PT1618904E - Implante com uma superfcie possuindo biofuncionalidade e processo para a sua produã†o - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

IMPLANTE COM UMA SUPERFÍCIE POSSUINDO BIOFUNCIONALIDADE E PROCESSO PARA A SUA PRODUÇÃO Âmbito do Invento 0 invento diz respeito a um implante com uma superfície melhorada e aos processos para a sua produção. 0 implante em conformidade com o invento pode ser utilizado no campo da medicina, em particular para contacto do osso e do tecido mole ou como prótese dentária.

Antecedentes do Invento

Os fosfatos de cálcio e em especial as apatites são componentes naturais dos ossos e dos dentes. Sabe-se que revestir implantes prostéticos com fosfatos de cálcio melhora a eficácia e a biocompatibilidade desses dispositivos, estimulando o crescimento do osso ou a fixação à estrutura óssea.

Conhece-se o fosfato de cálcio (CP) em diferentes fases, com composições e propriedades físicas e químicas distintas. As apatites como a hidroxiapatite (HAP) e a fluorapatite (FAP) são extremamente pouco solúveis em água. 0 fosfato de cálcio amorfo (ACP), a brushite e a monetite, pelo contrário, possuem solubilidades em água que são várias vezes superiores. 2

Do estado da arte conhecem-se várias abordagens para revestir superfícies de materiais de implante com fosfato de cálcio ou hidroxiapatite. A Patente internacional N°WO 02/05862 AI refere-se a camadas de compósito de fosfato de cálcio, que são depositadas electroquimicamente sobre implantes ósseos. As referidas camadas de compósito de elevada porosidade sobre os implantes são constituídas por pelo menos duas fases de fosfato de cálcio de diferente solubilidade. Para além do fosfato de cálcio pouco solúvel do osso maturo, as camadas de compósito contêm, em particular, as fases mais solúveis do tecido ósseo novo.

As Patentes N°US 5205921 e N° CA 2073781 A descrevem um processo de produção de um revestimento de fosfato cerâmico aderente sobre implantes prostéticos por electrodeposição de óxido de alumínio ou de fosfato de cálcio na forma de brushite da relativamente solúvel em água. A temperatura de processo é cerca de 65°C. A Patente N°EP1264606 AI refere-se à produção de materiais metálicos revestidos com apatite através de um processo electroquímico, usando um eléctrodo de substrato metálico, um contra-eléctrodo e um electrólito compreendendo uma solução aquosa contendo iões cálcio e iões fosfato, que compreende a realização de vários ciclos sucessivos de polarização catódica que compreendem a polarização em um ou mais estádios nas mesmas ou diferentes densidades de corrente de alta constante. O revestimento produzido contém cristais de hidroxiapatite e/ou esferas de fosfato de cálcio amorfo. 3 A Patente N° DE 19504386 C2 refere-se a um processo electroquímico para produzir um revestimento graduado de fases de fosfato de cálcio e fases de óxido metálico sobre implantes metálicos. Os eléctrodos de substrato são submetidos a polarização catódica e anódica, alternadamente. A Patente N° EP 1166804 A2 descreve um revestimento que consiste numa matriz de colagénio mineralizada com fosfato de cálcio. A Patente Internacional N° WO 03/039609 AI descreve um processo de dois estágios para deposição electroforética de um revestimento de fosfato de cálcio, tal como a hidroxiapatite, numa prótese de substituição de osso electricamente condutora. No primeiro estágio efectua-se o pré-tratamento do material por ataque electroquimico para dissolver uma fina camada superficial da superfície de substrato. A Patente N° DE 100 069 92 AI refere-se a um processo para o revestimento de um implante com fosfato de cálcio, que é solúvel no corpo. O revestimento é produzido por deposição electrolítica sobre o implante de uma solução compreendendo cálcio e fosfato em que são incorporadas no revestimento partículas de dispersão.

As partículas de dispersão para o revestimento de implantes encontram-se também descritas na Patente N° DE 101 131 08 Al.

As partículas possuem a forma de nanocápsulas ou microcápsulas ou de lipossomas, que contêm, no seu 4 interior, substâncias antibióticas e que consistem em polímeros orgânicos e fosfato de cálcio. Essas partículas permitirão a libertação controlada das substâncias antibióticas da superfície do implante.

Conhecem-se outras abordagens de dispensa de droga para permitir a libertação lenta, controlada, de substâncias da superfície do implante: A Patente Internacional N° WO 03/059407 Al, por exemplo, refere-se a um implante de titânio ou de liga de titânio com uma superfície revestida, pelo menos parcialmente, com factor de crescimento de transformação ou com uma hormona sistémica. A Patente DE 4121 043 Al descreve um material substituto de osso com uma matriz porosa, que está impregnado com um polipéptido que possui a actividade biológica de factores de crescimento de fibroblastos. A Patente N° DE 101 190 96 Al refere-se a uma superfície de substrato de poros abertos, com poros inter-comunicantes, com um teor de 15-50% de poros, compreendendo essencialmente um material inorgânico, não mineral, que consiste em fases de fosfato de cálcio de reabsorção controlável produzido, de preferência, por revestimento electroquímico, combinado com um pré-revestimento dos substratos por processos de SOL-GEL.

As moléculas de adesão e/ou de sinal ligam-se por covalência, num processo separado, a grupos âncora tais como acrilato ou oligómeros de ácido glutâmico ou ácido D, L-2-amino-5-fosfonopentanóico. 5

Os grupos âncora sofrem adsorção por interacções de fisissorção no fosfato de cálcio. A fase de fosfato de cálcio consiste principalmente em brushite e monetite, que são fases de fosfato de cálcio relativamente solúveis em água quando comparadas com a apatite. A camada de fosfato de cálcio degrada-se bastante rápido. Sete dias após a colocação do implante, a camada degradou quase completamente. Durante o processo de degradação, é libertado o péptido. Os péptidos solúveis libertados têm a desvantagem de bloquearem os receptores da superfície da célula, que são necessários para a adesão celular. A Patente N° US 6268348 BI refere-se a péptidos sintéticos que imitam a conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento das espécies de colagénio de ligação (tais como os receptores da superfície celular para o colagénio e a fibronectina) . Os péptidos podem sofrer adsorção por interacções físicas fracas por parte de partículas que consistem, em particular, de hidroxiapatite, que é isolada a partir de osso natural.

Os péptidos, que são adsorvidos pelas partículas através de interacções físicas fracas, são libertados pelas partículas após a colocação do implante no corpo.

Os péptidos solúveis libertados têm a desvantagem de bloquearem os receptores da superfície das células, que são necessários para a adesão celular.

No entanto, essas abordagens de dispensa de droga, que permitiriam a libertação controlada de substâncias pela superfície do implante têm a desvantagem de as substâncias não se ligarem de modo estável à superfície. 6 A ligação estável à superfície é, contudo, um pré-requisito para o sucesso da acção de moléculas de adesão. Frequentemente, são utilizadas proteínas como factores de crescimento que não são resistentes a processos de esterilização.

Assim, existe ainda uma necessidade de novos implantes, com superfícies bioactivas melhoradas, que evitem as desvantagens supramencionadas.

Objectivo do Invento

Um objectivo do presente invento é proporcionar um implante, em particular para contacto ósseo ou como prótese dentária, com uma superfície melhorada. Um outro objectivo do invento é proporcionar um processo para a produção do implante.

Descrição do Invento

Por um aspecto deste invento proporciona-se um implante destinado ao contacto com o osso e/ou tecido mole compreendendo uma base de material que possui , pelo menos numa parte da sua superfície, estruturas ao nível de mm até sub ym, de preferência, de 100 ym até nm, em que a superfície é electrocondutora, - possuindo pelo menos numa parte da sua superfície um revestimento compreendendo uma camada de apatite nanocristalina, em que pelo menos um péptido está parcialmente incorporado na camada de apatite nanocristalina. 7 0 implante do invento dispõe de uma superfície possuindo biofuncionalidade, que estimula a adesão de células. A adesão de células à superfície é notoriamente apoiada por: 1. a morfologia da superfície com estruturas ao nível de mm até sub ym; 2. um revestimento fino de apatite nanocristalina, que não bloqueia a morfologia; 3. a incorporação do péptido no revestimento de apatite nanocristalina. A expressão "superfície possuindo biofuncionalidade", no contexto da presente invenção, significa uma superfície com propriedades biológicas definidas, que resultam da imobilização de biomoléculas, por exemplo, péptidos ou proteínas, na superfície. 0 material de base usado para o implante, que está revestido em conformidade com o invento, pode ser qualquer material, que possua uma superfície electrocondutora. Um material preferido é o titânio ou uma liga de titânio. 0 material de base possui, pelo menos numa parte da sua superfície, de preferência na área de contacto com o osso, estruturas ao nível de sub mm até sub ym, de preferência, de 100 ym até nm.

As estruturas formam uma morfologia relativamente complexa e aumentam a rugosidade da superfície do implante que está acessível às células. Esta morfologia melhora, por si só, a adesão celular e reforça o contacto com o osso.

As estruturas ao nível de mm até sub ym são preferencialmente criadas por jacto de corindo, pulverização catódica (sputting) de pó de metal fundido na superfície, técnicas assistidas por laser, técnicas assistidas por plasma, ataque químico ou uma combinação destas técnicas.

Num modo de realização preferido, o material de base é em primeiro luqar tratado para produzir estruturas ao nível de sub mm, de preferência, por jacto de corindo ou por aplicação de impulsos de laser à superfície.

Em alternativa, as estruturas ao nível de sub ym até mm são produzidas por pulverização catódica de pó de metal fundido na superfície.

Num segundo passo, as estruturas ao nível de ym até nm são produzidas, de preferência, por ataque químico, de preferência ataque químico com ácido. A superfície para contacto com tecidos moles, no entanto, pode ser relativamente lisa tal como metal trabalhado ou torneado. A camada de apatite nanocristalina nesta superfície com estruturas ao nível de sub ym até mm é homogénea e relativamente fina, com uma espessura preferida inferior a 5 ym, sendo a mais preferida inferior a 1 ym. Este revestimento fino não mascara as estruturas. A camada consiste principalmente em hidroxiapatite ou hidroxiapatite e fluorapatite, de preferência formada por um revestimento, consistindo em agulhas muito finas que 9 possuem um comprimento de cerca de 200 nm a 500 nm e um diâmetro de cerca de 20 a 40 nm. Em vez de mascarar a morfologia deste material de base, as agulhas adicionam mesmo outras microestruturas ao nível de sub ym. A camada de apatite nanocristalina é pouco solúvel em água (produto de solubilidade de cerca de 5,35 x 10"118 (mol/1)18) e permanece ligada de forma estável ao implante após a colocação do mesmo no corpo. A incorporação do péptido na camada de apatite nanocristalina é conseguida por co-deposição dos péptidos com a apatite, assistida electroquimicamente, sobre a superfície do implante. A co-deposição assistida electroquimicamente é realizada na forma de polarização catódica durante a qual se constrói uma camada crescente de apatite nanocristalina e o péptido é incorporado na camada crescente de apatite.

Através desta incorporação na camada, o péptido liga-se de modo estável à superfície, por interacções que são muito mais fortes do que a adsorção por interacções físicas. Surpreendentemente, não são necessários quaisquer grupos âncora no péptido para conseguir esta incorporação. O péptido promove vantajosamente a adesão celular de células específicas à superfície do implante. Para promover a adesão celular o péptido é seleccionado de uma família de péptidos sintéticos que imitam moléculas que possuem uma conformação necessária para o reconhecimento e o acoplamento de moléculas da superfície celular, que se encontram na superfície de células. Num modo de 10 realização preferido, o péptido liga-se a um membro da familia da integrina de receptores da superficie celular.

Surpreendentemente, durante o processo de polarização catódica, o péptido é integrado apenas parcialmente na camada de apatite cristalina, deixando acessíveis às células os resíduos do péptido que são importantes para o reconhecimento de moléculas na superfície celular.

Experiências com células mostram que o péptido ligado de modo estável aumenta grandemente a acção estimuladora de adesão celular do implante. Experiências de controlo mostram que a elevada taxa de adesão celular, que é conseguida com o material de implante em conformidade com o invento, não pode ser conseguida pela adsorção do péptido na superfície. O péptido possui, de preferência, um comprimento de 5 a 100 aminoácidos, com maior preferência de 10 a 50 aminoácidos. O péptido é obtido preferencialmente por síntese química usando a química convencional de péptidos em fase sólida. Ao contrário das proteínas naturais, os pequenos péptidos são resistentes a técnicas de esterilização como a irradiação gama e podem ser guardados num meio seco à temperatura ambiente durante anos.

Um modo de realização do invento é um implante destinado ao contacto ósseo. Neste modo de realização o péptido possui preferencialmente um efeito osteocondutor por imitação da conformação necessária ao reconhecimento e acoplamento de receptores de integrina, ou de outras moléculas de superfície, que se encontram presentes na 11 superfície de células ósseas, de preferência nos osteoblastos. Este revestimento osteocondutor melhora o contacto ósseo do implante por adesão de osteoblastos à superfície do implante e a consequente formação de tecido ósseo sobre a superfície do implante. "Osteocondutor", no contexto deste invento, significa proporcionar uma estrutura que serve como estrutura orientadora para as células ósseas que se encontram no meio próximo, para aderirem à superfície. "Osteocondutor" é diferente de "osteoindutor" uma vez que osteoindutor significa induzir a formação de osso num tecido onde as células ósseas não estão normalmente presentes.

Num modo de realização mais preferido, o péptido imita o domínio de ligação à célula do colagénio, de preferência colagénio de tipo I, para que o péptido se ligue aos receptores de colagénio (por exemplo, integrinas) nas células e medeie a adesão celular ao implante. 0 domínio de ligação à célula ou de ligação à integrina do péptido inclui uma sequência principal que, em condições fisiológicas, está dobrada em folha beta, sendo a folha beta formada em -Ile-Ala-.

Um péptido preferido possui a sequência de aminoácidos em conformidade com a SEQ ID NO:l:

Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg-Gly-Val-Val (SEQ ID NO: 1).

Este modo de realização de quinze aminoácidos possui a mesma sequência que uma região pequena, particular, na cadeia al de colagénio. Outros péptidos preferidos são 12 seleccionados do grupo de péptidos com sequências de aminoácidos em conformidade com as seguintes sequências: Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg (SEQ ID N0:2), Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln (SEQ ID N0:3), Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-Arg (SEQ ID N0:4), Phe-Gly-Ile-Ala-Gly-Phe (SEQ ID N0:5),

Gly-Ile-Ala-Gly-Gln (SEQ ID NO:6),

Gln-Gly-Ala-Ile-Ala-Gln (SEQ ID NO:7), Cys-Gly-Ile-Ala-Gly-Cys (SEQ ID NO:8), Glu-Gly-Ile-Ala-Gly-Lys (SEQ ID NO:9), ou: (X) o-i5_Gly-Ile-Ala-Gly- (X) o-is onde (X) ο-is representa 0 a 15 aminoácidos de qualquer tipo.

Um modo de realização alternativo do invento é um implante destinado ao contacto com tecido mole. Nesta concretização o péptido é seleccionado de um grupo de péptidos, que promovem a adesão de células de tecido mole, de preferência queratinócitos ou fibroblastos, por imitação da conformação necessária ao reconhecimento e acoplamento de receptores de laminina, ou de outras moléculas de superfície que se encontram presentes na superfície de queratinócitos ou de fibroblastos. O revestimento assim produzido melhora o contacto com tecido mole do implante por adesão de células de tecido mole, de preferência queratinócitos ou fibroblastos, à superfície do implante.

Neste modo de realização o péptido imita o domínio de ligação da célula para a laminina para que o péptido se ligue aos receptores de laminina nas células e medeie a adesão celular ao implante. 13 0 domínio de ligação à célula, do péptido, inclui, de preferência, o padrão Arg-Gly-Asp (RGD) ou Ile-Lys-Val-Ala-Val· Os péptidos preferidos são seleccionados do grupo de péptidos com sequências de aminoácidos em conformidade com as sequências a seguir: (X) o-i5~Arg-Gly-Asp- (X) 0-15 ou (X) o-i5-Ile-Lys-Val-Ala-Val- (X) 0-15 onde (X) 0-15 representa 0 a 15 aminoácidos de qualquer tipo.

Os péptidos mais preferidos são seleccionados do grupo de péptidos com sequências de aminoácidos em conformidade com as seguintes sequências de SEQ ID NO:10 a 13: Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Tyr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 10)

Glu-Pro-Arg-Gly-Asp-Thr (SEQ ID NO: 11) Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro (SEQ ID NO:12)

Gly-Thr-Pro-Gly-Pro-Gln-Ile-Lys-Val-Ala-Val-Gln-Arg-Gly-Val (SEQ ID NO:13).

Um modo de realização especial do invento é um implante destinado ao contacto com o osso e o tecido mole, tal como uma prótese dentária. ou

Neste modo de realização, o implante é revestido na área destinada ao contacto ósseo com uma camada de apatite nanocristalina onde é incorporado um péptido osteocondutor para promover a adesão de células de tecido ósseo, de preferência osteoblastos. A área do implante que se destina ao contacto com o tecido mole é revestida com um segundo péptido que estimula a adesão de células de tecido mole, de preferência queratinócitos fibroblastos. 14

Preferencialmente, o implante para contacto com tecido ósseo e mole caracteriza-se por o material de base possuir, na parte da superfície destinada ao contacto ósseo, estruturas ao nível de sub mm até sub ym, e em que a parte da superfície para o contacto com tecido mole possui uma estrutura de superfície diferente.

Por um outro aspecto deste invento proporciona-se um procrsso para produzir um implante com uma superfície destinada ao contacto com tecido ósseo e/ou mole.

De acordo com o invento, este objectivo é alcançado por um processo que compreende as fases de revestimento da superfície com uma camada de apatite nanocristalina, em que, pelo menos um péptido, possuindo um efeito estimulante de adesão celular por imitação de uma conformação necessária ao reconhecimento e ao acoplamento das moléculas de superfície celular, de preferência integrinas, é parcialmente integrado em, pelo menos, uma parte da camada de apatite nanocristalina, deixando acessíveis às células os resíduos do péptido que são importantes para o reconhecimento das moléculas de superfície celular, em que a camada de apatite nanocristalina consiste em hidroxiapatite ou hidroxiapatite e fluorapatite, consistindo em agulhas muito finas que possuem um comprimento de cerca de 200 nm a 500 nm e um diâmetro de cerca de 20 a 40 nm, incluindo proporcionar um material de base com uma superfície electrocondutora possuindo, pelo menos uma parte da sua superfície, estruturas ao nível de sub mm até sub ym, que são produzidas por jacto de corindo, ou pulverização catódica de pó de metal fundido na superfície, ou técnicas assistidas por laser, ou técnicas assistidas por 15 plasma ou ataque químico, ou uma combinação destas técnicas, proporcionando uma solução de electrólito contendo pelo menos iões cálcio e iões fosfato, e possuindo um pH de 6,4 ± 0,4, proporcionando um contra-eléctrodo na solução de electrólito; colocação do material de base pelo menos parcialmente na solução de electrólito; e aplicação de uma corrente eléctrica entre o contra-eléctrodo e o material de base para que o material de base actue como cátodo.

Um destes processos assistidos electroquimicamente proporciona o revestimento da superfície de um implante com uma camada que consiste em apatite, na qual é parcialmente incorporado um péptido.

Num modo de realização do invento este processo utiliza: 1. ) um material de base (substrato) possuindo, pelo menos numa parte da sua superfície, estruturas ao nível de mm até sub ym, em que a superfície é electrocondutora; 2. ) um electrólito contendo o péptido, iões cálcio e iões fosfato, e possuindo um pH que é ligeiramente ácido ou aproximadamente neutro; 3. ) um contra-eléctrodo no electrólito.

Estas estruturas ao nível de mm até sub ym são, de preferência, produzidas por jacto de corindo, ou pulverização catódica de pó de metal fundido na superfície, ou técnicas assistidas por laser, como por aplicação de impulsos de laser, ou técnicas assistidas por plasma, ou ataque químico, ou uma combinação dessas técnicas. 16

Através deste pré-tratamento, a superfície do implante obtém uma morfologia relativamente complexa e maior rugosidade da superfície que está acessível às células. Esta morfologia melhora por si só a adesão celular e reforça o contacto com o osso.

Numa concretização preferida o material de base é primeiro tratado para produzir estruturas ao nível de sub mm, de preferência, por jacto de corindo ou pela aplicação de pulsos de laser à superfície.

Em alternativa, as estruturas ao nível de sub ym até mm são produzidas por pulverização catódica de pó de metal fundido na superfície. Num segundo passo, as estruturas ao nível de mm são produzidas por ataque químico, de preferência ataque químico com ácido. 0 passo de ataque químico com ácido é realizado, de preferência, a uma temperatura superior a 40°C com uma mistura de ácido clorídrico, ácido fluorídrico, ácido sulfúrico e ácido nítrico. 0 processo assistido electroquimicamente conduz, vantajosamente, a uma deposição de apatite muito homogénea e controlada na superfície. A espessura da camada depositada pode ser controlada através da densidade de corrente usada para a polarização e do tempo de polarização.

Esta deposição controlada é importante para que o processo do invento produza um revestimento homogéneo sobre a superfície que seja relativamente fino, com uma espessura preferida inferior a 5 ym, e não mascara as estruturas ao nível de sub ym até mm. 17

Esta deposição controlada de camadas finas homogéneas não é conseguida através das técnicas não electroquimicamente assistidas vulgarmente usadas para a deposição de apatite em superfícies. 0 processo electroquimicamente assistido é efectuado, de preferência, a uma temperatura entre 10°C e 45°C, com mais preferência entre a temperatura ambiente e 42°C, sendo a mais preferida entre os 30°C e os 38°C. Este intervalo de temperaturas preserva, com vantagem, a conformação biologicamente activa do péptido. 0 implante é colocado no electrólito e é aplicada uma corrente eléctrica entre o contra-eléctrodo e o implante, para que o material de base actue como cátodo. Este processo de um só passo conduz à deposição directa de apatite nanocristalina. A polarização catódica é realizada, de preferência, com um galvanostato. A densidade de corrente é seleccionada, de preferência, de forma a ser de 0,1 mA/cm2 a 20 mA/cm2, com mais preferência entre 2 mA/cm2 e 15 mA/cm2.

Para a execução do processo em conformidade com o invento, prefere-se uma combinação de dois eléctrodos, na qual um material inerte como uma placa de platina actua como contra-eléctrodo e o material de base como cátodo. Como célula de electrólito é utilizada uma célula controlada por termostato.

Num modo de realização alternativo do invento, utiliza-se uma combinação de três eléctrodos, na qual um eléctrodo saturado de calomelano actua como eléctrodo adicional de referência. 18

Por preferência, a corrente eléctrica é aplicada em impulsos, com uma duração preferida de impulso entre 2 e 10 segundos. As pausas entre impulsos são seleccionadas preferencialmente no mesmo intervalo. Num modo de realização 5 segundos de corrente são seguidos de 5 segundos sem corrente.

Durante o processo electroquimico formam-se bolhas de hidrogénio. Para melhorar a homogeneidade da camada de apatite formada, retiram-se preferencialmente as bolhas gasosas da superfície do material de base através do movimento do substrato no electrólito não agitado.

Num modo de realização preferido do processo, a homogeneidade da camada de apatite formada é ainda melhorada pela combinação da aplicação da corrente em impulsos com o movimento do substrato.

Os impulsos e o movimento podem ser realizados subsequentemente ou em paralelo, de preferência, a corrente é primeiro impulsionada e a amostra é subsequentemente movida. O electrólito usado para a polarização catódica é um meio polar, no qual estão solvidos iões cálcio e iões fosfatos. O péptido encontra-se no electrólito, de preferência numa concentração de 1 pg/ml a 10 mg/ml, mais preferencialmente de 100 yg/ml a 500 yg/ml. Para manter baixa a quantidade de péptido usado, de preferência, não se lava e não se seca o material de base, entre a aplicação dos impulsos individuais de polarização. 19

Durante o processo de polarização catódica, é construída uma camada de apatite nanocristalina e na camada crescente é incorporado o péptido. Através desta incorporação, o péptido liga-se de modo estável à superfície, por interacções que são muito mais fortes do que a adsorção.

Surpreendentemente, durante o processo de polarização catódica, o péptido é apenas parcialmente integrado na camada, deixando acessível a folha beta, que é importante para o reconhecimento de receptores de colagénio, para que as células adiram ao péptido.

Experiências com células mostram que o péptido ligado de modo estável aumenta grandemente a acção estimuladora de adesão celular do material de implante. A partir destes resultados, pode concluir-se que o domínio do péptido, que é importante para o reconhecimento dos receptores de colagénio, está ainda acessível após a incorporação na camada de apatite.

Num modo de realização alternativo do invento, o péptido não está solvido no electrólito, mas sim depositado na superfície do material de base por aplicação de uma solução de péptido ao material de base, seguido de uma fase de secagem. Através deste pré-tratamento, a superfície do implante é pré-revestida com o péptido, que está fracamente ligado à superfície. 0 material de base pré-revestido é agora colocado no electrólito e a polarização catódica é executada segundo foi descrito. Ao colocar o material de base no electrólito, o péptido é dissolvido lentamente, 20 conduzindo a um gradiente de concentração de péptido, com a concentração de péptido mais elevada na superfície do material de base. Para este modo de realização do processo são necessárias quantidades inferiores de péptido, em comparação com o modo de realização onde este é dissolvido no electrólito.

Num modo de realização particular do processo do invento, o material de base é previamente revestido com uma camada de apatite, antes de se executar a co-deposição assistida electroquimicamente de péptido e de apatite. Este revestimento prévio é especialmente preferido quando o péptido não está dissolvido no electrólito, mas sim depositado na superfície antes da polarização.

De preferência, a relação da concentração dos iões cálcio e fosfato no electrólito usado para a polarização catódica é seleccionada de modo a ser igual às suas concentrações em hidroxiapatite, resultando numa relação molar de Ca:P04 de 1:1 a 2:1, de preferência 1,67:1.

Num modo de realização preferido do invento, o electrólito é uma solução aquosa de 1 mmol/litro a 2 mmol/litro de CaCl2 e 0,5 a 1 mol de fosfato alcalino, como KH2PO4, por mole de Cálcio. Em modos de realização alternativos do invento, são usados outros sais de cálcio e fosfatos facilmente solúveis, como o fosfato de amónio.

Para a produção de uma camada contendo fluorapatite, é dissolvido no electrólito um sal de fluoreto solúvel em água, de preferência, fluoreto de sódio, numa concentração, de preferência, de 5% a 30% da concentração de fosfato. 21 0 valor de pH é, de preferência, ajustado entre pH 4 e pH 7,5 por meio de uma solução diluida de NH4OH. Num modo de realização preferido do invento, o pH durante a polarização catódica é pH 6,4 ± 0,4.

Num modo de realização especial do processo do invento, revestem-se partes distintas do implante com diferentes péptidos. Isto consegue-se, de preferência, inserindo o material de base, numa primeira fase, apenas parcialmente no electrólito contendo o primeiro péptido e realizando um primeiro processo de polarização catódica. O material de base é então virado e inserido com o outro lado num segundo electrólito contendo o segundo péptido e executa-se um segundo processo de polarização catódica.

Em alternativa, depositam-se, primeiro, ambos os péptidos em partes distintas do material de base. Neste caso a polarização catódica pode ser realizada num único processo. 0 invento é explicado com maior detalhe através dos exemplos que se seguem, que são meramente ilustrativos, do presente invento e não devem ser entendidos como limitações. EXEMPLO 1

Submete-se um disco constituído por 99,7% de titânio puro e um diâmetro de 13 mm, uma espessura de 2 mm, a jacto de corindo, a ataque químico com ácido, a limpeza em álcool, a lavagem em água desionizada e a secagem com uma ventoinha. 22

Prepara-se um electrólito com uma concentração de cálcio de 1,66 mmol/litro (de CaCl2»2H20) e uma concentração de fosfato 1 mmol/litro (de KH2P04) resultando numa razão de Ca:P04 = 1,67:1. Neste electrólito, dissolve-se o péptido com uma sequência de aminoácidos em conformidade com SEQ ID No. 1, numa concentração de 200 yg/ml.

Coloca-se o electrólito numa célula de vidro de parede dupla, aquece-se a 36°C e ajusta-se o valor de pH para pH=6,4 adicionando solução concentrada de NH4OH em gotas. Monta-se uma combinação de três eléctrodos. Utiliza-se um eléctrodo saturado de calomelanos como eléctrodo de referência. O contra-eléctrodo é uma placa de platina. O disco de titânio forma o eléctrodo de trabalho. Após a montagem de esta combinação, estabelece-se contacto com um galvanostato e realiza-se a polarização catódica da amostra de titânio. Para a polarização galvanostática aplicam-se impulsos com uma densidade de corrente I = 10 mA cm-2 durante 120 minutos. Cada impulso possui uma duração de 5 segundos e é seguido de uma pausa de 5 segundos. Durante este processo de deposição, faz-se mover a amostra continuamente no electrólito.

Remove-se a amostra do electrólito, lava-se com água desionizada e seca-se com uma ventoinha. A camada depositada tem aspecto amarelo esbranquiçado, está uniformemente desenvolvida e possui uma boa interface de ligação. As investigações efectuadas com um microscópio electrónico de varrimento revelou um revestimento denso, que consistia em aglomerados de agulhas muito finas que possuiam um comprimento de cerca de 500 nm e um diâmetro de cerca de 20 a 40 nm. A análise da composição elementar através de espectroscopia no infravermelho por 23 transformada de Fourier originou uma razão de Ca/P da fase no revestimento igual à da hidroxiapatite comercial. A análise por difracção de raios X verificou que a fase era hidroxiapatite. EXEMPLO 2

Testou-se a eficácia da adesão celular à superfície revestida em conformidade com o EXEMPLO 1 em experiências com células e comparou-se com superfícies não revestidas ou com superfícies revestidas por outros processos. Compararam-se os seguintes materiais: 1. Não revestido 2. Não revestido, esterilização com radiação gama 3. Péptido (SEQ ID NO: 1) adsorvido a partir de solução a 200 yg.ml-1 para a superfície não revestida 4. Como em 3) + esterilização com radiação gama 5. Revestido com HAP + péptido (SEQ ID NO:l) adsorvido a partir de solução a 200 yg.ml-1 6. Como em 5) + esterilização com radiação gama 7. Revestido com HAP em electrólito contendo péptido a 200 pg.ml"1 (SEQ ID NO:l) 8. Como em 7) + esterilização com radiação gama. O material não revestido em conformidade com os números 1 e 2 é semelhante ao EXEMPLO 1. Submeteu-se um disco constituído por 99,7% de titânio puro e um diâmetro de 13 mm, uma espessura de 2 mm, a jacto de corindo, ataque químico com ácido, a lavagem em álcool, lavagem em água desionizada e secagem com uma ventoinha.

Tratou-se o material em conformidade com os números 3 e 4 conforme foi descrito no EXEMPLO 1, mas sem a realização da polarização catódica, que resultou meramente na adsorção do péptido a partir da solução (200 yg/ml) na superfície não revestida.

Primeiro revestiu-se com HAP o material em conformidade com os números 5 e 6 tratado segundo foi descrito no EXEMPLO 1, mas excluindo o péptido do electrólito.

Após a polarização catódica, adicionou-se ao electrólito 200 yg/ml de péptido e incubou-se a amostra durante uns outros 60 minutos a 36°C sem realizar a polarização catódica.

Subsequentemente, lavou-se e secou-se a amostra incubada desta maneira conforme foi descrito no EXEMPLO 1.

Tratou-se o material em conformidade com os números 7 e 8 exactamente como foi descrito no EXEMPLO 1.

Para o material em conformidade com os números 2, 4, 6, 8, efectuou-se uma esterilização com radiação gama, como último passo (após o revestimento, a lavagem, a secagem), à temperatura ambiente com uma dose de 25 kgrey.

Para as experiências com células efectuaram-se culturas de osteoblastos primários de ratinhos calvaria, durante 24 h, em meio MEM de Dulbecco (DMEM) isento de soro (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) suplementado com 3H-timidina em materiais com superfícies tratadas conforme foi descrito sob os números 1 a 8.

Removem-se os materiais da cultura de células e lavam-se com Tampão de Fosfato Salino (PBS) . Mediu-se a taxa de adesão celular por contagem de cintilação. 25

Resultados : % de adesão 13 17

Estados de superfície em experiências com células: 1. Não revestida 2. Não revestida, esterilizada com radiação gama a 200 pg.ml' 3. Péptido adsorvido de solução para superfície não revestida 4. Como 3) + esterilizada com radiação gama \ 17 5. Revestida com HAP + péptido adsorvido de \ \ 27 solução de 200 yg.ml 1 \ 6. Como 5) + esterilizada com radiação gama \ 15 7. Revestida com HAP em electrólito contendo\ j 54 200 yg.ml 1 de péptido (EXEMPLO 1) \ 8. Como 7) + esterilizada com radiação gama \ 52

Interpretam-se estes resultados do seguinte modo: 1. O revestimento de HAP com incorporação do péptido no electrólito durante o processo de polarização catódica em conformidade com o EXEMPLO 1 (números 7 e 8) possui a taxa de adesão de osteoblastos mais elevada (52% e 54%). Isto demonstra o excelente efeito estimulante de adesão celular do revestimento do invento. 2. A esterilização com radiação gama não possui nenhum efeito negativo significativo no revestimento do invento (número 7 comparado ao número 8). 26 3. A adsorção de péptido na superfície não revestida (números 3 e 4) não melhora significativamente a adesão celular quando comparada à superfície não revestida (números 1 e 2). 4. Uma superfície revestida com HAP, que possui um péptido adsorvido (n.° 5) mostra apenas um efeito estimulante de adesão celular muito baixo, que é perdido após a irradiação gama (n.° 6) . A taxa de adesão celular que é atingida pelo revestimento do invento (n.° 7 e 8) é muito mais elevada.

Surpreendentemente, durante o processo de polarização catódica do invento, o péptido é apenas parcialmente integrado na camada, deixando acessível a folha beta, que é importante para o reconhecimento do péptido pelos receptores de colagénio para que as células adiram ao péptido. A adsorção de péptido na superfície revestida com HAP piora mesmo a taxa de adesão celular quando comparada a um revestimento com HAP sem adsorção de péptido (dados não apresentados). EXEMPLO 3

Tratou-se um disco constituído por 99,7% de titânio puro conforme se descreveu no EXEMPLO 1, mas por incorporação no electrólito de 500 pg/ml de péptido contendo o padrão Ile-Lys-Val-Ala-Val em conformidade com SEQ ID NO:13 em vez de um péptido com uma sequência em conformidade com a SEQ ID NO: 1. 27

Para a polarização galvanostática, aplica-se uma densidade de corrente I = 10 mA.cm"2, a 36°C, durante 60 minutos, sem impulsos.

Para as experiências com células efectuaram-se culturas de células HaCaT (queratinócitos humanos imortalizados obtidos da DKFZ - Centro Alemão de Investigação do Cancro, Heidelberg, Alemanha) durante 24 h em meio MEM de Dulbecco (DMEM) sem soro suplementado com 3H-Timidina sobre o disco de titânio revestido.

Efectuaram-se as respectivas experiências de controlo conforme se descreveu no EXEMPLO 2 usando o péptido. Os resultados são comparáveis ao EXEMPLO 2. O revestimento de HAP com incorporação, no electrólito, de péptido contendo o padrão Ile-Lys-Val-Ala-Val em conformidade como a SEQ ID NO:13, durante o processo de polarização catódica, possui a taxa de adesão de queratinócitos mais elevada. Isto demonstra o excelente efeito estimulante de adesão celular do revestimento do invento.

Surpreendentemente, durante o processo de polarização catódica do invento, o péptido é apenas parcialmente integrado na camada, deixando acessível o padrão Ile-Lys-Val-Ala-Val, que é importante para o reconhecimento pelos queratinócitos, para as células aderirem ao péptido. 28

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Friadent GmbH <120> Implant with a biofunctionalized surface and method for its production <130> P12135EP <160> 13 <17 0> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 1 Gly Thr Pro Gly Pro Gin Gly Ile 1 5 Ala Gly 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 2 Gly . 1 Pro Gin Gly Ile Ala Gly Gin Arg 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 3 Gin 1 Gly Ile Ala Gly Gin 5 <210> 4 <211> 7 15

<212> PRT <213> artificial <4 0 0> 4 Gin Gly Ile Ala Gly Gin Arg 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 5

Phe Gly Ile Ala Gly Phe 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 6

Gly Ile Ala Gly Gin 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 7

Gin Gly Ala Ile Ala Gin 1 5

<210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> artificial 30 <400> 8

Cys Gly Ile Ala Gly Cys 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 9

Glu Gly Ile Ala Gly Lys 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 10

Gly Arg Gly Asp Ser Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 10 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 11

Glu Pro Arg Gly Asp Thr I—f 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <4 0 0> 12

Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 31 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> artificial <4 Ο 0> 13

Gly Thr Pro Gly Pro Gin Ile Lys Vai Ala Vai Gin Arg Gly Vai 1 S 10 15 LISBOA, 7 de JULHO de 2010

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Implante com uma superfície que se destina ao contacto com o osso e/ou tecido mole, compreendendo um material de base que possui, pelo menos numa parte da sua superfície, estruturas ao nível de sub mm até sub ym, em que a superfície é electrocondutora, possuindo na sua superfície um revestimento que compreende uma camada de apatite nanocristalina, com pelo menos um péptido, caracterizado por o péptido possuir um efeito estimulante de adesão celular por imitação de uma conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento das moléculas da superfície celular, de preferência integrinas, ser parcialmente incorporado por co-deposição assistida electroquimicamente em pelo menos uma parte da camada de apatite nanocristalina, deixando acessíveis às células os resíduos do péptido que são importantes para o reconhecimento de moléculas de superfície da célula, e por a camada de apatite nanocristalina compreender hidroxiapatite ou hidroxiapatite e fluorapatite, consistindo em agulhas muito finas que apresentam um comprimento de cerca de 200 nm a 500 nm e um diâmetro de cerca de 20 a 40 nm.

2. Implante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido possuir um efeito osteocondutor por imitação da conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento de moléculas de superfície, que se encontram presentes na superfície 2 das células de tecido ósseo, de preferência osteoblastos.

3. Implante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido estimular a adesão de células de tecido mole, de preferência queratinócitos ou fibroblastos, por imitação da conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento de moléculas de superfície, que se encontram presentes na superfície de células de tecido mole, de preferência queratinócitos ou fibroblastos.

4. Implante de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por uma primeira parte da camada de apatite conter um primeiro péptido, que possui efeito osteocondutor por imitação de uma conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento de moléculas de superfície, que se encontram presentes na superfície de células de tecido ósseo, de preferência osteoblastos, e uma segunda parte da camada de apatite conter um segundo péptido que promove a adesão de células de tecido mole, de preferência queratinócitos ou fibroblastos, por imitação de uma conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento de moléculas de superfície, que se encontram presentes na superfície de células de tecido mole, de preferência queratinócitos ou fibroblastos.

5. Implante de acordo com a reivindicação 1, 3 caracterizado por o péptido imitar uma conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento de receptores que se ligam ao colagénio I.

6. Implante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado por o péptido conter um padrão Gly-Ile-Ala-Gly ou Arg-Gly-Asp ou Ile-Lys-Val-Ala-Val ou possuir uma sequência de aminoácidos seleccionada de sequências em conformidade com a SEQ ID NO: la SEQ ID NO: 13.

7. Implante de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 destinado ao contacto com osso e tecido mole caracterizado por o material de base possuir, na parte da superficie destinada ao contacto ósseo, estruturas ao nível de sub mm até sub pm e em que a parte da superfície para o contacto com tecido mole possui uma estrutura de superfície diferente.

8. Processo para produzir um implante com uma superfície destinada ao contacto com osso e/ou tecido mole, compreendendo a fase de: revestir a superfície com uma camada que compreende apatite nanocristalina, na qual pelo menos um péptido, caracterizado por o péptido ter um efeito estimulante de adesão celular por imitação de uma conformação necessária para o reconhecimento e acoplamento de moléculas da superfície celular, de preferência integrinas, ser parcialmente incorporado em pelo menos uma parte da 4 camada de apatite nanocristalina, deixando acessíveis às células os resíduos do péptido que são importantes para o reconhecimento de moléculas de superfície celular, por a camada de apatite nanocristalina compreender hidroxiapatite ou hidroxiapatite e fluorapatite, consistindo em agulhas muito finas que possuem um comprimento e cerca de 200 nm a 500 nm e um diâmetro de cerca de 20 a 40 nm; que inclui proporcionar um material de base com uma superfície electrocondutora que possui, pelo menos numa parte da sua superfície, estruturas ao nível de sub mm até sub pm produzidas por jacto de corindo ou pulverização catódica de pó de metal fundido na superfície, ou por técnicas assistidas por laser, ou técnicas assistidas por plasma, ou por ataque químico, ou por uma combinação dessas técnicas, proporcionando uma solução de electrólito contendo pelo menos iões cálcio e iões fosfato e possuindo um pH 6,4 ± 0,4; que inclui proporcionar um contra-eléctrodo na solução de electrólito; colocar o material de base pelo menos parcialmente na solução de electrólito; aplicar uma corrente eléctrica entre o contra-eléctrodo e o material de base para que o material actue como cátodo.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução de electrólitos conter ainda um péptido.

10. Processo de acordo com a reivindicação 8, 5 caracterizado por pelo menos um péptido estar depositado na superfície.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 10,caracterizado por ser realizado a uma temperatura entre os 10°C e os 45°C, de preferência de 25°C a 42°C.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 11, caracterizado por o material de base ser previamente revestido com uma camada de apatite.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, caracterizado por serem aplicados diferentes péptidos às partes distintas do material de base. LISBOA, 7 de JULHO de 2010