. De forma similar, el extremo carboxi de cualquiera de los péptidos puede comprender un grupo carboxilo

o pueden modificarse para comprender cualquiera de los siguientes: un grupo amido, un grupo hidrófobo o un grupo transportador macromolecular. En otros aspectos de esta forma de realización de la invención, el grupo amino terminal es un grupo hidrófobo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo, un conjugado lipídico, un grupo de polietilenglicol o un hidrato de carbono. En cualquier aspecto de esta forma de realización, el grupo carboxi terminal puede ser un grupo t-butiloxicarbonilo, un conjugado lipídico, un grupo de polietilenglicol o un hidrato de carbono.

Además, aspectos de esta forma de realización también incluyen péptidos en los que al menos un enlace que une residuos de aminoácidos adyacentes es un enlace no peptídico. En aspectos particularmente preferidos de esta forma de realización, el enlace no peptídico es un enlace imido, éster, hidracina, semicarbazoide o azo.

Otros aspectos de esta forma de realización proporcionan péptidos en los que al menos un aminoácido es un aminoácido isómero D.

Aspectos adicionales de esta forma de realización de la invención proporcionan péptidos en los que se ha realizado el compromiso de la sustitución de al menos un aminoácido de modo que un primer residuo de aminoácido es sustituido por un segundo residuo de aminoácido diferente. Estas sustituciones pueden ser conservadoras o no conservadoras, siempre que el péptido siga siendo funcional de acuerdo con la presente invención.

Como se ha indicado en lo que antecede, los péptidos de acuerdo con la invención deben comprender al menos 3 aminoácidos contiguos de una de las SEC ID Nº indicadas en lo que antecede y deben ser un segmento funcional.

Otras formas de realización de la invención proporcionan composiciones que comprenden uno más de los péptidos y/o anticuerpos descritos en la presente memoria descriptiva, bien solos o con un compuesto transportador. Preferentemente, el transportador es un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Por ejemplo, uno o más péptidos de la presente invención y/o uno o más anticuerpos específicos para los péptidos de la presente invención se pueden usar en combinación con uno

o más péptidos o anticuerpos dirigidos a inhibir la etapa de fusión con la membrana mediada por la proteína 1 de la cubierta del virus de la hepatitis C. Dichos péptidos se describen en la solicitud internacional WO 2003/044220.

Los péptidos E2 y E1 del VHC y/o anticuerpos pueden trabajar de forma sinérgica (Es decir, pueden estar activos a concentraciones menores cuando se usan en combinación que cuando se usan por separado) o pueden actuar de forma complementaria o aditiva.

EJEMPLOS:

Ejemplo 1: IDENTIFICACIÓN DE LOS PÉPTIDOS E2 DEL VIRUS DE LA HEPATITIS QUE INHIBEN LA INFECTIVIDAD MEDIADA POR LAS PROTEÍNAS DE LA CUBIERTA DEL VHC.

Normalmente, la asociación selectiva de un virus con una célula diana está determinada por una interacción entre las glicoproteínas de la superficie viral y receptor o receptores específicos sobre la superficie celular. La unión al receptor es una etapa esencial en el inicio de la infección y precede a otras etapas, tales como la fusión entre e virus y las membranas celulares. La(s) interacción(es) virión:receptor puede definir la gama de huéspedes y el tropismo celular o tisular de un virus y puede determinar la patogenicidad. El VHC codifica dos supuestas glicoproteínas de superficie, E1 y E2, que se cree que tienen dominios transmembrana en el extremo carboxilo que las anclan a la cubierta del virión. En estudios de expresión in vitro se ha demostrado que E1 y E2 se asocian para formar heterodímeros, que se acumulan en el retículo endoplásmico (RE), el sitio propuesto para el ensamblaje y la gemación del VHC (Flint y coI., 2004). Varias líneas de evidencias indican que E2 es la proteína de unión al receptor (Flint y McKeating, 2000). Se ha sugerido que E1 es la proteína de fusión del VHC (Flint y coI., 1999; Garry y Dash, 2003). No obstante, otros estudios indican que E2 tiene una estructura de proteína de fusión viral de clase II y que representa la proteína de fusión del VHC (Yagnik y coI., 2000), y es posible que tanto E1 como E2 del VHC tienen un papel en la fusión con la membrana. La carencia de sistemas in vitro para la propagación del VHC ha dificultado los estudios biológicos y fisioquímicos con el virión u su(s) mecanismo(s) de entrada en la célula, y los receptores celulares permanecen desconocidos. Se ha comunicado que el VHC purificado de plasma existe en asociación con lipoproteínas plasmáticas, lo que sugiere que el virus puede usar el receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LDLR) para entrar en las células Agnello y col., 1999. Truncated soluble versions of E2 have been reported to bind specifically to human cells and were used to identify interactions with CD81 (Pileri y coI., 1998; Roccasecca y coI., 2003; Cormier y col., 2004), receptor de secuestrantes de clase B tipo 1 (SR-B1) (Scarselli et aI., 2002), y la molécula de adhesión intercelular específica de células dendríticas 3 que no son integrina (DC-SIGN) (Pohlmann y coI., 2003). Los resultados sugieren que E2 puede representar una diana para desarrollar fármacos peptídicos contra la infección por el virus de la hepatitis C.

Materiales y procedimientos:

Para superar la carencia de un sistema de cultivo celular convencional para la propagación del VHC se han generado virus de seudotipo infeccioso que expresan glicoproteínas de la cubierta del VHC (Hsu y coI., 2003). Los seudotipos con proteínas del núcleo de VIH y proteínas de la cubierta del VHC se generaron mediante cotransfección de células 293-T con cantidades iguales de plásmidos que expresan E1 y E2 de VHC de la cepa H77 y el genoma proviral defectuoso en la cubierta del VIH, pNL4.3.Luc.RE (Pohlmann y coI., 2003). Los péptidos de un conjunto de péptidos de 18 mer, que solapan con 7-10 aminoácidos y representan toda la secuencia de aminoácidos de E2 de la cepa H77 de VHC (genotipo 1a) y toda la secuencia de aminoácidos de la cepa J4 de VHC (genotipo 1b) se solubilizaron en 20% de DMSO y se diluyeron (concentración final de DMSO< 2%). Los péptidos se incubaron a 37ºC con sobrenadantes virales de seudotipo de VHV normalizado con antígeno p24. La concentración media de los péptidos fue -25 µM, no obstante, las concentraciones reales de algunos péptidos en solución fueron 10 µM o inferiores debido a la baja solubilidad en DMSO. Los sobrenadantes también se trataron con vehículo DMSO solo o con un AcMo (anticuerpo monoclonal) contra la E2 del VHC que se sabe que neutraliza la infectividad del seudotipo. El péptido tratado y los seudotipos de VHC control se añadieron a las células, se incubaron durante 16 horas, se eliminó el virus y las células se incubaron a 37ºC durante 72 horas. Los lisados celulares se analizaron después para determinar la actividad luciferasa, tal como se ha descrito (Hsu y coI., 2003).

Resultados y discusión

Cincuenta péptidos de E2 de H77 1ª del VHC se analizaron en el ensayo de infectividad de VHC y se demostró que nueve tenían una inhibición mayor del 70% de la infectividad, demostrándose en varios una inhibición de aproximadamente el 95% (Tabla 7). De 46 péptidos de E2 de J41b de VHC analizados, se demostró que cuatro tenían una inhibición mayor del 70% de la infectividad (Tabla 8); Varios de los péptidos inhibidores solapaban en la secuencia de E2, por ejemplo los péptidos 4 y 5, 32 y 33, y 43 y 44 de E2 de H77 1ª de VHC (Fig. 1). Este resultado sugiere que cualquiera de los diversos péptidos dirigido a una región concreta puede ser inhibidor. Una comparación de los dos grupos de péptidos de E2, H77 y J4, revela que aunque los péptidos similares pueden ser inhibidores (Es decir, los péptidos 32, 33 y 108, 109), otros péptidos con secuencias estrechamente relacionadas no son inhibidores (es decir, los péptidos 4, 5 y 99).

Seleccionados péptidos inhibidores de E2 se añadieron a los seudotipos que contienen las proteínas del núcleo del VIH y las glicoproteínas transmembrana y de superficie del virus de la leucemia murina (MuLV y TM( o la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSVG). Estos péptidos inhibieron los seudotipos con E1 y E2 de VHC (Fig. 2a), pero no pudieron inhibir

5 significativamente los seudotipos MuLV o VSV (Fig. 2B y 2C). Los resultados indican que estos péptidos inhibidores de E2 del VHC son específicos de la inhibición de la infectividad de VHC. Estos resultados también demuestran el potencial de los péptidos E2 como fármacos anti-VHC. Tabla 7. Identificación de los péptidos inhibidores de E2 de VHC (cepa H77) que inhiben la

10 infectividad del VHC. Nº de péptido de H77 1a de Unidades de Porcentaje de VHC luciferasa† inhibición 1 250,376 44,1 2 447,336 0,2 3 447,906 0,05 4 10,62 97,6 5 48,000 89,3 6 503,446 -12,3 7 381,340 14,9 8 113,65 74,6 9 501,126 -11,8 10 334,196 25,4 11 360,410 19,6 12 417,706 6,8 13 313,323 31,1 14 279,626 37,6 15 253,410 43,5 16 403,430 10 17 254,516 43,2 18 435,026 2,9 19 301,406 32,7 20 231,373 48,4 21 242,223 45,9 22 245,900 45,2 23 367,916 17,9

(CONT)

24: 391,886 19,7

25: 480,280 7,2

26: 216,706 51,6

27: 575,206 -28,4

28: 394,780 11,9

29: 297,353 33,6

30: 655,04 -46,2

31: 419,263 6,4

32: 85,086 81,0

33: 22,406 95,0

34: 354,696 21,8

35: 153,553 66,7

36: 535,016 -19,5

37: 585,553 -30,7

38: 345,110 23

39: 400,756 11,6

40: 442,346 1,3

41: 434,743 3

42: 353,516 19,1

43: 32,283 92,8

44: 91,266 79,6

45: 24,703 94,5

46: 103,040 77,0

47: 195,320 56,4

48: 290,786 35,1

49: 307,310 31,4

50: 58,790 87,9

VIRUS SOLO: 448,123

Virus más anti-E2 2/69a: 10,309 97,6

Virus más anti-E2 9/27: 3,567 99,2

t Los números representan el número de unidades de luciferasa (lúmenes) producidos tras infección con el VHC o el seudotipo de MLV en presencia del péptido a una concentración o ~ 25 µM. Los resultados con una

inhibición superior al 70% se indican en negrita.

Tabla 8. Identificación de los péptidos inhibidores de E2 de VHC (cepa J4) que inhiben la

infectividad del VHC.

Nº de péptido J4 1b de: Unidades de Porcentaje de

VHC: luciferasa† inhibición

54: 372,3,93 17,9

81: 480,623 -7,3

82: 173,156 61,4

83: 518,993 -15,8

84: 392,023 12,5

85: 112,260 74,9

51: 237,086 47,1

86: 398,110 11,2

87: 399,700 10,8

88: 412,776 7,9

899: 449,293 -0,3

90: 423,326 5,5

91: 160,883 69,1

92: 372,4 16,9

93: 409,22 9,7

94: 311,736 30,4

95: 538,110 -20,1

96: 544,596 -21,5

97: 218,673 51,2

98: 467,636 -4,4

99: 111,043 75,2

100: 518,190 -15,6

101: 502,096 -12,0

102: 377,216 15,8

103: 305,690 31,8

104: 419,876 6,3

105: 552,170 -23,2

106: 193,533 60,4

107: 402,976 11,1

108: 40,853 90,9

(CONT)

109 96,893 79,4

110 602,506 -34,5 111 632,613 -39,2 112 527,95 -17,8 113 570,553 -27,3 114 270,190 39,7 115 475,713 -6,2 116 394,096 12,1 117 359,236 19,8 119 69,220 84,6 120 463,243 -3,4 121 338,200 24,5

t Los números representan el número de unidades de luciferasa (lúmenes) producidas después de la infección con VHC o el seudotipo MLV en presencia del péptido a una concentración de ~ 25 pM. Las muestras se compararon con los controles descritos en la Tabla 7. Los resultados de inhibición superior al 70% están indicados en negrita.

Tabla 9. Secuencia y localización de los péptidos mostrados en la Tabla 7.

Nº de péptido: Localización Secuencia de aminoácidos Solapamiento IP de

de H77 1a de: del péptido* E2 de VHC

VHC

1: 379-396 AGVDAETHVTGGSAGRTI (SEQ ID NO 43)

2: 386-403 HVTGGSAGRTIAGLVGLL (SEQ 10 NO 44)

3: 393-410 GRTIAGLVGLLTPGAKQN (SEQ 10 NO 45) VHC E21P 1

4: 399-417 VGLLTPGAKQMQLlNTN (SEQ 10 NO 46) VHC E21P 1

5: 407-424 AKQNIQLlNTNGSWHINS (SEQ 10 NO 47) VHC E21P

6: 414-431 INTNGSWHINSTALNCNE (SEQ 10 NO 48) VHC E21P 1

7: 421-438 HINSTALNCNESLNTGWL (SEQ 10 NO 49) VHC E21P 1/2

8: 428-445 NCNESLNTGWLAGLFYQH (SEQ 10 NO 50) VHC E21P 2

9: 442-459 FYQHKFNSSGCPERLASC (SEQ 10 NO 51) VHC E21P 2

10: 449-466 SSGCPERLASCRRLTOFA (SEQ 10 NO 52)

11: 456-473 LASCRRLTOFAQGWGPIS (SEQ 10 NO 53)

12 463-480 TOFAQGWGPISYANGSGL (SEQ 10 NO 54) 13 470-487 GPISYANGSGLOERPYCW (SEQ 10 NO 55) 14 477-494 GSGLOERPYCWHYPPRPC (SEQ 10 NO 56) 15 486-501 PYCWHYPPRPCGIVPAKS (SEQ 10 NO 57) 16 491-508 PRPCGIVPAKSVCGPVYC (SEQ 10 NO 58) 17 501-515 PAKSVCGPVYCFTPSPW (SEQ 10 NO 59) 18 505-522 PVYCFTPSPVWGTIORS (SEQ 10 NO 60) 19 512-529 SPVWGTIORSGAPTYSW (SEQ 10 NO 61) VHC E21P 3 20 526-543 TYSWGANOTOVFVLNNTR (SEQ 10 NO 62) VHC E21P 3 21 533-550 OTOVFVLNNTRPPLGNWF (SEQ 10 NO 63) VHC E21P 3 22 540-557 NNTRPPLGNWFGCTWMNS (SEQ 10 NO 64) VHC E21P 3 23 547-564 GNWFGCTWMNSTGFTKVC (SEQ 10 NO 65) VHC E21P 3 24 554-571 WMNSTGFTKVCGAPPCVI (SEQ 10 NO 66) VHC E21P 3 25 561-578 TKVCGAPPCVIGGVGNNT (SEQ 10 NO 67) 26 568-585 PCVIGGVGNNTLLCPTOC (SEQ 10 NO 68) 27 575-592 GNNTLLCPTOCFRKHPEA (SEQ 10 NO 69) 28 582-599 PTOCFRKHPEATYSRCGS (SEQ 10 NO 70) 29 589-606 HPEATYSRCGSGPWITPR (SEC ID Nº 71) 30 596-613 RCGSGPWITPRCMVOYPY (SEC ID Nº 72) VHC E21P 4 31 603-620 ITPRCMVOYPYRLWHYPC (SEC ID Nº 73) VHC E21P 4 32 610-627 OYPYRLWHYPCTINYTIF (SEC ID Nº 74) VHC E21P 4 33 617-634 HYPCTINYTIFKVRiVIYVG (SEC ID Nº 75) VHC E21P 4 34 624-641 YTIFKVRMYVGGVEHRLE (SEC ID Nº 76) VHC E21P 4 35 631-648 MYVGGVEHRLEAACNWTR (SEC ID Nº 77) VHC E21P 4 36 638-655 HRLEAACNWTRGERCOLE (SEC ID Nº 78) 37 645-662 NWTRGERCOLEORORSEL (SEC ID Nº 79) 38 652-669 COLEORORSELSPLLLST (SEC ID Nº 80) 39 659-676 RSELSPLLLSTIQWQVLP (SEC ID Nº 81) 40 666-683 LLSTIQWQVLPCSFTTLP (SEC ID Nº 82) 41 673-690 QVLPCSFTILPALSTGLI (SEC ID Nº 83) VHC E21P 5 42 680-697 TILPALSTGLlHLHQNIV (SEC ID Nº 84) VHC E21P 5 43 687-704 TGLlHLHQNIVOVQYLYG (SEC ID Nº 85) VHC E21P 5 44 694-711 QNIVOVQYLYGVGSSIAS (SEC ID Nº 86) VHC E21 P 5 45 701-718 YLYGVGSSIASWAIKWEY (SEC ID Nº 87) VHC E21 P 5 46 708-725 SIASWAIKWEYVVLLFLL (SEC ID Nº 88) VHC E21P 5/6

(CONT) 47 715-732 KWEYWLLFLLLAOARVC (SEC ID Nº 89) VHC E21 P 5/6 48 722-739 LFLLLAOARVCSCLWMML (SEC ID Nº 90) VHC E21 P 6 49 729-746 ARVGSCLWMMLLlSQAEA (SEC ID Nº 91). VHC E21 P 6 50 756-773 WMMLLlSQAEAALENLVI (SEC ID Nº 92) VHC E21P 6 *Los números se refieren a la numeración proporcionada en Genbank Accession NP_671491

Tabla 10. Secuencia y localización de los péptidos mostrados en la Tabla 8.

Nº péptido J4 Localización Secuencia de aminoácidos Solapamiento IP 1b VHC del péptido* de E2 de VHC

54 (379-396) AGVOG ETHTIG RVAGHTI (SEC ID Nº 93) 80 (386-403) HTIGRVAGHTISGFTSLF (SEC ID Nº 94) VHC E21P 1 81 (393-410). GHTISGFTSLFSSGASQK (SEC ID Nº 95) VHC E21P 1 82 (400-417) TSLFSSGASQKIQLVNTN (SEC ID Nº 96) VHC E21P 1 83 (407-424) ASQKIQLVNTNGSWHINR (SEC ID Nº 97) VHC E21P 1 84 (421-438) HINRTALNCNOSLQTGFF (SEC ID Nº 98) VHC E21P 1/2

85 (428-445) NCNOSLQTGFFAALFYAH (SEC ID Nº 99) VHC E21P 2

51 (435-452) TGFFAALFYAHKFNSSGC (SEC ID Nº 100) VHC E21P 2 86 (442-459) FYAHKFNSSGCPERMASC (SEC ID Nº 101) VHC E21 P 2 87 (449-466) SSGCPERMASCRPIOWFA (SEC ID Nº 102) 88 (456-473) MASCRPIOWFAQGWGPIT (SEC ID Nº 103) 89 (463-480) OWFAQGWGPITYTKPNSS (SEC ID Nº 104) 90 (477-494) PNSSOQRPYCWHYAPRPC (SEC ID Nº 105) 91 (484-501 ) PYCWHYAPRPCGWPASQ (SEC ID Nº 106) 92 (491-508) PRPCGWPASQVCGPVYC (SEC ID Nº 107) 93 (498-515) PASQVCGPVYCFTPSPW (SEC ID Nº 108) 94 (505-522) PVYCFTPSPVWGTIORS (SEC ID Nº 109) 95 (512-529) SPWVGTIORSGVPTYSW (SEC ID Nº 110) VHC E21P 3 96 (519-536) TORSGVPTYSWGENETOV (SEC ID Nº 111) VHC E21P 3 97 (526-543) TYSWGENETOVMLLNNTR (SEC ID Nº 112) VHC E21P 3 98 (533-550) ETOVMLLNNTRPPQGNWF (SEC ID Nº 113) VHC E21P 3 99 (540-557) NNTRPPQGNWFGCTWMNS (SEC ID Nº 114) VHC E21 P 3 100 (554-571 ) WMNSTGFTKTCGGPPCNI (SEC ID Nº 115) VHC E21P 3 101 (561-578) TKTCGGPPCNIGGVGNRT (SEC ID Nº 116) 102 (568-585) PCNIGGVGNRTLlCPTOC (SEC ID Nº 117)

5

10

15 21

103 (575-592) GNRTLlCPTOCFRKHPEA (SEC ID Nº 118) 104 (582-599) PTOCFRKHPEATYTKCGS (SEC ID Nº 119) 105 (589-606) HPEATYTKCGSGPWLTPR (SEC ID Nº 120) 106 (586-613) KCGSGPWLTPRCLVOYPY (SEC ID Nº 121) VHC E21P 4 107 (603-620) LTPRCLVOYPYRLWHYPC (SEC ID Nº 122) VHC E21 P 4 108 (610-627) OYPYRLWHYPCTLNFSIF (SEC ID Nº 123) VHC E21 P 4 109 (617-634) HYPCTLNFSIFKVRMYVG (SEC ID Nº 124) VHC E21P 4 110 (631-648) MYVGGVEHRLNAACNWTR (SEC ID Nº 125) VHC E21P4 111 (638-655) HRLNAACNWTRGERCNLE (SEC ID Nº 126) 112 (645-662) NWTRGERCNLEORORSEL (SEC ID Nº 127) 113 (652-669) CNLEORORSELSPLLLST (SEC ID Nº 128) 114 (659-676) RSELSPLLLSTIEWQILP (SEC ID Nº 129) 115 (666-683) LLSTIEWQILPCAFRTLP (SEC ID Nº 130) 116 (673-690) QILPCAFTILPALSTGLI (SEC ID Nº 131) VHC E21 P 5 117 (680-697) TILPALSTGLlHLHQNIV (SEC ID Nº 132) VHC E21 P 5 118 (694-711) QNIVOVQYLYGVGSAFVS (SEC ID Nº 133) VHC E21 P 5 119 (708-725) AFVSFAIKWEYILLLFLL (SEC ID Nº 134) VHC E21 P 5/6 120 (722-739) LFLLLAOARVCACLWMML (SEC ID Nº 135) VHC E21P 6 121 (729-746) ARVCACLWMMLLlAQAEA (SEC ID Nº 136) VHC E21P 6

*Los números se refieren a la numeración proporcionada en Genbank Accession BAA01583

Los péptidos de las Tablas 7-10 son un conjunto solapante de péptidos que representa la E2 de dos cepas del VHC (H77 y J4). Las SEC ID Nº 1-6 son versiones más largas de los "éxitos" resaltados en amarillo en las Tablas 7-10. La justificación del diseño de las SEC ID Nº 1-6 es que el péptido inhibidor óptimo puede incluir secuencias de flanqueo) y que el último péptido óptimo puede ser un fragmento de este péptido más largo. Las SEC ID Nº: 7-42 son variantes de las SEC ID Nº 1-6 que representan secuencias análogas de las proteínas E2 de los otros genotipos principales del VHC. EJEMPLO 2: Modelo computacional proteómico de la E2 del VHC.

Dado que el VHC no puede propagarse en cultivos celulares, se dispone de un número insuficiente de viriones para realizar análisis estructurales. Por tanto, la estructura molecular de E2 de VHC no se ha determinado y actualmente se desconoce. En ausencia de una estructura cristalográfica de rayos X de E2 del VHC, es posible derivar información estructural útil usando los recién desarrollados análisis computacionales suplementados mediante comparaciones con otras glicoproteínas virales de estructura conocida. Tal modelo de E2 de VHC puede ser útil para definir los posibles mecanismos de acción de los péptidos inhibidores de E2.

Materiales y procedimientos

Para las comparaciones de secuencia y de estructura se usaron representantes de la mayoría de los subtipos comunes del virus de la hepatitis C. Las cepas analizadas fueron una cepa H77 del VHC prototipo humana (subtipo 1a, nº de registro en Genbank NP _751921), la cepa HC-J4 (subtipo 1b, nº de registro en Genbank BAA01583), la cepa NDM59 (subtipo 2a, nº de registro en Genbank AF169005), cepa TrKJ (subtipos 3b, nº de registro en Genbank D49374), la cepa ED43 (subtipo 4a, nº de registro en Genbank Y11604), la cepa EUH1480 (subtipo 5a, nº de registro en Genbank Y13184), la cepa euhk2 (subtipo 6a, nº de registro en Genbank Y12083),.

Los procedimientos para derivar modelos generales de las glicoproteínas de superficie se han descrito anteriormente (Gallaher y coI., 1989). El PRSS3, un programa derivado de rdf2 (Pearson y Lipman, 1988), que usa el algoritmo de alineación de secuencia de Smith-Waterman (Smith-Waterman, 1981), se usó para determinar la significación de las alineaciones de las proteínas. El PRSS3 es parte del paquete FASTA de programas de análisis de secuencia disponibles mediante ftp anónima de ftp.virginia.edu. Se usaron los parámetros por defeco para PRSS3, incluida la matriz ce puntuación blosum50, la penalización de abertura de huecos de 12 y la penalización de extensión de huecos de 2. Se usó MacMolly (Soft Gene GmbH, Berlín) se usó para localizar áreas de similitud de secuencia limitada y para realizar los análisis de Chou-Fasman y Robson-Garnier (Biou y coI., 1988; Chou y Fasman, 1974) El PHDsec (Columbia University Bioinformatics Center, http://cubic.bioc.columbia.edu/predictprotein) fue el procedimiento preferido de predicción de la estructura secundaria (Rost y Liu, 2003). El PHDsec predice la estructura secundaria de múltiples alineaciones de secuencia por un sistema de redes neurales y está puntuado con una precisión media prevista de 72% para tres estados, hélice, hebra y bucle. Los dominios con una propensión significativa a formar hélices transmembrana se identificaron con TMpred (ExPASy ,Swiss Institute of Bioinformatics, http://www.ch.embnet.org/softwareITMPRED_form.html).

TMpred se basa en un análisis estadístico de TMbase, una base de datos de glicoproteínas transmembrana naturales (Hofmann y Stoffel, 1993). Las secuencias con una propensión al reparto en la bicapa lipídica se identificaron con Membrane Protein eXplorer versión 2.2a del laboratorio de Stephen White usando los parámetros por defecto (White y coI.,

2003).

Resultados y discusión

Un modelo bidimensional de E2 de VHC se desarrolló sobre la base de la aplicación de análisis computacional proteómico y comparación con las estructuras conocidas de otras proteínas de la cubierta viral de unión al receptor (Fig. 3). La estructura secundaria de E2 de VHC dibujada en la Figura 3 se ajusta al algoritmo de alineación de la estructura secundaria PHDsec y, también, por lo general es consistente con las predicciones de Chou-Fasman y Robson-Garnier. Una característica importante del modelo E2 es la predominancia de estructuras en lámina beta en los dos tercios amino terminales de la molécula y de las estructuras en alfa hélice en el tercio carboxilo terminal de la molécula. Se predijeron enlaces dicisteína sobre la base de la comparación con las glicoproteínas de la cubierta de los retrovirus. En las proteínas de la cubierta retroviral, normalmente, las cisteínas adyacentes que están separadas por más de 15 aminoácidos están unidas covalentemente entre sí. Normalmente, los grupos de cuatro cisteínas cada una separada por menos de 15 aminoácidos están unidas covalentemente con una cisteína no adyacente en el grupo. Las primeras dos alfa hélices largas predichas en el tercio carboxilo terminal de E2 forman una estructura en tallo predicha análoga a la región en talo de otras proteínas de la cubierta de flavivirus (Allison y coI., 1999). La estructura del dominio transmembrana representada se produjo con el algoritmo TMPRED.

Los péptidos inhibidores de E2 del VHC están en mapa de las regiones del modelo de E2 de VHC que corresponden a una región amino terminal, un grupo de cisteínas, el dominio en tallo y transmembrana (regiones sombreadas de la Fig. 3). Estos dominios de E2 de VHC pueden estar implicados en la unión al receptor del virus de la hepatitis C, reorganizaciones estructurales de E2 o interacciones proteína-proteína u otras etapas de pre-fusión. Los péptidos inhibidores de E2 de VHC se pueden usar para interferir con estas etapas precoces en la infección por VHC tal como se representa en la figura 4.

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Garry, Robert F. McKeating, Jane A.

<120> Inhibidores del virus de la hepatitis C

<130> 12920.0016.FZUS00

<160> 138

<170> Patentin versión 3.3

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<223> Péptido sintético

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<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético 30

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

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<212> PRT

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

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<223> Péptido sintético

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<223> Péptido sintético

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<213> Secuencia artificial

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<212> PRT

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

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<223> Péptido sintético

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Virus de la hepatitis C

<400> 137

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<212> PRT

<213> Virus de la hepatitis C

<400> 138

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5

10

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende uno o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en un péptido que consiste en por la secuencia de una cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº: 42.
2. Una composición farmacéutica que comprende al menos un péptido seleccionado de uno o más de los siguientes: a) Un péptido que consiste en por la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 42, en el que el resto N terminal es un grupo amino y el resto C-termina es un grupo carboxilo;

b) un péptido que consiste en por la secuencia de una cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 42, en el que el resto grupo amino N-terminal es sustituido por un resto N-terminal seleccionado del grupo consiste en r: un grupo acetilo, un grupo hidrófobo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo tbutoxicarbonilo o un grupo transportador macromolecular, seleccionado de entre un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono y/o en los que el grupo carboxilo en C terminal está sustituido por un resto en C-terminal seleccionado del grupo consiste en por un grupo amido, un grupo hidrófobo, un grupo t-butiloxicarbonilo o un grupo macromolecular seleccionado de entre un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono;

c) un péptido consiste en por la secuencia de una cualquiera de las SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 42, en el que al menos uno de los enlaces que une residuos de aminoácidos adyacentes es un enlace no peptídico;

d) un péptido constituido por la secuencia de una cualquiera de SEC ID Nº a SEC ID Nº 42, a excepción de que al menos un residuo de aminoácido está en la configuración de D-isómero.
3.

La composición de la reivindicación 2, en la que el resto terminal en el aminoácido N-terminal es un grupo acetilo, un grupo hidrófobo, un grupo carbobenzoxilo, un grupo dansilo, un grupo t-butiloxicarbonilo o un grupo transportador macromolecular, seleccionado de un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono; y/o el resto terminal en el aminoácido C-terminal es un grupo hidrófobo, un grupo t

butiloxicarbonilo o un grupo macromolecular seleccionado de un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono.
4.

La composición de la reivindicación 2, en la que la composición incluye un péptido consiste en por la secuencia de una cualquiera de SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 42, en la que el resto terminal del aminoácido N-terminal es un grupo transportador macromolecular seleccionado de un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono; y/o el resto terminal en el aminoácido C-terminal es un grupo transportador macromolecular seleccionado de un conjugado lipídico, polietilenglicol o un hidrato de carbono.
5.

La composición de la reivindicación 2, en la que al menos un enlace es un enlace no peptídico seleccionado del grupo consiste en por un enlace imido, un enlace éster, un enlace hidracina, un enlace semicarbazoide y un enlace azo.
6.

La composición de la reivindicación 2, en la que al menos un aminoácido es un aminoácido D-isómero.
7.

La composición de la reivindicación 2, en la que el resto terminal del grupo aminoácido N-terminal es un grupo amino y el resto terminal en el aminoácido C-terminal es un grupo carboxilo.
8.

La composición de la reivindicación 1, en la que al menos un péptido se selecciona del grupo de péptidos que consistente en una secuencia seleccionada de las secuencias de SECIDNº 7a42.
9.

Un medicamento para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por virus de la hepatitis C en un paciente, en el que el medicamento comprende una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10.

Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis C en un paciente.
11.

Un anticuerpo sustancialmente purificado usando como inmunógeno un péptido tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
12.

Un medicamento para su uso en el tratamiento o la prevención de la infección por el

5 virus de la hepatitis C en un paciente, en el que el medicamento comprende uno o más péptidos tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y/o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11 y que además comprende uno o más péptidos y/o uno o más anticuerpos dirigidos a la inhibición de la etapa de fusión con la membrana mediada por la proteína 1 de la cubierta del virus de la hepatitis C.

10
13.

Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 11 para usar en el tratamiento o la prevención de la infección por el virus de la hepatitis C en un paciente.
14.

Uso de una composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las

15 reivindicaciones 1 a 8 y/o un anticuerpo de la reivindicación 11 para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la infección por el virus de la hepatitis C en un paciente.
15. Un péptido constituido por la secuencia de una cualquiera de SEC ID Nº 1 a 6. 20
16. Un péptido constituido por la secuencia de una cualquiera de SEC ID Nº 7 a 42.