PT1735296E - Materiais e métodos para tratamento de distúrbios da coagulação - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Materiais e métodos para tratamento de distúrbios da coagulação"

Antecedentes da Invenção A warfarina (cumarina) é um anticoagulante que actua através da inibição dos factores de coagulação dependentes de vitamina K. Normalmente, os compostos à base de warfarina são derivados de 4-hidroxicumarina, como a 3-(a-acetonilbenzil)-4-hidroxicumarina (Coumadina). A Coumadina e outros anticoagulantes cumarinicos inibem a sintese dos factores de coagulação vitamina K-dependentes, os quais incluem os Factores II, VII, IX e X. As proteínas anticoagulantes C e S são também inibidas por anticoagulantes da warfarina. Acredita-se que a warfarina interfere com a síntese do factor de coagulação através da inibição da vitamina K epóxido-redutase, inibindo assim a regeneração da vitamina K.

Geralmente, o efeito anticoagulante é observado cerca de 24 horas após a administração de uma única dose de warfarina e é eficaz durante 2 a 5 dias. Enquanto os anticoagulantes não têm um efeito directo sobre um trombo estabelecido e não invertem os danos do tecido isquémico, o tratamento anticoagulante tem o fim de evitar a extensão dos coágulos formados e/ou prevenir complicações tromboembólicas secundárias. Estas complicações podem resultar em sequelas graves e potencialmente fatais. A FDA aprovou a warfarina para as seguintes indicações: 1) tratamento ou profilaxia da trombose venosa profunda e embolia pulmonar, 2) complicações tromboembólicas associadas a fibrilação atrial e/ou substituição da válvula cardíaca, e 3) redução do risco de morte, enfarte do miocárdio recorrente e acidente vascular cerebral ou embolia sistémica após enfarte do miocárdio. Há uma série de efeitos adversos associados à administração de warfarina. Estes incluem hemorragia, fatal ou não, de qualquer tecido ou órgão, para além de complicações hemorrágicas tal como paralisia. Outros efeitos 2 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ adversos compreendem parestesia, incluindo sensação de frio e calafrios; dor de cabeça; dores de tórax, de abdómen, articulares, musculares ou outras; tonturas; falta de ar; respiração ou deglutição difíceis; inchaço, fraqueza, hipotensão, ou choque inexplicável. Outras reacções adversas relatadas incluem reacções de hipersensibilidade/alérgicas, microembolização sistémica do colesterol, síndrome dos dedos dos pés roxos, hepatite, doença hepática colestática, icterícia, aumento das enzimas hepáticas, vasculite, edema, febre, exantema, dermatite incluindo erupções bolhosas, urticária, dor abdominal incluindo cólicas, flatulência/distensão abdominal, fadiga, letargia, mal-estar, astenia, náuseas, vómitos, diarreia, dor de cabeça, tonturas, alterações do paladar, prurido, alopecia e intolerância ao frio. A toxicidade dos fármacos é uma consideração importante no tratamento de seres humanos e animais. Os efeitos tóxicos secundários resultantes da administração de fármacos compreendem uma variedade de condições que variam desde febre baixa até à morte. A terapia por fármacos só se justifica quando os benefícios do protocolo de tratamento superam os potenciais riscos associados ao tratamento. Os factores considerados pelo médico incluem o impacto qualitativo e quantitativo do fármaco a ser utilizado, bem como as consequências no caso de o indivíduo não receber o medicamento. Outros factores a ter em conta compreendem a condição física do paciente, o estágio da doença e a sua história de progressão, e quaisquer conhecidos efeitos adversos associados ao fármaco. A eliminação do fármaco é o resultado da actividade metabólica sobre o fármaco e a subsequente excreção do fármaco do corpo. A actividade metabólica pode ter lugar no suprimento vascular e/ou em compartimentos celulares ou órgãos. 0 fígado é o principal local de metabolismo de fármacos. O processo metabólico pode ser dividido em metabolismo primário e secundário, também designado metabolismo de fase I e de fase II. No metabolismo de fase I, o fármaco é quimicamente alterado por oxidação, redução, hidrólise, ou qualquer combinação dos processos atrás mencionados e, geralmente, resulta num produto mais polar do 3

ΕΡ 1 735 295/PT que o medicamento original. No metabolismo de fase II, os produtos de reacção da fase I são combinados com substratos endógenos, por exemplo, ácido glucurónico, para produzir um produto de adição ou de conjugação que é ainda mais hidrófilo do que o produto da fase I, e que é facilmente eliminado pela bilis ou pela urina. Em alguns casos, o fármaco pode passar apenas pelo metabolismo de fase II (conjugação), noutros casos o fármaco pode ser eliminado na forma inalterada. 0 primeiro passo nestas reacções de sintese é muitas vezes um acoplamento oxidativo realizado pelo sistema do citocromo P450 (CYP450). Os metabolitos formados nas reacções de fase II são tipicamente o produto de uma reacção de acoplamento levada a cabo por uma enzima transferase. Estas reacções incluem glucuronidação, conjugação com aminoácidos, acetilação, sulfoconjugação, e metilação.

As enzimas do citocromo P450 (CYP450) de mamífero, incluindo o sistema CYP450 humano, são proteínas membranares hémicas que foram inicialmente descobertas em microssomas de fígado de rato. Para funcionar, as enzimas CYP450 precisam de uma fonte de electrões. Existem dois tipos diferentes de cadeias de transferência de electrões para as CYP450s, que dependem da localização da enzima na célula. Algumas P450s encontram-se na membrana mitocondrial interna e algumas no retículo endoplasmático (RE). A proteína que doa electrões às CYP450s no RE é designada NADPH citocromo P450-redutase. A ferredoxina é o doador imediato de electrões às CYP450s das mitocôndrias (CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP24, CYP27A1, CYP27B1, CYP27C1). 0 NADPH é a fonte dos electrões que fluem da ferredoxina-redutase para a ferredoxina e depois para o CYP450. Algumas P450s também podem aceitar electrões do citocromo b5.

Os polimorfismos (diferenças na sequência de ADN encontradas em 1% ou mais de uma população) podem conduzir a diferenças no metabolismo de fármacos, portanto, são características importantes dos genes CYP450 nos seres humanos. A CYP2C19 tem um polimorfismo que altera a capacidade da enzima para metabolizar mefenitoína (um fármaco marcador). Nos caucasianos, o polimorfismo do fenótipo metabolizador pobre atinge apenas 3% da população. No entanto, este é observado em 20% da população asiática. 4 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Devido a esta diferença, é importante estar ciente da raça de uma pessoa quando se administra medicamentos que são metabolizados de forma diferente por diferentes populações. A dose eficaz de alguns fármacos que possuem um intervalo estreito de eficácia antes de se tornarem tóxicos pode tornar-se uma overdose para um metabolizador pobre. A CYP2D6 é talvez a P450 melhor estudada com um polimorfismo no metabolismo de fármacos. Esta enzima é responsável por mais de 70 oxidações de fármacos diferentes. Uma vez que pode não haver outra maneira de eliminar estes fármacos do sistema, os metabolizadores pobres podem sofrer um risco grave de reacções adversas a medicamentos. Os substratos da CYP2D6 incluem anti-arrítmicos (flecainida, mexiletina, propafenona), antidepressivos (amitriptilina, paroxetina, venlafaxina, fluoxetina, trazadona), antipsicóticos (clorpromazina, haloperidol, tioridazina), beta-bloqueadores (labetalol, timolol, propanolol, pindolol, metoprolol), analgésicos (codeina, fentanil, meperidina, oxicodona, propoxifeno), e muitos outros fármacos. A CYP2E1 é induzida em alcoólicos. Existe um polimorfismo associado a este gene que é mais comum no povo chinês. A subfamilia CYP3A é uma das mais importantes famílias metabolizadoras de fármacos nos seres humanos. A CYP3A4 é "a CYP450 mais abundantemente expressa no fígado humano". (Arch. Biochem. Biophys. 369, 11-23, 1999). Sabe-se que a CYP3A4 metaboliza mais de 120 fármacos diferentes, por exemplo, acetaminofeno, codeína, ciclosporina A, diazepam, eritromicina, lidocaína, lovastatina, taxol, cisaprida, terfenadina, e warfarina, para citar alguns. O número de reacções adversas a medicamentos (RAMs) nos Estados Unidos aumentou drasticamente nos últimos anos e hoje representa um problema importante de saúde nacional. A Organização Mundial da Saúde (OMS) define uma RAM como "qualquer resposta prejudicial e não desejada a um medicamento que ocorre com doses habitualmente usadas para profilaxia, diagnóstico ou tratamento ou para modificação de funções fisiológicas". Para destacar a importância do erro na génese das RAMs e o facto de que a maioria (30-80%) das RAMs são evitáveis, uma definição mais recente de RAM é "uma 5

ΕΡ 1 735 296/PT resposta consideravelmente prejudicial ou desagradável, resultante de uma intervenção relacionada com a utilização de um medicamento, que prevê risco de futura administração e justifica prevenção ou tratamento especifico, ou a alteração do regime de administração, ou a suspensão do produto."

Uma vez que as RAMs são uma causa importante de morbidade e mortalidade no nosso sistema de saúde, a redução da incidência de RAMs tornou-se uma prioridade nacional (FDA, Center for Drug Evaluation and Research). De acordo com estimativas formais, mais de 2,5 milhões de RAMs ocorrem todos os anos em hospitais, serviços ambulatórios e lares de idosos, resultando em mais de 106 000 mortes e custando à economia dos U.S.A. 136 bilhões de dólares anualmente em morbidade e mortalidade associadas a fármacos. Esta despesa é superior ao custo anual de doenças cardiovasculares e diabetes nos Estados Unidos. Além disso, estima-se que a taxa de mortalidade associada a RAMs torna-as a quarta causa principal de morte no pais.

Muitas RAMs devem-se ao facto de que a maioria dos fármacos desenvolvidos pela indústria farmacêutica interagem significativamente com os componentes do sistema CYP, seja por depender deles para o seu metabolismo e/ou pela inibição ou indução de várias fracções do CYP. Noutras palavras, como muitas classes importantes de fármacos (por exemplo, anti-hipertensivos, anti-histaminicos, antidepressivos, imunossupressores, estatinas) interagem com o sistema CYP, este pode funcionar como um "ponto de estrangulamento" contra o metabolismo seguro e eliminação desses agentes tóxicos, com consequentes efeitos tóxicos. No que diz respeito ao metabolismo de fármacos, duas fracções do sistema CYP merecem menção especial: a CYP3A4 e a CYP2D6. Cerca da metade de todos os fármacos conhecidos interagem com a CYP3A4. Da mesma forma, a CYP2D6, uma fracção enzimática cuja actividade depende muito da genética (polimorfismos genéticos), metaboliza um terço dos medicamentos em uso clinico. Ambas as enzimas estão envolvidas no metabolismo de compostos do tipo warfarina. A grande maioria (70-90%) das RAMs ocorre como extensões dos seus esperados efeitos farmacológicos (acção 6

ΕΡ 1 735 296/PT farmacológica exagerada). Isto é particularmente relevante para a warfarina uma vez que a extensão do efeito farmacológico da warfarina é o sangramento. Embora diversos factores possam contribuir para o desenvolvimento de RAMs, o metabolismo alterado conduzindo a niveis elevados de fármacos, quer devido a interacções medicamentosas a nível enzimático, quer devido a alterações genéticas da actividade enzimática e/ou à disfunção de órgãos (fígado, rim), desempenham um papel particularmente importante na génese das RAMS . A terapia por fármacos com warfarina é particularmente difícil porque o metabolismo da warfarina é complexo e sujeito a interacções com uma série de outros fármacos, inclusive fármacos, como a amiodarona por exemplo, que são comummente prescritos para pacientes com fibrilação atrial. A warfarina é uma mistura de enantiómeros com diferentes actividades intrínsecas sobre a enzima da vitamina K epóxido-redutase (vker). Estes enantiómeros possuem diferentes vias metabólicas com diferentes isoenzimas CYP450. 0 sistema metabólico CYP450 é altamente induzível ou repressível por uma série de factores externos, tais como a alimentação e outras medicações. Além disso, o sistema CYP450 está sujeito a muitas variações genéticas, tem uma capacidade baixa e é facilmente saturável. Por estas razões, o metabolismo da warfarina está sujeito a variações imprevisíveis e cada enantiómero tem um destino metabólico diferente e diferentes potências sobre a enzima VKER.

Além disso, a actividade da warfarina sobre a enzima VKER resulta na inibição dos factores de coagulação II, VII, IX e X, que têm semi-vidas diferentes da sua, indo desde horas (factor VII) até dias (factor X). Devido a esta complexa situação, o efeito farmacológico (aumento do tempo de coagulação) da warfarina só se torna evidente 5 a 10 dias após administração. Assim, compreende-se porque é extremamente dificil prever os efeitos da terapia com warfarina e a razão pela qual os pacientes estão em alto risco de complicações hemorrágicas, incluindo a morte. No estado actual da terapia com warfarina, os pacientes devem apresentar-se num laboratório de coagulação uma vez por semana para serem controlados e para se detectar qualquer 7 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ risco precoce de complicações hemorrágicas. Mesmo com este estrito sistema de vigilância, muitos pacientes medicamentados com warfarina morrem anualmente de complicações hemorrágicas.

Os potenciais problemas clínicos e o risco empresarial associados ao desenvolvimento de fármacos, os quais têm de passar através do "braço de ferro" do metabolismo mediado por P450, aumentaram bastante nos Estados Unidos como se pode ver pelos seguintes factos: 1) o número de prescrições passadas neste país aumentou para cerca de 3 bilhões por ano ou 10 por pessoa, e 2) os pacientes, particularmente aqueles que viveram mais e têm mais problemas médicos complexos, tendem a tomar vários medicamentos. A última questão é importante porque a incidência das RAMs cresce exponencialmente quando os indivíduos tomam mais de quatro fármacos. Embora seja uma boa prática evitar a polifarmácia, em muitos casos isso não é possível porque os doentes necessitam de diferentes classes de medicamentos para tratar eficazmente complexas condições médicas. A paisagem da R&D farmacêutica está cheia de fármacos retirados pela FDA porque causavam RAMs fatais envolvendo o metabolismo mediado pelo CYP. Esses fármacos eram clinicamente eficazes e, em muitos casos, bem sucedidos comercialmente. Fármacos notáveis que foram retirados devido a mortes relacionadas com RAMs envolvendo o metabolismo mediado por CYP450 são a terfenadina (Fevereiro de 1998), o astemizol (Julho 1999) e a cisaprida (Janeiro 2000). Em todos estes casos, interacções medicamentosas envolvendo a CYP3A4 causaram o aumento da concentração do agente farmacêutico a tal ponto que inibiu um determinado tipo de canal de potássio no coração chamado IKr, o que, por sua vez, prolongou o intervalo QT e causou um forma potencialmente fatal de taquiarritmia ventricular designada "torsades de pointes".

Assim, um análogo da warfarina com um destino metabólico controlável e previsível, não dependente do CYP450, é muito desejável e seria um complemento importante ao arsenal de medicamentos disponíveis para o tratamento de pacientes com fibrilação atrial. Alguns análogos da warfarina foram 8 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ anteriormente relatados. Ver, por exemplo, WO 02/085882, que se incorpora aqui por referência.

Resumo da invenção A presente invenção proporciona compostos e composições farmacêuticas que são úteis como anticoagulantes ou úteis em terapia anticoagulante.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se um composto da fórmula:

e seus sais R é alquilo R é alquilo R é alquilo R é alquilo farmaceuticamente aceitáveis, em que

Ci-Cg substituído com pelo menos um halogéneo; C2-C8 substituído com pelo menos um halogéneo; C3-C7 substituído com pelo menos um halogéneo; ou C3-C6 substituído com pelo menos um halogéneo;

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, proporciona-se um composto de acordo com a reivindicação 1, em que: R é alquilo Ci-C8 substituído com pelo menos um grupo cloro; R é alquilo C2-C8 substituído com pelo menos um grupo cloro; R é alquilo C3-C7 substituído com pelo menos um grupo cloro; R é alquilo C3-C6 substituído com pelo menos um grupo cloro;

Estes compostos interagem com a VKER e/ou são úteis como anticoagulantes e/ou em terapia anticoagulante. A invenção também engloba composições farmacêuticas contendo estes compostos e a utilização destes compostos ou composições no tratamento de distúrbios da coagulação. 9 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Descrição sucinta das Figuras A Figura 1 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-(4-trifluorometoxifenil)propiónico. A Figura 2 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 2,2,3,3,3-pentafluoropropilico do ácido 4—(4— hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico. A Figura 3 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 3,3,3-trifluoropropilico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico A Figura 4 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 2,2,3,3,3-pentafluoro-l-metilpropílico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico. A Figura 5 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 4-fluorobenzilico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico. A Figura 6 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 2-(4-fluorofenoxi)etílico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico. A Figura 7 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 2,2,2-trifluoro-l-metiletílico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico. A Figura 8 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 2,2,2-trifluoro-l-trifluorometiletílico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico. A Figura 9 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo éster 2,2, 2-trifluoro-l-metil-l-trifluorometiletílico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico. A Figura 10 mostra actividade inibitória sobre a VKER pela warfarina. 10 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ A Figura 11 mostra a actividade inibitória sobre a VKER pelo ácido 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzóico. A Figura 12 mostra o efeito da fluoração no metabolismo mediado pelo citocromo P450 e por esterases em microssomas humanos combinados. Apresentam-se as razões de áreas dos picos de incubações microssomais na presença (barras cheias) ou ausência (barras vazias) de NADPH. As barras cheias representam CYP450 + esterase e as barras vazias representam esterase apenas. A Figura 13 mostra o efeito da fluoração no metabolismo mediado pelo citocromo P450 e por esterases em microssomas humanos combinados. Apresentam-se as razões de áreas dos picos para incubações microssomais na presença (barras cheias) ou ausência (barras vazias) de NADPH. As barras cheias representam CYP450 + esterase e as barras vazias representam esterase apenas. A Figura 14 mostra o desaparecimento de um composto original em microssomas humanos combinados contendo NADPH, na ausência (barras cheias) de paraoxona, ou na presença (barras vazias) de paraoxona, um conhecido inibidor da esterase.

Os compostos identificados nas Figuras que não estão dentro do âmbito das reivindicações, são para fins de informação.

Divulgação detalhada A invenção proporciona compostos da fórmula: o

OH e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que R é alquilo Ci-Cs substituído com pelo menos um halogéneo. 11 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona compostos em que R é alquilo C2-C8 substituído com pelo menos um halogéneo. Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona compostos em que R é alquilo C3-C7 substituído com pelo menos um halogéneo. Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona compostos em que R é alquilo C3-C6 substituído com pelo menos um halogéneo.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona compostos em que R é alquilo C3-C7 substituído com pelo menos um grupo flúor.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona compostos em que R é alquilo C3-C6 substituído com pelo menos dois grupos flúor.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona compostos em que R é um grupo tert-butilo substituído com pelo menos seis grupos flúor.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona compostos em que R é

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona o sal de sódio ou de potássio de 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3- 12 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ il)metil)benzoato de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo, sendo preferido o sal de sódio.

As concretizações especificas da presente invenção incluem os seguintes compostos:

F F

Por "alquilo" entende-se um hidrocarboneto linear ou ramificado, não ciclico. Exemplos de grupos alquilo incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, 2-pentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 3-metilpentilo, heptilo e octilo. "Alquilo Ci-C6" denota grupos alquilo, lineares ou ramificados, não ciclicos, com 1-6 átomos de carbono. Da mesma forma, "alquilo C1-C4" denota grupos alquilo, lineares ou ramificados, não ciclicos, com 1-4 átomos de carbono. 13 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Os termos "halogéneo" ou "halo" indicam flúor, cloro, bromo e iodo. A presente invenção proporciona materiais e métodos para tratamento anticoagulante. Os compostos terapêuticos da presente invenção são convenientemente estáveis em armazenagem mas possuem uma semi-vida mais curta no ambiente fisiológico do que outros fármacos disponíveis para tratamento anticoagulante; assim, os compostos da presente invenção podem ser usados com menor incidência de efeitos colaterais e de toxicidade. Numa concretização preferida, a presente invenção proporciona compostos terapêuticos anticoagulantes. Os compostos da presente invenção podem ser usados para tratar populações em risco, trazendo assim alívio dos sintomas, melhorando a qualidade de vida, prevenindo complicações agudas e a longo prazo, reduzindo a mortalidade e tratando distúrbios secundários.

Vantajosamente, a presente invenção proporciona compostos que são facilmente metabolizados pelos sistemas fisiológicos de desintoxicação metabólica de fármacos. Especificamente, numa concretização preferida, os compostos terapêuticos da presente invenção contêm um grupo éster halogenado que não prejudica a capacidade terapêutica destes compostos, mas que os torna mais susceptíveis à degradação por hidrolases, principalmente por esterases séricas e/ou citosólicas. Determinou-se que os compostos convenientemente inibem a enzima vitamina K epóxido-redutase (VKER).

Para além da sua actividade sobre a enzima VKER, a presença de pelo menos um átomo de halogéneo na molécula de éster confere a estes compostos certas propriedades vantajosas. Especificamente, a adição de halogéneo a estes compostos reduz significativamente ou elimina o seu metabolismo mediado pelo CYP450, enquanto ao mesmo tempo aumenta bastante a hidrólise mediada por esterases. Assim, a halogenação favorece inesperadamente o metabolismo através da esterase. Na ausência de halogenação, existe uma preferência pelo metabolismo mediado por CYP450. Esta propriedade confere aos compostos de ésteres halogenados importantes vantagens terapêuticas em relação aos seus análogos não halogenados. 14 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Uma vez que os compostos halogenados da presente invenção não dependem das enzimas do CYP450 para o seu metabolismo, também são menos propensos à interacção com outros fármacos no local do CYP450 e, por isso, são seguras para usar em pacientes que já estão a tomar outras medicações, ao contrário dos seus análogos não halogenados. Os compostos da presente invenção são úteis em métodos de tratamento que compreendem a administração destes compostos a indivíduos que necessitam de tratamento anticoagulante.

Numa concretização adicional, a presente invenção refere-se a produtos de degradação que são formados quando os compostos terapêuticos da presente invenção sofrem acção pelas esterases. Esses produtos de degradação podem ser usados, por exemplo, como aqui descrito para acompanhar a depuração dos compostos terapêuticos de um paciente.

Os compostos da presente invenção são úteis em métodos para o tratamento de distúrbios da coagulação. Especificamente, a presente invenção proporciona compostos que são facilmente metabolizados pelo sistema hidrolítico de desintoxicação de fármacos em preferência ao sistema oxidativo de desintoxicação de fármacos. Especificamente, esta invenção proporciona compostos que são susceptíveis à degradação por hidrolases, particularmente esterases séricas e/ou citosólicas.

Esta invenção é concebida para os compostos que são mais facilmente metabolizados pelos sistemas hidrolíticos de desintoxicação de fármacos. Especificamente, esta invenção proporciona análogos de medicamentos que foram concebidos para serem mais susceptíveis à degradação por hidrolases, principalmente esterases séricas e/ou citosólicas, e métodos de tratamento que compreendem a administração destes análogos aos indivíduos.

Vantajosamente, a utilização dos compostos da presente invenção pode resultar numa redução das interacções metabólicas clinicamente relevantes que envolvem o sistema CYP (particularmente a fracção CYP3A4) e ajudar a prevenir RAMs. Estes compostos não dependem do sistema enzimático CYP450, mas sim, exploram esterases amplamente distribuídas 15 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ para ο seu metabolismo e geração de um metabolito substancialmente inactivo sob o ponto de vista farmacológico. Esta abordagem torna os agentes anticoagulante mais seguros, mantendo a eficácia e reduzindo significativamente o risco financeiro associado ao desenvolvimento de medicamentos.

Numa concretização preferida da presente invenção, proporcionam-se compostos terapêuticos que são úteis para tratamento anticoagulante e que contêm um grupo éster halogenado que é susceptivel à acção hidrolítica de enzimas, deste modo decompondo o composto num metabolito substancialmente inactivo e solúvel em água e facilitando a sua eficaz remoção do indivíduo tratado. Como aqui referido, um metabolito "substancialmente inactivo" pode apresentar, por exemplo, cerca de 10% ou menos (e mais preferivelmente cerca de 5% ou menos; ainda mais preferivelmente cerca de 2% ou menos; ainda mais preferivelmente, cerca de 1% ou menos) da actividade do composto original. Numa concretização preferida, os compostos terapêuticos são metabolizados pelas esterases plasmáticas, esterases tecidulares, e/ou esterases microssomais não oxidativas/hidrolíticas.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se aos produtos de degradação que são produzidos quando os compostos terapêuticos da presente invenção sofrem acção das esterases. A presença destes produtos de degradação na urina ou no soro pode ser usada para monitorizar a taxa de depuração do composto terapêutico de um paciente. A ligação éster pode ser introduzida no composto num local conveniente no processo de fabrico do fármaco alvo. Além disso, a sensibilidade da ligação éster pode ser manipulada através da adição de grupos laterais que dificultem ou promovam a actividade hidrolítica das hidrolases ou esterases responsáveis pela clivagem do fármaco no sítio do éster. Métodos para adicionar estes grupos laterais, bem como os próprios grupos laterais, são bem conhecidos pelo técnico perito e podem ser facilmente levados a cabo através das orientações aqui dadas.

Os compostos da presente invenção são úteis para tratamento anticoagulante, o qual inclui a administração de 16

ΕΡ 1 735 296/PT uma quantidade terapeuticamente eficaz de compostos de ésteres halogenados a um indivíduo com necessidade de tratamento. Assim, a presente invenção proporciona ésteres halogenados e composições farmacêuticas destes compostos de éster. Numa concretização preferida, o paciente é um ser humano; no entanto, animais não humanos também podem ser tratados.

As interacções medicamentosas (IM) adversas, a elevação dos valores dos testes da função hepática (TFH), e o prolongamento do intervalo QT conduzindo a torsades de pointes (TDP) são as três razões principais pelas quais os potenciais fármacos não conseguem obter a aprovação da FDA. Todas estas causas são, em certa medida, baseadas no metabolismo. Um fármaco com duas vias metabólicas incluídas na sua estrutura, uma oxidativa e uma não oxidativa, é altamente desejável na indústria farmacêutica. Uma via metabólica não oxidativa opcional oferece ao indivíduo tratado outra possibilidade de desintoxicação de fármacos (uma via de saida) quando uma das vias metabólicas oxidativas se encontra saturada ou não funcional. Enquanto uma via metabólica dupla é desejável e necessária para haver alternativa no caso de a principal via metabólica estar bloqueada, no caso dos inibidores da VKER, tais como os compostos revelados na presente invenção, é muito importante que a via principal de metabolismo seja não oxidativa porque o metabolismo oxidativo é especialmente sensível a interacções medicamentosas. Os ésteres halogenados desta invenção são primariamente, se não apenas, metabolizados por esterases, um sistema enzimático não oxidativo, e, portanto, são especialmente úteis para tratar pacientes que estejam a tomar outros medicamentos.

Os compostos aqui divulgados podem facilmente sofrer modificações adicionais pelos peritos na especialidade. Assim, análogos e sais dos compostos exemplificados estão dentro do âmbito da presente invenção. Conhecendo os compostos da presente invenção, químicos experientes podem utilizar procedimentos conhecidos para sintetizar esses compostos a partir de substratos disponíveis. Conforme utilizado no presente pedido, o termo "análogos" refere-se a compostos que são substancialmente iguais a um outro 17 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ composto, mas que podem ter sido modificados, por exemplo, pela adição de grupos laterais. 0 termo "análogos" tal como usado neste pedido pode também referir-se a compostos que são substancialmente iguais a um outro composto, mas que possuem substituições atómicas ou moleculares em determinados locais do composto.

Análogos dos compostos exemplificados podem ser facilmente preparados utilizando reacções padrão do conhecimento comum. Entre estas reacções padrão constam, mas não lhes estando limitadas, as reacções de hidrogenação, metilação, acilação, halogenação e acidificação. Por exemplo, podem preparar-se novos sais dentro do âmbito da invenção através da adição de bases minerais, por exemplo, NaOH, etc., ou bases fortes orgânicas, por exemplo, trietanolamina, etc., em quantidades apropriadas para formar o sal do composto original ou um seu derivado. Além disso, podem utilizar-se reacções de sintese de acordo com procedimentos conhecidos, para adicionar ou modificar vários grupos nos compostos exemplificados, a fim de produzir outros compostos dentro do âmbito da invenção.

Entre os sais farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos constam, mas não lhes estando limitados, sais de ácidos inorgânicos, tais como dos ácidos clorídrico, sulfúrico, fosfórico, difosfórico, bromídrico, nítrico, ou sais de ácidos orgânicos, como dos ácidos fórmico, cítrico, málico, maleico, fumárico, tartárico, succínico, acético, láctico, metanossulfónico, p-toluenossulfónico, 2-hidroxietil-sulfónico, salicílico e esteárico. Da mesma forma, os catiões farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não lhes estando limitados, sódio, potássio, cálcio, alumínio, lítio e amónio. Os peritos na especialidade reconhecerão uma grande variedade de sais de adição farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos. A presente invenção também abrange pró-fármacos dos compostos da presente invenção.

Vantajosamente, os compostos halogenados constituem substratos menos favoráveis para o citocromo CYP450 do que os análogos não halogenados. São, portanto, mais susceptíveis a serem metabolizados por esterases, o que é desejável para 18

ΕΡ 1 735 296/PT eliminar as interacções medicamentosas de acordo com a presente invenção. A sintese dos compostos da presente invenção pode ser levada a cabo como se mostra no Esquema 1.

Esquema 1:

OH

O

No Esquema 1, 4-hidroxicumarina e um aldeido aromático opcionalmente substituído são aquecidos numa mistura de trietilamina e ácido fórmico (razão molar 2:5) para dar a correspondente 3-benzil-4-hidroxicumarina substituída, na qual R é como atrás definido. A presente invenção refere-se ainda a compostos enantiomericamente enriquecidos e a composições que os compreendem, úteis para o tratamento de distúrbios da coagulação. As formas enantioméricas isoladas dos compostos da invenção estão substancialmente isentas uma da outra (ou seja, em excesso enantiomérico). Noutras palavras, as formas "R" dos compostos estão substancialmente isentas das formas "S" dos compostos e estão, portanto, em excesso enantiomérico em relação às formas "S". Por outro lado, as formas "S" dos compostos estão substancialmente isentas das formas "R" dos compostos e estão, portanto, em excesso enantiomérico em relação às formas "R". Numa concretização da invenção, os compostos enantioméricos isolados estão pelo menos em cerca de 80% de excesso enantiomérico. Numa concretização preferida, os compostos estão, pelo menos, em cerca de 90% de excesso enantiomérico. Numa concretização mais preferida, os compostos estão, pelo menos, em cerca de 95% de excesso enantiomérico. Numa concretização ainda mais preferida, os compostos estão pelo menos em cerca de 97,5% de excesso enantiomérico. Numa concretização mais preferida, os compostos estão pelo menos em 99% de excesso enantiomérico. 19

ΕΡ 1 735 296/PT

Os compostos da presente invenção são úteis em métodos para tratar distúrbios da coagulação, que compreendem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz dos ésteres halogenados da presente invenção a um indivíduo com necessidade de tratamento. Os compostos terapêuticos desta invenção têm aplicação em ambos os contextos clínicos, veterinário e humano. Além disso, os compostos da presente invenção têm propriedades terapêuticas semelhantes àquelas do composto original não modificado (Coumadina). Assim, as doses e vias de administração dos compostos divulgados são semelhantes às já utilizados na arte e conhecidas do técnico perito (ver, por exemplo, Physicians' Desk Reference, 54a ed., Medicai Economics Company, Montvale, NJ, 2000 ou a Patente U.S. 5856525).

Os compostos da presente invenção podem ser administrados por via oral, tópica, parentérica, rectal, por inalação ou pulverização, em formulações de unidades de dosagem contendo transportadores, adjuvantes e veículos convencionais não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. O termo parentérico como aqui utilizado inclui injecção percutânea, subcutânea, intravascular (por exemplo, intravenosa), intramuscular ou intratecal, ou técnicas de infusão e similares. Além disso, proporciona-se uma formulação farmacêutica compreendendo um composto da presente invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. Podem estar presentes um ou mais compostos da presente invenção em associação com um ou mais transportadores e/ou diluentes e/ou adjuvantes não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis e, se desejado, outros princípios activos. As composições farmacêuticas contendo os compostos da presente invenção podem estar numa forma adequada para uso oral, por exemplo, na forma de comprimidos, trociscos, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, em pó ou grânulos dispersíveis, emulsão, cápsulas moles ou duras, xaropes ou elixires.

As formulações encontram-se descritas pormenorizadamente em várias referências que serão bem conhecidas e estarão facilmente à disposição dos peritos na especialidade. Por exemplo, Remington's Pharmaceutícal Science por E.W. Martin descreve formulações que podem ser utilizadas em conexão com 20

ΕΡ 1 735 296/PT a presente invenção. Em geral, as composições da presente invenção serão formuladas de modo a combinar uma quantidade eficaz do composto(s) bioactivo com pelo menos um transportador, solvente, excipiente, e/ou adjuvante adequado, a fim de facilitar a administração eficaz da composição .

De acordo com a invenção, proporciona-se composições farmacêuticas compreendendo como principio activo uma quantidade eficaz de um ou mais compostos da invenção e um ou mais transportadores e/ou diluentes não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. Entre os exemplos destes transportadores para uso na invenção constam etanol, dimetilsulfóxido, glicerol, silica, alumina, amido, e transportadores e diluentes equivalentes.

Além disso, os transportadores aceitáveis podem ser sólidos ou líquidos. As preparações na forma sólida incluem pós, comprimidos, pilulas, cápsulas, hóstias, supositórios e grânulos dispersiveis. Um transportador sólido pode ser uma ou mais substâncias que podem actuar como diluentes, aromatizantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes de suspensão, ligantes, conservantes, desagregantes de comprimidos ou um material de encapsulamento.

As composições farmacêuticas divulgadas podem ser divididas em unidades de dosagem contendo quantidades adequadas do componente activo. A forma de unidade de dosagem pode ser uma preparação acondicionada, tal como comprimidos, cápsulas e pós embalados em papel, ou em recipientes de plástico, ou em frascos, ou ampolas. Além disso, a unidade de dosagem pode ser uma preparação em base liquida ou formulada para ser incorporada em produtos alimentares sólidos, goma de mascar ou pastilha. O termo "indivíduo(s)" é definido como um mamífero individual ao qual se administra um composto da presente invenção. O mamífero pode ser um roedor, como por exemplo, um ratinho ou um rato, um não roedor, por exemplo, um porco, um cavalo, um coelho, uma cabra, uma vaca, um gato, um cão, ou pode ser um ser humano. Numa concretização preferida, o indivíduo é um ser humano. 21

ΕΡ 1 735 296/PT

Seguem-se exemplos que ilustram os procedimentos para a prática da invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como uma restrição. Todas as percentagens estão em peso e todas as proporções de solventes em mistura estão em volume, salvo indicação em contrário. As reacções foram realizadas em solventes secos sob uma atmosfera de azoto, salvo indicação em contrário, e foram seguidas de cromatografia em camada fina (CCF) em placas de vidro Altech (0,25 mm) pré-revestidas com silica-gel que foram visualizadas com luz UV de ondas curtas ou numa câmara de iodo. O termo "tratamento padrão" refere-se à adição de água à mistura reaccional, extracção com acetato de etilo (3x), lavagem das camadas orgânicas combinadas sucessivamente com água e salmoura, secagem em Na2S04 anidro, filtração e concentração num evaporador rotativo Buchi R-114. As separações cromatográficas foram realizadas em colunas de silica-gel (silica-gel Aldrich, mesh 70-230, 60 A) ou num Gilson Liquid Handler com uma coluna de inversão de fases Polaris C18 (5 μ, 100x212) . Espectros de RMN de XH foram registados num espectómetro Nicolet/GE NT 300.

Exemplo 1 - Preparação do éster 2,2,2-trifluoro-l-metil-1-trifluorometiletilico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico

Preparou-se formato de trietilamónio (TEAF) pela adição de TEA (20,0 ml) a ácido fórmico (16,5 ml) com arrefecimento por gelo. Ao TEAF adicionou-se 4-(2,2,2-trifluoro-l-metil-1-trifluorometiletoxicarbonil)benzaldeído (3,78 mL) e 4-hidroxi-cromen-2-ona (6,Og) e a mistura resultante foi aquecida a 130-140°C durante 3 horas, arrefecida até à temperatura ambiente, diluída com água e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca em MgSCg e concentrada sob vácuo para dar um sólido amarelo claro. O sólido bruto foi recristalizado em etanol para dar éster 22

ΕΡ 1 735 296/PT 2,2,2-trifluoro-l-metil-l-trifluorometiletílico do ácido 4-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico (1,95 g).

Exemplo 2 de Informação - Preparação de 4-hidroxi-3-(3-oxo-1, 3-di-hidroisobenzofurano-l-il)-cromen-2-ona O ,0

Uma solução de 4-hidroxicromen-2-ona (650 mg) e 2-carboxibenzaldeído (300 mg) em etanol foi aquecida ao refluxo durante 4 horas, arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada sob vácuo para dar um óleo bruto que foi diluido com água. O precipitado 4-hidroxicromen-2-ona foi recolhido por filtração (490 mg). Um segundo lote de sólidos foi recolhido das águas-mães, triturado com acetato de etilo quente e filtrado para dar 4-hidroxi-3-(3-oxo-l,3-di-hidroisobenzofuran-l-il)cromen-2-ona na forma de um sólido branco.

Exemplo 3 de Informação - Preparação do éster clorometilico do ácido 2-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico

A uma solução de 4-hidroxi-3-(3-oxo-l,3-di-hidro-isobenzofurano-l-il)cromen-2-ona (60mg) em etanol adicionou-se Pd a 10%/C (10 mg) e a seguir agitou-se sob um balão de hidrogénio durante 12 horas. A mistura reaccional foi filtrada através de um almofada de celite e o filtrado foi concentrado sob vácuo para dar o ácido 2-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico na forma de um sólido branco (50 mg) . MS: 295 [M-H] . 23 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Uma solução de ácido 2-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico numa solução de bicarbonato de sódio a 5% foi adicionada a uma solução 1,5 equivalentes de clorometilclorossulfato em cloreto de metileno. Adicionou-se hidrogenossulfato de tetrabutilamónio (quantidade catalítica) e a mistura foi agitada vigorosamente durante 5 horas. A camada orgânica foi seca em MgS04 e concentrada sob vácuo para dar o éster clorometílico do ácido 2-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-ilmetil)benzóico na forma de um sólido branco.

Exemplo 4 - Preparação de 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo

Etapa 1: Preparação de 4-formilbenzoato de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo.

Uma mistura de 41,1 g (274 mmoles) de 4-carboxibenzaldeído, 50 g (274 mmoles) de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metil-2-propanol, e 33,4 g (274 mmoles) de DMAP em 700 mL de DCM foi agitada até à homogeneidade (aproximadamente 0,5 h) . A solução foi arrefecida num banho de gelo sob uma atmosfera de Ar, e a seguir adicionou-se 52,3 g (274 mmoles) de EDCI às porções. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 48 h e concentrada na forma de óleo num Rotovap. Adicionou-se EA ao óleo, e a seguir lavou-se com água, duas vezes com ácido cítrico diluído, duas vezes com bicarbonato de sódio diluído, e salmoura. A camada orgânica foi seca em sulfato de sódio e concentrada para dar 25,5 g de um sólido amarelo claro. 24 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Etapa 2: Preparação do composto de título

Uma mistura de 22 g (70 mmoles) do benzaldeido, 11,3 g (70 mmoles) de 4-hidroxicumarina, e 70 mL de TEA/ácido fórmico 1,2:1 (v/v) foi aquecida a 140°C sob uma atmosfera de azoto durante 2 horas. (3 horas teria sido melhor). O progresso da reacção foi monitorizado por CCF usando (HOAc a 1%/EA)/Hexano 1:1. A mistura foi deixada arrefecer por um curto período de tempo, tratada com 50 mL de THF (para inibir a cristalização) e vertida em 500 mL de EA. A camada de EA foi lavada 3 vezes com água, uma vez com salmoura e seca em sulfato de sódio. Filtração e concentração resultaram num sólido branco recristalizável em EA ou acetona.

Se desejado, o composto do título pode ser convertido num sal farmaceuticamente aceitável, tal como sal de sódio.

Exemplo 5 - Preparação de 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3- il)metil) benzoato de 3,3,4,4,4-pentafluorobutan-2-ilo

Etapa 1: Preparação de 4-formilbenzoato de 3,3,4,4,4-pentafluorobutan-2-ilo (3)

Uma mistura de 4-carboxibenzaldeído (21,9 g, 145,9 mmoles), 3, 3, 4, 4, 4-pentafluoro-2-butanol (24,1 g, 146,9 mmoles), EDC (33,5 g, 174,8 mmoles) e DMAP (18,1 g, 148,1 mmoles) foi dissolvida em dmf (60 ml) à temperatura ambiente 25

ΕΡ 1 735 296/PT e agitada durante 36 h a esta temperatura. Adicionou-se hexano e lavou-se com HC1 IN, NaHC03 saturado e salmoura. As camadas aquosas foram extraidas três vezes com hexano. Secou-se em Na2S04, filtrou-se, concentrou-se e o residuo foi purificado por cromatografia em silica-gel (acetato de etilorhexano 1:10) para produzir o aldeido desejado na forma de um óleo amarelo (67%).

Etapa 2: Preparação do composto de titulo

Ácido fórmico (35,8 ml) foi adicionado a 4-hidroxi-cumarina (15,8 g, 97,5 mmoles) e aldeido 3 (28,9 g, 97,6 mmoles). Trietilamina (43 ml) foi adicionada (exotérmica) a 0°C. Aqueceu-se a 140°C e agitou-se durante 4 horas a esta temperatura. A solução amarela foi arrefecida até à temperatura ambiente e acetato de etilo foi adicionado. Lavou-se com HC1 IN e salmoura, secou-se em Na2S04 e removeu-se o solvente. O sólido ligeiramente amarelo foi recristalizado em acetato de etilo para dar o composto título na forma de um sólido branco com uma pureza de 98% (rendimento de 60%). O sal de sódio foi feito da seguinte forma: o ácido livre (21,39 g, 48,35 mmoles) e NaHC03 (4,06 g, 48,30 mmoles) foram dissolvidos em acetonitrilo (400 ml) e água (100 ml) e subsequente liofilização resultou no sal de sódio na forma de um sólido branco.

Exemplo 6 - Preparação de 2-(6-metoxinaftaleno-2-il)propanoato de (S)-((R)-3,3,4,4,4-pentafluorobutan-2-ilo)

Etapa 1: Preparação de 2-(6-metoxinaftalen-2-il)-propanoato de (2S)-3,3,4, 4, 4-pentafluorobutan-2-ilo (mistura de diastereómeros) (6) 26 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Uma mistura de (S)-naproxeno (9,23 g, 40,1 mmoles), 3,3,4,4,4-pentafluoro-2-butanol racémico (6,58 g, 40,1 mmoles), EDC (9,20 g, 48,0 mmoles) e DMAP (4,89 g, 40,0 mmoles) foi dissolvida em CH2C12 (40 mL) à temperatura ambiente. Após agitação durante 8 h a esta temperatura, a mistura foi diluida com CH2C12 e foi lavada sucessivamente com HC1 IN, NaHCC>3 saturado e salmoura. Após secagem em Na2SC>4 e concentração, obteve-se uma mistura de ésteres diastereoméricos de naproxeno na forma de um sólido branco.

Passo 2: Pequenas quantidades dos diastereoisómeros foram separadas por HPLC de fase inversa (coluna C18 com CH3CN 50% a 70%/água).

Éster (S,S)-naproxeno (único diastereoisómero) RMN (CDC13, 400 MHz ) δ 7,70 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 7,65 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,37 (dd J = 1,8, 8,6 Hz, 1H) , 7,15 (dd, J = 2,8, 8,8 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 5,35-5,42 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,90 (q, J= 7,2 Hz, 1H), 1,60 (d, J= 7,2

Hz, 3H), 1,39 (d, J= 6,0 Hz, 3H) ; 19F RMN (CDC13, 376 MHz) δ -82,0 (S, 3F), -122,7 (dd, J = 7, 0, 278,2 Hz, 1F), -128,6 (dd, J = 16,0, 278,9 Hz, 1F).

Éster (S,R)-naproxeno (único diastereoisómero) 1E RMN (CDCI3, 400 MHz) δ 7,71 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,66 (d, J= 1,2

Hz, 1H), 7,38 (dd, J = 1,8, 8,6 Hz, 1H) , 7,15 (dd, J = 2,4, 8,8 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 2,4 Hz, 1H) , 5,39-5,47 (m, 1H), 3,92 (s, 3H) , 3,90 (q, J= 7,2 Hz, 1H), 1,59 (d, J= 7,2 Hz, 3H), 1,27 (d, J = 6,4 Hz, 3H) ; 19F RMN (CDC13, 376 MHz) δ - 82,0 (s, 3F), -122,7 (dd, J = Hz 7,0, 278,2, 1F), -128,6 (dd, J = 16,0, 279, 1 Hz, 1F) . 27 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Passo 3: Ο agente de resolução Naproxeno foi removido hidroliticamente. 27 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

6 S 7 (S,S-diastereoisómero) (S-isómero opticamente enriquecido) 0 éster (S,S)-Naproxeno (3,83 g, 10,18 mmoles) da etapa 2 foi tratado com KOH IN (19 ml) e THF (19,5 ml) à temperatura ambiente. A emulsão foi agitada à temperatura ambiente e, após 3 h, tornou-se uma solução clara. Após mais 1 h de agitação adicionou-se CH2C12 (50 mL) e a solução foi lavada com NaHC03 saturado (quatro vezes), seca em Na2S04 e filtrada para dar uma solução do isómero S do álcool. A solução foi usada directamente na etapa seguinte sem purificação.

Etapa 4: O éster é formado.

8 (S-isómero) 9 (S-isómero) A uma solução do isómero S do álcool da etapa 3) adicionou-se 4-carboxibenzaldeido (3,35 g, 22,3 mmoles), EDC (5,14 g, 26,8 mmoles) e DMAP (2,70 g, 22,1 mmoles). A mistura reaccional foi agitada durante 16 h à temperatura ambiente. Adicionou-se acetato de etilo e a camada orgânica foi lavada sucessivamente com NaHC03 saturado (aq) e salmoura. Após secagem em Na2S04, filtração e concentração, o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica-gel (acetato de etilo: hexano 1:10) para dar o éster 2,2,3,3,3-pentafluoro-l-metil-propílico do ácido (S)-4-formilbenzóico na forma de um óleo amarelo (82%). 28

ΕΡ 1 735 296/PT

Etapa 5: Acoplamento final - preparação de 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de (S)-3,3, 4, 4, 4-pentafluorobutan-2-4-ilo

4 9 (S-isómero)

Dissolveu-se 4-hidroxicumarina (1,367 g, 8,44 mmoles) e o éster 2,2,3,3,3-pentafluoro-l-metilpropilico do ácido (S)-4-formilbenzóico (2,505 g, 8,46 mmoles) em ácido fórmico (3,0 mL) e Et3N (3,6 mL) a 0°C. Após agitação a 140°C durante 4 h, a solução amarela foi arrefecida até à temperatura ambiente, acetato de etilo foi adicionado, e a camada orgânica foi lavada sucessivamente com HC1 IN e salmoura. Após secagem em Na2S04 e concentração, o sólido amarelo foi purificado duas vezes por cromatografia em sílica-gel (DCMrMeOH 100:6 e DCM:MeOH 100:5) para dar o composto em 92,5% como determinado por HPLC quiral. O sal de sódio foi produzido da seguinte forma: O ácido livre (1,60 g, 3,62 mmoles) e NaHC03 (303 mg, 3,62 mmoles) foram dissolvidos em acetonitrilo (25 mL) e água (5 mL), seguido de liofilização para dar o desejado sal de Na na forma de um sólido branco. MS m/e 465 (MNa+), 441 (MH); XH RMN (DMSO-de) δ 7, 76-7, 80 (m, 3H), 7,43 (d, J= 8,3 Hz, 2H) , 7,31 (dt, 1H), 7,02-7,08 (m, 2H), 5,71-5,79 (m, 1H), 3,70 (s, 2H), 1,48 (d, J= 6,9 Hz, 3H); 19F RMN (DMSO-d6) δ -81,3 (s, 3F), -121,2 (dd, J = 7,0, 276, 7 Hz, 1F), -128,2 (d, J = 17, 1, 276,7

Hz, 1F) .

Exemplo 7 - Preparação de 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3- il)metil) benzoato de (R)-3,3,4,4,4-pentafluorobutan-2-4-ilo

Através de métodos e procedimentos essencialmente análogos aos do Exemplo 6, o diastereoisómero (S,R) do Exemplo 6, etapa 2, foi hidrolisado para dar o desejado (R)- 29

ΕΡ 1 735 296/PT isómero do álcool, que foi então acoplado a 4- carboxibenzaldeído para dar 4-formilbenzoato de (R)- 3,3,4,4,4-pentafluorobutan-2-ilo, que foi então acoplado a 4-hidroxicumarina para dar o composto do título. O sal de sódio foi feito da seguinte forma: dissolveu-se o ácido livre (1,605 g, 3,63 mmoles) e NaHC03 (303 mg, 3,62 mmoles) em acetonitrilo (20 mL), água (5 mL), seguido de liofilização para dar o sal de sódio na forma de um sólido branco. MS m/e 465 (MNa+), 441 (MH); XH RMN (DMSO-d6) δ 7,81 (dd, (J = 1,1, 7,9 Hz, 1H), 7, 77-7, 80 (m, 2H) , 7,43 D, J = 8,3 Hz, 2H), 7,32-7,36 (m, 1H), 7,05-7,11 (m, 2H), 5,71-5,80 (m, 1H), 3,72 (s, 2H) , 1,49 (d, J = 6,1 Hz, 3H) ; 19F RMN (DMSO-ds) δ -81,3 (s, 3F), -121,2 (dd, J = 6,0, 265, 6 Hz, 1F), -128,2 (dd, J= 16,2, 265,8 Hz, 1F).

Exemplo 8

Os seguintes compostos foram preparados essencialmente de acordo com os métodos e esquemas aqui descritos. Os compostos que não se encontram dentro do âmbito das reivindicações são dados para fins de informação.

Nome ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanó ico 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato de metilo 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato de etilo 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanamida 3-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato de 2-hidroxietilo 3-(4-hidroxi-2-oxo-2íí-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato 2,2,3,3,3-pentafluoropropilo de 3-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato 3,3,3-trifluoropropilo de 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato 2-fenilsulfoniletilo de 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato 2-(metilsulfonil)etilo de 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato 2 - ( 4-fluorofenil)etilo de 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato 1,1-dimetiletilo de 2,2,2-trifluoro- 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato 1-feniletilo de 2,2,2-trifluoro- ácido 2-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzóico ácido {4—[(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il) metil ]fenil}acético

30 ΕΡ 1 735 296/PT ácido 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenil)metilacético (2-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de metilo ácido 3-(2-[(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]fenilpropanóico 3 —(2 —[(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]fenil)propanoato de etilo ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-(4-metoxifenil)propanóico 3-[3-etoxi-l-(4-metoxifenil)-3-oxopropil]-2-oxo-2fí-cromen-4-olato de sódio ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)butanóico 3- (4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)butanoato de etilo ácido 4-[3-etoxi-l-( 4-hidrox i-2-oxo-2.fi-cr omen-3-il) -3-oxopropil] benzóico 4- [3-etoxi-l-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-oxopropil]benzoato de etilo ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)hexanóico 3-(4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)hexanoato de etilo ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)-5-metil-hexanóico 3-(4-hidroxi-2-oxo-2íí-cromen-3-il)-5-metil-hexanoato de etilo ácido 3-(4-clorofenil)-3-(4-hidroxi-2-oxo-2íí-cromen-3-il)propanóico ácido 3-(3,4-diclorofenil)-3-(4-hidroxi-2-oxo-2ff-cromen-3-il)propanóico ácido 3-(2,3-di-hidro-l, 4-benzodioxin-6-il)-3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3 — i1)propanóico 3-(2,3-di-hidro-l,4-benzodioxin-6-il)-3-(4-hidroxi-2-oxo-2ff-cromen-3-il)propanoato de etilo ácido 4-[bis(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]benzóico ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)propanóico 3-(4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)propanoato de etilo 3- (4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)propanoato de ciclo-hexilo 4- [bis(4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)metil]benzoato de metilo ácido 5-[(4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)metil]-2-metoxibenzóico 5- [(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]-2-metoxibenzoato de metilo ácido 5-[(4-hidroxi-2-oxo-2if-cromen-3-il)metil]-2-isopropoxibenzóico 5-[(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]-2-isopropoxibenzoato de metilo 5-[(4-hidroxi-2-oxo-2Jí-cromen-3-il)metil]-2-isopropoxibenzoato de isopropilo 2-{4-[(4-hidroxi-2-oxo-2íí-cromen-3-il)metil]fenoxi}-2-metilpropanoato de etilo f\7— { 4 — [ (4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]benzoil]-L-valinato de metilo Λ7— {4 —[(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]benzoilJglicinato de metilo N-{4-[(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]benzoil}-W-metilglicinato de metilo ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-[4-(trifluorometoxi)fenil]-propanóico

3-(6 —fluoro-4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-fenilpropanoato de etilo 31 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ Ν-[3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-(4-metoxifenil)propanoíl]glici-nato de metilo ácido {4—[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenoxi}acético {4—[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenoxi}acetato de metilo 2-[bis(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de etilo

4-[(6-fluoro-4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de etilo ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-(1-naftil)propanóico 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-(1-naftil)propanoato de metilo ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)-3-(2-naftil)propanóico 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-(2-naftil)propanoato de metilo ácido 3-{4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenil}propanóico 3— {4—[(4-hidroxi-2-oxo-2íí-cromen-3-il)metil]fenilJpropanoato de metilo 4- hidroxi-3-(4-hidroxibenzil)-2H-cromen-3-ona propionato de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenilo pivalato de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenilo benzoato de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenilo 2,6-dimetilbenzoato de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2ií-cromen-3-il)metil]fenilo 2- metilbenzoato de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]fenilo ácido 6-[(4-hidroxi-2-oxo-2ií-cromen-3-il)metil]-2-naftóico 6-[(4-hidroxi-2-oxo-2ií-cromen-3-il)metil]-2-naftoato de metilo 3- (benzilamino)4-hidroxi-2H-cromen-3-ona ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-[4-(trifluorometoxi)fenil]-propanóico 4- hidroxi-3-(3-oxo-l,3-di-hidro-2-benzofuran-l-il)-2H-cromen-2-ona 3- benzil-4-hidroxi-2H-cromen-3-ona 4- hidroxi-3-(3-hidroxi-l-fenilpropil)-2H-cromen-2-ona ácido 3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-3-[4-(trifluorometoxi)fenil]-propanóico ácido (3Ξ)—3—(3,4-diclorofenil)-3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-propanóico ácido (3R)-3-(3,4-diclorofenil)-3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-propanóico ácido 2-benzil-3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)propanóico 2- benzil-3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)propanoato de etilo ácido 3-ciclo-hexil-3-(4-hidroxi-2-oxo-2ii-cromen-3-il)propanóico 3- ciclo-hexil-3-(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)propanoato de etilo 2-(4-hidroxi-2-oxo-2i3-cromen-3-il)butanoato de etilo (4-hidroxi-2-oxo-2íí-cromen-3-il)(fenil)acetato de etilo ácido 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzóico 4- [(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de metilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de etilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de butilo 32

ΕΡ 1 735 296/PT 3-{4-[(2-hidroxietoxi)carbonil]benzil}-2- -oxo-2H-cromen-4-olato de sódio 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il)metil]benzoato de isopropilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2i7-cromen-3-il)metil]benzoato de 2,2-dimetilpropilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil benzoato de 2-metoxietilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil etilo benzoato de 2-pirrolidin-l-il- 4-[(4-hidr oxi-2-oxo-2 fí-cromen-3-il)metil 2,2,3,3,3-pentafluoropropilo benzoato de 4-[(4-hidr oxi-2-oxo-2 fí-cromen-3-il)metil 2-(metilsulfonilo)etilo benzoato de 4- [ ( 4-hidroxi-2-oxo-2fí-cromen-3-il) metil 3,3,3-trifluoropropilo benzoato de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil 2,2,3,3,3-pentafluoro-l-metilpropilo benzoato de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil benzoato de 4-fluorobenzilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil etilo benzoato de 2- (4-fluorofenoxi)- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato etilo de 2-(fenilsulfonil)- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de ciclopropilmetilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato (fluorometil)etilo de 2-fluoro-1- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil metiletilo benzoato de 2,2,2-trifluoro-1- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil (trifluorometil)etilo benzoato de 2,2,2-trifluoro-1- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil benzoato de fenilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil benzoato de 2,3-dimetilfenilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil benzoato de 2-metilfenilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil metil-1-(trifluorometil)etilo benzoato de 2,2,2-trifluoro-1- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil benzoato de 2,6-dimetilfenilo 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil etilo benzoato de 2-(fenilsulfinil)- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2ií-cromen-3-il)metil]benzoato 4-fluoro-2-metilfenilo de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato 2,2,3,3,3-pentafluoro-l-metilpropilo de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato 2,2,3,3,3-pentafluoro-l-metilpropilo de 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil trifluoro-l-hidroxietilo benzoato de (IS)-2,2, 2- 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil trifluoro-l-hidroxietilo benzoato de (1R)~2,2,2- 4-hidroxi-3-(3-oxo-l-fenilbutil)-2fl-cromen-2-ona 33 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Exemplo 9 - Efeitos dos compostos na actividade da vitamina K epóxido-redutase

Testou-se o efeito de compostos da presente invenção na vitamina K epóxido-redutase.

Resumidamente: concentrações crescentes dos compostos foram incubadas na presença de epóxido da vitamina K e na presença de uma preparação microssomal bovina contendo vitamina K epóxido-redutase. A quantidade de epóxido da vitamina K residual no final do período de incubação era directamente proporcional à actividade inibitória dos compostos de teste sobre a enzima.

Os testes foram realizados como se segue:

Prepararam-se microssomas a partir de fígado de vaca fresco de acordo com o método descrito em: "Purification of gamma-glutamyl carboxylase from bovine liver. Wu SM, Mutucumarana VP, and Stafford DW. Methods in Enzymology (1997) 282:346-57."

Para as diluições em série dos compostos de teste utilizou-se o seguinte procedimento: dissolver os compostos de teste até uma diluição final de 10 mM em água ou, no caso de não serem solúveis em água, em DMSO. Desta solução-mãe, preparar mais 2 diluições por diluição com água: uma solução 200 μΜ e uma solução 5 mM. Preparar uma série de tubos da seguinte forma:

Tabela 1

Tubo Substrato Água (pL) 1 30 pL de solução 200 μΜ 0 2 20 pL de solução 200 μΜ 10 3 10 pL de solução 200 μΜ 20 4 45 pL de solução 5 μΜ - 5 30 6 30 7 30 8 30 9 30 34 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Retirar 15 pL do tubo 4 e adicionar ao tubo 5, submeter a vórtice, a seguir retirar 15 pL do tubo 5 e adicionar ao tubo 6, submeter a vórtice, etc... até se ter adicionado 15 pL ao tubo 9. Submeter a vórtice e retirar 15 pL do tubo 9.

Preparar um outro conjunto de 4 tubos e adicionar 30 pL de água.

Preparou-se uma mistura reaccional consistindo de 600 pL de tampão (NaCl 2,5 M, MOPS 0,125 M, pH 7,5), 520 pL de água, e 150 pL de CHAPS a 10%. Os tubos foram mantidos em gelo durante 5 minutos e a seguir adicionou-se 500 pL da preparação microssomal. A mistura foi agitada por vórtice e mantida em gelo durante 10 min para se obter solubilização suficiente. Acrescentou-se 150 pL de solução de epóxido de vitamina K (1,5 mg/ml de isopropanol), submeteu-se a vórtice novamente e manteve-se no gelo durante 5 minutos. Uma aliquota (70 pL) da mistura reaccional foi adicionada a cada um da série de tubos preparados atrás contendo diluições em série de compostos de teste em 30 pL de água. Os tubos foram então agitados por vórtice e deixados em gelo durante 5 min. A 2 dos tubos contendo água adicionou-se 500 pL de um reagente de paragem consistindo de 5 volumes de AgN03 50 mM e 5 volumes de isopropanol. Estes 2 tubos foram usados para medir o valor zero.

Os tubos foram colocados num misturador 30C durante 3 min e a seguir adicionou-se 5 pL de solução DTT 100 mM em água. Os tubos foram submetidos a vórtice e mantidos no escuro, sem agitação, durante mais 20 minutos, ao fim dos quais se adicionou 500 pL do reagente de paragem. A cada tubo adicionou-se então 600 pL de uma solução de vitamina E a 100 pg/ml em hexano, os tubos foram tapados e submetidos a vórtice durante 1 minuto. Os tubos foram então centrifugados durante 5 min a 5 000 g e a camada superior (camada de hexano) foi transferida para uma nova série de tubos. O hexano foi evaporado à temperatura ambiente no escuro por meio de um SpeedVac, e o sedimento resultante foi ressuspenso em 100 pL de metanol. 35

ΕΡ 1 735 296/PT A quantidade de epóxido de vitamina K das amostras foi determinada por um método de HPLC. 0 epóxido de vitamina K residual foi então representado graficamente em função da concentração do composto de teste. Os resultados apresentam-se nas Figuras 1-9.

Exemplo 10 - Metabolismo em microssomas humanos combinados

Uma combinação de microssomas de fígado humano foi utilizada como modelo in vitro do metabolismo de fármacos. Estes microssomas continham tanto esterase como enzimas do metabolismo de fármacos mediado pelo CYP450. Os microssomas humanos combinados foram suspensos em tampão Tris (50 mM, pH 7,4) a uma concentração final de 1 mg/ml de proteína microssomal. Os compostos de teste dissolvidos em acetonitrilo:DMSO (1:99) foram adicionados a uma concentração final de 2 μΜ. Realizaram-se incubações a 37°C e recolheram-se amostras (50 pL) após 5, 15, 30, 60 e 90 minutos. As amostras foram precipitadas pela adição de 100 pL de acetonitrilo contendo Internai Standard, e centrifugadas a 14 000 rpm por 15 min a 4°C. As amostras foram analisadas por LC-MS/MS quanto ao teor do medicamento original.

Para determinar o papel do CYP450 no metabolismo, levaram-se a cabo incubações com e sem um sistema de regeneração de NADPH - NADPH é um co-factor obrigatório para as enzimas do CYP450. As incubações que incluem o co-factor NADPH representam o metabolismo total mediado por CYP450 + esterase. As incubações sem o co-factor NADPH representam o metabolismo mediado apenas pela esterase. Assim, quando se observa um decréscimo relativo do fármaco original maior na presença de NADPH, o metabolismo é mediado pelo CYP450. Quando o decréscimo relativo é equivalente na presença e ausência do co-factor, o metabolismo é mediado pela esterase.

Um grupo adicional de incubações foi levado a cabo como controlo: as incubações não continham microssomas e serviam para estabelecer a estabilidade do composto no sistema de teste. Todos os compostos eram estáveis. 36 ΕΡ 1 735 296/ΡΤ

Os compostos de teste tinham a fórmula geral:

em que R representa um grupo capaz de formar uma porção éster. Testaram-se estruturas semelhantes em que a única diferença era a presença ou ausência de um átomo de halogéneo no grupo éster. Os resultados estão apresentados nas Figuras 12-14.

Da mesma forma, foram testados compostos nos quais R era CH3, CH2-CH3, (CH2)3CH3, CH2-CH2-OH, CH2-C(CH3)3, ch2-ch2-o-ch3, 1-pirrolidiniletilo, CH2-CH2-S02-CH3, benzilo, CH2-CH2-0-fenilo, CH2-CH2-S02-fenilo, CH2-ciclopropilo, fenilo, fenilo substituído. Em todos os casos, CYP450 era o único agente metabólico, ou, se esterases estavam presentes, CYP450 era a via principal. Testaram-se também outros ésteres halogenados, tais como compostos nos quais R era CH(CH2F)2, C (CH3) (CF3) 2, ciclo-hexilo polifluorado. Em todos os casos, o metabolismo era mediado principalmente pela esterase.

Num grupo separado de incubações testaram-se os efeitos da paraoxona, um conhecido inibidor da esterase, a fim de confirmar que 0 metabolismo observado era mediado pela esterase. A paraoxona, a uma concentração final de 320 pg/mL, efectivamente inibiu o metabolismo dos ésteres halogenados tal como se mostra na Figura 15, confirmando que a esterase era a enzima principal envolvida no metabolismo dos compostos halogenados. A seguir apresentam-se mais resultados obtidos essencialmente através do protocolo de testes atrás descrito. 37

ΕΡ 1 735 296/PT

Estabilidade de vários compostos (a uma concentração final de 2 μΜ), em microssomas humanos combinados CYP + Esterase Esterase Tampão Estrutura VKER ic50 (μΜ) % Estabilidade aos 90 min (Est t44) % Estabilidade aos 90 min (Est t44) % Estabilidade aos 90 min (Est t44) |í^yC02H 0 >30,00 101% (>90 min) ND 99% (>90 min) OXO1^· 0 Racémico 3,38 69%** (>90 min) 70%** (>90 min) 108%** (>90 min) GÇOCy^; 0 F f F F 5,07 91%** (>90 min) 96%** (>90 min) 92%** (>90 min) CXXXJ f . OH Isómero S 4, 02 70% (>90 min) 86% (>90 min) 123% (>90 min) 0X0Vx· OH Isómero R 4,15 24% («30 min) 27% («30 min) 113% (>90 min) Warfarina 3,0+0,8* * média de 3 testes levados a cabo em 3 dias diferentes

Os resultados indicam que a incorporação de uma ligação éster torna possível a mudança de metabolismo de degradação mediada por CYP para vias mediadas pela carboxilesterase.

Exemplo 11 - Estudo de Células HEK-293

Obtiveram-se registos electrofisiológicos do lKr em células HEK-293 transfectadas estavelmente na configuração célula inteira da técnica de patch-clamp (Hamill et al.r 1981) utilizando um amplificador Axopatch 200B (Axon Instruments, Foster City, CA). Os microeléctrodos foram 38

ΕΡ 1 735 296/PT obtidos a partir de um tubo de vidro de borossilicato de 1,5 mm usando um dispositivo de fabrico de micropipetas (pipette puller) vertical de dois estágios (Narishige, East Meadow, NY). Os microeléctrodos, cheios com a solução de registo, apresentavam uma resistência de 3-5 ΜΩ. As células HEK-293 foram plaqueadas em placas de plástico para cultura de células e tecidos durante 2-3 dias. Para a aplicação das soluções contendo o fármaco nas células, utilizou-se o sistema SF-77B (Warner Instrument Corp, Hamden, CT). As trocas de solução foram concluídas em 20 ms. Os dados de corrente foram digitalizados em linha usando uma placa conversora analógico-digital DigiData 1200A (Axon Instruments) e armazenados no disco rigido de um computador Pentium IBM compatível (GP7-600 MHz, Gateway Computer, Sioux City, ND) . Os protocolos experimentais de voltage-clamp e a análise de dados não em linha foram realizados utilizando o programa de software pCLAMP7 (Axon Instruments). Os testes foram realizados à temperatura ambiente (22-23°C). A composição da solução extracelular de controlo está descrita na tabela seguinte. O seu pH foi ajustado a 7,4 com

NaOH. A composição da solução de enchimento dos microeléctrodos está descrita na tabela seguinte e o seu pH foi ajustado a 7,4 com KOH.

Registos electrofisiológicos do IKr Fonte Células HEK-293 de mamífero que expressam o gene hERG Potencial -80 mV Despolarização +10 mV durante 20 s Polarização -50 mM durante 5 s Temperatura de incubação 22-23°C Solução extracelular NaCl 140 mM, KC1 4 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfónico (HEPES) 10 mM e glicose 11 mM Tampão dos eléctrodos Gluconato de potássio 135 mM, MgCl2 1 mM, ácido etilenoglicoltetra-acético (EGTA) 5 mM, HEPES 10 mM, MgATP 5 mM

Os efeitos no iKr da warfarina, do 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de 2,2,2-trifluoro-l-metil-1-(trifluorometil)etilo e do seu metabolito ácido 39

ΕΡ 1 735 296/PT correspondente, o ácido 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)-metil]benzóico, foram avaliados por meio de um protocolo de dois impulsos na linha celular HEK-293 transfectada estavelmente. As células foram mantidas a um potencial de -80 mV, despolarizadas para +10 mV por um período de 20 s para activar o lKr, e repolarizadas para -50 mV durante 5 segundos a fim de provocar uma corrente de cauda de desactivação de saída (corrente de cauda do IKr) · O protocolo de dois impulsos foi aplicado a cada 45 s. A amplitude da corrente de cauda do IKr foi medida como a diferença entre a corrente de pico e a corrente de base a -50 mV do controlo e na presença de compostos ATI quando se atingiu bloqueio em estado estacionário. O estudo mostrou que o 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzoato de 2,2,2-trifluoro-l-metil-1-(trifluoro-metil)etilo e o seu metabolito ácido correspondente, o ácido 4-[(4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil]benzóico, não tiveram um efeito inibitório no lKr humano (IC50>100 e >1000 m, respectivamente). Nem nenhum dos compostos exibiu actividade significativa num teste alargado de rastreio de receptores celulares e bioquímicos com concentrações até 10 μΜ.

As modificações dos compostos aqui divulgados podem ser facilmente levadas a cabo pelos peritos na especialidade. Assim, análogos, derivados, enantiómeros e sais dos compostos exemplificados estão dentro do âmbito de aplicação da presente invenção. Conhecendo os compostos da presente invenção e as suas estruturas, os químicos especializados podem usar procedimentos conhecidos para sintetizar estes compostos a partir de substratos disponíveis.

Subentende-se que as concretizações e os exemplos descritos neste documento são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz daqueles serão sugeridas pelos peritos na especialidade e terão de ser consideradas dentro do âmbito e alcance do presente pedido.

Tanto a invenção como a maneira e processo para a sua realização e utilização serão agora descritos em termos completos, claros, concisos e exactos a fim de permitir que qualquer perito na especialidade relevante realize e utilize 40

ΕΡ 1 735 296/PT os mesmos. Subentende-se que o precedente descreve as concretizações preferidas da invenção e que modificações podem ser feitas sem fugir ao âmbito da invenção tal como apresentado nas reivindicações. De forma a destacar particularmente e a reivindicar distintamente a presente matéria considerada como invenção, as reivindicações que se seguem concluem este fascículo.

Lisboa, 2010-02-02

Claims (9)

1. ΕΡ 1 735 296/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composto da fórmula:

   e seus sais R é alquilo R é alquilo R é alquilo R é alquilo farmaceuticamente aceitáveis, em que Ci-Cg substituído com pelo menos um halogéneo; C2-C8 substituído com pelo menos um halogéneo; C3-C7 substituído com pelo menos um halogéneo; C3-C6 substituído com pelo menos um halogéneo;
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R é alquilo C3-C6 substituído com pelo menos um grupo flúor; R é alquilo C3-C6 substituído com pelo menos dois grupos flúor; R é um grupo tert-butilo substituído com seis grupos flúor; ou R é .CF, -CH, CF,
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R é alquilo Ci-Cs substituído com pelo menos um grupo cloro; R é alquilo C2-C8 substituído com pelo menos um grupo cloro; R é alquilo C3-C7 substituído com pelo menos um grupo cloro; ou R é alquilo C3-Cê substituído com pelo menos um grupo cloro;
4. 4. Compostos ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, que são 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de (R)-3,3,4,4,4-pentafluorobutan-2-ilo; ou 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de (S)-3,3, 4, 4, 4-pentafluoro- butan-2-ilo. ΕΡ 1 735 296/PT 2/2
5. 5. Composto da fórmula:
6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1 que é: 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de 1.1.1.3.3.3- hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis; 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de 1.1.1.3.3.3- hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo; ou o sal de sódio ou potássio de 4-((4-hidroxi-2-oxo-2H-cromen-3-il)metil)benzoato de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-metilpropan-2-ilo.
7. 7. Composição que compreende um composto ou sal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou reivindicação 6 e pelo menos um deslizante, solvente, adjuvante, diluente, lubrificante, excipiente farmaceuticamente aceitáveis ou uma sua combinação.
8. 8. Composição ou sal farmaceuticamente aceitável de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou reivindicações 6 ou 7 para utilização como medicamento.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que o medicamento é adequado para utilização no tratamento de distúrbios da coagulação ou é adequado para utilização em pacientes que estão em risco de desenvolver um distúrbio. Lisboa, 2010-02-02