KR20020017088A - 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 우골 분말 - Google Patents

Abstract

본 발명은 칼슘 포스페이트(calcium phosphate) 초박막 코팅(coating)된 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P deproteinated bovine bone powder, Ca-P BBP)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 결함이 있는 골조직 치료시 골이식 대체제로 이용되는 무기질 이종골인 탈단백 우골 분말을 칼슘 염(calcium salt) 및 포스페이트 염(phosphate salt)을 이용한 과포화 칼슘 포스페이트 용액으로 초박막 코팅하여 신생골 형성능력 및 골개조 능력이 우수한 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P BBP)에 관한 것이다. 본 발명의 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P BBP)은 생체 반응성이 뛰어나고 반응 표면적이 넓어 우수한 신생골 형성능력 및 골개조 능력을 가진 생체 적합성 골이식 대체재로서 골결손 조직을 치유하기 위한 치과수술, 외상, 정형, 악골안면 및 하학골 외과수술 및 수의학 외과수술 등에 골이식 대체재로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 우골 분말{Deproteinated bovine bone powder coated by calcium phosphate thin film}

본 발명은 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 Ca-P BBP에 관한 것으로, 보다 상세하게는 결함이 있는 골조직 치료시 골이식 대체제로 이용되는 무기질 이종골인 탈단백 우골 분말을 칼슘 염 및 포스페이트 염을 이용한 과포화 칼슘 포스페이트 용액으로 초박막 코팅하여 신생골 형성능력 및 골개조 능력이 우수한 Ca-P BBP에 관한 것이다.

칼슘 포스페이트 결정(calcium phosphate crystal)은 생체 적합성(biocompatibility)이 있는 것으로 알려져 있다. 그 중에도 인회석 결정(apatite crystal)은 유일하게 생체 석회화 조직에 존재하는 것으로서(Kim, H. M.et al., J. Bone-Miner. Res., 10, 1589-1601, 1995; 미국 특허 제 5,565,502호; 및 미국 특허 제 5,691,397호), 골이식 대체재로 이용되어 왔다. 또한, 인회석 결정은 금속 등으로 만들어진 생체 재료의 표면에 인회석 결정 막을 형성시키고 조직과 접촉시켜 조직의 적합성을 높이기 위해서 사용되거나 이를 위한 고체 입자로도 널리 사용되어 왔다(Greesink, R. G. T.et al., Clin. Orthop. Relat. Res.,261, 39-58, 1990; Dunn, M. G. and Maxian, S. H., J.Long Term Effect. Med. Implants,1, 193-203, 1992).

칼슘 이온, 포스페이트 이온 및 히드록시 이온으로 구성되어 있는 순수한 수산화 인회석 결정은 긴 막대기같은 구조가 배열되어 있는 화학량론적인(Stoichiometric) 결정으로서 결정도가 높다. 반면, 골 또는 석회화연골 조직(calcified cartilage)으로부터 분리된 생체결정(biocrystal)은 비화학량론적인(nonstoichiometric) 인회석으로서 결정도가 낮다(Elliott, J. C.et al., Studies in Inorganic Chemistry,18, 111-190, 1994). 생체결정은 크기가 매우 작은 얇은 판(thin plate) 구조의 나노크리스탈(nanocrystal)(골의 경우 27.3 X 15.8 nm, 석회화 연골조직의 경우 103 X 68 nm; 길이 X 넓이)로서, 반응 표면적(specific surface)이 매우 넓기 때문에 생체결정 표면의 반응성이 높아 대사 활성(metabolic activity)을 나타낸다(Kim, H. M.et al., J. Bone-Miner. Res.,10, 1589-1601, 1995; Posner A. S.et al.,Skeletal Research: An Experimental Approach, Academic Press: New York, 167-192, 1979).

상기와 같은 생체결정과 유사한 나노크리스탈 결정을 가진 막에 대한 연구결과 칼슘 포스페이트 초박막이 개발되었는데, 상기 칼슘 포스페이트 초박막은 온도를 낮추거나, 이에 더하여 선택적으로 적절한 완충 시스템을 선택함으로써 수용액 내에서 칼슘 포스페이트 결정의 침전 반응을 억제시켜 제조된 고농도의 칼슘 이온 및 포스페이트 이온의 과포화 용액을 이용하여 짧은 시간내에 형성된 나노크리스탈 결정을 가진 초박막으로 생체 반응성이 우수하고 결정도가 낮아 품질이 뛰어난 생체 적합성 초박막이다(한국 특허: 제 98-38553호).

한편, 골은 살아있는 조직으로서 파골세포에 의해 기존 골조직이 흡수되면 조골세포가 새로운 골조직을 형성하여 재흡수된 골과 새로 조성된 골사이에서 항상 균형이 유지되는 골개조(bone remodeling) 능력을 가지고 있다. 이러한 골개조 능력을 이용하여 결손된 골조직 치유를 위한 골이식 또는 골대체술을 개발하고자 하는 노력이 진행되어 왔다.

골이식 또는 골대체는 1800 년대 초에 처음 과학적으로 공지된 후 현재까지 상당한 발전이 이루어진 분야로서, 이 분야에 이용되는 골이식 대체재란 여러 가지 치과질환 또는 정형외과적 질환으로 인하여 골조직의 결손부가 생긴 경우 이를 대체하고 신생골의 형성을 촉진시키기 위하여 사용하는 이식재이다. 골대체재에는 자가골, 동종골, 이종골 및 합성골 등이 있는데, 이중 자가골은 일반적으로 가장 이상적인 골이식 대체재이나 이차적인 수술이 필요하고 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들 뿐만 아니라 일반 개인의원에서 시술하기가 어렵다는 단점을 가지고 있다.

동종골은 같은 종의 골조직으로부터 떼어낸 이식재로서 골 형성 가능성이 높은 것으로 보고되고 있으나, 동종골을 제조한 조직은행에 따라 골형성능에 있어서 심한 차이를 보이고 동일한 조직은행에서 제조한 것이라도 골형성능에 서로 차이가 있음이 보고되고 있다. 또한, 동종골은 조작이 쉽지 않고 질환 보유자로보터 채취한 골의 감염여부가 논란이 되고 있다.

합성골로는 하이드록시아파타이트(hydroxyaptite), 트리칼슘 포스페이트(tricalcium phosphate), 칼슘 카보네이트(calcium carbonate) 등이 널리 이용되고 있으나 그 성분이나 구조에 있어서, 뼈와 근접한 특히, 인골에 가까운 물질이 아니므로 생체가 잘 인식하지 못한다.

이종골은 다른 종의 골조직으로부터 떼어낸 이식재로서 쥐 실험 결과 면역 반응을 일으키지 않는 골전도성 물질로 보고되어 있는데(Cohen R. E.et al., J.Periodontol.,65, 1008-1015, 1994; Specter, M.et al., Clin Oral Implants Res.,6, 155-163, 1995), 상기 골전도성 물질이란 일종의 수동적 기질로서 작용하는 이식재로 그 위를 덮어주어서 신생골의 발생을 유도하는 격자 울타리 또는 뼈대 역할을 하는 것이다. 대표적으로 탈단백 무기질 골이 사용상의 편리성 및 채취의 용이성을 갖춘 골전도성 물질로서 사용되고 있는데, 특히 최근에 개발된 탈단백 우골 분말은 신생 층판골과 치밀하게 접촉하여 이식재의 흡수성을 나타내고 다른 골이식 대체제에 비하여 우수한 신생골 형성능력을 가지는 골전도성 물질로 보고되었다(Klinge, B.et al., J. Oral. Maxillofac. Surg.,50, 241-249, 1992). 상술한 이점에도 불구하고 기존 탈단백 우골 분말은 이식재 주변에 둘러쌓인 결합조직으로 인하여 신생골 형성효과가 미약하다는 단점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 신생골 형성 효과가 뛰어난 생체 적합성 탈단백 우골 분말을 개발하기 위해 노력한 결과, 탈단백 우골 분말에 칼슘 염 및 포스페이트 염을 이용한 과포화 칼슘 포스페이트 용액으로 초박막 코팅 처리하여 Ca-P BBP를 제조하고 상기 Ca-P BBP가 생체내에서 뛰어난 신생골 형성효과 및 골개조 능력을 나타내는 생체 적합성 골이식 대체재임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신생골 형성능력 및 골개조 능력이 우수한 생체 적합성 Ca-P BBP를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 칼슘 포스페이트 초박막으로 코팅된 칼슘-인 탈단백 우골 분말(이하 "Ca-P BBP"라 약칭함)의 표면을 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 2는 기존의 탈단백 우골 분말의 표면을 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 3은 12 시간 동안 흔들어주면서 칼슘 포스페이트 초박막 코팅하여 제조한 본 발명의 Ca-P BBP의 단면을 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 4는 12 시간 동안 흔들어주지 않고 칼슘 포스페이트 초박막 코팅하여 제조한 본 발명의 Ca-P BBP의 단면을 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 5는 발치와 치유시 골이식 대체재를 이식하지 않은 외과적 처치한지 4 주 후의 치아를 현미경으로 관찰한 사진이고,

A: 발치와 내의 상피의 개입

B: 발치와 주변의 결합조직

도 6은 발치와 치유시 골이식 대체재를 이식하지 않은 외과적 처치한지 8 주 후의 치아를 현미경으로 관찰한 사진이고,

A: 발치와 상부의 교원섬유

B: 교원섬유 내의 작은 혈관

도 7은 발치와 치유시 골이식 대체재로 기존 탈단백 우골 분말을 이용하여 외과적 처치한지 4 주 후의 치아를 현미경으로 관찰한 사진이고,

A: 기존의 치간골

B: 골이식 대체재 주변의 결합조직

도 8은 발치와 치유시 골이식 대체재로 기존 탈단백 우골 분말을 이용하여 외과적 처치한지 8 주 후의 치아를 현미경으로 관찰한 사진이고,

A: 치간골 근처의 골이식 대체재 주변

B: 교원섬유 배열

도 9는 발치와 치유시 골이식 대체재로 본 발명의 Ca-P BBP을 이용하여 외과적 처치한지 4 주후의 치아를 현미경으로 관찰한 사진이고,

A: 발치와 내

B: 골이식 대체제 주변

도 10은 발치와 치유시 골이식 대체재로 본 발명의 Ca-P BBP을 이용하여 외과적 처치한지 8 주 후의 치아를 현미경으로 관찰한 사진이고,

A: 발치와 내

B: 골이식 대체제 주변

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탈단백 우골 분말에 칼슘 염 및 포스페이트 염을 이용한 과포화 칼슘 포스페이트 용액으로 초박막 코팅된 Ca-P BBP를 제공한다.

본 발명에서 이용된 우골 분말은 한우 송아지골을 처리하여 만든 골이식재료로 해면골이어서 구조적으로 신생골 형성이 유리하고 면역반응이 적으며 생체적합성이 우수하여 치아나 인공치근 주위와 같은 압박력을 견뎌내야 할 골결손 부위에 사용되도록 만들어진 이식용 골분말 재료이다.

본 발명자들은 상기 우골 분말에 하기와 같은 방법으로 칼슘 포스페이트 초박막 코팅을 실시하였다.

먼저, 본 발명자들의 기존 특허출원(한국 특허 제 10-1999-038528호)에 기재된 방법에 따라 과포화 칼슘 포스페이트 용액을 제조한 후 이를 이용하여 우골 분말에 초박막 코팅을 수행하였다.

본 발명에서 이용한 칼슘 포스페이트 초박막 코팅방법은

1) 칼슘포스페이트 결정 또는 칼슘 염과 포스페이트 염을 산 용액에 용해시킨 후 고농도의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 용액을 제조하는 단계(단계 1);

2) 상기 고농도의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 용액을 낮은 온도에서 알카리 용액과 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계(단계 2);

3) 상기 혼합액으로부터 침전 반응(nucleation) 및 결정 성장의 핵으로 작용할 수 있는 무형(amorhpous) 칼슘 포스페이트 과립(particle) 또는 결정을 제거하여 칼슘 포스페이트 초박막 코팅 용액을 제조하는 단계(단계 3); 및

4) 탈단백 우골 분말에 상기 칼슘 포스페이트 초박막 코팅 용액을 적용하여 탈단백 우골 분말 표면에 칼슘 포스페이트 초박막을 형성시키는 단계(단계 4)로 이루어진다.

단계 1을 구체적으로 설명하면, 과포화 칼슘 포스페이트 용액의 제조를 위해 어떠한 종류의 칼슘 염과 포스페이트 염이라도 모두 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 어떤 종류의 칼슘 포스페이트 결정이라도 모두 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 칼슘 포스페이트 결정은 당업계에 공지된 인공 합성 방법에 의해 얻어지는 것일 수 있다. 예를 들면, C. Rey 등의 문헌(Calcif.Tissue Int., 45, 157-164, 1989; Calcif.Tissue Int., 46, 157-164, 1990)에 공지된 바와 같이, Ca(NO₃)₂·4H₂O을 증류수에 녹인 용액과 (NH₄)₂HPO₄과 암모니아수를 증류수에 녹인 용액을 급속히 혼합하여 여과하고 냉동 건조시키거나 CaCl₂·2H₂O와 KH₂PO₄를 사용하여 인회석을 얻을 수도 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 인회석 결정은 뼈조직에서 분리할 수도 있다(Kim, H.M.et al., J. Bone Miner. Res., 10, 1589-1601, 1995). 인공 합성된 칼슘 포스페이트 결정을 이용하는 경우는, 용액 내에 포함되는 이온의 종류를 칼슘 이온, 포스페이트 이온, 탄산 이온 등 결정을 구성하는 이온만으로 제한시킬 수 있다는 장점이 있다. 또한, 석회화 조직을 산 용액으로 탈회하여 제조된 용액을 즉시 단계 2에 사용할 수도 있다. 상기 칼슘 포스페이트 결정을 용해시키기 위해 사용되는 산 용액은 어떤 종류의 산을 사용하여 제조해도 무방하다. 예를들면, N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산](N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2'-ethanesulfonic acid]), N-트리스-[히드록시메틸]메틸-2-아미노에탄설폰산(N-tris-[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonic acid), 1,4-피페라진디에탄설폰산(1,4-piperazinediethanesulfonic acid), (3-N-모르포리노)프로판설폰산((2-N-morpholino)propanesulfonic acid), 아세트산과 같은 통상적인 유기산, HCl, HBr, HI, H₂SO₄, H₃PO₄, HNO₃, H₂CO₃와 같은 무기산 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 바람직하기로는 HCl과 N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산]을 사용하는 것이 바람직하다. 칼슘 포스페이트 결정은 알칼리 용액과 혼합된 용액 상태에서 결정 침전물의 형성이 가능한 농도 이상으로 용해시킨다.

단계 2를 구체적으로 설명하면, 낮은 온도로 인하여 용액내 칼슘 포스페이트의 동종 핵형성(homogeneous nucleation)이 억제되고, 이로 인하여 자유 이온이 손실되지 않으므로 이후 칼슘 포스페이트 박막의 형성에 사용될 수 있다. 또한, 적절한 완충 시스템을 사용함으로써 이러한 억제 효과를 더욱 증진시킬 수 있다.

단계 3을 구체적으로 설명하면, 무형 칼슘 포스페이트 과립의 석출을 위하여 알칼리 용액을 칼슘 포스페이트가 용해되어 있는 산 용액에 첨가한다. 이때, 용액내 칼슘 포스페이트의 침전 반응을 억제하여 자유 이온을 고농도로 유지시키기 위해서는 두 용액의 온도 및 반응 온도를 낮게 유지시켜야 한다. 바람직하기로는 온도를 0∼37℃로 하는 것이 바람직하다.

상기 알칼리 용액을 제조하기 위해서는 NaOH, KOH, LiOH, Ca(OH)₂, Mg(OH)₂, NH₄OH와 같은 통상적인 무기 염기, 트리스[히드록실메틸]아미노메탄(tirs[hydroxy-

methyl]aminomethane), 비스[2-히드록시에틸]이미노트리스[히드로메틸]메탄(bis[2-

hydroxyethyl]aminotris[hydroxymethyl]methane), 1,3-비스[트리스 (히드록시메틸)메틸아미노]프로판(1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propane)과 같은 유기 염기 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 이 때, 유기 염기는 원하는 pH 범위에 따라 각 염기의 완충 허용 범위를 고려하여 선택한다. 또한, 과포화 칼슘 포스페이트 이온 용액의 제조가 가능한 경계가 되는 온도는, 무기 염기를 사용할 때보다 유기 염기를 사용할 때 더 높다.

또한, 알칼리 용액은 전체 혼합 용액의 pH가 6.0∼8.0이 되도록 첨가하고, 더욱 바람직하게는 pH 7.0∼7.6이 되도록 첨가한다. 칼슘 포스페이트 결정은 pH에 따라서 형성되는 결정학적 특성이 달라진다. 따라서, pH를 조절함으로써 원하는 종류의 결정을 얻을 수 있다. 디칼슘 포스페이트 이수화물 결정(dicalcium phosphate dihydrate crystal)을 제조하기 위한 이온의 과포화 용액은 pH를 6.0∼6.5로, 옥타칼슘 포스페이트 결정(octacalcium phosphate crystal)을 제조하기 위해서는 pH를 6.5∼6.8로, 생체재료로서 널리 쓰이고 있는 인회석 결정 막을 제조하기 위해서는 pH를 6.8∼8.0으로 조절한다.

상기 용액을 사용하여 균일한 표면을 갖는 인회석 막을 형성하기 위해서는용액내에 생성된 무형 칼슘 포스페이트 과립을 제거해야 한다. 알칼리 용액으로 중화시킨 용액에 포함된 무형 칼슘 포스페이트 과립은 통상적으로 사용되는 여과법이나 원심 분리법으로 제거된다. 필터를 사용하는 여과법을 실행하면, 용액 중의 세균(microbe)을 동시에 제거할 수 있기 때문에 후에 별도로 멸균하지 않아도 되는 장점이 있다.

본 발명에서 이용되는 과포화 칼슘 포스페이트 용액의 이온 농도는 반응 조건에 따라 이온적이 6.0∼30.0 mM²[Ca²⁺]x[HPO₄ ^2-]이다. 상기 과포화 칼슘 포스페이트 용액에서 이온 농도는 동종 핵형성(homogeneous nucleation)에 의해 침전물을 형성할 수 있을 정도로 높으나, 제조 단계에서 온도를 낮춤으로써 침전물 또는 결정의 형성이 억제된다. 그러나, 과포화 칼슘 포스페이트 용액을 고체 표면과 접촉시키면 이러한 핵형성 억제 작용에 영향을 받지 않는 이형 핵형성(heterogenous nucleation)에 의해 표면에 결정이 형성되고 부착되어 성장할 수 있다. 본 발명에서 이용한 칼슘 포스페이트 용액내 자유 이온의 농도는 매우 높기 때문에 낮은 온도에서도 이형 핵형성에 의해 쉽게 결정을 형성될 수 있으며, 전하량이 작은 표면 상태에서와 같이 높은 에너지가 필요한 조건에서 조차도 이형 핵형성에 의해 결정이 쉽게 형성될 수 있다.

단계 4를 구체적으로 설명하면, 박막 형성시 온도는 0∼60℃로 하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는, 고체 표면 위에 결정이 형성되는 초기 단계에는 온도를 0∼37℃로 하고, 이후 이 결정을 증식 및 성숙시키는 단계에는 0∼60℃로하는 것이 좋다. 또한, 결정이 형성되는 초기 단계의 반응시간은 2 내지 72 시간이고 결정을 증식 및 성숙시키는 단계의 반응시간은 5 내지 24 시간이 바람직하다.

상술한 칼슘 포스페이트 초박막 코팅방법으로 탈단백 우골 분말의 표면에 형성된 칼슘 포스페이트 초박막은 두께가 20 내지 50 nm이고 결정의 크기가 균일하며 안정된 구조를 가지고 있는 인회석 결정 박막으로서 생체내 골 인회석과 유사한 낮은 결정도를 가지고 있어 생체 반응성이 뛰어나고 결정 크기가 극도로 작아서 반응 표면적이 넓기 때문에 인회석 결정의 표면 반응성이 높아져 세포 또는 유기 환경하에서 상호작용이 가능하다. 또한, 상기 칼슘 포스페이트 초박막은 파골세포에 의해 제거가능하므로 칼슘 포스페이트 초박막 코팅층을 가진 본 발명의 Ca-P BBP는 파골세포 및 조골세포에 의해 골개조 될 수 있는 생체 적합성 골이식 대체제이다.

상기와 같은 특성을 가진 칼슘 포스페이트 초박막 코팅층을 가지고 있기 때문에 본 발명의 Ca-P BBP는 코팅되지 않은 기존의 탈단백 우골 분말에 비하여 결정도가 낮고 결정 크기가 작은 균일한 표면을 가지고 있어 반응 표면적이 넓은데, 이러한 특징은 흔들주지 않고 박막을 형성한 Ca-P BBP 표면보다 흔들면서 박막을 형성한 Ca-P BBP 표면에서 더 잘 나타나 있다(도 1내지도 4참조).

따라서, 본 발명의 Ca-P BBP는 생체 반응성이 우수하고 파골세포에 의해 제거되어 골개조를 유도할 수 있는 칼슘 포스페이트 초박막 코팅층이 있어 우수한 생체 적합성을 가진다.

본 발명자들은 동물을 이용한 생체내 실험에 본 발명의 Ca-P BBP를 적용하여신생골의 형성정도, 골 밀도,골 흡수 및 결함이 있는 골조직 치유능력을 조사한 결과, 본 발명의 Ca-P BBP를 골이식 대체제로 적용한 경우에 골이식 대체제를 적용하지 않은 대조군과 기존의 탈단백 우골 분말을 골이식 대체제로 적용한 경우보다 신생골 형성능력이 매우 향상되었고 우골 분말 주위의 신생골주들이 서로 연결되어 성숙골이 형성되는 골개조 현상이 나타났으며 일부 골분말에서는 골 밀도를 장기간 동안 고밀도로 유지시킬 수 있어 생리적인 흡수에 대한 저항성을 가지고 있었다(도 5내지도 9참조). 또한, 본 발명의 Ca-P BBP에서 형성된 신생골은 기존의 탈단백 우골 분말에서 형성된 신생골보다 빠른 시간내에 성숙골로 대체되었으나 기존의 탈단백 우골 분말에서는 간혹 연골증식이 관찰되기도 하였다(도 10참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 Ca-P BBP의 제조

<1-1> 과포화 칼슘 포스페이트 용액의 제조

우골 분말에 칼슘 포스페이트 초박막 코팅을 하기 위하여, 본 발명자은 하기와 같은 과포화 칼슘 포스페이트 용액을 제조하였다.

Ca(NO₃)₂·4H₂O 17.7 mg을 증류수 250 ㎖에 용해시킨 칼슘 이온 용액과 (NH₄)₂·HPO₄40 mg과 암모니아수 1 ㎖을 증류수 500 ㎖에 용해시킨 포스페이트 이온 용액을 급속히 혼합하여 여과한 후 냉동건조시켜 인회석 결정을 합성하였다. 인회석 결정 400 mg을 0.2 M HCl 40 ㎖에 용해시켜 칼슘 이온과 포스페이트 이온을 포함하는 산성 이온 용액을 제조하였다. 상기 산성 이온 용액을 0.2 M HCl 용액으로 희석하여 칼슘 포스페이트의 농도가 15%인 용액을 제조한 후 이 용액을 0.2 N NaOH 용액과 혼합하고 교반하여 pH 7.4의 이온 용액을 제조하였다. 상기에서 모든 용액의 온도는 4℃로 유지하였다. 이 때, 무형 칼슘 포스페이트가 급속히 형성되었으나, 온도를 낮추었기 때문에 무형 칼슘 포스페이트 과립의 형성에 참여하지 않은 자유 이온이 남았으며, 석출된 결정의 양은 서서히 감소하여 평형을 이루었다. 상기 이온 용액을 4℃에서 10 분간 방치한 후 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 생성된 무형 칼슘 포스페이트를 제거하여 중화 이온 완충용액(neutralized ionic buffer solution)을 제조하였다.

상기 완충용액에 대하여 원자 흡수 스펙트럼법(Atomic Absorption Spectrophotometry, Perkin Elmer, USA)과 비색검출법(colorimetric method, Bartlett GDet al.,J. Biol.Chem.,234, 466-468, 1959)으로 측정한 결과, 이온 농도적이 15 내지 20 mM²[Ca²⁺]X[HPO₄ ^2-]로서 과포화 용액이 제조된 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 얻어진 과포화 용액은 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

<1-2> 칼슘 포스페이트 초박막 코팅

실시예 <1-1>에서 제조된 과포화 용액을 이용하여 우골 분말에 칼슘 포스페이트 초박막 코팅을 수행하였다.

먼저, 우골 분말(BBP^TM, Oscotec Co.) 20 mg을 포함하는 5 ㎖ 튜브(tube)에 3 ㎖의 상기 과포화 용액을 첨가한 후 이를 8℃로 유지되는 항온조에서 2 내지 72 시간 동안 코팅시켰다. 이 때, 실험을 두 조로 나누어 실시하였는데, 한 조는 흔들어주면서 코팅하고 다른 조는 흔들어주지 않으면서 코팅하였다. 이 후 온도를 37℃까지 올리고, 이 온도에서 5 내지 24 시간 더 코팅하였다. 코팅하는 전과정은 무균실(cleen room)에서 저온상태를 유지하면서 실시되었고 코팅이 종결된 후 증류수를 이용하여 1 회 이상 반복 세척하고 무균대(cleanbench) 내에서 1 시간 이상 건조한 다음 (주)그린피아에서 방사선(γ-ray)으로 멸균하였다.

상기와 같이 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 우골 분말과 코팅되지 않은 우골분말을 주사 전자 현미경(SEM: 840A, JEOL, 일본) 하에서 관찰하고 표면을 10,000 배로 확대한 SEM 사진을 얻었다. 상기 SEM 사진에서 알 수 있는 바와 같이, 칼슘 포스페이트 초박막을 코팅하지 않은 우골 분말의 표면은 결정의 크기가 크고 균일하지 않았으며 반응 표면적이 좁았다(도 2). 반면, 본 발명의 칼슘-인 우골 분말에 코팅된 칼슘 포스페이트 초박막은 결정의 크기가 극도로 작고 균일하여 반응 표면적이 넓으면서 안정된 구조를 가지고 있었다(도 1).

한편, 흔들어주면서 칼슘 포스페이트 초박막을 형성시켰을 경우에는 흔들지 않고 칼슘 포스페이트 초박막을 형성시켰을 경우 보다 단시간에 우골 분말 표면 전체적가 코팅되어 결정의 크기가 더 작고 균일하고 반응 표면적이 더 넓으면서 안정된 구조를 가지고 있었다(도 3및도 4).

<실험예 1> 칼슘-인 우골 분말의 발치와 치료효과 측정

칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 본 발명의 칼슘-인 우골 분말의 골조직 치료효과를 기존 우골 분말의 골조직 치료효과와 비교하기 위하여, 본 발명자들은 상기 칼슘-인 우골 분말 및 기존 우골 분말을 골이식 대체재로 이용하여 골결손과 관련된 치주질환으로 인한 발치와 치료효과를 측정하였다.

구체적으로, 실험에 사용한 동물은 전신적으로 건강하여 치주조직에 염증이 없는 생후 13 개월 내지 16 개월 된 체중 15 kg 내외의 비글개(beagle dog) 5 마리를 사용하였으며, 송아지 뼈에서 추출한 이종골로 제조된 기존의 탈단백 우골 분말인 바이오-오스(Osteohealth Co., USA)와 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 본 발명의 칼슘-인 우골 분말을 골이식 대체제로 사용하여 발치와 치료효과를 비교하였다.

먼저, 실험동물에 케타민(Ketamine) HCl(Ketalar, 유한양행, 한국) 0.2 ㎖/kg을 근육 주사하여 진정시킨 후 5% 포도당 주사액(100 cc/시간, IV)을 외과적 시술이 끝날 때까지 투여하였다. 마취 상태를 유지하기 위하여 케타민 HCl(0.1 ㎖/kg, IV)과 자일라진(Xylazine) HCl(Rompun, 한국 바이엘, 0.1 ㎖/kg, IM)을 평균 20 분 간격으로 번갈아 투여하였다.

상기와 같은 방법으로 준비된 실험동물의 하악 전치 부위에 2% 리도케인(Lidocaine) HCl(Epinephrine 1:80,000)로 침윤 마취시킨 후 하악 우측 견치에 인접한 절치를 발치겸자를 사용하여 조심스럽게 발거하고 치아를 한 개씩 건너서 동일한 방법으로 두 개의 치아를 더 발치하였다. 형성된 세 개의 발치와중 우측 발치와는 이식을 하지 않는 대조군으로 하고 중간 발치와에는 기존의 탈단백 우골 분말인 바이오-오스(Bio-Oss)를 이식하였으며, 좌측 발치와에는 본 발명의 칼슘-인 우골 분말을 이식한 후 크로믹 켓것(chromic catgut)을 이용하여 봉합하였다.

상기와 같은 외과적 수술처치를 한지 4 주 후에 3 마리, 8 주 후에 2 마리를 각각 전신 마취하여 희생시킨 후 pH 7.4 인산염 완충용액(phosphate buffer)을 이용한 2% 파라포르알데하이드(paraformaldehyde)와 2.5% 글루타르알데하이드(glu

-taraldehyde)의 혼합액으로 두부를 관류고정시키고 실험부위의 치아, 골, 상부 연조직을 적출하여 상기 혼합액으로 다시 고정하였다. 고정된 치아, 골, 상부 연조직을 물로 수세하고 알코올(graded alcohol)로 탈수시킨 후 5% 질산을 이용하여 탈회하고 통상의 방법에 따라 파라핀(parafin)에 포매하여 발치와 상부를 교합면에 평행하게 4 ㎛ 두께의 절편을 연속적으로 제작하였다. 상기 절편을 Gomori 등의 트리크롬(trichrome)방법(Masson, P.et al.,J. Tech. Method. 12, 75-90, 1929)으로 염색한 후 광학 현미경 하에서 관찰하였다.

그 결과, 골이식 대체재를 사용하지 않은 대조군에서는 이식을 한지 4 주 후에 발치와 내로 상피의 개입이 관찰되었고 발치와는 결합조직으로 채워져 있었으며 결합조직내에 확장된 혈관이 관찰된 반면, 발치와에 인접한 부분에서의 치간골 및 신생골 형성은 관찰되지 않았다(도 5). 또한, 이식한지 8 주 후에도 대조군에서는신생골 형성이 관찰되지 않았으며, 불규칙한 교원섬유 다발과 작은 혈관들이 관찰되었다(도 6).

기존 탈단백 우골 분말인 바이오 오스를 골이식 대체재로 사용한 실험군에서는 이식한지 4 주 후에 상피의 개입없이 발치와가 치유되고 있었고 골이식 대체재는 흡수되지 않으면서 세포성분이 많은 결합조직에 의해 둘러싸여 있었으며, 대조군에서 관찰되지 않은 치간골이 치아주변에 관찰되었고 기존 골에서부터 약간의 신생골 형성이 보였으나 이식재 주변에서는 신생골 형성이 관찰되지 않았다(도 7). 또한, 이식한지 8 주 후에도 치간골 및 규칙적인 교원섬유다발이 보였고 기존 골 근처에서 소량의 신생골과 이 부위의 이식재에서 융합이 유발되었으나 대부분은 신생골 형성이 저조하였으며 부분적으로 골이식 대체재에서 연골 증식이 관찰되기도 하였다(도 8).

반면, 20 내지 50 nm의 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 본 발명의 Ca-P BBP을 골이식 대체재로 이용한 실험군에서는 이식한지 4 주 후에 발치와에 상피의 개입 없이 치유가 되었고 본 발명의 Ca-P BBP은 흡수되지 않으면서 상기 Ca-P BBP 주변으로 염증세포 개재없이 많은 신생골 형성이 관찰되었다(도 9). 또한, 이식한지 8 주 후에는 본 발명의 Ca-P BBP 주변에 혈관들이 보였고 신생골 및 기존골 근처에서 직접 연결되기도 하였으며, 신생골이 더 많이 관찰되었고 이들이 서로 연결되어 성숙골이 형성되는 골개조 현상이 관찰되었다(도 10).

상기의 결과로부터, 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 본 발명의 Ca-P BBP은 기존의 탈단백 우골 분말보다 신생골 형성능력 및 골개조 능력이 우수한 생체 적합성 골이식 대체재임을 확인하였다.

본 발명의 칼슘 포스페이트 초박막 코팅된 Ca-P BBP은 생체 반응성이 뛰어나고 반응 표면적이 넓은 칼슘 포스페이트 초박막(20 내지 50 nm) 코팅 처리되어 신생골 형성능력 및 골개조 능력이 우수하고 신생골이 형성되는 기간 동안 생체내에서 흡수되지 않는 생체 적합성 골이식 대체재이므로 골결손 조직을 치료하기 위한 치과수술, 외상, 정형, 악골안면 및 하학골 외과수술 및 수의학 외과수술 등에 골이식 대체제로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (10)

1. 칼슘 포스페이트 초박막(calcium phosphate thin film) 코팅(coating)층을 가진 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P deproteinated bovine bone powder, Ca-P BBP).
2. 제 1항에 있어서, 칼슘 포스페이트 초박막은 20 내지 50 nm의 두께인 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P BBP).
3. 제 1항에 있어서,

   1) 칼슘포스페이트 결정 또는 칼슘 염과 포스페이트 염을 산 용액에 용해시킨 후 고농도의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 용액을 제조하는 단계(단계 1);

   2) 상기 고농도의 칼슘 이온과 포스페이트 이온 용액을 낮은 온도에서 알카리 용액과 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계(단계 2);

   3) 상기 혼합액으로부터 침전 반응(nucleation) 및 결정 성장의 핵으로 작용할 수 있는 무형(amorhpous) 칼슘 포스페이트 과립(particle) 또는 결정을 제거하여 칼슘 포스페이트 초박막 코팅 용액을 제조하는 단계(단계 3); 및

   4) 탈단백 우골 분말에 상기 칼슘 포스페이트 초박막 코팅 용액을 적용하여칼단백 우골 분말 표면에 칼슘 포스페이트 초박막을 형성시키는 단계(단계 4)로 이루어지는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P BBP).
4. 제 3항에 있어서, 산 용액과 알카리 용액의 온도 및 단계 2의 반응온도는 0 내지 37℃인 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P BBP).
5. 제 3항에 있어서, 단계 1의 산 용액은 HCl, HBr, HI, H2SO4, HNO3 및 H2CO3으로 이루어진 군에서 선택되는 무기산, N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-[2-에탄설폰산](N-[2-hydroxyethyl]piperazine-N'-[2'-ethanesulfonic acid]), N-트리스-[히드록시메틸]메틸-2-아미노에탄설폰산(N-tris-[hydroxymethyl]methyl-2-amino

   ethanesulfonic acid), 1,4-피페라진디에탄설폰산(1,4-piperazinediethanesulfonic acid), (3-N-모르포리노)프로판설폰산((2-N-morpholino)propanesulfonic acid) 및 아세트산으로 구성되는 군에서 선택되는 유기산 또는 그들의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P).
6. 제 3항에 있어서, 단계 2의 알칼리 용액은 NaOH, KOH, LiOH, Ca(OH)2,Mg(OH)2, NH4OH으로 구성되는 군에서 선택되는 무기 염기, 트리스[히드록실메틸]아미노메탄(tirs[hydroxy-methyl]aminomethane), 비스[2-히드록시에틸]이미노트리스[히드로메틸]메탄(bis[2-hydroxyethyl]aminotris[hydroxymethyl]methane),1,3-비스[트리스(히드록시메틸)메틸아미노]프로판(1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]

   propane)으로 구성되는 군에서 선택되는 유기 염기 또는 그들의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P).
7. 제 3항에 있어서, 단계 2에서 알칼리 용액을 첨가하여 용액의 pH를 6.0 내지 8.0으로 하는 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P).
8. 제 3항에 있어서, 단계 3에서 무형 칼슘 포스페이트 과립 또는 결정은 다공성 필터를 사용하는 필터법 또는 원심분리법으로 제거하는 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P).
9. 제 1항에 있어서, 골결손 조직을 치유하기 위한 골이식 대체제로서의 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P BBP).
10. 제 4항에 있어서, 골이식 대체제는 치과수술, 외상, 정형, 악골안면 및 하학골 외과수술 및 수의학 외과수술에 이용되는 것을 특징으로 하는 칼슘-인 탈단백 우골 분말(Ca-P BBP).