KR100675573B1 - 다공성 칼슘포스페이트 박막 형성을 통한 표면 개질방법 - Google Patents

다공성 칼슘포스페이트 박막 형성을 통한 표면 개질방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다공성 칼슘포스페이트 박막 형성을 통한 표면 개질방법에 관한 것으로, 구체적으로는 1) 칼슘이온용액과 인산이온용액을 제조하는 단계; 2) 상기 칼슘이온용액과 인산이온용액을 혼합하여 칼슘과 인산의 이온농도가 각각 1 내지 3 mM 및 3 내지 5 mM이 되는 혼합이온용액을 제조하는 단계; 및 3) 상기 혼합이온용액을 이용하여 고체 표면에 다공성 칼슘포스페이트 박막을 형성하는 단계를 포함하는, 표면 개질방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 고체 표면에 저결정성 3차원 입체구조를 갖는 다공성 표면구조를 형성함으로써 인체삽입용 인공대체물질 또는 의료용 이식물(implant)의 표면이 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성(osteoconductivity)을 갖도록 개질하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다공성 칼슘포스페이트 박막 형성을 통한 표면 개질방법{METHOD FOR SURFACE MODIFICATION BY COATING WITH HIGHLY POROUS CALCIUM PHOSPHATE THIN FILM}
도 1은 본 발명의 방법에 따라 칼슘포스페이트 박막으로 코팅된 실리카 유리 플레이트의 표면형태를 코팅 처리시간에 따라 AFM(atomic force microscope)으로 분석한 결과이고,
(a) 15분, (b) 30분, (c) 60분, (d) 90분
도 2는 본 발명의 방법에 따라 칼슘포스페이트 박막으로 코팅된 실리카 유리 플레이트의 표면형태를 코팅 처리시간에 따라 SEM(scanning electron microscope)으로 관찰한 결과이고,
(a) 15분, (b) 30분, (c) 60분, (d) 90분
도 3은 본 발명의 방법에 따라 실리카 유리 플레이트 표면에 코팅된 칼슘포스페이트 박막의 화학적 조성을 코팅 처리시간에 따라 XPS(X-ray photoelectron spectroscope)로 분석한 결과이고,
(a) 15분, (b) 30분, (c) 60분, (d) 90분
도 4는 본 발명의 방법에 따라 칼슘포스페이트 박막으로 코팅된 실리카 유리 플레이트 표면에 대한 조골세포의 부착정도를 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 염색으로 조사한 결과이고,
도 5는 본 발명의 방법에 따라 칼슘포스페이트 박막으로 코팅된 실리카 유리 플레이트 표면에서 조골세포의 증식정도를 MTT 분석방법으로 조사한 결과이고,
도 6은 본 발명의 방법에 따라 칼슘포스페이트 박막으로 코팅된 실리카 유리 플레이트 표면에서 조골세포의 분화정도를 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 활성분석으로 조사한 결과이다.
본 발명은 칼슘이온과 인산이온을 적절한 농도로 혼합한 혼합이온용액을 이용하여 고체 표면에 다공성 칼슘포스페이트 박막을 형성함으로써 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성이 우수한 특성을 갖도록 고체 표면을 개질하는 방법에 관한 것이다.
손상된 조직이나 인공장기를 대체할 만한 생체용 재료의 개발 및 개선을 위하여 많은 연구가 이루어지고 있으며, 이러한 목적으로 개발된 합성 고분자, 티타늄, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)와 같은 여러 종류의 생체용 재료들이 조직 및 인공장기를 대체하기 위하여 사용되고 있다(J.C. Elliott, Structure and chemistry of the apatites and other calcium orthophosphates, Elsvier, New York, 1994; O. Kim 및 S. Han, J. Ind. Eng. Chem.. 10: 395, 2004; J.W. Choi, et al., J. Ind. Eng. Chem. 10: 428, 2004). 특히, 하이드록시아파타이트(Ca10(PO4)6(OH)2)는 실제 뼈 조직과 가장 유사한 화학적인 특성을 갖고 있기 때문에 노화 또는 사고에 의해 손상된 뼈 조직을 대체하는 물질로 널리 활용되고 있다(J.C. Elliott, Structure and chemistry of the apatites and other calcium orthophosphates, Elsvier, New York, 1994; H. Aoki, Medical Applications of hydroxyapatite, Ishiyaku EuroAmerica, Inc., Tokyo, 1994). 뿐만 아니라, 하이드록시아파타이트는 생체적합성이 우수하여 정형외과 혹은 치과용 이식물(implant)의 표면특성을 향상시켜 뼈 생성을 개선하기 위한 코팅물질로도 널리 이용되고 있다(W. Weng 및 J. L. Baptista, Biomaterials 19: 125, 1998; S.A. Bender, et al., Biomaterials 21: 299, 2000; H. Zeng 및 W.R. Lacefield, Biomaterials 21: 23, 2000). 이 외에도, 다이칼슘포스페이트(dicalcium phosphate, DCP), 트라이칼슘포스페이트(tricalcium phosphate, TCP), 옥타칼슘포스페이트(octacalcium phosphate, OCP) 등이 생체용 재료로서 생체적합성이 우수한 것으로 알려져 있다(J.C. Elliott, Structure and chemistry of the apatites and other calcium orthophosphates, Elsvier, New York, 1994).
한편, 의학적인 용도로 사용되는 인체삽입용 인공대체물질의 표면개질을 위한 칼슘포스페이트 코팅방법으로 모의 체액법(simulated body fluid, SBF)이 사용되어 왔다(T. Kokubo, et al., J. Biomed. Mater. Res. 24: 721, 1990; K. Kato, et al., J. Biomed. Mater. Res. 32: 687, 1996). 최근에는 보다 우수한 생체적합성을 갖는 칼슘포스페이트 박막을 제조하기 위하여 플라즈마 분사법(plasma spray; J.A.M. Clemens, et al., J. Biomed. Mater. Res. 48: 741, 1999; K. de Groot, et al., J. Biomed. Mater. Res. 21: 1375, 1987), 졸-겔법(sol-gel; T. Peltola, et al., J. Biomed. Mater. Res. 41: 504, 1998; F. Barrere, et al., Biomaterials 23: 2211, 2002; M.M. Pereira, et al., J. Biomed. Mater. Res. 28: 693, 1994), 스퍼터링법(sputtering; L. Torrisi 및 G. Forti, Appl. Surf. Sci. 69: 140, 1993), 침전법(precipitation; B. Feng, et al., Biomaterials 25: 3421, 2004) 등과 같은 다양한 종류의 코팅방법이 개발되고 있다.
상기와 같은 방법으로 고체의 표면을 칼슘포스페이트 박막으로 코팅하는 것은 일반적으로 제조에 상당한 시간이 필요하며, 코팅시의 조건이 인체에서 뼈 조직이 생성될 때의 환경, 즉, 온도, pH 등과 다르다는 문제점이 있다(P. Li, et al., J. Am. Ceram. Soc. 77: 1307, 1994). 이러한 방법들은 제조과정에서 뿐만 아니라 실제적인 응용 측면에 있어서도 상당한 제한을 갖는데, 예를 들면 플라스마 분사법은 굴곡이 심하거나 다공성이 높은 표면을 갖는 구조의 인체삽입물을 대상으로 하는 경우에는 표면에 칼슘포스페이트 박막을 균일하게 형성하는 것이 매우 어렵다. 또한, 플라스마 분사법 등과 같은 방법들은 처리공정의 온도가 매우 높기 때문에, 고온에서 형성된 칼슘포스페이트 박막은 천연의 뼈 조직보다 훨씬 더 높은 결정성을 가지게 되고, 산화물 등과 같은 불순물들이 포함될 수 있어 실제 뼈 조직과 상당히 다른 박막이 형성될 수 있는 위험요인을 내포하고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존에 칼슘포스페이트 박막을 코팅하는 방법에서 제기된 상기와 같은 문제점들을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 칼슘이온용액과 인산이온용액을 혼합하여 칼슘과 인산의 이온농도가 각각 1 내지 3 mM 및 3 내지 5 mM이 되는 혼합이온용액을 제조한 후 상기 혼합이온용액을 이용하여 고체 표면에 다공성 칼슘포스페이트 박막을 형성함으로써 매우 간단하고 경제적이며 인체 친화적으로 고체 표면을 개질할 수 있는 방법을 개발하고, 상기 방법이 인체삽입용 인공대체물질 또는 의료용 이식물의 표면이 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성(osteoconductivity)을 갖도록 개질하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인체삽입용 인공대체물질 또는 의료용 이식물이 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성이 우수한 표면을 갖도록 다공성 칼슘포스페이트 박막을 형성하여 표면을 개질하는 간단하고 경제적이며 인체 친화적인 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 칼슘이온용액과 인산이온용액을 제조하는 단계;
2) 상기 칼슘이온용액과 인산이온용액을 혼합하여 칼슘과 인산의 이온농도가 각각 1 내지 3 mM 및 3 내지 5 mM이 되는 혼합이온용액을 제조하는 단계; 및
3) 상기 혼합이온용액을 이용하여 고체 표면에 다공성 칼슘포스페이트 박막을 형성하는 단계를 포함하는, 칼슘포스페이트 박막 형성을 통한 표면 개질방법을 제공한다.
단계 1)에서는, 칼슘이온용액과 인산이온용액을 제조하기 위하여 초순수(distilled deionized water 또는 DDW)를 용매로 사용한다. DDW에 Ca(NO3)2ㆍ4H2O, (Sigma, C4955), CaCl2 (Sigma, C4901) 또는 CaHPO4,(Sigma, C4006)를 용해시켜 0.1 내지 2 M 농도의 칼슘이온용액을 제조하고, DDW에 (NH4)2HPO4(Sigma, A5764) 또는 NH4H2PO4(Sigma, A1292)를 용해시켜 0.1 내지 6 M 농도의 인산이온용액을 제조한다. 본 발명에서는 칼슘이온용액과 인산이온용액을 제조하기 위한 용매로 DDW를 사용하기 때문에 제조와 취급이 매우 용이할 뿐만 아니라, 기존에 완충용액의 사용시 완충용액 중의 이온성분들이 칼슘이온 또는 인산이온들과 반응하여 칼슘포스페이트 박막 내에 포함될 수 있는 가능성을 최대한 억제할 수 있다는 장점을 갖는다.
단계 2)에서는, 단계 1)에서 제조된 칼슘이온용액과 인산이온용액을 칼슘이온과 인산이온의 농도가 각각 1 내지 3 mM 및 3 내지 5 mM이 되도록 혼합하여 칼슘포스페이트 박막 코팅을 위한 혼합이온용액을 제조하는 단계이다. 이때, 혼합이온용액은 칼슘이온용액, 인산이온용액 및 증류수를 1:1:10 내지 1:1:1500, 바람직하게는 1:1:125의 부피비로 혼합하여 제조하는 것이 바람직하다.
칼슘이온과 인산이온은 반응성이 매우 높아 용액 내에서 쉽게 칼슘포스페이 트 결정을 생성하여 침전물이 생길 수 있기 때문에, 결정이 생성되는 균일 침전반응(homogeneous precipitation reaction)은 억제하면서 용액 내에 존재하는 이온들이 고체 표면에 코팅층을 형성하는 불균일 침전반응(heterogeneous precipitation reaction)은 원활하게 하기 위하여 칼슘이온과 인산이온의 농도를 적절히 조절하는 것이 중요하다. 이러한 목적에 부합하도록 본 발명에서는 칼슘이온과 인산이온의 농도를 각각 1 내지 5 mM 및 2 내지 7 mM이 되도록 조절된 혼합이온용액을 코팅제로 사용한다.
단계 3)에서는, 단계 2)에서 제조된 칼슘이온과 인산이온의 혼합이온용액을 코팅하고자 하는 인체삽입용 인공대체물질 또는 의료용 이식물의 표면에 적용하여 다공성 칼슘포스페이트 박막을 형성하는 단계이다. 이 단계는 혼합이온용액에 코팅하고자 하는 물질을 담가 1 내지 20℃, 바람직하게는 4℃에서 5분 내지 24시간 동안 방치하여 박막 형성을 위한 핵을 형성하는 단계와 이를 다시 1 내지 40℃에서 10분 이상 보관하여 박막을 형성하는 단계로 이루어진다. 또한, 칼슘이온과 인산이온의 농도를 적절하게 조절하였더라도 칼슘과 인산은 매우 반응성이 높은 물질들이기 때문에 균일 침전반응에 의한 결정이 생성될 수 있으므로 상기와 같이 제조된 혼합이온용액을 박막 코팅에 사용하기 전에 기공 사이즈(pore size) 0.25 ㎛ 이하의 필터로 여과하여 침전된 결정을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일반적으로, 칼슘이온과 인산이온의 균일 침전반응에 의한 결정 생성은 반응온도가 상승함에 따라 활성화되기 때문에 1 내지 20℃ 범위의 가능한 낮은 온도에서 박막 형성을 실시하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에서와 같이 혼합이온 용액내 칼슘이온과 인산이온의 농도가 적절하게 조절된 경우에는 저온에서의 반응이 필수적인 것은 아니다. 본 발명에 따른 칼슘포스페이트 박막 형성에 적절한 온도조건은 0 내지 40℃로 상당히 넓은 범위의 온도조건에서 박막 형성이 가능하며, 체온과 비슷한 37℃ 내외에서 처리하는 것이 바람직하다고 볼 수 있다. 이는 인체내에서 뼈가 37℃에서 형성되므로, 이 조건과 동일한 조건에서 합성칼슘포스페이트를 형성하는 것이 바람직한 것으로 사료된다. 상기 온도조건에서 박막 형성을 위한 코팅 처리시간은 5분 내지 24시간이 바람직하다. 이로부터 최종적으로 고체 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막은 인산이온에 대한 칼슘이온의 몰비가 1:1.27 내지 1:1.36인 것이 바람직하다.
본 발명의 표면 개질방법은 인체삽입용 인공대체물질이나 의료용 이식물로 사용되는 물질이라면 어떠한 것에나 적용될 수 있으며, 금속, 세라믹, 유리, 유기 중합체, 동물이나 식물의 생체조직 등의 다양한 표면이 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 표면 개질방법은 뼈 성장을 위한 골격을 제공할 뿐만 아니라 약물 및 세포 운반에 사용되고 있는 폴리글리콜산(polyglycolic acd), 폴리락트산(polylactic acid), 폴리(락틱-글리콜산) 공중합체 등의 다공성 중합체의 표면에 칼슘포스페이트 박막을 형성함으로써 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성을 부여할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 상기 방법에 따라 실리카 유리 플레이트의 표면에 코팅 처리시간을 달리하여 칼슘포스페이트 박막을 형성한 후 이의 물리화학적 특성을 조사하였다. 코팅 처리시간에 따른 칼슘포스페이트 박막의 표면조 도(surface roughness)의 변화를 원자현미경(atomic force microscope, AFM)을 사용하여 조사한 결과, 박막의 표면조도는 코팅처리의 초기 30분까지는 급격히 증가하다가 그 이후에는 거의 변화를 나타내지 않는다(도 1 참조). 초기 30분 동안의 표면조도의 급격한 증가는 칼슘포스페이트 박막 형성을 위한 결정의 핵 형성과 성장 등의 과정에 기인한 것이고, 30분 이후의 코팅시간 동안에는 박막 형성이 안정적으로 유지되어 표면조도의 변화가 상대적으로 완화되는 것이다.
또한, 코팅시간의 증가에 따른 칼슘포스페이트 박막 표면의 형태학적 변화를 주사 전자 현미경(scanning electron microscope, SEM)을 이용하여 관찰하면 15분간 칼슘포스페이트 박막 코팅된 실리카 유리 플레이트 표면에서는 핵 형성이 뚜렷하게 관찰되고(도 2의 a 참조), 점차 처리시간이 증가하면서 나노 크기의 기공들이 존재하는 표면구조를 갖는 칼슘포스페이트 박막이 형성된다(도 2의 b 내지 d 참조). 이러한 다공성의 칼슘포스페이트 박막구조는 전체적인 비표면적을 상당히 증가시켜 다량의 부착단백질의 흡착을 유발할 수 있고, 이는 그 만큼 조골세포가 상호반응할 수 있는 부착단백질이 증가되는 것이므로 뼈 재생을 더욱 촉진할 수 있다는 장점을 갖는다.
아울러, X-선 광전자 분광기(X-ray photoelectron spectroscope, XPS)를 이용한 칼슘포스페이트 박막의 화학적 조성 분석에서는 코팅 처리시간의 변화에 따라 칼슘과 인산을 나타내는 피크들의 강도가 증가한다(도 3 참조). 이들 피크들의 증가는 실리카 유리 플레이트 표면에 칼슘포스페이트 박막이 형성되었음을 의미하는 것으로 코팅 처리시간에 따라 점차 박막의 두께가 증가하고 있음을 나타내는 것이 다.
상기와 같이 형성된 칼슘포스페이트 박막은 코팅 처리시간의 증가에 따라 칼슘 및 인산의 양이 증가하고(표 1 참조), 비교적 짧은 코팅 처리(15분 및 30분)에 의해 형성된 칼슘포스페이트 박막의 Ca/P 몰비는 하이드록시아파타이트(Ca/P=1.67)보다 낮지만, 옥타칼슘포스페이트(octacalcium phosphate, OCP)(Ca/P=1.33)와 유사하다(표 2 참조).
상기 결과들로부터, 본 발명의 표면 개질방법에 따라 실리카 유리 플레이트 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막은 인체 뼈 조직과 같이 상당히 낮은 결정성을 갖는 반면, 높은 친수성과 삼차원적 다공성 구조를 가짐을 확인하였다.
이와 같은 물리화학적 특성을 갖는 칼슘포스페이트 박막은 뼈의 인공대체물질이나 이식물로 사용될 수 있는 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성을 갖는다. 상기 칼슘포스페이트 박막의 세포 부착, 증식 및 분화 유도효과는 조골세포(osteoblast)를 이용하여 확인할 수 있다. 먼저, 본 발명에 따라 칼슘포스페이트 박막이 코팅되지 않은 대조군에 비해 칼슘포스페이트 박막이 코팅된 실험군에서 세포가 잘 부착되어 높은 성장률을 나타낸다(도 4 참조). 또한, 세포 증식효과 조사를 위한 MTT 분석에서는 7일간의 배양 후에 칼슘포스페이트 박막이 코팅된 실험군에서 대조군에 비해 세포의 증식이 유의미하게 증가한다(도 5 참조). 아울러, ALP(alkaline phosphatase) 활성을 이용한 세포 분화실험에서는 대조군에서 배양한 조골세포에 비하여 칼슘포스페이트 박막이 코팅된 실험군에서 배양한 조골세포가 훨씬 높은 ALP 활성을 나타내는데(도 6 참조), 이는 본 발명에 따라 형성된 칼슘포 스페이트 박막이 매우 우수한 뼈 재생성을 가지고 있음을 입증하는 것이다.
상기 결과들을 요약하면, 본 발명의 방법에 따라 고체 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막은 저결정성으로 3차원 입체구조를 갖는 다공성 표면구조를 가져 현저하게 증가된 비표면적을 갖는다. 이러한 특징으로 인해 상기 칼슘포스페이트 박막이 코팅된 인체삽입용 인공대체물질이나 의료용 이식물은 부착단백질 혹은 생체분자들과 접촉할 수 있는 면적이 증가되어 그 만큼 흡착량을 증가시킬 수 있고, 박막의 표면과 상호반응하여 조골세포의 부착을 증가시킬 수 있으므로 세포의 증식과 분화를 활성화할 수 있는 가능성을 높일 수 있다. 따라서, 본 발명의 표면 개질방법에 따라 인공대체물질 혹은 의료용 이식물의 표면을 다공성 칼슘포스페이트 박막으로 코팅하면 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성을 갖게 되므로 정형외과, 치과 등의 의료분야에서 사고 혹은 노화로 인하여 손상되거나 손실된 뼈의 생체 대체물질로서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 다공성 칼슘포스페이트 박막 코팅에 의한 표면 개질
125 ㎖의 DDW에 8.85 g의 Ca(NO3)24H2O를 넣고 완전히 용해시켜 299 mM 농도의 칼슘이온용액을 제조하였고, 250 ㎖의 DDW에 20 g의 (NH4)2HPO4을 넣고 용해시켜 605.6 mM 농도의 인산이온용액을 제조하였다.
칼슘이온용액과 인산이온용액이 혼합될 때 결정을 생성시키는 균일 침전반응을 최대한 억제하면서 불균일 침전반응에 의한 칼슘포스페이트 박막의 형성이 원활하게 이루어질 수 있도록, 상기에서 제조된 칼슘이온용액 8 ㎖과 인산이온용액 8 ㎖을 1000 ㎖의 DDW에 혼합하여 혼합액내 칼슘이온과 인산이온의 농도가 각각 2.39 mM과 4.84 mM이 되도록 하였다. 이때, 혼합이온용액의 pH는 7.2가 되게 하였다.
칼슘이온과 인산이온의 농도를 적절하게 조절하였더라도 칼슘과 인산은 매우 반응성이 높은 물질들이기 때문에 균일 침전반응에 의한 결정이 생성될 수 있으므로 상기와 같이 제조된 혼합이온용액을 박막 코팅에 사용하기 전에 기공 사이즈(pore size) 0.2 ㎛ 이하의 필터로 여과하여 침전된 결정을 제거하였다. 여과된 혼합이온용액에 표면을 칼슘포스페이트로 박막 코팅하고자 하는 실리카 유리 플레이트(12 ㎜, Fisher brand)를 담가 4℃에서 1시간 동안 방치하여 박막 형성을 위한 핵을 형성한 후 이를 다시 37℃에서 15, 30, 60 및 90분씩 보관하여 박막 형성을 유도하였다. 이로부터 표면에 칼슘포스페이트 박막이 형성된 각각의 실리카 유리 플레이트 시료를 CaP-15, CaP-30, CaP-60 및 CaP-90으로 명명하였다.
<실시예 2> 칼슘포스페이트 박막의 물리화학적 특성 분석
상기 실시예 1에서 코팅 처리시간을 달리하여 실리카 유리 플레이트 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막의 물리화학적 특성을 다음과 같이 분석하였다.
<2-1> AFM(atomic force microscope) 분석
코팅 처리시간에 따른 칼슘포스페이트 박막의 표면조도(surface roughness)의 변화를 주사 탐침 현미경(scanning probe microscope)의 일종인 원자현미경(atomic force microscope, AFM: Thermomicroscops AutoProbe CP Research System, USA)을 이용하여 조사하였다. AFM 이미지는 공기 중에서 각 시료의 1×1 ㎛2의 표면적을 확대하여 얻었고, 이들 이미지들로부터 칼슘포스페이트 박막의 평균 표면조도를 계산하여 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 실리카 유리 플레이트 표면에 코팅된 칼슘포스페이트 박막의 표면조도는 CaP-15가 37.9 Å, CaP-30이 73.0 Å, CaP-60이 76.9 Å 및 CaP-90이 73.0 Å으로 코팅처리의 초기 30분까지는 급격히 증가하다가 그 이후에는 거의 변화를 나타내지 않았다. 즉, 초기 30분까지는 칼슘포스페이트 박막 형성을 위한 결정의 핵 형성과 성장 등의 과정이 발생하므로 조도의 변화가 급격한 것으로, 최소한 코팅 처리가 15분 이상 지속되어야 다공성이 높은 칼슘포스페이트 박막이 형성될 수 있으며 30분 이후에는 박막 형성이 안정적으로 유지되어 표면조도가 상대적으로 완화되는 것임을 알 수 있다.
<2-2> SEM(scanning electron microscope) 분석
코팅시간의 증가에 따른 칼슘포스페이트 박막 표면의 형태학적 변화를 주사 전자 현미경(SEM, JSM-5800, Jeol, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 모든 사진들은 20,000× 배율에서 촬영한 것이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 15분간 칼슘포스페이트 박막 코팅된 실리카 유리 플레이트 표면(a)에서는 핵 형성이 뚜렷하게 관찰되었고, 점차 처리시간이 30분(b), 60분(c) 및 90분(d)으로 증가하면서 나노 크기의 기공들이 존재하는 표면구조를 갖는 칼슘포스페이트 박막이 형성되었다. 처리시간이 증가함에 따라 기공의 크기가 점차적으로 작아지는 경향을 보이고 있으며, 30분 이상 처리한 경우에 비교적 균일한 칼슘포스페이트 박막이 형성되는 것을 볼 수 있다. 이러한 다공성의 칼슘포스페이트 박막구조는 전체적인 비표면적을 상당히 증가시켜 다량의 부착단백질이나 생체분자의 흡착을 유발할 수 있고, 그 만큼 조골세포가 상호 반응할 수 있는 부착단백질이나 생체분자가 증가되는 것이므로 뼈 재생을 더욱 촉진할 수 있다는 장점을 갖는다.
<2-3> XPS(X-ray photoelectron spectroscope) 분석
실시예 1에서 코팅 처리시간을 달리하여 실리카 유리 플레이트 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막의 화학적 조성을 XPS(VG microtech ESCA 2000, England)를 이용하여 분석하였다. 이때, XPS는 MgKα를 X-선 공급원으로 0 내지 700 eV 결합에너지 범위에서 분석하였고, XPS N1s 핵-수준 신호(core-level signal)는 칼슘포 스페이트 박막에 포함된 화학적 구성요소들, 특히 칼슘과 인산의 상대적인 양을 측정하는데 사용하였다. 이때, 표면 구성요소의 양은 몰 백분율로 계산하였다.
도 3의 그래프들은 실리카 유리 플레이트 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막을 형성하고 있는 화학적 성분들을 나타내는 XPS 광폭 주사 스펙트럼(XPS wide scan spectra)이다. 코팅 처리시간의 변화에 따라 O1s, O2s, C1s, Ca2s, Ca2p, P2s 및 P2p로 표시되는 피크들의 강도가 증가하였는데, 이들 중 Ca2s, Ca2p, P2s 및 P2p의 피크들은 칼슘과 인산을 나타내는 것으로 이들 피크의 증가는 실리카 유리 플레이트 표면에 칼슘포스페이트 박막이 형성되었음을 의미하는 것이다. 또한, 코팅 처리시간이 증가할수록 Ca2p와 P2p에 대한 피크 강도는 계속적으로 증가한 반면, C1s에 대한 피크 강도는 감소하였는데, 이는 코팅 처리시간에 따라 점차 박막의 두께가 증가하고 있음을 나타내는 것이다.
XPS 분석결과로부터 얻은 칼슘포스페이트 박막 구성원소들의 상대적인 양을 하기 표 1에 나타내었고, 이로부터 칼슘포스페이트 박막의 인산이온에 대한 칼슘이온(Ca/P)의 몰비를 계산하여 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112005013630440-pat00001
Figure 112005013630440-pat00002
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 코팅 처리시간의 증가에 따라 칼슘(Ca2p) 및 인산(P2p)의 양이 증가하여 점차 칼슘포스페이트 박막이 형성되고 있음을 알 수 있다. 칼슘포스페이트 박막의 특성은 주로 박막을 구성하고 있는 인산이온에 대한 칼슘이온(Ca/P)의 몰비를 사용하여 특정한다. 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 비교적 짧은 코팅 처리(15분 및 30분)에 의해 형성된 칼슘포스페이트 박막의 Ca/P 몰비는 하이드록시아파타이트(Ca/P=1.67)보다 낮았지만, 옥타칼슘포스페이트(octacalcium phosphate, OCP)(Ca/P=1.33)와 유사하였다. 코팅 처리시간이 60분 및 90분으로 증가함에 따라 Ca/P 몰비가 1.27 및 1.28로 감소하였지만, 건조시간이 증가하여도 1.28 이하로는 감소하지 않았다.
상기 결과들로부터, 본 발명에 의해 실리카 유리 플레이트 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막은 인체 뼈 조직과 같이 결정성이 상당히 낮았고 높은 친수성과 삼차원적 다공성 구조를 가짐을 확인하였다.
<실시예 3> 칼슘포스페이트 박막의 세포 부착, 증식 및 분화 유도효과
상기 실시예 1에서 실리카 유리 플레이트 표면에 형성된 칼슘포스페이트 박막이 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성을 가져 실제로 뼈의 인공대체물질이나 이식물의 표면 개질제로 사용될 수 있는지 확인하기 위해, 조골세포를 이용하여 칼슘포스페이트 박막의 세포 부착, 증식 및 분화 유도효과를 하기와 같이 조사하였다.
<3-1> 세포배양
세포 부착, 증식 및 분화 유도효과를 조사하기 위한 조골세포로 HOS(human osteosarcoma) 세포주를 사용하였다. 상기 HOS 세포주를 10% FBS(fetal bovine serum)와 0.5% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium)에 접종한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 계대배양시 세포를 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척한 후 10% 트립신-EDTA와 90% HBSS를 혼합한 용액으로 세포를 떼어낸 후 1,600 rpm으로 원심분리하여 세포를 분리하였다. 세포수를 세어 2×104개의 농도로 2 내지 3일간 계대배양한 후 세포수가 2×104개가 되었을 때 다시 계대 배양하였다.
<3-2> 세포 부착실험
실시예 1에서 칼슘포스페이트 박막이 30분 및 60분간 코팅된 실리카 유리 플레이트(12 ㎜, Fisher brand)에 상기 <3-1>에서 준비된 조골세포 배양액을 1×103 cells/㎖ 농도로 적가하고 37℃에서 2, 4 및 8시간 동안 방치하여 칼슘포스페이트 박막에 세포부착을 유도하였다. 상기 실리카 유리 플레이트에 부착된 세포를 600 ㎛ PBS(phosphate buffered saline)로 상온에서 3회 세척한 후 70% 냉각 에탄올 250 ㎕를 이용하여 상온에서 10분간 고정시켰다. 이를 다시 600 ㎕ PBS로 세척한 후 크리스탈 바이올렛 스톡 용액(crystal violet stock solution, Sigma C-6158)으로 상온에서 10분간 염색하고 DDW로 세척하였다. 세척한 실리카 유리 플레이트를 1% SDS 용액에 담가 10분간 교반한 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 570 ㎚에서 각각의 OD(optical density) 값을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 칼슘포스페이트 박막이 코팅되지 않은 대조군(CTL)에 비해 칼슘포스페이트 박막이 30분과 60분간 코팅된 실험군(CaP-30 및 CaP-60)에서 세포가 잘 부착되고 높은 성장률을 보임을 확인하였다. 그러나, 60분간 코팅한 실리카 유리 플레이트(CaP-60)보다는 30분간 코팅한 실리카 유리 플레이트(CaP-30)에서 세포의 성장률이 더욱 높았다. 상기 결과로부터, 본 발명의 방법에 따른 칼슘포스페이트 박막의 세포 부착 및 성장에 가장 적합한 코팅 처리시간은 30분으로, 코팅 처리시간이 증가할수록 추가적으로 부착되는 세포의 수는 오히려 감소함을 알 수 있었다.
<3-3> 세포 증식실험
증식실험은 MTT 분석 킷트(Sigma, CGD-1)와 CCK-9 세포수 측정 킷트(CCK-9 cell counting kit-9, Dojindo, CK04)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 3일 및 7일 간격으로 측정하였다. 칼슘포스페이트 박막이 30분 및 60분간 코팅된 실리카 유리 플레이트에 조골세포 배양액을 1×103 cells/㎖ 농도로 적가하고 37℃에서 3일 및 7일간 배양하였다. 배지를 제거한 후 실리카 유리 플레이트 표면에 부착된 세포를 MTT 용액과 배지를 1:9의 비율로 혼합한 용액 600 ㎕를 첨가하고 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 상기 혼합액을 제거한 후 실리카 유리 플레이트를 PBS로 세척하였다. 여기에 MTT 용매를 각각 200 ㎕씩 첨가하여 20분간 교반한 후 마이크로 플레이트 판독기를 이용하여 570 ㎚에서 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 배양 3일째까지는 칼슘포스페이트 박막이 코팅되지 않은 대조군(CTL)과 코팅된 실험군(CaP-30 및 CaP-60)에서의 세포 증식정도가 별다른 차이를 보이지 않았으나, 7일간 배양한 후에는 세포의 증식이 칼슘포스페이트 박막이 30분간 코팅된 실험군(CaP-30)에서 대조군에 비해 유의미하게 증가하였다. 칼슘포스페이트 박막이 60분간 코팅된 실험군(CaP-60)에서 대조군보다 낮은 증식효과를 나타내는 것은 칼슘이온과 인산이온의 몰비의 변화, 즉 칼슘포스페이트 결정의 화학적 구조의 변화 로 인한 구조적인 차이때문인 것으로 판단된다. 따라서 미세한 결정의 화학적 성질의 변화에 대해 세포의 반응은 매우 민감하다는 것을 알 수 있다.
<3-4> 세포 분화실험
분화실험은 ALP 킷트(alkaline phosphatase activity kit, Sigma, 104)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 4, 7 및 10일 간격으로 측정하였다. 칼슘포스페이트 박막이 코팅된 실리카 유리 플레이트에서 각각 4일, 7일 및 10일간 배양된 세포에 200 ㎕의 용혈 완충용액(lysis buffer)을 첨가하고 4℃에서 10분간 보관하였다. 알칼라인 완충용액과 스톡 기질용액(stock substrate solution)을 15 ㎖ 튜브에 각각 0.5 ㎖씩 첨가한 후 37℃ 항온조에 10분간 담가두었다. 4℃에 보관한 세포 용혈용액을 상기 튜브에 100 ㎕씩 넣고 37℃ 항온조에서 1시간 동안 보관하였다. 여기에 0.05 N NaOH를 각각 10 ㎖씩 첨가하고 표준용액과 함께 400 ㎚에서 OD 값을 측정하였다.
그 결과, 대조군에 비해 가장 우수한 분화활성을 나타낸 실험군은 칼슘포스페이트 박막이 60분간 코팅된 CaP-60으로, 도 6에 나타난 바와 같이, 대조군(CTL)에서 배양한 조골세포에 비하여 CaP-60에서 배양한 조골세포가 훨씬 높은 ALP 활성을 나타내었는데, 이는 본 발명에 따라 형성된 칼슘포스페이트 박막이 매우 우수한 뼈 재생성을 가지고 있음을 입증하는 것이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 다공성 칼슘포스페이트 박막 형성을 통한 표면 개질방법은 매우 간편하고 경제적이면서 인체 친화적으로 고체 표면에 저결정성 3차원 입체구조를 갖는 다공성 표면구조를 형성함으로써 인체삽입용 인공대체물질 또는 의료용 이식물의 표면이 우수한 생체적합성, 세포적합성 및 골전도성을 갖도록 개질하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

1) 칼슘이온용액과 인산이온용액을 각각 제조하는 단계;
2) 상기 칼슘이온용액, 인산이온용액을 혼합하여 칼슘과 인산의 이온농도가 각각 1 내지 3 mM 및 3 내지 5 mM이 되는 혼합이온용액을 제조하는 단계; 및
3) 상기 혼합이온용액을 이용하여 1 내지 20℃에서 5분 내지 24시간 동안 고체 표면에 핵을 형성한 다음, 1 내지 40℃에서 10분 이상 보관하여 다공성 칼슘포스페이트 박막을 형성하는 단계를 포함하는, 다공성 칼슘포스페이트 박막 형성을 통해 고체 표면을 개질하는 방법.
제 1항에 있어서,
단계 1)에서 칼슘이온용액의 농도는 0.1 내지 2 M이고, 인산이온용액의 농도는 0.1 내지 6 M인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
단계 2)에서 혼합이온용액은 칼슘이온용액:인산이온용액:증류수를 1:1:10 내지 1:1:1500의 부피비로 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1항에 있어서,
단계 3)에서 형성된 칼슘포스페이트 박막의 인산이온에 대한 칼슘이온의 몰비가 1:1.27 내지 1:1.36인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,
단계 3) 전에 혼합이온용액을 기공 사이즈(pore size)가 0.25 ㎛ 이하인 필터를 이용하여 여과하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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