KR20060120203A

KR20060120203A - 질병 예방과 통제를 위한 기생충 생물제의 용도

Info

Publication number: KR20060120203A
Application number: KR1020067011879A
Authority: KR
Inventors: 조엘 브이. 웨인스탁; 데이비드 이. 엘리오트
Original assignee: 유니버시티 오브 아이오와 리서치 파운데이션
Priority date: 2003-11-17
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2006-11-24
Also published as: DK1530972T3; MXPA06005537A; CN102988417A; WO2005052115A2; CN101128597B; EP1530972A3; CY1115012T1; CN101128597A; US20050118655A1; JP2012008133A; JP2007533302A; KR101363138B1; PL1530972T3; AU2004293761A1; ES2425350T3; AU2004293761B2; EP1530972A2; HK1076047A1; PT1530972E; UA94023C2

Abstract

본 발명은 조절 T 세포 기능에 영향을 주는 장내 기생충 제제를 스크리닝하는 방법 및 기생충 제제의 투여를 통하여 조절 T 세포 활성을 변화시킴으로써 질환을 치료하는 방법에 관계한다.

기생충 제제

Description

질병 예방과 통제를 위한 기생충 생물제의 용도{USE OF PARASITIC BIOLOGICAL AGENTS FOR DISEASES PREVENTION AND CONTROL}

본 발명은 변화된 면역 반응에 기인하는 질병이나 질환 상태의 예방 및/또는 치료에서 기생충 조성물 및 이의 용도에 관계한다.

기생충은 다른 생물에 기생하면서 이들 숙주로부터 영양분을 뺏어가는 살아있는 존재이다. 장에 기생하는 기생충은 점막 면역계와 복잡한 상호작용을 한다. 이들은 생존을 위하여 숙주 점막 방어와 평온한 상관관계를 확립한다.

비정상적인 Th1 또는 Th2 반응을 유발하는 면역계의 조절장애는 여러 인간 질병의 원인이 될 수 있다. 지배적 Th1 반응에 기인한 일부 질병에는 IBD, 류머티스 관절염, 유사 육종증, 다발성 경화증, 인슐린-의존성 당뇨병이 포함된다. Th2 관련된 질병에는 알레르기 질환과 암이 포함된다.

최근에, 기생충 노출은 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 심각도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Sewell et al., 2003, International Immunology, 15: 59-69). 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 중추신경계(CNS)의 만성 염증성 탈수초화로 특성화되는 다발성 경화증(MS)에 대한 동물 모델이다. Sewell은 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni) 알 예방접종(ova immunization)된 생쥐에서, EAE의 심각 도가 감소된 임상 스코어 및 CNS 세포 침윤물에 의한 측정에서 감소한다고 보고하였다. 말초에서 IFN-감마가 감소하고 IL-4, 전환 성장 인자-베타, IL-10 수준이 증가하며, 뇌에서 IL-4 생산 신경항원-특이적 T 세포의 빈도가 증가한다.

크론병은 조절장애 T 보조(Th)1-형 점막 염증에 기인한다. 크론병은 열대 국가에서는 드물게 발생하는 반면 온대 기후(temperate climate)를 갖는 선진국에서 빈번하게 발생하는데, 이의 발생률이 1940년 이후 상승하였다. 대조적으로, 장내 기생충에 대한 노출은 열대 국가에서는 흔히 발생하지만 선진국에서는 드물게 발생한다. Elliott 등(2003, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 284:G385-G391)은 장내 기생충이 과도한 Th1-형 염증을 약화시킨다고 설명하였다. 이런 가설을 검증하기 위하여, 생쥐를 장내 기생충 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni)의 알에 노출시키고, 이후 트리니트로벤젠술폰산(trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 직장내 공격하여 대장염을 유도하였다. 주혈흡충(schistosome) 알 노출은 TNBS 대장염을 약화시키고 and protected mice from lethal inflammation. 주혈흡충(schistosome) 알 노출은 TNBS-처리된 생쥐의 항-CD3-자극된 비장과 장간막 림프절(mesenteric lymph node)로부터 IFN-감마를 감소시키고 IL-4 생산을 강화시켰다. 주혈흡충(schistosome) 알 노출은 TNBS-처리된 생쥐에서 대장 IFN-감마를 감소시키지만 IL-10 mRNA 발현을 증가시켰다. 전사 6의 완전한 신호 전달인자와 활성인자가 대장염의 약화에 필요하였다. 본 저자는 장내 기생충에 대한 노출이 뮤린 대장 염증을 감소시킬 수 있음을 입증하였다.

de Jong et al., 2002, J. Immunol., 168:1704-1709에서는 장내 기생충 만손 주혈흡충(Schistosoma mansoni)으로부터 유래된 단백질 추출물이 OX40 리간드의 강화된 발현을 통하여 Th2 세포의 발달을 촉진하는 DC2의 발달을 유도한다는 것을 입증하였다. 유사하게, 세포외 세균 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)로부터 유래된 독소 역시 아직 기전이 알려지지 않은 OX40 리간드-독립적 기전을 통하여 DC2의 발달을 유도하였다. 대조적으로, 세포내 세균 백일해균(Bordetella pertussis)으로부터 유래된 독소는 Th1 세포 발달을 촉진하는 강화된 IL-12 생산으로 DC1의 발달을 유도하였다. 폴리(I:C)(dsRNA, 바이러스를 모방)는 강화된 IL-12 생산없이 극히 강력한 Th1-유도성 DC1의 발달을 유도하였다.

U.S. 특허 출원 2003/0103938 A1에서는 Th1/Th2 비율을 조절함으로써 인간이나 동물에서 Th1 세포- 또는 Th2-세포 관련된 질병을 예방하거나 치료하기 위한 IL-4와 SDF-1α, 또는 IL-2와 SDF-1α로 구성되는 제약학적 조성물을 기술한다.

Doetze et al., 2000, International Immunology, 12: 623-630에서는 추정 면역(PI) 개체로부터 얻은 말초혈 단핵 세포와 비교하여 만성 장내 기생충 감염, 다시 말하면, 전신성 회선사상충증(generalized onchocerciasis, GEO)을 앓는 개체로부터 얻은 PBMC에 의한 Ov 항원(OvAg)에 대한 T 세포 증식성 과민증을 조사하였다. 상기 연구에서, GEO에서 이와 같은 세포 과민증을 매개하는 기전을 조사하였다: PI 개체로부터 PBMC에서 증식성 반응에 비하여 GEO 개체로부터 얻은 PBMC에서 낮은 증식성 반응은 IL-4 생산의 부재 및 IL-5의 현저하게 낮은 생산과 연관하였는데, 이는 과민증의 원인인 T(h)2 반응으로의 전반적인 이동을 반박하였다. 대조적으로, T(h)3 반응과 연관된 2가지 사이토킨, IL-10과 형질전환 성장 인자(TGF)-베 타가 과민증을 매개하는 것으로 나타났다: GEO 개체로부터 얻은 PBMC는 훨씬 많은 IL-10을 생산하고, 이런 군에서 T 세포 증식성 과민증은 항-IL-10과 항-TGF-베타 항체의 첨가로 역전될 수 있었다. 이들 저자는 과민증이 OvAg에 특이적이고 관련된 선충(nematode) 항원으로 자극이후 관찰되지 않았는데, 이는 진행성 염증을 억제하는 것으로 알려진 T 세포 하위군(T(h)3과 T(r)1)과 유사하게, 독특한 사이토킨 프로필(IL-2 없음, 하지만 높은 IL-10 및/또는 TGF-베타 생산)을 보유하는 GEO PBMC로부터 클론될 수 있었는데, 이는 감염성 질환에서 아직까지 발견되지 않았던 상기 세포형이 Ov-특이적 과민증을 유지하는데 관여한다는 것을 암시한다.

Th3 세포는 조절 T 세포의 하위군이고, MBP에 경구 톨레라이제이션(tolerization)된 생쥐에서 처음 생산되고 확인되었으며, TGF-b-의존성 기전에 의한 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)의 유도를 저해하였다(Chen et al., 1994, Science, 265:1237-1240). 최근의 연구는 조절 T 세포가 생체내에서 박테리아, 바이러스, 기생충 항원에 대하여 유도될 수 있고, 자가면역 질환, 감염-유도된 면역병리를 예방하거나, 또는 보호성 Th1 반응을 억제함으로써 병원균 지속(pathogen persistence)을 연장시킬 수 있다고 제안한다(참조: McGuirk and Mills, 2002, Trends in Immunology, 23:450-455; Tung et al., 2001, Immunological Reviews, 182:135-148; Maloy and Powrie, 2001, Nature Immunology, 2:816-822).

조절 T 세포는 일반적으로, 면역 반응, 다시 말하면, 항체-매개된 및/또는 세포-매개된 면역 반응을 억제하는 림프구로서 기술된다(참조: McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002;23(9):450-5; Field, A. C., L. Caccavelli, M. F. Bloch, and B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170:2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):223-32; Francois Bach J. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) Regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec14(6):771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific Regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep;23(9):450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug;182:135-48; Read S, Powrie F. CD4(+) Regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec;13(6):644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep;3(11):899-904). 이들 조절 T 세포(Tr 세포)는 인터루킨-2(IL-2)에 대한 수용체의 알파 사슬인 막통과 단백질(CD25)이다. 다른 T 세포와 유사하게, 이들 역시 항원에 대한 αβ(알파-베타) T-세포 수용체(TCR)를 발현하고, 펩티드-클래스 II MHC 분자 또는 CD8 조절 세포의 경우에, 특이적인 클래스 I MHC에 결합하는 경우에만 활성화될 수 있다. 하지만, 일단 활성화되면, 이들은 다량의 인터루킨 10(IL-10) 및 종종 일부 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β)를 분비하기 시작한다. 이들 양 림포카인은 세포-매개된 면역과 염증을 위한 Th1 보조, 항체 생산을 위한 Th2 보조, 아마도 CD8⁺세포융해 T 림프구(CTL)의 작용을 저해하는 강력한 면역억제제이다. 일부 다른 조절 T 세포가 Tr 세포와 구별된다. 가령, Tr1 세포는 여러 방면에서 Tr 세포와 유사하지만, 이들은 표면상에 다량의 CD25를 발현하지 않는다. 이들은 형성을 위하여 IL-10을 필요로 하고, 일단 성숙하면 이를 다량으로 분비한다. Th3 세포에 대한 주요 림포카인은 TGF-β이다.

조절 T 세포가 장내 기생충 제제를 이용한 Th1 또는 Th2 관련된 질병의 예방 또는 치료에서 일정한 역할을 수행하는 지는 아직 확인되지 않고 있다.

본 발명의 요약

본 발명은 기생충 제제가 Th1 또는 Th2 관련된 질병의 치료에서 조절 T 세포의 활성을 변화시킬 수 있다는 발견에 기초한다.

한 구체예에서, 본 발명은 조절 T 세포 활성을 변화시키는 장내 기생충(helminthic parasite) 제제를 스크리닝하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 장내 기생충 제제를 획득하고; (b) 상기 장내 기생충 제제를 표적과 접촉시키고; (c) 접촉이후, 상기 표적에서 조절 T 세포 활성에 대한 내부 마커의 수준을 결정하고, 여기서 접촉이후 내부 마커의 수준에서 변화는 상기 장내 기생충 제제가 조절 T 세포 활성을 변화시킴을 암시한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 조절 T 세포 활성을 변화시키는 장내 기생충 제제를 스크리닝하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 장내 기생충 제제를 획득하고; (b) 상기 장내 기생충 제제를 표적과 접촉시키고; (c) 접촉이후, 상기 표적에서 조절 T 세포에 대한 세포 표면 마커의 수준을 결정하고, 여기서 접촉이후 세포 표면 마커의 수준에서 변화는 상기 장내 기생충 제제가 조절 T 세포 활성을 변화시킴을 암시한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 조절 T 세포 활성을 변화시키는 장내 기생충 제제를 동물에 투여함으로써 상기 동물에서 Th1 또는 Th2 관련된 질병을 치료하는 방법을 제시한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 자가면역 질환 또는 알레르기 질환용 장내 기생충 제제의 치료 효능을 동물에서 모니터링하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 장내 기생충 제제 또는 이의 분획물을 함유하는 조성물을 상기 동물에 투여하고; (b) 투여이후, 상기 동물에서 조절 T 세포 활성의 수준을 결정하고, 여기서 투여이후 조절 T 세포 활성의 수준에서 증가는 상기 장내 기생충 제제의 치료 효능을 암시한다.

적절하게는, 치료되는 질병은 염증성 장 질환, 류머티스 관절염, 낭창, 연소성 인슐린-의존성 당뇨병(1형), 유사 육종증, 다발성 경화증, 천식, 알레르기 비염에서 선택된다.

조절 T 세포 마커는 내부 마커, 세포 표면 마커, 또는 분비된 마커이다.

적절하게는, 내부 마커는 Scurfin, Smad7, Gata3, Tbet(Tbx21)이다.

더욱 적절하게는, 세포 표면 마커는 CD4, CD45RB^lo, CD45Rc, 세포융해 T 림프구 연관된 항원 4(CTLA-4), Ox40, 4-1BB, CD25, CD103, CD62L, a_Eβ 인테그린, 잠복-연관된 펩티드(LAP) 또는 글루코코르티코이드 유도된 TNF 수용체 집단 관련된 단백질(GITR), 케모킨 수용체 CCR5, TI-ST2에서 선택된다.

더욱 적절하게는, 분비된 마커는 IL-5, IL-10 또는 TGFβ이다.

도 1에서는 조류결핵(M. avium), 만소니주혈흡충(S. mansoni) 또는 본 발명의 한 구체예에 따른 양 미생물로 감염된 생쥐의 비장 세포 상층액에서 측정된 IFNγ, IL-4, IL-5의 농도를 도시한다. 비장림프구(4 x 10⁵/웰)는 최적 농도의 PPD 또는 SEA의 존부하에 200 ㎕의 배지에서 37℃에서 48시간동안 시험관내 배양하였다. 사이토킨 분비는 ELISA로 정량하였다.

도 2에서는 조류결핵(M. avium), 만소니주혈흡충(S. mansoni) 또는 본 발명의 한 구체예에 따른 양 미생물로 감염된 생쥐의 육아종 세포 상층액에서 IFNγ과 IL-4의 농도를 도시한다. 육아종 세포(4 x 10⁵/웰)는 최적 농도의 PPD 또는 SEA의 존부하에 200 ㎕의 배지에서 37℃에서 48시간동안 시험관내 배양하였다. 사이토킨 분비는 ELISA로 정량하였다.

도 3에서는 조류결핵(M. avium), 만소니주혈흡충(S. mansoni) 또는 본 발명의 한 구체예에 따른 양 미생물(동시)로 감염된 생쥐에서 측정된 혈청 IgG1, IgE, IgG2a 수준을 도시한다. 면역글로불린은 ELISA로 측정하였다.

도 4에서는 IL-4 처리가 본 발명의 한 구체예에 따른 만성선충(H. polygyrus) 감염된 생쥐를 치료할 수 있음을 보여준다. 생쥐는 사멸이전 12일부터 시작하여 IL-4 복합체를 3회 주입하였다. 데이터는 복수 측정의 평균 +/- SE이다.

도 5에서는 analyzing 본 발명의 한 구체예에 따른 >4 WT 생쥐/군을 분석하는 3가지 별도의 실험으로부터 평균 염증 스코어(mean inflammatory score)± SD를 나타내는 데이터를 도시한다.

도 6: 본 발명의 한 구체예에 따라, IBD 없는 WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체를 형성시켰다. 대조는 가짜 위관영양(sham gavage)을 섭취하였다. LPMC는 TI로부터 분리하고 항-CD3/항-CD28 자극과 함께 또는 이런 자극 없이 시험관내에서 48시간동안 배양하였다. 상층액에서 IFNγ은 ELISA로 측정하였다. 데이터는 2가지 독립된 실험으로부터 6회 측정의 평균 ± SE이다.

도 7: 본 발명의 한 구체예에 따라, WT 생쥐는 도 2에서와 동일하게 처리하였다. 분리된 LPMC는 CpG 올리고와 함께 시험관내에서 48시간동안 배양하여 IL12 생산을 촉진하였다. IL12는 ELISA로 측정하였다. 데이터는 2가지 독립된 실험으로부터 6회 측정의 평균 ± SE이다.

도 8: 본 발명의 한 구체예에 따라, IBD 없는 WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체를 형성시켰다. 대조는 가짜 위관영양(sham gavage)을 섭취하였다. LPMC는 도 2에서와 동일하게 분리하고 2주간 배양하였다. 데이터는 2가지 독립된 실험으로부터 6회 측정의 평균 ± SE이다.

도 9: 본 발명의 한 구체예에 따라, WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체를 형성시켰다. LPMC는 분리하고 항-CD3/항-CD28 +/- αIL10R mAb와 함께 시험관내에서 48시간동안 배양하였다. 상층액에서 IFNγ은 ELISA로 측정하였다. 데이터는 3가지 독립된 측정의 평균± SE이다.

도 10: 본 발명의 한 구체예에 따라, IBD 없는 WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체를 형성시켰다. 대조는 가짜 위관영양(sham gavage)을 섭취하였다. LPMC는 도 2에서와 동일하게 분리하고 2주간 배양하였다. 데이터는 2가지 독립된 실험으로부터 6회 측정의 평균 ± SE이다.

도 11: 본 발명의 한 구체예에 따라, IBD 없는 WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체를 형성시켰다. 대조는 가짜 위관영양(sham gavage)을 섭취하였다. LPMC는 도 2에서와 동일하게 분리하고 2주간 배양하였다. 데이터는 2가지 독립된 실험으로부터 6회 측정의 평균 ± SE이다.

도 12: 본 발명의 한 구체예에 따라, IBD 없는 WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체를 형성시켰다. 대조는 가짜 위관영양(sham gavage)을 섭취하였다. LPMC는 도 2에서와 동일하게 분리하고 2주간 배양하였다. LPMC는 TI로부터 분리하고 LPS 자극과 함께 또는 이런 자극 없이 시험관내에서 48시간동안 배양하였다. 데이터는 3가지 독립된 실험으로부터 9회 측정의 평균 ± SE이다.

도 13: 본 발명의 한 구체예에 따라, T 세포는 자성 비드를 이용하여 분산된 장내 LPMC로부터 분리하였다. T 세포-농축된(T 세포) 분획물과 T 세포-고갈된(비-T) 분획물은 상층액에서 IFNγ를 분석하기에 앞서 항-CD3/항-CD28 자극과 함께 또 는 이런 자극 없이 시험관내에서 48시간동안 배양하였다. 데이터는 2가지 독립된 실험으로부터 6회 측정의 평균 ± SE이다.

도 14: 본 발명의 한 구체예에 따라, 감염되지 않은 WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체가 형성된 생쥐로부터 얻은 2x10⁷MLN 세포를 섭취하였다. 1주후, LPMC는 이들 수용자로부터 분리하고, 상층액에서 IFNγ를 분석하기에 앞서 항-CD3/항-CD28 자극과 함께 또는 이런 자극 없이 48시간동안 배양하였다. 데이터는 2가지 독립된 실험으로부터 6회 측정의 평균 ± SE이다.

도 15: 본 발명의 한 구체예에 따라, GFP WT 생쥐는 선충(H. polygyrus)으로 군체를 형성시켰다. 2주후, 이들 장내 기생충-조절된 GFP 생쥐로부터 얻은 MLN 세포는 I.P. 주입으로 정상 C57BL/6 생쥐에 이전하였다. 7일후, 점막고유판(lamina propria)을 분산시키고 형광 현미경하에 GFP+ T 세포를 검사하였다. A) GFP+ LP T 세포. B) 광 현미경하에 동일 필드.

도 16: 본 발명의 한 구체예에 따라, IL10-/- 동물은 5주령부터 피록시캄(piroxicam)을 함유하는 사료를 섭취하였다. 2주 처리후, 피록시캄을 중단하고, 2주후 대장염을 평가하였다. 연령-정합된 IL10-/- 대조는 피록시캄을 섭취하지 않았다(대조). 대장염은 0-4 포인트 규모(point scale)를 이용하여 맹검 판독자에 의해 조직 절편에서 기록되었다. A) 대조 IL10^-/-생쥐의 대장. B) 피록시캄 처리이후 연령-정합된 IL10^-/- 생쥐의 대장. C) 피록시캄 처리이후 CD4⁺ T 세포로 대장 점막고유판의 침윤(H&E 10X, IHC 20X). 그래프 데이터는 5가지 별도의 실험(각각, 5-6 마 리/군)으로부터 평균이다.

도 17: 본 발명의 한 구체예에 따라, 패널 A, B, C는 선충(H. polygyrus)을 섭취하지 않는 피록시캄-처리된 생쥐에서 전형적인 대장 염증을 보여준다. D, E, F는 선충(H. polygyrus)을 섭취한 이후 2주 시점에 대장염에서 개선을 보여준다(모두 H&E, 4X). 대장염은 0-4 포인트 규모로 기록한다. 데이터는 2가지 별도의 실험에서 검사된 11마리 동물로부터 평균± SE이다.

도 18: 본 발명의 한 구체예에 따라, 대장염 IL10-/- 생쥐는 도 12에 기술된 바와 같이, 선충(H. polygyrus) 또는 가짜 위관영양(sham gavage)을 섭취하였다. 2주후, LPMC를 분리하고 항-CD3/항-CD28 자극(IFN)과 함께 또는 이런 자극 없이, 또는 CpG 올리고(IL12)와 함께 시험관내에서 48시간동안 배양하였다. 데이터는 3가지 독립된 실험으로부터 8-9회 측정의 평균± SE이다.

도 19: 본 발명의 한 구체예에 따라, 대장염 IL10^-/- 생쥐는 도 13에서와 동일하게 처리하였다. 데이터는 3가지 독립된 실험으로부터 9회 측정의 평균± SE이다.

도 20: 본 발명의 한 구체예에 따라, A) 선충(H. polygyrus) 또는 가짜(대조) 위관영양(sham gavage)을 섭취한 이후 2주 시점에 IL10^-/-생쥐로부터 분리된 MLN 세포는 i.p. 주입으로 피록시캄-처리된 생쥐에 이전하였다(20x10⁶). 이전이후 2주 시점에, 도 12에서 동일하게 평가하였다. B) 대조 또는 군체 형성된 생쥐로부터 분리된 MLN T 세포는 대장염 생쥐에 이전하였다(5x10⁶). 데이터는 2가지 독립된 실험에서 9마리 생쥐/군으로부터 평균± SE이다.

도 21: 본 발명의 한 구체예에 따라, mRNA는 2주간의 가짜-처리 또는 피록시캄-처리에 뒤이은 가짜 위관영양 또는 선충(H. polygyrus) 위관영양이후 2주 시점에 IL10^-/-생쥐로부터 분리된 MLN 세포로부터 추출하였다. Foxp3에 대한 실시간 PCR은 HPRT mRNA에 표준화시켰다(방법). 주의: 발현이 높아질수록 역치(threshold)에 도달하는데 필요한 PCR 주기가 줄어든다. 데이터는 3가지 독립된 실험(각각, 4마리 생쥐/군)으로부터 평균± SE이다.

도 22: 본 발명의 한 구체예에 따라, mRNA는 가짜 위관영양 또는 선충(H. polygyrus) 위관영양이후 2주 시점에 IL10^-/-생쥐의 MLN 세포로부터 추출하였다. 발현이 낮아질수록 역치에 도달하는데 필요한 PCR 주기가 늘어난다. 데이터는 3가지 독립된 실험(각각, 4마리 생쥐/군)으로부터 평균± SE이다.

도 23: 본 발명의 한 구체예에 따른 항원 제조 절차에 대한 개요 다이어그램.

본 발명은 조절 T 세포 활성을 변화시키는 기생충 제제를 스크리닝하는 방법을 포괄한다.

본 명세서에서, “장내 기생충 제제”에는 전체 기생충, 기생충 추출물, 기생충 알, 기생충 알 추출물, 기생충 알, 기생충 알 추출물, 기생충 유충, 기생충 유충 추출물, 기생충 세르카리아, 기생충 세르카리아 추출물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. “기생충 제제”에는 기생충과 이의 추출물로부터 유래되는 분리된 단백질, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물 또는 지질 역시 포함된다.

본 명세서에서, 본 발명에 이용하기 위하여 사육되는 동물에 적용되는 “특이적-병원균 없는”은 표적 동물 또는 인간에서 질병을 유발하는 특정 병원성 미생물이 동물에 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 병원균 없는 동물을 사육하는 방법은 당분야에 공지되어 있다(참조: Brown et al., A Bibliography on the Culture and Maintenance Specific Pathogen-Free Organisms, available at http://www.ctsa.org/upload/publication/CTSA_116631681202959092495.pdf). Brown 등은 SPF 환경에서 서로 다른 가축과 실험실 동물을 사육하기 위한 참고문헌 및 건물 설계와 관리에서 절차와 필요조건을 제공한다. SPF 절차 및 잠재적으로 우려되는 여러 인간 바이러스와 박테리아 병원균의 목록은 M. Michael Swindle, J. Invest. Surg., 9:267-271, 1996을 참조한다.

본 명세서에서, “조절 T 세포”는 고유 T 세포에 비하여 적어도 2배(가령, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 8-배, 10-배 또는 그 이상) 증가된 IL-10 및/또는 TGFβ를 분비하는 림프구 세포 개체군을 의미한다. IL-10 또는 TGFβ 분비의 결정은 당분야에 공지되어 있다. 가령, 이는 항-CD3과 같은 T 세포 자극인자와 함께 또는 이런 자극인자 없이 24시간 또는 48시간동안 시험관내에서 세포를 배양하고, 이후 사이토킨 특이적인 ELISA를 이용하여 배양 상층액에서 이들 사이토킨을 검사함으로써 결정될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 조절 T 세포는 다른 유형의 T 세포(가령, 고유 T 세포)와 비교하여 높은 수준의 FoxP3 전사체로 특성화된다. “높은 수준의 FoxP3 전사체”는 다른 유형의 T 세포에 비하여 상기 수준에서 적어도 4-배 증가를 의미한다. FoxP3은 실시간 PCR 또는 정량적 PCR(가령, Hori, S., T. Nomura, and S. Sakaguchi. 2003. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299:1057-1061에 기술된 바와 같이, PCR 프라이머 CCCAGGAAAGACAGCAACCTT, TTCTCACAACCAGGCCACTTG(SEQ ID NO. 1) 및 표지된 프로브 6FAM-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-TAMRA(SEQ ID NO. 2)을 이용하여)로 검출할 수 있다. 수치는 하우스키핑 유전자인 HPRT 발현에 표준화시킨다. 대안으로, FoxP3 단백질 산물, Scurfin을 당분야에 공지된 바와 같이, 예를 들면, 염소 항-FoxP3(FoxP3) 다클론 항체(Catalog Number ab2481, Novus Biologicals, Littleton, CO)를 이용한 웨스턴 블랏팅 분석으로 검출할 수 있다. 선택적으로, 조절 T 세포는 다른 T 세포(가령, 고유 T 세포)에 비하여 적은, 다시 말하면, 적어도 2-배, 바람직하게는 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 10-배 또는 그 이하의 적은 IFNγ을 생산할 수도 있다. 또한, 선택적으로, 조절 T 세포는 IL10 및/또는 TGFβ를 발현하지만 IFNγ를 거의(또는 전혀) 발현하지 않는 T 세포를 검출하는 세포질내 유동 분석(intracytoplasmic flow analysis)을 이용하여 검출할 수도 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 추가의 선택적 마커를 이용하여 조절 T 세포 또는 조절 T 세포의 활성을 검출할 수 있다.

본 명세서에서, “고유 T 세포”는 골수에서 면역계의 새로운 세포의 생산으로부터 생성된 T-세포를 의미한다. 고유 T-세포는 면역계에 의해 이전에 가공된 바 없는 항원을 보유하는 새로운 병원균에 반응한다. 고유 T-세포는 당분야에 공지된 방법에 따라 확인할 수 있다(참조: Tough et al., 1999, Immunol Rev. 170:39-47; Itano et al., 2003, Nat Immunol. 4(8):733-9; Berard et al., 2002, Immunology. 106(2):127-38).

본 명세서에서, “조절 T 세포 활성을 변화시키는 기생충 제제”는 기생충 제제에 접촉하지 않는 경우에 표적에서 조절 T 세포 활성과 비교하여, 표적에 접촉한 이후 표적에서 조절 T 세포의 활성을 적어도 40%, 예를 들면, 50%, 80%, 100%, 2-배, 4-배, 6-배, 8-배, 10-배, 또는 그 이상 변화시키는 기생충 제제를 의미한다. 조절 T 세포의 활성은 조절 T 세포 내부 마커(가령, FoxP3 mRNA 또는 이의 단백질 산물 Scurfin, Smad7, Gata3, 또는 Tbet(Tbx21)와 같은 전사 인자), 또는 조절 T 세포 표면 마커(가령, CD4, CD45RB^lo, CD45Rc, 세포융해 T 림프구 연관된 항원 4(CTLA-4), Ox40, 4-1BB, CD25, CD103, CD62L, a_Eβ 인테그린, 잠복-연관된 펩티드(LAP) 또는 글루코코르티코이드 유도된 TNF 수용체 집단 관련된 단백질(GITR), 실험적 알레르기 뇌척수염(EAE), 케모킨 수용체 CCR5, TI-ST2) 또는 분비된 마커(가령, IL4, IL13, IL-5, IL-10, TGFβ)의 수준을 모니터함으로써 측정할 수 있다. 증가된 조절 T 세포 활성은 당분야에 공지된 본 명세서에 기술된 방법에 따른 측정에서, 조절 T 마커의 수준에서 적어도 40%, 예를 들면, 50%, 80%, 100%, 2-배, 4-배, 6-배, 8-배, 10-배, 또는 그 이상의 증가(가령, FoxP3, Ox40, 4-1BB, CD4, CTLA-4, CD25, CD103, CD62L, a_Eβ 인테그린, LAP, GITR, EAE, CCR5, TI-ST2, IL-10, TGFβ) 또는 감소(가령, D45Rc)로 나타난다.

적절하게는, 조절 T 세포 활성을 변화시키는 기생충 제제는 상기한 2가지 이상의 마커의 수준을 변화시킨다.

본 명세서에서, “조절 T 세포 마커의 수준”은 표적에서 특이적인 조절 T 세포 마커의 양(가령, 마이크로그램 또는 몰 양)을 의미한다. 전형적으로, 조절 T 세포 마커는 단백질인데, 이의 양은 단백질 정량을 위한 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, ELISA, 웨스턴 블랏, 면역침전(immunoprecipitation), 방사면역측정법(radioimmunoassay), 또는 FACS 분석으로 측정할 수 있다(참조: Innis et al.,(1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2d Edition, Sambrook, et al.(1989); Current Protocols in Molecular Biology(1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc.)). 단백질 마커의 수준은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 노던 블랏, 정량적 RT-PCR, 마이크로어레이 분석으로 이의 mRNA 수준에서 측정할 수도 있다(참조: Innis et al.,(1990) Academic Press, Inc.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2d Edition, Sambrook, et al.(1989); Current Protocols in Molecular Biology(1997, Ausubel et al., John Weley & Sons, Inc.)).

본 명세서에서, “표적”은 시험관내 시스템(가령, 배양된 조직 또는 세포, 전사/번역 추출물) 또는 생체내 시스템(가령, 동물)을 의미한다.

적절하게는, 표적은 인간 세포를 비롯한 동물 세포를 보유하는 생체내 시스템이다. 더욱 적절하게는, 표적은 동물이다. 이보다 더욱 적절하게는, 표적은 포유동물이다. 이보다 더욱 적절하게는, 표적은 인간이다.

또한, 본 발명은 동물에서 변화된 면역 반응에 의해 유발된 질병을 예방하거나 치료하는 방법을 포괄하는데, 상기 방법은 상기 동물에서 상기 질병을 예방하거나 치료할 만큼 충분한 양으로 장내 기생충 제제를 투여하는 단계를 포함한다.

본 명세서에서, “변화된 면역 반응에 의해 유발된 질병”은 비-질병 동물과 비교하여 면역 반응에서 차이로 인하여 동물(가령, 인간)에서 발병하는 질병을 의미한다. 가령, 질병 동물은 정상적인 비-질병 동물에서 동일한 항원에 대한 반응과 비교하여, 항원(가령, 자기 또는 비-자기 항원)에 대한 비정상적(가령, 과도한 또는 불충분한) 면역 반응을 보인다. 본 발명에 따른 “변화된 면역 반응에 의해 유발된 질병”에는 본 명세서에 기술된 Th1 관련된 질병 또는 Th2 관련된 질병이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 명세서에서, “Th1 관련된 질병”은 Th1 세포가 질병 과정을 뒷받침하거나, 유발하거나 또는 매개하는 질병, 또는 Th1 세포가 강화되거나 약화된 Th1 활성으로 대표되는 질병의 증상을 치료하거나 완화하는데 관여하는 질병을 의미한다. “강화된”은 병든 동물이 질병 없는 다른 동물과 비교하여, Th1 활성에서 증가(가령, 적어도 2-배, 바람직하게는 5-배, 6-배, 8-배, 10-배, 또는 그 이상)를 보이는 것을 의미한다. 강화된 Th1 활성은 당분야에 공지된 방법에 따라, 분비된 사이토킨(가령, IL-2, IFN-γ, TNFα, IgG2a, IL-12, IL-18, IL-23)의 수준에서 증가, 또는 분비된 사이토킨(가령, IL-4, IL-13)의 수준에서 감소로 측정할 수 있다. “약화된”은 병든 동물이 질병 없는 다른 동물과 비교하여, Th1 활성에서 감소(가령, 적어도 50% 이하, 또는 2-배, 바람직하게는 5-배, 6-배, 8-배, 10-배, 또는 그 이하)를 보이는 것을 의미한다. 약화된 Th1 활성은 당분야에 공지되고 본 명세서에 기술된 방법에 따라, 분비된 사이토킨(가령, IFN-γ, TNFα, IgG2a)의 수준에서 감소, 또는 분비된 사이토킨(가령, IL-4, IL-13)의 수준에서 증가로 측정할 수 있다(U.S. 특허 출원 09/209,732, 09/362,598).

본 명세서에서, “감소된”은 “약화된”과 동의어로 이용되고, “증가된”은 “강화된”과 동의어로 이용된다.

본 명세서에서, “Th2 관련된 질병”은 Th2 세포가 질병 과정을 뒷받침하거나, 유발하거나 또는 매개하는 질병, 또는 Th2 세포가 강화되거나 약화된 Th2 활성으로 대표되는 질병의 증상을 치료하거나 완화하는데 관여하는 질병을 의미한다. “강화된”은 병든 동물이 질병 없는 다른 동물과 비교하여, Th2 활성에서 증가(가령, 적어도 2-배, 바람직하게는 5-배, 6-배, 8-배, 10-배, 또는 그 이상)를 보이는 것을 의미한다. 강화된 Th2 활성은 당분야에 공지된 방법에 따라, 분비된 사이토킨과 항체(가령, IL-4, IL-5, IgE, IgG1)의 수준에서 증가로 측정할 수 있다. “약화된”은 병든 동물이 질병 없는 다른 동물과 비교하여, Th2 반응에서 감소(가령, 적어도 50% 이하, 또는 2-배, 바람직하게는 5-배, 6-배, 8-배, 10-배, 또는 그 이하)를 보이는 것을 의미한다. 약화된 Th2 활성은 당분야에 공지되고 본 명세서에 기술된 방법에 따라, 분비된 사이토킨과 항체(가령, IL-4, IL-5, IgE, IgG1)의 수준에서 감소로 측정할 수 있다(U.S. 특허 출원 09/209,732, 09/362,598).

본 명세서에서, “치료 효능”은 기생충 제제를 이용한 질병 치료의 효능을 의미한다. “치료 효능”은 일반적으로, 동물이 기생충 제제로 치료받았거나 치료받고 있는 특정 질병에 대한 임상적 반응으로 측정된다.

본 발명에 유용한 장내 기생충

유용한 장내 기생충에는 2가지 군이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 첫 번째 군은 인간에 자연적으로 군체를 형성하는 장내 기생충이고, 두 번째 군은 동물에 군체를 형성하지만 인간에 보호를 제공하는 장내 기생충이다.

첫 번째 군에서, 장내 기생충은 복잡한 생명 주기와 발달을 보이는 정교한 다세포 기생충이다. 선충(비-분절된 선충류) 및 편형동물은 인간 내장에 군체를 형성하는 2가지 장내 기생충 군이다. 본 발명에 따라, 인간이나 동물에 자연적으로 군체를 형성하는 다수의 장내 기생충이 의도된 결과를 제공하게 된다.

인간 내장에 주로 기생하는 선충은 회충(Ascaris lumbricoides), 요충(Enterobius vermicularis)(pin worm), 편충(Trichuris trichiura)(whipworm), 구충(Ancylostoma duodenale)과 아메리카 구충(Necator americanus)(hookworms), 분선충(Strongyloides stercoralis)이다. 선모충(Trichinella spiralis)은 소장을 일시적으로 감염시킨다.

편형동물에는 흡충(trematode)과 촌충류(cestode)가 포함된다. 인간 내장에 존재하는 가장 일반적인 성체 흡충은 비대흡충(Fasciolopsis), 극구흡충(Echinostoma), 이형흡충(Heterophyes) 종이다. 담관계(biliary system)에 존재하는 흡충은 간흡충(Clonorchis sinensis), 타이간흡충(Opisthorchis viverrini)과 고양이간흡충(pisthorchis felineus), 간질충(Fasciola hepatica)이다. 만손주혈흡충(Schistosoma)은 정맥계(venous system)에 기생하지만, 여러 종이 장벽을 통한 알의 통과로 장에 만성적인 영향을 준다. 일반적으로 인간을 감염시키는 성체 촌충류는 광두열두조충(Diphyllobothrium) 종(fish tapeworm), 아시아조충(Taenia saginata)(beef tapeworm), 갈고리촌충(Taenia solium)(pork tapeworm), 왜소조충(Hymenolepsis nana)(dwarf tapeworm)이다.

다른 장내 기생충에는 필라리아(filarial) 기생충과 폐흡충(lung fluke)이다. 이들은 장 단계(gut phase)를 거치지 않지만, 강한 Th2-형 반응을 촉진한다.

본 발명에 이용될 수 있는 두 번째 장내 기생충 군은 동물에 군체를 형성하지만 면역-매개된 질환으로부터 보호를 제공할 수 있는 장내 기생충이다. 여기에는 생쥐편충(Trichuris muris)(mouse whipworm), 선모충(Trichinella spiralis), 쥐모양선충(Nippostrongylus brasiliensis), 만성선충(Heligmonsomoides polygyrus), 왜소조충(Hymenolepsis nana)인데, 이들 모두 생쥐를 감염시키는 장내 기생충이다. 부가적으로, 광동주혈선충(Angiostrongylus)은 쥐 장내 기생충이다. 돼지편충(Trichuris suis)과 돈회충(Ascaris suum)은 인간을 감염시킬 수 있는 돼지 장내 기생충이다. 개편충(Trichuris vulpis), 개회충(Toxocara) 종, 악구충(Gnathostoma), 구충(Ancylostoma)은 인간을 감염시킬 수도 있는 개 또는 고양이 장내 기생충이다. 아니사키스(Anisakis)와 고래회충(Pseudoterranova)은 인간에게 전염될 수 있는 수상 포유동물의 선충이다. 새 주혈흡충(schistosome)은 인간을 일시적으로 감염시킬 수 있다. 이런 주혈흡충(schistosome)에는 쉬스토소마튬 도우티티(Schistosomatium douthitti), 트리코빌하르지아 오셀라타(Trichobilharzia ocellata), 트리코빌하르지아 스타그니콜라에(Trichobilharzia stagnicolae), 트리코빌하르지아 피셀라에(Trichobilharzia physellae), 지간토빌하르지아 후로네시스(Gigantobilharzia huronensis)가 포함된다.

장내 기생충 제제는 자연적으로 인간에 군체를 형성하는 장내 기생충 및 동물에 군체를 형성하지만 변화된 면역 반응으로 유발된 질병으로부터 인간이나 동물을 보호할 수 있는 장내 기생충에서 선택된다.

본 발명의 일부 구체예에서, 장내 기생충은 회충(Ascaris lumbricoides), 요충(Enterobius vermicularis), 편충(Trichuris trichiura), 구충(Ancylostoma duodenale)과 아메리카 구충(Necator americanus), 분선충(Strongyloides stercoralis), 선모충(Trichinella spiralis)에서 선택되는 선충이다.

본 발명의 다른 구체예에서, 장내 기생충은 비대흡충(Fasciolopsis), 극구흡충(Echinostoma), 이형흡충(Heterophyes) 종, 간흡충(Clonorchis sinensis), 타이간흡충(Opisthorchis viverrini), 고양이간흡충(Opisthorchis felineus), 간질충(Fasciola hepatica), 만손주혈흡충(Schistosoma) 종, 광두열두조충(Diphyllobothrium) 종, 아시아조충(Taenia saginata), 갈고리촌충(Taenia solium), 왜소조충(Hymenolepsis nana)과 같은 흡충(trematode)과 촌충류(cestode)에서 선택되는 편형동물이다.

다른 구체예에서, 장내 기생충은 필라리아(filarial) 기생충과 폐흡충(lung fluke)에서 선택된다.

바람직한 구체예에서, 장내 기생충은 생쥐편충(Trichuris muris), 선모충(Trichinella spiralis), 쥐모양선충(Nippostrongylus brasiliensis), 만성선충(Heligmonsomoides polygyrus), 왜소조충(Hymenolepsis nana), 광동주혈선충(Angiostrongylus) 종, 돼지편충(Trichuris suis), 돈회충(Ascaris suum), 개편충(Trichuris vulpis), 개회충(Toxocara) 종, 악구충(Gnathostoma) 종, 구충(Ancylostoma) 종, 아니사키스(Anisakis) 종, 고래회충(Pseudoterranova) 종에서 선택된다.

적절하게는, 기생충 생산과 제조를 위한 준비 동물은 특이적인 병원균-없는(SPF)(가령, 특이적인 인간 병원균 없는) 환경에서 사육된다.

본 발명에 따른 치료가능 질병

본 발명에 따른 치료가능 질병의 예에는 Th1 또는 Th2 관련된 암을 비롯한 Th1 관련된 질병과 Th2 관련된 질병이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

Th1-관련된 질병

Th1-관련된 질병에는 감염성 질환, 자가면역 질환, 지연형 과민성 질환, 암 등이 포함된다.

감염성 질환 군에는 기생충과 바이러스, 예를 들면, HIV에 의해 유발되는 질환이 포함된다.

자가면역 질환 군에는 뇌척수병성(encephalomyelopathic) 질환, 탈수초(demyelinating) 질환, 다른 자가면역 질환이 포함된다.

뇌척수병성 질환의 예에는 다발성 경화증(MS); 다발성 경화증; 국소성 경화증; 고립성 경화증; 척수로(tabes dorsalis)(후부 경화증); MS의 동물 모델인 급성과 만성 실험적 알레르기(또는 자가면역) 뇌척수염(EAE); 갈리안-바레 증후군; 실험적 알레르기 신경염(갈리안-바레 증후군의 동물 모델); 급성 다발성 뇌척수염; 근육통성 뇌척수염(양성과 전염성); 바이러스 뇌척수염; 육아종성 뇌척수염 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또한, 개 홍역(canine distemper); 고양이 홍역(feline distemper); 말 뇌척수염(eastern, Venezuelan, western); 조류 뇌척수염; 돼지 뇌척수염; 소 뇌척수염; 생쥐 뇌척수염 등과 같은 동물 질병이 포함된다.

탈수초 질환의 예에는 다발성 경화증(MS), 다발성 경화증(DS), 급성 다발성 뇌척수염, 진행성 다발성 백질뇌증(PML), 아급성 경화성 범뇌염(SSPE) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

다른 자가면역 질환의 예에는 다발성 경화증(MS), 다발성 결절 동맥염(polyartheritis nodosa), 천식, 과민성 폐렴(hypersensitivity pneumonitis), 간질성 폐 질환, 유사 육종증, 특발성 폐 섬유증, 크론병 또는 궤양성 대장염 또는 휘플병(Whipple's disease)과 연관된 간질성 폐 질환, 베게너 육아종증 또는 과민성 혈관염과 연관된 간질성 폐 질환, 혈관염 증후군, Hennoch-Schonleins 자반병, 급성 사구체신염 증후군(Goodpastures syndrome), 베게너 육아종증; 급성 사구체신염에서처럼 항체 매개된 사구체병증(glomerulopathy), 전신성 홍반성 낭창(SLE)과 연관된 신염, 베게너 육아종증과 급성 사구체신염 증후군과 같은 다른 전신성 질환과 연관된 신염, 혼성 연결 조직 질환, 만성 간질성 신염, 만성 사구체신염과 같은 신장 질환; 크론병, 궤양성 대장염, 세리악병(coeliac disease), 휘플병, 교원성 대장염, 호산구성 대장염, 임파구성 대장염과 같은 위장관 질환(가령, IBD); 자가면역 간염, 알코올 유도된 간염, 문맥주위 섬유증, 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis), 경화성 담도염(sclerosing cholangitis)과 같은 간담도계 질환(hepatobilliary diseases); 건선, 아토피성 피부염, 습진, 알레르기 피부 질환, 진행성 전신성 경화증(scleroderma), 탈피성 피부염(exfoliating dermatitis), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris)과 같은 피부 질환; 류머티스 관절염(RA), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 건선 또는 염증성 장 질환과 연관된 관절염과 같은 관절 질환; 근무력증(MG), 다발성근염(polymyositis)과 같은 근골격 질환, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가면역 갑상선염(Hashimoto), 티레오톡시코시스(thyreotoxicosis), 갑상선기능항진증(Graves disease)과 같은 내분비 질환; 자가면역 빈혈, 자가면역 혈소판감소증(thrombocytopenia), 자가면역 재생불량성 빈혈과 같은 조혈계 질환; 심근병증, 혈관염, 전신 질환, 예를 들면, 전신성 홍반성 낭창, 다발성 결절 동맥염, 류머티스 관절염, 경피증, 유사 육종증과 연관된 심혈관 질환과 같은 심혈관 질환이 포함된다.

자가면역 질환의 눈에 띄는 특징은 이들의 가족성 클러스터링(familial clustering) 및 특정 유전자, 특히, 클래스 I과 클래스 II 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 발현과의 연관이다. 가령, 대부분의 MS 환자는 HLA-DR2 일배체형을 보유한다(Beall S S, Concannon P, Charmley P, et al., J. Neuroimmunol.,v 21, p 59-66, 1989). 감수성 유전형을 보유한 모든 개체에서 자가면역 질병이 발병하는 것은 아니기 때문에, 환경 요인 역시 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 가령, MS는 온대 지역에 살고 있는 개체에서 더욱 빈번하게 나타난다(Kurtzke J F, IN: Multiple Sclerosis, Hallpike J F, Adams C W M, Tourtelotte W W, editors, Williams and Wilkins, Baltimore, Md., 1983, p 49-95). 오랫동안, 자가면역 질환의 환경 요인은 바이러스와 같은 감염성 인자인 것으로 추정되어 왔다. 여러 인간과 동물 질병의 병인은 바이러스 감염에 기인할 수 있다. 가령, 타일러 뮤린 뇌척수염(Theiler's murine encephalomyelitis)은 EAE와 유사한 임상적, 병리학적 증상을 보이는 탈수초 질환이다. 항체가 자가면역 질환의 일부 작동체 반응에 관여하긴 하지만, 대부분의 경우에 유인 현상은 B 세포 성숙과 클론 확장을 위하여 필요한 CD4 T-세포의 활성화로 시작된다.

지연형 과민증 군에는 저분자량 물질에 대한 접촉 과민증이 포함된다.

A. 염증성 장 질환(CD와 UC):

역학 데이터는 크론병(CD)과 궤양성 대장염(UC)의 발병에 유전적 민감도(genetic susceptibility)를 암시한다. 산업화된 사회에서 CD의 발병률은 1950대부터 1980년대 중반까지 증가하였고, 현재는 연간 100,000명당 1 내지 8명이다. 이는 환경에서 미지의 변화가 CD의 빈도에 영향을 준다는 것을 암시한다.

IBD의 원인은 아직 확인되지 않고 있지만, 장내 점막 면역계의 조절장애에 기인하는 것으로 생각된다. 점막에서 염증 세포는 정상 상태에서, 관(luminal) 내용물로부터 우리를 보호한다. 이러한 고도로 유효한 만성 염증은 조직 손상을 제한하기 위하여 극도로 통제된다. IBD는 관 인자에 대한 과도하게 활발한 면역 반응에 기인한다. CD는 IFN-γ과 TNFα를 생산하는 과도하게 활발한 Th1-형 염증인 것으로 생각된다.

궤양성 대장염(UC)과 크론병(CD)은 불완전하게 한정된 환경 노출 및 적어도 일부 경우에 민감성 유전자의 유전형질의 상호작용에 의해 유발된 복합적인 유도성 질환이다. IBD에 대한 유전적 소인의 증거는 이런 질환을 앓는 환자의 가족 구성원에서 IBD의 예상보다 높은 발생 및 서구 국가의 유태인 집단에서 상기 질환의 높은 이환률(prevalence)이다(Roth MP, Petersen GM, McElree C et al. Geographic origins of Jewish patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology 1989;97(4):900-4)). 하지만, IBD는 유사한 인종적 기원(Grossman A, Fireman Z, Lilos P et al. Epidemiology of ulcerative colitis in the Jewish population of central Israel 1970-1980. Hepato-Gastroenterology 1989;36(4):193-7)의 이스라엘의 유태인 집단에서 훨씬 낮은 빈도로 발병한다(Fireman Z, Grossman A, Lilos P et al. Epidemiology of Crohn's disease in the Jewish population of central Israel, 1970-1980. Am J Gastro 1989;84(3):255-8). 쌍둥이 연구는 적어도 CD에 대한 유전적 소인의 증거를 제공한다(Halfvarson J, Bodin L, Tysk C et al. Inflammatory bowel disease in a Swedish twin cohort: a long-term follow-up of concordance and clinical characteristics.Gastroenterology 2003;124(7):1767-73.). 박테리아 산물 무라밀 디펩티드를 감지하는 세포내 단백질 CARD15/NOD2(Inohara M, Ogura Y, Fontalba A et al. Host recognition of bacterial muramyl dieptide mediated through NOD2: implications for Crohn's disease. J Biol Chem 2003; Girardin SE, Boneca IG, Viala J et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide(MDP) detection. J Biol Chem 2003)에서 유전적 결함으로 인하여, 일부 개체는 CD에 더욱 민감하다. 다양한 다른 유전적 변이가 IBD 위험 인자로서 제안되고 있다. 하지만, 유전적 소인은 이와 같이 급격하게 증가하는 발병률을 설명하지 못한다.

Elliott et al., 1998, Inflammatory Bowel Disease and Celiac Disease. In: The Autoimmune Disease, Third ed., N.R. Rose and I.R. MacKay, eds. Academic Press, San Diego, CA)에 보고된 바와 같이, 만성 장내 염증의 여러 동물 모델이 존재한다. 중요한 진전은 유전자 조작으로 유전자 결실된 일부 생쥐에서 IBD와 유사한 만성 장 염증이 발병할 수 있다는 최근의 발견이다(Elson et al., 1995, Gastroenterology 109:1344). 이들은 특히 IL-2, IL-10, MHC 클래스 II 또는 TCR 유전자에 대한 표적된 결실을 보유하는 변이 생쥐이다. 이들 모델 중에서 일부를 이용하여, Berg et al., 1996, J. of Clin. Investigation 98:1010, Ludviksson et al., 1997, J. of Immunol. 158:104 및 Mombaerts et al., 1993, Cell 75:274에서는 조절장애 면역계 자체가 장내 손상을 매개할 수 있음을 보여준다. 이들 모델 중에서 여러 모델의 점막 염증은 대량의 IFN-γ와 TNF-α를 발생시키는데, 이는 Th1-형 사이토킨의 과도한 생산이 병인의 기초가 되는 공통의 기전임을 암시한다. 또한, Th1 회로(circuitry)의 차단은 염증을 예방한다. CD는 Th1 반응이다. 따라서, 이들 모델은 상기 인간 질환 과정의 면역병리에 직접적으로 관여할 수 있다.

B. 류머티스 관절염(RA):

RA는 일반적으로 대칭적으로 분포하는 말단 관절에서 지속적인 염증성 활액막염(synovitis)을 특징으로 하는 만성 염증이다. 이런 염증은 골 부식, 연골 손상, 관절 파괴를 유발할 수 있다. 이는 전체 인구의 약 1%에게 고통을 주고 있다. 이환율은 연령에 비례하여 증가하고, 여성은 남성보다 더욱 빈번하게 고통을 받는다. RA의 확대는 CD4+ Th1 세포에 의해 유도되는 면역학적으로 매개된 현상이다.

C. 인슐린-의존성 연소성 당뇨병(DM)(1형):

1형 DM은 일반적으로, 초기 성인기에 시작되고, 증가하는 혈당에 대응하여 인슐린을 생산하지 못함으로써 발생하는 질병이다. 이런 지속적인 고혈당 및 글루코오스를 적절히 대사하는 능력의 부재는 궁극적으로 눈, 신장, 심장, 다른 장기를 손상시키는 대사 장애(metabolic disturbance)를 유발한다. 인슐린을 비경구로 섭취하면 이들 대사 문제를 부분적으로 조절할 수 있다. I형 DM은 인슐린의 근원인 췌장 베타 세포에 대한 자가면역 공격에 기인한다. 활성화된 대식세포와 세포독성 T 세포는 췌장 베타 세포를 둘러싸고 파괴한다. 유전적 민감도 및 불완전하게 한정된 환경 현상이 이런 질병 과정을 유인한다.

D. 홍반성 낭창(LE):

LE는 초기 내지 중기 성인기의 여성에서 가장 빈번하게 발생하는 전신 자가면역 질환이다. 조직 손상은 자가항체 및 과민성 조절 T 세포에 의해 유발된다. 비정상적인 면역 반응으로 병원성 자가항체와 면역 복합체가 지속적으로 생산된다. 이는 근골격, 피부, 조혈, 신장 및 다른 시스템을 손상시킨다. 비정상적인 면역 반응은 아마도, 복수 유전성(multiple hereditary) 및 환경 요인의 상호작용에 기인한다.

E. 유사 육종증:

유사 육종증은 원인이 알려지지 않은 폐와 다른 장기의 만성 육아종성 질환이다. 대부분의 환자는 20대 내지 40대이다. 가장 빈번한 증상은 호흡의 단축이다. 상기 질환은 아마도, 제한된 수의 항원에 대한 과도한 Th1-형 세포 면역 반응에 기인한다. 유사 육종증은 전세계적으로 발생하며, 모든 인종에 고통을 준다. 하지만, 특정 민족과 인종 집단 사이에 유사 육종증의 이환율이 현저하게 다양하다. 가령, 상기 질환은 폴란드, 동남아시아, 인도에서는 드물게 발생한다.

F. 다발성 경화증(MS):

MS는 뇌의 국소성 탈수초화와 상처를 유발하는 중추신경계의 만성 재발성 다병소성 염증 질환이다. 이는 대략 350,000명의 미국인에게 고통을 주고, 조기 내지 중기 성인기에 시작되는 질병이다. MS는 적어도 부분적으로 Th1 세포에 의해 매개되는 자가면역 질환이다. MS의 병소는 활성화된 T 세포와 대식세포를 포함하는 지연형 과민 반응에 의해 유발된 병소와 유사하다. 이는 온대 기후의 질병으로, 적도로부터 거리에 비례하여 이환율이 증가한다.

Th2-관련된 질병

Th2-관련된 질병은 아래의 질병 군: 알레르기 질환과 암으로 구성된다.

유전적 소인이 있는 개체는 다양한 환경 출처로부터 기원되는 항원에 노출되면 감작화(알레르기)되는 것으로 알려져 있다. 알레르기 반응은 이전에 감작화된 개체가 동일하거나 상동한 알레르기원에 재-노출되는 경우에 발생한다. 알레르기 반응은 꿀벌이나 말벌에 쏘임 또는 곤충에 물림에 대한 대응으로 건초열, 코결막염, 비염, 천식에서부터 전신 아나필락시스와 사망까지 다양하다. 이런 반응은 즉각적이고 다양한 아토피성 알레르기원, 예를 들면, 풀, 나무, 잡초, 곤충, (집 먼지) 진드기, 식품, 약물, 화학물질, 향수로부터 기원하는 화합물에 의해 유발될 수 있다.

알레르기 질환 군에는 건초열, 코결막염, 비염, 천식이 포함된다.

알레르기 반응이 발생하는 가장 일반적인 알레르기원은 나무, 풀, 허브, 균류, 진드기, 집 먼지 진드기(house dust mites), 저장 진드기(storage mites), 바퀴벌레(cockroaches)와 동물 털, 깃털, 비듬으로부터 기원하는 흡입 알레르기원이다. 나무, 풀, 허브로부터 유래되는 중요한 화분 알레르기원은 박달나무(Betula), 오리나무(Alnus), 개암나무(Corylus), 서나무(Carpinus), 올리브(Olea)를 비롯한 참나무목(Fagales), 물푸레나무목(Oleales), 소나무목(Pinales); 보리속(Lolium), 아재비속(Phleum), 포아속(Poa), 우산잔디속(Cynodon), 오리새속(Dactylis), 맥각속(Secale)의 풀을 비롯한 벼목(Poales); 암브로시아속(Ambrosia)과 향쑥속(Artemisia)의 허브를 비롯한 국화목(Asterales)과 쐐기풀목(Urticales)으로부터 기원한다. 균류로부터 중요한 흡입 알레르기원은 알테르나리아속(Alternaria)과 클라도스포리움속(Cladosporium)으로부터 기원한다. 다른 중요한 흡입 알레르기원은 먼지 진드기 속(Dermatophagoides)의 집 먼지 진드기; 레피도글리피스 디스트럭터(Lepidoglyphys destructor)의 저장 진드기; 바퀴벌레; 고양이, 개, 말, 소와 같은 포유동물; 조류로부터 유래된다. 또한, 꿀벌, 말벌을 비롯한 벌목(Hymenoptera)의 곤충과 같은 쏘거나 무는 곤충 및 개미에 대한 알레르기 반응이 통상적으로 관찰된다. 특이적인 알레르기 성분은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 여기에는 예로써 참나무목의 Bet v 1(B. verrucosa, 박달나무), Aln g 1(Alnus glutinosa, 오리나무), Cor a 1(Corylus avelana, 개암나무), Car b 1(Carpinus betulus, 서나무속)이 포함된다. 또한, Cry j 1(소나무목), Amb a 1과 2, Art v 1(국화목), Par j 1(쐐기풀목), Ole e 1(물푸레나무목), Ave e 1, Cyn d 1, Dac g 1, Fes p 1, Hol l 1, Lol p 1과 5, Pas n 1, Phi p 1과 5, Poa p 1, 2, 5, Sec c 1과 5, Sor h 1(다양한 풀 화분), Alt a 1과 Cha h 1(균류), Der f 1과 2, Der p 1과 2(각각, 큰다리 먼지 진드기(D. farinae)와 세로무늬 먼지 진드기(D. pteronyssinus)), Lep d 1, Bla g 1과 2, Per a 1(각각, 독일바퀴(Blatella germanica)와 미국바퀴(Periplaneta americana)), Fel d 1(고양이), Can f 1(개), Equ c 1, 2, 3(말), Apis m 1과 2(꿀벌), Ves g 1, 2, 5, Pol a 1, 2, 5(모든 말벌), Sol i 1, 2, 3, 4(불개미) 역시 포함된다.

A. 천식

많은 사람에서, 천식은 공기를 통하여 통상적으로 흡입되는 물질, 예를 들면, 동물 비듬, 화분, 또는 먼지 진드기, 바퀴벌레 찌꺼기에 대한 알레르기 반응인 것으로 보인다. 이들 물질을 통칭하는 알레르기원(allergen)은 알레르기 반응을 촉발하는 임의의 물질을 의미한다. 일부 사람들은 특정 알레르기원에 반응하는 유전적 소인을 안고 있다. 1998년에, 대략 17백만, 또는 전체 인구의 대략 6.4%의 미국인이 천식으로 고통을 받았다. 천식을 앓는 미국인 중에서 아동은 4.8백만 명이다. 양 동물 모델로부터 획득가능한 실험적, 임상적 정보 및 인간 천식의 병리에 대한 임상적 정보는 상기 질병의 병리에서 Th2 세포를 지시한다.

Th1-과 Th2-관련된 암

일반적으로, 암 세포는 암 세포에 의해 특이적으로 발현되는 항원에 면역 반응을 유발한다. Th1과 Th2 면역 반응 모두 조직의 세포독성 소거를 유도하는 강한 염증 반응을 유도하기 때문에, Th1 또는 Th2 면역 반응의 조절이 암의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물로 치료될 수 있는 암은 암종과 선암종을 비롯한 악성 상피 종양 및 지방육종(liposarcomas), 섬유육종(fibrosarcomas), 연골육종(chondrosarcomas), 골육종(osteosarcomas), 평활근육종(leiomyosarcomas), 횡문근육종(rhabdomyosarcomas), 교종(gliomas), 신경모세포종(neuroblastomas), 수아세포종(medulloblastomas), 악성 흑색종(malignant melanoma), 악성 뇌수막종(malignant meningioma), 다양한 백혈병, 다양한 골수증식성 질환, 다양한 림프종(호지킨 림프종과 비-호지킨 림프종), 혈관육종(haemangiosarcoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 악성 기형종(malignant teratoma), 미분화세포종(dysgerminoma), 정상피종(seminoma), 융모암종(choricarcinoma)을 비롯한 비-상피 종양으로 조직유전학적으로 분류될 수 있다. 암종과 선암종이 가장 빈번하게(암으로부터 사망의 대략 90%) 발생하고, 따라서 본 발명에 따른 치료/예방의 흥미로운 표적 질환이 된다. 가장 중요한 암종과 선암종은 기도(특히, 기관지 기원), 유방, 결장직장, 위의 암종과 선암종이다. 하지만, 전립선, 난소, 림프구 조직과 골수, 자궁, 췌장, 식도, 방광, 신장의 암종과 선암종 역시 상당한 사망자를 유발하기 때문에, 이들 역시 표적 질환에 포함된다. 또한, 암 질환 군에는 Sezary 중후군, 피부 T-세포 림프종, 간 암종, 폐암 역시 포함된다.

Th1 또는 Th2 관련된 질환에서 조절 T 세포

조절 T 세포는 말초 관용(peripheral tolerance)을 유도하고 점막 반응성을 제한할 수 있다(McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol 2002;23(9):450-5). 다양한 동물 모델에서, 여러 조절 T 세포 표현형이 보고되었다. 조절 T 세포는 다양한 마커를 발현하고 상이한 질병에 관여하는 것으로 기술되었다(참조: Field, A. C., L. Caccavelli, M. F. Bloch, and B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170:2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):223-32; Francois Bach J. regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec;14(6):771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep;23(9):450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T-cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug;182:135-48; Read S, Powrie F. CD4(+) regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec;13(6):644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep;3(11):899-904)). 일부 시스템에서, 이들은 CD25(Shevach, E. M. 2002. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nature Reviews.Immunology. 2:389-400), CD45RB(Annacker, O. and F. Powrie. 2002. Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection. 4:567-574) 및 CTLA-4(Read, S., V. Malmstrom, and F. Powrie. 2000. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) control cells that control intestinal inflammation. J.Exp.Med. 192:295-302)와 같은 표면 분자의 차별적 발현을 통하여 구별된다. 세포 표면 단백질 발현의 이런 패턴은 이들이 기폭된 작동제 또는 기억 상태로 존재한다는 것을 암시한다. 이들 조절 세포는 IL10과 TGFβ의 생산을 통하여 이들의 효과중 일부를 매개할 수 있다. 높은 수준의 IL10과 TGFβ를 생산하는 무반응(anergic) 조절 T 세포(Tr1)가 보고되었다. Th3이라고 하는 다른 세포는 주로 TGFβ의 생산을 통하여 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도를 억제한다. 또 다른 조절 T 세포는 가용성 IL10 또는 TGFβd[ 의존하지 않고, 대신에 TGFβ 전구 펩티드의 아미노-말단 도메인인 잠복-연관된 펩티드를 표면에 발현한다(Oida T, Zhang X, Goto M et al. CD4+CD25- T cells that express latency-associated peptide on the surface suppress CD4+CD45RBhigh-induced colitis by a TGF-beta-dependent mechanism. J Immunol 2003;170(5):2516-22). 조절 T 세포에 대한 내부 세포 마커 역시 보고되었다(Schubert LA, Jeffery E, Zhang Y, Ramsdell F, Ziegler SF, Scurfin(FOXP3) acts as a repressor of transcription and regulates T cell activation. J Biol Chem. 2001 Oct 5;276(40):37672-9). 모든 참고문헌은 본 명세서에서 순전히 참조로 한다.

CD4+, CD45^highT 세포로 재구성된 Rag 생쥐는 심각한 대장염이 발병할 수 있는데, 이는 CD4+, CD45^low T 세포의 동시-전달로 예방될 수 있다(Annacker O, Powrie F. Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection 2002;4(5):567-74). 보호를 위하여 TGFβ와 IL10이 필요한데, 이는 조절 과정에서 이들 사이토킨의 역할을 암시한다.

본 발명에 따른 장내 기생충 제제

장내 기생충은 기생 동물(기생충)인데, 이들은 종에 따라, 숙주의 장관(intestinal lumen), 혈류(blood stream) 또는 근육에 존재한다. 이들 생물체는 전체 인구의 1/3 이상에서 군체를 형성한다. 장내 기생충 군체 형성(colonization)은 위생이 불량한 온대 지역에 거주하는 어린에서 가장 빈번하다. 이들 생물체의 감염성 형태는 오염된 토양, 식품 또는 식수와의 접촉으로 확산된다. 1940년대 이전에, 미국에서 많은 아동과 성인이 장내 기생충을 보유하였다. 기생충 보유(worm carriage)는 남부의 시골 지역과 주요 도시의 빈민가에서 특히 흔하였다(Elliott DE, Urban JF, Jr., Argo CK et al. Does the failure to acquire helminthic parasites predispose to Crohn's disease? FASEB J 2000;14(12):1848-55). 미국과 유럽에서, 장내 기생충 군체 형성은 지속적으로 감소하고 있다. 이들은 저개발 국가로부터 최근 이민자(Salas SD, Heifetz R, Barrett-Connor E. Intestinal parasites in Central American immigrants in the United States. Arch Intern Med 1990;150(7):1514-6) 및 일부 인디언 보호구역과 같은 미국내에서 경제적으로 곤궁한 지역에 거주하는 집단에서 발견된다(Healy GR, Gleason NN, Bokat R et al. Prevalence of ascariasis and amebiasis in Cherokee Indian school children. Public Health Rep 1969;84(10):907-14). 장내 기생충의 이환율은 온대 지역 및 인구가 과밀하고 위생이 불량하며 불순한 식수가 공급되는 지역에 기주하는 집단에서 가장 높다. 염증성 장 질환(IBD), 류머티스 관절염, 자가면역 질환은 이들 지역에서 드물다.

인간 장에 빈번하게 기생하는 선충은 회충(Ascaris lumbricoides), 요충(Enterobius vermicularis)(pin worm), 편충(Trichuris trichiura)(whipworm), 구충(Ancylostoma duodenale)과 아메리카 구충(Necator americanus)(hookworms), 분선충(Strongyloides stercoralis)이다. 선모충(Trichinella spiralis)은 소장을 일시적으로 감염시킨다.

숙주는 감염성 형태의 기생충으로 오염된 토양, 식품 또는 식수와 접촉을 통하여 다양한 장내 기생충 종을 획득한다. 아동은 토양과의 근접한 접촉 및 최적이하 위생 습관으로 인하여 장내 기생충에 가장 빈번하게 감염된다. 장내 기생충은 장내 Th2 반응을 유발하는데, 이는 기생충 구제(worm expulsion)를 유도하거나 감염 정도를 제한할 수 있다. 비-산업화된 국가에서 거주하는 대부분의 아동이 이들 기생충을 보유한다. 많은 장내 기생충 종이 내장, 담도(biliary tree) 또는 장간막 정맥(mesenteric vein) 내에서 수년간 생존하면서 매일 수천개의 알을 낳는다. 따라서, 유아기부터 시작하여 이들 기생충 및/또는 이들의 알은 수년간 장내 점막 표면을 감싸고 Th2-형 염증을 유도하는 분자를 방출한다.

A. 생존가능 생물체 백신:

생존가능 장내 기생충 생물체는 성분 백신에 비하여 상대적인 장명(longevity)으로 인하여 가장 심오한 점막 조절을 제공할 수 있다. 생존간능 생물체는 장내 기생충에 따라, 알, 유충, 세르카리아, 또는 포낭-형성된 유충 형태에 투여될 수 있다. 인간과 준비 동물에 군체를 형성할 수 있는 장내 기생충이 이용될 수 있다.

준비 동물은 장내 기생충에 의한 높은 효능이 가능하도록 조작될 수 있다. 이런 조작에는 글루코코르티코이드 또는 아자티오프린과 같은 면역억제제 약물; 항-히스타민, 항-사이토킨, 또는 재조합 사이토킨과 같은 Th2 효과를 방해하는 약물; 항-콜린성 약물 또는 아편제와 같은 장 운동에 영향을 주는 약물로 처리가 포함될 수 있다. 동물의 사료는 거친 섬유 함량이 감소하도록 변화된다. 동물은 쥐, 돼지, 햄스터, 조류, 또는 다른 준비 동물일 수 있다.

준비 동물은 당분야에 공지된 방법에 따라, 특이적인 병원균-없는(SPF)(가령, 특정 인간 병원균 없는) 환경에서 사육된다. 이들은 인간 박테리아, 마이코박테리아, 바이러스 병원균의 부재를 조사한다. SPF 환경에서 동물을 사육하는 방법 및 이의 이점은 예로써 M. Michael Swindle(J. Invest. Surg., 9:267-271, 1996, hereby incorporated by reference)에 의해 보고되었다. Swindle은 또한, 우려되는 여러 잠재적 인간 바이러스와 박테리아 병원균의 목록을 기술하였다. 따라서, 특정 인간 병원균 없는 환경에서 사육된 동물로부터 유래된 기생충 제제는 이들 인간 병원균을 함유하지 않고, 따라서 임의의 SPF 환경에서 사육된 동물로부터 제조된 기생충 제제로부터 명백하게 구별된다.

알: 일부 장내 기생충은 생존가능 알의 섭취로 획득된다. 장내 기생충은 SPF 준비 동물, 예를 들면, 준비 돼지에서 유지된다. 알을 수거하기 위하여, 이들 동물은 거친 섬유가 적은 특별 사료를 제공한다. 동물은 정화(defecation)를 유도하는 경구 정화제(purgative)를 제공한다. 대변을 수거하고 효소적으로 소화시켜 알을 유리시킨다. 알은 액체화된 대변으로부터 밀도 구배에서 부양, 스크린 여과(screen filtration), Visser 여과(Visser filtration), 또는 원심 세정(centrifugal elutriation)으로 분리한다. 알의 보존은 이용된 장내 기생충에 따라 달라진다. 탈수(desiccation)에 저항하는 장내 기생충의 알은 건조시키고 불활성 물질과 혼합하며 장용 캡슐(enteric capsule)에 집어넣고 냉동시킨다. 탈수에 민감한 장내 기생충의 알은 액체 배지에서 냉동으로, 또는 동결보존제를 첨가하고 냉동 질소에서 동결시킴으로써 보존한다. 생존가능 알은 세척하고 냉각된 락토오스-없는 푸딩(pudding) 또는 전달 장소에서 다른 운반제와 혼합한다. 글리세롤-기초된 동결보존제에 저장된 알은 세척을 필요로 하지 않는다. 각 로트로부터 알은 부화율(hatching rate)을 조사하여 효과량을 결정한다. 각 로트로부터 알은 박테리아와 바이러스 병원균의 부재를 조사한다.

유충: 일부 장내 기생충(가령, 십이지장충)은 인간에 군체를 형성하기에 앞서 토양 성숙 단계를 필요로 한다. 이들 병원체로부터 알은 최적 조건하에 배양하여 배아를 성숙시키거나, 또는 알을 부화시켜 유충 형태를 제공한다. 환자는 생존가능 유충의 피하 주입 또는 경구 섭취로 접종될 수 있다.

세르카리아: 일부 장내 기생충은 중간 숙주를 이용하는 복잡한 생명 주기를 보유한다. 중간 숙주는 인간에 군체를 형성할 수 있는 형태를 전파시킨다. 세르카리아는 뱀과 같은 중간 숙주에 의해 전파되는 흡충 장내 기생충(즉, 흡충) 형태이다. 세르카리아는 SPF 조건에서 성장된 군체 형성된 뱀으로부터 분리한다. 세르카리아는 세척한다. 이들은 동결보존제를 첨가하고 액체 질소에서 냉동시켜 보존할 수 있다. 해동되거나 새로운 세르카리아는 세척하고 피하 주입하여 환자를 접종한다. 각 로트로부터 샘플은 병원균의 부재를 조사하고 효과량을 결정한다.

포낭-형성된 유충: 일부 장내 기생충(가령, 촌총)은 중간 숙주에서 포낭-형성된 유충 또는 세르카리아를 형성한다. 이런 포낭-형성된 유충 형태는 인간 군체 형성을 유인한다. 포낭-형성된 유충은 중간 숙주, 예를 들면, SPF 조건에서 성장된 소 또는 어류 또는 식물로부터 분리한다. 포낭은 숙주 조직이 남지 않도록 세척한다. 포낭은 동결보존제를 첨가하고 액체 질소에서 동결시킴으로써 보존할 수 있다. 해동되거나 새로 이용된 포낭은 세척하고 냉각된 락토오스-없는 푸딩 또는 전달 장소에서 다른 운반제와 혼합하며 개체에게 공급한다. 각 로트로부터 샘플은 병원균의 부재를 조사하고 효과량을 결정한다.

B. 비-생존가능 성분 백신:

장내 기생충의 비-생존가능 성분은 Th1-매개된 병리를 예방할 만큼 면역 반응의 충분한 Th2 조절을 제공한다.

비-생존가능 성분은 알, 유충 또는 성체 기생충으로부터 유래된다.

비-생존가능 완전 주혈흡충(schistosome) 알은 강한 Th2 반응을 유도한다. 알은 SPF 조건에서 성장된 준비 동물(즉, 햄스터)의 간으로부터 분리한다. 알은 Coker and Lichtenberg, 1956, Proceedings of the Soc. For Exp. Biol. & Med. 92:780에 처음 기술된 방법으로 변형된 방법으로 분리한다. 이들 변형은 자기분해 소화 시간의 감소와 함께, 배양과 세척 단계에서 1.7% 염수 대신에 글루코오스를 함유하는 인산염 완충된 염수를 이용하는 것으로 구성된다. 이들 변화는 생존가능 알의 분리를 용이하게 한다. 상기 방법은 아래와 같다.

골든 햄스터(golden hamster)를 1000 내지 1500 세르카리아로 감염시킨다. 감염을 성숙시킨다(6 내지 7주). 동물로부터 간을 떼어내고 5% 글루코오스, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 600 mOsm 무균 인산염 완충된 염수에 위치시킨다. 간은 24시간동안 실온에서 자기소화시킨다. 차가운 Waring 혼합기에서 3분간 낮은 속도로 펄스하여 간을 균질화시킨다. 32°C에서 1시간동안 콜라게나제(2 ㎎/㎖)와 트립신(2 ㎎/㎖)과 함께 균질액을 배양한다. 50과 80-100 메시(mesh) 체를 통하여 균질액을 여과하여 조직 덩어리와 잔해를 제거한다. 325 메시 체에 통과시켜 여과액으로부터 알을 회수한다. 알은 스크린을 통과하지 않는다. 알을 스크린으로부터 50 ㎖ 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 이전한다. 5% 글루코오스를 함유하는 무균 인산염 완충된 염수에서 반복된 저속(400 x g) 원심분리로 알을 세척한다. 알은 콜라겐 잔해가 남지 않도록 한다. 1 ㎖ Sedwick 챔버에서 알의 분량을 산정하여 전체 알 개수를 결정한다.

분리된 알은 염수에 부유시키고 동결보존제 없이 액체 질소에서 급속 동결한다. 이는 알을 사멸시킨다. 해동된 알은 피하, 근육내 또는 정맥내, 또는 강한 Th2 반응을 유도하는 Th1 염증 부위에 주입한다. 다른 장내 기생충으로부터 알 역시 이용될 수 있다.

기생충 알로부터 분리된 단백질, 지질 또는 탄수화물을 함유하는 성분 백신 역시 이용될 수 있다. 한가지 실례는 주혈흡충(schistosome) 가용성 알 항원(SEA)이다. 주혈흡충(schistosome) 알 항원을 준비하는 방법은 Boros and Warren, 1970, J. of Experimental Med . 132:488에서 이미 보고되었다.

세척된 알은 50,000 알/㎖의 인산염 완충된 염수에서 재부유시킨다. 이는 유리 조직 균질화기로 이전한다. 알은 얼음 위에서 균질화시킨다. 모든 껍질이 파괴되고 미라시디아(miracidia)가 파괴되도록 담보하기 위하여, 현미경 검사를 위한 분량(5 ㎖)을 떼어낸다. 균질액을 원심분리 튜브로 이전한다. 4℃애서 2시간동안 100,000 x g에서 원심분리한다. 수성 분획물(SEA)을 회수하고 단백질 함량을 결정한다. 소량 분량의 SEA를 -70°C에 보관한다. 상기 방법은 Th2 조절을 가장 강하게 촉진하는, 다시 말하면, 최적 효과 농도(100 ㎍ SEA 또는 10,000 알/동물)를 달성하는 기생충 알 산물을 분리한다. 알 또는 가용성 알 성분은 Th2 반응을 유인하거나, 또는 생존가능 장내 기생충의 군체 형성으로 이미 유인된 Th2 반응을 강화시킨다. 알 또는 알 성분은 병원균과 내독소의 부재를 조사한다.

성분 백신은 장내 기생충의 유충과 성체 기생충으로부터 개발될 수도 있다. 유충 또는 기생충은 SPF 조건에서 성장된 준비 동물로부터 분리한다. 비-생존가능 원형 생물체, 또는 장내 기생충으로부터 분리된 단백질, 지질 또는 탄수화물을 하유하는 백신은 장내 기생충 알에서 전술한 바와 유사한 방식으로 제조되고 이용된다.

또한, 본 발명에는 장내 기생충의 분획물 또는 부분분획물을 함유하는 백신 및 예로써 당분야에 공지된 방법에 따라 장내 기생충으로부터 유래된 분리된 단백질, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 지질 등을 함유하는 백신이 포함된다(참조: Williams et al., 1994, Leukocytes of patients with Schistosoma mansoni respond with a Th2 pattern of a cytokine production to mitogen or egg antigens but with a Th0 pattern to worm antigens. J. Infect. Dis. 170:946; Xu-Amano et al., 1993, Helper T cell subsets for immunoglobulin A responses: oral immunization withtetanus toxoid and cholera toxin as adjuvant selectively induces Th2 cells in mucosa associated tissues. J. Exp. Med. 178:1309; Ausiello et al., 2000, Cell mediated immunity and antibody responses to Bordetella pertussis antigens in children with a history of pertussis infection and in recipients of an acellular pertussis vaccine. J. infect. Dis., 181:1989).

가령, 분획물 또는 부분분획물은 Thaumaturgo et al., 2001, Preliminary Analysis of Sm14 in Distinct 분획물s of Schistosoma mansoni Adult Worm Extract, Mem. Inst. Oswaldo Cruz vol.96 suppl. Vol. 96, Suppl.: 79-83에서 기술된 방법에 따라 준비할 수 있다. 상기 방법에서, 만소니주혈흡충(S. mansoni) 기생충은 감염후 45일 시점에, 헤파린처리 염수(0.85% NaCl 용액)를 이용한 역관류(retrograde perfusion)로 획득하고(Pellegrino & Siqueira 1956, T?cnica de perfus?o para colheita de Schistosoma mansoni em cobaias experimentalmente infectadas. Rev Bras Mal D Trop 8: 589-597), 상이한 추출물을 준비하는데 이용한다.

성체-기생충-유래된 추출물(SE)의 준비 - 기생충은 PBS에서 헹구었다. 이후, 생존 기생충은 새로운 PBS(인산염 완충된 염수)에서 2-3시간동안 실온(28°C 내지 30°C)에 방치하고 -20°C에서 동결하였다. 해동이후, 기생충의 PBS 현탁액(1g 기생충/10 ㎖ PBS)을 와이어 메시(wire mesh)를 통하여 여과하고 4°C에서 1시간동안 10,000 g로 원심분리하였다(Tendler & Scapin 1981, Schistosoma mansoni antigenic extracts obtained by different extraction procedures. Mem Inst Oswaldo Cruz 76: 103-109; Tendler et al. 1982, Immunogene and protective activity of an extract of Schistosoma mansoni. Mem Inst Oswaldo Cruz 77: 275-283). SE의 단백질 함량은 Lowry 방법(Lowry et al. 1951)으로 사정하고, 1 ㎎/㎖을 함유하는 저장 배치(stock batch)를 -20°C에 보관하였다. 암컷과 수컷 추출물은 관류 직후에 분리된 기생충으로 동일한 방법에 따라 준비하였다.

성체-기생충-유래된 추출물(SEi)의 신속하게 방출되는 “분획물”의 준비 - SEi 제제는 SE의 최초 단계에 해당한다: SE에서 기술한 바와 같이 관류이후, 생존 기생충을 PBS에서 실온(28℃ 내지 30℃)에서 2-3시간동안 배양하였다. 이후, 성체 기생충은 와이어 메시에서 배양 용액(SEi)으로부터 여과하였다.

SE2 제제 - SE 최초 제조물로부터 남아있는 성체 기생충은 PBS에서 동결시켜(-20℃)에서 1주일동안 재-보관하였다(1g 기생충/10 ㎖ PBS). 해동이후, PBS 현탁액은 와이어 메시를 통하여 여과하고 4°C에서 1시간동안 10,000 g에서 원심분리하였다.

기생충 항원은 Thaumaturgo et al.(supra)의 도 1에 기술된 바와 같이 추출할 수도 있다(도 23에서처럼 재현). 대안으로, 기생충 항원은 Deelder et al.(1980. Applicability of different antigen preparations in the enzyme-linked immunosorbent assay for schistosomiasis mansoni. Am. J. Trop. Med. Hyg. 29:401-410)에 기술된 바와 같이 준비될 수 있다. 가령, 항원은 개별 수명 주기 단계의 완충된 염수 균질액으로부터 가용성 상층액으로서 제조된 SWAP으로부터 준비될 수 있다(Goes et al. 1989, Production and characterization of human monoclonal antibodies against Schistosoma mansoni. Parasite Immunol 11: 695-711). SWAP는 기존 문헌(Hirsch & Goes 1996, Characterization of 분획물ated Schistosoma mansoni soluble adult worm antigens that elicit human cell proliferation and granuloma formation in vitro.Parasitology 112: 529-535)에 기술된 바와 같이, FPLC(신속 단백질 액체 크로마토그래피)에서 음이온-교환 크로마토그래피로 분획하였다. 간단히 말하면, 단백질은 1M NaCl까지 증가하는 다단계 구배에서 20 mM Tris-HCl, pH 9.6로 용리하고 0, 100, 280, 450, 600, 750 mM에서 유지-구배 간격(hold-gradient interval)으로 중단시켰다. 플로어-스루(flow-through) 분획물은 동결건조로 농축하였다. 농축된 물질은 0.15 M 인산염-완충된 염수(PBS), pH 7.4에 투석하고 여과로 멸균하며 -70℃에서 보관하였다. 단백질 함량은 Bradford 마이크로측정법에 따라 측정하였다(Bradford 1976, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt Biochem 72: 248-254). 환원 조건하에 10% SDS-PAGE(소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)(Laemmli 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685)으로 분리된 6개 분획물의 분석에서 복수 단백질 띠를 보이는데, 분획물 III은 높은(97과 160 KDa), 중간(52와 56 KDa), 낮은(28과 36 KDa) 단백질을 보유한다. 상기 분획물은 PIII이라 하고, 상이한 면역학적 검사에 이용하였다.

지질 역시 당분야, 예를 들면, van der Kleij et al., 1999, Recognition of Schistosome Glycolipids by Immunoglobulin E: Possible Role in Immunity Infection and Immunity, 67: 5946-5950에 기술된 바와 같이 준비하였다.

한 구체예에서, 만소니주혈흡충(S. mansoni) 성체 기생충(12 g[습식 중량])과 알(1.6g[습식 중량])의 지질은 Bligh와 Dyer(1959. A rapid method of total lipid extracion and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917)에 의해 기술된 방법으로 추출하였다. 유기상은 회전 증발로 건조시키고 10 ㎖의 클로로프롬에 용해시키며 하이드록실 형태로 전환된 음이온 교환기 TEAE-셀룰로오스(Serva, Heidelberg, Germany)의 20-㎖ 칼럼에 적용하였다. 지질은 Rouser et al., 1969. Diethylaminoethyl and triethylaminoethyl cellulose column chromatographic procedures for phospholipids, glycolipids, and pigments. Methods Enzymol. 14:272-317에 기술된 바와 같이 용리하였다. 상기 프로토콜에 따라, 분획물은 아래의 지질을 함유한다: 분획물 1, 콜레스테롤, 글리세리드 및 다른 중성 지질; 분획물 2, 세레브로시드, 글리세롤 디글리세리드, 포스파티딜콜린, 시핑고미엘린; 분획물 3, 세라미드폴리헥소사이드; 분획물 4, 무기 물질; 분획물 5, 포스파티딜에탄올아민과 유리 지방산; 분획물 6, 포스파티딜세린; 분획물 7, 없음(세척 단계); 분획물 8, 포스파티딘산, 카디올리핀(cardiolipin), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 다른 산성 지질. 분획물 2와 3에서 당지질의 존재는 HPTLC 플레이트에서 지질 분획물의 오르시놀(orcinol) 염색으로 확증되었다(1956. Quantitative estimation of cerebrosides in nervous tissue. J. Neurochem. 1:42-53).

C. 장내 기생충 생물체의 유지:

장내 기생충은 SPF 조건에서 성장된 중간 동물과 준비 동물을 통하여 순환시킨다. 장내 기생충 집단의 샘플은 군체 형성율(colonization rate), 생산력(fecundity), 항-장내 기생충에 감수성을 담보하기 위하여 검사한다.

용량, 투여 및 제약학적 조성물

치료를 필요로 하는 개체는 선택된 기생충의 자연 생명 주기에 따라, 기생충의 감염성 형태(알, 세르카리아 또는 유충)를 경구 또는 비경구 섭취한다. 대안으로, 가용성 기생충 또는 알 추출물은 TH2 반응을 유도하기 위하여 경구 또는 비경구 제공될 수 있다.

장과 간의 장내 기생충과 주혈흡충(schistosome)에 관하여, 이들은 접종이후 대략 30-60일 시점에, 대변에 나타나는 알을 생산하기 시작한다. 대변에서 알의 정량은 감염의 적절성과 강도를 평가하기에 적합하다. 대변의 분량은 수크로오스 부양으로 가공하여 각 시료에서 알의 총수를 결정하였다. 수크로오스 용액에서 유동은 정확한 산정을 위하여 대변으로부터 알을 분리하는데 주로 이용되는 방법이다(Koontz and Weinstock, 1996, Gastroenterology Clinics of N. America , 25:435).

본 발명의 장내 기생충 화합물은 임의의 간편한 방식으로 투여용으로 조제될 수 있고, 따라서 본 발명에는 인간에 사용되도록 적합된 본 발명에 따른 장내 기생충 화합물을 함유하는 제약학적 조성물이 포함된다. 이들 조성물은 필요한 제약학적 담체 또는 부형제의 보조로 통상적인 방식으로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 장내 기생충 화합물은 주입용, 특히 백신용으로 조제될 수 있고, 필요한 경우 보존제의 첨가와 함께 앰플에 담긴 단위 투약 형태(unit dose form) 또는 복수투약 용기로 제공될 수 있다. 또한, 이들 조성물은 현탁액, 용액 또는 유성이나 수성 운반제의 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 대안으로, 장내 기생충은 분말 형태로 존재하거나, 또는 사용에 앞서 적절한 운반제, 예를 들면, 무균의 발열원 없는 물로 재구성될 수 있다.

원하는 경우, 이들 분말 조성물은 분말이 물로 재구성되도록 하기 위하여 적절한 비-독성 염기를 함유할 수 있는데, 생성된 수성 조성물의 pH는 생리학적으로 허용되어야 한다.

장내 기생충 화합물은 예로써 전통적인 좌약 기부, 예를 들면, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는 좌약으로 조제될 수도 있다.

장내 기생충 화합물은 통상적인 충전제, 담체, 부형제로 경구 제형으로 조제될 수도 있다. 병든 개체에 투여되는 기생충의 양은 자가면역 질환을 예방하거나 치료할 만큼 충분한 양이다. 이러한 양은 기생충이 본래대로, 또는 알, 유충, 추출물 또는 세르카리아로서 투여되는 지에 상관없이, 치료되거나 예방되는 질환 및 장내 기생충에 의해 좌우된다.

전형적으로, 기생충이 본 명세서에 기술된 모든 자가면역 질환에 처방되는 경우에, 양은 대략 50 내지 50,000이다. 구체적으로, 양은 대략 500 내지 5,000이다. 알이 이용되는 경우에, 본 명세서에 기술된 자가면역 질환을 치료하는데 대략 500 내지 5000이 사용된다. 추출물이 투여되는 경우에, 자가면역 질환을 치료하는데 대략 100 ㎍ 내지 10,000 ㎍이 사용된다. 유충과 세르카리아가 투여되는 경우에, 용량은 각 경우에 대략 500 내지 5,000이다.

예방 또는 백신 용도에서, 기생충의 양은 500-5,000이다.

기생충 제제의 용량은 Th1, Th2 또는 조절 세포 반응을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 대안으로, 용량은 당분야에 공지되거나 본 명세서에 기술된 특정 질병의 병리 또는 증상을 평가함으로써 모니터할 수 있다.

A. Th1과 Th2 반응의 결정

본 발명의 효능을 입증하기 위하여, Th1과 Th2 반응을 구별할 수 있다. Metawali et al., 1996, J. of Immunol. 157:4546에서는 생쥐에서, 조직학적 분석 및 사이토킨과 면역글로불린 프로필의 분석으로 Th1 반응과 Th2 반응을 구별할 수 있음을 입증하였다. 더 나아가, Sandor et al., 1990, J. of Exp. Med.171:2171에서는 Fcg3과 MHC 클래스 II 분자의 세포 표면 발현이 이런 구별을 가능하게 함을 입증하였다. 이런 절차에서, 점막 염증, 호산구증가증(eosinophilia), 비만세포증(mastocytosis)의 정도를 결정하기 위하여 소장과 대장을 조직학적으로 검사한다. 후자 세포형은 Th2 반응을 지시한다. 중간막 림프절(Mesenteric lymph node, MLN)과 비장은 마이크로웰 평판에서 시험관내 배양을 위한 단일 세포 현탁액으로 분리될 수 있다. 완전 RPMI 배지에서 세포(1-2 x 10⁶/웰)는 기생충 항원 또는 항-CD3의 존부하에 최대 72시간동안 배양하고, 이후 상층액에서 사이토킨과 면역글로불린을 검사한다. IFN-γ, TNFα, IgG2a는 Th1 반응을 특성화하는 반면, IL-4, IL-5, IgE, IgG1은 Th2 반응을 대표한다. 혈청 역시 사이토킨과 면역글로불린 농도를 검사할 수 있다. 더 나아가, 분산된 염증 백혈구는 대식세포에서 Fcγ3 발현(Th1) 및 B 세포에서 MHC 클래스 II 발현(Th2)에 대한 유세포 분석법으로 검사한다. 대조는 기생충이 존재하지 않는 적절한 연령-정합된 한배 생쥐로부터 얻은 혈청, MLN, 비장이다.

유사한 분석으로 인간 Th1 반응과 Th2 반응을 구별할 수 있다. 염증 조직, 염증 부위로부터 분리된 백혈구, 말초 혈액 세포를 검사한다. 백혈구는 단독으로 또는 기생충 항원이나 유사분열물질의 존재하에 시험관내에서 배양하여 사이토킨 방출을 자극한다. IgG2가 IgG2a를 대체한다.

B. 조절 T 세포 활성의 결정

시험관내 배양액 또는 동물로부터 조절 T 세포를 분리하는 방법은 당분야에 공지되어 있다(참조: McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases.Trends Immunol 2002;23(9):450-5; Field, A. C., L. Caccavelli, M. F. Bloch, and B. Bellon. 2003. Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity. Journal of Immunology. 170:2508-2515; von Herrath MG, Harrison LC. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):223-32; Francois Bach J. Regulatory T cells under scrutiny. Nat Rev Immunol. 2003 Mar;3(3):189-98; Curotto de Lafaille MA, Lafaille JJ. CD4(+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy. Curr Opin Immunol. 2002 Dec;14(6):771-8; McGuirk P, Mills KH. Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases. Trends Immunol. 2002 Sep;23(9):450-5; Tung KS, Agersborg SS, Alard P, Garza KM, Lou YH. Regulatory T cell, endogenous antigen and neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease. Immunol Rev. 2001 Aug;182:135-48; Read S, Powrie F. CD4(+) regulatory T cells. Curr Opin Immunol. 2001 Dec;13(6):644-9; Yssel H, Lecart S, Pene J. Regulatory T cells and allergic asthma. Microbes Infect. 2001 Sep;3(11):899-904; Shevach, E. M. 2002. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nature Reviews.Immunology. 2:389-400; Annacker, O. and F. Powrie. 2002. Homeostasis of intestinal immune regulation. Microbes & Infection. 4:567-574; Read, S., V. Malmstrom, and F. Powrie. 2000. Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. J.Exp.Med. 192:295-302.

조절 T 세포 반응 또는 활성은 본 명세서에 기술된 바와 같이 내부 마커, 세포 표면 마커, 또는 분비된 마커에 의해 측정될 수 있다.

조절 T 세포에 유용한 내부 마커에는 Scurfin, Smad7, Gata3, Tbet(Tbx21)과 같은 전사 인자가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

조절 T 세포에 유용한 표면 마커에는 CD4, CD45RB^lo, CD45Rc, 세포융해 T 림프구 연관된 항원 4(CTLA-4), CD25, CD103, Ox40, 4-1BB, CD62L, a_Eβ 인테그린, 잠복-연관된 펩티드(LAP) 또는 글루코코르티코이드 유도된 TNF 수용체 집단 관련된 단백질(GITR), 케모킨 수용체 CCR5, TI-ST2가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

조절 T 세포에 유용한 분비된 마커에는 IL-5, IL-10, TGFβ가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

C. 마커의 양을 시험관내에서 측정하기 위한 방법의 무-제한적 실례

유세포 분석법에 의한 사이토킨 검출: RPMI 완전 배지에서 비장림프구, MLN 또는 장내 염증 세포는 2 x 10⁶세포/웰로 24-웰 조직 배양 평판에 위치시킨다. 세포는 10 ㎍/㎖ 브레펠딘(brefeldin)과 함께, 항-CD3 또는 적절한 항원의 존부하에 4-6시간동안 배양한다. 브레펠딘은 단백질의 토세포 현상(exocytosis)을 예방하고 세포 내에서 사이토킨 축적을 촉진한다. 세포질 사이토킨 검출을 위하여, 세포는 세포 아류형(subtype)을 구별하기 위하여 표면 염색이후 5분간 실온에서 2% 파라포름알데하이드에 고정시킨다. 세포는 세척하고 50 ㎕ PBS 0.2% 사포닌(Saponin)과 1 ㎍ 항-사이토킨 항체에 재-부유시키고 실온에서 20분간 배양하였다. 이후, 이들 세포는 사포닌에서 2회 세척하고 PBS/FCS에 재-부유시켰다. 사이토킨 항체 염색의 특이성은 과량의 공액되지 않은 동일한 아이소타입과 사이토킨 특이성의 항체로 세포를 미리-차단하거나, 또는 세포를 재조합 사이토킨의 존재하에 배양함으로써 확증한다. 피코에리트린(PE)-표지된 무관한 항체 대조 역시 포함시켜 배경 염색을 사정한다. 이들 세포는 유세포 분석법으로 분석한다.

ELISA: ELISA는 마이크로역가 평판에서 배양되고 전술한 바와 같이 조작된 세포로부터 얻은 세포 상층액에서 사이토킨과 항체 농도를 측정한다. 이들 검사의 대부분은 실험실에서 현용되고 있다. 사이토킨은 2-부위 샌드위치 ELISA에서 2개의 단클론 항체(mAb)를 이용하여 검사한다. 항-사이토킨 mAb는 항체 분비 하이브리도마 클론의 상층액으로부터 암모늄 침전으로 정제한다. 마이크로역가 평판은 Tween 20을 함유하는 PBS(PBS-T)에 담긴 50 ㎕의 1 ㎍/㎖ 코팅 항체로 코팅하고 4℃에서 하룻밤동안 배양한다. 이후, 웰은 PBS에 담긴 150 ㎕의 10% FCS를 첨가하여 차단하고 37℃에서 30분간 배양한다. 기준은 유사분열물질로부터 재조합 사이토킨 또는 사이토킨-함유 상층액, 또는 주혈흡충증(schistosomiasis)-감염된 생쥐로부터 항원-활성화된 비장 세포로 구성된다. 샘플과 기준 희석액은 별도의 96-웰 평편 바닥 마이크로역가 평판에서 10% FCS를 포함하는 RPMI(완전 RPMI)에서 만들고, 50 ㎕를 PBS-T에서 3회 세척된 ELISA 평판으로 이전한다. 샘플은 37℃에서 1시간동안 검사 평판에서 배양한다. 적절한 mAb는 비오틴에 공액된다. PBS-T에서 3회 세척이후, 각 웰은 1% BSA/PBS-T에서 0.5 ㎍/㎖로 50 ㎕의 항체-비오틴 공액체를 수용한다. 평판은 실온에서 1식간동안 배양하고, 이후 PBS-T에서 3회 세척한다. 스트렙타비딘-양고추냉이 과산화효소 공액체(75 ㎕)를 1% BSA/PBS-T에 1 ㎍/㎖로 첨가하고 실온에서 1시간동안 배양한다. 평판은 새로운 PBS-T에서 10회 세척하고, 44 mM Na₂HPO₄, 28 mM 구연산, 0.003% H₂O₂에 녹인 100 ㎕ 기질(2.2'-아지노(3-에틸벤즈티아졸린 술폰산))을 1 ㎎/㎖로 첨가한다. 유색 산물은 490 nm을 참고 파장(reference wavelength)으로 하여 405 nm 파장에서, 멀티스캔 다중평판 판독기(multiscan microplate reader)를 이용하여 측정한다.

면역글로불린은 항-아이소타입 특이적 ELISA를 이용하여 정량한다. 친화성-정제된 염소 항-IgM, -IgG1, -IgG2a, -IgG2b, -IgG3, -IgA, -IgE를 포획 항체(capture antibody)로 이용하고 유연성 폴리비닐 마이크로역가 접시에 10 ㎍/㎖로 흡수시킨다. 배양 상층액의 첨가, 배양, 세척이후, 적절한 아이소타입 알칼린-포스파타아제-공액된 염소 항-면역글로불린을 이용하여 평판에 결합된 전체 생쥐 면역글로불린을 검출한다. 정제된 면역글로불린을 이용하여 기준 곡선을 산출한다. 기생충 항원-특이적 항체를 측정하기 위하여, 비오틴화된 가용성 항원을 이용하여 결합된 생쥐 면역글로불린을 검출한다. 평판은 410 nm에서 ELISA 판독기에서 분석하고, 기준 곡선과 최적합 분석 소프트웨어를 이용하여 전체 면역글로불린의 농도를 결정한다. 항원-특이적 항체 농도는 O.D. 판독 결과에 상관하여 비교하는데, 그 이유는 가용성 기생충 항원이 정확한 정량이 가능한 정의된 항원이 아니기 때문이다.

ELISPOT 검사: ELISPOT 검사는 다클론 항체 또는 사이토킨을 분비하는 림프구를 계수하기 위하여 확립된다. 96-웰 니트로셀룰로오스-배경된 마이크로역가 평판은 4℃에서 하룻밤동안, PBS-T에 담긴 1㎍/㎖의 항-면역글로불린 또는 항-사이토킨 항체로 코팅한다. 이후, 이들 평판은 10% FCS를 포함하는 PBS로 차단하고 PBS-T로 충분히 세척한다.

5 x 10⁴ 세포/웰로 시작되는 단일 세포 현탁액의 연속 희석액은 가습된 5% CO₂대기하에 37℃에서 5시간동안 평판에서 배양한다. 이들 평판은 PBS-T로 세척하고 4℃에서 하룻밤동안, 비오틴화된 항-면역글로불린 또는 항-사이토킨 항체를 위에 덮는다. 이후, 평판은 세척하고 스트렙타비딘-글루코오스 옥시다아제-공액체로 2시간동안 처리하고 다시 세척한다.

단일 세포에 의해 분비되는 항체 또는 사이토킨은 기질로 가시화시킨다. 30분후 세척으로 비색 반응(colorimetric reaction)을 중단시키고, 30X 배율하에 반점을 계수한다. 10-50개 반점/웰을 산출하는 세포의 희석도를 이용하여 샘플당 분비 세포의 총수를 산정한다. 대조는 부적절한 염소 항체 또는 부적절한 항원으로 코팅되거나, 또는 코팅되지 않은 웰이다.

가용성 항원을 이용하여 웰을 코팅하는 검사를 수정하여, 기생충 항원-특이적인 면역글로불린 분비 B 세포 역시 정량할 수 있다. 간략하게 말하면, 평판은 성체 0.25 ㎍/웰로 생쥐편충(T. muris) 항원, 또는 적절한 무관한 대조 항원으로 코팅한다. 세척이후 세포를 웰에 첨가한다. 적절한 배양이후, 평판을 다시 세척하고 전술한 바와 같이 처리한다.

D. 질병 병리의 평가

치료 필요성을 결정하고 치료 과정을 모니터하기 위하여 자가면역 질환의 존재 및 이의 치료 또는 완화의 증거가 필요하다. 아래의 절차를 이용하여 이들 질환의 임상적 파라미터를 측정한다.

1. 염증성 장 질환

염증의 평가: 생쥐에서, 질병의 임상적 증거는 체중 감소, 설사, 직장탈(rectal prolapse), 장내 염증의 조직학적 증거이다. 따라서, 이들 파라미터에서 개선은 질병 완화를 의미한다.

동물 모델에서 장내 염증의 등급을 결정하기 위하여, 표준 방법에 따라 조직을 떼어내고 스위스-롤(Swiss-roll)하며 파라핀에 포매한다. 절편은 헤마톡실린과 에오신으로 염색한다. 대장 염증의 정도는 통상적인 표준화 기술을 이용하여 1명의 병리학자가 맹검 방식으로 0 내지 4의 등급에서 반정량적으로 결정한다: 0 = 염증 없음; 1 = 낮은 수준 염증; 2 = 중간 수준 염증; 3 = 높은 수준 염증과 벽 비후(wall thickening); 4 = 경벽 침윤(transmural infiltration), 술잔 세포(goblet cell)의 상실, 벽 비후.

비만 세포(mast cell)를 계수하기 위하여, 스위스-롤 기술로 개별 생쥐로부터 장내 조직 샘플을 준비하고 Carnoy 고정액에 고정시키며 파라핀 포매하고 Alcian Blue와 사프라닌(safranin)으로 염색을 위하여 가공한다. 일정한 절편의 50개 인접한 필드는 점막고유판과 근육 층에서 점막 비만 세포를 조사한다. 비만 세포는 Alcian Blue로 개별적인 세포내 과립 염색으로 확인한다. 모든 샘플은 맹검으로 평가한다.

인간에서 질병 활성은 다양한 임상적, 실험적, 조직학적 척도를 이용하여 모니터한다. 설사 빈도와 복통과 같은 임상적 파라미터를 모니터하는 널리 확립된 IBD 질병 활성 지수가 다수 존재한다. 크론병의 사정을 위한 특히 유용한 지수는 크론병 활성 지수, 또는 CDAI이다(Best et al., 1976, Gastroenterology 70: 439). CDAI는 질병 활성과 관련된 8가지 변수를 통합하고, 크론병에서 치료약물의 최근 연구에 이용되고 있다. 여기에는 액체 또는 매우 부드러운 대변의 횟수, 복통이나 경련의 심각도, 전반적인 상태, 상기 질병의 장관외 증상(extraintestinal manifestation)의 존재, 적취(abdominal mass)의 존부, 항-설사제의 복용, 헤마토크릿(hematocrit), 체중이 포함된다. 복합 스코어는 0 내지 대략 600이다. 150 미만의 스코어는 질병의 경감을 지시하고, 450 초과의 스코어는 심각한 병적 상태를 지시한다.

치료 과정을 사정하기 위하여 검증되고 인증된 질병 특이적 삶의 질 질문서 역시 치료 전후에 작성될 수 있다. Irvine 염증성 장 질환 질문서는 32개-항목 질문서이다(Irvine et al., 1996, The Short Inflammatory Bowel Disease Questionnaire: a quality of life instrument for community physicians managing inflammatory bowel disease. CCRPT Investigators. Canadian Crohn's Relapse Prevention Trial.Am J Gastroenterol. 1996 91(8):1571-8). 이는 장 기능(가령, 흐트러진 대변과 복통), 전신 증상(피로와 변화된 수면 패턴), 사회적 기능(작업 참가(work attendance)와 사교 행사의 치료 필요성), 감정적 상태(분노, 우울증, 또는 짜증)의 측면에서 삶의 질을 평가한다. 스코어는 32 내지 224이고, 스코어가 높을수록 삶의 질이 높다. 질병이 경감된 환자는 일반적으로, 170 초과의 스코어를 보유한다.

장내 질병 활성의 내시경, x-레이, 조직학적 사정 역시 평가에 도움이 된다. C-반응성 단백질 수준과 혈액 세포 침강 속도(sedimentation rate) 역시 염증의 전신 지표로서 모니터될 수 있다.

2. 류머티스 관절염

염증의 평가:

콜라겐-유도된 관절염을 앓는 생쥐의 경우에, 이들 생쥐는 격일로 검사하고 이들의 발을 아래와 같이 스코어를 계산한다: 0, 정상; 1, 홍반 및 발목 관절이나 발가락에 한정된 경미한 부종; 2. 홍반 및 발목으로부터 발의 중간부위(midfoot)까지 연장된 경미한 부종; 3, 홍반 및 발목으로부터 중족관절(metatarsal joint)까지 연장된 심각한 부종; 4, 관절 부종으로 강직성 기형(ankylosing deformation). 이들 4가지 파라미터는 관절염 관절에서 조직학적 변화와 상관될 수 있다. 성공적인 치료는 조직학적 개선으로 관절염 스코어에서 감소를 유도한다(Anthony DD. Haqqi TM., Collagen-induced arthritis in mice: an animal model to study the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Clinical & Experimental Rheumatology. 17(2):240-4, 1999).

프리스탄-유도된 관절염의 경우에, 관절을 측미계(micrometer)로 측정하여 부종을 검출할 수 있다. 인간에서, RA는 관절 부종, 홍반, 운동의 제한, 통증을 측정함으로써 스코어를 계산한다. 부가적으로, 당분야에 공지된 방법에 따라, 활막액(synovial fluid)에서 사이토킨과 염증성 단백질 농도 및 백혈구 조성과 기능을 분석할 수 있다(Felson DT. Anderson JJ. Boers M. Bombardier C. Furst D. Goldsmith C. Katz LM. Lightfoot R Jr. Paulus H. Strand V. et al. American College of Rheumatology. Preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatism. 38(6):727-35, 1995 Schiff M. A rationale for the use of summary measurements for the assessment of the effects of rheumatoid arthritis therapies. Clinical Therapeutics. 25(3):993-1001, 2003)

3. 낭창

염증 평가:

면역계의 정상적인 발달과 기능은 아폽토시스(apoptosis)라고 하는 과정에 의한 원치않는 세포의 제거에 결정적으로 의존한다. 특정 세포 표면 분자와 이들의 수용체를 통한 세포-세포 상호작용이 이런 과정을 주로 유인한다. 이런 시스템중 하나는 FAS와 FAS 리간드이다. FAS(LPR-/-) 또는 FAS 리간드(GLD-/-)에서 결손된 생쥐는 낭창과 같은 자가면역 질환이 발병한다(Reilly CM. Gilkeson GS. Use of genetic knockouts to modulate disease expression in a murine model of lupus, MRL/lpr mice.Immunologic Research. 25(2):143-53, 2002)

LPR 또는 GLD 생쥐의 콜로니는 특정 병원균-없는 조건하에 마이크로-분리기 수용 단위(micro-isolator housing unit)에 유지시킨다. 이들 생쥐는 자발적으로 자가면역이 발생하지만, 인공 유도이후에 더욱 예측가능하다. 질병을 유도하기 위하여, 8주령 생쥐에 프리스탄과 같은 약물을 주입한다. 2개월 이내에, 생쥐는 자가면역 질환이 발병한다. 양 생쥐와 인간에서 질병 유도와 완화를 평가하는데 유용한 다수의 임상적, 조직학적, 면역학적 척도가 당분야에 널리 공지되어 있다(Satoh M. Richards HB. Shaheen VM. Yoshida H. Shaw M. Naim JO. Wooley PH. Reeves WH. Widespread susceptibility among inbred mouse strains to the induction of lupus autoantibodies by pristane.Clinical & Experimental Immunology. 121(2):399-405, 2000)

4. 연소성 인슐린-의존성 당뇨병(Type 1)

염증의 평가:

NOD 생쥐는 췌장 β 세포의 자가면역 파괴로 인하여 인간에서와 유사한 I형 당뇨병이 발병한다. 생쥐에서 질병 유도와 완화를 평가하는데 유용한 임상적, 생화학적, 면역학적, 조직학적 검사 방법이 당분야에 널리 공지되어 있다(참조: Adorini L. Gregori S. Harrison LC. Understanding autoimmune diabetes: insights from mouse models. Trends in Molecular Medicine. 8(1):31-8, 2002

5. 유사 육종증

염증의 평가:

폐 염증의 비드 색전 폐색(bead embolization) 모델에서, 항원(즉, Th1 또는 Th2)은 고리 정맥으로의 주입을 통하여 생쥐의 폐를 폐색시키는 세파로즈 비드에 결합시킨다. 이들 동물은 일반적으로, 결합된 항원에 미리-감작화된다. 숙주의 면역계는 침입 비드에 활발한 면역 반응을 유도한다. 수주간 지속될 수 있는 이들 병소성 염증 반응은 조직학적으로 크기를 검사할 수 있다. 또한, 이들은 조직으로부터 분리하고 세포 조성과 사이토킨 생산을 조사할 수 있다. 게다가, 반대편 폐문 림프절(hilar lymph node)과 비장이 실험에 용이하게 이용될 수 있다(참조: Kunkel SL. Lukacs NW. Strieter RM. Chensue SW. Animal models of granulomatous inflammation. Seminars in Respiratory Infections. 13(3):221-8, 1998).

인간 질환인 유사 육종증은 일반적으로 폐에 관련한다. 유사 육종증과 이의 정도의 결정은 당분야에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 폐 기능 검사는 폐 유순도(lung compliance)와 기능을 사정할 수 있다. 또한, 기관지세척술(bronchiolar lavage)로 염증 과정동안 기관세지(bronchiolar tree)에 침윤된 염증 세포를 획득한다. 이들 세포는 조성과 기능을 조사할 수 있다. 폐 침윤물과 문림프절증(hilar lymphadenopathy)은 유사 육종증의 특징이다. 따라서, 주기적 흉부 x-레이 또는 CT 촬영은 질병 활성을 사정하는데 도움이 된다. 당분야에 공지된 방법에 따른 안지오텐신 전환 효소의 측정과 같은 혈청학적 검사를 이용하여 질병 정도와 활성을 판단할 수 있다(참조: Hunninghake GW. Costabel U. Ando M. Baughman R. Cordier JF. du Bois R. Eklund A. Kitaichi M. Lynch J. Rizzato G. Rose C. Selroos O. Semenzato G. Sharma OP. ATS/ERS/WASOG statement on sarcoidosis. American Thoracic Society/European Respiratory Society/World Association of Sarcoidosis and other Granulomatous Disorders. Sarcoidosis Vasculitis & Diffuse Lung Diseases. 16(2):149-73, 1999)

6. 다발성 경화증

염증의 평가:

실험적 자가면역 뇌척수염은 적절한 감작화 미엘린 항원의 반복된 주입에 의해 민감성 생쥐에서 유도된다. 생쥐는 아래의 척도에 따라 임상적으로 사정한다: 0, 질병 없음; 1, 꼬리 이완(atony); 2, 뒷다리 약화; 3, 뒷다리 마비; 4, 뒷다리 마비와 앞다리 마비 또는 약화; 5, 활동 중지. 조직학적 분석을 위하여, 척수와 뇌를 떼어내고 포르말린에 고정시킨다. 파라핀-포매된 절편은 염색하고 광 현미경하에 관찰한다. 분산된 비장림프구 및 다른 부위로부터 세포는 상기한 바와 같이, 시험관내에서 조사할 수 있다. 이들 파라미터는 질병 완화 또는 개선을 측정하는데 도움이 될 수 있다(참조: Sewell, Diane, Zing Qing, Emily Reinke, David Elliott, Joel Weinstock, Matyas Sandor, and Zsuzsa Fabry. Immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis by helminth ova immunization. International Immunol. 15:59-69, 2003).

인간에서, MS 질병 활성은 신경학적 징후와 증상의 진행과 이장성(remittence)을 모니터함으로써 판단한다. 가장 널리 이용되는 결과 척도는 확장 장애 상태 척도(expanded disability status scale)이다. 당분야에 공지된 방법에 따라 분석된 뇌척수액 단백질 조성과 세포 함량을 이용하여 질병 활성을 모니터할 수 있다. 게다가, 일련의 MRI 연구에서 새로운 가돌리늄-강화된 뇌 병소가 밝혀졌다(McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD, McFarlandHF, Paty DW, Polman CH, Reingold SC, Sandberg-Wollheim M, Sibley W, Thompson A, van den Noort S, Weinshenker BY, Wolinsky JS. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: Guidelines from the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis Ann Neurol 50(1):121-7. 2001. Poser CM, Paty DW, Scheinberg L, et al."New Diagnostic Criteria For Multiple Sclerosis: Guidelines For Research Protocols" Ann Neurol 1983;13:227-231 Statistical Methods). 일부 데이터는 일표본 t-검정(one sample t-test)으로 분석하여 평균 수치가 0으로부터 유의하게 달라지는 지를 결정한다. 쌍체 비교(Paired t-test)를 이용하여 군 평균간 차이를 분석한다. 분산분석(analysis of variance)과 Dunnett t-검증(Dunnett's t-test)을 이용하여 복수 비교 데이터를 분석한다.

본 발명에 유용한 동물 모델

아래의 표 1에서는 본 발명에 유용한 동물 모델의 무-제한적 실례를 예시한다. 추가의 무-제한적 실례는 예로써 Current Protocols in Immunology(2001, Eds. John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, published by John Wiley & Sons)에서 확인할 수 있다.

치료가능 질환	일부 동물 모델
1. 염증성 장 질환	TNBS 대장염(Neurath et al., 1995, J. of Exp. Med. 182:1281)
	IL-2 돌연변이 생쥐(Ludviksson et al., 1997, J. of Immunol. 158:104)
	IL-10 돌연변이 생쥐(Berg et al., 1996, J. of Clin. Investigation 98:1010)
	TCR 유전자도입 생쥐(Mombaerts et al., 1993, Cell 75:274)
	SCID 생쥐에 이전된 CD45+ T 세포(Powrie et al., 1994, Immunity 1:553)
2. 류머티스 관절염	뮤린 프리스탄-유도된 관절염(Stasluk et al., 1997, Immunol. 90:81)
	뮤린 콜라겐-유도된 관절염(Horsfall et al., 1997, J. of Immunol. 159:5687)
3. 인슐린-의존성 당뇨병(1형)	NOD 생쥐(Cameron et al., 1997, J. of Immunol . 159:4686)
4. 낭창	(NZWX NZB) F ₁ 모델(Santiago et al., 1997, J. of Exp. Med . 185:65)
	GRD, LPR 생쥐(FAS 돌연변이)(Bhandoola et al., 1994, Int. Rev. of Immunol . 11:231)
5. 유사 육종증	Murine Berylliosis(Pfeifer et al., 1994, Int. Archives of Allergy & Immunol . 104:332) 조류결핵(M. avium) 생쥐(Chen et al., 1994, Science 265:1237)
6. 다발성 경화증	생쥐에서 실험적 알레르기 뇌척수염 Owens T, Sriram S. 1995, Neurol Clin. 13(1):51-73. Review. Degaonkar et al., 2002, J Magn Reson Imaging. 16(2):153-9. Duckers et al., 1996, Neuroscience 1(2):507-21.

본 발명은 아래의 재료와 방법이 이용되는 무-제한적 실시예에 의해 예시된다. 각 참고문헌은 본 명세서에서 순전히 참조로 한다.

실시예 1. 일반적인 방법:

동물: 129/SV IL-10-/- 돌연변이 생쥐의 콜로니 및 적절한 대조 동물은 표준 방법에 따라 특정 병원균-없는 환경으로 유지된 시설에서 수용한다.

기생충 유지, 동물 감염, 주혈흡충(schistosome) 알의 생산: 생쥐편충(T. muris)의 유지 및 감염 방법은 Else and Wakelin, 1990, Parasitology, vol. 100, part 3: 479에서 기술한다.

주혈흡충(schistosome) 알은 Elliott, 1996, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 9:255에 기술된 바와 같이 주혈흡충(schistosome)-감염된 햄스터의 간으로부터 수거하고 저장하였다. 5마리의 감염된 햄스터는 대략 2 x 10⁶개의 알을 산출한다.

돼지편충( T. suis ) 알의 준비: 돼지편충(T. suis) 알의 준비와 수거에 아래의 과정을 이용하였다. 성체 돼지편충(T. suis) 기생충은 돼지편충(T. suis) 알의 실험적 접종물에 노출이후 7-8주 시점에 돼지의 대장으로부터 분리하였다. 미발달된 알은 성체 기생충을 시험관내에서 배양하고, 이후 원심분리로 배양 배지로부터 분리되는 배출된 알을 포기(bubbling)하면서 22℃에서 5-6주간 0.2% 중크롬산칼륨(potassium dichromate) 용액에 위치시켜 감염성 1-단계 유충을 얻었다. 알은 10분간 1200 x g에서 원심분리로 무균수에서 2회 세척하고 계수하며 2,500의 산정된 양에 기초하여 원하는 양의 염수에 재-부유시켰다. 이들 알은 개체에 사용을 위하여 저장하였다. 이들 알은 냉장고에서 적어도 1년간 안정하다. 감염도(infectivity)를 확인하기 위하여, 군체 형성이후 대변에서 알의 출현을 환자에서 모니터하였다. 대변에서 알의 개수는 침입(infestation)의 강도에 비례한다. 또 한, 저장된 알로 돼지를 감염시켜 감염도의 지속을 확인한다.

조류결핵( M. avium )으로 감염: 생쥐는 10⁶개의 콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)의 조류결핵(Mycobacterium avium)(ATCC 25291)을 복강내 주입하여 감염시켰다. 감염 60일 시점에, 일부 생쥐는 35개의 만소니주혈흡충(S. mansoni) 세르카리아를 주입하여 이중 감염을 유도하였다.

주혈흡충(schistosome) 감염과 알의 분리: 일부 실험에서 만소니주혈흡충(S. mansoni)으로 8-9주간 감염된 생쥐(18-20g)을 이용하였다. 생쥐는 Puerto Rican 균주로부터 40개의 세르카리아로 피하 감염시켰다.

육아종 분리와 분산: 육아종은 감염 6주 시점에 시작되는 자연 탁란(natural deposition)으로 인하여, 주혈흡충(schistosome)-감염된 생쥐에서 형성된다. 조류결핵(M. avium) 역시 육아종을 유발한다. 기존 문헌(Elliott, 1996, supra)에 기술된 바와 같이, 감염된 생쥐로부터 분리된 간 육아종을 조사한다. 육아종을 분산시켜 단일-세포 현탁액을 만들었다. 분리된 육아종은 교반기 수조에 담긴 5 ㎎/㎖ 콜라게나제를 함유하는 RPMI 배지에서 37℃에서 35분간 교반하였다. 남아있는 육아종은 흡수하고 1 ㎖ 주사기를 통하여 방출하여 추가적인 분리를 유도하였다. 생성된 세포 현탁액은 거즈를 통하여 여과하고 3회 세척하였다. Eosin-Y 배제로 세포 생존능을 측정하였다. 상기 프로토콜은 보존된 표면 분자 발현을 보이는 고수율의 생존가능 염증 세포를 산출하였다.

비장과 MLN 분산: 비장림프구와 MLN은 스테인리스 스틸 메시를 통하여 조직 을 얇게 뜨고 세척하여 분산시켰다. 오염 RBC는 H20로 용해시키고, 세포는 사용에 앞서 RPMI에서 x3 세척하였다.

TNBS 대장염의 유도: 대장염은 Neurath et al., 1995, J. Exp. Med., 182: 1281에 기술된 바와 같이, 트리니트로벤젠술폰산(TNBS)의 직장 점적주입(instillation)으로 유도하였다. 간략하게 말하면, 대조 또는 기생충-노출된 BALB/c 생쥐는 30시간동안 굶기고, 이후 메톡시플루란(methoxyflurane)으로 마취하였다. 1.2mm 카테터를 대장으로 4cm 전진시키고 0.l ㎖의 TNBS 용액(50% 에탄올에서 5 ㎎/㎖ TNBS(Sigma))을 점적주입하였다. 이들 동물은 대장 점막과의 균일한 접촉을 담보하기 위하여 3분간 꼬리를 잡고 유지시켰다.

점막 염증의 평가: 장내 염증의 등급을 결정하기 위하여, 표준 방법에 따라 지정된 시점에서 조직을 떼어내고 스위스-롤하며 파라핀에 포매시켰다. 절편은 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다. 대장 염증의 정도는 통상적인 표준화 기술(19)을 이용하여 1명의 병리학자가 맹검 방식으로 0 내지 4의 등급에서 반정량적으로 결정한다: 0 = 염증 없음; 1 = 낮은 수준 염증; 2 = 중간 수준 염증; 3 = 높은 수준 염증과 벽 비후(wall thickening); 4 = 경벽 침윤(transmural infiltration), 술잔 세포(goblet cell)의 상실, 벽 비후.

세포 분리와 T 세포 농축:

Th1, Th2, 조절 T 세포는 당분야에 공지된 방법에 따라 분리할 수 있다(참조: Current Protocols in Immunology(2001, Eds. John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, published by John Wiley & Sons).

한 구체예에서, MLN의 단일 세포 현탁액은 RPMI 1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)에서 얇게 뜸(teasing)으로써 준비하였다. 이들 세포는 증류수에 짧게 재-부유시켜 RBC를 용해시켰다. 이후, MLN을 다량의 RPMI에서 3회 세척하였다.

장 LPMC를 후술한 바와 같이 분리하였다. 장내 조직은 RPMI로 충분히 세척하고, 모든 가시화된 파이어 소절(Peyer's patch)은 가위로 제거했다. 장을 세로로 개봉하고 5 mm 조각으로 절단하며, 이후 교반하면서 칼슘과 마그네슘-없는 Hanks 용액에 녹인 0.5 mM EDTA에서 37℃에서 20분간 배양하여 상피내 림프구와 상피 세포를 방출하였다. 이는 완전한 세척이후 반복하였다. 그 다음, 10% FCS, 25 mM HEPES 완충액, 2 mM L-글루타민, 5x10⁵M-멀캡토에탄올, 1 mM 나트륨 피루베이트, 100 U/㎖ 페니실린, 5 ㎎/㎖ 젠타마이신, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신(모두 GIBCO), 1 ㎎/㎖ 콜라게나제(Sigma #CO130)를 함유하는 20 ㎖ RPMI에서 37℃에서 20분간 조직을 배양하였다. 배양의 종결 시점에서, 조직은 1 ㎖ 주사기를 이용하여 물리적으로 더욱 파괴하였다. 잔해를 제거하기 위하여, LPMC 제조물은 깔때기에 층상으로 쌓여있는 미리-적셔진 거즈를 통하여 RPMI로 세척하였다. 이후, LPMC는 다시 세척하고 10 ㎖ 주사기로 부드럽게 포장된 미리-적셔진 2 cm 나일론 울(nylon wool) 칼럼을 통하여 걸러냈다. 세척이후, 세포(최대 2 x10⁷)는 30:70% 구배의 Percoll 칼럼에 층을 만들었다. 세포는 실온에서 20분간 2200xG로 회전시켰다. 30:70 인터페이스로부터 수거된 LPMC는 세척하고 사용 때까지 얼음 위에 유지시켰다. 세포 생존 능은 에오신 Y 배제에 의한 측정에서 90%이었다.

세포 이전 실험을 위하여, 제조업자(#17031, #17032, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)에 의해 기술된 바와 같이, 항체-코팅되고 밀집된 입자를 이용한 SpinSep 농축 절차를 활용한 음성 선별(negative selection)로 MLN T 세포를 분리하였다. Thy+ T 세포의 적절한 회수와 순도(>98%)를 담보하기 위하여 각 분리이후 유세포 분석법을 이용하였다.

세포 이전:

MLN 세포는 선충(H. polygyrus)으로 2주간 군체 형성된 IL10-/- 생쥐, 또는 이런 군체 형성이 없는 연령-정합된 건강한 IL10-/- 생쥐로부터 분리하였다. 이들 분획되지 않고 분산된 MLN 세포(2x10⁷세포/생쥐) 또는 MLN T 세포(5x10⁶ 세포/생쥐)는 ip 주입으로, 피록시캄 처리이후 2일 시점에 대장염 IL10-/- 생쥐에 이전하였다. 14일후, 대장염을 평가하였다.

조절 T 세포 준비를 위한 다른 방법

본 발명의 일부 구체예에서, 조절 T 세포는 당분야에 공지된 방법에 따른 추가적인 분석을 위하여 배양된 세포 또는 동물로부터 준비할 수 있다(참조: US 특허 출원 2003/0170648, 2003/0157057, 2003/0133936, 2003/0064067, 2003/0049696, 2002/0182730, 2002/0090724, 2002/0090357)

세포의 공급원으로서 유용한 세포 개체군의 생체내 공급원에는 말초혈, 백혈구성분채집(leukopheresis) 혈액 산물, 성분채집(apheresis) 혈액 산물, 말초 림프 절, 장 연관된 림프구 조직, 비장, 흉선, 제대혈(cord blood), 중간막 림프절, 간, 면역학적 병소 부위, 예를 들면, 활막액, 췌장, 뇌척수액, 종양 샘플 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 공여자는 가급적 인간이고 태아, 신생아, 아동, 성인일 수 있으며 정상적이거나, 병들었거나, 또는 목적 질환에 민감하다.

가령, 본 발명의 조절 T 세포는 세포 표면 마커의 발현에 기초하여 농축될 수 있다. 한 구체예에서, 이들 세포는 CD4와 CD25의 발현에 대하여 양으로 선별되고, CD45RA의 부재에 대하여 음으로 선별될 수 있다. 선택적으로, 다른 마커를 이용하여 CD69, CCR6, CD30, CTLA-4, CD62L, CD45RB, CD45RO를 비롯한 Treg 세포의 개별 하위군을 더욱 분리할 수 있다. 이들 방법은 농축이나 정제 절차, 또는 다른 세포 특이적 마커에 대한 양의 선별에 의한 세포 분리 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 구체예에서, 조절 T 세포는 CD4⁺CD25⁺및 선택적으로 CD45RA^-인 특성을 보유하는 세포를 농축하는 기술에 의해 복합적 세포 혼합물로부터 분리된다. 조직으로부터 세포의 분리를 위하여, 분산 또는 현탁을 위한 적절한 용액을 이용할 수 있다. 일반적으로, 이런 용액은 5-25 mM의 낮은 농도의 허용가능 완충액과 공동으로, 소 태아 혈청, BSA, 통상적인 염소 혈청, 또는 다른 자연 발생 인자로 보충된 균형 염 용액, 예를 들면, 통상적인 염수, PBS, Hank 균형 염 용액 등이다. 통상적인 완충액에는 HEPES, 인산염 완충액, 락테이트 완충액 등이 포함된다.

다른 구체예에서, 조절 T 세포 집단의 분리는 실질적으로 순수한 집단을 제 공하는 친화성 분리를 이용한다. 친화성 분리 기술에는 항체-코팅된 자성 비드를 이용한 자성 분리(magnetic separation), 친화성 크로마토그래피, 단클론 항체에 결합되거나 단클론 항체와 공동으로 이용되는 세포독성제, 예를 들면, 보체와 세포독소(cytotoxin), 고체 매트릭스, 예를 들면, 평판에 부착된 항체로 “패닝”, 또는 다른 통상적인 기술이 포함된다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 형광 활성화된 세포 분류기인데, 이는 다양한 정교함 수준, 예를 들면, 복수 칼라 채널, 낮은 각도와 무딘 광 산란 검출 채널, 임피던스 채널(impedance channel)을 보유할 수 있다. 세포는 사멸 세포와 결합하는 염료(프로피디움 요오드, LDS)를 이용함으로써 사멸 세포로부터 선별할 수 있다. 선별되는 세포의 생존능에 과도하게 치명적이지 않은 임의의 기술을 이용할 수 있다.

친화성 반응물은 상기한 세포 표면 분자에 대한 특이적인 수용체 또는 리간드일 수 있다. 항체 반응물에 더하여, 펩티드-MHC 항원과 T 세포 수용체 쌍이 이용될 수 있다; 펩티드 리간드와 수용체; 작동제와 수용체 분자 등. 항체와 T 세포 수용체는 단클론 또는 다클론이고, 유전자도입 동물, 예방접종된 동물, 영속화된 인간이나 동물 B-세포, 항체 또는 T 세포 수용체를 인코딩하는 DNA 벡터로 형질감염된 세포 등에 의해 생산될 수 있다. 항체 제조 및 특이적인 결합 구성원으로서 이들의 적합성에 관한 상세는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

친화성 반응물로서 항체의 이용이 특히 주목을 받고 있다. 편의적으로, 이들 항체는 분리용 표지로 공액된다. 특정 세포형의 용이한 분리를 가능하게 하는 표지에는 직접적인 분리를 가능하게 하는 자성 비드, 서포트에 결합된 아비딘이나 스트 렙타비딘으로 제거될 수 있는 비오틴, 형광 활성화된 세포 분류기와 함께 이용될 수 있는 형광색소(fluorochrome) 등이 포함된다. 이용될 수 있는 형광색소는 피코빌프로테인(phycobiliprotein), 예를 들면, 피코에리트린(phycoerythrin)과 알로피코시아닌(allophycocyanin), 플루레신(fluorescein), 텍사스 레드(Texas red)이다. 빈번하게, 각 항체는 각 마커에 대한 독립적인 분류를 위하여 상이한 형광색소로 표지된다.

한 구체예에서, 이들 항체는 세포 현탁액에 첨가하고, 가용한 세포 표면 항원에 결합할 만큼 충분한 기간동안 배양한다. 일반적으로, 배양은 적어도 5분에서 대략 30분 이하로 수행된다. 분리 효율이 항체의 부족에 의해 제한되지 않도록, 다시 말하면, 포화량의 항체를 이용함으로써 반응 혼합물에 충분한 농도의 항체를 보유하는 것이 바람직하다. 적절한 농도는 적정으로 결정될 수도 있다. 세포가 분리되는 배지는 세포의 생존능을 유지하는 임의의 배지이다. 선호되는 배지는 0.1 내지 0.5% BSA를 함유하는 인산염 완충된 염수이다. 다양한 배지는 상업적으로 구입가능하고 세포의 특성에 맞게 이용될 수 있는데, 여기에는 주로 소 태아 혈청, BSA, HSA 등으로 보충되는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), HBSS(Hank's Basic Salt Solution), DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline), RPMI, 이스코브 배지(Iscove's medium), 5 mM EDTA를 포함하는 PBS 등이 포함된다.

세포의 염색 강도는 유세포 분석법으로 모니터할 수 있는데, 여기서 레이저가 형광색소의 정량적 수준(이는 항체에 의해 결합된 세포 표면 항원의 양에 비례한다)을 검출한다. 유세포 분석법, 또는 FACS는 항체 염색의 강도 및 다른 파라미 터, 예를 들면, 세포 크기와 광 산란(light scatter)에 기초하여 세포 집단을 분리하는 데에도 이용될 수 있다. 비록 염색의 절대 수준이 특정 형광색소와 항체 제조물에 따라 달라지긴 하지만, 이런 데이터는 대조에 표준화될 수 있다.

이후, 표지된 세포는 CD4와 CD25의 발현에 관해서 분리한다. 분리된 세포는 세포의 생존능을 유지시키고 수집 튜브의 바닥에 혈청 쿠션을 보유하는 임의의 적절한 배지에 집합될 수 있다. 다양한 배지가 상업적으로 구입가능하고 세포의 특성에 맞게 이용될 수 있는데, 여기에는 주로 소 태아 혈청으로 보충되는 DMEM, HBSS, DPBS, RPMI, 이스코브 배지(Iscove's medium) 등이 포함된다.

이런 방식으로, 인간 Treg 활성을 위한 고도로 농축된 조성물이 달성될 수 있다. 개체 집단은 세포 조성의 대략 70% 또는 그 이상, 바람직하게는 세포 조성의 대략 90% 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 세포 조성의 대략 95%이다. 농축된 세포 집단은 즉시 이용될 수 있다. 세포는 동결할 수도 있는데, 세포는 분리 절차에 앞서 동결시키는 것이 바람직하긴 하지만, 액체 질소 온도에서 동결하여 장기간 보관하고 해동하여 재사용할 수 있다. 일반적으로, 세포는 배지, 글루코오스 등과 공동으로 DMSO 및/또는 FCS에 저장된다. 일단 해동된 세포는 증식과 분화를 위한 성장 인자, 항원, 자극, 수상돌기 세포 등을 이용하여 증폭할 수 있다.

세포 배양:

사이토킨 분석을 위하여, 세포는 200 ㎕의 배지(5 x 10⁵세포/웰)를 포함하는 96 웰 마이크로역가 평판(Corning, Cambridge, MA)에서 37℃에서 48시간동안 배 양하였다. 배양 배지는 10% FCS, 25 mM HEPES 완충액, 2 mM L-글루타민, 5x10⁵ M -멀캡토에탄올, 1 mM 나트륨 피루베이트, 100 U/㎖ 페니실린, 5 ㎎/㎖ 젠타마이신, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신(모두 GIBCO)을 함유하는 RPMI이었다. 대부분의 실험에서, 세포는 단독으로, 또는 항-CD3(2Cl1, ATCC)과 항-CD28 mAb(Pharminogen, San Diego, CA)(각각, 1 ㎍/㎖)와 함께 배양하였다. 분리된 T 세포는 항-CD3과 항-CD28 mAb로 하룻밤동안 미리 코팅된 웰에서 배양하였다. IL12 분석을 위하여, 세포는 Coley Pharmaceutical Group(Wellesley, MA)에 의해 제공되고 0.6 ㎍/㎖로 이용되는 2개의 면역촉진 CpG 모티프(13;14)(밑줄로 표시됨)를 보유하는 합성 포스포로티오에이트 골격 올리고뉴클레오티드 ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT)(SEQ ID NO. 3)과 함께 배양하였다.

뮤린 사이토킨에 대한 ELISA: ELISA는 상기 섹션 VI에 기술된 바와 같이 수행하였다.

실시예 2. 만소니주혈흡충( S. mansoni )에 대한 Th2 반응은 무관한 박테리아 Th1-유도 항원에 대한 이후의 Th1 반응을 하향-조절한다:

Th 세포 면역 반응은 Th1 또는 Th2 패턴으로 양분될 수 있는 것으로 알려져 있다. 이런 양분화는 Th1 세포로부터 IFNγ이 Th2 세포의 증식을 저해하고, Th2 세포로부터 IL-4와 IL-10이 Th1 세포의 발달을 저해하기 때문에 발생한다. 아래의 실험에서는 주혈흡충증(schistosomiasis)이 확립된 마이코박테리아 감염에 대한 뮤린 Th1 반응을 변화시킨다는 것을 입증한다.

생쥐는 조류결핵(M. avium)과 만소니주혈흡충(S. mansoni)으로 동시-감염시켜 이와 같은 명백하게 상이한 Th1과 Th2 염증성 자극에 대한 숙주 반응을 평가하였다. BALB/cAnN 생쥐는 조류결핵(M. avium)(10⁶ CFU)으로 감염되면 만성적인 조류결핵(M. avium) 감염이 발생한다. 마이코박테리아 감염의 확립이후 60일 시점에, 생쥐는 만소니주혈흡충(S. mansoni)(40개의 세르카리아)으로 감염시켰다. 생쥐는 60일후에 사멸시켰다. 대조군은 120일동안 조류결핵(M. avium) 단독 또는 60일동안 만소니주혈흡충(S. mansoni) 단독으로 처리된 생쥐이었다. 이들 동물로부터 유래된 분산된 비장림프구 또는 분리된 육아종 세포는 최적 농도로 이용되는 주혈흡충(schistosome) 알 항원(SEA, 강한 Th2 항원) 또는 마이코박테리아 항원 정제된 단백질 유도체(PPD, 강한 Th1-유도 항원)의 존부하에 48시간동안 시험관내에서 배양하였다(4 x 10⁵ 세포/웰). 배양이후, 상층액은 ELISA를 이용하여 사이토킨 또는 면역글로불린 생산을 검사하였다. 도 1-3에서 데이터는 3회 독립된 실험의 평균 +/- SD이다.

조류결핵(M. avium) 단독으로 감염된 생쥐로부터 비장림프구는 PPD(Th1 항원)로 자극이후 다량의 IFNγ을 분비하였다. 감염되지 않은 대조 생쥐로부터 비장 세포는 이를 전혀 생산하지 않았다. 더욱 중요하게는, 동시 감염된 생쥐로부터 비장 세포 배양액에서 IFNγ가 전혀 검출되지 않았다(조류결핵(M. avium)) 단독 vs. 동시 감염, P<.001, 도 1). 가용성 주혈흡충(schistosome) 알 항원(SEA, Th2 항원)은 만소니주혈흡충(S. mansoni)-감염된 동물의 비장림프구로부터 IL-4와 IL-5 방출 만을 촉진하였다. 조류결핵(M. avium) 단독으로 감염된 생쥐는 PPD 또는 SEA에 대응하여 IL-4 또는 IL-5를 생산하지 않았다. 하지만, 동시-감염된 동물로부터 비장림프구는 PPD 자극이후 일부 IL-4를 분비하였다(도 1).

조류결핵(M. avium) 또는 만소니주혈흡충(S. mansoni)으로 감염된 생쥐의 간으로부터, 또는 동시 감염된 동물로부터 육아종을 분리하였다. 동시 감염된 동물은 조직학적 검사에서 용이하게 확인되는 주혈흡충(schistosome) 알과 마이코박테리아를 모두 보유하는 간 육아종이 발병한다. 이들 동물로부터 유래된 분산된 육아종 세포는 최적 농도로 이용되는 SEA 또는 PPD의 존부하에 48시간동안 시험관내에서 배양하였다. 조류결핵(M.avium) 단독으로 감염된 생쥐로부터 유래된 육아종 세포는 PPD로 자극이후 다량의 IFNγ를 분비하였다. 동시 감염된 생쥐로부터 육아종 세포 배양액에서 IFNγ는 전혀 검출되지 않았다(조류결핵(M. avium) 단독 vs 기타, P<.001)(도 2). SEA는 만소니주혈흡충(S. mansoni)-감염된 동물의 육아종 세포로부터 IL-4 방출을 촉진하였다. SEA는 어떤 조건하에서도 IFNγ 분비를 촉진하지 않았다. 조류결핵(M.avium) 단독으로 감염된 생쥐는 PPD에 대응하여 IL-4를 생산하지 않았다. 하지만, 동시-감염된 동물로부터 육아종 세포는 PPD 자극이후 일부 IL-4를 분비하였다(도 2).

Th1 반응은 IgG2a 생산을 촉진하는 반면, Th2 반응은 IgGl과 IgE를 강화시킨다. 도 3에서는 조류결핵(M. avium)으로 감염된 생쥐가 높은 혈청 IgG2a 수준을 보유한다는 것을 보여준다. 하지만, 동시-감염된 동물은 정상적인 혈청 IgG2a 농도를 보유하지만 IgGl과 IgE 수준이 상승한다. 이들 데이터를 종합하면, 장내 기생충 감 염에 대한 Th2 반응은 조류결핵(M. avium)과 같은 강한 Th1-유도 생물체에 대한 이후의 숙주 반응을 하향-조절할 수 있다.

실시예 3. 장내 기생충으로 군체 형성 또는 이들의 알에 대한 노출은 뮤린 TNBS-유도된 대장염에서 Th1-형 장 염증을 약화시킨다:

50% 에탄올에 녹인 TNBS의 직장 점적주입은 크론병과 유사한 특징을 갖는 대장염을 생쥐에서 유발한다. 대장 염증은 상승된 IFNγ mRNA 발현과 함께 침윤 CD4+ T 세포로 특성화된다. TNBS 처리된 생쥐로부터 점막고유판 T 세포는 대조로부터 T 세포에 비하여 50배 많은 IFNγ 및 5배 적은 IL4를 분비한다(Neurath et al., 1995, supra). 점막고유판 단핵구 세포는 대조 생쥐로부터 세포에 비하여 30배 많은 TNFα를 분비한다(Neurath et al., 1997, Eur. J. Immunol., 27: 1743). 중요하게는, TNBS 대장염은 항-IL-12(Neurath et al., 1995, supra), 항-TNFα(Neurath et al., 1997, supra), 또는 rIL-10(Duchmann et al., 1996, Eur. J. Immunol., 26: 934) 처리에 의해 예방되거나 개선될 수 있다. 또한, TNBS-유도된 대장염은 합텐에 사전 경구 노출(Elson et al., 1996, J. Immunol., 157: 2174)에 의해, 아마도 점막 IL-4, IL-10, TGFβ 반응(Neurath et al., 1996,J. Exp. Med., 183: 2605)이 증가함으로써 예방될 수 있다.

BALB/c 생쥐를 이용한 TNBS 대장염 모델이 확립된다. 50% 에탄올에 녹인 TNBS(0.1 ㎖의 5 ㎎/㎖ 원액)의 직장 투여는 이들 동물에서 대장염을 재현가능하게 유발하였다. 후술된 각 TNBS 실험에서, 기생충-노출된 동물과 대조 동물은 처리군에 맹검인 동일 작업자에 의해 동일 날짜에 동일한 TNBS 제조물로 처리하였다.

A. 주혈흡충증(Schistosomiasis)은 TNBS 처리된 생쥐의 MLN과 비장 세포로부터 IFNγ 방출을 저해한다.

주혈흡충(schistosome) 감염이 TNBS 처리된 동물 대장염 모델 생쥐에서 Th1 반응을 변화시키는 지를 조사하였다. 생쥐는 sc. 주입으로 35개의 만소니주혈흡충(S. mansoni) 세르카리아로 감염시켰다. 기생충은 감염이후 6주 시점에 성숙하고 알을 낳기 시작한다. 2주후(감염 8주에), 생쥐는 TNBS로 처리하였다. 수일후, T 세포 자극(항-CD3)에 반응하여 IFNγ를 생산하는 MLN과 비장 세포의 능력을 조사하였다. 표 2에 도시된 바와 같이, 자연 주혈흡충(schistosome) 감염은 TNBS-처리된 생쥐의 중간막 림프절(MLN)과 비장 세포로부터 IFNγ 방출을 강하게 저해한다.

주혈흡충증(Schistosomiasis)은 TNBS-처리된 생쥐의 MLN과 비장 T 세포로부터 IFNγ 생산을 저해한다.

군	α-CD3 자극된 IFNγ(ng/㎖)
군	MLN 세포	비장 세포
TNBS가 제공된 감염되지 않은 생쥐	3.2± 0.7	44.1± 2.3
TNBS가 제공된 주혈흡충(schistosome)- 감염된 생쥐	1.9± 0.3^a	4.2± 0.4^b
ELISA에 의해 측정된 삼중 측정의 평균 IFNγ(ng/㎖)± SE. a) p<0.1 b) p<0.05 배양액은 항-CD3(1 ㎍/㎖)(2C11)의 존재하에 37℃에서 48시간동안 200 ㎕ 배지에서 배양된 10⁶ 분산된 MLN 또는 비장 세포/웰을 보유하였다. 결과는 2가지 실험을 대표한다.

B. 주혈흡충(schistosome) 알에 노출은 TNBS 처리된 생쥐의 MLN과 비장 세포로부터 IFNγ 방출을 저해한다.

주혈흡충증에서, 성체 기생충보다는 기생충 알에 대한 노출이 Th2 반응을 유도한다. 주혈흡충(schistosome) 감염은 기생충이 성숙하고 알을 낳기 시작할 때까지는 강한 Th2 반응을 유도하지 않는다(Grzych et al., 1991, J. Immunol., 146: 1322). 자연 감염 없이 완전한 주혈흡충(schistosome) 알에 노출된 생쥐는 강한 Th2 반응이 발생한다(Oswald et al., 1994, J. Immunol., 153: 1707). 이들 관찰 결과는 자연 감염 없이 주혈흡충(schistosome) 알에 대한 노출이 Th2 반응을 유도하고 Th1 반응을 억제한다는 것을 암시한다.

주혈흡충(schistosome) 알에 대한 사전-노출이 성체 기생충에 의한 감염 없이도 Th1 반응을 저해하는 지를 조사하기 위하여, TNBS로 직장 공격 시점으로부터 14일과 4일전에 10⁴ 주혈흡충(schistosome) 알을 복강내(ip) 주입으로 생쥐에 2회 접종하였다. 이들 시점은 자연 감염에서 발생하는 연속 탁란(continuous egg deposition)을 모델로 하기 위하여 선택되었다. 기생충 알에 노출되지 않지만 TNBS로 처리된 생쥐는 대조로 하였다. 알은 미리 동결시켜 주입 시점에 생존하지 않도록 하였다. TNBS 점적주입하고 수일후 T 세포 자극(항-CD3)에 대응하여 IFNγ을 생산하는 MLN과 비장 세포의 능력을 다시 조사하였다. 자연 주혈흡충(schistosome) 감염(표 1)과 유사하게, ip. 알 노출은 표 3에 도시된 바와 같이, TNBS-처리된 생쥐의 MLN과 비장 T 세포로부터 IFNγ 생산을 저해하였다.

주혈흡충증(Schistosomiasis) 알에 대한 노출은 TNBS-처리된 생쥐의 MLN과 비장 T 세포로부터 IFNγ 생산을 저해한다.

처리	α-CD3 자극된 IFNγ(ng/㎖)
처리	MLN 세포	비장 세포
TNBS 단독	4.65± 0.02	47.1± 3.0
알 ip. 및 TNBS	2.19± 0.11^a	21.8± 3.4^b
ELISA에 의해 측정된 삼중 측정의 평균 IFNγ(ng/㎖)± SE. a) p<0.5 배양액은 항-CD3(1 ㎍/㎖)(2C11)의 존재하에 37℃에서 48시간동안 200 ㎕ 배지에서 배양된 10⁶ 분산된 MLN 또는 비장 세포/웰을 보유하였다. 결과는 3가지 독립된 실험을 대표한다.

C. 주혈흡충(schistosome) 알은 TNBS-유도된 대장염으로부터 생쥐를 보호한다.

점막 Th1 반응의 발생을 저해하면 TNBS-유도된 대장염을 완화시킬 수 있다. 주혈흡충(schistosome) 알에 사전 노출은 MLN과 비장 T 세포에 의한 Th1 사이토킨 분비를 저해한다. 주혈흡충(schistosome) 알의 ip 주입이 TNBS-유도된 대장염을 저해하는 지를 조사하기 위하여, 알을 TNBS 처리이후 상기한 바와 같이 주입하였다. 알 처리는 3가지 독립된 실험에서 누적 치사율을 대조군에서 60%(16/27)에서 알-노출된 생쥐에서 22%(6/27)로 급격하게 감소시켰다. 장내 염증은 상기 일반적인 방법에서 상술된 바와 같이, 4-포인트 스케일로 스코어를 기록하였다. 생존한 생쥐에서, 알 처리는 장내 염증을 대조군에서 3.1± 0.5(평균± SD)에서 알-노출된 생쥐에서 1.3± 0.3으로 약화시켰다(p<0.05, 도 4). 후속 실험에서, 군간 최대 차이는 TNBS 처리이후 3일 시점에 나타나는 것으로 밝혀졌다. TNBS 점적주입이후 14일 시점에 수행된 다른 실험에서, 알 노출은 연장된 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 주혈흡충(schistosome) 알이 점막 Th1 반응을 저해함으로써 치명적인 대장염으로부터 생쥐를 보호한다는 것을 암시한다.

D. 장내 기생충은 숙주 Th2 반응을 유도한다.

만소니주혈흡충(S. mansoni) 이외의 장내 기생충이 숙주 Th1 반응을 유도할 수 있는 지를 조사한다. 장내 선충에 대한 보호 면역의 표출은 CD4 T 세포-의존성이다. 생쥐는 Th2 반응을 유인함으로써 기생충을 구제하거나 또는 감염을 제한한다. 기생충 구제는 장내 호산구증가증(eosinophilia) 또는 점막 비만세포증(mastocytosis)에 전적으로 의존하지는 않는 것으로 보인다. IL-4는 기생충 구제에서 결정적인 역할을 수행하는데, 그 이유는 차단 항-IL-4 또는 항-IL-4 수용체 mAb로 처리하면 기생충 머무름이 촉진되기 때문이다(Else et al., 1994, J. Exp. Med., 179: 347). 반대로, IL-4로 처리하면 기생충 제거가 촉진된다(도 4).

생쥐편충(T. muris)은 뮤린 숙주의 대장에 기생한다. 이는 거의 10억명의 인간에게 존재하는 기생충인 편충(Trichuris trichiura)에 속한다(Grencis et al., 1996, Gastroenterology Clinics of North America, 25: 579). 알을 섭취하면 감염이 시작된다. 알은 맹장 상피를 침투하는 유충을 방출한다. 이후, 이들은 성체 기생충으로 성숙한다. 기생충은 숙주 내에서 복제되지 않기 때문에, 감염의 강도를 조절할 수 있다(Bancroft et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24: 3113).

생쥐편충(T. muris)은 장내 Th1 반응성을 하향-조절하는데 이용하였다. 생쥐편충(T. muris) 감염은 생존가능 유충을 보유하는 250개의 미발달 알로 경구 위관영양(oral gavage)으로 확립한다. BALB/c 생쥐는 생쥐편충(T. muris)을 보유할 수 있고, 감염후 4주 이내에 기생충을 자연적으로 구제할 수 있다. 생쥐편충(T. muris)- 또는 가짜-감염된 생쥐는 감염이후 4주 시점에 TNBS의 직장 점적주입으로 처리하였다. 생쥐편충(T. muris)으로 사전 군체형성은 2가지 독립된 실험에서 누적 치사율을 가짜-감염된 군에서 58%(7/12)에서 기생충-노출된 군에서 21%(3/14)로 감소시켰다. 더 나아가, 생쥐편충(T. muris)으로 미리 군체 형성된 생쥐(0.92± 0.5, 평균± SD)는 가짜-감염된 생쥐(3.13± 0.63)에 비하여 TNBS 대장염을 약화시켰다(p<0.05). 이들 데이터는 장내 기생충, 생쥐편충(T. muris)에 대한 사전 노출이 심각한 Th1-매개된 대장염으로부터 생쥐를 보호한다는 것을 암시한다.

실시예 4. IL-10 유전자 파괴는 숙주/기생충 상호작용에 별다른 영향을 주지 않는다.

IL-10은 대식세포 활성화 및 보조 세포 기능을 하향-조절하는 중요한 면역조절 사이토킨이다(Moore et al., 1993, Ann. Rev. Immunol., 11: 165). 표적된 유전자 파괴로 IL-10이 결손된 생쥐(IL-10-/-)는 대장 균총에 의해 영향을 받는 만성 장염이 발병한다(Kuhn et al., 1993, Cell, 75: 263). 장내 염증은 항-IFNγ 항체로 처리에 의해 약화되는데, 이는 대장염이 대장 내용물에 대한 과도하게 왕성한 Th1 반응으로부터 기인한다는 것을 입증한다(Berg, et al., 1996, J. Clin. Invest., 98: 1010). 이들 생쥐는 크론병과 유사한 자발적 대장염에 대한 우수한 모형으로서 기능한다.

A.IL-10-/- 생쥐는 기생충에 대한 Th2 반응을 유인할 수 있다.

장내 선충, 노카르디아 브라실리엔시스(Nocardia brasiliensis)로 감염된 생쥐는 IL-4, IL-5, IL-10의 생산과 함께 기생충에 대한 Th2-형 염증이 발생한다. 노카르디아 브라실리엔시스(N. brasiliensis)는 IL-10-/- 생쥐에 군체를 형성할 수 있고 적절한 장내 Th2 반응을 자극할 수 있다(Kuhn et al., 1993, supra). IL-10 -/- 생쥐는 만소니주혈흡충(S. mansoni)으로 감염시켜 이들이 Th2 반응을 유도하는 지를 조사하였다.

표 4에서는 만소니주혈흡충(S. mansoni)으로 8주동안 군체 형성된 IL-10 유전자-파괴된 생쥐로부터 비장세포가 주혈흡충(schistosome) 알 항원(SEA) 또는 항-CD3으로 자극이후 다량의 IL-4를 분비한다는 것을 보여준다. 이들 생쥐에서 주혈흡충(schistosome) 알을 둘러싸는 육아종은 통상의 높은 비율(45-50%)의 호산구를 보유하고, IL-4와 IL-5를 생산한다. 따라서, 이들은 효과적인 Th2 반응을 보인다. 이들 데이터는 만소니주혈흡충(S. mansoni)과 같은 장내 기생충에 대한 노출이 IL-10의 부재하에서도 강한 Th2 반응을 유도한다는 것을 암시한다.

주혈흡충증(Schistosomiasis)은 IL10 결손 생쥐에서 Th2 반응을 유도한다.

주혈흡충(schistosome)-감염된 생쥐로부터 비장 세포
사이토킨	자극되지 않음	SEA-자극됨	α-CD3 자극됨
IL-4(ng/㎖)
야생형	0.07± 0.08	0.21± 0.02	3.94± 0.12
IL-10-/-	0.41± 0.10	2.56± 0.23	5.06± 0.33
ELISA에 의해 측정된 삼중 측정의 평균 IL-4(ng/㎖)± SE. 배양액은 주혈흡충(schistosome) 알 항원(SEA 5 ㎍/㎖) 또는 항-CD3(1 ㎍/㎖)(2C11)의 존부하에 37℃에서 48시간동안 200 ㎕ 배지에서 배양된 10⁶ 세포/웰을 보유하였다. 결과는 각 실험에서 최소한 4가지 야생형과 KO 생쥐를 이용한 2가지 독립된 실험을 대표한다.

B. 장내 기생충 Th2-조절은 IL-10 -/- 생쥐에서 점막 염증의 자연 발생을 저해한다.

IL-10 결손 생쥐는 장내 기생충을 보유하고 강한 Th2 반응을 유도할 수 있을 것으로 생각된다. IL-10 -/- 생쥐는 Th2 반응을 발생시키고 장내 기생충을 보유할 수 있기 때문에, 자발적 또는 진행성 대장염에 대한 기생충 노출의 효과를 조사하는데 있어 우수한 모형으로서 기능한다. IL-10은 중요한 항-염증성 사이토킨이다. 이런 필수적인 면역조절 회로의 파괴가 기생충에 의한 점막 Th2 조절을 예방할 수도 있다. 현재의 증거는 생쥐편충(T. muris)으로 감염이 IL-10-/- 생쥐에서 발생하는 자발적 대장염을 방해한다는 것을 암시한다. 동물(6주령)은 생쥐편충(T. muris) 또는 가짜 감염으로 처리하고 6주후에 희생시켰다. 생쥐편충(T. muris) 또는 가짜-감염된 IL-10-/- 생쥐의 대장 감염은 상기 일반적인 방법에서 상술한 바와 같이 4-포인트 스케일에서 스코어를 기록하였다. 생쥐편충(T. muris)으로 사전 감염은 장내 염증을 가짜-감염된 군에서 3.0± 0.3(평균± SE)에서 기생충 노출된 IL-10-/- 생쥐에서 2.2 ± 0.1로 약화시켰다(p<0.05). 이들 데이터는 장내 기생충에 대한 사전 노출이 IL-10 결손 생쥐에서 자발적 대장염을 약화시킨다는 것을 입증한다.

실시예 6. 돼지편충( Trichuris suis )으로 장내 군체 형성은 크론병 환자에서 질병 활성을 하향-조절한다:

크론병 환자는 돼지편충(Trichuris suis)으로 군체를 형성시키고 질병 활성에서 개선을 사정한다. 돼지편충(T.suis, porcine whipworm)은 미개발 국가에서 흔히 발견되는 인간 장내 기생충인 편충(T. trichiura)에 속한다. 상기 편충은 잠재적인 치료제이다. 자연 인간 기생충, 편충(Trichuris trichiura)은 점막 부착으로 대장에 기생하는 매우 작은 생물체이다. 통상의 균체 형성은 숙주에서 증상과 건강 문제를 유발하지 않는다. 전세계적으로 수백만명에게 군체가 형성되지만, 극히 일부에서 심각한 체내 침입이 설사, 출혈, 철 결핍 빈혈을 유발한다. 흥미롭게도, 상기 기생충의 수명은 숙주가 자기-감염되지 않도록 한다. 이들 알은 감염력을 획득하기 위하여 성숙을 위한 고체상을 필요로 하고, 이후 개체에 대한 기생충 로드(parasitic load)를 증가시키기 위하여 재-섭취되어야 한다. 따라서, 편충(Trichuris trichiura) 체내 침입은 토양에 있는 알이 흡입될 때까지 숙주 내에서 증가하지 않는다. 상기 병원체는 3일간의 메벤다졸로 효과적으로 치료된다. 인간 편충은 숙주에 군체를 형성하는데 이용될 수 있고, 크론병에서 면역 과정을 변화시키는 실험적 작용제로서 간주될 수 있다.

하지만, 편충(Trichuris trichiura)은 숙주에 잠재적인 건강 문제를 유발한다. 인간이 유일한 자연 숙주이기 때문에 실험 목적의 알이 다른 인간으로부터 수거되어야 하는데, 이로 인하여 다른 인간 감염성 질환이 실험 개체로 전파될 위험이 있다. 이런 이유로, 근접된 동물 기생충을 이용하였다. 돼지편충(Trichuris suis)은 증상, 질병, 동시-감염성 질환 또는 공종 보건에 위해를 유발하지 않으면서 인간 숙주에서 일시적으로 군체를 형성하는 능력을 보유한다.

돼지편충은 인간을 감염시키는 종과 밀접하게 관련된다. 이들 두 생물체는 동일 과(科)에 속하고 형태적으로 유사하지만, 종이 상이하고 형태적, 발달적, 임상적으로 구별될 수 있다. 돼지편충 알은 약간 더 크고 상이한 형태의 돌기를 보유하며, 알에서 성체로의 발달 속도가 편충(Trichuris trichiura)의 발달 속도보다 약간 늦다(Beer, 1976, Res. Vet. Sci., 20:47). 중요하게는, SPF 동물로부터 감염성 기생충 알을 획득할 수 있다.

감염성 돼지편충(T. suis) 알은 상기한 바와 같이 준비하였다. 이들 알은 장내 병원균(가령, 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 캄필로박터(Campylobacter), 여시니아(Yersinia), 장독소 대장균(E. coli))과 바이러스(가령, CMV, HSV, VZV, 아데노바이러스, 엔테로바이러스)에 의한 오염의 부재를 검사하였다.

진전된 약물-저항성 크론병을 앓는 2명의 환자에 돼지편충(T. suis)으로 군체를 형성시켰다. 이들 환자는 상기 기생충에 기인한 증상 없이 이들 생물체를 관용하였다. 표 5에서는 환자 군체 형성을 달성한 이후, 양 참가자에서 CDAI 수치, 설사, 염증 지수가 감소되었음을 보여준다. 이런 결과는 장내 기생충이 크론병을 비롯한 비정상적인 면역 반응을 조절하는데 유용하다는 것을 암시한다.

크론병 환자는 돼지편충(T. suis)에 의한 군체 형성으로부터 도움을 받을 수 있다.

환자	파라미터	기준 ^a	2주 ^b	4주 ^b
1	CDAI^c	250.2	269.9	147.4
	대변/week	67	101	49
	ESR^d	17	11	4
	C-반응성	<0.5	<0.5	<0.5
	단백질
2	CDAI	341.3	169.6	136.7
	대변/week	77	27	25
	ESR	19	7	ND
	C-반응성	0.9	<0.5	<0.5
	단백질
a) 연구 시작 시점에서 수치. b) 돼지편충(T. suis)에 의한 군체 형성이후 2주와 4주 시점에서 수치. c) 크론병 활성 지수. d) 적혈구 침강 속도 . ND; 측정되지 않음.

실시예 7. 염증성 장 질환의 예방과 치료에서 선충(H. polygyrus):

염증 질환에 대한 기생충 유도된 보호에서 조절 T 세포의 역할을 조사하기 위하여, 추가의 실험을 수행하였다.

이들 실험에는 뮤린 장내 기생충, 선충(H. polygyrus)을 이용하였다. 선충(H. polygyrus)은 말단 회장(terminal ileum)과 대장에 염증이나 손상을 유발하지 않으면서 숙주의 십이지장에 기생한다. 알코올에 녹인 TNBS를 생쥐의 직장내에 점적주입하여 대장염을 유도한다. 도 5에서는 상기 생물체가 TNBS-유도된 대장염으로부터 생쥐를 보호한다는 것을 보여준다. 군체 형성은 200개의 생존가능 유충의 경구 위관영양으로 확립하였다. 생쥐는 군체 형성이후 대략 2주 시점에 기생충을 구제한다. 선충(H. polygyrus)- 또는 가짜-감염된 생쥐는 기생충 군체 형성이후 4주 시점에 0.1 ㎖ TNBS(50% EtOH에서 5 ㎎/㎖)의 직장 점적주입으로 처리하였다. 대장염의 유도이후 3일 시점에 염색된 조직 절편에서 염증을 사정하였다.

장내 기생충 군체 형성이 Th1 사이토킨, 예를 들면, IFNγ, TNFα, IL12의 장내 생산을 제한함으로써 TNBS-유도된 IBD로부터 생쥐를 보호하는 지를 조사하는 실험을 수행하였다. 도 6과 7에서는 IBD가 없는 건강한 WT 생쥐를 선충(H. polygyrus)에 노출시키면 원위 장내 점막이 IFNγ과 IL12를 훨씬 적게 생산한다는 것을 보여준다.

IL10, TGFβ, PgE2와 같은 조절 사이토킨은 "Th1" 세포 기능을 제한할 수 있다. 선충(H. polygyrus)이 장내 점막내에서 이들 조절 사이토킨의 생산을 촉진하는 지를 조사하였다. 도 8에서는 상기 기생충이 점막 IL10 생산을 유도한다는 것을 보여준다. IL10은 친염증성 매개물질, 예를 들면, TNFα, IL6, IL12의 어레이를 하향-조절한다. 이런 이유로, 장내 점막에서 생산된 IL10이 "Th1" 세포 기능을 제한한다고 추정하는 것은 합리적이다. 도 9에서는 선충(H. polygyrus)을 포함하는 생쥐로부터 LPMC가 저해 항-IL10R mAb와 함께 배양되는 경우에 실질적으로 증가된 IFNγ을 생산한다는 것을 보여주는데, 이는 상기 가설을 뒷받침한다.

질병으로부터 보호를 제공할 수 있는 잠재적으로 중요한 면역조절 사이토킨은 프로스타글란딘 E2(PgE2), IL4, IL5, IL13, TGFβ 등이다. 도 10-12에서는 장내 기생충이 장내 점막에서 보호성 사이토킨 E2(PgE2), IL4, IL5, IL13, TGFβ를 유도한다는 것을 보여준다.

T 세포는 장내 점막에서 IFNγ의 주요 출처이다(도 13). IFNγ은 TNBS 대장염의 유도에 중요하다.

장내 기생충은 장으로 이동하는 MLN에서 조절 T 세포를 유도하여 점막 면역 반응성을 국소적으로 조절한다. 실험을 통하여, 감염되지 않은 고유 WT 생쥐로부터 LPMC는 기생충-감염된 생쥐로부터 MLN T 세포의 이전이후 IFNγ을 생성하는 차별된 능력을 보이는 것으로 밝혀졌다(도 14).

일부 실험에는 MLN 조절 T 세포 하위군이 장내 점막고유판에 들어가 조절 사이토킨을 후속으로 생산하는 지를 결정하기 위하여 적응성 이전 실험을 위한 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자도입 생쥐를 이용하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, 선충(H. polygyrus)을 보유하는 GFP+ 생쥐로부터 추정 MLN 조절 T 세포는 건강한 WT 수용자의 장내 점막에 들어간다.

상기 실험은 장내 기생충이 질병으로부터 어떻게 보호되는 지를 보여준다. 임상 시험에서, 장내 기생충 군체 형성은 활성 IBD를 개선하는 것으로 밝혀졌다. 선충(H. polygyrus)에 의한 군체 형성이 이후의 뮤린 대장염을 전환시키는 지를 또한 조사하였다.

IL10-/- 생쥐는 만성 Th1 대장염이 발병하고, 나이가 들수록 점진적으로 악화되었다. 하지만, 자발성 질환의 대부분의 IBD 모형에서처럼, SPF 시설에서 IL10-/- 생쥐는 수개월이후에 가변적 표현의 대장염이 발병한다. IBD 모형을 개선하여 실험에 더욱 유용하도록 하였다. 5주령 IL10-/- 생쥐에 NSAID(피록시캄)를 2주간 사용하면 약물이 중단된 이후에도 영구적으로 지속되는 심각한 Th1 대장염이 발생하는 것으로 밝혀졌다. 염증은 각 생쥐 개체에서 매우 예측가능하고, 균일한 심각도로 결장과 TI에 영향을 준다(도 16). WT 생쥐는 피록시캄 처리로 대장염을 발생시키지 않는다.

선충(H. polygyrus)으로 IL10-/- 생쥐의 군체 형성은 이전에 확립된 대장염을 소멸시키는 것으로 밝혀졌다(도 17). 5주령 C57BL/6 IL10-/- 생쥐는 피록시캄(80 ㎎/250g 사료)으로 처리하였다. 2주후, 피록시캄을 중단하였다. 이 시점에서, 모든 생쥐는 대장염이 발병하였다. 피록시캄을 중단하고 2일후, 일부 생쥐는 위관 영양(gastric gavage)으로 200개의 선충(H. polygyrus)을 군체 형성시키고, 다른 생쥐는 가짜-처리하였다. 군체 형성 2주후, 대장염 스코어는 대조에서 3.6± 0.4(SE)에서 군체 형성된 생쥐에서 0.55± 0.5로 감소하였다(p=0.001).

선충(H. polygyrus)에 의한 확립된 대장염의 치료는 LPMC 사이토킨 생산에서 변화와 연관한다.

고유(피록시캄 없음) 또는 대장염 가짜-군체 형성된 생쥐로부터 분리된 LPMC는 항-CD3/항-CD28로 자극이후 IFNγ(도 18) 및 CpG 올리고뉴클레오티드(0.6㎍ #1826/㎖)로 자극이후 IL12를 다량 방출한다. 피록시캄-처리되고 선충(H. polygyrus)-군체 형성된 IL10-/- 생쥐로부터 LPMC는 민감성 (30pg/㎖) ELISA에 의해 IFNγ이 거의 검출되지 않고 IL12의 방출을 감소시킨다(도 18). 고유 또는 대장염 IL10-/- 생쥐로부터 LPMC는 IL4와 IL13을 전혀(또는 거의) 생산하지 않는다(도 19). 대조적으로, 선충(H. polygyrus)-군체 형성된 생쥐로부터 LPMC는 얼마간의 IL4 및 상당량의 IL13을 생산한다. 장내 기생충 군체 형성은 대장 염증을 전환시키지만, LPMC 사이토킨 프로필은 고유 IL10-/- 생쥐의 프로필로 단순하게 환원되지는 않는다. 오히려, 군체 형성은 대장염의 치료와 연관된 새로운 사이토킨 프로필을 유도한다.

선충(H. polygyrus) 군체 형성은 IL10-/- 생쥐의 LPMC에서 조절 회로를 활성화시킨다. 대장염 IL10-/- 생쥐로부터 IFNγ-생산 LPMC를 선충(H. polygyrus)-군체 형성된 생쥐로부터 LPMC와 1:1로 혼합하면 IFNγ 생산이 저해된 공동-배양물이 생성된다.

선충(H. polygyrus)은 십이지장에 기생하지만, 대장염을 전환시키고 원위 LPMC 사이토킨을 변화시키는 조절 회로를 개시시킨다. 장내 기생충 군체 형성은 선충(H. polygyrus)-군체 형성된 생쥐의 MLN T 세포 구획 내에 존재하는 순환 조절 세포를 유도하거나 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 선충(H. polygyrus)-군체 형성된 IL10-/- 생쥐로부터 20x10⁶MLN 세포 또는 5x10⁶MLN T 세포의 대장염이 확립된 IL10-/- 동물로의 이전은 염증의 소멸을 유도한다(도 20).

Scurfin은 foxp3 유전자에 의해 인코딩되고 조절 T 세포의 발달이나 활성에 중요한 전사 인자이다. Foxp3 전사체는 실시간 RT-PCR에 의한 정량에서, 기생충-없는 IL10-/- 생쥐에 비하여 선충(H. polygyrus)-군체 형성된 생쥐의 MLN에서 증가한다(도 21). PCR 주기 역치에서 각 감소는 HPRT mRNA에 대하여 표준화된 2배의 Foxp3 함량에 상당하다. 장내 기생충 군체 형성은 MLN 세포에서 3- 내지 5-배 증가된 Foxp3 발현을 유도한다. Foxp3은 기생충-없는 대조에 비하여 선충(H. polygyrus)-군체 형성된 IL10-/- 생쥐의 LPMC에서 또한 증가한다(3배). 단지 조절 T 세포만 Foxp3을 발현하는 것으로 알려져 있다(Hori, S., T. Nomura, and S. Sakaguchi. 2003. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299:1057-1061). MLN과 LPMC에서 Foxp3 발현의 증가는 장내 기생충이 확립된 대장염의 소멸을 조정하는 조절 T 세포를 유도한다는 가설을 뒷받침한다.

면역조절 인자에 대한 다른 전사체는 선충(H. polygyrus) 군체 형성에 의해 변화된다. Smad7은 TGFβ 신호전달을 차단하는 전사 인자이다. 선충(H. polygyrus) 군체 형성은 실시간 RT-PCR에 의한 측정에서, MLN 세포 Smad7 발현을 4.5-배 감소시킨다(도 22). Smad7 전사체는 LPMC에서도 감소한다. Smad7의 감소는 세포가 면역조절 TGFβ에 더욱 반응하도록 한다. 게다가, Smad7 발현의 감소는 복수 조절 기전이 IL10-/- 대장염을 소멸시키는데 유사하게 작동한다는 것을 입증한다.

Smad7에 대한 프라이머와 프로브는 TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC(SEQ ID NO. 4), GAGTAAGGAGGAGGGGGAGA(SEQ ID NO. 5), FAM-TTGATCTTCCCGTAAGATTCACAGCAACA-TAMRA(SEQ ID NO. 6)이다. Foxp3과 Smad7 mRNA의 발현은 HPRT의 발현에 표준화시킨다. HPRT에 대한 프라이머와 프로브는 TGAAGAGCTACTGTAATGATCAGTCAAC(SEQ ID NO. 7), GCAAGCTTGCAACCTTAACCAT(SEQ ID NO. 8), TET-TGCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACAGCCC-TAMRA(SEQ ID NO. 9)이다.

다른 구체예

상기한 실시예는 본 발명을 작업하고 실행함에 있어 본 발명자들에 의해 수행되고 고려된 실험을 예시한다. 이들 실시예는 본 발명을 실행하고 이의 유용성을 예시하기 위하여 언급할 가치가 있는 기술의 개시를 수반한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 기술과 구체예는 선호되는 구체예이며, 다수의 균등한 방법과 기술이 동일한 결과를 달성하는데 이용될 수 있다.

본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 하나이상 구체예를 실행하기 위한 기초를 제공하는 범위 내에서 참조된다.

SEQUENCE LISTING <110> University of Iowa <120> USE OF PARASITIC BIOLOGICAL AGENTS FOR DISEASES PREVENTION <130> 27045/2038 <140> Not Yet Assigned <141> 22-October-2004 <150> 10/715,659 <151> 17-November-2003 <160> 9 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 cccaggaaag acagcaacct tttctcacaa ccaggccact tg 42 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 atcctaccca ctgctggcaa atggagtc 28 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 tcctgctgtg caaagtgttc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 gagtaaggag gagggggaga 20 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(29) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 ttgatcttcc cgtaagattc acagcaaca 29 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 tgaagagcta ctgtaatgat cagtcaac 28 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 gcaagcttgc aaccttaacc at 22 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sythetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 tgctttccct ggttaagcag tacagccc 28

Claims

조절 T 세포 활성을 변화시키는 장내 기생충(helminthic parasite) 제제를 스크리닝하는 방법에 있어서,

(a) 장내 기생충 제제를 획득하고;

(b) 상기 장내 기생충 제제를 표적과 접촉시키고;

(c) 접촉이후, 상기 표적에서 조절 T 세포 활성에 대한 내부 마커의 수준을 결정하고, 여기서 접촉이후 내부 마커의 수준에서 변화는 상기 장내 기생충 제제가 조절 T 세포 활성을 변화시킴을 암시하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서, 내부 마커는 전사 인자인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 2항에 있어서, 전사 인자는 Scurfin, Smad7, Gata3, 또는 Tbet(Tbx21)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 2항에 있어서, 전사 인자의 수준은 단백질 또는 mRNA 수준에서 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
조절 T 세포 활성을 변화시키는 장내 기생충 제제를 스크리닝하는 방법에 있 어서,

(a) 장내 기생충 제제를 획득하고;

(b) 상기 장내 기생충 제제를 표적과 접촉시키고;

(c) 접촉이후, 상기 표적에서 조절 T 세포에 대한 세포 표면 마커의 수준을 결정하고, 여기서 접촉이후 세포 표면 마커의 수준에서 변화는 상기 장내 기생충 제제가 조절 T 세포 활성을 변화시킴을 암시하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 5항에 있어서, 세포 표면 마커는 CD4, CD45RB^lo, CD45Rc, 세포융해 T 림프구 연관된 항원 4(CTLA-4), Ox40, 4-1BB, CD25, CD103, CD62L, a_Eβ 인테그린, 잠복-연관된 펩티드(LAP) 또는 글루코코르티코이드 유도된 TNF 수용체 집단 관련된 단백질(GITR), 케모킨 수용체 CCR5, TI-ST2에서 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
제 6항에 있어서, 표면 마커의 수준은 단백질 또는 mRNA 수준에서 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
조절 T 세포 활성을 변화시키는 장내 기생충 제제를 동물에 투여함으로써 동물에서 Th1 또는 Th2 관련된 질환을 치료하는 방법.
자가면역 질환 또는 알레르기 질환용 장내 기생충 제제의 치료 효능을 동물에서 모니터링하는 방법에 있어서,

(a) 장내 기생충 제제 또는 이의 분획물을 함유하는 조성물을 상기 동물에 투여하고;

(b) 투여이후, 상기 동물에서 조절 T 세포 활성의 수준을 결정하고, 여기서 투여이후 조절 T 세포 활성의 수준에서 증가는 상기 장내 기생충 제제의 치료 효능을 암시하는 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.
제 9항에 있어서, 조절 T 세포 활성은 조절 T 세포 마커의 수준을 결정함으로써 측정하는 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.
제 10항에 있어서, 조절 T 세포 마커는 내부 마커인 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.
제 11항에 있어서, 내부 마커는 Scurfin, Smad7, Gata3, 또는 Tbet(Tbx21)인 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.
제 10항에 있어서, 조절 T 마커는 세포 표면 마커인 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.
제 13항에 있어서, 세포 표면 마커는 CD4, CD45RB^lo, CD45Rc, 세포융해 T 림프구 연관된 항원 4(CTLA-4), Ox40, 4-1BB, CD25, CD103, CD62L, a_Eβ 인테그린, 잠복-연관된 펩티드(LAP) 또는 글루코코르티코이드 유도된 TNF 수용체 집단 관련된 단백질(GITR), 케모킨 수용체 CCR5, TI-ST2에서 선택되는 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.
제 10항에 있어서, 조절 T 세포 마커는 분비된 마커인 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.
제 15항에 있어서, 분비된 마커는 IL4, IL13, IL-5, IL-10 또는 TGFβ, PgE2인 것을 특징으로 하는 모니터링 방법.