PT1530972E - Uso de agentes biológicos parasitários para prevenção e controlo - Google Patents

Description

ΡΕ1530972 1

DESCRIÇÃO

"USO DE AGENTES BIOLÓGICOS PARASITÁRIOS PARA PREVENÇÃO E CONTROLO DE DOENÇAS"

CAMPO DO INVENTO

Esta divulgação está relacionada com métodos que utilizam preparações de parasita helmintico.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os parasitas são seres vivos que vivem sobre ou dentro de outros seres vivos durante alguma parte dos seus ciclos de vida, retirando nutrientes do hospedeiro. Os parasitas que habitam os intestinos possuem uma interacção complexa com o sistema imune das mucosas. Devem estabelecer uma relação tranquila com as defesas das mucosas do hospedeiro para sobreviverem. A desregulação do sistema imune conducente a uma resposta anormal Thl ou Th2 pode ser a causa de várias doenças humanas. Algumas doenças devido a respostas dominantes Thl incluem IBD, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerose múltipla e diabetes mellitus dependente de insulina. As doenças relacionadas com Th2 incluem doenças alérgicas e cancro. 2 ΡΕ1530972

Recentemente, foi demonstrado que a exposição a parasitas reduz a gravidade de encefalomielite autoimune experimental (EAE) (Sewell et al., 2003, International Immunology, 15: 59-69). A encefalite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal para a esclerose múltipla (MS) caracterizado pela desmielinização inflamatória crónica do sistema nervoso central (CNS). Sewell descreveu que em murganhos imunizados com ovos de Schistosoma mansoni, a gravidade de EAE é reduzida, conforme medido pelo decréscimo das classificações clinicas e infiltrados celulares do SNC. Existe um decréscimo de IFN-gama e aumento dos níveis de IL-4, factor de crescimento transformante-beta e IL-10 na periferia e aumento da frequência de células T específicas de neuroantigénio produtoras de IL-4 no cérebro. A doença de Crohn resulta de inflamação descontrolada das mucosas do tipo T auxiliar (Th)l. A doença de Crohn é rara em países tropicais mas prevalente em países desenvolvidos com climas temperados, onde a sua incidência subiu depois de 1940. Pelo contrário, a exposição a parasitas helmínticos é comum nos países tropicais mas é rara nos países desenvolvidos. Elliott et al. (2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284:G385-G391) demonstraram que os helmintas podem atenuar a inflamação excessiva tipo Thl. Para testar aquela hipótese, os murganhos foram expostos a ovos do helminta Schistosoma mansoni e depois tratados rectalmente com ácido trinitro-benzenossulfónico (TNBS) para induzir colite. A exposição a 3 ΡΕ1530972 ovos de esquistossoma atenuou a colite por TNBS e protegeu os murganhos de inflamação letal. A exposição a ovos de esquistossoma diminuiu a produção de IFN-gama e aumentou a de IL-4 em células do baço estimuladas com anti-CD3 e em nódulos linfáticos mesentéricos de murganhos tratados com TNBS. A exposição a ovos de esquistossoma diminuiu IFN-gama no cólon mas aumentou a expressão de mRNA de IL-10 em murganhos tratados com TNBS. 0 transdutor de sinal e activador da transcrição 6 intacto foi necessário para atenuação da colite. Os autores mostraram que a exposição aos helmintas pode diminuir a inflamação colónica murina. de Jong et al. (2002, J. Immunol., 168:1704-1709) demonstraram que um extracto proteico derivado do helminta Schistosoma mansoni induziu o desenvolvimento de DC2s que promovem o desenvolvimento de células Th2 através da estimulação da expressão do ligando 0X40. Igualmente, a toxina da bactéria extracelular Vibrio cholerae induziu também o desenvolvimento de DC2s, no entanto através de um mecanismo ainda desconhecido independente do ligando 0X40. Pelo contrário, a toxina da bactéria intracelular Bordetella pertussis induziu o desenvolvimento de DCls com aumento da produção de IL-12, a qual promove um desenvolvimento de células Thl. Poli(I:C) (dsRNA, simulador de virus) induziu o desenvolvimento de DC1 indutora forte de Thl sem estimulação da produção de IL-12. O pedido de Patente U.S. 2003/0103938 Al descreve uma composição farmacêutica consistindo em IL-4 e SFD-Ια ou 4 ΡΕ1530972 IL-2 e SDF-la para a prevenção ou tratamento de uma doença relacionada com células Thl ou células Th2, num ser humano ou num animal, através da modulação da razão Thl/Th2.

Doetze et ai. (2000, International Immunology, 12: 623-630) investigaram a hipo-resposta proliferativa de células T ao antigénio Ov (OvAg) pelas células mononucleadas do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos com infecções helmínticas crónicas, i.e. oncocercose generalizada (GEO) comparativamente com PBMCs de indivíduos putativamente imunes (PI). Neste estudo, foram investigados os mecanismos que medeiam esta hipo-resposta celular em GEO: a baixa resposta proliferativa em PBMCs de indivíduos GEO foi associada à ausência da produção de IL-4 e produção significativamente mais baixa de IL-5, comparativamente com a dos indivíduos PI, argumentando contra uma mudança geral para uma resposta T (h) 2 como sendo a causa de hipo-resposta. Pelo contrário, IL-10 e o factor de crescimento transformante (TGF)-beta, duas citocinas associadas a uma resposta T(h)3, pareceram mediar a hipo-resposta: PBMCs de indivíduos com GEO produziram significativamente mais IL-10 e a hipo-resposta proliferativa de células T neste grupo pode ser invertida pela adição de anticorpos anti-IL-10 e anti-TGF-beta. Os autores mostraram que a hipo-resposta era específica de OvAg e não observada quando da estimulação com antigénios de nemátodos relacionados, argumentando a favor de uma regulação negativa específica de Ov mediada por células T. Células T específicas de Ov foram clonadas a partir de PBMCs GEO que tinham um perfil de citocinas único 5 ΡΕ1530972 (sem IL-2 mas com produção elevada de IL-10 e/ou TGF-beta), semelhante a subséries de células T conhecidas por suprimirem a inflamação em curso (T(h)3 e T®1), indicando que este tipo de células que até aqora não tinha sido encontrado em doenças infecciosas pode estar envolvido na manutenção da hipo-resposta especifica de Ov.

As células Th3 são uma sub-série de células T reguladoras e foram originalmente geradas e identificadas em murganhos oralmente tolerizados a MBP e suprimiam a indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) através de um mecanismo dependente de TGF-b (Chen et al., 1994, Science, 265:1237-1240). Estudos recentes sugeriram que as células T reguladoras podem ser induzidas contra antigénios de bactérias, virus e parasitas in vivo e devem prevenir doenças auto-imunes, imunopatologia induzida pela infecção ou persistência prolongada de patogénicos através da supressão de respostas Thl protectoras (ver, por exemplo, McGuirk and Mills, 2002, Trends in Immunology, 23:450-455; Tung et al., 2001, Immunological Reviews, 182:135-148; and Maloy and Powrie, 2001, Nature Immunology, 2:816-822).

As células T reguladoras são, de um modo geral, descritas como linfócitos que suprimem as respostas imunes, i.e., mediada por anticorpos e/ou mediada por células (e.g., para revisões, ver McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl /Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 6 ΡΕ1530972 2002;23 (9) :450-5; Field, A. C, L. Caccavelli, M. F. Bloch, and B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170:2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. I Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar; 3 (3) :223-32; Francois Bach J. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3): 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec; 14 (6):771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep;23 (9) :450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug; 182: 135-48; Read S, Powrie F. CD4 ( + ) regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec; 13(6):644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep;3(1 1):899-904). Estas células T reguladoras (células Tr) expressam uma proteína transmembranar (designada CD25) que é a cadeia alfa do receptor de interleucina-2 (IL-2). À semelhança de outras células T, também expressam o receptor de antigénio de células T (TCR)αβ (alfa-beta) e podem apenas ser activadas se ele se ligar à molécula de péptido MHC Classe II ou, no caso de células reguladoras CD8, a MHC Classe I, para o qual é especifica. No entanto, se activadas começam a secretar grandes quantidades de interleucina 10 (IL-10) e, 7 ΡΕ1530972 frequentemente, também algum factor de crescimento transformante-beta (TGF-β). Ambas as linfocinas são fortes imuno-supressores que inibem o auxilio de Thl na imunidade mediada por células e inflamação, o auxilio de Th2 na produção de anticorpos e, possivelmente, a acção de linfócitos T citoliticos (CTL) CD8+. Algumas outras células T reguladoras diferem das células Tr. Por exemplo, as células Trl assemelham-se a células Tr de várias formas, ainda que não expressem grandes quantidades de CD25 na sua superfície. Elas requerem 11-10 para a sua formação e, uma vez maduras, secretam grandes quantidades de IL-10. A principal linfocina para as células Th3 é TGF-β. Transplatation 61, 2 (1996) descreve o uso de preparações contendo o organismo Nippostrongylus brasiliensis ou um extracto do mesmo no tratamento de sobrevivência de enxertos. WO00/25810 descreve o uso de uma proteína obtida a partir do nemátodo He ligmosomoides polygyrus para tratamento imuno-supressor e como um anti-alérgico.

Journal of Immunology 167, 9 (2001) descreve que um helminta inibe a colite num modelo de doença inflamatória intestinal através da indução de células T reguladoras.

Digestive disease week abstracts and intinerary planner May (2003) descreve que Heligmosomo ides polygyrus inibe colite num modelo de doença inflamatória intestinal através da indução de células T reguladoras. 8 ΡΕ1530972 WO02/094228 descreve composições helmínticas na prevenção e tratamento de alergias e asma.

Science 296, 5567 (2002) revê a hipótese da higiene relacionada com parasitas e alergias. WO03/006058 descreve métodos e composições para a identificação de novos alvos para o diagnóstico, prognóstico, intervenção terapêutica e prevenção de distúrbios autoimunes, rejeição de transplantes e cancro.

Science 299, 5609 (2003) descreve o controlo do desenvolvimento de células T reguladoras pelo factor de transcrição Foxp3.

Development Biology 246 1 (2002) descreve a definição de elementos da rede reguladora para o desenvolvimento de células T através da análise de perturbação com PU.l e GATA-3.

Journal of Immunology 171, 3 (2003) descreve que a expressão diferencial de transcritos Smad7 identifica as células T reguladoras CD4+CD45RChigh que medeiam a tolerância induzida por colagénio tipo V a enxertos de pulmão.

Expert Opinion on Therapeutic Targets 6, 6 (2002) descreve T-bet como um possível alvo terapêutico em doenças autoimunes. 9 ΡΕ1530972 WO01/13960 descreve métodos de terapia génica in vivo para o tratamento de doenças das articulações, tais como osteoartrite.

Continua sem se saber se as células reguladoras T desempenham um papel na prevenção ou tratamento de doenças relacionadas com Thl ou Th2 utilisando uma preparação de parasita helmintico.

SUMÁRIO DO INVENTO

Os aspectos e realizações do presente invento estão expostos nas reivindicações. A presente divulgação é baseada na descoberta de que preparações de parasita podem alterar a actividade de células reguladoras T no tratamento de doenças relacionadas com Thl ou Th2. A presente divulgação proporciona um método de rastreio de uma preparação de parasita helmintico que altera a actividade células T reguladoras, o referido método compreendendo os passos de: (a) obtenção de uma preparação de parasita helmintico; (b) contacto da referida preparação de parasita helmintico com um alvo; e (c) determinação do nivel de um marcador de superfície celular para a célula T reguladora no alvo após o contacto, em que uma alteração no nível do marcador interno após o contacto 10 ΡΕ1530972 é indicativa da preparação de parasita helmíntico alterar uma actividade das células T reguladoras. A presente divulgação também proporciona um método de rastreio de uma preparação de parasita helmíntico que altera a actividade células T reguladoras, o referido método compreendendo os passos de: (a) obtenção de uma preparação de parasita helmíntico; (b) contacto da referida preparação de parasita helmíntico com um alvo; e (c) determinação do nível de um marcador de superfície celular para a célula T reguladora no alvo após o contacto, em que uma alteração no nível do marcador interno após o contacto é indicativa da preparação de parasita helmíntico alterar uma actividade das células T reguladoras. A presente divulgação também proporciona um método para o tratamento de um animal com uma doença relacionada com Thl ou Th2, através da administração de uma preparação de parasita helmíntico que altera uma actividade das célula T reguladoras no animal. A presente divulgação também proporciona um método para a monitorização da eficácia do tratamento com uma preparação de parasita helmíntico numa doença autoimune ou alergia num animal compreendendo: (a) administração de uma composição compreendendo uma preparação de parasita helmíntico ou uma fracção do mesmo ao animal; e (b) determinação do nível de uma actividade das células T reguladoras no animal após a administração, em que um aumento no nível da 11 ΡΕ1530972 actividade das células T reguladoras após a administração é indicativo da eficácia do tratamento com a preparação do parasita helmintico. A doença a ser tratada pode ser uma seleccionada do grupo consistindo em doença inflamatória intestinal, artrite reumatóide, lupus, diabetes mellitus juvenil dependente de insulina (tipo 1), sarcoidose, esclerose múltipla, asma e rinite alérgica. 0 marcador das células T reguladoras pode ser um marcador interno, um marcador da superfície celular ou um marcador secretado.

De preferência, o marcador interno é Scurfin, Smad7, Gata3, Tbet (Tbx21).

Igualmente, de preferência, o marcador da superfície celular é seleccionado grupo consistindo em CD4, CD45RB10,CD45Rc, antigénio associado a linfócitos T citolíticos 4 (CTLA-4), CD25, CD103, CD26L, integrina αΕβ, péptido associado a latência (LAP) ou proteína relacionada com a família do receptor de TNF induzido por gluco-corticóides (GITR), encefalite alérgica experimental (EAE), receptor de quimiocinas CCR5, TI-ST2.

Igualmente, de preferência o marcador secretado é IL-5, IL-10 ou Τ6Εβ. 12 ΡΕ1530972

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. A figura 1 descreve as concentrações de IFNy, IL-4 e IL-5 medidas em sobrenadantes de células do baço de murganhos infectados com M. avium, S. mansoni ou ambos os organismos de acordo com uma realização da divulgação. Os esplenócitos (4 x 105/alvéolo) foram cultivados in vitro durante 48 horas a 37°C em 200 μΐ de meio na presença ou ausência de concentrações óptimas de PPD ou SEA. A secreção de citocinas foi quantificada por ELISA.

Figura 2. A figura 2 descreve as concentrações de IFNy e IL-4 em sobrenadantes de células de granuloma de murganhos infectados com M. avium, S. mansoni ou ambos os organismos de acordo com uma realização da divulgação. As células de granuloma (4 x 105/alvéolo) em 200 μΐ de meio foram cultivadas in vitro a 37°C durante 48 horas na presença ou ausência de concentrações óptimas de PPD ou SEA. A secreção de citocinas foi quantificada por ELISA.

Figura 3. A figura 3 descreve os niveis de IgGl, IgE e IgG2a medidos em murganhos infectados com M. avium, S. mansoni ou ambos (em simultâneo) de acordo com uma realização da divulgação. A concentração de imunoglobulinas foi determinada por ELISA.

Figura 4. A Figura 4 mostra que o tratamento com IL-4 pode curar murganhos com infecção crónica por H. 13 ΡΕ1530972 polygyrus de acordo com uma realização da divulgação. Os murganhos receberam três injecções de um complexo de IL-4 começando 12 dias antes da morte. Os dados são médias +/-DP de múltiplas determinações.

Figura 5: Os dados representam a média das pontuações inflamatórias ±DP de três experiências separadas analisando >4 murganhos selvagens/grupo.

Figura 6: Murganhos selvagens sem IBD foram colonizados com H. polygyrus. Os controlos receberam gavagem de placebo. LPMC foram isolados a partir de TI e cultivados durante 48 h in vitro com ou sem estimulação anti-CD3/anti-CD28. IFNy nos sobrenadantes foi medido cm ELISA. Os dados são média ± DP de 6 determinações de 2 experiências independentes.

Figura 7: Murganhos selvagens foram tratados como na Fig. 2. LPMC isolados foram cultivados 48 h in vitro com oligo CpG para promover a produção de IL12. IL12 foi medida com ELISA. Os dados são média ± DP de 6 determinações de 2 experiências independentes.

Figura 8: Murganhos selvagens sem IBD foram colonizados com H. polygyrus. Os controlos receberam placebo por gavagem. LPMC foram isolados e cultivados 2 semanas mais tarde como na Figura 2. Os dados são média ± DP de 6 determinações de 2 experiências independentes. 14 ΡΕ1530972

Figura 9: Murganhos selvagens sem IBD foram colonizados com H. polygyrus. LPMC foram isolados e cultivados durante 48 h in vitro com mAb anti-CD3/anti-CD28 + /-oíIL10R. IFNy nos sobrenadantes foi medido com ELISA. Os dados são média ± DP de 3 determinações independentes.

Figura 10: Murganhos selvagens sem IBD foram colonizados com H. polygyrus. Os controlos receberam placebo por gavagem. LPMC foram isolados e cultivados 2 semanas mais tarde como na Figura 2. Os dados são média ± DP de 6 determinações de 2 experiências independentes.

Figura 11: Murganhos selvagens sem IBD foram colonizados com H. polygyrus. Os controlos receberam placebo por gavagem. LPMC foram isolados e cultivados 2 semanas mais tarde como na Figura 2. Os dados são média ± DP de 6 determinações de 2 experiências independentes.

Figura 12: Murganhos selvagens sem IBD foram colonizados com H. polygyrus. Os controlos receberam placebo por gavagem. LPMC foram isolados a partir de TI e cultivados durante 48 h in vitro com ou sem estimulação com LPS. Os dados são média ± DP de 9 determinações de 3 experiências independentes.

Figura 13: Células T foram isoladas a partir de LPMC intestinal disperso usando esferas magnéticas. As fracções enriquecidas em células T (células T) e sem células T (não T) foram cultivadas durante 48 h in vitro 15 ΡΕ1530972 com ou sem estimulação com anti-CD3/anto-CD28 antes de testar IFNy nos sobrenadantes. Os dados são média ± DP de 6 determinações de 2 experiências independentes.

Figura 14: Murganhos selvagens não infectados receberam 2 x 107 células MLN de murganhos selvagens colonizados com H. polygyrus. Uma semana mais tarde LPMC foram isolados a partir destes recipientes e cultivados 48 h com ou sem estimulação com anti-CD3/anti-CD28 antes de testar IFNy nos sobrenadantes. Os dados são média ± DP de 6 determinações de 2 experiências independentes.

Figura 15: Murganhos selvagens GFP foram colonizados com H. polygyrus. Uma semana mais tarde, células MLN destes murganhos GFP condicionados com helmintas foram transferidas para murganhos C57BL/6 normais por injecção I.P. Sete dias mais tarde, a lâmina própria foi dispersa e examinada relativamente a células T GFP+ por microscopia de fluorescência. A) células T GFP+LP. B) o mesmo campo em microscopia óptica.

Figura 16: Animais IL10-/- receberam alimentos contendo piroxicam começando às 5 semanas de idade. Controlos IL-10-/- com a mesma idade não receberam piroxicam (Controlo). A colite foi pontuada em secções histológicas por leitores cegos usando uma escala de 0-4 pontos. A) cólon de um murganho controlo IL10-/-. B) Cólon de um murganho IL10-/- da mesma idade após tratamento com piroxicam. C) Infiltração da lâmina própria colónica com 16 ΡΕ1530972 células T CD4+ após piroxicam (H&E 10X, IHC 20X). Os dados dos gráficos são médias de 5 experiências separadas, cada uma com 5/6 murganhos/grupo.

Figura 17: Os painéis A, B e C mostram a inflamação colónica tipica em murganhos tratados com piroxicam que não receberam H. polygyrus. D, E e F mostram melhoria da colite 2 semanas após receberem H. polygyrus (Todos H&E, 4X) . A colite foi pontuada numa escala de 0-4 pontos. Os dados são médias ± DP de 11 animais estudados em 2 experiências separadas.

Figura 18: Murganhos IL10-/- com colite receberam H. polygyrus ou placebo por gavagem como descrito na Fig. 12. Duas semanas mais tarde, LPMC foram isolados e cultivados 48 h in vitro com ou sem estimulação com anti-CD3/anti-CD28 (IFNy) ou com oligo CpG (IL12) . Os dados são média ± DP de 8-9 determinações de 3 experiências independentes.

Figura 19: Murganhos IL10-/- com colite foram tratados como na Fig. 13. Os dados são média ± DP de 9 determinações de 3 experiências independentes.

Figura 20: A) Células MLN isoladas a partir de murganhos IL10-/- 2 semanas após receberem H. polygyrus ou placebo por gavagem (Controlo) foram transferidas (20 x 106) por injecção i.p. em murganhos tratados com piroxicam. Duas semanas após transferência, a colite foi avaliada como 17 ΡΕ1530972 na Fig. 12. B) Células T MLN isoladas a partir de murganhos controlo ou colonizados foram transferidas (5 x 106) para murganhos com colite. Os dados são média ± DP de 9 murganhos/grupo em 2 experiências separadas.

Figura 20: mRNA foi extraído de células MLN isoladas a partir de murganhos IL10-/- 2 semanas após gavagem de placebo ou de H. polygyrus após 2 semanas tratamento com placebo ou com piroxicam. PCR em tempo real para Foxp3 foi normalizado para mRNA de HPRT (Métodos). Nota: A expressão mais elevada requer menos ciclos de PCR para atingir o patamar. Os dados são médias ± DP de 3 experiências independentes, cada uma usou 4 murganhos/grupo.

Figura 22: Extraiu-se mRNA de células MLN de murganhos IL10-/- 2 semanas após gavagem de placebo ou de H. polygyrus. A expressão mais baixa requer mais ciclos de PCR para atingir o patamar. Os dados são médias ± DP de 3 experiências independentes, cada uma usou 4 murganhos/grupo.

Figura 23: Um diagrama esquemático de um procedimento de preparação de antigénio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O invento diz respeito a um método in vitro de rastreio de uma preparação de parasita helmíntico que 18 ΡΕ1530972 altera uma actividade das células T reguladoras humanas, como descrito nas reivindicações.

Como aqui usado, o termo "preparação de parasita helmíntico" inclui, mas não está limitado a qualquer parasita completo, extracto de parasita, ovos de parasita, extracto de ovos de parasita, ovo fecundado de parasita, extracto de ovo fecundado de parasita, larvas de parasita, extracto de larvas de parasita, cercaria de parasita e extracto de cercária de parasita. Uma "preparação de parasita" pode também ser uma proteína isolada, polinucleótido, açúcar ou lípido derivado do parasita e seu extracto.

Como aqui usado, o termo "livre de agentes patogénicos específicos" aplica-se a animais criados para usar no presente invento quando se sabe que os animais não possuem microrganismos patogénicos específicos que possam causar doença num animal alvo ou ser humano. Os métodos para criar animais sem agentes patogénicos são conhecidos na área, e.g., ver referências de Brown et al., A Bibliography on the Culture and Maintenance Specific Pathogen-Free Organisms, available at http://www.ctsa.org/ uploadpublication/CTSA_116631681202959092495.pdf. Brown et al. proporciona referências para criar diferentes animais de quinta e de laboratório em ambiente SPF, assim como procedimentos e requisitos para o desenho e gestão de construções. Ver igualmente M. Michael M. Michael Swindle (J. Invest. Surg., 9:267-271, 1996, aqui incluído como 19 ΡΕ1530972 referência) para o procedimento SPF e listas de vários potenciais agentes patogénios humanos virais e bacterianos.

Como aqui usado, o termo "células T reguladoras" refere-se a uma população de células linfociticas que secretam pelo menos mais de duas vezes (e.g., 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou mais) IL-10 e/ou ΤΘΕβ, comparativamente com células T naive. A determinação da secreção de IL-10 ou ΤΘΕβ é conhecida na área. Por exemplo, pode ser determinada através da cultura das células in vitro durante 24 ou 48 h com ou sem um estimulador das células T, como anti-CD3 e depois ensaio do sobrenadante da cultura relativamente àquelas citocinas usando ELISAs específicos de citocinas. Ainda, as células T reguladoras são também caracterizadas por um nível elevado de transcrito Foxp3 comparativamente com outros tipos de células T (e.g., células T naive). Por "nível elevado de transcrito Foxp3" é entendido um aumento de pelo menos 4 vezes no nível comparativamente com outros tipos de células T. Foxp3 é detectável usando PCR em tempo real ou PCR quantitativo (i.e., usando sequências iniciadoras para PCR CCCAGGAAAGACAGCAACCTT, TTCTCACAACCAGGCCACTTG (SEQ ID NO. 1), e a sonda marcada 6FAM-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-TAMRA (SEQ ID NO. 2) como descrito em Hori S., T. Nomura, and S. Sakaguchi. 2003. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299:1057-1061). Os valores foram normalizados para a expressão de HPRT, o qual é um gene de manutenção. Como alternativa, o produto proteico Foxp3, Scurfin, pode ser 20 ΡΕ1530972 detectado por análise de transferências Western conhecida na área, e.g. usando o anticorpo policlonal anti-Foxpd (Foxp3) de cabra (Número de Catálogo ab2481, Novus

Biologicals, Littleton, CO). Facultativamente, as células T reguladoras podem também produzir muito menos IFNy comparativamente com outras células T (e.g., células T naive), i.e., pelo menos 2 vezes, de preferência 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou menos.

Também facultativamente, as células T reguladoras podem ser igualmente detectadas usando análise de fluxo intracito-plásmico para detectar células T que expressam IL10 e/ou ΤΘΒβ mas pouco ou nenhum IFNy. Marcadores facultativos adicionais como aqui descrito abaixo podem também ser usados para detectar células T reguladoras ou a actividade de células T reguladoras.

Como aqui usado, o termo "células T naive"

refere-se a células T que surgem da produção do sistema imune de células frescas na medula óssea. As células T naive respondem a patogénicos encontrados pela primeira vez contendo antigénios que o sistema imune não processou anteriormente. As células T naive podem ser identificadas de acordo com métodos conhecidos na área (para revisões, ver, e.g., Tough et al., 1999, Immunol Rev. 170:39-47; Itano et al., 2003, Nat Immunol. 4(8) :733 — 9; Berard et al., 2002, Immunology. 106(2): 127-38).).

Como aqui usado, o termo "preparação de parasita que altera uma actividade das células T reguladoras" 21 ΡΕ1530972 refere-se a uma preparação de parasita que altera a actividade das células T reguladoras num alvo em pelo menos 40%, e.g., 50%, 80%, 100%, 2 vezes, 4 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou mais quando do contacto com o alvo, comparativamente com a actividade de células T reguladoras no alvo sem contacto com a preparação de parasita. A actividade de células T reguladoras pode ser medida monitorizando o nivel de um marcador interno das células T reguladoras (e.g., um factor de transcrição como seja mRNA de Foxp3 ou o seu produto proteico Scurfin, Smad7, Gata3, ou Tbet (Tbx21)) ou um marcador da superfície das células T reguladoras (e.g., CD4, CD45RB10,CD45Rc, antigénio associado a linfócitos T citolíticos 4 (CTLA-4), CD25, CD103, CD26L, integrina αΕβ, péptido associado a latência (LAP) ou proteína relacionada com a família do receptor de TNF induzido por glucocorticóides (GITR), encefalite alérgica experimental (EAE), receptor de quimiocinas CCR5, TI-ST2) ou um marcador secretado (e.g., IL4, IL13, IL-5, IL-10, ΤΰΕβ) . Um aumento de actividade das células T reguladoras pode ser representado por um acréscimo (e.g., Foxp3, 0x40, 4IBB, CD4, CTLA-4, CD25, CD103, CD62L, integrina αΕβ, LAP,

GITR, EAE, CCR5, T1-ST2, IL-10, Τ6Εβ) ou um decréscimo (e.g., D45Rc) no nível de um marcador de células T reguladoras, em pelo menos 40%, e.g., 50%, 80%, 100%, 2 vezes, 4 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou mais, medido de acordo com métodos conhecidos na área e como aqui descrito.

Uma preparação de parasita que altera uma 22 ΡΕ1530972 actividade de células T reguladoras pode alterar o nivel de dois ou mais marcadores aqui descritos.

Como aqui usados, o termo "o nível de um marcador das células T reguladoras" refere-se à quantidade de um marcador específico das células T reguladoras num alvo, e.g., medido em microgramas ou quantidades molares. Tipicamente, o marcador das células T reguladoras é uma proteína, para a qual a quantidade pode ser medida através de quaisquer métodos conhecidos na área para quantificação de proteínas, por exemplo, por ELISA, transferência Western, imunoprecipitação, radio-imunoensaio ou análise por FACS (e.g., em Innis et al., (1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Edition. Sambrook. et al. (1989); and Current Protocols in Molecular Biology (1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc.). O nível de um marcador proteico pode também ser medido como o nivel do seu mRNA de acordo com métodos conhecidos na área, e.g., por transferência Northern, RT-PCR quantitativo, análise de micro-arranjos (e.g., em Innis et al., (1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2d Edition. Sambrook, et al. (1989); e Current Protocols in Molecular Biology (1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc.).

Como aqui usado, o termo "alvo" refere-se a um sistema in vitro (e.g., tecido ou células em cultura, extracto de transcrição/tradução). 23 ΡΕ1530972 A divulgação também descreve um método de prevenção ou tratamento de uma doença causada por uma resposta imune alterada num animal compreendendo a administração de uma preparação de parasita helmintico numa quantidade suficiente para prevenir ou tratar a doença no animal. Como aqui usado, o termo "doença causada por uma resposta imune alterada" refere-se a uma doença que um animal desenvolve (e.g., um ser humano) devido a uma diferença na sua resposta imune comparativamente com um animal não doente. Por exemplo, o animal doente pode ter uma resposta imune anormal (e.g. excessiva ou não suficiente) contra um antigénio (e.g., um antigénio próprio ou não próprio) comparativamente com uma resposta contra o esmo antigénio num animal normal não doente. Uma "doença causada por uma resposta imune alterada" de acordo com a presente divulgação inclui, mas não está limitada a doença relacionada com Thl ou doença relacionada com Th2 como aqui descrito.

Como aqui usado, o termo "doença relacionada com Thl" refere-se a uma doença em que as células Thl suportam, causam ou medeiam o processo de doença ou em que as células Thl estão envolvidas na cura ou alivio dos sintomas da doença, os quais podem ser representados por uma actividade Thl aumentada ou reduzida. Por "aumentada", pretende-se significar que um animal doente tem um aumento (e.g., pelo menos 2 vezes e, possivelmente, 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou mais) na sua actividade Thl, comparativamente com um outro animal sem a doença. Um aumento da actividade - 24 - ΡΕ1530972

Thl pode ser medido por um acréscimo no nivel de citocinas secretadas (e.g., IL-2, IFN-γ, TNFa, IgG2a,IL-12, 11-18, IL-23) ou um decréscimo no nivel de citocinas secretadas (e.g., IL-4, IL-13), de acordo com métodos conhecidos na área. Por "reduzido", pretende-se significar que um animal doente possui um decréscimo (e.g., pelo menos 50% mais baixo, ou 2 vezes e possivelmente 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou menos) na sua actividade Thl, comparativamente com um outro animal sem a doença. Uma actividade Thl reduzida pode ser medida através de um decréscimo no nivel de citocinas secretadas (e.g., IFN-γ, TNFa, IgG2a) ou um aumento no nivel de citocinas secretadas (e.g., IL-4, IL-13) de acordo com métodos conhecidos na área e como descrito aqui e no pedido de patente U.S. 2003/039666 e 09/362598.

Como aqui usado, o termo "reduzido" é usado como sinónimo de "diminuído" e o termo "aumentado" é usado como sinónimo do termo "potenciado".

Como aqui usado, o termo "doença relacionada com Th2" refere-se a qualquer doença, em que as células Th2 suportam, causam ou medeiam o processo de doença ou em que as células Th2 estejam envolvidas na cura ou no alivio dos sintomas das doenças, os quais pode ser representados por um aumento ou redução da actividade Th2. Por "aumentado", pretende-se significar que um animal doente possui um aumento (e.g., pelo menos 2 vezes e possivelmente 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou mais) na sua actividade Th2, 25 ΡΕ1530972 comparativamente com um outro animal sem a doença. Uma actividade Th2 aumentada pode ser medida através de um aumento no nivel de citocinas secretadas e anticorpos (e.g., IL-4, IL-5, IgE e IgGl) de acordo com métodos conhecidos na área. Por "reduzido" pretende-se significar que um animal doente tem um decréscimo (e.g., pelo menos 50%, 2 vezes e possivelmente 5 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes ou menos) na sua actividade Th2, comparativamente com um outro animal sem a doença. Uma actividade Th2 reduzida pode ser medida através de um decréscimo no nivel de citocinas secretadas e anticorpos (e.g., IL-4, IL-5, IgE e IgGl) de acordo com métodos conhecidos na área e como descrito no pedido de patente U.S.2003/039666.

Como aqui usado, o termo "eficácia de tratamento" refere-se à eficácia de um tratamento de uma doença usando uma preparação de parasita. "Eficácia de tratamento " é geralmente medida através de uma resposta clinica a uma doença especifica para a qual o animal foi ou está a ser tratado com uma preparação de parasita.

PARASITAS HELMÍNTICOS

Parasitas helminticos úteis incluem, mas não estão limitados a dois grupos. 0 primeiro grupo é parasitas helminticos que naturalmente colonizam os humanos e o segundo grupo é parasitas helminticos que colonizam animais, mas podem conferir protecção a seres humanos. 26 ΡΕ1530972

No primeiro grupo, os parasitas helminticos são vermes multicelulares elaborados com ciclos de vida e desenvolvimento complexos. Os nemátodos (vermes cilíndricos não segmentados) e os platelmintas (vermes achatados) são dois grupos de helmintas que colonizam os intestinos humanos. De acordo com o presente invento, qualguer um de uma série de parasitas helminticos que naturalmente colonizam os seres humanos ou animais proporcionarão os resultados pretendidos.

Os nemátodos que frequentemente habitam o intestino humano são Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis (oxiúro), Trichuris trichuria (tricurídeo), Ancylostoma duodenale e Necator americanus (ancilóstomo) e Strongyloides stercoralis. Trichinella spiralis infesta o intestino delgado durante um curto período.

Os platelmintes incluem os tremátodos e cestodos. Os tremátodos adultos mais comuns que residem nos intestinos humanos são espécies de Fasciolopsis, Echinos-toma e Heterophyes. Os que vivem no sistema biliar incluem Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini e felineus e Fasciola hepatica. 0 esquistossoma habita o sistema venoso, mas várias espécies afectam cronicamente o intestino através da passagem de ovos pela parede intestinal. Os cestodos adultos que frequentemente infectam os seres humanos são espécies de Diphyllobothrium (ténia dos peixes), Taenia saginata (ténia do boi), Taenia solium (ténia do porco) e Hymenolepsis nana (ténia anã). 27 ΡΕ1530972

Outros helmintas de interesse incluem os parasitas do tipo filária e a fasciola do pulmão. Estes não possuem uma fase intestinal, mas estimulam fortes respostas tipo Th2. 0 segundo grupo geral de parasitas helminticos que podem ser utilizados no presente invento inclui helmintas que colonizam animais, mas que podem conferir protecção aos seres humanos contra doenças mediadas por imunidade. Estes incluem Trichuris muris (tricurideos do murganho), Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasilien-sis, Heligmonsomoid.es polygyrus e Hymenolepsis nana, todos eles são helmintas intestinais que infectam os murganhos. Ainda, Angiostrongylus é um helminta de rato. Trichuris suis e Ascaris suum são helmintas de porcos que podem infectar humanos. Trichuris vulpis, espécies de Toxocara, Gnathostoma e Ancylostoma são helmintas de cão ou de gato que também podem infectar humanos. Anisakis e Pseudoter-ranova são nemátodos de mamíferos marinhos que podem ser transmitidos ao Homem. Os esquistossomas de aves podem infectar transitoriamente seres humanos. Tais esquistossomas incluem S. douthitti, Trichobilharzia ocellata, T. stagnicolae, T. physellae e Gigantobilharzia huronensis. A preparação helmíntica pode ser seleccionada do grupo consistindo em helmintas que naturalmente colonizam humanos e helmintas que colonizam animais mas que podem proteger humanos ou animais de uma doença causada por uma resposta imune alterada. 28 ΡΕ1530972

Nalgumas realizações do invento, o parasita helmíntico é um nemátodo e pode ser seleccionado do grupo tal como Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichuris trichuria, Ancylostoma duodenale, Necator ameri-canus, Strongyloides stercoralis e Trichinella spiralis.

Noutras realizações do invento, o parasita helmíntico é um platelminta e pode ser seleccionado do grupo consistindo em tremátodos e cestodos, tais como espécies de Fasciolopsis, Echinostoma e Heterophyes, Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus, Fasciola hepatica, espécies de Schistosoma, espécies de Diphyllobothrium (ténia dos peixes), Taenia saginata, Taenia solium e Hymenolepsis nana.

Noutras realizações, o parasita helmíntico é seleccionado do grupo consistindo em parasitas do tipo filária e fasciola dos pulmões.

Em realizações preferidas, os parasitas helmín-ticos são seleccionados do grupo que consiste em Trichuris muris, Trichinella spiralis, Nippostrongylus brasiliensis, Heligmonsomoides polygyrus e Hymenolepsis nana, espécies de Angiostrongylus, Trichuris suis, Ascaris suum, Trichuris vulpis, espécies de Toxocara, espécies de Gnathostoma, espécies de Ancylostoma, espécies de Anisakis e espécies de

Pseudoterranova. 29 ΡΕ1530972

Prefere-se que os animais preparatórios para a produção e preparação de parasitas sejam criados em ambientes livres de patogénicos específicos (SPF) (e.g., sem patogénicos específicos de humanos).

DOENÇAS TRATÁVEIS

Exemplos de doenças tratáveis, de acordo com a descrição, incluem, mas não estão limitados a doenças relacionadas com Thl e relacionadas com Th2, incluindo cancros relacionados com Thl ou Th2.

Doenças relacionadas com Thl

As doenças relacionadas com Thl compreendem os seguintes grupos de doenças: doenças infecciosas, doenças autoimunes, doenças de hipersensibilidade do tipo retardado e cancro. 0 grupo de doenças infecciosas inclui doenças causadas por parasitas e vírus, tais como HIV. 0 grupo de doenças autoimunes inclui doenças autoimunes encefalomielopáticas, desmielinizantes e outras.

Exemplos de doenças encefalomielopáticas incluem, mas não estão limitadas a esclerose múltipla; esclerose focal; esclerose insular; tabes dorsalis (esclerose posterior); encefalomielite experimental alérgica (EAE) (ou 30 ΡΕ1530972 autoimune) , aguda e crónica, que é um modelo animal de MS; síndroma de Guillain-Barré; neurite alérgica experimental (um modelo animal da síndroma de Guillain-Barré); encefalo-mielite disseminada aguda; encefalomielite miálgica (benigna e epidémica); encefalomielite virai; encefalomielite granulomatosa; etc. Estão também incluídas doenças animais, tais como cinomose canina, cinomose felina; encefalomielite equina (do leste, Venezuelana e do ocidente); encefalomielite aviária; encefalomielite porcina; encefalomielite bovina; encefalomielite murina; etc.

Exemplos de doenças desmielinizantes incluem, mas não estão limitadas a esclerose múltipla (MS) , esclerose disseminada (DS), encefalomielite disseminada aguda, leuco-encefalopatia multifocal progressiva (ML) e panencefalite esclerótica subaguda (SSPE).

Exemplos de outras doenças autoimunes incluem esclerose múltipla (MS), poliartrite nodosa, asma, pneumo-nite de hipersensibilidade, doença intersticial pulmonar, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, doença intersticial pulmonar associada a doença de Crohn ou colite ulcerativa ou doença de Whipple, doença intersticial pulmonar associada a granulomatose de Wegeners ou vasculite de hipersensibilidade, síndromas de vasculite, púrpura de Hennoch-Schonleins, síndroma de Goodpastures, granulomatose de

Wegeners 31 ΡΕ1530972 doenças renais tais como glomerulopatia mediada por anticorpos como em glomerulonefrite aguda, nefrite associada a lupus sistémico eritematoso (SLE), nefrite associada a outras doenças sistémicas tais como granulo-matose de Wegeners e sindroma e Goosdpastures e doença mista do tecido conjuntivo, nefrite intersticial crónica, glomerulonefrite crónica, doenças gastrointestinais (e.g. IBD) , como seja doença de Crohn, colite ulcerativa, doença celiaca, doença de Whipple, colite por colagénio, colite eosinofilica, colite linfocitica, doenças hepatobiliares tais como hepatite auto-imune, hepatite induzida pelo álcool, fibrose periportal, cirrose biliar primária, colangite esclerosante, doenças da pele tais como psoríase, dermatite atópica, doença alérgica da pele, esclerose sistémica progressiva (escleroderma), dermatite exfoliante, pemphigus vulgaris, doenças das articulações tais como artrite reu-matóide (RA), espondilite anquilosante, artrite associada a psoriase ou doença inflamatória intestinal, doenças musculo-esqueléticas tais como miastenia grave (MG), polimiosite, 32 ΡΕ1530972 doenças endócrinas tais como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), tiroidite autoimune (Hashi-moto), ti-reotoxicose, hipertiroidismo (doença de Graves), doença do sistema hematopoiético tal como anemia autoimune, trombocitopenia autoimune, anemia autoimune aplástica, doenças cardiovasculares tais como cardiomiopa-tia, vasculite, doença cardiovascular associada a doenças sistémicas tais como lupus eritematoso sistémico, poliar-trite nodosa, artrite reumatóide, escleroderma, sarcoidose.

Uma caracteristica importante das doenças auto-imunes é o seu agrupamento familiar e associação com a expressão de genes particulares, em particular genes do complexo major de histocompatibilidade (MHC) classe I e classe II. Por exemplo, uma grande proporção de doentes MS possui o haplótipo HLA-DR2 (Beall S S, Concannon P, Charmley P, et al., J. Neuroimmunol., v 21, p 59-66, 1989) . uma vez que nem todos os indivíduos com um genótipo susceptivel desenvolvem a doença autoimune, parece que os factores ambientais podem desempenhar um papel importante. Por exemplo, MS parecer ser mais comum em indivíduos que vivem em regiões de clima temperado (Kurtzke J F, IN: Multiple Sclerosis, Hallpike J F, Adams C W M, Tourtelotte W W, editors, Williams and Wilkins, Baltimore, Md., 1983, p 49-95). Durante muito tempo especulou-se que o factor 33 ΡΕ1530972 ambiental das doenças autoimunes poderia ser um agente infeccioso, como seja um virus. A etiologia de várias doenças humanas e animais pode ser atribuída a infecção virai. Por exemplo, a encefalomielite murina de Theiler é uma doença desmielinizante com sinais clínicos e patológicos semelhantes a EAE. Ainda que estejam envolvidos anticorpos nalgumas respostas efectoras das doenças autoimunes, o evento que as desencadeia, na maioria dos casos, começa com a activação de células T CD4 que são necessárias para a maturação das células B e expansão clonal. 0 grupo de hipersensibilidade do tipo retardado inclui a hipersensibilidade de contacto a substâncias de baixa massa molecular. A. Doenças inflamatórias intestinais (CD e UC):

Os dados epidemiológicos sugerem uma suscepti-bilidade genética ao desenvolvimento da doença de Crohn (CD) e de colite ulcerativa (UC) . A incidência de CD em sociedades industrializadas tem aumentado a partir dos anos 50 até meados dos anos 80 e agora é de 1 para 8 por 100 000 pessoas por ano. Isto sugere que alterações desconhecidas no nosso ambiente têm afectado a frequência de CD.

Ainda que a causa de IBD permaneça indeterminada, presume-se que resulte da desregulação do sistema imune da mucosa intestinal. As células inflamatórias na mucosa 34 ΡΕ1530972 normalmente protegem-nos dos conteúdos luminais. Esta inflamação crónica altamente eficaz está estreitamente controlada para limitar a lesão tecidular. IBD pode resultar de respostas imunes inadequadamente vigorosas a factores luminais. CD parece ser uma inflamação vigorosa tipo Thl que produz IFN-γ e TNFcx. A natureza de UC está pior definida.

A colite ulcerativa UC) e a doença de Chron (CD) são distúrbios de derivação complexa causada pela interacção de exposições ambientais mal definidas e, pelo menos nalguns casos, a hereditariedade de genes susceptiveis. Frequentemente citada como evidência de predisposição genética para IBD é esta ser mais elevada do que a ocorrência esperada de IBD nos membros da familia dos doentes com esta condição e a prevalência elevada da doença em populações de judeus dos paises ocidentais (Roth MP, Petersen GM, McElree C et al. Geographic origins of Jewish patients with inflammatory bowel disease. Gasfroenterology 1989;97(4):900-4). Apesar de IBD ser menos prevalente na população judia de Israel (Fireman Z, Grossman A, Lilos P et al. Epidemiology of Crohn's disease in the Jewish population of central Israel, 1970-1980. Am J Gastro 1989,-84(3):255-8)) com origem étnica semelhante (Grossman A, Fireman Z, Lilos P et al. Epidemiology of ulcerative colitis in the Jewish population of central Israel 1970-1980. Hepato-Gastroenterology 1989/36(4): 193-7). Estudos com gémeos proporcionaram evidência de predisposição genética para pelo menos CD (Halfvarson J, Bodin L, Tysk C 35 ΡΕ1530972 et al. Inflammatory bowel disease in a Swedish twin cohort: a long-term follow-up of concordance and clinicai characteristics. Gastroenterology 2003; 124(7): 1767-73.). Um defeito genético em CARD15/NOD2, uma proteína intracelular que detecta o produto bacteriano muramil-dipéptido (Inohara M, Ogura Y, Fontalba A et al. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through N0D2: implications for Crohn' s disease. J Biol Chem 2003; Girardin SE, Boneca IG, Viala J et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. J Biol Chem 2003), torna algumas pessoas mais susceptíveis a CD. Várias outras alterações genéticas foram propostas como factores de risco para IBD. No entanto, as predisposições genéticas não explicam a incidência rapidamente crescente da doença.

Existem vários modelos animais de inflamação crónica intestinal, por exemplo, como descrito por Elliott et al., (Elliott et al., 1998, Inflammatory Bowel Disease and Celiac Disease. In: The Autoimmune Diseases, Third ed., N.R. Rose and I.R. MacKay, eds. Academic Press, San Diego, CA). Um avanço importante na descoberta recente de que alguns murganhos com deleções genéticas manipuladas por engenharia genética podem desenvolver inflamação crónica intestinal semelhante a IBD, ver Elson et al., 1995, Gastroenterology 109:1344. Estas incluem murganhos mutantes portadores de deleções dirigidas para genes de IL-2, IL-10, MHC classe II ou TCR entre outros. Usando alguns dos modelos, Berg et al., 1996, J. of Clin. Investigation 36 ΡΕ1530972 98:1010, Ludviksson et al., 1997, J. of Immunol. 158:104, and Mombaerts et al., 1993, Cell 75:274 demonstraram que um sistema imune desregulado pode ele próprio mediar distúrbios intestinais. A inflamação das mucosas de vários destes modelos gera grandes quantidades de IFN-γ e TNF-a sugerindo que a produção em excesso de citocinas tipo Thl seja um mecanismo comum subjacente à patogénese da doença. Igualmente, o bloqueio do circuito Thl inibe a inflamação. CD é uma resposta Thl. Assim, estes modelos podem ter implicações directas relativamente à imunopatologia deste processo de doença humana. B. Artrite reumatóide (RA): RA é uma doença crónica caracterizada por sinovite inflamatória persistente, geralmente envolvendo articulações periféricas numa distribuição simétrica. Esta inflamação pode conduzir a erosões ósseas, destruição de cartilagem e destruição da articulação. Atinge cerca de 1% da população. A prevalência aumenta com a idade e as mulheres são mais frequentemente afectadas que os homens. A propagação de RA é um evento mediado imunologicamente conduzido pelas células CD4+ Thl. C. Diabetes mellitus (DM) juvenil dependente de insulina (tipo 1): DM tipo 1 é uma doença que geralmente começa no inicio da idade adulta e que resulta da incapacidade para 37 ΡΕ1530972 produzir insulina como resposta ao aumento de açúcar no sangue. Este açúcar persistentemente elevado no sangue e a incapacidade para metabolizar adequadamente a glucose causa distúrbios metabólicos que eventualmente causam destruição dos olhos, rins coração e outros órgãos. A tomada de insulina parentericamente pode controlar parcialmente estes problemas metabólicos. DM tipo 1 resulta de um ataque autoimune às células pancreáticas beta, as quais são a fonte de insulina. Os macrófagos activados e as células T citotóxicas rodeiam e destroem as células pancreáticas beta. A susceptibilidade genética e eventos ambientais mal definidos desencadeiam o processo de doença. D. Lupus eritematoso (LE): LE é uma doença autoimune sistémica que é mais frequente nas mulheres adultas jovens até meia idade. A destruição de tecidos é causada por auto-anticorpos e células T reguladoras hiper-reactivas. A resposta imune anormal permite a produção sustentada de auto-anticorpos e complexos imunes patogénicos. Isto conduz a destruição dos sistemas musculo-esquelético, cutâneo, hematológico, renal e outros. A resposta imune anormal provavelmente depende da interacção de múltiplos factores hereditários e ambientais. E. Sarcoidose:

A sarcoidose é uma doença granulomatosa crónica dos pulmões e de outros órgãos de causa desconhecida. A 38 ΡΕ1530972 maioria dos doentes apresenta idades de 20-40 anos. O sintoma mais frequente é a dificuldade em respirar. A doença resulta de um tipo Thl exagerado, resposta imune celular, provavelmente contra um número limitado de antigénios. A sarcoidose distribui-se por todo o mundo e atinge todas as raças. No entanto, existe uma notável diversidade da prevalência da sarcoidose entre determinados grupos étnicos e raciais. Por exemplo, a doença é rara na Polónia, Sudeste Asiático e índica. F. Esclerose múltipla (MS): MS é um distúrbio inflamatório multifocal crónico com relapsos do sistema nervoso central que conduz à desmielinização focal e cicatrização do cérebro. É uma doença frequente que afecta 350 000 americanos e que começa durante o inicio e meio da idade adulta. MS é uma doença autoimune mediada, pelo menos em parte pelas células Thl. As lesões MS assemelham-se às induzidas por respostas de hipersensibilidade retardada que contêm células T activadas e macrófagos. É uma doença de climas temperados, aumentando a prevalência com a distância ao equador.

Doenças relacionadas com Th2

As doenças relacionadas com Th2 compreendem os seguintes grupos de doenças: doenças alérgicas e cancro. É conhecido que os indivíduos com predisposição 39 ΡΕ1530972 genética ficam sensibilizados (alérgicos) para antigénios derivados de uma variedade de fontes ambientais, às quais os indivíduos estão expostos. A reacção alérgica ocorre quando um indivíduo previamente sensibilizado é novamente exposto ao mesmo alergénio ou a um homólogo. As respostas alérgicas variam entre a febre dos fenos, rinoconjuntivite, rinite e asma a anafilaxia sistémica e morte em resposta a, e.g., picada de abelha ou vespa ou picada de insecto. A reacção é imediata e pode ser causada por uma variedade de alergénios atópicos tais como compostos derivados de relva, árvores, gramíneas, insectos, ácaros (pó da casa), alimentos, fármacos, quimicos e perfumes. 0 grupo de doenças alérgicas inclui febre dos fenos, rinoconjuntivite, rinite e asma.

Os alergénios mais comuns, aos quais ocorrem reacções alérgicas, incluem inalação de alergénios originados, e.g., em árvores, gramíneas, ervas, fungos, ácaros do pó da casa, ácaros dos cereais, baratas e pêlos animais, penas e caspa. Os alergénios importantes tipo pólen das árvores, gramíneas e ervas podem derivar de ordens taxonómicas de Fagales, Oleales e Pinales, incluindo i.a. bétula (Bétula), amieiro (Alnus), aveleira (Corylus), choupo (Carpinus) e oliveira (Olea), da ordem Poales incluindo gramíneas do género Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis e Secale, as ordens Asterales e Urticales incluindo i.a. ervas do género Ambrósia e Artemísia. Alergénios inalados importantes são os de fungos, i.a. 40 ΡΕ1530972 derivados dos géneros Alternaria e Cladosporium. Outros alergénios importantes inalados são os dos ácaros do pó da casa do género Dermarophagoides, ácaros dos cereais do género Lepidoglyphys destructor, os das baratas e os de mamíferos tais como gato, cão, cavalo, vaca e aves. Igualmente reacções alérgicas contra picada e mordedura de insectos tais como os da ordem taxonómica dos Hymenoptera incluindo abelhas, vespas e formigas são frequentemente observados. Componentes alergénios específicos são conhecidos dos familiarizados com a área e incluem, e.g. Bet v 1 (B. verrucosa, bétula), Aln g 1 (Alnus glutinosa, amieiro), Cor a 1 (Corylus avelana, aveleira) e Car b 1 (Carpinus betulus, choupo) da ordem Fegales. Outros são Cry j 1 (Pinales) , Amb a 1 e 2, Art vl (Asterales) , Par j 1 (Urticales) , Ole e 1 (Oleales), Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol 1 1, Lol p 1 e 5, Pas η 1, Phi p 1 e 5, Poa p 1, 2 e 5, Sec c 1 e 5 e Sor h 1 (vários pólens de gramíneas), Alt a 1 Cha h 1 (fungos), Der fl e 2, Der p 1 e 2 (ácaros do pó da casa, D. farinae e D. pteronyssinus, respectivamente) , Lep d 1, Bla g 1 e 2, Per a 1 (baratas, Blatella germanica e Periplaneta americana, respectivamente) , Fel d 1 (gato), Can f 1 (cão), Que cl, 2 e 3 (cavalo), Apis m 1 e 2 (abelha), Ves g 1, 2 e 5, pol a 1, 2 e 5 (Todas vespas) e Sol i 1, 2, 3 e 4 (formiga do fogo) para mencionar apenas alguns. A. Asma

Em muitas pessoas, a asma surge como uma reacção 41 ΡΕ1530972 alérgica a substâncias normalmente respiradas no ar, como sejam pelos de animais, pólen ou ácaros do pó e produtos de detritos de baratas. 0 nome genérico para estas substâncias, alergénios, refere-se a qualquer coisa que provoque uma reacção alérgica. Algumas pessoas possuem uma predisposição genética para reagir a certos alergénios. Em 1998, estimava-se que 17 milhões de Americanos, ou 6,4 por cento da população, tinham asma. As crianças correspondem a 4,8 milhões de Americanos com asma. Informação experimental e clinica disponivel de modelos animais e de informação clinica sobre a patologia das asma indicam que as células Th2 estão associadas à patologia desta doença-

Cancros relacionados com Thl e Th2

Em geral, as células de cancro podem surgir de uma resposta imune a antigénios especificamente expresso por uma célula de cancro. Uma vez que ambas as respostas imunes Thl e Th2 podem dirigir fortes respostas inflamatórias conduzindo a erradicação citotóxica do tecido, a modulação das respostas imunes Thl ou Th2 podem ser usadas no tratamento de cancro.

Os cancros que podem ser tratados com a composição de acordo com a divulgação podem ser histogene-ticamente classificados como tumores epiteliais malignos, incluindo carcinomas e adenocarcinomas e como tumores não epiteliais malignos, incluindo lipossarcomas, fibrossar-comas, condrossarcomas, osteossarcomas, leiomiossarcomas, 42 ΡΕ1530972 rabdomiossarcomas, gliomas, neuroblastomas, meduloblasto-mas, melanoma maligno, neningioma maligno, várias leucemias, vários distúrbios mieloproliferativos, vários linfo-mas (linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin), hemangiossarcoma, sarcoma de Kaposi, linfangiossarcoma, teratoma maligno, disgerminoma, seminoma, e coricarcinoma. Os carcinomas e adenocarcinomas são os mais abundantes (correspondendo a aproximadamente 90% das mortes por cancro) e são portanto doenças alvo interessantes para tratar/prevenir de acordo com a divulgação. Os carcinomas e adenocarcinomas mais importantes são os das vias respiratórias (especialmente de origem brônquica), da mama, colo-rectal e do estômago. No entanto, também os carcinomas e adenocarcinomas da próstata, do ovário, do tecido linfóide e da medula óssea, do útero, do pâncreas, do esófago, da bexiga e do rim causam u número significativo de mortes e de são portante interessantes. 0 grupo de doenças cancerosas ainda inclui sindroma de Sezary, linfoma cutâneo das células T, carcinoma hepático e cancro do pulmão.

CÉLULAS T REGULADORAS EM DOENÇAS RELACIONADAS COM THl OU TH2

As células T reguladoras podem induzir tolerância periférica e limitar a reactividade das mucosas (McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl Th2 paradigm in immunity to infectious 43 ΡΕ1530972 diseases. Trends Immunol 2002;23(9):450-5). Em vários modelos animais, foram descritos vários fenótipos de células T reguladoras. As células T reguladoras expressam vários marcadores e têm sido indicadas como estando envolvidas em várias doenças (Ver, e.g., Field, A. C, L. Caccavelli, M. F. Bloch, and B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2 -mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170:2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):223-32; Francois Bach J. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3): 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec;14(6):771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep;23(9):450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug; 182: 135-48; Read S, Powrie F. CD4 ( + ) regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec; 13(6):644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep;3(l 1):899-904). Nalguns sistemas, distinguem-se pela expressão diferencial das moléculas de superfície tais como CD25 (Shevach, E. M. 2002. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nature Reviews. Immunology. 2:389-400),) CD45RB (Annacker, O. and F. Powrie. 2002. Homeostasis of 44 ΡΕ1530972 intestinal immune regulation. Microbes & Infection. 4:567-574), e CTLA-4 (Read, S., V. Malmstrom, and F. Powrie. 2000. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J.Exp.Med. 192:295-302). Este padrão de expressão de proteínas da superfície celular sugere que possam estar num estado efector sensibilizado ou de memória. Estas células reguladoras podem mediar alguns dos seus efeitos através da produção de IL10 e ΤΘΕβ. Está descrita uma célula T reguladora anérgica (Trl) que produz níveis elevados de IL10 e ΤΕΘβ. Uma outra célula designada Th3 suprime a indução de encefalomielite autoimune experimental principalmente através da produção de ΤΟΕβ. Ainda, outras não estão dependentes de IL10 ou TGFp solúvel, mas antes expressam na sua superfície péptido associado a latência, o qual é o domínio terminal amina do péptido percursor ΤΘΓβ (Oida T, Zhang X, Goto M et al. CD4+CD25- T cells that express latency-associated peptide on the surface suppress CD4+CD45RBhigh-induced colitis by a TGF-beta-dependent mechanism. J Immunol 2003 ; 170(5):2516-22). Os marcadores celulares internos também foram descritos para células T reguladoras (Schubert LA, Jeffery E, Zhang Y, Ramsdell F, Ziegler SF, Scurfin (FOXP3) acts as a repressor of transcription and regulates T cell activation. J Biol Chem. 2001 Oct 5;276 (40) :37672-9) . Todas as referências são aqui incluídas como referência.

Murganhos Rag reconstituídos com células CD4+ 45 ΡΕ1530972 CD45high podem desenvolver colite severa, a qual pode ser prevenida pela cotransferência de células T CD4+, CD45low (Annacker 0, Powrie F. Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection 2002;4(5):567-74). TGF£ e IL-10 são necessárias para a protecção sugerindo um papel destas citocinas no processo regulador.

PREPARAÇÕES DE PARASITAS HELMÍNTICOS

Os helmintas são animais parasitas (vermes), dependentes de outras espécies, vivem em localizações tais como o lúmen intestinal, corrente sanguínea ou músculos do hospedeiro. Estes organismos colonizam mais de 1/3 da população mundial. A colonização por helmintas é mais frequente em crianças que vivem nos climas quentes e sujeitos a pouco saneamento. As formas infecciosas destes organismos são disseminadas através do contacto com solo, alimentos ou água contaminados. Antes dos anos 40, muitas crianças e adultos nos Estados Unidos eram portadores de helmintas. Ser portador de vermes era particularmente comum em áreas rurais do Sul e em populações indigentes das grandes cidades ( (Elliott DE, Urban JF, Jr., Argo CK et al. Does the failure to acquire helminthic parasites predispose to Crohn's disease? FASEB J 2000; 14(12): 1848-55).). Nos

Estados Unidos e Europa, a colonização por helmintas tem diminuído estavelmente. Eles são encontrados em imigrantes recentes de países menos desenvolvidos (Salas SD, Heifetz R, Barrett-Connor E. Intestinal parasites in Central American immigrants in the United States. Arch Intern Med 46 ΡΕ1530972 1990; 150(7) : 1514-6)) e em populações economicamente em desvantagem vivendo nas regiões carenciadas dos Estados Unidos, como sejam algumas reservas índias ((Healy GR, Gleason NN, Bokat R et al. Prevalence of ascariasis and amebiasis in Cherokee Indian school children. Public Health Rep 1969; 84 (10) :907-14) .) . A prevalência de helmintas é mais elevada em climas quentes e em populações de grandes densidades, mau saneamento básico e fontes de alimentos contaminadas. A doença inflamatória intestinal (IBD), artrite reumatóide e doenças autoimunes são raras nestas mesmas regiões.

Os nemátodos que frequentemente habitam o intestino humano são Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis (oxiúro) , Trichuris trichuria (tricurideo), Ancylostoma duodenale e Necator americanus (ancilóstomo) e Strongyloides stercoralis. Trichinella spiralis infesta o intestino delgado durante um curto período.

Os platelmintas incluem tremátodos e cestodos. Os tremátodos adultos mais comuns que residem nos intestinos humanos são espécies de Fasciolopsis, Echinostoma e Heterophyes. Os que vivem no sistema biliar incluem Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini e felineus e Fasciola hepatica. O esquistossoma habita o sistema venoso, mas várias espécies afectam cronicamente o intestino através da passagem de ovos através da parede intestinal. Os cestodos adultos que frequentemente infectam os seres humanos são espécies de Diphyllobothrium (ténia dos 47 ΡΕ1530972 peixes), Taenia saginata (ténia do boi), Taenia solium (ténia do porco) e Hymenolepsis nana (ténia anã). 0 hospedeiro adquire várias espécies helmínticas através do contacto com o solo, alimentos ou água contaminados com a forma infecciosa do parasita. As crianças frequentemente são portadoras de infecções helmínticas devido ao seu contacto estreito com o solo e práticas higiénicas subóptimas. Os helmintas induzem uma resposta intestinal Th2, a qual pode causar a expulsão dos vermes ou limitar a magnitude da infecção. A maioria das crianças que vivem em países não industrializados possuem estes parasitas. Muitas espécies de helmintas sobrevivem durante anos no intestino, árvore biliar ou veias mesentéricas produzindo milhares de ovos diariamente. Assim, começando na infância, estes vermes e/ou os seus ovos libertam moléculas que banham a mucosa intestinal durante anos induzindo inflamação tipo Th2. A. Vacinas de organismos viáveis:

Os organismos parasitas helmínticos viáveis podem proporcionar o condicionamento mais profundo das mucosas devido à sua relativa longevidade comparativamente com vacinas de componentes. Organismos viáveis podem ser administrados nas formas de ovos, larvas, cercárias ou larvas enquistadas, dependendo dos helmintas. Podem ser utilizados helmintas que podem colonizar os humanos e um animal preparatório. 48 ΡΕ1530972 O animal preparatório pode necessitar de manipulação para permitir elevada patência pelo helminta. Tal manipulação pode incluir tratamento com agentes que são imuno-supressores tipo glucocorticóides ou azatioprina; agentes que impedem efeitos Th2 tipo anti-histaminas, anti-citocinas ou citocinas recombinantes; e agentes que influenciam a motilidade intestinal tipo anticolinérgicos ou opiáceos. A dieta do animal será alterada para reduzir o teor em fibra. 0 animal pode ser um rato, porco, hamster, ave ou outro animal preparatório.

Os animais preparatórios são criados em ambientes livres de agentes patogénicos específicos (SPF) (e.g., livres de patogénicos humanos específicos) de acordo com métodos conhecidos na área. Eles são testados para assegurar a ausência de bactérias humanas, micobactérias e agentes patogénicos virais. Os métodos para criar animais em ambiente SPF e a sua vantagem estão descritos na área, e.g., por M. Michael Swindle (J. Invest. Surg., 9:267-271, 1996, aqui incluído como referência). Swindle também descreve vários agentes patogénicos humanos virais e bacterianos com importância. Assim, as preparações de parasitas derivadas de animais criados num ambiente livre de agentes patogénicos humanos específicos não conterá estes agentes patogénicos humanos e como tal são francamente distintas das preparações de parasitas preparadas a partir de animais criados em qualquer ambiente SPF. 49 ΡΕ1530972

Ovos: alguns helmintas intestinais são adquiridos através da ingestão de ovos viáveis. Os helmintas são mantidos em animais preparatórios, por exemplo porcos SPF. Para colher os ovis, é dada aos animais uma dieta especial baixa em fibras. Os animais recebem uma purga oral para induzir a defecação. As fezes são colhidas e digeridas enzimaticamente para libertar os ovos. Os ovos são isolados a partir de fezes liquefeitas através da flutuação em gradientes de densidade, filtração, filtração de Visser ou elutriação centrífuga. A preservação dos ovos varia com o helminta usado. Os ovos dos helmintas que sejam resistentes a desidratação são secos, formulados com material inerte, incorporados numa cápsula entérica e refrigerados. Os ovos de helmintas que sejam susceptiveis à desidratação são preservados através de refrigeração em meio liquido ou através da adição de crioprotector e congelação em azoto liquido. Os ovos viáveis são lavados, misturados com pudim sem lactose arrefecido ou outro veiculo no local de entrega. Os ovos guardados em crioprotector baseado em glicerol podem não necessitar de lavagem. Os ovos de cada lote são testados relativamente à eclosão para determinar a dosagem efectiva. Os ovos de cada lote são testados relativamente à ausência de agentes patogénicos bacterianos e virais.

Larvas: Alguns helmintas (i.e. ancilóstomos) requerem uma fase de maturação no solo antes de poderem colonizar os humanos. Os ovos destes agentes serão incubados em condições óptimas para maturar o embrião ou 50 ΡΕ1530972 eclodir o ovo e proporcionar formas larvares. Os doentes podem ser inoculados por injecção subcutânea ou ingestão oral de larvas viáveis.

Cercárias: Alguns helmintas possuem ciclos de vida complexos que utilizam um hospedeiro intermediário. 0 hospedeiro intermediário dissemina a forma capaz de colonizar os seres humanos. As cercarias são a forma para os helmintas tremátodos (i.e. fasciola) se disseminarem através de hospedeiros intermediários como sejam os caracóis. As cercárias são isoladas a partir de caracóis colonizados crescidos em condições SPF. As cercárias são lavadas. Estas podem ser preservadas através da adição de crioprotector e congelação em azoto líquido. As cercárias descongeladas ou frescas são lavadas e injectadas subcutaneamente para inocular doentes. Amostras de cada lote são testadas relativamente à ausência de agentes patogénicos e determinada a dose efectiva.

Larvas enquistadas: Alguns helmintas (e.g. ténias) formam larvas enquistadas ou cisticercos em hospedeiros intermediários. É a forma de larva enquistada que inicia a colonização humana. As larvas enquistadas são removidas dos hospedeiros intermediários, por exemplo gado bovino ou peixe ou plantas crescidas em condições SPF. Os cistos são lavados para remover tecido do hospedeiro. Os cistos podem ser preservados através da adição de crioprotector e congelação em azoto liquido. Os cistos são descongelados ou usados frescos, lavados, misturados com 51 ΡΕ1530972 pudim sem lactose arrefecido oou outro veiculo no local de entrega e dados aos indivíduos. As amostras de cada lote são testadas relativamente à ausência de agentes patogénicos e para determinar a dose efectiva. B. Vacinas de componentes não viáveis:

Os componentes não viáveis de parasitas helmínticos proporcionam condicionamento Th2 suficiente da resposta imune para prevenir a patologia mediada por Thl. Os componentes não viáveis derivam de ovos, larvas ou vermes adultos.

Ovos de esquistossoma intactos não viáves produzem uma forte resposta Th2. Os ovos são isolados a partir de figados de animais preparatórios (i.e, hamsters) crescidos em condições SPF. Os ovos são isolados por um método modificado relativamente ao originalmente descrito por Coker e Lichtenberg, 1956, Proceedings of the Soc. For Exp. Biol. & Med. 92:780. As modificações consistem na utilização de soro fisiológico tamponado com fosfatos e glucose em vez de 1,7% de soro fisiológico para incubação e passos de lavagem juntamente com o decréscimo do tempo de digestão autolitica. Estas alterações promovem o isolamento de ovos viáveis. 0 método é como se segue.

Infectar cobaios dourados com 1000 a 1500 cercá-rias. Deixar a infecção maturar (6 a 7 semanas). Remover os figados dos animais e colocar em soro fisiológico tamponado 52 ΡΕ1530972 com fosfatos estéril 600 mOsm contendo 5% de glucose, 100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina. Os fígados são deixados a autodigerir durante 24 horas à temperatura ambiente. Os fígados são homogeneizados com pulsos a baixa velocidade durante 3 minutos num misturador Waring frio. Incubar o homogenato com colagenase (2 mg/ml) e tripsina (2 mg/ml) a 32°C durante uma hora. Filtrar o homogenato através de crivos de 50 e 80-100 mesh para remover grumos de tecido e detritos. Recuperar os ovos a partir do filtrado passando sobre um crivo de 325 mesh. Os ovos não passam através do filtro. Os ovos são aspergidos do filtro para um tubo de centrífuga de 50 ml em poli-propileno. Lavar os ovos através de centrifugação repetida a baixa velocidade (400 xg) em soro fisiológico tamponado com fosfatos estéril com 5% de glucose. Os ovos devem estar livres de quaisquer detritos de colagénio. Contar uma alíquota de ovos numa câmara de Sedwick de 1 ml para determinar o número total de ovos.

Os ovos isolados são suspensos em soro fisiológico e congelados em azoto líquido sem crioprotector. Isto mata o ovo. Os ovos descongelados são injectados subcu-taneamente, intramuscularmente ou intravenosamente, ou em locais de inflamação Thl para induzir fortes respostas Th2. Os ovos de outros helmintas podem ser igualmente utilizados .

As vacinas de componentes podem ser igualmente usadas e empregam proteínas, lípidos ou açúcares isolados a 53 ΡΕ1530972 partir de ovos do parasita. Um exemplo é os antigénios solúveis do ovo de esquistossoma (SEA) . 0 método para a preparação de antigénio do ovo de esquistossoma foi anteriormente descrito por Boros and Warren, 1970, J. of Experimental Med. 132:488 e está resumidamente descrito abaixo.

Os ovos lavados são suspensos a 50 000 ovos/ml de soro fisiológico tamponado com fosfatos. Isto é transferido para um homogeneizador de tecidos em vidro. Os ovos são homogeneizados em gelo. Para assegurar que todas as cascas são rebentadas e os miracideos destruídos, uma alíquota (5 ml) é removida para observação ao microscópio. Transferir o homogenato para tubos de ultracentrifuga. Centrifugar a 100000 x g durante 2 horas a 4°C. Recuperar a fracção aquosa (SEA) e determinar o teor proteico. Guardar o SEA em pequenas aliquotas a -70°C. Este método pode requerer modificação para isolar os produtos dos ovos de parasita que mais fortemente promovam o condicionamento Th2, i.e., para atingir uma concentração eficaz óptima (100 pg SEA ou 10000 ovos/animal). Os ovos ou componentes solúveis dos ovos foram usados para iniciar respostas Th2 ou para reforçar respostas Th2 anteriormente iniciadas através da colonização com helmintas viáveis. Os ovos ou componentes dos ovos são testados para confirmar a ausência de agentes patogénicos e endotoxina.

As vacinas de componentes podem também ser desenvolvidas a partir de larvas e vermes adultos de 54 ΡΕ1530972 parasitas helmínticos. As larvas ou vermes são isolados a partir de animais preparatórios crescidos em condições SPF. As vacinas que empregam organismos intactos não viáveis ou proteínas, lípidos ou açúcares isolados a partir do helminta são preparados e utilizados de forma semelhante ao anteriormente descrito para os ovos de helmintas.

Também estão incluídas na presente divulgação vacinas contendo fracções ou subfracções dos parasitas helmínticos, assim como vacinas contendo proteínas isoladas, polinucleótidos, açúcares, lípidos, etc. derivados de parasitas helmínticos de acordo métodos conhecidos na área, e.g., como descrito em Williams et al., 1994, Leukocytes of patients with Schistosoma mansoni respond with a Th2 pattern of a cytokine production to mitogen or egg antigens but with a ThO pattern to worm antigens. J. Infect. Dis. 170:946; Xu-Amano et al., 1993, Helper T cell subsets for immunoglobulin A responses: oral immunization with tetanus toxoid and cholera toxin as adjuvant selectively induces Th2 cells in mucosa associated tissues. J. Exp. Med. 178: 1309; Ausiello et al., 2000, Cell mediated immunity and antibody responses to Bordetella pertussis antigens in children with a history of pertussis infection and in recipients of an acellular pertussis vaccine. J. infect. Dis., 181:1989.

Por exemplo, as fracções ou subfracções podem ser preparadas de acordo com o método descrito em Thaumaturgo et al., (2001, Preliminary Analysis ofSml4 in Distinct 55 ΡΕ1530972

Fractions of Schistosoma mansoni Adult Worm Extract, Mem. Inst. Oswaldo Cruz vol.96 suppl. Vol. 96, Suppl.: 79-83, aqui incluído como referência na sua totalidade) . Neste método, parasitas de S. mansoni foram obtidos por perfusão retrógrada com soro fisiológico heparinizado (solução a 0,85% de NaCl), 45 dias pós-infecção (Pellegrino & Siqueira 1956, Técnica de perfusão para colheita de Schistosoma mansoni em cobaias experimentalmente infectadas. Rev Bras Mai D Trop 8: 589-597), e usados para a preparação dos diferentes extractos.

Preparação de extracto derivado de vermes adultos (SE) - Os parasitas foram lavados em PBS. Os vermes vivos foram então deixados em repouso à temperatura ambiente (28°C a 0°C) em PBS (soro fisiológico tamponado com fosfatos) fresco durante 2-3 horas e congelados a -20°C. Após descongelação, as suspensões de PBS dos vermes (1 g de vermes/10 ml de PBS) foram filtradas através de um crivo e centrifugadas a 10000 xg durante lha 4°C (Tendler & Scapin 1981, Schistosoma mansoni antigenic extracts obtained by different extraction procedures. Mem Inst Oswaldo Craz 76: 103-109; Tendler et al. 1982, Immunogene and protective activity of an extract of Schistosoma mansoni. Mem Inst Oswaldo Cruz 77: 275-283). O teor proteico de SE foi avaliado pelo método de Lowry (Lowry et al. 1951) e lotes de stock contendo 1 mg/ml foram guardados a -20°C. Os extractos de machos e de fêmeas foram preparados de acordo com a mesma metodologia, com os parasitas separados imediatamente após a perfusão. 56 ΡΕ1530972 A preparação de uma "fracção" rapidamente libertada de extracto derivado de vermes adultos (Sei) preparação Sei correspondeu ao passo inicial de SE: após perfusão como descrito para SE, os vermes vivos foram incubados durante 2-3 horas à temperatura ambiente (28°C a 30°C) em PBS. Em seguida, os vermes adultos foram filtrados da solução de incubação (Sei) num crivo.

Preparação de SE2 - Os vermes adultos, que restaram da preparação SE inicial, foram novamente armazenados congelados (-20°C) em PBS durante uma semana (1 g de vermes/10 ml de PBS) . Após descongelação, as suspensões de PBS foram filtradas através de um crivo e centrifugadas a 10000 g durante lha 4°C.

Os antigénios de parasitas podem ser igualmente extraídos como descrito na figura 1 de Thaumaturgo et al. (supra) (reproduzida como Figura 23) . Como alternativa, os antigénios de parasitas podem ser preparados como descrito em Deelder et al. (1980. Applicability of different antigen preparations in the enzyme-linked immunosorbent assay for schistosomiasis mansoni. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29:401-410). Por exemplo, os antigénios podem ser preparados a partir de SWAP preparado como fluidos solúveis do sobre-nadante dos homogenatos em soro fisiológico tamponado da respectiva fase do ciclo de vida (Goes et al. 1989,

Production and characterization of human monoclonal antibo-dies against Schistosoma mansoni. Parasite Immunol 11 : 57 ΡΕ1530972 695-711). SWAP foi fraccionado por cromatografia de permuta aniónica em FPLC (cromatografia liquida rápida de proteínas) como anteriormente descrito (Hirsch & Goes 1996, Characterization of fractionated Schistosoma mansoni soluble adult worm antigens that elicit human cell proli-feration and granuloma formation in vitro. Parasitology 112: 529-535). Resumidamente, as proteínas foram eluídas com Tris-HCl 20 mM, pH 9, 6, num gradiente crescente de múltiplos passos até NaCl 1 M, interrompido por intervalos de de paragem do gradiente em 0, 100, 280, 450, 600 e 750 nM. As fracções não retidas foram concentradas por liofilização. O material concentrado foi dialisado contra soro fisiológico tamponado com fosfatos 0,15M (PBS), pH 7,4, esterilizado por filtração e guardado a -70°C. O teor proteico foi medido de acordo co o microensaio de Bradford (Bradford 1976, A rapid and sensitive method for the quantification ofmicrogram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Analyt Biochem 72: 248-254, aqui incluído como referência na sua totalidade). A análise das seis fracções, separadas por 10% SDS-PAGE (electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poli-acrilamida) em condições redutoras (Laemmli 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophage T4. Nature 227: 680-685, aqui incluído como referência na sua totalidade) mostrou múltiplas bandas proteicas, a fracção III contendo proteínas de massa elevada (97 e 160 kDa) , intermédia (52 e 56 kDa) e baixa (28 e 36 kDa). Esta fracção foi designada PIII e foi usada em diferentes ensaios imunológicos. 58 ΡΕ1530972

Os lípidos podem ser igualmente preparados como descrito na literatura, por exemplo, em van der Kleij et al. (1999, Recognition of Schistosome Glycolipids by Immunoglobulin E: Possible Role in Immunity Infection and Immunity, 67: 5946-5950, aqui incluído como referência na sua totalidade).

Numa realização, os lípidos de vermes adultos de S. mansoni (12 g [peso molhado)] e ovos (1,6 g [peso molhado]) foram extraídos pelo método descrito por Bligh and Dyer (1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917). A fase orgânica foi seca num rotavapor, dissolvida em 10 ml de clorofórmio e aplicada numa coluna de 20 ml do permutador iónico TEAE-celulose (Serva, Heidelberg, Germany) que foi convertida na forma de hidroxilo. Os lípidos foram eluídos como descrito por Rouser et ai. (1969. Diethylaminoethyl and triethylaminoethyl cellulose column chromatographic procedures for phospholipids, glycolipids, and pigments. Methods Enzymol. 14:272-317). de acordo com este protocolo, as fracções contendo os lípidos: fracção 1, colesterol, glicéridos e outros lípidos neutros; fracção 2, cerebrósidos, glicerol diglicéridos, fosfatidilcolina e esfingomielina; fracção 3, ceramidapoli-hexósidos; fracção 4, substâncias inorgânicas; fracção 5, fosfatidiletanolamina e ácidos gordos livres; fracção 6, fosfatidilserina; fracção 7, nenhum (passo de lavagem); e fracção 8, ácido fosfatidico, cardiolipina, fosfatidil- 59 ΡΕ1530972 glicerol, fosfatidilinositol e outros lípidos acidicos. A presença de glicolípidos nas fracções 2 e 3 foi confirmada por coloração com orcinol das fracções lipídicas em placas de HPTLC (1956. Quantitative estimation of cerebrosides in nervous tissue. J. Neurochem. 1 :42-53). C. Manutenção de organismos helmintas:

Os helmintas foram passados ciclicamente através de animais intermediários e preparatórios crescidos em condições SPF. As amostras de populações de helmintas foram testadas para assegurar a estabilidade fenotipica como sejam taxas de colonização, fecundidade e susceptibilidade a anti-helmínticos.

DOSAGEM, ADMINISTRAÇÃO E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

Os indivíduos necessitados de tratamento receberam a forma infectada do parasita (ovo, cercárias ou larvas) oralmente ou parenteralmente, dependendo do ciclo de vida natural do parasita seleccionado. Como alternativa, os extractos de vermes solúveis podem ser dados oralmente ou parenteralmente para induzir respostas TH2.

Relativamente aos helmintas intestinais e hepáticos e esquistossomas, eles começam a produção de ovos que surgem mas fezes cerca de 30-60 dias após inoculação. A quantificação dos ovos em fezes é prova satisfatória da 60 ΡΕ1530972 adequação da avaliação e intensidade da infecção. Aliquotas de fezes foram processadas por flutuação em sacarose para determinar o número total de ovos em cada amostra. A flutuação numa solução de sacarose é um método frequentemente usado para isolar ovos a partir de fezes para a contagem com precisão como descrito por Koontz and Weinstock, 1996, Gastroenterology Clinics of N. America. 25:435.

Os compostos de parasitas helminticos da divulgação podem ser formulados para administração de qualquer forma conveniente e a divulgação inclui assim composições farmacêuticas compreendendo o composto de parasita helmintico de acordo com a divulgação adaptada para uso em seres humanos. Tais composições podem ser apresentadas para uso de forma convencional com a ajuda dos veiculos ou excipientes farmacêuticos necessários. 0 composto de parasita helmintico de acordo com a descrição pode ser formulado para injecção e, portanto, uso como vacina e pode ser apresentado na forma de dosagem unitária em ampolas ou em contentores de múltiplas doses, se necessário, como preservativo adicionado. As composições podem igualmente tomar formas como suspensões, soluções ou emulsões de veiculos oleosos ou aquosos e podem conter agentes formuladores tais como agentes suspensores, estabilizadores e/ou dispersores. Como alternativa, o parasita helmintico pode estar na forma de pó ou reconstituído 61 ΡΕ1530972 com um veículo adequado, e.g., água estéril apirogénica, antes de uso.

Caso se pretenda, tal formulação de pó pode conter uma base não tóxica adequada de forma a assegurar que o pó seja reconstituído com água, o pH da formulação aquosa resultante sendo fisiologicamente aceitável.

Os compostos do parasita helmíntico podem também ser formulados como supositórios, e.g. contendo bases de supositórios convencionais tais como manteiga de cacau ou outros glicéridos.

Os compostos de parasita helmíntico podem ser igualmente formulados para dosagem oral com agentes de enchimento convencionais, veículos e excipientes. A quantidade de parasita administrado ao indivíduo necessitado é uma quantidade suficiente para prevenir ou tratar a doença autoimune. Esta quantidade pode variar dependendo da doença a ser tratada ou prevenida e do parasita helmíntico, se é para ser administrado intacto ou como um ovo, larva, extracto ou cercária.

Tipicamente, quando os parasitas são administrados para todas as doenças autoimunes aqui discutidas, as quantidades variam entre cerca de 50 e cerca de 50000. Mais particularmente, esta quantidade pode variar entre cerca de 500 e cerca de 5000. Quando os ovos são utilizados, cerca de 500 a cerca de 5000 podem ser utilizados para tratar as 62 ΡΕ1530972 doenças autoimunes aqui descritas. Quando os extractos são administrados, cerca de 100 yg a cerca de 10000 yg são utilizados para tratar as doenças autoimunes. Quando as larvas e as cercarias são administradas, as dosagens podem variar entre cerca de 500 e cerca de 5000 em cada caso.

Para a prevenção ou uso como vacina, as quantidades dos parasitas podem ser de 500-5000. A dosagem de uma preparação de parasita pode ser monitorizada através da medição das repostas Thl, Th2 ou de células reguladoras. Como alternativa, a dosagem pode ser monitorizada através da avaliação da patologia ou sintomas de uma doença particular como conhecido na arte ou aqui descrito. A. Determinação das respostas Thl e Th2 de forma a mostrar a eficácia do presente invento, a resposta Thl e Th2 pode ser distinguida. Metawali et al., 1996, J. of Immunol. 157:4546 mostrou que nos murganhos, é possível distinguir ua resposta Thl de Th2 através da análise histológica e através da análise dos perfis de citocinas e de imunoglobulinas. Ainda, Sandor et al., 1990, J. of Exp. Med. 171:2171 mostraram que a expressão na superfície celular de moléculas Fcg3 e MHC Classe II permite a descriminação. Neste procedimento, intestino delgado e cólon são examinados histologicamente para determinar o grau de inflamação da mucosa, eosinofilia 63 ΡΕ1530972 e mastocitose. Os múltipos tipos celulares são indicativos de uma resposta Th2. os nódulos mesentéricos (MLN) e baços podem ser dissociados em suspensões de células individuais para cultura in vitro em placas de micro-alvéolos. As células (1-2 x 106/alvéolo) em meio PMI completo foram cultivadas durante até 72 h na presença ou ausência de antigénio de verme ou anti-CD3 e depois os sobrenadantes foram testados relativamente a citocinas e imunoglobulinas. IFN-γ, TNFoí e IgG2a caracterizam uma resposta Thl, enquanto IL-4, 11-5, IgE e IgGl tipificam uma reacção Th2. Igualmente, o soro pode ser testado para concentrações de citocinas e imunoglobulinas. Ainda, leucócitos inflamatórios dispersos foram avaliados por citometria de fluxo para a expressão de FCy3 em macrófagos (Thl) e expressão de MHC Classe II em células B (Th2). Os controlos incluem soro, MLN e baços de murganhos com a mesma idade da mesma ninhada mas sem parasita.

Uma análise semelhante pode diferenciar uma resposta Thl de Th2 humana. Examina-se tecido inflamado, leucócitos isolados das regiões de inflamação e células do sangue periférico. Os leucócitos foram cultivados in vitro sozinhos ou na presença de antigénio de parasita ou de mitogénios para estimular a libertação de citocinas. IgG2 substitui IgG2a. B. Determinação de actividade de células T reguladoras

No presente invento a actividade de células T 64 ΡΕ1530972 reguladoras é determinada através da determinação do nivel de Scurfin. Os métodos de isolamento de células T reguladoras a partir de cultura in vitro ou de animais são conhecidos na área, por exemplo, como descrito em McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl /Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002; 23 ( 9) :450-5; Field, A. C, L. Caccavelli, M. F. Bloch, and B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170:2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):223-32; Francois Bach J. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3): 189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec;14(6):771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Thl/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep; 23 (9) :450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug; 182: 135-48; Read S, Powrie F. CD4 ( + ) regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec;13(6):644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep;3(l l):899-904; Shevach, E. M. 2002. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nature Reviews.Immunology. 2:389-400; Annacker, O. and F. Powrie. 2002. Homeostasis of 65 ΡΕ1530972 intestinal immune regulation. Microbes & Infection. 4:567-574; Read, S., V. Malmstrom, and F. Powrie. 2000. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function ofCD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J.Exp.Med. 192:295-302. A resposta de células T reguladoras ou actividade pode ser medida através de um marcador interno, um marcador da superfície celular ou um marcador secretado como aqui descrito.

Marcadores internos úteis para células T reguladoras incluem mas não estão limitados a factores de transcrição tais como Scurfin, Smad7, Gata 3, Tbet (Tbx21).

Marcadores de superfície úteis para as células T reguladoras incluem mas não estão limitados a CD4, CD45RB10, CD45Rc, Antigénio associado a linfócitos T citoliticos 4 (CTLA-4), CD25, CD 103, 0x40, 4- IBB, CD62L, integrina αΕβ, péptido associado à latência (LAP) ou proteina relacionada com a familia de receptores de TNF induzido por glucocorticóides (GITR), receptor de quimiocinas CCR5, TI-ST2.

Marcadores secretados úteis para as células T reguladoras incluem mas não estão limitados a IL-5, IL-10 e TGF3. 66 ΡΕ1530972 C. Exemplos de métodos para a medição in vitro da quantidade de marcadores

Detecção de citocinas por citometria de fluxo:

Esplenócitos, MLN ou células inflamatórias intestinais em meio completo RPMI foram colocadas e placas de cultura de tecidos de 24 alvéolos a 2 x 106 células/alvéolo. as células foram incubadas 4-6 h na presença ou ausência de anti-CD3 ou do antigénio adequado com brefeldina A a 10 yg/ml. A brefeldina inibe a exocitose de proteínas e promove a acumulação da citocina dentro da célula. Para a detecção citoplasmática de citonas, as células são fixadas em 2% de paraformaldeido à temperatura ambiente durante 5 minutos seguido da coloração da superfície para distinguir os subtipos celulares. As células foram lavadas e ressuspensas em 50 μΐ de PBS 0,2% de Saponina e 1 yg de anticorpo anti-citotcina e incubadas à temperatura ambiente durante 20 minutos. Em seguida, as células foram lavadas duas vezes em Saponina e ressuspensas em PBS/FCS. A especificidade do anticorpo contra citocinas foi confirmada através do pré-bloqueio das células com um excesso de anticorpo não conjugado do mesmo isotipo e especificidade da citocina ou através da incubação das células na presença de citocina recombinante. Os controlos de anticorpo irrelevante marcado com ficoeritrina (PE) também estão incluídos para avaliar a coloração de fundo. As células foram analisadas usando citometria de fluxo. ELISAs: Os ELISA sedem as concentrações de 67 ΡΕ1530972 citocina e anticorpo nos sobrenadantes celulares das células em cultura em placas de microtitulação e manipuladas como descrito atrás. Muitos destes ensaios estavam já optimizados no nosso laboratório. As citocinas foram testadas usando dois anticorpos monoclonais (mAbs) num ELISA tipo sanduíche de dois locais. Os mAbs anti-citocina foram purificados por precipitação com amónio a partir de sobrenadantes de clones de hibridoma secretores de anticorpo. As placas de microtitulação foram revestidas com 50 μΐ de um anticorpo de revestimento a 1 yg/ml em PBS contendo Tween 20 (PBS-T) e incubadas a 4°C durante a noite. Em seguida, os alvéolos foram bloqueados pela adição de 150 μΐ de 10% FCS em PBS com incubação a 37°C durante 30 minutos. Os padrões compreendem citocina recombinante ou sobrenadantes contendo citocinas derivados de células do baço activadas com mitogénio ou com antigénio de murganhos infectados com esquistossomose. As diluições da amostra e dos padrões foram feitas em RPMI contendo 10% de FCS (RPMI completo) numa placa de microtitulação de fundo plano, 96 alvéolos, separada e volumes de 50 μΐ foram transferidos para as placas de ELISA que tinham sido lavadas três vezes em PBS-T. As amostras foram incubadas nas placas do ensaio durante lha 37°C. O mAb adequado foi conjugado com biotina. Após três lavagens em PBS-T, cada alvéolo recebeu 50 μΐ de conjugado anticorpo-biotina a 0,5 pg/ml em 1% BSA/PBS-T. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 h seguido de lavagem três vezes em PBS-T. O conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano silvestre (75 μΐ) foi adicionado a 1 μ/ml em 1% BSA/PBS-T e incubado 68 ΡΕ1530972 à temperatura ambiente durante 1 h. As placas foram lavadas 10 vezes em PBS-T fresco e 100 μΐ de substrato (ácido 2.2'-azino (3-etilbenzetiazolino sulfónico) a 1 mg/ml em Na2HPC>4 , ácido citrico 28 mM e adicionou-se 0.003% H2O2. O produto corado foi medido num comprimento de onda de 405 nm com um comprimento de onda de referência de 4 90 nm, usando um leitor de microplacas de multivarrimento.

As imunoglobulinas foram quantificadas usando ELISas específicos anti-isotipo. Os anticorpos de cabra purificados por afinidade anti-IgM, -IgGl, -IgG2a, -IgG2b, -IgG3, -IgA e -IgE foram usados como anticorpos de captura e absorvidos a placas de microtitulação flexíveis em polivinilo a 10 pg/ml. Após adição dos sobrenadantes de cultura, incubação e lavagem, foi usado a anti-imunoglobulina do isotipo adequado de cabra conjugado com fosfatase alcalina para detectar imunoglobulinas totais de murganho ligadas às placas. Foram produzidas curvas padrão usando imunoglobulina purificada. Para medir o anticorpo específico do antigénio de parasita, antigénio solúvel foi biotinilado e usado para detectar imunoglobulina de murganho ligada. As placas foram analisadas num leitor de ELISA a 410 nm e as concentrações de imunoglobulina total foram determinadas usando a curva padrão e programas de análise de melhor ajustamento. As concentrações de anticorpos específicos de antigénio foram comparadas relativamente às leituras das D.O., uma vez que o antigénio solúvel de parasita não é um antigénio definido que permite a quantificação precisa. 69 ΡΕ1530972

Ensaios de ELISPOT: Os ensaios de ELISPOT foram estabelecidos para contar linfócitos secretores de anticorpo policlonal ou citocinas. Placas de microtitulação de noventa e seis alvéolos nitrocelulose backed # foram revestidas durante a noite a 4°C com 1 pg/ml de anticorpos anti-imunoglobulina ou anti-citocina em PBS-T. As placas foram então bloqueadas com PBS contendo 10% FCS e lavadas extensivamente com PBS-T.

Diluições seriadas de uma suspensão de células isoladas, começando com 5 x 104 células/alvéolo, foram incubadas na placa durante 5 horas a 37 °C numa atmosfera húmida de 5% CO2. As placas foram lavadas com PBS-T e cobertas com anticorpos anti-imunoglobulina ou anti-citocina biotinilados durante a noite a 4°C. Em seguida foram lavadas e tratadas com conjugado de estreptavidina-glucose oxidase durante 2 h e novamente lavadas. O anticorpo ou citocina secretada pelas células individuais foi visualizado com substrato. A reacção colorimétrica foi parada após 30 min através da lavagem eos pontos enumerados com uma amplificação de 30X. A diluição de células produtoras de 10-50 pontos/alvéolo foi usada para calcular 0 número total de células secretoras por amostra. Os controlos incluem alvéolos revestidos com anticorpo de cabra inadequado ou antigénio inadequado ou deixados por revestir. 70 ΡΕ1530972

Uma modificação do ensaio usando antigénio solúvel para revestir os alvéolos permite também a quantificação de células secretoras de imunoglobulina especifica do antigénio de parasita. Resumidamente, por exemplo, as placas foram revestidas com antigénio de T. muris adulto a 0,25 pg/alvéolo ou o antigénio controlo irrelevante adequado. As células foram adicionadas aos alvéolos após lavagem. Após incubação adequada, as placas foram lavadas novamente e tratadas como descrito atrás. D. Avaliação da patologia da doença A evidência da presença de uma doença auto-imune e da sua cura ou melhoria é necessária para determinar a necessidade de tratamento e para monitorizar a progressão do tratamento. Os procedimentos que se seguem foram utilizados para medir os parâmetros clínicos das doenças estudadas. 1. Doença inflamatória intestinal

Avaliação da inflamação: Em murganhos, a evidência clínica de doença inclui perda de peso, diarreia, prolapso rectal e evidência histológica da inflamação intestinal. Assim a melhoria destes parâmetros deverá significar melhoria da doença.

Para classificar a inflamação intestinal em modelos animais, o tecido é removido, enrolado e embebido 71 ΡΕ1530972 em parafina de acordo com métodos convencionais. As secções foram cordas com hematoxilina e eosina. 0 grau de inflamação colónica foi classificado semiquantitativamente entre 0 e 4 numa forma cega por um único patologista usando a nossa técnica habitual: 0= ausência de inflamação; 1= nivel baixo de inflamação; 2= nivel intermédio de inflamação; 3= nivel elevado de inflamação com espessamento da parede; e 4= infiltração transmural e perda das células goblet com espessamento da parede.

Para contar os mastócitos, as amostras de tecido intestinal de murganhos individuais foram preparadas através da técnica de enrolamento de torta, fixadas em fixador de Carnoy, embebidas em parafina e processadas para coloração com Azul Alsaciano e safranina. Cinquenta campos adjacentes de uma determinada secção foram varridos para encontrar mastócitos da mucosa na lâmina própria e nas camadas de músculo. Os mastócitos foram identificados pela sua coloração distinta granular intracelular com Azul Alsaciano. Todas as amostras foram avaliadas cegamente. A actividade de doença em humanos é monitorizada usando vários critérios clínicos, laboratoriais e histológicos. Existem vários índices de actividade da doença IBD bem estabelecidos que monitorizam Parâmetros clínicos como a frequência de diarreia e a dor abdominal. Um índice particularmente útil para avaliação da doença de Crohn é o índice de Actividade da Doença de Crohn ou CDAI (Best et ai., 1976, Gastroenterology 70: 439). O CDAI incorpora 8 72 ΡΕ1530972 variáveis relacionadas com a actividade de doença e tem sido usado nos estudos mais recentes de agentes terapêuticos na doença de Crohn. Inclui o número de fezes liquidas ou muito moles, a gravidade da dor abdominal ou cólicas, bem-estar geral, a presença de manifestações extra-intestinais da doença, presença ou ausência de uma massa abdominal, uso de fármacos antidiarreicos, hema-tócrito e peso do corpo. A pontuação composta varia entre 0 e cerca de 600. As pontuações abaixo de 150 indicam remissão e as pontuações acima de 450 indicam doença grave.

Um questionário sobre a qualidade de vida especifico da doença e testado e aceite pode também ser dado antes e após o tratamento para avaliar o progresso terapêutico. O Questionário de Doença Inflamatória Intestinal de Irvine é uma questionário e 32 itens (Irvine et al., 1996, The Short Inflammatory Bowel Disease Questionnaire: a quality of life instrument for community physicians managing inflammatory bowel disease. CCRPT 'Investigators. Canadian Crohn's Relapse Prevention Trial. Am J Gasfroenterol. 1996 91(8): 1571-8). Avalia a qualidade de vida relativamente à função intestinal (e.g. fezes moles e dor abdominal), sintomas sistémicos (fadiga e padrão do sono alterado), função social (assiduidade ao trabalho e necessidade de cancelar eventos sociais) e estatuto emocional (furioso, deprimido ou irritável). As pontuações de variam entre 32 e 224, com pontuações mais elevadas a indicarem uma melhor qualidade de vida. Os doentes em remissão geralmente pontuam acima de 170. 73 ΡΕ1530972 A avaliação endoscópica, com raios X e histológica da actividade de doença intestinal pode também ser usada na avaliação. Os niveis de proteína C reactiva e a velocidade de sedimentação podem também ser monitorizados como indicadores sistémicos da inflamação. 2. Artrite reumatóide

Avaliação da inflamação:

Para murganhos com artrite induzida por cola-génio, os murganhos foram avaliados dia sim dia não e as suas patas pontuadas como se segue: 0, normal; I, eritema e inchaço suave confinado à articulação do joelho ou pés; 2, eritema e inchaço suave prolongando-se do tornozelo até ao meio do pé; 3, eritema e inchaço severo estendendo.se desde o tornozelo até às articulações metatársicas; e 4 deformação anquilosante com inchaço da articulação. Estes quatro parâmetros podem ser correlacionados com as alterações histológicas nas articulações artríticas. 0 sucesso do tratamento resulta num decréscimo da pontuação da artrite com melhoria na histologia. Anthony DD. Haqqi TM., Collagen-induced arthritis in mice: an animal model to study the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clinicai & Experimental Rheumatology. 17(2):240-4, 1999.

Para a artrite induzida por pristano, as articulações podem ser medidas com um micrómetro para detectar 74 ΡΕ1530972 inchaço. Em humanos, RA é pontuada através da medição do inchaço da articulação, eritema, limitação do movimento e dor. Em adição, o fluido sinovial pode ser analisado relativamente a concentrações de citocinas e de proteina inflamatória e relativamente à composição de leucócitos e função, de acordo com métodos conhecidos na área. A biópsia sinovial proporciona tecido para análise histológica de acordo com métodos conhecidos na área. Felson DT. Anderson JJ. Boers M. Bombardier C. Furst D. Goldsmith C. Katz LM. Lightfoot R Jr. Paulus H. Strand V. et al. American College of Rheumatology. Preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis.Arthritis & Rheumatism. 38(6):727-35, 1995 Schiff M. A rationale for the use of summary measurements for the assessment of the effects of rheumatoid arthritis therapies. Clinicai Therapeutics. 25(3):993-1001, 2003. 3. Lupus

Avaliação de inflamação: 0 desenvolvimento normal e a função do sistema imune depende criticamente da remoção de células indesejáveis através de um processo designado apoptose. As interacções célula-célula através de moléculas especificas da superfície celular e seus receptores frequentemente induzem o processo. Um desses sistemas é designado FAZ e ligando FAZ. Os murganhos deficientes em FAS (LPR-I-) ou ligando FAS (GLD-I-) desenvolvem uma doença auto-imune do 75 ΡΕ1530972 tipo lupus. Reilly CM. Gilkeson GS. Use of genetic knockouts to modulate disease expression in a murine model of lupus, MRL/lpr mice. Immunologic Research. 25(2):143-53, 2002 .

As colónias de murganhos LPR ou GLD gforam mantidas em unidades de alojamento micro-isoladoras em condições especificas sem agentes patogénicos. Estes murganhos podem desenvolver autoimunidade espontaneamente, mas de forma mais previsível após indução artificial. Para induzir doença, murganhos com 8 semanas de idade foram injectados com um agente tipo pristano. Dentro de dois meses, os murganhos tinham doença auto-imune. Muitos critérios clínicos, histológicos e imunológicos úteis para avaliação da indução da doença e melhoria em murganhos e humanos são bem conhecidos na área. Satoh M. Richards HB. Shaheen VM. Yoshida H. Shaw M. Nairn JO. Wooley PH. Reeves WH. Widespread susceptibility among inbred mouse strains to the induction of lupus autoantibodies by pristane. Clinicai & Experimental Immunology. 121(2):399-405, 2000 4. Diabetes mellitus juvenil independente de insulina (Tipo 1)

Avaliação da inflamação: mellitus tipo autoimune das bioquímico, clínico, O murganho NOD desenvolve diabetes 1 semelhante a humanos devido a destruição células β pancreáticas. Exames 76 ΡΕ1530972 imunológico e histológico de acordo com métodos conhecidos na técnica permitiram a avaliação da indução e melhoramento da doença em murganhos. Ver, e.g., Adorini L. Gregori S. Harrison LC. Understanding autoimmune diabetes: insights from mouse models. Trends in Molecular Medicine. 8(1):31-8, 2002 5. Sarcoidose

Avaliação da inflamação:

No modelo de embolização com uma esfera de inflamação pulmonar, os antigénios (i. e. Thl ou Th2)são acoplados a esferas de Sepharose, as quais são embolizadas nos pulmões de murganhos via injecção nas suas veias da cauda. Os animais geralmente são pré-sensibilizados com o antigénio acoplado. 0 sistema imune do hospedeiro monta uma forte resposta imune contra a esfera ofensiva. Estas respostas inflamatórias focais, que podem durar várias semanas, podem ser avaliadas histologicamente relativamente ao tamanho. Igualmente, podem ser isoladas a partir do tecido e estudadas relativamente à composição de células e produção de citocinas. Ainda, os nódulos linfáticos hilares e baços são facilmente obtidos para experimentação. Ver, Kunkel SL. Lukacs NW. Strieter RM. Chensue SW. Animal models of granulomatous inflammation. Seminars in Respiratory Infections. 13(3):221-8, 1998. 77 ΡΕ1530972 A sarcoidose, uma doença humana, geralmente envolve o pulmão. A determinação do grau de sarcoidose e o grau da doença podem ser feitos de acordo com métodos conhecidos. Os testes de função pulmonar podem avaliar a resposta e função do pulmão. Igualmente, a lavagem bronquiolar obtém células infamatórias que se infiltraram nas árvores brônquica durante o processo inflamatório. Estas células podem ser estudadas relativamente à composição e função. Os infiltrados pulmonares e a linfade-nopatia hilar são caracteristicos da sarcoidose. Assim, o raios X periódico ou varrimentos de CT pode ajudar a avaliar a actividade da doença, os testes serológicos, tais como medição da actividade da enzima conversora da angiotensina de acordo com métodos conhecidos na área, podem ser usados para avaliar a progressão e actividade da doença. Ver, e.g., e.g., Hunninghake GW. Costabel U. Ando M. Baughman R. Cordier JF. du Bois R. Eklund A. Kitaichi M. Lynch J. Rizzato G. Rose C. Selroos 0. Semenzato G. Sharma OP. ATS/ERS/WASOG statement on sarcoidosis. American Thoracic Society/European Respiratory Society/World Association of Sarcoidosis and other Granulomatous Disorders. Sarcoidosis Vasculitis & Diffuse Lung Diseases. 16(2): 149-73, 1999. 6. Esclerose múltipla

Avaliação da inflamação: A encefalomielite auto-imune experimental é 78 ΡΕ1530972 induzida em murganhos susceptíveis através da injecção repetida de antigénios adequados de sensibilização de mielina. Os murganhos são avaliados clinicamente de acordo com os seguintes critérios: 0, sem doença; 1, atonia da cauda; 2, fraqueza dos membros posteriores; 3, paralisia dos membros posteriores; 4, paralisia dos membros posteriores e paralisia ou fraqueza dos membros anteriores; 5, moribundo. Para análise histológica, as medulas espinais e cérebros foram removidos e fixados em formalina. As secções embebidas em parafina foram coradas e examinadas por microscopia óptica. Os esplenócitos dispersos e as células de outras regiões podem ser estudadas in vitro como descrito atrás, estes parâmetros podem ajudar a medir a melhoria da doença, ver, e.g., Sewell, Diane, Zing Qing, Emily Reinke, David Elliott, Joel Weinstock, Matyas Sandor, and Zsuzsa Fabry. Immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by helminth ova immunization. International Immunol. 15:59-69, 2003.

Nos seres humanos, a actividade da doença MS foi avaliada através da monitorização da progressão e remissão dos sinais e sintomas neurológicos. A medição do desfecho mais largamente usada é designada a Escala expandida do estatuto de incapacidade. A composição proteica do fluido espinal cerebral e o teor de células analisados de acordo com métodos conhecidos na área também podem ser usados para monitorizar a actividade de doença. Ainda, estudos seriados de MRI mostram novas lesões cerebrais estimuladas por 79 ΡΕ1530972 gadolínio. McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD, McFarland HF, Paty DW, Polman CH, Reingold SC, Sandberg-Wollheim M, Sibley W, Thompson A, van den Noort S, Weinshenker BY, Wolinsky JS. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: Guidelines from the International Panei on the Diagnosis of Multiple Sclerosis Ann Neurol 50(1):121-7. 2001. Poser CM, Paty DW, Scheinberg L, et al. "New Diagnostic Criteria For Multiple Sclerosis: Guidelines For Research Protocols "Ann Neurol 1983;13:227-231. Métodos estatísticos: Alguns dados foram analisados +elo teste t para uma amostra para determinar se os valores médios diferiam significativamente de zero. O teste t para amostras emparelhadas foi usado para analisar diferenças entre médias de grupos. A análise da variância e o teste t de Dunnett foram usados para analisar dados de múltiplas comparações.

MODELOS ANIMAIS A Tabela I que se segue ilustra exemplos não limitantes de modelos animais úteis de acordo com o presente invento. Outros exemplos não limitantes podem ser encontrados na área, e.g. como descrito em Current Protocols in Immunology (2001, Eds. John E. Coligan, Ada M. Kraisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Sfrober, published by John Wiley & Sons). ΡΕ1530972 80 TABELA 1 DCEM?AS TRATÁVEIS AIGUNS MXEIOS ANIMAIS 1. Doenças inflamatórias intestinais Colite TNBS (Neurath et al., 1995, J of Exp. Mad. 182:1281) Murganho mutante para IL-2 (Ludviksson et al., 1997, J. of Inmunol. 158:104) Murganho mutante para IL-10 (Berg et al., 1996, J. of Clin. Investigation 98:1010) Murganhos transgénicos para TCR (Maribaerts et al., 1993, Cell 75:274) Células T CD45+ transferidas para murganhos SCID (Powrie et al., 1994, Inrnunity 1:553) 2. Artrite reumatóide Artrite murina induzida por pristano (Stasluk et al., 1997, Irtrnunol. 90:81) Artrite murina induzida por colagénio (Horsfall et al., 1997, J. of Immunol. 159:5687) 3. Diabetes dependentes de insulina (tipo 1) Murganho NX> (Cameron et al., 1997, J. of Inmunol. 159:4686) 4. Lupus Modelos F1 (NZWXNZB) (Santiago et al., 1997, J. of Exp. Mad. 185:65) Murganho GRD, LPR (mutação Fas) (Hhandoola et al., 1994, Int. Ver. of Immunol. 11:231) 5. Sarcoidose Beriliose murina (Pfeifer et al., 1994, Int. Archives of Allergy & Immunol. 104:332) Murganho M. avium (Che net al., 1994, Science 265:1237) 6. Esclerose múltipla Encefalcmielite alérgica experimental em murganhos Owens T, Sriram S. 1995, Neurol Clin. 13(1):51-73 Revisão. Degaonkar et al., 2002, j Magn Reson Imaging. 16(2):153-9. Duckers et al., 1996, Neuroscience 1(2):507-21

EXEMPLOS O invento é ilustrado pelos exemplos não limi- 81 ΡΕ1530972 tantes que se seguem em que foram empregues os seguintes materiais e métodos.

Exemplo 1. Métodos gerais:

Animais: Colónias de murganhos mutantes 129/SV IL-10-/- e animais controlo adequados foram mantidos e alojados nas estruturas adequadas a um ambiente sem agentes patogénicos específicos de acordo com métodos convencionais.

Manutenção de parasitas, infecção de animais, produção de ovos de esquistossoma: A manutenção de T. muris e o método usado na infecção são como descritos por Else and Wakelin, 1990, Parasitology, vol. 100, part 3: 479.

Os ovos de esquistossoma foram colhidos dos fígados de cobaios infectados com esquistossoma e guardados como descrito por Elliot, 1996, Elliott, 1996, Methods: A Companion to Methods in Enzymology. 9:255. Cinco cobaios infectados deram cerca de 2 x 106 ovos.

Preparação de ovos de T. suis: O processo que se segue foi usado na preparação e colheita de ovos de T. suis. Vermes de Γ. suis adultos foram isolados a partir de cólon de porcos com 7-8 semanas após exposição a uma inoculação experimental de ovos de T. suis. Os ovos embrionados foram obtidos através da cultura de vermes adultos in vitro e depois os ovos excretados separados do 82 ΡΕ1530972 meio de cultura por centrifugação, foram colocados em solução de dicromato de potássio a 0,2% a 22°C durante 5-6 semanas com borbulhamento para se obter larvas infecciosas na primeira fase. Os ovos foram lavados duas vezes em água estéril por centrifugação a 1200 xg durante 10 minutos, contados e ressuspensos na quantidade pretendida de soro fisiológico baseado numa dose calculada de 2500. Estes ovos foram guardados para usar nos indivíduos. os ovos embrionados são estáveis durante pelo menos um ano no frigorifico. Para assegurar a infecciosidade, monitorizámos os doentes relativamente ao aparecimento de ovos embrionados nas fezes após colonização. O número de ovos embrionados nas fezes é proporcional à intensidade da infestação. Igualmente, de vez em quando, infectámos porcos com os nossos ovos embrionados guardados para assegurar a continuidade da infecciosidade.

Infecção com M, avium: Murganhos foram infectados através da injecção de 106 unidades formadoras de colónias (CFU) de Mycobacterium avium (ATCC 25291) intraperito-nealmente. No dia 60 da infecção, alguns murganhos também receberam 35 cercárias de S. mansoni para induzir duplas infecções.

Infecção por esquistossoma e isolamento dos ovos embrionados: Nalgumas experiências foram usados murganhos (18-20 g) infectados durante 8-9 semanas com S. mansoni. Os murganhos foram infectados subcutaneamente com 40 cercárias da estirpe Puerto Rican. 83 ΡΕ1530972

Isolamento e dispersão de granulomas: Os granu-lomas formam-se em murganhos infectados com esquistossoma devido à deposição natural de ovos, a qual começa na 6a semana da infecção. M avium também induz granulomas. Estudámos os granulomas hepáticos isolados a partir de murganhos infectados como descrito Elliott, 1996, supra). Os granulomas foram dispersos para produzir suspensões de células isoladas, os granulomas isolados foram agitados durante 35 min a 37°C num banho-maria com agitação em meio RPMI contendo 5 mg/ml de colagenase. os granulomas residuais foram sugados e expelidos através de uma seringa de 1 ml para induzir mais dissociação. A suspensão de células resultante foi filtrada através de gaze e lavada três vezes. A viabilidade celular foi determinada por exclusão de Eosina-Y. Este protocolo resultou num rendimento elevado daas células inflamatórias viáveis que mostram expressão preservadas das moléculas de superfície.

Dispersão de baço e MLN: Os esplenócitos e MLN foram dispersos rasgando e lavando o tecido através de um crivo de aço inoxidável. Os RBCs contaminantes foram lisados com H20 e as células foram lavadas 3x em RPMI antes de usar.

Indução de colite TNBS: A colite foi induzida por instilação rectal de ácido trinitrobenzenossulfónic (TNBS) como descrito por Neurath et al., 1995, J. Exp. Med., 182: 1281. resumidamente, murganhos BALB/c controlo ou expostos 84 ΡΕ1530972 a parasitas foram jejuados durante 30 hrs e depois anestesiados com metoxiflurano. Um cateter de 1,2 mm foi introduzido 4 cm dentro do cólon e 0,1 nl de solução de TNBS (5 mg/ml de TNBS (Sigma) em 50% de etanol) foi instilado. O animal foi segurado pela cauda durante 3 minutos para assegurar contacto uniforme com a mucosa colónica.

Avaliação da inflamação da mucosa: para classificar a inflamação intestinal, o tecido foi removido nos tempos indicados, enrolados e embebidos em parafina de acordo com métodos convencionais. As secções foram coradas com hematoxilina e eosina. 0 grau de inflamação do cólon foi classificada semiquantitativamente entre 0 e 4 numa forma cega por um único patologista usando a nossa técnica habitual: 0= ausência de inflamação; 1= nivel baixo de inflamação; 2= nivel intermédio de inflamação; 3= nivel elevado de inflamação com espessamento da parede; e 4= infiltração transmural e perda das células goblet com espessamento da parede.

Isolamento de células e enriquecimento em células T: isoladas descrito John E. Ethan M. Células Thl, Th2 e T reguladoras podem ser de acordo com métodos conhecidos, e.g., como em Current Protocols in Immunology (2001, Eds. Coligan, Ada M. Kraisbeek, David H. Margulies, Shevach, Warren Sfrober, published by John Wiley &

Sons). 85 ΡΕ1530972

Numa realização, as suspensões de células isoladas de MLN foram preparadas raspando suavemente em meio RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY). As células foram rapidamente ressuspensas em água destilada para lisar os RBC. MLN foram então lavadas três vezes num grande volume de RPMI. LPMC intestinais foram isolados como descrito abaixo. Tecido intestinal foi lavado extensivamente com RPMI e todas as placas de Peyer foram removidas com tesoura. O intestino foi aberto longitudinalmente, cortado em pedaços de 5 mm e depois incubado em EDTA 0,5 mM em Hank sem cálcio nem magnésio durante 20 minu a 37°C com agitação para libertar linfócitos intra-epiteliais e células epite-liais. Isto foi repetido após extensa lavagem. O tecido foi então incubado 20 min a 37°C em 20 ml de RPMI contendo 10% FCS, tampão HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, 5 x 105 M de β-mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM, 100 U/ml de penicilina, 5 mg/ml de gentamicina e 100 mg/ml de estreptomicina (todos da Gibco) e 1 mg/ml de colagenase (Sigma #CO130). No final da incubação, o tecido foi sujeito a mais disrupção mecânica usando uma seringa de 1 ml. Para remover os detritos, as preparações de LPMC foram lavadas através de uma gaze pré-molhada colocada num funil com RPMI. Em seguida, LPMC foram lavados uma vez e foram filtrados através de uma coluna de lã de nylon de 2 cm pré-molhada colocada numa seringa de 10 ml. Após lavagem, as células (até 2 x 107) foram colocadas numa coluna de 86 ΡΕ1530972

Percoll com um gradiente de 30:70%. As células foram centrifugadas a 2200 xg à temperatura ambiente durante 20 minutos. Os LPMC colhidos da interface de 30:70 foram lavados e mantidos em gelo até serem usados. A viabilidade celular foi de 90% conforme determinado por exclusão de eosina Y.

Para as experiências de transferência, células T MLN foram isoladas através de selecção negativa usando o procedimento de enriquecimento SpinSep empregando partículas densas revestidas com anticorpo como descrito pelo fabricante (#17031, #17032, Stem Cell Technologies,

Vancouver, Canada). A citometria de fluxo foi usada após cada separação para assegurar recuperação e pureza adequadas (>98%) das células T Thy+.

Transferência de células: Células MLN foram isoladas a partir de murganhos IL10-/- colonizados 2 semanas com H. polygyrus ou a partir de murganhos IL-10-/- saudáveis, da mesma idade, sem tal colonização. Estas células MLN não fraccionadas dispersas (2xl07 células/murganho) ou células T MLN (5 x 106 células/murganho) foram então transferidas para murganhos IL10-/- colíticos 2 dias após descontinuação do tratamento com piroxicam por injecção ip. A colite foi avaliada 14 dias mais tarde. 87 ΡΕ1530972 Métodos adicionais para a preparação de células T reguladoras

Nalgumas realizações da presente divulgação, células T reguladoras podem ser preparadas a partir de células em cultura ou de um animal para posterior análise de acordo com métodos conhecidos na área, e.g., como descrito nos Pedidos de Patente US com os Nos de Série 2003/0170648, 2003/0157057, 2003/0133936, 2003/0064067, 2003/0049696, 2002/0182730, 2002/0090724, 2002/0090357.

As fontes in vivo das populações celulares úteis como uma fonte de células incluem, mas não estão limitadas a sangue periférico, produto da leucoforese do sangue, produto da aferese de sangue, nódulos linfáticos periféricos, tecido linfóide associado ao intestino, baço, timo, cordão umbilical, nódulos linfáticos mesentéricos, figado, locais de lesões imunológicas, e.g. fluido sinovial, pâncreas, fluido cerebrospinal, amostras de tumor e similares. O dador é, de preferência, humano e pode ser fetal, neonatal, criança, adulto e pode ser normal, doente ou susceptivel a uma doença de interesse.

Por exemplo, as células T reguladoras podem ser enriquecidas com base na expressão de marcadores da superfície celular. Numa realização, as células são seleccionadas positivamente relativamente à expressão de CD4 e CD25 e podem ser seleccionadas negativamente relativamente à ausência de CD45RA. Facultativamente, outros ΡΕ1530972 marcadores podem ser usados para separar subpopulações de células Treg, incluindo CD69, CCR6, CD30, CTLA-4, CD62L, CD45RB, e CD45RO. Os métodos podem incluir posteriores processos de enriquecimento ou purificação ou passos para o isolamento de células através de selecção positiva de outros marcadores celulares específicos.

Numa outra realização, as células T reguladoras são separada de uma mistura complexa de células através de técnicas de enriquecimento de células tendo as caracteristicas de serem CD4+CD25+ e facultativamente CD45RA-. Para isolamento de células a partir do tecido, pode ser usada uma solução adequada para dispersão ou suspensão. Tal solução será, de um modo genérico, uma solução equilibrada de sais, e.g., soro fisiológico normal, PBS, solução salina equilibrada de Hanks, etc., convenientemente suplementada com soro fetal de vitela, BSA, soro normal de cabra ou outros factores naturais, conjuntamente com um tampão aceitável numa concentração baixa, de um modo geral entre 5-25 mM. Tampões adequados incluem HEPES, tampões de fosfato, tampões de lactato, etc.

Numa outra realização, a separação da população de células T reguladoras usa então separação por afinidade para proporcionar uma população substancialmente pura. Técnicas para a separação por afinidade podem incluir separação magnética usando esferas revestidas com anticorpo, cromatografia de afinidade, agentes citotóxicos ligados a um anticorpo monoclonal ou usados conjuntamente 89 ΡΕ1530972 com um anticorpo monoclonal, e.g. complemento e citotoxinas e "selecção" com o anticorpo ligado a uma matriz sólida, e.g. placa, ou outra técnica conveniente. Técnicas que proporcionam separação precisa incluem separadores de células activada por fluorescência, os quais podem ter graus variáveis de sofisticação, como seja canais para múltiplas cores, canais de detecção de refracção de luz de ângulo baixo e obtuso, canais de impedância, etc. As células podem ser seleccionadas contra células mortas empregando corantes associados a células mortas (iodeto de propidio, LDS). Pode ser empregue qualquer técnica desde que não seja prejudicial para a viabilidade das células seleccionadas.

Os reagentes de afinidade podem ser receptores específicos ou ligandos para as moléculas da superfície celular atrás indicadas. Para além dos reagentes anticorpos, podem ser usados pares de péptido-MHC antigénio e pares de receptores de células T; ligandos peptídicos e receptor, moléculas efectoras e receptores e similares. Os anticorpos e receptores de células T podem ser monoclonais ou policlonais e podem ser produzidos por animais transgénicos, animais imunizados, células B imortalizadas humanas ou animais, células transfectadas com vectores de DNA codificadores do anticorpo ou do receptor de células T, etc. Os detalhes da preparação de anticorpos e a sua adequação para uso como membros de ligação específicos são conhecidos dos familiarizados com a área. 90 ΡΕ1530972 É de particular interesse o uso de anticorpos como reagentes de afinidade. por conveniência, estes anticorpos são conjugados com uma marca para usar na separação. As marcas incluem esferas magnéticas, as quais permitem a separação directa, biotina, a qual pode ser removida coma avidina ou estreptavidina ligada a um suporte, fluorocromos, os quais podem ser usados com um separador de células activadas por fluorescência, ou similares, para permitir a separação fácil do tipo celular particular, Os fluorocomos que podem ser usados incluem ficobiliproteinas, e.g. ficoeritrina e aloficocianinas, fluoresceina e vermelho Texas. Frequentemente cada anticorpo é marcado com um fluorocromo diferente, para permitir a separação independente para cada marcador.

Numa realização, os anticorpos são adicionados a uma suspensão de células e incubados durante um periodo de tempo suficiente para se ligar aos antigénios da superficie celular. A incubação será, geralmente, pelo menos cerca de 5 minutos e geralmente menos de aproximadamente 30 minutos. É desejável ter concentração suficiente de anticorpos na mistura de reacção, de forma que a eficiência da separação não seja limitada pela ausência de anticorpo, i.e. usando uma quantidade saturante de anticorpo. A concentração adequada pode também ser determinada por titulação. 0 meio em que as células são separadas será qualquer meio que mantenha a viabilidade das células. Um meio preferido é soro fisiológico tamponado com fosfatos contendo entre 0,1 e 0,5% de BSA. Vários meios podem ser comprados e podem ser 91 ΡΕ1530972 usados de acordo com a natureza das células, incluindo Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (dMEM), Solução salina básica de Hank (HBSS), soro fisológico tamponado com fosfatos de Dulbecco (dPBS), RPMI, meio de Iscove, PBS com 5 mM EDTA, etc., frequentemente suplementado com soro fetal de vitela, BSA, HSA, etc. A intensidade da coloração das células pode ser monitorizada por citometria de fluxo, onde os lasers detectam níveis quantitativos de fluorocromo (o qual é proporcional à quantidade de antigénio na superfície da célula ligado às moléculas de anticorpo). Citometria de fluxo, ou FACS, pode ser igualmente usado para separar populações de células baseado na intensidade da coloração com o anticorpo, assim como outros parâmetros tais como tamanho da célula e difracção da luz. Ainda que o nível absoluto de coloração possa diferir com um fluorocromo particular e preparação de anticorpo, os dados podem ser normalizados relativamente a um controlo.

As células marcadas foram então separadas relativamente à expressão de CD4 e CD25. As células separadas podem ser colhidas em qualquer meio adequado que mantenha a viabilidade das células, geralmente tendo uma almofada de soro no fundo do tubo de colheita. Vários meios podem ser comprados no comércio e podem ser usados de acordo com a natureza das células, incluindo dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, meio de Iscove, etc., frequentemente suplementado com soro fetal de vitela. 92 ΡΕ1530972

As composições, altamente enriquecidas em actividade Treg humana, podem ser conseguidas desta forma. A população será cerca de 7 0% ou mais da composição de células e geralmente 90% ou mais da composição celular e pode ser mesmo cerca de 95% ou mais da população celular. A população de células enriquecida pode ser usada imediatamente. As células podem também ser congeladas, ainda que seja preferível congelar células antes do procedimento de separação ou podem ser congeladas a temperaturas de azoto líquido e guardadas durante um longo período de tempo, sendo descongeladas e capazes de serem reusadas. As células serão geralmente guardadas em DMSO e/ou FCS, em combinação com meio, glucose, etc. Uma vez descongeladas, as células podem ser expandidas usando como factores de crescimento, estimulação com antigénios, células dendríticas, etc. para proliferação e diferenciação.

Cultura celular:

Para a análise de citocinas, as células foram cultivadas durante 48 h em placas de microtitulação de 96 alvéolos (Corning, Cambridge, MA) com 200 μΐ de meio (5 x 105 células/alvéolo) a 37°C. O meio de cultura foi RPMI contendo 10% FCS, tampão HEPES 25 mM, L-glutamina 2 mM, 5 x 105 M de β-mercaptoetanol, piruvato de sódio 1 mM, 100 U/ml de penicilina, 5 mg/ml de gentamicina e 100 mg/ml de estre-ptomicina (todos da Gibco). Para a maioria das experiências, as células foram cultivadas sozinhas ou com anti CD3 93 ΡΕ1530972

(2C11, ATCC) e anti-CD28 mAb (Pharminogen, San Diego, CA)(cada a 1 pg/ml). As células T isoladas foram cultivadas em alvéolos previamente revestidos durante a noite com o mAb anti-CD3 e -CD28. Para a análise de IL12, as células foram cultivadas com o oligonucleótido de esqueleto fosfo-rotioato sintético ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT) (SEQ ID NO. 3) que possui dois motivos CpG imunoestimuladores (sublinhados) (13;14) proporcionados por Coley Pharmaceu-tical Group (Wellesley, MA), e usados a 0,6 yg/ml para estimular a produção. ELISAs para Citocinas murinas: Firam realizadas ELISAs como descrito na secção VI, atrás.

Exemplo 2. Resposta Th2 a S. mansoni modula negativamente a resposta Thl contra antigénio bacteriano não relacionado indutor de Thl:

Está bem estabelecido que as respostas imunes de células Th podem polarizar em padrões Thl ou Th2. Esta polarização ocorre devido a IFNy das células Thl inibir a proliferação de células Th2, enquanto IL-4 e IL-10 das células Th2 inibe o desenvolvimento de células Thl. As experiências que se seguem demonstram que esquistossomíase altera a resposta Thl murina a uma infecção estabelecida por micobactérias.

Os murganhos foram coinfectados com M. avium e S. mansoni para avaliar a resposta do hospedeiro a estes 94 ΡΕ1530972 estímulos inflamatórios Thl e Th2 distintamente diferentes. Murganhos BALB/cAnN desenvolveram infecção crónica por M. avium quando injectados com este organismo (106 CFU) . Sessenta dias após o estabelecimento da infecção micobac-teriana, os murganhos foram infectados com S. mansoni (40 cercárias). Os murganhos foram mortos sessenta dias mais tarde. Os grupos controlo incluíram murganhos que receberam M. avium apenas durante 120 dias ou S. mansoni apenas durante 60 dias, Os esplenócitos dispersos ou as células de granuloma isoladas destes animais foram cultivados in vitro (4 x 105 células/alvéolo) durante 48 h na presença ou ausência de antigénio de ovos de esquistossoma (SEA, um antigénio Th2 forte) ou derivado de proteína purificada de antigénios micobacterianos (PPD, um forte antigénio indutor de Thl) usado na concentração óptima. Após a incubação, os sobrenadantes foram testados relativamente à produção de citocinas ou de imunoglobulinas usando ELISAs. Os dados nas figuras 1-3 são valores médios ± DP de três experiências separadas

Os esplenócitos de murganhos infectados apenas com M. avium secretaram grandes quantidades de IFNy após estimulação com PPD (antigénio Thl). As células de baço de murganhos controlo não infectados não produziram nada. Mais importante, não foi detectado IFNy em culturas de células do baço derivadas de murganhos infectados em simultâneo (M. avium apenas vs infecção simultânea, P<0,001, Figura 1). O antigénio solúvel de ovo de esquistossoma (SEA, antigénio Th2) estimulou apenas a libertação de IL-4 e IL-5 pelos 95 ΡΕ1530972 esplenócitos de animais infectados com S. mansoni. Os murganhos singularmente infectados com M. avium não produziram IL-4 ou IL-5 como resposta a PPD ou SEA. No entanto, os esplenócitos de animais coinfectados secretaram alguma IL-4 após estimulação com PPD (Figura 1).

Os granulomas foram isolados a partir de figados de murganhos infectados com M. avium ou S. mansoni, ou a partir de animais que foram infectados em simultâneo. Os animais infectados simultaneamente desenvolveram granulomas no figado que continham ovos de esquistossomas e micobactérias facilmente evidentes no exame histológico. As células de granuloma dispersas derivadas destes animais foram cultivadas in vitro durante 48 h na presença ou ausência de SEA ou PPD usado em concentrações óptimas. As células de granuloma de murganhos infectados apenas com M. avium secretaram grandes quantidades de IFNy após estimulação com PPD. Não foi detectado IFNy em culturas de células de granuloma de murganhos infectados em simultâneo (M. avium sozinho vs outro, P<0,001) (Figura 2). SEA estimulou a libertação de IL-4 pelas células de granuloma de animais infectados com S. mansoni. SEA não promoveu a secreção de IFNy em qualquer circunstância. Os murganhos infectados individualmente com M. avium não produziram IL-4 como resposta a PPD. No entanto, as células de granuloma de animais co-infectados secretaram alguma IL-4 após estimulação com PPD (Figura 2).

As respostas Thl promoveram a produção de IgG2a, enquanto as reacções Th2 estimularam IgGl e IgE. A Figura 3 96 ΡΕ1530972 mostra que os murganhos infectados com M. avium possuem níveis elevados de IgG2a no soro. No entanto, os animais co-infectados possuem concentrações normais de IgG2a no soro, mas níveis aumentados de IgGl e IgE. Estes dados considerados em conjunto mostram que uma resposta Th2 a uma infecção helmíntica pode modular negativamente a resposta do hospedeiro mesmo a um organismo mais forte indutor de Thl, como M. avium.

Exemplo 3. Colonização com helmintas intestinais ou exposição aos seus ovos embrionados atenua inflamação intestinal tipo Thl em colite murina induzida por TNBS: A instilação rectal de TNBS em 50% de etanol induz uma colite em murganhos que partilham características com a doença de Crohn. A inflamação colónica caracteriza-se pela infiltração de células T CD4+ com elevada expressão de mRNA de IFNy. As células T da lâmina própria de murganhos tratados com TNBS secretam 50 vezes mais IFNy e 5 vezes menos IL-4 que as células T dos controlos (Neurath et al., 1995, supra). As células mononucleadas da lâmina própria secretam 30 vezes mais TNFa que as células dos murganhos controlo (Neurath et al., 1997, Eur. J. Immunol., 27: 1743). De salientar que a colite por TNBS pode ser prevenida ou melhorada através do tratamento com anti-IL12 (Neurath et al., 1995, supra), anti-TNFa (Neurath et al., 1997, supra), ou rIL-10 (Duchmann et al., 1996, Eur. J. hnmunol..26: 934). A colite induzida por TNBS também pode ser prevenida através da exposição oral prévia ao hapteno (Elson et al., 1996, J. Immunol., 157: 2174) provavelmente 97 ΡΕ1530972 através do aumento das respostas IL-4, IL-10 e TGF£ (Neurath et al., 1996. J. Exp. Med.. 183: 2605). O modelo de colite que usa murganhos Balb/c está estabelecido. A administração rectal de TNBS (0,1 ml of 5 mg/ml stock) em 50% de etanol produz de forma reprodutível colite nestes animais. Para cada uma das experiências com TNBS discutida abaixo, animais expostos ao parasita e controlo foi administrada a mesma preparação de TNBS no mesmo dia pelo mesmo operador que desconhecia o grupo de tratamento. A. Ά esguistossomíase inibe a libertação de IFNy por MLN e células do baço de murganhos tratados com TNBS.

Foi investigado se a infecção por esquistossoma altera a resposta Thl em murganhos do modelo de colite animal tratados com TNBS. Os murganhos foram infectados com 35 cercárias de S. mansoni através de injecção sc. Os vermes amadureceram e começaram a pôr ovos cerca de 6 semanas após o início da infecção. Duas semanas mais tarde (às 8 semanas de infecção) os murganhos foram tratados com TNBS. A capacidade de MLN e células do baço produzirem TNFy como resposta à estimulação de células T (anti-CD3) foi examinada vários dias mais tarde. Como se mostra na Tabela 2, a infecção natural por esquistossoma inibe fortemente a produção de IFNy pelas células dos nódulos linfáticos mesentéricos e células do baço de murganhos tratados com TNBS. 98 ΡΕ1530972

Tabela 2 Esquistossoma inibe a produção de IFNy por MLN e células T esplénicas de murganhos tratados com TNBS Grupo IFNy (ng/ml) estimulado por a-CD3 Células MLN Células do baço Murganhos não infectados 3,2 ±0,7 44,1 ±2,3 tratados com TNBS Murganhos infectados com 1,9 ±0,3* 4,2 ±0,4b Tratados com TNBS esquistossoma Média de IFNy (ng/ml) ± SE de determinações em triplicado medidas por ELISA. a) p<0,l b) p<0,05. As culturas continham 106 MLN dispersos ou células do baço/alvéolo incubados em 200 μΐ de meio durante 48 hrs a 37 °C na presença de anti-CD3 (lgg/ml) (2C11) Os resultados são representativos de duas experiências.

B. Exposição a ovos embrionados de esquistossoma inibe a produção de IFNy por MLN e células do baço de murganhos tratados com TNBS

Na esquistossomiase, é a exposição aos ovos embrionados do parasita e não aos vermes adultos que induz uma resposta Th2. A infecção por esquistossoma não induz respostas Th2 fortes até os vermes sofrerem maturação e começarem a pôr ovos (Grzych et al., 1991. J. Immunol.. 146: 1322). Os murganhos expostos a ovos de esquistossoma intactos na ausência de infecção natural desenvolvem uma forte resposta Th2 (Oswald et al., 1994, J. hnmunol.. 153: 1707). Estas observações sugerem que a exposição a ovos de esquistossoma na ausência de infecção natural pode induzir Th2 e suprimir respostas Thl. 99 ΡΕ1530972

Para avaliar se a pré-exposição a ovos de esquistossoma inibe respostas Thl sem requerer a infecção por vermes adultos, os murganhos foram inoculados duas vezes com 104 ovos de esquistossomas por injecção intraperitoneal (ip) aos 14 e 4 dias antes da exposição rectal a TNBS. Estes tempos foram escolhidos para modular a deposição de ovos continua que ocorre na infecção natural. Os murganhos não expostos a ovos de parasitas mas tratados com TNBS serviram de controlo. Os ovos foram previamente congelados e não eram viáveis na altura da injecção. Mais uma vez, a capacidade de MLN e as células do baço para fazer IFNy como resposta à estimulação de células T (anti-CD3) foi examinada vários dias após a instilação de TNBS. Tal como a infecção natural por esquistossoma (Tabela 1), a exposição ip. aos ovos inibiu a produção de IFNy pelas células MLN e células T do baço de murganhos tratados como se mostra na Tabela 3.

Tabela 3

Exposição a esquistossoma inibe a produção de ΙΕΝγ por MLN e células T esplénicas de murganhos tratados com TNBS Tratamento IFNy (ng/ml) estimulado por a-CD3 Células MLN Células do baço TNBS apenas 4,65±0,02 47,113,0 Ovos i.p. e TNBS 2,19+0,11* 21, 813,4b Média de IFNy (ng/ml) ± DP de determinações em triplicado medidas por ELISA, a) p<0,5. As culturas continham 106 MLN dispersos ou células do baço/alvéolo incubadas em 200 μΐ de meio durante 48 hrs a 37°C na presença de anti-CD3 (lpg/ml) (2C11). Os resultados são representativos de três experiências separadas._ 100 ΡΕ1530972 C. exposição a ovos embrionados de esquistossoma protege murganhos de colite induzida por TNBS. A inibição do desenvolvimento da resposta Thl nas mucosas pode atenuar a colite induzida por TNBS. A exposição prévia a ovos de esquistossoma inibe a secreção de citocinas Thl por MLN e células T esplénicas. Para avaliar se a injecção ip de ovos de esquistossoma inibe a colite induzida por TNBS, os ovos foram injectados como atrás seguido de tratamento com TNBs. O tratamento com ovos reduziu dramaticamente a mortalidade cumulativa em três experiências separadas de 60% no grupo controlo (16/27) para 22% (6/27) nos murganhos expostos a ovos. A inflamação intestinal foi classificada numa escala de 0-4 pontos como detalhado nos Métodos Gerais atrás. Nos murganhos que sobreviveram, o tratamento dos ovos atenuou a inflamação intestinal de 3,110,5 (média ±DP) no grupo controlo para 1,3 ±0,5 (média ± DP) no grupo controlo para 1,3 ±0,3 nos murganhos expostos a ovos (p<0,05, Figura 4. As experiências subsequentes mostraram que a principal diferença entre grupos era evidente aos 3 dias após tratamento com TNBS. Outras experiências realizadas 14 dias após a instilação de TNBS mostrou que a exposição a ovos conferiu protecção prolongada. Estes dados indicam que os ovos de esquistossoma protegem murganhos do desenvolvimento de colite fatal ao inibir as respostas Thl nas mucosas. 101 ΡΕ1530972 D. Helmintas intestinais induzem respostas Th2 no hospedeiro.

Foi estudado se outros parasitas helminticos diferentes de S. mansoni podem modular as respostas Thl do hospedeiro. A expressão de imunidade protectora contra nemátodos intestinais é dependente de células T CD4. Os murganhos expelem vermes ou limitam a infecção através da montagem de uma resposta Th2. A expulsão de vermes não parece depender exclusivamente da eosinofilia intestinal nem da mastocitose das mucosas. IL-4 pode ter um papel critico na expulsão de vermes, uma vez que o tratamento com mAb de bloqueio anti-IL-4 ou anti-recetor de IL-4 promove a retenção de vermes (Else et al., 1994, J. Exp. Med., 179: 347). Pelo contrário, o tratamento com IL-4 promove a eliminação de vermes (Figura 4). Γ. muris vive no cólon do hospedeiro murino. está relacionado com Trichuris trichiura, um parasita de que são portadores quase um bilião de pessoas durante as suas vidas (Grencis et al., 1996, Gastroenterology Clinics of North America, 25: 579). A ingestão de ovos inicia a infecção. Os ovos libertam larvas que penetram no epitélio cecal. Elas sofrem então maturação para vermes adultos. 0 parasita não se replica dentro do hospedeiro permitindo controlar a intensidade da infecção (Bancroft et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24: 3113). Γ. muris foi usado para modular negativamente a 102 ΡΕ1530972 resposta Thl intestinal. A infecção por T. muris é estabelecida por gavagem oral com 250 ovos embrionados contendo as larvas viáveis, os murganhos Balbc podem ser portadores de T. muris e naturalmente expelem os vermes dentro de 4 semanas de infecção. Murganhos infectados com T. muris ou com placebo foram tratados com instilação rectal de TNBS 4 semanas após a iniciação da infecção Colonização anterior com T. muris reduziu a mortalidade cumulativa em duas experiências separadas de 58% (7/12) no grupo não colonizado para 21% (3/14) no grupo exposto ao parasita. Ainda, os murganhos previamente colonizados com T. muris desenvolvem colite por TNBS atenuada (0,9210,5, média ± DP) comparativamente com os murganhos infectados com placebo (3,13 ±0,63, p<0,05). Estes dados indicam que a exposição prévia a parasitas intestinais (T. muris) protege murganhos de desenvolverem colite grave mediada por Thl.

Exemplo 4. Disrupção do gene IL-10 não altera significativamente a interacção hospedeiro/parasita.

IL-10 é uma citocina imuno-reguladora importante que modula negativamente a activação de macrófagos e a função de células acessórias (Moore et al., 1993, Ann. Rev. Immunol., 11: 165). Os murganhos tornados deficientes para IL-10 através da disrupção dirigida do gene (IL10-/-) desenvolvem uma enterocolite crónica que é influenciada pela flora colónica (Kuhn et al., 1993, Cell, 75: 263). A inflamação intestinal é atenuada pelo tratamento com anticorpo anti-IFNY demonstrando que a colite resulta das 103 ΡΕ1530972 respostas exuberantes aos tores colónicos (Berg, et ai., 1996, J. Clin. Invest.. 98: 1010). Estes murganhos servem como modelos excelentes para acolite espontânea semelhante à da doença de Crohn. Neste exemplo, foram usados murganhos IL-10-/-nos fundos 129 e C57B1/6. A. Murganhos IL-10-/- podem montar resposta Th2 contra parasitas

Os murganhos infectados com o nemátodo N. brasiliensis desenvolveram inflamação tipo Th2 contra o parasita com produção de IL4, IL-5 e IL-10. N. brasiliensis pode colonizar murganhos IL-10-/- e estimular uma resposta Th2 intestinal adequada (Kuhn et ai., 1993, supra). Murganhos IL-10-/- foram infectados com S. mansoni para avaliar se montam uma resposta Th2. A Tabela 4 mostra que os esplenócitos de murganhos com o gene IL-10 destruído colonizados durante 8 semanas com S. mansoni secretam grandes quantidades de IL-4 quando estimulados com antigénio do ovo de esquistossoma (SEA) ou anti-CD3. Os granulomas que rodearam os ovos de esquistossoma nestes murganhos possuiam a habitual percentagem elevada (43-50%) de eosinófilos e produziam IL-4 e IL-5. Assim eles mostraram uma resposta Th2 eficaz. Estes dados indicam que a exposição aos parasitas helminticos como S. mansoni induzirá uma forte resposta Th2 mesmo na ausência de IL-10. 104 ΡΕ1530972

Tabela 4

Esquistossomíase induz uma resposta Th2 em murganhos deficiente para IL-10 Células do baço de murganhos infectados com Esquistossoma

Citocina Não estimulado Estimulado com SEA Estimulado com a-CD3 IL-4 (ng/ml) Selvagem 0,07±0,0, 08 0,21+0,02 3,94+0,12 IL-10-/- 0,41±'0,10 2,56±0,23 5, 06±0,33 Média de IL-^ l (ng/ml) ± DP de determinações em triplicado medidas por ELISA. As culturas continham 106 células/alvéolo incubadas em 200 μΐ de meio durante 48 hrs a 37°C na ausência ou presença de antigénio do ovo de esquistossoma (SEA 5 pg/ml) ou de anti-CD3 (lpg/ml) (2C11). Os resultados são representativos de duas experiências separadas usando um mínimo de quatro murganhos selvagens e KO em cada experiência. B. O condicionamento Th2 helmíntico inibe o desenvolvimento natural de inflamação das mucosas em murganhos IL-10-/-.

Murganhos deficientes em IL-10 puderam ser portadores de parasitas helmínticos e montaram uma forte resposta Th2. Devido aos murganhos IL-10-/- puderem desenvolver respostas Th2 e serem portadores de parasitas intestinais, eles servem como modelos excelentes para estudar o efeito de exposição a parasitas na colite espontânea ou em curso. IL-10 é uma citocina anti-inflamatória importante. É possivel que a disrupção deste circuito imuno-regulador essencial previna o condicionamento Th2 das mucosas pelos parasitas. A evidência presente indica que a infecção por T. muris impede a colite espontânea que se 105 ΡΕ1530972 desenvolve me murganhos IL-10-/-. Os animais (6 semanas de idade) receberam T. murtis ou infecção simulada e foram mortos 6 semanas mais tarde. A inflamação colónica de murganhos IL-10-/- infectados com T. murtis ou não infectados foi registada numa escala de 4 pontos como detalhado nos Métodos Gerais, atrás. Infecção anterior com Γ. murtis atenuou a inflamação intestinal de 3,0±0,3 (média ± DP) no grupo com infecção simulada para 2,2±0,1 (p<0,05) nos murganhos IL-10-/- expostos aos parasitas. Estes dados demonstram que a exposição prévia aos parasitas helminticos atenua a colite espontânea em murganhos deficientes para IL-10.

Exemplo 6. Colonização intestinal com Trichuris suis modula negativamente a actividade de doença em doentes com doença de Crohn:

Doentes com doença de Crohn foram colonizados com Trichuris suis e avaliada a melhoria da actividade da doença. T. suis, o tricurideo de porco, está estreitamente relacionado com T. trichiura, um helminta intestinal humano comum nos paises desenvolvidos. 0 tricurideo é um potencial agente para terapia. 0 parasita humano natural Trichuris trichiura é um organismo muito pequeno que reside no cólon através da ancoragem à mucosa. A colonização normal geralmente não produz sintomas e não causa problemas de saúde ao hospedeiro. Este é o caso de milhões de pessoas colonizados através do mundo, mas numa minoria, a infestação forte 106 ΡΕ1530972 produz diarreia, hemorragia e anemia com deficiência em ferro. É interessante que o ciclo de vida do parasita é tal que o hospedeiro não é auto-infectado. Os ovos necessitarão de uma fase sólida para a maturação para se tornar infeccioso e depois deve ser novamente ingerido para aumentar a carga parasitária de um indivíduo. Assim, a infestação por Γ. trichiura não aumentará no hospedeiro a menos que sejam ingeridos ovos do solo. O agente é facilmente e eficazmente tratado com três dias de mebendazole. O tricurídeo humano poderá ser usado para colonizar o hospedeiro e ser considerado como um agente experimental para modificar o processo imune na doença de Crohn.

No entanto, Trichuris trichuria constitui um potencial problema de saúde para o hospedeiro. Devido ao ser humano ser o único hospedeiro natural, os ovos para o uso experimental teriam de ter sido colhidos a partir de outros seres humanos, criando o potencial de transmissão de outras doenças infecciosas humanas ao indivíduo em questão. Assim, foi usado um parasita animal estreitamente relacionado. O tricurídeo de porco (Trichuris suis) tem o potencial de colonizar temporariamente um hospedeiro humano sem causar sintomas, doença, uma doença coinfecciosa ou um perigo para a saúde pública. O tricurídeo de porco está estreitamente relacionado com as espécies que infectam os humanos. Os dois 107 ΡΕ1530972 organismos são da mesma família e são morfologicamente semelhantes, mas pertencem a uma espécie diferente e pode ser morfologicamente, em termos de desenvolvimento e clinicamente distinguido. 0 ovo de tricurídeo de porco é ligeiramente maior, possui uma espinha com forma diferente e a velocidade de desenvolvimento a partir desde o ovo até ao adulto é mais lenta do que Trichuris trichiuria (Beer, 1976, Res. Vet. Sei., 20:47). É importante que se pode obter ovos infecciosos do parasita a partir de animais SPF.

Uma fonte de ovos de T. suis infecciosos foi produzida como descrito atrás. Os ovos foram testados para confirmar a ausência de contaminação com patogénicos entéricos (e.g. Shigella, Salmonella, Campylobacter, Yersinia e E. coli enterotóxica) e vírus (e.g., CMV, HSV, VZV, adenovírus e enterovírus).

Dois doentes com doença de Crohn avançada resistente à medicação foram colonizados com Γ. suis. Eles toleraram o parasita com pouco ou nenhum sintoma atribuível a este organismo. A Tabela 5 mostra que após se conseguir colonização óbvia, ambos os participantes tiveram uma queda nos valores de CDAI, diarreia e índices inflamatórios. Este resultado indica que os helmintas são úteis para modular respostas imunes anormais, incluindo, mas não estando limitado a doença de Crohn. 108 ΡΕ1530972

Tabela 5

Doentes com doença de Crohn podem beneficiar da colonização com T. suis Doente Parâmetro Linha de basea Semana 2b Semana 4b 1 CDAIc 250,2 269,9 147,4 Fezes/semana 67 101 49 ESRd 17 11 4 Protena C-reactiva <0,5 <0,5 <0,5 2 CDAIc 341,1 169,6 136,7 Fezes/semana 77 27 25 ESR 19 7 ND Protena C-reactiva 0,9 <0,5 <0,5 a) Valores estáveis quando da entrada neste estudo b) Os valores às 2 e 4 semanas após iniciação da colonização com T. suis. c) índice de actividade da doença de Crohn. d) velocidade de sedimentação de eritrócitos. ND; não determinado.

Exemplo 7. H. polygyrus na prevenção e terapia de doença inflamatória intestinal:

Para investigar o papel das células T reguladoras na protecção induzida por parasita contra doença inflamatória, foram realizadas mais experiências.

As experiências usaram o helminta intestinal murino H. polygyrus. H. polygyrus habita o duodeno do hospedeiro sem causar inflamação ou destruição ao ileo terminal ou cólon. TNBS em álcool induz colite quando instilado intra-rectalmente em murganhos. A Figura 5 mostra que este organismo protege murganhos da colite induzida por TNBS. A colonização foi estabelecida por gavagem oral de 109 ΡΕ1530972 200 larvas viáveis. Os murganhos expelem os vermes cerca de 2 semanas após o inicio da colonização. Murganhos infectados com H. polygyrus ou com infecção simulada foram tratados com instilação rectal de 0,1 ml de TNBS (5 mg/ml em 50% EtOH) 4 semanas após o inicio da colonização dos vermes. A inflamação foi avaliada em secções histológicas coradas 3 dias após indução da colite.

Realizaram-se experiências para testar se a colonização helmintica protege os murganhos de IBD induzida por TNBS ao limitar a produção intestinal de citocinas Thl tais como IFNy, TNFa e IL-12. As Figs 6 e 7 mostram que a exposição de murganhos selavgens (WT) sem IBD a H. polygyrus torna a mucosa intestinal distai menos capaz de produzir IFNy e IL-12.

As citocinas reguladoras tipo IL10, TGFP e PgE2 são capazes de restringir a função das células "Thl". Determinou-se se H. polygyrus promove a produção destas citocinas reguladoras dentro da mucosa intestinal. A Fig 8 mostra que este verme induz a produção de IL10 nas mucosas. IL-10 regula negativamente um arranjo de mediadores pro-inflamatórios tais como TNFa, IL6 e IL12. Assim, é razoável assumir que IL10 produzida na mucosa intestinal restringe a função das células "Thl". A Fig. 9 mostra que LPMC de murganhos com H. polygyrus fazem substancialmente mais IFNy quando cultivadas com mAb inibidor anti-ILlOR suportando esta hipótese. 110 ΡΕ1530972

Citocinas imuno-reguladoras potencialmente importantes que podem proteger de doença incluem prostaglandina E2(PgE2), IL4, IL5, IL13 e TGF3. As if 10-12 mostram que os helmintas induzem a produção de citocinas protectora E2 (PgE2) , IL4, IL5, IL13 e TGFP na mucosa intestinal.

As células T são a principal fonte de IFNy na mucosa intestinal (Fig. 13) . IFNy é importante para a indução de colite por TNBS.

Os helmintas intestinais induzem células T reguladoras nos MLN que migram para o intestino para localmente controlarem a reactividade imune da mucosa. As experiências revelaram (Fig. 14) que LPMC de murganhos WT naive não infectados apresentam uma capacidade minima para produzir IFNy após transferência de células T MLN de verme para murganho infectado.

Algumas experiências usaram murganhos transgé-nicos para a proteína fluorescente verde (GFP) para experiências de transferência adaptativa para determinar se as subséries de células T reguladoras MLN entraram na lâmina própria intestinal para subsequentemente produzirem citocinas reguladoras. Como se vê na Fig. 15, células T reguladoras MLN putativas de murganhos GFP+ portadores da mucosa intestinal de recipientes WT saudáveis. os helmintas

Esta experiência mostra como 111 ΡΕ1530972 protegem da doença. Encontrou-se nos ensaios clínicos que a colonização helmíntica melhora IBD activa. Foi igualmente testada como a colonização com H. polygyrus reverte a colite murina em curso.

Os murganhos IL10-/- desenvolveram colite Thl crónica que piora gradualmente à medida que os animais ficam mais crescidos. No entanto, como acontece com a maioria dos modelos IBD de doença espontânea, os murganhos IL-10-/- num alojamento SPF desenvolvem colite com expressão variável apenas após vários meses. 0 modelo IBD foi melhorado para ser tornado mais útil para experimentação. Encontrou-se que dar um NSAID (piroxicam) a murganhos IL-10-/- com 5 semanas de idade durante 2 semanas induz colte Thl severa que persiste indefinidamente mesmo após o fármaco ser parado. A inflamação é altamente previsível de murganho para murganho, envolvendo o cólon e TI com gravidade uniforme (Fig. 16) . Os murganhos WT não desenvolvem colite com o tratamento com piroxicam.

Encontrou-se que a colonização de murganhos IL-10-/- com H. polygyrus resolve colite previamente estabelecida (Fig. 17). Murganhos C57BL/6 IL10-/- com cinco semanas de idade foram receberam piroxicam (80 mg/250 g de alimento) . Após 2 semanas, foi parado o piroxicam. Nesta altura, todos os murganhos tinham colite. Dois dias após piroxicam ter parado, alguns murganhos foram colonizados com 200 H. polygyrus por gavagem gástrica, enquanto outros receberam placebo. Após 2 semanas de colonização, a 112 ΡΕ1530972 pontuação da colite caiu de 3,610,4 (DP) nos controlos para 0,5510,5 em urganhos colonizados (p=0,001). A cicatrização da colite estabelecida por H. polygyrus está associada a mudanças da produção de citocinas em LPMC. LPMC isolados a partir de murganhos narve (sem piroxicam) ou murganhos coliticos sem colonização produzem grandes quantidades de IFNy quando da estimulação com anti-CD3/anti-CD28 (Fig. 18) e IL12 quando da estimulação com o oligonucleótido CpG (0,6 yg #1826/ml). LPMC de murganhos IL-10-/- colonizados com H. polygyrus tratados com piroxicam produzem pouco ou nenhum IFNy detectável por ELISA sensivel (30 pg/ml) e tem produção limitada de IL-12 (Fig. 18). LPMC de murganhos IL-10-/- narve ou colinico não produzem IL-4 e pouco IL-3 (Fig. 19). Pelo contrário, LPMC de murganhos colonizados com H. polygyrus produzem alguma IL-4 e grandes quantidades de IL-13. A colonização helmintica reverte a inflamação colónica, mas o perfil de citocinas de LPMC não volta simplesmente ao de outro murganho IL-10-/- narve. Em vez disso, a colonização resulta nu novo perfil de citocinas associado a cicatrização de colite. A colonização por H. polygyrus activa circuitos reguladores em LPMC de murganhos IL10-/-. A mistura de LPMC produtores de IFNy de murganhos coliticos IL10-/- com LPMC de murganhos colonizados com H. pyrogyus, resulta em coculturas com produção de IFNy inibida. 113 ΡΕ1530972 H. polygyrus reside no duodeno, mas inicia os circuitos reguladores que revertem a colite e alteram os perfis de citocinas de LPMC distantes. Foi mostrado que a colonização com helmintas induz ou activa células reguladoras circulantes que residem dentro do compartimento das células T MLN de murganhos colonizados com H. polygyrus. A transferência de 20xl06 células MLN ou de 5 x 106 células T MLN de murganhos IL-10-/- colonizados com H. polygyrus com colite IL10-/- estabelecida resulta na resolução da inflamação (Fig. 20).

Scurfin é um factor de transcrição, codificado pelo gene foxp3, importante para o desenvolvimento ou actividade de células T reguladoras. Os transcritos de Foxp3 são aumentados em MLN de murganhos IL-10-/-colonizados com H. polygyrus comparativamente com os sem vermes, conforme quantificado por RT-PCR em tempo real (Fig. 21) . Cada decréscimo do patamar dos ciclos de PCR é equivalente a duplicar o conteúdo de Foxp3 normalizado para mRNA de HPRT. A colonização helmintica resulta em aumento de 3 a 5 vezes da expressão de Foxp3 em células MLN. Foxp3 também aumenta (3 vezes) em LPMC de murganhos IL10-/-colonizados com H. polygyrus comparativamente com controlos sem vermes. Apenas as células T reguladoras são conhecidas por expressarem Foxp3 (Hori, S., T. Nomura, and S. Sakaguchi. 2003. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299:1057-1061). O aumento da expressão de foxp3 em MLN e LPMC suporta a 114 ΡΕ1530972 hipótese de os helmintas induzirem células T reguladoras que orquestram a resolução de colite estabelecida.

Outros transcritos de factores imuno-reguladoes são alterados através da colonização com H. polygyrus. Smad7 é um factor de transcrição que bloqueia a sinalização ΤΟΕβ. A colonização com H. polygyrus baixa a expressão de Smad7 em células MLN 4,5 vezes conforme medido por RT-PCR em tempo real (Fig. 22). Os transcritos Smad7 também estão mais baixos em LPMC. Um decréscimo de Smad7 permitiria que as células fossem menos responsivas ao imuno-regulador ΤΘΕβ. Ainda, o decréscimo da expressão de Smad7 mostra que múltiplos mecanismos reguladores provavelmente funcionam de forma a resolver a colite IL10-/-.

As sequências iniciadoras e a sonda para Smad7 são TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC (SEQ ID NO. 4), GAGTAAGGAGGAGGG-GGAGA (SEQ ID NO. 5), e FAM-TTGATCTTCCCGTAAGATTCACAGCAACA-TAMRA (SEQ ID NO. 6). A expressão do mRNA de Foxp3 e Smad7 foram normalizados relativamente ao de HPRT. As sequências iniciadoras e a sonda para HPRT são TGAAGAGCTACTGTAAT-GATCAGTCAAC (SEQ ID NO. 7), GCAAGCTTGCAACCTTAACCAT (SEQ ID NO. 8), e TET-TGCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACAGCCC-TAMRA (SEQ ID NO. 9).

OUTRAS REALIZAÇÕES

Os exemplos descritos demonstram experiências realizadas e contempladas pelo presente invento na 115 ΡΕ1530972 preparação e realização do invento. Pensamos que estes exemplos incluem uma descrição das técnicas, servindo para avaliar a realização do invento e para demonstrar a sua utilidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> University of Iowa

<12 0> USO DE AGENTES BIOLÓGICOS PARASITÁRIOS PARA A PREVENÇÃO DE DOENÇAS

<130> 27045/2039EP <140> Ainda não atribuído <141> Ainda não entregue <150> 10/715,659 <151> 17 de Novembro de 2003 <160> 9 <171> Patentln versão 3.1

<210 1 <211> 42 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> Oligonucleótido sintético <400> 1 cccaggaaag acagcaacct tttctcacaa ceaggçcact tg 42

<210 2 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc feature <222> (1)..(28) 116 ΡΕ1530972 <223> Oligonucleótido sintético <400> 2 atcctaccca ctgctggcaa atggagtc 28

<210 3 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Oligonucleótido sintético <400> 3 tceatgacgt tcctgacgtt 20

<210 4 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Oligonucleótido sintético <400> 4 tcctgctgtg caaagtgttc 20

<210 5 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Oligonucleótido sintético <400> 5 gagtaaggag gagggggaga 20 <210 6 <211> 29

ΡΕ1530972 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> Oligonucleótido sintético <400> 6 ttgatcttce egtaagattc acagtaaca

<210 7 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Oligonucleótido sintético <400> 7 taãasaaeta etataataat caetcaac

<210 8 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Oligonucleótido sintético <400> 8 gcaagcttgc aaccttaacc at

<210 9 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (1)..(28) ΡΕ1530972 <223> Oligonucleótido sintético <400> 9 tgctttccct ggttaagtag tacagcce

Lisboa, 31 de Julho de 2013

Claims (8)

1. ΡΕ1530972 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método in vitro de rastreio de uma preparação de parasita helmíntico que altera o nível de uma actividade de células T reguladoras humanas, o referido método compreendendo os passos de: (a) obtenção de uma preparação de parasita helmíntico; (b) contacto da referida preparação de parasita helmíntico com um sistema humano in vitro contendo as células T reguladoras; e (c) determinação do nível de um marcador interno para a actividade de células T reguladoras no referido alvo após o referido contacto, em que o referido marcador interno é o factor de transcrição Foxp3 (Scurfin); e em que uma alteração no referido nível do referido marcador interno após o referido contacto é indicativo da referida preparação de parasita helmíntico alterar uma actividade das células T reguladoras.
2. 2 . 0 método da reivindicação 1, em que o referido nível do factor de transcrição é medido como o nível da sua proteína ou de mRNA.
3. 3. 0 método da reivindicação 1, em que a referida actividade de células T reguladoras é encontrada nas células mononucleadas da lâmina própria do referido sistema. 2 ΡΕ1530972
4. 4. O método da reivindicação 1, em que a referida actividade mediada por células T reguladoras é encontrada nos nódulos linfáticos mesentéricos do referido sistema.
5. 5. Um método para monitorização da eficácia do tratamento de uma preparação de parasita helmíntico para uma doença auto-imune ou alergia num modelo animal não humano compreendendo: (i) administração de uma composição compreendendo uma animpreparação de parasita helmíntico ou uma fracção do mesmo ao referido modelo animal não humano; e (ii) determinação do nível de um marcador interno para a actividade das células T reguladoras no referido modelo al não humano após a referida administração, em que o referido marcador interno é o factor de transcrição Foxp3 (Scurfin) em que um aumento no referido nível do referido marcador interno após a referida administração é indicativo da eficácia do tratamento da preparação de parasita helmíntico.
6. 6. O método da reivindicação 5, em que o referido nível do referido factor de transcrição é medido ao nível da sua proteína ou do seu mRNA. 3 ΡΕ1530972
7. 7. O método da reivindicação 5, em que o referido nivel do referido marcador é encontrado nas células mononucleadas da lâmina própria do referido modelo.
8. 8. 0 método da reivindicação 5, em que o referido nivel do referido marcador é encontrado nos nódulos linfáticos mesentéricos do referido modelo. Lisboa, 31 de Julho de 2013