CN102988417B

CN102988417B - 寄生性生物制剂用于疾病预防和控制的用途

Info

Publication number: CN102988417B
Application number: CN201210181952.9A
Authority: CN
Inventors: 乔尔·V·温斯托克; 大卫·E·埃利奥特
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 2003-11-17
Filing date: 2004-10-22
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2024-10-22
Also published as: ES2425350T3; PT1530972E; CA2546416A1; CN101128597A; SI1530972T1; CY1115012T1; US20050118655A1; HK1076047A1; PL1530972T3; EP1530972A2; UA94023C2; AU2004293761B2; JP2007533302A; KR20060120203A; WO2005052115A2; MXPA06005537A; EP1530972A3; WO2005052115A3; KR101363138B1; AU2004293761A1

Abstract

本发明涉及筛选影响调节性T细胞功能的蠕虫类(heminthic)寄生虫制剂的方法和通过施用寄生虫制剂改变调节性T细胞活性而治疗疾病的方法。

Description

寄生性生物制剂用于疾病预防和控制的用途

本申请是申请日为2004年10月22日提交的中国专利申请200480033971.0的分案申请，该母案申请是PCTUS2004/035164的国家阶段申请。

发明领域

本发明涉及寄生虫组合物及其在预防和/或治疗由于免疫应答改变导致的状况或疾病状态的用途。

发明背景

寄生虫是在其他生物的部分生命周期中栖息于它们之上或之内并从宿主获取营养的活体。栖息于肠道的寄生虫与粘膜免疫系统有复杂的相互作用。它们必须与宿主粘膜防御系统建立平稳的关系以存活。

导致异常Th1或Th2应答的免疫系统失调可能是几种人疾病的原因。Th1应答占优势的所导致的一些疾病包括IBD、类风湿性关节炎、结节病、多发性硬化和胰岛素依赖的糖尿病。Th2相关疾病包括变应性疾病和癌症。

最近已经表明，寄生虫暴露降低实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的严重性(Sewell et al.，2003，International Immunology，15：59-69)。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是多发性硬化的动物模型，其特征是中枢神经系统(CNS)的慢性炎症性脱髓鞘。Sewell报告在用曼氏血吸虫卵免疫的小鼠中，EAE严重程度降低，测定到临床评分和CNS细胞浸润降低。周围系统中IFN-γ水平降低，IL-4、转化生长因子-β和IL-10水平增加，脑中产生IL-4的神经抗原特异性T细胞的频率增加。

克罗恩氏病由失调的T辅助细胞(Th)型粘膜炎症引起。克罗恩氏病在热带国家少见，但在温带气候的发达国家流行，其发病率在1940以后增加。相比较而言，暴露于蠕虫类寄生虫在热带国家常见，但在发达国家少见。Elliott等人(2003，Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.，284：G385-G391)证明蠕虫可以减弱过度的Th1型炎症。为测试该假说，将小鼠暴露于蠕虫曼氏血吸虫的卵，然后经直肠用三硝基苯磺酸(TNBS)激发以诱导结肠炎。血吸虫卵暴露减弱TNBS结肠炎并保护小鼠免于致死性炎症。血吸虫卵暴露减低TNBS处理小鼠中抗-CD3刺激的脾和肠系膜淋巴结细胞生成的IFN-γ，并增强IL-4生成。血吸虫卵暴露降低TNBS处理小鼠中结肠IFN-γ，但增加IL-10mRNA表达。减弱结肠炎需要完整的信号转导和转录活化蛋白6。作者表明暴露于蠕虫可降低小鼠结肠炎症。

de Jong等人(2002，J.Immunol.，168：1704-1709)证明来自蠕虫曼氏血吸虫的蛋白质提取物诱导DC2形成，DC2进而通过增强OX40配体表达来促进Th2细胞形成。与之相似，细胞外细菌霍乱弧菌的毒素也诱导DC2形成，然而是通过不依赖于OX40配体、仍未知的机制。比较而言，细胞内细菌百日咳博代杆菌诱导DC1发育并增强IL-12生成，从而促进Th1细胞形成。Poly(I：C)(dsRNA，病毒模拟物)诱导极强的诱导Th1的DC1形成，而不增强IL-12生成。

美国专利申请2003/0103938 A1公开了由IL-4和SDF-1α组成或由IL-2和SDF-1α组成的药物组合物，用于通过调节Th1/Th2比率预防或治疗人或动物的Th1细胞或Th2细胞相关的疾病。

Doetze等人(2000，International Immunology，12：623-630)通过慢性蠕虫感染(即一般性盘尾丝虫病(GEO))个体的外周血单核细胞(PBMC)与推定免疫(PI)个体的PBMC比较，研究了对Ov抗原(OvAg)的T细胞增殖性反应不足。在此研究中，调查了介导GEO中这种细胞反应不足的机制：与PI个体比较，GEO个体的PBMC中的低增殖反应与缺乏IL-4生成和明显更低的IL-5生成有关，反驳了向T(h)2反应的一般性转移是反应不足的原因。比较而言，两种与T(h)3反应相关的细胞因子，即IL-10和转化生长因子(TGF)-β似乎介导反应不足：GEO个体的PBMC产生明显更多的IL-10，该组中的T细胞增殖反应不足可以通过加入抗IL-10和抗-TGF-β抗体而被逆转。作者表明反应不足对OvAg特异，当用相关蠕虫抗原刺激时没有观察到，这支持T细胞介导的、Ov特异性下调。Ov特异性T细胞能从GEO PBMC中克隆，它具有独特的细胞因子谱(无IL-2但高IL-10和/或TGF-β生成)，与已知抑制进行性炎症(T(h)3和T(r)1)的T细胞亚组相似，这表明在传染病中从未发现的这种细胞类型可能参与维持Ov特异性反应不足。

Th3细胞是调节性T细胞亚组，最初在口服耐受MBP的小鼠中产生并鉴定，通过TGF-β依赖性机制抑制诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(Chen et al.，1994，Science，265：1237-1240)。近来的研究提示通过抑制保护性Th1反应，调节性T细胞能被诱导抵抗体内细菌、病毒和寄生虫抗原，并可以预防自身免疫病、感染诱导的免疫病或延长病原体持续(例如见McGuirk and Mills，2002，Trends in Immunology，23：450-455；Tung et al.，2001，Immunological Reviews，182：135-148；和Maloy and Powrie，2001，Nature Immunology，2：816-822)。

调节性T细胞一般描述为抑制免疫应答即抗体介导和/或细胞介导的免疫应答的淋巴细胞(例如综述见McGuirk P，Mills KH.Pathogen-specific regulatory T cellsprovoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases.TrendsImmunol 2002；23(9)：450-5；Field，A.C.，L.Caccavelli，M.F.Bloch，and B.Bellon.2003.Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediatedautoimmunity.Journal of Immunology.170：2508-2515；von Herrath MG，HarrisonLC.Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity.Nat Rev Immunol.2003 Mar；3(3)：223-32；Francois Bach J.Regulatory T cells under scrutiny.Nat Rev Immunol.2003 Mar；3(3)：189-98；Curotto de Lafaille MA，Lafaille JJ.CD4(+)regulatory T cellsin autoimmunity and allergy.Curr Opin Immunol.2002 Dec；14(6)：771-8；McGuirk P，Mills KH.Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigmin immunity to infectious diseases.Trends Immunol.2002 Sep；23(9)：450-5；Tung KS，Agersborg SS，Alard P，Garza KM，Lou YH.Regulatory T-cell，endogenous antigenand neonatal environment in the prevention and induction of autoimmune disease.Immunol Rev.2001 Aug；182：135-48；Read S，Powrie F.CD4(+) regulatory T cells.Curr Opin Immunol.2001 Dec；13(6)：644-9；Yssel H，Lecart S，Pene J.Regulatory Tcells and allergic asthma.Microbes Infect.2001 Sep；3(11)：899-904)。这些调节性T细胞(Tr细胞)表达跨膜蛋白(称为CD25)，该蛋白是白介素-2(IL-2)受体的α链。与其它T细胞相似，它们也表达αβ(alpha-beta)T细胞抗原受体(TCR)，并仅在结合到II类MHC分子时而被活化，或者对于CD8调节性细胞对I类MHC特异。然而如果被活化，它们开始分泌大量白介素10(IL-10)，并经常还分泌一些转化生长因子-β(TGF-β)。这两种淋巴因子都是强免疫抑制剂，抑制辅助细胞介导的免疫和炎症的Th1、辅助抗体生成的Th2和可能的CD8+溶细胞性T淋巴细胞(CTL)作用。一些其它调节性T细胞与Tr细胞不同。例如，Tr1细胞以几种方式类似于Tr细胞，尽管它们不在表面表达大量CD25。它们的形成需要IL-10，一旦成熟则分泌大量IL-10。Th3细胞的主要淋巴因子是TGF-β。

调节性T细胞是否在用蠕虫类寄生虫制剂预防或治疗Th1或Th2相关疾病中起作用仍然未知。

发明内容

本发明基于以下发现：在Th1或Th2相关疾病的治疗中，寄生虫制剂能改变调节性T细胞的活性。

在一个实施方案中，本发明提供筛选改变调节性T细胞活性的蠕虫类寄生虫制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得蠕虫类寄生虫制剂；(b)将蠕虫类寄生虫制剂与目标物接触；和(c)测定接触以后目标物中调节性T细胞的内部标记物水平，其中接触以后内部标记物水平的变化是蠕虫类寄生虫制剂改变调节性T细胞活性的指标。

在另一个实施方案中，本发明提供筛选改变调节性T细胞活性的蠕虫类寄生虫制剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)获得蠕虫类寄生虫制剂；(b)将蠕虫类寄生虫制剂与目标物接触；和(c)测定接触以后目标物中调节性T细胞的细胞表面标记物水平，其中接触以后细胞表面标记物水平的变化是蠕虫类寄生虫制剂改变调节性T细胞活性的指标。

在另一个实施方案中，本发明提供通过向患有Th1或Th2相关疾病的动物施用改变调节性T细胞活性的蠕虫类寄生虫制剂来治疗所述动物的方法。

在另一个实施方案中，本发明提供监测蠕虫类寄生虫制剂对动物自身免疫或变态反应疾病的治疗效果的方法，包括：(a)向动物施用包含蠕虫类寄生虫制剂或其组分的组合物；和(b)测定施用以后动物中调节性T细胞活性水平，其中施用以后调节性T细胞活性水平的增加是蠕虫类寄生虫制剂治疗效果的指标。

优选地，待治疗疾病是一种选自下面的疾病：炎性肠病、类风湿性关节炎、狼疮、儿童胰岛素依赖性糖尿病(I型)、结节病、多发性硬化、哮喘和变应性鼻炎。

调节性T细胞标志物可以是内部标志物、细胞表面标志物或分泌型标志物。

优选地，内部标志物是Scurfin、Smad7、Gata3、Tbet(Tbx21)。

还优选地，细胞表面标志物选自：CD4、CD45RB^1o、CD45Rc、溶细胞性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、CD25、CD103、CD62L、α_Eβ整合素、潜伏相关肽(LAP)或糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白(GITR)、实验性变应性脑炎(EAE)、趋化因子受体CCR5、TI-ST2。

还优选地，分泌型标志物是IL-5、IL-10或TGFβ。

附图说明

图1：本图描述根据本发明一种实施方案感染鸟分枝杆菌、曼氏血吸虫或同时感染两种生物的小鼠脾细胞上清液中IFNγ、IL-4和IL-5的浓度。脾细胞(4×10⁵/孔)于37℃在200μl培养基中体外培养48小时，其中培养基中存在或缺少最适浓度的PPD或SEA。细胞因子分泌用ELISA定量。

图2：本图描述根据本发明一种实施方案感染鸟分枝杆菌、曼氏血吸虫或同时感染两种生物的小鼠肉芽肿细胞上清液中IFNγ和IL-4浓度。肉芽肿细胞(4×10⁵/孔)于37℃在200μl培养基中体外培养48小时，其中培养基中存在或缺少最适浓度的PPD或SEA。细胞因子分泌用ELISA定量。

图3：本图描述根据本发明一种实施方案感染鸟分枝杆菌、曼氏血吸虫或同时感染(共感染)两种生物的小鼠中测定的血清IgG1、IgE和IgG2a水平。免疫球蛋白浓度用ELISA测定。

图4：本图表示根据本发明一种实施方案IL-4治疗能治愈慢性H.polygyrus感染的小鼠。处死前12天开始小鼠接受三次IL-4复合物注射。数据是多次测定的平均值±SE。

图5：数据是根据本发明一种实施方案分析＞4WT小鼠/组的三次分离实验中的平均炎症评分±SD。

图6：根据本发明一种实施方案，向无IBD的WT小鼠植入H.polygyrus。对照接受假饲喂。LPMC从TI分离并在有或无抗CD3/抗CD28刺激下体外培养48小时。用ELISA测定上清液中的IFNγ。数据是2个独立实验中6次测定的平均值±SE。图7：根据本发明一种实施方案，如图2处理WT小鼠。分离的LPMC与CpG寡核苷酸一起体外培养48小时以促进IL12生成。用ELISA测定IL12。数据是2个独立实验中6次测定的平均值±SE。

图8：根据本发明一种实施方案，向无IBD的WT小鼠植入H.polygyrus。对照接受假饲喂。两周后如图2分离并培养LPMC。数据是2个独立实验中6次测定的平均值±SE。

图9：根据本发明一种实施方案，向WT小鼠植入H.polygyrus。分离LPMC并与抗CD3/抗CD28+/-αIL10R mAb下体外培养48小时。用ELISA测定上清液中的IFNγ。数据是3次独立测定的平均值±SE。

图10：根据本发明一种实施方案，向无IBD的WT小鼠植入H.polygyrus。对照接受假饲喂。两周后如图2分离并培养LPMC。数据是2个独立实验中6次测定的平均值±SE。

图11：根据本发明一种实施方案，向无IBD的WT小鼠植入H.polygyrus。对照接受假饲喂。两周后如图2分离并培养LPMC。数据是2个独立实验中6次测定的平均值±SE。

图12：根据本发明一种实施方案，向无IBD的WT小鼠植入H.polygyrus。对照接受假饲喂。两周后如图2分离并培养LPMC。LPMC从TI分离并在有或无LPS刺激下体外培养48小时。数据是3个独立实验中9次测定的平均值±SE。

图13：根据本发明的一种实施方案，用磁珠从分散的肠LPMC分离T细胞。富含T细胞(T细胞)和去除T细胞(非T)的组分在有或无抗CD3/抗CD28刺激下体外培养48小时，然后测试上清液中IFNγ。数据是2个独立实验中6次测定的平均值±SE。图

图14：根据本发明的一种实施方案，WT未感染小鼠接受来自植入H.polygyrus小鼠的2x10⁷MLN细胞。一周后从这些接受体小鼠分离LPMC并在有或无抗CD3/抗CD28刺激下体外培养48小时，然后测试上清液中IFNγ。数据是2个独立实验中6次测定的平均值±SE。

图15：根据本发明一种实施方案，向GFP WT小鼠植入H.polygyrus。两周后，这些具有蠕虫状况的GFP小鼠的MLN细胞通过I.P.注射被转入正常C57BL/6小鼠。七天后，固有层被分散并在荧光显微镜下检查GFP+T细胞。A)GFP+LP T细胞。B)光学显微镜下相同视野。

图16：根据本发明一种实施方案，IL10-/-动物从5周龄开始接受含吡罗昔康的食物。处理2周后，停止吡罗昔康并在2周后评价结肠炎。年龄相当的IL10-/-对照不接受吡罗昔康(对照)。由不知情读者(blinded reader)用0-4分量表对组织切片中结肠炎进行评分。A)对照IL10^-/-小鼠的结肠。B)年龄相当的吡罗昔康处理后的IL10^-/-小鼠的结肠。C)吡罗昔康处理后CD4+T细胞对结肠固有层的浸润(H&E 10X，IHC20X)。图中数据是5次独立实验的平均值，实验中每组5-6只小鼠。

图17：根据本发明一种实施方案，A、B和C表示未接受H.polygyrus的吡罗昔康处理小鼠中的典型结肠炎症。D、E和F表示接受H.polygyrus后2周结肠炎的改善(全部H&E，4X)。用0-4分量表对结肠炎进行评分。数据是2次独立实验中研究的11只动物的平均值±SE。

图18：根据本发明的一种实施方案，如图12所述结肠炎IL-10-/-小鼠接受H.polygyrus或假饲喂。两周后，分离LPMC并在有或无抗CD3/抗CD28刺激下(IFNγ)或与CpG寡核苷酸(IL12)一起体外培养48小时。数据是3个独立实验中8-9次测定的平均值±SE。

图19：根据本发明的一种实施方案，如图13所述处理结肠炎IL-10-/-小鼠。数据是3个独立实验中9次测定的平均值±SE。

图20：根据本发明的一种实施方案，A)从接受H.polygyrus或假饲(对照)后2周的IL10^-/-小鼠分离的MLN细胞经I.P.注射转入吡罗昔康处理的小鼠。转移后两周如图12评价结肠炎。B)从对照或定殖小鼠中分离的MLN T细胞转入(5x10⁶)结肠炎小鼠。数据是2次独立实验中每组9只小鼠的平均值±SE。

图21：根据本发明的一种实施方案，假处理或吡罗昔康处理2周之后假饲喂或H.polygyrus饲喂之后2周从IL-10^-/-小鼠分离的MLN细胞提取mRNA。Foxp3实时PCR用HPRT mRNA校正(方法)。注意：为达到阈值，表达越高需要越少PCR循环。数据是3次独立实验的平均值±SE，实验中每组用4只小鼠。

图22：根据本发明的一种实施方案，假饲喂或H.polygyrus饲喂之后2周从IL-10^-/-小鼠分离的MLN细胞提取mRNA。为达到阈值，表达越低需要越多PCR循环。数据是3次独立实验的平均值±SE，实验中每组用4只小鼠。

图23：根据本发明的一种实施方案的抗原制备方法的示意图。

具体实施方式

本发明涉及筛选改变调节性T细胞活性的寄生虫制剂的方法。

本文所用术语“蠕虫类寄生虫制剂”包括但不限于完整寄生虫、寄生虫提取物、寄生虫卵(parasite ova)、寄生虫卵提取物、寄生虫蛋(parasite egg)、寄生虫蛋提取物、寄生虫幼虫、寄生虫幼虫提取物、寄生虫尾蚴和寄生虫尾蚴提取物。“寄生虫制剂”还可以是从寄生虫及其提取物来源的分离蛋白、多核苷酸、碳水化合物或脂质。

本文所用术语“无特定病原体”适用于当已知动物没有能引起目标动物或人疾病的特定病原微生物时为本发明应用而饲养的动物。饲养无病原体动物的方法在本领域已知，例如见Brown等人编辑的参考文献：A Bibliography on the Culture and Maintenance Specific Pathogen-Free Organisms，可从以下网址获得http://www.ctsa.org/upload/publication/CTSA_116631681202959092495.pdf(经引用并入本文)。Brown等人提供在SPF环境中饲养不同农场动物和实验室动物的参考，以及建筑物设计和管理的方法和要求。SPF方法和几种潜在的相关人病毒和细菌病原体列表也见M.Michael Swindle(J.Invest.Surg.，9：267-271，1996，经引用并入本文)。

本文所用术语“调节性T细胞”表示与初始T细胞相比分泌IL-10和/或TGFβ至少增加2倍(如3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍或更多)。IL-10或TGFβ分泌的测定在本领域已知。例如可以这样测定，将细胞在有或无T细胞刺激剂如抗CD3下体外培养24或48小时，然后用细胞因子特异性ELISA测试培养上清液的这些细胞因子。此外，与其它类型T细胞(如初始T细胞)比较，本发明的调节性T细胞另外的特征是高水平FoxP3转录本。“高水平FoxP3转录本”表示与其它类型的T细胞相比至少增加4倍。FoxP3检测可通过使用实时PCR或定量PCR(如用PCR引物CCCAGGAAAGACAGCAACCTT，TTCTCACAACCAGGCCACTTG(SEQID NO.1)，和标记探针6FAM-ATCCTACCCACTGCTGGCAAATGGAGTC-TAMRA(SEQ ID NO.2)，见下述：Hori，S.，T.Nomura，and S.Sakaguchi.2003.Control of regulatory T celldevelopment by the transcription factor Foxp3.Science.299：1057-1061)。值用管家基因HPRT表达进行校正。作为替代方案，FoxP3蛋白产物Scurfin可用本领域已知的Western印迹分析检测，例如用山羊抗FoxP3(FoxP3)多克隆抗体(目录号ab2481，Novus Biologicals，Littleton，CO)。任选地，与其它T细胞(如初始T细胞)相比，所述调节性T细胞也可以制造少得多的IFNγ，即少至少2倍，优选3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍或更少。还任选地，调节性T细胞还可以用细胞浆内流动分析检测，以检测表达IL10和/或TGFβ但很少或没有IFNγ的T细胞。本文以下所述的另外任选的标志物也可以用于检测调节性T细胞或调节性T细胞的活性。

本文所用术语“初始T细胞”表示从骨髓中新鲜细胞的免疫系统生成的T细胞。初始T细胞对包含免疫系统之前从未加工抗原的新遇到病原体作出应答。初始T细胞可用本领域已知的方法鉴定(综述例如见Tough et al.，1999，Immunol Rev.170：39-47；Itano et al.，2003，Nat Immunol.4(8)：733-9；Berard et al.，2002，Immunology.106(2)：127-38)。

本文所用术语“改变调节性T细胞活性的寄生虫制剂”表示与未接触寄生虫制剂的目标物中调节性T细胞活性相比，当与目标物接触时将目标物中调节性T细胞活性改变至少40％，如50％、80％、100％、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍或更多的寄生虫制剂。可以通过监测调节性T细胞内部标志物(如转录因子如FoxP3mRNA或其蛋白质产物Scurfin、Smad7、Gata3或Tbet(Tbx21))或调节性T细胞表面标志物(如CD4、CD45RB^1o、CD45Rc、溶细胞性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、Ox40、4-1BB、CD25、CD103、CD62L、α_Eβ整合素、潜伏相关肽(LAP)或糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白(GITR)、实验性变应性脑炎(EAE)、趋化因子受体CCR5、TI-ST2)或分泌型标志物(如IL4、IL13、IL-5、IL-10、TGFβ)的水平来测定调节性T细胞活性。增加的调节性T细胞活性可用根据本领域已知方法和本文所述测定的调节性T细胞标志物水平的增加(如FoxP3、Ox40、4-1BB、CD4、CTLA-4、CD25、CD103、CD62L、αEβ整合素、LAP、GITR、EAE、CCR5、TI-ST2、IL-10、TGFβ)或降低(如D45Rc)至少40％，如50％、80％、100％、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍或更多来表示。

优选地，改变T细胞活性的寄生虫制剂改变两种或更多本文上述标志物的水平。

本文所用术语“调节性T细胞标志物的水平”表示目标物中具体调节性T细胞标志物的量，如以微克或摩尔量测定。典型地，调节性T细胞标志物是蛋白质，其量可通过本领域已知的任何蛋白质定量方法测定，例如ELISA、Western印迹、免疫沉淀、放射免疫测试或FACS分析(如见Innis et al.，(1990)Academic Press，Inc.；Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2d Edition，Sambrook，et al.(1989)；和Current Protocols in Molecular Biology(1997，Ausubel et al.，John Weley & Sons，Inc.)。也可以根据本领域已知的方法在mRNA水平测定蛋白质标志物的水平，例如Northern印迹、定量RT-PCR、微阵列分析(如见Innis et al.，(1990)Academic Press，Inc.；Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2d Edition，Sambrook，et al.(1989)；和Current Protocols in Molecular Biology(1997，Ausubel et al.，John Weley & Sons，Inc.)。

本文所用术语“目标物”涉及体外系统(如培养组织或细胞、转录/翻译提取物)或体内系统(如动物)。

优选地，所述目标物是包含动物细胞的体内系统，其中动物细胞包括人细胞。更优选地，目标物是动物。甚至更优选地，目标物是哺乳动物。还更优选地，目标物是人。

本发明还涉及预防或治疗动物中免疫应答改变而引起的疾病的方法，包括向动物施用足以预防或治疗疾病的量的蠕虫类寄生虫制剂。

本文所用术语“免疫应答改变而引起的疾病”表示由于和无疾病动物相比的免疫应答差异而使动物(如人)发生的疾病。例如，与正常无疾病动物对相同抗原的应答比较，疾病动物可以对抗原(如自身或非自身抗原)有异常(如过量或不足)的免疫应答。根据本发明，“免疫应答改变而引起的疾病”包括但不限于本文所述的Th1相关疾病或Th2相关疾病。

本文所用术语“Th1相关疾病”表示这样的疾病，其中Th1细胞支持、引起或介导疾病过程，或其中Th1细胞参与治愈或减缓疾病症状，这可以通过Th1活性的增强或降低而表现出来。“增强”是指与无疾病的另一个动物相比，疾病动物具有增加(如至少2倍，并可能5倍、6倍、8倍、10倍或更多)的Th1活性。根据本领域已知的方法，通过分泌型细胞因子(如IL-2、IFN-γ、TNFα、IgG2a、IL-12、IL-18、IL-23)水平的增加或分泌型细胞因子(如IL-4、IL-13)水平的降低，可以测定Th1活性的增强。“降低”是指与无疾病的另一个动物相比，疾病动物具有降低的Th1活性(如至少50％或2倍，并可能5倍、6倍、8倍、10倍或更低)。根据本领域已知的方法和本文所述和全部内容经引用并入本文的序列号为09/209,732、09/362,598的美国申请，通过分泌型细胞因子(如IFN-γ、TNFα、IgG2a)水平的降低或分泌型细胞因子(如IL-4、IL-13)水平的增加，可以测定Th1活性的降低。

本文所用术语“降低”可与术语“减少”互换使用，术语“增加”可与术语“增强”互换使用。

本文所用术语“Th2相关疾病”表示这样的疾病，其中Th2细胞支持、引起或介导疾病过程，或其中Th2细胞参与治愈或减缓疾病症状，这可以通过Th2活性的增强或降低而表现出来。“增强”是指与无疾病的另一个动物相比，疾病动物具有增加的Th2活性(如至少2倍，并可能5倍、6倍、8倍、10倍或更多)。根据本领域已知的方法，通过分泌型细胞因子(如IL-4、IL-5、IgE和IgG1)水平的增加，可以测定Th2活性的增强。“降低”是指与无疾病的另一个动物相比，疾病动物具有降低的Th2活性(如至少50％、2倍，并可能5倍、6倍、8倍、10倍或更低)。根据本领域已知的方法和本文所述和全部内容经引用并入本文的序列号为09/209,732、09/362,598的美国申请，通过分泌细胞因子(如IL-4、IL-5、IgE和IgG1)水平的降低，可以测定Th2活性的降低。

本文所用术语“治疗效果”表示用寄生虫制剂治疗疾病的有效性。“治疗效果”通常通过对具体疾病的临床反应来测定，所述疾病是动物已经或正在用寄生虫制剂治疗的疾病。

根据本发明有用的蠕虫类寄生虫

有用的蠕虫类寄生虫包括但不限于两类。第一类是天然定殖于人的蠕虫类寄生虫，第二类是植入动物但可提供对人的保护作用的蠕虫类寄生虫。

第一类中，蠕虫类寄生虫是具有复杂生命周期和发育的复杂多细胞蠕虫。线虫(不分节的圆形蠕虫)和扁形动物(扁蠕虫)是两类定殖于人肠道的蠕虫。根据本发明，天然定殖于人或动物的多种蠕虫类寄生虫的任一种将提供预期结果。

经常栖息于人肠的线虫是似蚓蛔线虫、蠕形住肠线虫(蛲虫)、毛首鞭形线虫(鞭虫)、十二指肠钩口线虫和美洲板口线虫(钩虫)，以及粪类圆线虫。旋毛形线虫只是侵染小肠。

扁形动物包括吸虫和绦虫。居留于人肠道的最常见成体吸虫是姜片吸虫、棘口吸虫和异形吸虫物种。生活于胆系统的那些包括华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫和猫后睾吸虫，以及肝片吸虫。血吸虫属居住于静脉系统，但几个种通过将卵传递过肠壁而慢性影响肠道。通常感染人的成年绦虫是裂头绦虫属(鱼绦虫)、无钩蛲虫(牛肉绦虫)、有钩绦虫(猪肉绦虫)和Hymenolepsis nana(短小绦虫)。

感兴趣的其它蠕虫包括丝虫寄生虫和肺吸虫。它们没有肠阶段，但刺激强Th2型应答。

第二类能用于本发明的蠕虫类寄生虫包括定殖于动物但可提供保护人免受免疫介导疾病的蠕虫。这些包括鼠鞭形线虫(鼠鞭虫)、旋毛形线虫、巴西日圆线虫、Heligmonsomoides polygyrus和Hymenolepsis nana。所有这些都是感染小鼠的肠道蠕虫。另外，管圆线虫是大鼠蠕虫。猪毛首线虫和猪蛔虫是能感染人的猪蠕虫。狐毛尾线虫、弓蛔虫、颚口线虫和钩口线虫是也能感染人的狗或猫蠕虫。异尖线虫和伪新地蛔线虫(Pseudoterranova)是能传播给人的海洋哺乳动物的线虫。鸟血吸虫能一过性感染人。这些血吸虫包括S.douthitti、Trichobilharzia ocellata、T.stagnicolae、T.physellae和Gigantobilharzia huronensis。

蠕虫制剂可以选自天然定殖于人的蠕虫和定殖于动物并可保护人或动物免受免疫应答改变引起疾病的蠕虫。

在本发明一些实施方案中，蠕虫类寄生虫是线虫，并可以选自如似蚓蛔线虫、蠕形住肠线虫、毛首鞭形线虫、十二指肠钩口线虫、美洲板口线虫、粪类圆线虫和旋毛形线虫。

在本发明的另一些实施方案中，蠕虫类寄生虫是扁形动物，并可以选自吸虫和绦虫，如姜片吸虫、棘口吸虫和异形吸虫物种、华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫、猫后睾吸虫、肝片吸虫、血吸虫属、裂头绦虫属、无钩蛲虫、有钩绦虫和Hymenolepsis nana。

在另一些实施方案中，蠕虫类寄生虫选自丝虫寄生虫和肺吸虫。

在优选实施方案中，蠕虫类寄生虫选自鼠鞭形线虫、旋毛形线虫、巴西日圆线虫、Heligmonsomoides polygyrus、Hymenolepsis nanan、管圆线虫、猪毛首线虫、猪蛔虫、狐毛尾线虫、弓蛔虫物种、颚口线虫物种和钩口线虫物种、异尖线虫物种和伪新地蛔线虫(Pseudoterranova)物种。

优选用于寄生虫产生和制备用动物饲养在无特定病原体(SPF)(如无特定人病原体)环境中。

根据本发明可治疗的疾病

根据本发明，可治疗的疾病的实例包括但不限于Th1相关的和Th2相关的疾病，包括Th1或Th2相关的癌症。

Th1相关疾病

Th1相关疾病包括以下疾病：传染病、自身免疫病、迟发型超敏反应疾病和癌症。

传染病的类别包括由寄生虫和病毒如HIV引起的疾病。

自身免疫病的类别包括脑脊髓性疾病、脱髓鞘性疾病和其它自身免疫病。

脑脊髓性疾病的实例包括但不限于多发性硬化(MS)、播散性硬化；局部性硬化；孤岛样硬化(insular sclerosis)；脊髓痨(后部硬化)；急性和慢性实验性变态反应性(或自身免疫性)脑脊髓炎(EAE)，它是MS的动物模型；急性热病性多神经炎；实验性变应性神经炎(急性热病性多神经炎的动物模型)；急性散播性脑脊髓炎；肌痛性脑脊髓炎(良性和流行性)；病毒性脑脊髓炎；肉芽肿性脑脊髓炎；等。还包括动物疾病，例如但不限于犬瘟热；猫瘟热；马脑脊髓炎(东方、委内瑞拉和西方)；禽脑脊髓炎；猪脑脊髓炎；牛脑脊髓炎；小鼠脑脊髓炎；等等。

脱髓鞘疾病的实例包括但不限于多发性硬化(MS)、散播性硬化(DS)、急性散播性脑脊髓炎、进行性多灶性白质脑病(PML)和亚急性硬化性全脑炎(SSPE)。

其它自身免疫病的实例包括多发性硬化(MS)、polyartheritis nodosaasthma、间质肺病、结节病、先天性肺纤维化、与克罗恩氏病相关的间质肺病或溃疡性结肠炎或惠普尔病、与韦格纳肉芽肿病相关的间质肺病或超敏性脉管，

脉管炎综合征、亨诺赫-舍恩莱因紫癜、古德综合征、韦格纳肉芽肿，

肾病如抗体介导的肾小球病如急性肾小球肾炎、与系统性红斑狼疮(SLE)相关的肾炎、与其它全身疾病如韦格纳肉芽肿和古德综合征和混合结缔组织病相关的肾炎、慢性间质性肾炎、慢性肾小球肾炎，

胃肠道疾病(如IBD)，如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、惠普尔病、胶原性结肠炎、嗜酸性粒细胞性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎，

肝胆疾病如自身免疫性肝炎、醇诱导性肝炎、门静脉周纤维化、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎(colangitis)，

皮肤病如牛皮癣、特应性皮炎、湿疹、变应性皮肤病、进行性系统性硬化(硬皮病)、剥脱性皮炎、寻常型天疱疮，

关节病如类风湿性关节炎(RA)、强直性脊柱炎、与牛皮癣或炎性肠病相关的关节炎，

肌肉骨骼病如重症肌无力(MG)、多肌炎，

内分泌疾病如胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎(桥本)、thyreotoxicosis、甲状腺机能亢进(格雷夫斯病)，

造血系统疾病如自身免疫性贫血、自身免疫性血小板减少症、自身免疫性再生障碍性贫血，

心血管疾病如心肌病、脉管炎、与系统性疾病如系统性红斑狼疮类、多关节炎nodosa、类风湿性关节炎、硬皮病、结节病相关的心血管疾病。

自身免疫病的值得关注的特征是家族性簇发，并与特定基因尤其是I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)基因的表达相关。例如，大部分MS患者具有HLA-DR2单倍型(Beall S S，Concannon P，Charmley P，et al.，J.Neuroimmunol.，v 21，p 59-66，1989)。因为并非所有具有易感基因型的个体都发生自身免疫病，似乎环境因素也起主要作用。例如，MS似乎在生活于温带气候区的个体中更常见(Kurtzke JF，IN：Multiple Sclerosis，Hallpike J F，Adams C W M，Tourtelotte W W，editors，Williams and Wilkins，Baltimore，Md.，1983，p 49-95)。长期以来认为自身免疫病的环境因素可能是传染因子如病毒。几种人和动物疾病的病原学可以归因于病毒感染。例如，Theiler’s小鼠脑脊髓炎是具有和EAE相似临床和病理表现的脱髓鞘疾病。尽管抗体参与自身免疫病的一些效应子应答，多数情况下触发事件开始于CD4T细胞的活化，这是B细胞成熟和克隆扩张需要的。

迟发型超敏反应的组包括与低分子量物质的接触超敏反应。

A.炎性肠病(CD和UC)

流行病学数据提示发生克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的遗传易感性。工业化社会的CD发病率从1950年代到1980年代中期一直增加，现在每年每十万人1-8例。这提示我们环境中的未知变化对CD频率有作用。

尽管IBD的病因仍未确定，但被假定为是由于肠粘膜免疫系统的失调。粘膜中的炎症细胞正常情况下保护我们免受腔内容物影响。这种高度有效的慢性炎症受到严谨调控以限制组织损伤。IBD可能是由于对腔内因素的不适当活性的免疫应答。CD似乎是产生IFN-γ和TNFα的过度活性的Th1型炎症。UC的本性还没有清楚确定。

溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)是具有复杂起源的疾病，由不确定环境暴露和至少有些情况下的易感基因遗传性的相互作用引起。经常引用的IBD遗传因素的证据是患有这种疾病的患者家族成员中具有高于预期的IBD发生率和西方国家犹太人中疾病的高度普遍性(Roth MP，Petersen GM，McElree C et al.Geographic origins of Jewish patients with inflammatory bowel disease.Gastroenterology 1989；97(4)：900-4)。然而，IBD在具有相似人种来源的以色列犹太人(Fireman Z，Grossman A，Lilos P et al.Epidemiology of Crohn′s disease in theJewish population of central Israel，1970-1980.Am J Gastro 1989；84(3)：255-8)中低得多(Grossman A，Fireman Z，Lilos P et al.Epidemiology of ulcerative colitis in theJewish population of central Israel 1970-1980.Hepato-Gastroenterology1989；36(4)：193-7)。双胞胎研究至少为CD的遗传诱因提供证据(Halfvarson J，BodinL，Tysk C et al.Inflammatory bowel disease in a Swedish twin cohort：a long-termfollow-up of concordance and clinical characteristics.Gastroenterology2003；124(7)：1767-73)。一种感受细菌产物胞壁酰二肽的细胞内蛋白质CARD15/NOD2的遗传缺陷(Inohara M，Ogura Y，Fontalba A et al.Host recognitionof bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2：implications for Crohn′sdisease.J Biol Chem 2003；Girardin SE，Boneca IG，Viala J et al.Nod2 is a generalsensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide(MDP)detection.JBiol Chem2003)使有些人更易患CD。各种其它遗传变化也被提出作为IBD风险因子。然而，遗传诱因不能解释迅速增加的疾病发病率。

有几种慢性肠炎症的动物模型，例如Elliott等人(Elliott et al.，1998，Inflammatory Bowel Disease and Celiac Disease.In：The Autoimmune Diseases，Third ed.，N.R.Rose and I.R.MacKay，eds.Academic Press，San Diego，CA)报告。重要进展是最近发现：具有遗传工程基因删除的有些小鼠能发生与IBD相似的慢性肠炎症，见Elson et al.，1995，Gastroenterology 109：1344。这些包括携带靶向缺失IL-2、IL-10、II类MHC或TCR基因的突变小鼠。使用其中一些模型，Berg et al.，1996，J.of Clin.Investigation 98：1010，Ludviksson et al.，1997，J.of Immunol.158：104和Mombaerts et al.，1993，Cell 75：274已经发现免疫系统自身失调能介导肠损伤。这些模型中几种的粘膜炎症产生大量IFN-γ和TNF-α，提示过量生成Th1型细胞因子是疾病病理发生的一种共同机制。另外，阻断Th1回路防止炎症。CD是Th1应答。因此，这些模型已经直接反映了该人类疾病过程的免疫病理学。

B.类风湿性关节炎(RA)

RA是具有持续性炎性滑膜炎特征的慢性疾病，通常以对称分布影响周围关节。这种炎症能导致骨侵蚀、软骨损伤和关节破坏。群体中约1％受其影响。发病率随年龄增加，女性比男性更易受影响。RA的传播是由CD4+Th1细胞驱动的免疫介导事件。

C.胰岛素依赖的、儿童糖尿病(DM)(I型)：

I型DM是通常在成年早期开始的疾病，起因于不能对血糖增加应答而生成胰岛素。这种持续高血糖和不能恰当代谢葡萄糖引起代谢紊乱，最终破坏眼、肾、心和其它器官。注射胰岛素可部分控制这些代谢问题。I型DM起因于对胰脏β细胞自身免疫攻击，所述胰脏β细胞是胰岛素的来源。活化的巨噬细胞和细胞毒性T细胞围绕并破坏胰脏β细胞。遗传易感性和未明确的环境事件触发疾病过程。

D.红斑狼疮(LE)

LE是系统性自身免疫病，最常发生于成年早到中期的女性。自身抗体和超反应性调节性T细胞引起组织破坏。异常免疫应答允许持续产生致病性自身抗体和免疫复合物。这导致肌肉骨骼、皮肤、血液、肾和其它系统的破坏。异常免疫应答可能依赖于多种遗传和环境因素的相互作用。

E.结节病

结节病是肺和其它器官的未知原因的慢性肉状瘤疾病。多数患者年龄在20-40岁。最常见的症状是呼吸短促。疾病起因于可能针对有限数目抗原的过度Th1型细胞免疫应答。结节病在全世界发生，影响所有种族。然而，在某些民族和种族中结节病发病率具有显著多样性。例如，该病在波兰、东南亚和印度少见。

F.多发性硬化(MS)：

MS是中枢神经系统的慢性复发性、多病灶炎症，导致脑的局部脱髓鞘和疤痕。它是影响约350,000美洲人的频发疾病，在成年早到中期开始。MS是至少部分由Th1细胞介导的自身免疫病。MS损伤与含活化T细胞和巨噬细胞的迟发型超敏反应诱导的损伤相似。它是温带气候的疾病，发病率随与赤道的距离而增加。

Th2相关疾病

Th2相关疾病包括下组的疾病：变应性疾病和癌症。

众所周知具有遗传诱因的个体对来源于个体所暴楼的多种环境的抗原敏感(变应性)。已经被敏化的个体再次暴露于相同和同源变应原时发生变态反应。变态反应范围从枯草热、rhinoconductivitis、鼻炎和哮喘到对例如蜜蜂和胡蜂叮和昆虫咬作出反应的全身性过敏反应和死亡。反应是即发的，能由多种特应性变应原引起，这些变应原如来源于草、树、杂草、昆虫、(居室尘)螨、食物、药物、化学品和香水的化合物。

变应性疾病的组包括枯草热、rhinoconductivitis、鼻炎和哮喘。

发生变态反应的最常见的变应原包括吸入变应原，例如来源于树、草、药草(herb)、真菌、居室尘螨、储螨、蟑螂和动物毛发、羽毛和皮屑。树、草和药草的重要的花粉变应原起源于分类学上的壳斗目、木犀目和松杉目，即包括桦(桦属)、桤木(桤木属)、榛(榛属)、鹅耳枥(鹅耳枥属)和橄榄(木犀榄属)；禾本目，即包括黑麦草属、梯牧草属、早熟禾属、狗牙根属、鸭茅属和黑麦属的草本；菊目和荨麻目，即包括豚草属和蒿属的药草。真菌的重要吸入变应原例如来源于链格孢属和支孢属。其它重要的变应原是来自尘螨属的居室尘螨、Lepidoglyphys destructor属的储螨，来自蟑螂和哺乳动物如猫、狗、马、牛和鸟的变应原。另外，也经常观察到对叮咬昆虫的变态反应，所述叮咬昆虫如膜翅目，包括蜜蜂、黄蜂和蚂蚁。具体变应原成分对本领域技术人员已知，最常见的包括例如壳斗目的Bet v 1(白桦，桦)、Aln g 1(欧洲桤木，桤木属)、Cor a 1(欧榛，榛)和Car b 1(欧洲鹅耳枥，鹅耳枥)。其它有Cry j 1(松杉目)、Amb a 1和2、Art v 1(菊目)、Par j 1(荨麻目)、Ole e 1(木犀目)、Ave e 1、Cyn d 1、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1和5、Pas n 1、Phi p 1和5、Poa p 1、2和5、Sec c 1和5、Sor h 1(各种草花粉)、Alt a 1和Cha h 1(真菌)、Der f 1和2、Der p 1和2(居室尘螨，分别是粉尘螨和屋尘螨)、Lep d 1、Bla g 1和2、Per a 1(蟑螂，分别是德国小蠊和美洲大蠊)、Fel d 1(猫)、Can f 1(狗)、Equ c 1、2和3(马)、Apis m 1和2(蜜蜂)、Ves g 1、2和5、Pol a 1、2和5(所有黄蜂)和Sol i 1、2、3和4(火蚁)。

A.哮喘

很多人中，哮喘似乎是对通过呼吸空气而经常遇到的物质产生的变态反应，所述物质如动物毛皮屑、花粉，或尘螨和蟑螂排泄物。这些物质的总括性名称是变应原，是指引起变态反应的任何物质。有些人对某些变应原反应有遗传诱因。1998年，估计一千七百万美洲人或人口的6.4％发生哮喘。在发生哮喘的美洲人中儿童占四百八十万。动物模型以及人哮喘病理的临床信息来源的可用实验和临床信息指出Th2细胞与该疾病的病因有关。

Th1和Th2相关的癌症

一般来说，癌细胞可引起对癌细胞特异性表达抗原的免疫应答。因为Th1和Th2免疫应答可以产生强炎症反应，导致细胞毒性根除组织，调节Th1或Th2免疫应答可用于治疗癌症。

可用本发明组合物治疗的癌症可以被组织遗传学分为恶性上皮肿瘤和恶性非上皮肿瘤，所述恶性上皮肿瘤包括癌和腺癌，所述恶性非上皮肿瘤包括脂肪肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、恶性黑素瘤、恶性脑膜瘤、多种白血病、多种骨髓增生性疾病、多种淋巴瘤(何杰金淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤)、血管肉瘤、卡波希肉瘤、淋巴管肉瘤、恶性畸胎瘤、无性细胞瘤、精原细胞瘤和绒毛膜癌。癌和腺癌最常见(占癌症死亡的约90％)，因此是根据本发明治疗/预防的感兴趣的目标疾病。最重要的癌和腺癌来自气道(尤其支气管来源)、乳房、结直肠和胃。然而，前列腺、卵巢、淋巴组织和骨髓、子宫、胰脏、食管、膀胱和肾的癌和腺癌也引起大量的死亡，因此也受到关注。

癌症疾病的类别还包括赛塞利综合征、皮肤T细胞淋巴瘤、肝癌和肺癌。

Th1或Th2相关疾病中的调节性T细胞

调节性T细胞能诱导周围耐受并限制粘膜反应性(McGuirk P，Mills KH.Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm inimmunity to infectious diseases.Trends Immunol 2002；23(9)：450-5)。在多种动物模型中，已经报告了几种调节性T细胞表型。调节性T细胞表达多种标志物并已经被指出参与不同疾病(例如见Field，A.C.，L.Caccavelli，M.F.Bloch，and B.Bellon.2003.Regulatory CD8+ T cells control neonatal tolerance to a Th2-mediated autoimmunity.Journal of Immunology.170：2508-2515；von Herrath MG，Harrison LC.Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity.Nat Rev Immunol.2003Mar；3(3)：223-32；Francois Bach J.Regulatory T cells under scrutiny.Nat RevImmunol.2003 Mar；3(3)：189-98；Curotto de Lafaille MA，Lafaille JJ.CD4(+)regulatory T cells in autoimmunity and allergy.Curr Opin Immunol.2002Dec；14(6)：771-8；McGuirk P，Mills KH.Pathogen-specific regulatory T cells provoke ashift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases.Trends Immunol.2002 Sep；23(9)：450-5；Tung KS，Agersborg SS，Alard P，Garza KM，Lou YH.Regulatory T-cell，endogenous antigen and neonatal environment in the prevention andinduction of autoimmune disease.Immunol Rev.2001 Aug；182：135-48；Read S，PowrieF.CD4(+) regulatory T cells.Curr Opin Immunol.2001 Dec；13(6)：644-9；Yssel H，Lecart S，Pene J.Regulatory T cells and allergic asthma.Microbes Infect.2001Sep；3(11)：899-904)。在一些系统中，它们通过差异表达表面分子如CD25而得以区分(Shevach，E.M.2002.CD4+ CD25+ suppressor T cells：more questions than answers.Nature Reviews.Immunology.2：389-400)、CD45RB(Annacker，O.and F.Powrie.2002.Homeostasis of intestinal immune regulation.Microbes & Infection.4：567-574)、和CTLA-4(Read，S.，V.Malmstrom，and F.Powrie.2000.Cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function ofCD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation.J.Exp.Med.192：295-302)。这种细胞表面蛋白表达模式提示它们可以处于引发的效应或记忆状态。这些调节性细胞可以通过产生IL10和TGFβ介导它们的一些作用。描述的是产生高水平IL10和TGFβ的无反应性调节性T细胞(Tr1)。另一种称为Th3的细胞通过产生TGFβ抑制实验性自身免疫脑脊髓炎。还有另外的细胞不依赖于可溶性IL10或TGFβ，而是在其表面表达潜伏相关肽，它是TGFβ前体肽的氨基端结构域(OidaT，Zhang X，Goto M et al.CD4+CD25- T cells that express latency-associated peptideon the surface suppress CD4+CD45RB high-induced colitis by a TGF-beta-dependentmechanism.J Immunol 2003；170(5)：2516-22)。调节性T细胞的内部细胞标志物也已报道(Schubert LA，Jeffery E，Zhang Y，Ramsdell F，Ziegler SF，Scuifin(FOXP3)actsas a repressor of transcription and regulates T cell activation.J Biol Chem.2001 Oct5；276(40)：37672-9)。所有参考经引用并入本文。

用CD4+、CD45^高T细胞重构的Rag小鼠能发生严重结肠炎，这能通过共转移CD4+、CD45^低T细胞预防(Annacker O，Powrie F.Homeostasis of intestinal immuneregulation.Microbes & Infection 2002；4(5)：567-74)。保护作用需要TGFβ和IL10提示这些细胞因子在调节过程中的作用。

根据本发明的蠕虫类寄生虫制剂

蠕虫是寄生动物(虫)，根据物种，生活于宿主的肠腔、血流或肌肉之类的位置。这些生物定殖于世界人口的超过1/3。蠕虫定殖在生活于温暖气候和卫生条件差的儿童中最常见。这些生物的感染形式通过与污染土壤、食物或水的接触而传播。1940年代之前，美国的很多儿童和成年人携带蠕虫。携带虫在南方的乡村地区和大城市的贫困人口中特别常见(Elliott DE，Urban JF，Jr.，Argo CK et al.Does the failure toacquire helminthic parasites predispose to Crohn′s disease？FASEB J2000；14(12)：1848-55)。在美国和欧洲，蠕虫定殖稳定地降低。它们在来自较不发达的新移民(Salas SD，Heifetz R，Barrett-Connor E.Intestinal parasites in CentralAmerican immigrants in the United States.Arch Intern Med 1990；150(7)：1514-6)和生活于美国缺少服务地区如一些印第安保留地的经济贫穷人口(Healy GR，Gleason NN，Bokat R et al.Prevalence of ascariasis and amebiasis in Cherokee Indian schoolchildren.Public Health Rep 1969；84(10)：907-14)中发现。蠕虫发病率在温暖气候和生活于拥挤、卫生差和不洁食物供应的人口中最高。炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎和自身免疫病在这些相同地区少见。

经常栖息于人肠道的线虫是似蚓蛔线虫、蠕形住肠线虫(蛲虫)、毛首鞭形线虫(鞭虫)、十二指肠钩口线虫和美洲板口线虫(钩虫)，以及粪类圆线虫。旋毛形线虫只是侵染小肠。

扁形动物包括吸虫和绦虫。居留于人肠道的最常见成体吸虫是姜片吸虫、棘口吸虫和异形吸虫物种。生活于胆系统的那些包括华支睾吸虫、麝猫后睾吸虫和猫后睾吸虫和肝片吸虫。血吸虫属居住于静脉系统，但几个种通过将卵传递过肠壁而慢性影响肠道。通常感染人的成年绦虫是裂头绦虫属(鱼绦虫)、无钩蛲虫(牛肉绦虫)、有钩绦虫(猪肉绦虫)和Hymenolepsis nana(短小绦虫)。

宿主通过接触被这些寄生虫的感染形式污染的土壤、食物或水而获得多种蠕虫。儿童最经常蠕虫感染，这是因为他们与土壤和非最佳卫生实践的紧密接触。蠕虫激发肠Th2应答，这能引起驱虫或限制感染程度。生活于非工业化国家的多数儿童有这些寄生虫。很多蠕虫在肠、胆管树或肠系膜静脉中存活多年，每天产生成千上万的卵。因而，从儿童期开始这些虫和/或其卵释放分子，它们浸浴肠粘膜表面多年，激发Th2型炎症。

A.活生物疫苗：

活蠕虫类寄生虫生物可以提供最有前景的粘膜训练，这是因为与成分疫苗相比它们相对长寿。根据蠕虫类型，活生物能以卵、幼虫、尾蚴或被囊幼虫形式施用。可以利用能定殖于人和制备用动物的蠕虫。

制备用动物可能需要操作使得向蠕虫高度开放。这种操作可以包括用免疫抑制剂如糖皮质激素或硫唑嘌呤，用阻止Th2作用的因子如抗组胺剂、抗细胞因子或重组细胞因子，和影响肠动力的因子如抗胆碱能药物或阿片进行处理。动物饮食将被改变以减少粗纤维成分。动物可以是大鼠、猪、仓鼠、鸟或其它制备用动物。

根据本领域已知方法，制备用动物饲养于无特定病原体(SPF)(如无人特定病原体)环境中。对它们进行测试以确保没有人细菌、分枝杆菌和病毒病原体。在SPF环境中饲养动物的方法及其优点已在本领域描述，例如M.Michael Swindle (J.Invest.Surg.，9：267-271，1996，经引用并入本文)。Swindle还列举了几种潜在的相关人病毒和细菌病原体。因此，来自饲养于无特定人病原体环境中的动物的寄生虫制剂将不含有这些人病原体，从而是可专利地区别于由饲养于任意SPF环境的动物制备的寄生虫制剂。

卵：一些肠蠕虫通过摄入活卵获得。蠕虫在SPF制备用动物如SPF猪中维持。为了收获卵，向动物给予低粗纤维的特殊饮食。向动物给予口服通便剂以诱导排便。收集粪便并酶促消化成游离的卵。通过密度梯度浮选、筛网过滤、Visser过滤或离心淘析从液化粪便中分离卵。卵的保存根据所用蠕虫类型而定。干燥抗干燥的蠕虫卵，与惰性物质复合，装入肠溶胶囊，并冷藏。对干燥敏感的蠕虫卵在液体介质中冷藏保存或通过加入冷冻保护剂并在液氮中冷冻保存。在递送位置洗涤活卵，并与冰冷的无乳糖布丁或其它载体混合。保存于甘油基冷冻保护剂中的卵不需要洗涤。测试每批卵的孵化率以确定有效剂量。测试每批卵没有细菌或病毒病原体。

幼虫：一些蠕虫(即钩虫)在定殖于人之前需要土壤成熟阶段。这些因子的卵将在最适条件下孵育以使胚胎成熟，或孵化卵并提供幼虫形式。可以经皮下注射或口服摄入活幼虫而接种患者。

尾蚴：一些蠕虫有复杂生命周期，要利用中间宿主。中间宿主提供能定殖于人的形式。尾蚴是由中间宿主如蜗牛提供的绦虫蠕虫形式。从生长于SPF条件下的定殖蜗牛分离尾蚴。洗涤尾蚴。加入冷冻保护剂并在液氮中冷冻保存。洗涤解冻的或新鲜尾蚴，并皮下注射接种患者。测试每批样品没有病原体并确定有效剂量。

被囊幼虫：一些蠕虫(如绦虫)在中间宿主中形成被囊幼虫或囊尾蚴。正是被囊幼虫形式启动人定殖。从生长于SPF条件下的中间宿主如牛或鱼或植物取出被囊幼虫。洗涤包囊去除残余宿主组织。包囊可通过加入冷冻保护剂并在液氮中冷冻保存。在递送位置解冻包囊或使用新鲜包囊，洗涤，与冰冷的无乳糖布丁或其它载体混合，并给予个体。测试每批样品没有病原体并确定有效剂量。

B.非活性成分疫苗：

蠕虫类寄生虫的非活性成分提供足以预防Th1介导疾病的Th2免疫应答训练。非活性成分来自卵、幼虫或成虫。

非活性、完整血吸虫卵产生强Th2应答。从生长于SPF条件下的制备用动物(即仓鼠)的肝分离卵。分离卵的方法由Coker and Lichtenberg，1956，Proceedings of the Soc.For Exp.Biol.& Med.92：780原始描述的方法改进而来。改进包括：使用含葡萄糖的磷酸盐缓冲液代替1.7％盐水用于孵育和洗涤步骤，并降低自裂解消化时间。这些改变促进分离活卵。所述方法如下：

用1000-1500个尾蚴感染黄金鼠。允许感染至成熟(6-7周)。取出动物肝，并放置于600mOsm无菌磷酸盐缓冲液中，所述磷酸盐缓冲液中还含有5％葡萄糖、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。室温自消化肝24小时。在冷Waring混合器中低速脉冲匀浆肝3分钟。匀浆物与胶原酶(2mg/ml)和胰蛋白酶(2mg/ml)在32℃一起孵育1小时。用50和80-100目筛过滤匀浆物以除去组织块和碎片。通过325目筛从滤液中回收卵。卵将不通过筛。从筛上冲掉卵并冲入50ml聚丙烯离心管。经重复低速离心(400x g)在含5％葡萄糖的无菌磷酸盐缓冲液中洗涤卵。卵必须没有任何胶原性碎片。计数1ml Sedwick室中的一份卵以确定总卵数。

分离卵悬于盐水中，不加冷冻保护剂在液氮中快速冷冻。这将杀死卵。解冻的卵经皮下、肌内或静脉注射或在Th1炎症部位注射，以诱发强Th2应答。也可使用其它蠕虫的卵。

也可使用成分疫苗，其利用从寄生虫卵分离的蛋白质、脂质或碳水化合物。血吸虫可溶性卵抗原(SEA)是一个实例。制备血吸虫卵抗原的方法已经描述于Borosand Warren，1970，J.of Experimental Med.132：488，并在以下简述。

洗涤后的卵以50,000卵/ml重悬于磷酸盐缓冲液中。将其转入玻璃组织匀浆器。在冰上匀浆卵。为确认破碎所有壳并破坏毛蚴，取一份(5ml)进行显微检查。将匀浆物转入超离心管。在4℃以100,000x g离心2小时。回收水相组分(SEA)并测定蛋白质含量。以小份将SEA保存于-70℃。这种方法可能需要修改以分离最强烈促进Th2训练的寄生虫卵产物，即达到最佳有效浓度(100μg SEA或10,000卵/动物)。卵或可溶性卵成分用于引发Th2应答或增强已通过定殖活蠕虫而引发的Th2应答。测试卵或卵成分以确认没有病原体和内毒素。

也可从蠕虫类寄生虫的幼虫和成虫开发成分疫苗。从生长于SPF条件的制备用动物分离幼虫或虫。制备利用非活性完整生物或分离自蠕虫的蛋白质、脂质或碳水化合物的疫苗，以与前述蠕虫卵相似的方式使用。

本发明还涉及含蠕虫类寄生虫组分或亚组分的疫苗，以及含分离蛋白质、多核苷酸、碳水化合物、脂质等的疫苗，所述分离物质根据本领域已知方法来自蠕虫类寄生虫，例如描述于Williams et al.，1994，Leukocytes of patients with Schistosomamansoni respond with a Th2 pattern of a cytokine production to mitogen or egg antigensbut with a Th0 pattern to worm antigens.J.Infect.Dis.170：946；Xu-Amano et al.，1993，Helper T cell subsets for immunoglobulin A responses：oral immunization withtetanus toxoid and cholera toxin as adjuvant selectively induces Th2 cells in mucosaassociated tissues.J.Exp.Med.178：1309；Ausiello et al.，2000，Cell mediated immunityand antibody responses to Bordetella pertussis antigens in children with a history ofpertussis infection and in recipients of an acellular pertussis vaccine.J.infect.Dis.，181：1989。

例如，组分或亚组分可根据Thaumaturgo et al.(2001，Preliminary Analysis ofSm14 in Distinct Fractions of Schistosoma mansoni Adult Worm Extract，Mem.Inst.Oswaldo Cruz vol.96 suppl.Vol.96，Suppl.：79-83，全部内容通过引用并入本文)中所述方法制备。在此方法中，通过在感染后45天用肝素化盐水(0.85％NaCl溶液)倒灌(Pellegrino & Siqueira 1956，Técnica depara colheita de Schistosomamansoni em cobaias experimentalmente infectadas.Rev Bras Mal D Trop 8：589-597)获得曼氏血吸虫寄生虫，并用于制备不同提取物。

—制备成虫来源的提取物(SE)-用PBS漂洗寄生虫。然后使活虫在新鲜PBS(磷酸盐缓冲液)中室温(28℃-30℃)静置2-3小时，并在-20℃冷冻。解冻后，虫的PBS悬液(1g虫/10ml PBS)用丝网过滤，并在4℃于10,000g离心1小时(Tendler& Scapin 1981，Schistosoma mansoni antigenic extracts obtained by different extractionprocedures.Mem Inst Oswaldo Cruz 76：103-109；Tendler et al.1982，Immunogeneand protective activity of an extract of Schistosoma mansoni.Mem Inst Oswaldo Cruz77：275-283)。用Lowry方法测定SE的蛋白质含量(Lowry et al.1951)，含1mg/ml的储存批保存于-20℃。根据相同方法用灌注后立即分离的寄生虫制备雄性和雌性提取物。

制备成虫来源提取物的快速释放“组分”(SEi)-SEi制剂对应SE的SE的起始步骤：如SE所述灌注以后，活虫在PBS中室温(28℃-30℃)孵育2-3小时。此后，从孵育溶液(SEi)经丝网过滤成虫。

制备SE2-从SE起始制剂保留成虫，并重新冷冻(-20℃)保存于PBS中1周(1g虫/10ml PBS)。解冻以后经丝网过滤PBS悬液，并在4℃以10,000g离心1小时。

寄生虫抗原也可以如Thaumaturgo等人(同上)的图1(复制为图23)所述提取。作为替代方案，寄生虫抗原可以如Deelder et al.(1980.Applicability of differentantigen preparations in the enzyme-linked immunosorbent assay for schistosomiasismansoni.Am.J.Trop.Med.Hyg.29：401-410)中所述制备。例如，可从生命周期各阶段的缓冲盐匀浆物液制备作为可溶性上清液的SWAP，再从SWAP制备抗原(Goeset al.1989，Production and characterization of human monoclonal antibodies againstSchistosoma mansoni.Parasite Immunol 11：695-711)。在FPLC(快速蛋白质液相层析)上经阴离子交换层析对SWAP进行分级，如前所述(Hirsch & Goes 1996，Characterization of fractionated Schistosoma mansoni soluble adult worm antigens thatelicit human cell proliferation and granuloma formation in vitro.Parasitology 112：529-535)。简单的说，以多步骤增加梯度直至1M NaCl，在0、100、280、450、600和750mM间以恒定梯度间隔，用20mM Tris-HCl，pH9.6洗脱蛋白质。流出组分经冻干浓缩。浓缩物对0.15M磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.4透析，过滤除菌并保存于-70℃。根据Bradford微量测试测定蛋白质含量(Bradford 1976，A rapid andsensitive method for the quantiffcation of microgram quantities of protein utilizing theprinciple of protein-dye binding.Analyt Biochem 72：248-254，全部内容经引用并入本文)。在还原条件下经10％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析六种级分(Laemmli 1970，Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4.Nature 227：680-685，全部内容经引用并入本文)，显示多个蛋白质带，含高(97和160KDa)、中(52和56KDa)和低(28和36KDa)蛋白质的组分III。该级分被称为PIII并用于不同免疫测试。

也可如本领域所述制备脂质，例如见van der Kleij et al.(1999，Recognition ofSchistosome Glycolipids by Immunoglobulin E：Possible Role in Immunity Infectionand Immunity，67：5946-5950，其全部内容经引用并入本文)。

在一个实施方案中，曼氏血吸虫成虫(12g[湿重])和卵(1.6g[湿重])的脂质用Bligh和Dyer(1959.A rapid method of total lipid extraction and purification.Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917)所述方法提取。旋转蒸发干燥有机相，溶于10ml氯仿中，加到转化成羟基形式的20ml阴离子交换柱TEAE-纤维素(Serva，Heidelberg，Germany)上。如Rouser等人(1969.Diethylaminoethyl and triethylaminoethyl cellulosecolumn chromatographic procedures for phospholipids，glycolipids，and pigments.Methods Enzymol.14：272-317)所述洗脱脂质。根据这种方法，所述级分含以下脂质：级分1：胆固醇、甘油酯和其它中性脂；级分2：脑苷脂、甘油甘油二酯、磷脂酰胆碱和鞘磷脂；级分3：神经酰胺聚己糖苷(ceramidepolyhexosides)；级分4：无机物；级分5：磷脂酰乙醇胺和游离脂肪酸；级分6：磷脂酰丝氨酸；级分7：无(洗涤步骤)；和级分8：磷脂酸、心磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和其它酸性脂。经在HPTLC板上对脂组分进行地衣酚染色，确认在级分2和3中存在糖脂(1956.Quantitative estimation of cerebrosides in nervous tissue.J.Neurochem.1：42-53)。

C.维持蠕虫生物：

蠕虫经生长于SPF条件的中间和制备用动物循环。测试蠕虫群体的样品以确保表型稳定性，如定殖率、繁殖力和对抗蠕虫剂的易感性。

剂量、给药和药物剂型

根据所选寄生虫的自然生命周期，需要治疗的个体经口或非胃肠道接受感染形式的寄生虫(卵、尾蚴或幼虫)。作为替代方案，可以经口或非胃肠道给予可溶性虫或卵提取物以诱导TH2应答。

对于肠和肝蠕虫和血吸虫，接种后约30-60天它们开始产卵，这些卵出现于粪便中。粪便中卵的定量证实评价感染程度和强度是令人满意的。取小份粪便经蔗糖浮选处理以确定每个样品中的总卵数。蔗糖溶液浮选是经常用于从粪便中分离卵以精确计数的方法，报道于Koontz and Weinstock，1996，Gastroenterology Clinics of N. America，25：435。

本发明的蠕虫类寄生虫化合物可以配制用于以任何方便的方式给药，因此本发明在其范围内包括根据本发明适用于人的含有所述蠕虫类寄生虫化合物的药物组合物。可以在任何必要的药物载体或赋形剂的辅助下使这些组合物以常规方式使用。

根据本发明的蠕虫类寄生虫化合物可以配制成注射剂，因此用于疫苗，并可以单位剂量形式在安瓿中或多剂量容器中提供，必要时添加防腐剂。所述组合物还可以采用这些形式：悬剂、油性或水性载体的溶液或乳液，并可以含有配方试剂如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。作为替代方案，蠕虫类寄生虫可以是粉末形式或在使用前用合适的载体如无菌无热源水重构。

必要时这些粉末制剂可以含有适当的无毒基质以确保粉末用水重构时，所得水性制剂的pH是生理接受的。

蠕虫类寄生虫化合物还可以配制成栓剂，如含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯的栓剂。

蠕虫类寄生虫化合物还可以用常规填料、载体和赋形剂配制成口服剂型。向需要的个体给予的寄生虫的量是足以预防或治疗自身免疫病的量。无论是完整的给予还是以卵、幼虫、提取物或尾蚴给予，此量都可根据待治疗或预防的疾病和蠕虫类寄生虫而变化。

典型地，当施用寄生虫用于本文讨论的所有自身免疫病时，所述量为约50-约50,000。更具体地，此量可以是约500-约5,000。当用卵时，可以使用约500-约5000用于治疗本文公开的自身免疫病。当施用提取物时，使用约100μg-约10,000μg来治疗自身免疫病。当施用幼虫或尾蚴时，各情况下剂量可以是约500-约5,000。

对于预防或疫苗应用，寄生虫的量可以是500-5,000。

寄生虫制剂的剂量可以通过测定Th1、Th2或调节性细胞应答来监测。作为替代方案，可以如本领域已知或本文所述通过评价具体疾病的病理或症状来监测剂量。

A.测定Th1和Th2应答

为显示本发明的效果，可以区分Th1和Th2应答。Metawali et al.，1996，J.of Immunol.157：4546已经表明在小鼠中可以通过组织学分析以及细胞因子和免疫球蛋白谱分析来区分Th1和Th2应答。另外，Sandor et al.，1990，J.of Exp.Med.171：2171已经表明细胞表面表达Fcg3和II类MHC分子提供区分。在该方法中，组织学检查小肠和结肠以确定粘膜炎症、嗜酸性粒细胞过多和肥大细胞增多。后面的细胞类型是Th2应答的指征。肠系膜淋巴结(MLN)和脾可以解离成单细胞悬液，用于在微孔板中体外培养。细胞(1-2x10⁶/细胞)在完全RPMI培养基中培养可达72小时，培养基中可存在或没有虫抗原或抗CD-3，然后测试悬液中细胞因子和免疫球蛋白。IFN-γ、TNF-α和IgG2a是Th1应答的特征，而IL-4、IL-5、IgE和IgG1是Th2反应的典型表现。另外，可测试血清中细胞因子和免疫球蛋白浓度。此外，用流式细胞术检查分散的炎症白细胞，分析巨噬细胞上Fcγ3表达(Th1)和B细胞上II类MHC表达(Th2)。对照包括适当年龄相当的、同窝出生的、不携带寄生虫的小鼠血清、MLN和脾。

类似分析可区分人Th1和Th2应答。检查发炎组织、从炎症区域分离的白细胞和外周血细胞。体外单独培养白细胞，或在寄生虫抗原或丝裂原存在下培养白细胞以刺激细胞因子释放。IgG2替换IgG2a。

B.测定调节性T细胞活性

本领域已知从体外培养物或动物分离调节性T细胞的方法，例如下述：McGuirkP，Mills KH.Pathogen-specific regulatory T cells provoke a shift in the Th1/Th2paradigm in immunity to infectious diseases.Trends Immunol 2002；23(9)：450-5；Field，A.C.，L.Caccavelli，M.F.Bloch，and B.Bellon.2003.Regulatary CD8+ T cells controlneonatal tolerance to a Th2-mediated autaimmunity.Journal of Immunology.170：2508-2515；von Herrath MG，Harrison LC.Antigen-induced regulatory T cells inautaimmunity.Nat Rev Immunol.2003 Mar；3(3)：223-32；Francois Bach J.RegulatoryT cells under scrutiny.Nat Rev Immunol.2003 Mar；3(3)：189-98；Curotto de LafailleMA，Lafaille JJ.CD4(+) regulatory T cells in autoimmunity and allergy.Curr OpinImmunol.2002 Dec；14(6)：771-8；McGuirk P，Mills KH.Pathogen-specific regulatory Tcells provoke a shift in the Th1/Th2 paradigm in immunity to infectious diseases.Trends Immunol.2002 Sep；23(9)：450-5；Tung KS，Agersborg SS，Alard P，Garza KM，Lou YH.Regulatory T-cell，endogenous antigen and neonatal environment in theprevention and induction of autoimmune disease.Immunol Rev.2001 Aug；182：135-48；Read S，Powrie F.CD4(+) regulatory T cells.Curr Opin Immunol.2001Dec；13(6)：644-9；Yssel H，Lecart S，Pene J.Regulatory T cells and allergic asthma.Microbes Infect.2001 Sep；3(11)：899-904；Shevach，E.M.2002.CD4+ CD25+suppressor T cells：more questions than answers.Nature Reviews.Immunology.2：389-400；Annacker，O.and F.Powrie.2002.Homeostasis of intestinal immuneregulation.Microbes & Infection.4：567-574；Read，S.，V.Malmstrom，and F.Powrie.2000.Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the functionof CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation.J.Exp.Med.192：295-302。

可用本文所述的内部标志物、细胞表面标志物或分泌型标志物测定调节性T细胞应答或活性。

对于调节性T细胞有用的内部标志物包括但不限于转录因子，如Scurfin、Smad7、Gata3、Tbet(Tbx21)。

对于调节性T细胞有用的表面标志物包括但不限于CD4、CD45RB^1o、CD45Rc、溶细胞性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、CD25、CD103、Ox40、4-1BB、CD62L、αEβ整合素、潜伏相关肽(LAP)或糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白(GITR)、趋化因子受体CCR5、TI-ST2。

对于调节性T细胞有用的分泌型标志物包括但不限于IL-5、IL-10和TGFβ。

C.体外测定标志物量的方法的非限制性实例

流式细胞术检测细胞因子：RPMI完全培养基中的脾细胞、MLN或肠炎症细胞以2x10⁶细胞/孔放入24孔组织培养板中。在存在或缺少抗CD3或适当抗原下与10μg/ml的布雷菲德菌素一起孵育细胞4-6小时。布雷菲德菌素防止蛋白质的细胞外排并促进细胞因子在细胞内积累。对于细胞浆细胞因子检测，室温下在2％多聚甲醛中固定细胞5分钟，随后表面染色以区分细胞亚型。洗涤细胞并重悬于50μl PBS，其中含0.2％皂素和1μg抗细胞因子抗体，在室温孵育20分钟。接下来，在皂素中洗涤细胞两次并重悬于PBS/FCS中。用过量的相同同种型和细胞因子特异性的未偶联抗体预封闭，或细胞与重组细胞因子一起孵育，确认细胞因子抗体染色的特异性。也包括藻红蛋白(PE)标记的不相关抗体对照，用于评价背景染色。用流式细胞术分析细胞。

ELISA：如上述操作经ELISA测定培养于微滴定板中细胞的细胞上清液中的细胞因子和抗体浓度。很多这些测试在我们实验室已经是常规操作。用两种单克隆抗体(mAb)在两位点夹心ELISA中测试细胞因子。经铵沉淀从分泌抗体的杂交瘤克隆的上清液中纯化抗细胞因子mAb。微滴定板包被50μl含1μg/ml包被抗体的含Tween 20的PBS中(PBS-T)，在4℃孵育过夜。然后加入150μl含10％FCS的PBS，在37℃孵育30分钟。标准品含重组细胞因子或含细胞因子的丝裂原或抗原活化的脾细胞的上清液，所述脾细胞来自感染血吸虫病的小鼠。用含10％FCS的RPMI(完全RPMI)在相独立的96孔平底微滴定板中制备样品和标准品稀释液，转移50μl体积到已经用PBS-T洗涤三次的ELISA板中。样品在测试板中在37℃孵育1小时。适当mAb与生物素偶联。在PBS-T中洗涤3次之后，每孔接受50μl含0.5μg/ml抗体-生物素偶联物的1％BSA/PBS-T。板子在室温孵育1小时，随后在PBS-T中洗涤3次。加入含1μg/ml链亲和素-辣根过氧化物酶偶联物的1％BSA/PBS-T(75μl)并在室温孵育1小时。在新鲜PBS-T中洗涤板子10次，加入100μl含1mg/ml底物(2，2’-连氮基(3-乙基苯噻唑啉磺酸)的44mM Na₂HPO₄、28mM柠檬酸和0.003％H₂O₂溶液。用全自动多功能(multiscan)酶标仪以490nm为参考波长、在405nm波长测定有色产物。

用抗同种型特异性ELISA定量免疫球蛋白。亲和纯化的山羊抗IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgE用作捕获抗体并以10μg/ml吸附到柔性聚乙烯基微滴定板盘中。加入培养上清液后，孵育并洗涤，适当同种型碱性磷酸酶偶联的山羊抗免疫球蛋白用于检测与板结合的总小鼠免疫球蛋白。使用纯化的免疫球蛋白生成标准曲线。为测定寄生虫抗原特异性抗体，可溶性抗原被生物素化并用于检测结合的小鼠免疫球蛋白。在ELISA酶标仪上在410nm处分析板子，用标准曲线和最优拟合分析软件确定总免疫球蛋白的浓度。抗原特异性抗体浓度相对于OD读数进行比较，因为可溶性寄生虫抗原不是允许精确定量的明确抗原。

ELISPOT测试：建立ELISPOT测试法，以对分泌多克隆抗体或细胞因子的淋巴细胞进行计数。96孔硝酸纤维素支持的微滴定板用1μg/ml抗免疫球蛋白或抗细胞因子抗体的PBS-T溶液在4℃包被过夜。然后用含10％FCS的PBS封闭板子并用PBS-T彻底洗涤。

从5x10⁴细胞/孔开始系列稀释单细胞悬液，在板子上在5％CO₂湿空气中在37℃孵育5小时。用PBS-T洗涤板子并用生物素化抗免疫球蛋白或细胞因子抗体覆盖于4℃过夜。接下来，洗涤板子，用链亲和素-葡萄糖氧化酶偶联物处理2小时并再次洗涤。

单个细胞分泌的抗体或细胞因子用底物显示。30分钟后用洗涤终止比色反应，在30X放大倍数下计数斑点。产生10-50个斑点/孔的细胞稀释液用于计算每种样品中的分泌细胞总数。对照包括包被不适当山羊抗体或不适当抗原或未包被的孔。

用可溶性抗原包被孔对测试进行改进，也可以对寄生虫抗原特异性、分泌免疫球蛋白的B细胞进行定量。简单的说，例如，用0.25μg/孔的成体鼠鞭形线虫抗原或适当的不相关对照抗原包被板子。洗涤后将细胞加入孔中。适当孵育以后再次洗涤板子并如上述处理。

D.疾病病理评价

需要自身免疫病存在及其治愈或改善的证据以确定是否需要治疗并监测治疗进程。以下方法用于测定所述疾病的临床参数。

1.炎性肠病

评价炎症：小鼠疾病的临床证据包括体重降低、腹泻、直肠下垂和肠道炎症的组织学证据。因而，改善这些参数将显著改善疾病。

为对动物模型中的肠道炎症进行分级，取出组织，根据标准方法Swiss-rolled并包埋在石蜡中。用苏木精伊红染色切片。由单独的病理学家以不知情的方式用常用标准化技术从0-4对结肠炎症程度进行半定量分级：0＝无炎症；1＝低水平炎症；2＝中等水平炎症；3＝高水平炎症伴随壁增厚；和4＝跨粘膜浸润、杯状细胞丧失并伴随壁增厚。

为计数肥大细胞，用Swiss-roll技术制备个体小鼠的肠组织样品，在Carnoy固定剂中固定，石蜡包埋并处理以进行阿辛蓝和番红染色。在给定切片的50个相邻视野扫描固有层和肌肉层的肥大细胞。通过阿辛蓝染色的区别性细胞内颗粒识别肥大细胞。在不知情条件下评价所有样品。

用多种临床、实验室和组织学标准监测人的疾病活性。有几种公认的IBD疾病活性指标用于监测临床参数如腹泻和腹痛频率。评价克罗恩氏病的一种特别有用的指数是克罗恩氏病活性指数，或CDAI(Best et al.，1976，Gastroenterology 70：439)。CDAI集中8个与疾病活性相关的变量，并已经用于克罗恩氏病治疗剂的最近研究中。它包括液体或极软粪便数、腹痛或绞痛严重程度、一般健康状况、疾病的肠外表现的存在性、是否存在腹部肿块、止泻药的使用、血细胞比容和体重。组合评分范围从0-约600。低于150的评分指示缓解，高于450的评分指示严重疾病。

也可以在治疗前后进行经测试的、已被接受的和疾病特异性生活质量调查问卷，以评价治疗进程。欧文炎性肠病调查问卷(Irvine Inflammatory Bowel DiseaseQuestionnaire)是一种32项问卷(Irvine et al.，1996，The Short Inflammatory BowelDisease Questionnaire：a quality of life instrument for community physicians managinginflammatory bowel disease.CCRPT Investigators.Canadian Crohn′s RelapsePrevention Trial.Am J Gastroenterol.199691(8)：1571-8)。它评价与肠功能(如稀便和腹痛)、系统性症状(疲劳和睡眠模式改变)、社会功能(出勤率和取消社交事件的需要)和情感状态(怒、抑郁或易激惹)有关的生活质量。评分为32-224，较高评分指示较好生活质量。缓解患者通常得分高于170。

内镜、X射线和组织学评价肠疾病活性也可用于评价。也可以监测C反应蛋白水平和血细胞沉降速率作为炎症的系统性指标。

2.类风湿性关节炎

炎症评价：

对于具有胶原诱导关节炎的小鼠，每隔一天检查小鼠，它们的爪评分如下：0，正常；1，局限于踝关节或脚趾的红斑和轻度肿胀；2，从踝关节扩展到足中部的红斑和轻度肿胀；3，从踝扩展到跖关节的红斑和严重肿胀；4，僵硬变形并伴随关节肿胀。这四种参数可以与关节炎关节的组织学变化相关。治疗成功导致关节炎评分降低和组织学改善。Anthony DD.Haqqi TM.，Collagen-induced arthritis in mice：an animalmodel to study the pathogenesis of rheumatoid arthritis.Clinical & ExperimentalRheumatology.17(2)：240-4，1999。

对于姥鲛烷诱导的关节炎，可用测微计测量关节以检测肿胀。对于人，测量关节肿胀、红斑、运动限制和疼痛来评价RA。另外，可根据本领域已知方法分析滑液中细胞因子和炎性蛋白浓度、白细胞组成和功能。滑膜活组织检查提供根据本领域已知方法进行组织学分析的组织。Felson DT.Anderson JJ.Boers M.Bombardier C.Furst D.Goldsmith C.Katz LM.Lightfoot R Jr.Paulus H.Strand V.et al.AmericanCollege of Rheumatology.Preliminary definition of improvement in rheumatoidarthritis.Arthritis & Rheumatism.38(6)：727-35，1995 Schiff M.A rationale for theuse of summary measurements for the assessment of the effects of rheumatoidarthritis therapies.Clinical Therapeutics.25(3)：993-1001，2003

3.狼疮

炎症评价

免疫系统的正常发育和功能密切依赖于通过所谓凋亡的过程去除不想要的细胞。通过特异性细胞表面分子及其受体的细胞-细胞相互作用经常触发这一过程。一种这样的系统称为FAS和FAS配体。缺陷FAS(LPR-/-)或FAS配体(GLD-/-)的小鼠发生类似狼疮的自身免疫病。Reilly CM.Gilkeson GS.Use of genetic knockoutsto modulate disease expression in a murine model of lupus，MRL/lprmice.Immunologic Research.25(2)：143-53，2002

成群的LPR或GLD小鼠在无特定病原体的条件下维持于微隔离居室单元中。这些小鼠可以自发发生自身免疫，但人工诱导后更可预测。为诱导疾病，向8周龄小鼠注射试剂如姥鲛烷。在两个月内，小鼠患有自身免疫病。判断小鼠和人疾病诱导和改善有用的很多临床、组织学和免疫学标准在本领域公知。Satoh M.Richards HB.Shaheen VM.Yoshida H.Shaw M.Naim JO.Wooley PH.Reeves WH.Widespreadsusceptibility among inbred mouse strains to the induction of lupus autoantibodies bypristane.Clinical & Experimental Immunology.121(2)：399-405，2000

4.儿童胰岛素依赖性糖尿病(I型)

炎症评价：

NOD小鼠由于胰脏β细胞的自身免疫性破坏而发生与人相似的I型糖尿病。根据本领域已知方法的临床、生化、免疫学和组织学检查允许评价小鼠疾病诱导和改善。例如见Adorini L.Gregori S.Harrison LC.Understanding autoimmune diabetes：insights from mouse models.Trends in Molecular Medicine.8(1)：31-8，2002

5.结节病

炎症评价：

在肺炎症的珠栓塞模型中，抗原(即Th1或Th2)被偶联到Sepharose珠上，经尾静脉注射在肺中形成栓塞。动物通常对偶联抗原进行预敏化。宿主免疫系统对入侵珠发生强免疫应答。这些局灶性炎症应答能持续几周，并可以组织学检查其大小。另外，它们也可以从组织分离并研究细胞组成和细胞因子生成。而且，门淋巴结和脾对于实验很容易得到。例如见Kunkel SL.Lukacs NW.Strieter RM.Chensue SW.Animal models of granulomatous inflammation.Seminars in Respiratory Infections.13(3)：221-8，1998

结节病是一种通常与肺有关的人类疾病。结节病确诊以及疾病程度可根据本领域已知方法进行。肺功能测试可以评价肺依从性和功能。另外，支气管肺泡获得在炎症过程期间浸润入支气管树的炎症细胞。可研究这些细胞的组成和功能。肺浸润和门淋巴结病特征为结节病。因此，定期胸部X光片或CT扫描可帮助评价疾病活性。血清学测试，如根据本领域已知方法测定血管紧张素转化酶活性，能用于评价疾病程度和活性。例如见Hunninghake GW.Costabel U.Ando M.Baughman R.Cordier JF.du Bois R.Eklund A.Kitaichi M.Lynch J.Rizzato G.Rose C.Selroos O.SemenzatoG.Sharma OP.ATS/ERS/WASOG statement on sarcoidosis.American ThoracicSociety/European Respiratory Society/World Association of Sarcoidosis and otherGranulomatous Disorders.Sarcoidosis Vasculitis & Diffuse Lung Diseases.16(2)：149-73，1999

6.多发性硬化

炎症评价：

通过重复注射适当敏化性髓磷脂抗原诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎。根据以下标准进行临床评价：0，无疾病；1，尾松弛；2，后肢无力；3，后肢瘫痪；4，后肢瘫痪且前肢瘫痪或无力；5，垂死。为了组织学分析，取出脊髓和脑并在甲醛中固定。石蜡包埋切片经染色并在光学显微镜下检查。分散脾细胞和来自其它区域的细胞可以如上述进行体外研究。例如见Sewell，Diane，Zing Qing，Emily Reinke，DavidElliott，Joel Weinstock，Matyas Sandor，and Zsuzsa Fabry.Immunomodulation ofexperimental autoimmune encephalomyelitis by helminth ova immunization.International Immunol.15：59-69，2003.

对于人，通过监测神经表现和症状的进程和缓解来评价MS症活性。最广泛使用的测定结果称为(Expanded Disability Status Scal)。根据本领域已知方法分析的脑脊髓液的蛋白质组成和细胞含量也可用于监测疾病活性。而且，系列MRI研究显示新的钆增强的脑损伤。McDonald WI，Compston A，Edan G，Goodkin D，HartungHP，Lublin FD，McFarland HF，Paty DW，Polman CH，Reingold SC，Sandberg-Wollheim M，Sibley W，Thompson A，van den Noort S，Weinshenker BY，Wolinsky JS.Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis：Guidelinesfrom the International Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis Ann Neurol 50(1)：121-7.2001.Poser CM，Paty DW，Scheinberg L，et al.“New Diagnostic CriteriaFor Multiple Sclerosis：guidelines For Research Protocols“Ann Neurol 1983； 13：227-231.统计学方法：一些数据经单样品t-检验以确定平均值是否明显与0不同。成对t-检验用于分析组平均值之间的区别。方差分析和Dunnett t-检验用于分析多重比较数据。

根据本发明有用的动物模型

下表1举例说明根据本发明有用的动物模型的非限制性实例。其它非限制性实例可以在本领域发现，例如描述于Current Protocols in Immunology(2001，Eds.JohnE.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，WarrenStrober，published by John Wiley & Sons)。

表1

实施例

本发明以下非限制性实施例举例说明，其中使用以下材料和方法。以下引用的每篇参考的全部内容经引用并入本文。

实施例1.一般方法：

动物：129/SV IL-10-/-突变小鼠群体和适当对照小鼠，饲养于根据标准方法维持无特定病原体环境的设施中。

寄生虫维持、动物感染、血吸虫卵生产：用于感染的方法和鼠鞭形线虫维持描述于Else and Wakelin，1990，Parasitology，vol.100，part 3：479。

血吸虫卵按下述从感染血吸虫的仓鼠肝中收获并保存：Elliott，1996，Methods：A Companion to Methods in Enzymology，9：255。五只感染仓鼠产生约2x10⁶卵。

制备猪毛首线虫卵：以下方法用于制备和收获猪毛首线虫卵。从暴露于实验性接种猪毛首线虫卵后7-8周的猪结肠分离成体猪毛首线虫。体外培养成虫获得含胚卵，以及随后的外泌卵，经离心从培养基中分离，放置入22℃0.2％重铬酸钾溶液中5-6周，鼓泡，以获得感染性第一阶段幼虫。经1200x g离心10分钟在无菌水中洗涤两次卵，计数，基于计算剂量2,500重悬于预期量盐水中。保存这些卵用于受试对象。卵在冷藏箱中至少稳定一年。为确认感染性，我们监测患者在定殖以后粪便中是否出现卵。粪便中卵数与侵染强度成比例。另外，有时我们用保存卵感染猪以确保连续感染性。

用鸟分枝杆菌感染：腹腔内注射10⁶菌落形成单位(CFU)鸟分枝杆菌(ATCC25291)以感染小鼠。感染第60天时，一些小鼠还接受35曼氏血吸虫尾蚴以诱导双重感染。

血吸虫感染和卵分离：一些实验使用感染曼氏血吸虫8-9周的小鼠(18-20g)。小鼠皮下感染40个Puerto Rican株的尾蚴。

肉芽肿分离和分散：由于感染第6周开始的自然性卵沉积，血吸虫感染小鼠中形成肉芽肿。鸟分枝杆菌也诱导肉芽肿。我们研究从如下述感染的小鼠中分离的肝肉芽肿(Elliott，1996，同上)。分散肉芽肿产生单细胞悬液。分离的肉芽肿在37℃振荡水浴中在含5mg/ml胶原酶的RPMI培养基中搅拌35分钟。吸取残留肉芽肿并使之从1ml注射器中排出以诱导进一步解离。所得细胞悬液经纱布过滤并洗涤三次。用伊红Y排斥来测定细胞活力。该方法导致高产率的有活力炎症细胞，这些细胞显示保持表面分子表达。

脾和MLN分散：使组织通过不锈钢网处理并洗涤以分散脾细胞和MLN。用H20裂解污染的RBC，细胞使用前在RMPI中洗涤三次。

诱导TNBS结肠炎：如下述直肠灌输三硝基苯磺酸(TNBS)诱导结肠炎：Neurathet al.，1995，J.Exp.Med.，182：1281。简单的说，对照或暴露于寄生虫的BALB/C小鼠禁食30小时，然后用甲氧氟烷麻醉。使1.2mm导管进入结肠4cm，灌输0.1ml TNBS溶液(5mg/ml TNBS(Sigma)的50％乙醇溶液)。把持动物尾3分钟以确保与结肠粘膜的均匀接触。

评价粘膜炎症：为对肠炎症进行分级，在指定时间点取组织，根据标准方法Swiss-rolled并包埋在石蜡中。用苏木精伊红对切片进行染色。由一个病理学家以不知情的方式用常用标准化技术(19)从0-4对结肠炎症程度进行半定量分级：0＝无炎症；1＝低水平炎症；2＝中等水平；3＝高水平炎症并伴随壁增厚；4＝跨粘膜浸润、杯状细胞丧失并伴随壁增厚。

细胞分离和T细胞富集：

Th1、Th2和调节性T细胞可以根据本领域已知方法分离，如下述：Current Protocols in Immunology(2001，Eds.John E.Coligan，Ada M.Kruisbeek，David H.Margulies，Ethan M.Shevach，Warren Strober，published by John Wiley & Sons)。

在一个实施方案中，通过在RPMI 1640培养基(GIBCO，Grand Island，NY)中小心挑拨(tease)制备MLN的单细胞悬液。将细胞简单重悬于蒸馏水中以裂解RBC。然后用大体积RPMI洗涤三次MLN。

肠LPMC如下述分离。用RPMI彻底洗涤肠组织。用剪刀去除所有可见的集合淋巴结。沿径向打开肠，切成5mm块，然后在0.5mM EDTA在无钙镁的Hank’s液中37℃振摇孵育20分钟，以释放上皮内的淋巴细胞和上皮细胞。彻底洗涤后再次重复。然后将组织在20ml RPMI中孵育20分钟，RPMI中还含有10％FCS、25mMHEPES缓冲剂、2mM L-谷氨酰胺(glutarmine)、5x10⁵M β-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、5mg/ml庆大霉素和100mg/ml链霉素(全部来自GIBCO)和1mg/ml胶原酶(Sigma#CO130)。孵育结束时用1ml注射器将组织进一步机械破碎。除去碎片，通过叠层在漏斗中用RPMI预湿的纱布洗涤LPMC制备物。然后洗涤LPMC一次，经预湿的轻轻装填入10ml注射器中的2cm尼龙棉(nylon wool)柱筛分。洗涤后，细胞(上至2x10⁷)铺层于30∶70％梯度的Percoll柱上。室温2200xg离心细胞20分钟。从30∶70界面收集LPMC，洗涤并维持于冰上直至使用。经伊红Y排斥确定细胞活力为90％。

对于细胞转移实验，用SpinSep富集方法经负选分离MLN T细胞，其中使用制造商所述的包被抗体的致密颗粒(#17031，#17032，Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)。每次分离后用流式细胞术确保Thy+T细胞的适当回收率和纯度(＞98％)。

细胞转移：

从定殖H.polygyrus两周的IL10-/-小鼠或从年龄相当的未定殖的健康IL10-/-小鼠分离MLN细胞。然后将这些未分级的、分散MLN细胞(2x10⁷细胞/小鼠)或MLN T细胞(5x10⁶细胞/小鼠)转入腹腔注射吡罗昔康处理中断两天后的结肠炎IL10-/-小鼠。14天后评价结肠炎。

制备调节性T细胞的其它方法

在本发明一些实施方案中，可以根据本领域已知方法从培养细胞或动物制备调节性T细胞，以供分析，如系列号如下的美国专利申请所述：2003/0170648、2003/0157057、2003/0133936、2003/0064067、2003/0049696、2002/0182730、2002/0090724、2002/0090357，其全部内容经引用并入本文。

用作细胞来源的细胞群体的体内来源包括但不限于外周血、去除白细胞的血制品、单采血液成分的(apheresis)血制品、外周淋巴结、肠相关淋巴组织、脾、胸腺、脐带血、肠系膜淋巴结、肝、免疫损伤部位如滑液、胰、脑脊液、肿瘤样品等。供体优选是人，可以是胎儿、新生儿、儿童、成年，还可以正常、患病或对感兴趣疾病敏感。

例如，本发明的调节性T细胞可以基于细胞表面标志物的表达而富集。在一个实施方案中，细胞对于Cd4和Cd25表达加以阳性选择，对于CD45RA缺失加以阴性选择。任选地，可以使用其它标志物以进一步分离Treg细胞的亚群，包括CD69、CCR6、CD30、CTLA-4、CD62L、CD45RB和CD45RO。这些方法可以进一步包括富集或纯化操作或步骤，以通过阳性选择选择其它细胞特异性标志物进行细胞分离。

在另一个实施方案中，利用富集具有CD4⁺CD25⁺和任选地CD45RA-特征的细胞的技术，从复杂的细胞混合物中分离调节性T细胞。为从组织中分离细胞，可以用适当溶液进行分散或悬浮。这种溶液一般是平衡盐溶液，如正常盐水、PBS、Hank’s平衡盐溶液等，方便地添加胎牛血清、BSA、正常羊血清或其它天然存在因子，以及可接受的低浓度缓冲剂，一般为5-25mM。方便的缓冲剂包括HEPES、磷酸缓冲剂、乳酸缓冲剂等。

在另一个实施方案中，分离调节性T细胞群体然后用亲合分离以提供基本纯的群体。亲合分离技术可以包括磁分离、用包被抗体的磁珠，亲合层析、细胞毒试剂连接到单克隆抗体上或与单克隆抗体组合使用、如补体和细胞毒素，和用与固体基质如板连接的抗体“淘析(panning)”，或其它方便的技术。提供精确分离的技术包括荧光活化细胞分选仪，它能具有多种程度的精度如多色通道、低角和钝角光散射检测通道、阻抗通道等。通过使用结合死细胞的染料(碘化丙啶，LDS)可以选择细胞而分开死细胞。可以使用不对选择细胞的活力有不适当不利影响的任何技术。

亲合试剂可以是上述细胞表面分子的特异性受体或配体。除了抗体试剂以外，也可使用肽-MHC抗原和T细胞受体对；肽配体和受体；效应子和受体分子等。抗体和T细胞受体可以是单克隆或多克隆，并可以用转基因动物、免疫动物、永生化人或动物B细胞、转染编码抗体或T细胞受体的DNA载体的细胞等进行生产。抗体制备细节及其用作特异性结合成员的适用性对本领域技术人员是公知的。

特别感兴趣的是抗体作为亲合试剂的用途。方便地，这些抗体与分离标记物连接。标记物包括可直接分离的磁珠、可用结合到支持物上的亲合素或链亲合素除去的生物素、能用于荧光激活细胞分选仪的荧光物质等，它们使得容易分离特定细胞类型。发现有用的荧光物质包括藻胆蛋白如如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素和德克萨斯红。通常各种抗体用不同荧光物质标记，以允许独立分选各种标志物。

在一个实施方案中，将抗体加入细胞悬液中，孵育足以与可用的细胞表面抗原结合的一段时间。孵育通常至少约5分钟，通常少于约30分钟。期望反应混合物中有足够浓度的抗体，使得分离效率不因缺乏抗体而受限制，也就是说使用饱和量的抗体。也可以通过滴定确定合适浓度。细胞分离介质将是维持细胞活力的任意介质。优选介质是含0.1-0.5％BSA的磷酸盐缓冲液。多种介质有商品供应并可根据细胞自身性质使用，包括Dulbecco’s Modified Eagle Medium(dMEM)、Hank’s Basic SaltSolution(HBSS)、Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(dPBS)，RPMI、Iscove’s介质、含5mMEDTA的PBS等，通常添加胎牛血清、BSA、HSA等。

可通过流式细胞术监测细胞染色强度，其中激光检测荧光物质(与抗体结合的细胞表面抗原的量成比例)的定量水平。流式细胞术或FACS也可基于抗体染色强度以及其它参数如细胞大小和光散射用于分离细胞群体。尽管特定荧光物质和抗体制备物的绝对染色水平可能有差异，数据可用对照校正。

然后可根据CD4和CD25的表达分离标记的细胞。分离的细胞可以收集于维持细胞活力的任意适当介质中，通常在收集管底部有血清垫底。多种介质有商品供应并可根据细胞自身性质使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove’s介质等，通常添加胎牛血清。

高度富集人Treg活性的组合物可以这种方式实现。目标群体将是细胞组合物的70％或约70％或更多，通常是细胞组合物的90％或约90％或更多，并可以是细胞群体的多达约95％或更多。富集的细胞群体可以立即使用。细胞也可以冷冻，尽管优选在分离步骤之前冷冻细胞，或者可以在液氮温度冷冻并长期保存，解冻并再次使用。细胞通常保存于DMSO和/或FCS中，并与培养基、葡萄糖等组合。一旦解冻，细胞可用生长因子、抗原、刺激、树突细胞等扩张，用于增殖和分化。

细胞培养：

为分析细胞因子，将细胞在96孔微滴定板(Corning，Cambridge，MA)中与200μl培养基(5x10⁵细胞/孔)在37℃培养48小时。培养基是RPMI，还含10％FCS、25mM HEPES缓冲剂、2mM L-谷氨酰胺、5x10⁵M β-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠、100U/ml青霉素、5mg/ml庆大霉素和100mg/ml链霉素(全部来自GIBCO)。对于大多数实验，细胞单独培养或与抗CD3(2C11，ATCC)和抗-CD28mAb(Pharminogen，San Diego，CA)(分别是1μg/ml)一起培养。分离的T细胞培养于用抗CD3和CD28mAb预先包被过夜的孔中。对于IL12分析，细胞与合成的硫代磷酸骨架寡核苷酸ODN1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT)(SEQ ID NO.3)一起培养，所述寡核苷酸含有两个(下划线)免疫刺激CpG基序(13；14)，由ColeyPharmaceutical Group(Wellesley，MA)提供，使用0.6μg/ml浓度以刺激生成。小鼠细胞因子ELISA：根据上述VI部分进行ELISA。

实施例2.对曼氏血吸虫的Th2应答下调对不相关细菌Th1诱导抗原的正在进行的Th1应答：

公认Th细胞免疫应答能极化成Th1或Th2模式。这种极化发生是因为Th1细胞的IFNγ抑制Th2细胞增殖，而Th2细胞的IL-4和IL-10抑制Th1细胞的发育。以下实验证明血吸虫病改变小鼠对已建立的分枝杆菌感染的Th1应答。

小鼠共感染鸟分枝杆菌和曼氏血吸虫以评价宿主对这些截然不同的Th1和Th2免疫刺激的应答。当注射鸟分枝杆菌(10⁶CFU)时BALB/cAnN小鼠发生慢性鸟分枝杆菌感染。建立分枝杆菌感染后60天，小鼠感染曼氏血吸虫(40个尾蚴)。60天后处死小鼠。对照组包括只接受鸟分枝杆菌120天的小鼠或只接受曼氏血吸虫60天的小鼠。来自这些动物的分散的脾细胞或分离的肉芽肿细胞体外培养(4×10⁵细胞/孔)48小时，其中有或无最佳浓度的血吸虫卵抗原(SEA，强Th2抗原)或分枝杆菌抗原纯化的蛋白质衍生物(PPD，强Th1诱导性抗原)。孵育以后，用ELISA测试上清液中细胞因子或免疫球蛋白的生成。图1-3的数据是三次独立实验的平均值+/-SD。

PPD(Th1抗原)刺激以后，只感染鸟分枝杆菌的小鼠脾细胞分泌大量IFNγ。未感染对照小鼠的脾细胞不产生。最重要的是，在共感染小鼠的脾细胞培养物中没有检测到IFNγ(单独鸟分枝杆菌与共感染相比，P＜.001，图1)。可溶性血吸虫卵抗原(SEA，Th2抗原)仅刺激感染曼氏血吸虫动物的脾细胞释放IL-4和IL-5。单独感染鸟分枝杆菌的小鼠对PPD或SEA应答时不产生IL-4或IL-5。然而共感染动物的脾细胞在PPD刺激以后分泌一些IL-4(图1)。

从感染鸟分枝杆菌或曼氏血吸虫的小鼠的肝或从共感染动物分离肉芽肿。共感染动物发生肝肉芽肿，其中含有血吸虫卵和分枝杆菌，这容易由组织学检查证明。这些动物的分散的肉芽肿细胞体外培养48小时，其中有或无最适浓度的SEA或PPD。PPD刺激以后，仅感染鸟分枝杆菌的小鼠的肉芽肿细胞分泌大量IFNγ。而在共感染小鼠的肉芽肿细胞培养物中未检测到IFNγ(单独鸟分枝杆菌与其它相比，P＜.001)(图2)。SEA刺激感染曼氏血吸虫的动物的肉芽肿细胞释放IL-4。在任何情况下SEA都不促进IFNγ分泌。单独感染鸟分枝杆菌的小鼠对PPD应答时不产生IL-4。然而，共感染动物的肉芽肿细胞在PPD刺激以后分泌一些IL-4(图2)。

Th1应答促进IgG2a生成，而Th2反应增强IgG1和IgE。图3表明感染鸟分枝杆菌的小鼠具有高IgG2a血清水平。另外，共感染动物具有正常的IgG2a血清浓度，但IgG1和IgE水平增加。这些数据一起表明对蠕虫感染的Th2应答可以下调宿主对相当强的Th1诱导性生物如鸟分枝杆菌的正在进行的应答。

实施例3.在小鼠TNBS诱导的结肠炎中肠蠕虫定殖或暴露于肠蠕虫的卵减弱Th1型肠炎症：

直肠灌输含TNBS的50％乙醇诱导小鼠结肠炎，它与克罗恩氏病具有共同特征。结肠炎症的特征是浸润性CD4+T细胞表达IFNγmRNA增加。与来自对照的T细胞相比，来自TNBS处理小鼠的固有层T细胞分泌多50倍的IFNγ和少5倍的IL4(Neurath et al.，1995，同上)。与来自对照小鼠的细胞相比，固有层单核细胞分泌多30倍的TNFα(Neurath et al.，1997，Eur.J.Immunol.，27：1743)。重要的是，经抗IL-12(Neurath et al.，1995，同上)、抗TNFα(Neurath et al.，1997，同上)或rIL-10(Duchmann et al.，1996，Eur.J.Immunol.，26：934)处理，可以防止或改善TNBS结肠炎。还可以通过预先经口暴露于半抗原(Elson et al.，1996，J.Immunol.，157：2174)而预防TNBS诱导的结肠炎，这可能是由于粘膜IL-4、IL-10和TGFβ应答增加(Neurath et al.，1996，J.Exp.Med.，183：2605)。

用BALB/c小鼠建立TNBS结肠炎模型。直肠施用含TNBS(0.1ml 5mg/ml贮液)的50％乙醇溶液在这些动物中可重现地产生结肠炎。对于以下讨论的每个TNBS实验，在同一天由对治疗组不知情的同一操作员向暴露于寄生虫的和对照动物施用相同的TNBS制剂。

A.血吸虫病抑制TNBS处理小鼠的MLN和脾细胞释放IFNγ。

研究血吸虫感染是否改变TNBS处理动物结肠炎模型小鼠中的Th1应答。用35个曼氏血吸虫尾蚴经皮下注射感染小鼠。开始感染后约6周虫子成熟并开始产卵。两周后(感染第8周)，用TNBS处理小鼠。几天后检查MLN和脾细胞对T细胞刺激(抗CD3)应答生成IFNγ的能力。如表2所示，天然血吸虫感染强烈抑制TNBS处理小鼠的肠系膜淋巴结(MLN)和脾细胞释放IFNγ。

B.暴露于血吸虫卵抑制TNBS处理小鼠的MLN和脾细胞释放IFNγ。

在血吸虫病中，暴露于寄生虫卵比成虫更诱导Th2应答。血吸虫感染不诱导强Th2应答，直至虫成熟并开始产卵(Grzych et al.，1991，J.Immunol.，146：1322)。缺少天然感染下暴露于完整血吸虫卵的小鼠发生强Th2应答(Oswald et al.，1994，J. Immunol.，153：1707)。这些观察结果提示在缺少天然感染下暴露于血吸虫卵可以诱导Th2并抑制Th1应答。

为研究预先暴露于血吸虫卵是否将抑制Th1应答而不要求用成虫感染，直肠TNBS激发之前14天和4天腹腔注射(ip)10⁴血吸虫卵两次，以接种小鼠。选择这些时间是为了模拟天然感染中出现的连续卵沉积。不暴露于寄生虫卵但用TNBS处理的小鼠作为对照。卵预先冷冻，注射时没有活力。TNBS灌输后几天再一次检查MLN和脾细胞对T细胞刺激(抗CD3)的应答时生成IFNγ的能力。类似于天然血吸虫感染(表1)，如表3所示，腹腔注射卵暴露抑制TNBS处理小鼠的MLN和脾细胞生成IFNγ。

C.暴露于血吸虫卵保护小鼠免于TNBS诱导的结肠炎。

抑制粘膜Th1应答的发生可以减弱TNBS诱导的结肠炎。预先暴露于血吸虫卵抑制MLN和脾T细胞分泌Th1细胞因子。为研究腹腔注射血吸虫卵是否将抑制TNBS诱导的结肠炎，如上所述注射卵，然后TNBS处理。卵处理大大降低累计死亡率，在三次分离的实验中从对照组的60％(16/27)降低到卵暴露小鼠的22％(6/27)。如上述一般方法详述根据4分量表评分肠炎症。在存活小鼠中，卵处理将肠炎症从对照组的3.1±0.5(平均值±SD)降低到卵暴露小鼠的1.3±0.3(p＜0.05，图4)。随后的实验表明两组间最大区别在TNBS处理后3天时明显。其它进行到TNBS灌输后14天的实验显示卵暴露提供更长时间的保护。这些数据表明血吸虫卵通过抑制粘膜Th1应答保护小鼠免于发生致死性结肠炎。

D.肠蠕虫诱导宿主Th2应答。

研究曼氏血吸虫以外的蠕虫类寄生虫是否能调节宿主Th1应答。表现对肠线虫的保护性免疫是CD4T细胞依赖性的。小鼠通过引发Th2应答驱除蠕虫或限制感染。驱虫似乎不绝对依赖肠嗜酸性粒细胞增多和粘膜肥大细胞增多。IL-4可能在驱虫中具有关键作用，因为用阻断抗IL-4或抗IL-4受体mAb的处理促进虫滞留(Else et al.，1994，J.Exp.Med.，179：347)。相反，IL-4处理促进虫清除(图4)。

鼠鞭形线虫生活于小鼠宿主的结肠中。它与毛首鞭形线虫相关，几乎有十亿人在生活期间携带毛首鞭形线虫(Grencis et al.，1996，Gastroenterology Clinics of North America，25：579)。摄入卵引发感染。卵释放幼虫，幼虫侵入盲肠上皮。它们然后成熟成为成虫。该寄生虫不在宿主中复制，使我们能够控制感染强度(Bancroft et al.，1994，Eur.J.Immunol.，24：3113)。

鼠鞭形线虫用于下调肠Th1反应性。经口饲喂含活幼虫的250个含胚卵，从而建立鼠鞭形线虫感染。BALB/c小鼠能供鼠鞭形线虫栖息并在感染4周内自然排除成虫。引发感染后4周，鼠鞭形线虫或假感染的小鼠用直肠灌输TNBS进行处理。预先定殖鼠鞭形线虫在两个独立实验中将累计死亡率从假感染组的58％(7/12)降低到寄生虫暴露组的21％(3/14)。而且，与假感染小鼠比较(3.13±0.63，p＜0.05)，预先定殖鼠鞭形线虫的小鼠发生TNBS结肠炎也减弱(0.92±0.5，平均值±SD)。这些数据表明预先暴露于肠寄生虫(鼠鞭形线虫)保护小鼠免于发生严重的Th1介导的结肠炎。

实施例4.IL-10基因敲除不明显改变宿主/寄生虫相互作用。

IL-10是重要的免疫调节性细胞因子，它下调巨噬细胞活化和辅助细胞功能(Moore et al.，1993，Ann.Rev.Immunol.，11：165)。通过靶向基因敲除提供IL-10缺陷小鼠(IL-10-/-)，这些小鼠发生受结肠菌群影响的慢性小肠结肠炎(Kuhn et al.，1993，Cell，75：263)。用抗IFNγ抗体处理减弱肠炎症，证明结肠炎是由于对结肠内容物的过度活性的Th1应答(Berg，et al.，1996，J.Clin.Invest.，98：1010)。这些小鼠用作与克罗恩氏病相似的自发性结肠炎的优异模型。在本实施例中使用具有129和C57B1/6背景的IL-10-/-小鼠。

A.IL-10-/-小鼠能引发对寄生虫的Th2免疫应答。

感染肠线虫巴西日圆线虫的小鼠对寄生虫发生Th2型炎症，产生IL-4、IL-5和IL-10。巴西日圆线虫能定殖于IL-10-/-小鼠中并刺激适当的肠Th2应答(Kuhn et al.，1993，同上)。用曼氏血吸虫感染IL-10-/-小鼠以检查它们是否引发TH2应答。

表4显示当用血吸虫卵抗原(SEA)或抗CD3刺激时，用曼氏血吸虫定殖8周的IL-10基因敲除小鼠的脾细胞分泌大量IL-4。这些小鼠中包围血吸虫卵的肉芽肿含有通常高百分比(45-50％)的嗜酸性粒细胞，并产生IL-4和IL-5。因此，它们显示有效的Th2应答。这些数据表明暴露于蠕虫类寄生虫如曼氏血吸虫将诱导强Th2应答，即使缺少IL-10也是如此。

B.蠕虫Th2训练抑制IL-10-/-小鼠中粘膜炎症的自然发生。

IL-10缺陷小鼠能供蠕虫类寄生虫栖息并引发强Th2应答。因为IL-10-/-小鼠能发生Th2应答并供肠寄生虫栖息，它们用作研究寄生虫暴露对自发或正在发生的结肠炎的作用的优异模型。IL-10是重要的抗炎性细胞因子。破坏这种关键免疫调节回路将有可能预防寄生虫对粘膜的Th2训练。现有的证据表明感染鼠鞭形线虫阻碍IL-10-/-小鼠发生自发性结肠炎。动物(6周龄)接受鼠鞭形线虫或假感染，6周后处死。鼠鞭形线虫或假感染的IL-10-/-小鼠的结肠炎症如上述一般方法详述用4分量表进行评分。预感染鼠鞭形线虫将肠炎症从假感染组的3.0±0.3(平均值±SE)降低到寄生虫暴露的IL-10-/-小鼠的2.2±0.1(p＜0.05)。这些数据证明预先暴露于蠕虫类寄生虫降低IL-10缺陷小鼠的自发性结肠炎。

实施例6.肠定殖猪毛首线虫下调克罗恩氏病患者的疾病活性：

使克罗恩氏病患者定殖猪毛首线虫并评价疾病活性的改善。猪毛首线虫，猪鞭虫，与毛首鞭形线虫密切相关，是不发达国家常见的人肠道蠕虫。该鞭虫是潜在的治疗剂。天然人寄生虫毛首鞭形线虫是非常小的生物，通过附着于粘膜而居留于结肠。普通定殖通常不产生症状，不引起宿主的健康问题。实际情况下全世界有几百万人定殖该寄生虫，但仅少数人有重度侵染，产生腹泻、出血和缺铁性贫血。有趣的是，该寄生虫的生活史使得宿主不能自我感染。卵需要土壤阶段进行成熟而变得有感染性，然后必须再次摄入从而增加个体的寄生虫载量。因此，如果不摄入土壤中的卵，宿主内的毛首鞭形线虫侵染将不增加。该因子可以容易且有效地使用三天甲苯达唑进行处理。这种人鞭虫能用于定殖宿主并被考虑作为修饰克罗恩氏病中免疫过程的实验剂。

然而，毛首鞭形线虫对宿主具有潜在的健康问题。因为人是唯一的天然宿主，实验用卵将不得不从其他人中收获，产生将其他人的传染病传播给实验对象的潜在问题。因此，使用紧密相关的动物寄生虫。猪鞭虫(猪毛首线虫)具有临时定殖人宿主的能力而不引起症状、疾病、共感染疾病或公共健康危险。

猪鞭虫与感染人的物种紧密相关。这两种生物属于同一科，并且形态相似，但它们属于不同物种并可以在形态、发育和临床上区分。猪鞭虫卵稍大，具有不同形状的棘，从卵向成体发育的速率比毛首鞭形线虫更慢((Beer，1976，Res.Vet.Sci.，20：47)。重要的是，我们可以从SPF动物获得感染性寄生虫卵。

如上所述产生感染性猪毛首线虫的供应。测试卵以确认没有污染肠病原体(如志贺氏菌、沙门氏菌、弯曲杆菌、耶尔森氏菌和肠毒性大肠杆菌)和病毒(如CMV、HSV、VZV、腺病毒和肠病毒)。

使两个耐药的晚期克罗恩氏病患者定殖猪毛首线虫。他们耐受寄生虫，具有很少或没有由这种生物引起的症状。表5显示进行专利(patent)定殖以后两个患者的CDAI值、腹泻和炎症指数都降低。这种结果表明蠕虫可用于调节异常免疫应答，包括但不限于克罗恩氏病。

实施例7.H.polygyrus用于预防和治疗炎性肠病：

为了研究调节性T细胞在寄生虫诱导的抗炎症疾病保护作用，进行了更多实验。

实验使用小鼠肠蠕虫H.polygyrus。H.polygyrus栖息于宿主的十二指肠，不引起末端回肠或结肠的炎症或损伤。当直肠内灌输入小鼠时，含TNBS的醇诱导结肠炎。图5表示这种生物保护小鼠免于TNBS诱导的结肠炎。经口饲喂200个活幼虫建立定殖。开始定殖后约2周小鼠驱除蠕虫。蠕虫定殖开始后4周用直肠灌输0.1mlTNBS(5mg/ml，50％EtOH溶液)处理H.polygyrus或假感染的小鼠。诱导结肠炎后3天在染色的组织切片中评价炎症。

进行实验以测试蠕虫定殖是否通过限制Th1细胞因子如IFNγ、TNFα和IL12的产生保护小鼠免于TNBS诱导的IBD。图6和7显示无IBD的健康WT小鼠暴露于H.polygyrus使得远端肠粘膜更少能产生IFNγ和IL12。

调节性细胞因子如IL10、TGFβ和PgE2能限制“Th1”细胞功能。确定H.polygyrus是否促进在肠粘膜内产生这些调节性细胞因子。图8表示这种蠕虫诱导粘膜IL10生成。IL10下调一系列促炎症介质如TNFα、IL6和IL12。因此，可以合理的推断肠粘膜产生的IL10限制“Th1”细胞功能。图9表示当与抑制性抗IL10R mAb一起培养时具有H.polygyrus的小鼠的LPMC产生实质上更多IFNγ，这支持这种推论。

能保护免于疾病发生的潜在重要的免疫调节细胞因子包括前列腺素E2(PgE2)、IL4、IL5、IL13和TGFβ。图10-12显示蠕虫诱导在肠粘膜中产生保护性细胞因子E2(PgE2)、IL4、IL5、IL13和TGFβ。

T细胞是肠粘膜中IFNγ的主要来源(图13)。IFNγ对于TNBS结肠炎的诱导是重要的。

肠蠕虫诱导迁移到肠的MLN中的调节性T细胞，以局部调控粘膜免疫活性。实验表明(图14)，转移感染蠕虫小鼠的MLN T细胞之后，幼稚未感染WT小鼠的LPMC显示产生IFNγ的能力降低。

一些实验使用绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠进行过继转移实验，以确定MLN调节性T细胞亚组是否进入肠固有层并随后产生调节性细胞因子。如图15所示，携带H.polygyrus的GFP+小鼠的假想的MLN调节性T细胞确实进入健康WT受体的肠粘膜。

该实验表明蠕虫如何免于疾病发生。临床试验中发现蠕虫定殖改善活性IBD。也验证了H.polygyrus定殖如何逆转进行中的小鼠结肠炎。

IL10-/-小鼠发生随动物成长逐渐加重的慢性Th1结肠炎。然而，正如对多数自发性疾病IBD模型是真实的，仅几个月以后SPF设施中的IL10-/-小鼠发生可变表达的结肠炎。改进IBD模型使得更适用于实验。发现向5周龄IL10-/-小鼠饲喂NSAID(吡罗昔康)2周诱导严重的Th1结肠炎，甚至在停药以后无限持续。从小鼠到小鼠炎症是高度可预测的，涉及结肠和TI，具有一致的严重性(图16)。WT小鼠不随吡罗昔康处理而发生结肠炎。

已经发现IL10-/-小鼠定殖H.polygyrus使已建立的结肠炎消退(图17)。5周龄C57BL/6IL10-/-小鼠接受吡罗昔康(80mg/250g饲料)。2周后停止吡罗昔康。在此时间点，所有小鼠都有结肠炎。停止吡罗昔康两天后，经灌胃将200个H.polygyrus定殖于一些小鼠，而另一些假处理。定殖2周后，结肠炎评分从对照的3.6±0.4(SE)降到定殖小鼠中的0.55±0.5(p＝0.001)。

H.polygyrus治愈已建立的结肠炎与LPMC细胞因子生成的变化相关。

当用抗CD3/抗CD28(图18)刺激时从初始(无吡罗昔康)或结肠炎假定殖小鼠分离的LPMC释放多量的IFNγ，而当用CpG寡核苷酸(0.6μg#1826/ml)刺激时产生IL12。经灵敏的(30pg/ml)ELISA检测，吡罗昔康处理的定殖H.polygyrus的IL10-/-小鼠的LPMC产生很少或不产生IFNγ，并减少IL12的释放(图18)。初始或结肠炎IL10-/-小鼠的LPMC不产生IL4，并且产生很少IL13(图19)。相比较而言，定殖H.polygyrus的小鼠的LPMC产生一些IL14和多量的IL13。蠕虫定殖逆转结肠炎症，但LPMC细胞因子谱不是简单的回到初始IL10-/-小鼠那样。相反，定殖导致与结肠炎治愈相关的新的细胞因子谱。

H.polygyrus定殖活化IL10-/-小鼠中的调节回路。将结肠炎IL10-/-小鼠的产生IFNγ的LPMC与定殖H.polygyrus的小鼠的LPMC以1∶1混合，导致共培养中IFNγ生成受抑制。

H.polygyrus位于十二指肠，但启动逆转结肠炎并改变远端LPMC细胞因子谱的调节性回路。已经表明，蠕虫定殖诱导或活化位于定殖H.polygyrus的小鼠的MLNT细胞区隔范围内的循环中调节性细胞。将来自定殖H.polygyrus的IL10-/-小鼠的20x10⁶MLN细胞或5x10⁶MLN细胞转入具有已建立IL10-/-结肠炎的动物导致炎症消退(图20)。

Scurfin是一种转录因子，由foxp3基因编码，对于调节性T细胞的形成或活性很重要。经实时RT-PCR定量，与无蠕虫的IL10-/-小鼠相比，Foxp3转录本在定殖H.polygyrus的IL10-/-小鼠的MLN中增加(图21)。PCR循环阈值的每个降低相当于经HPRT mRNA校正的加倍的Foxp3含量。蠕虫定殖导致MLN细胞中Foxp3表达增加3-5倍。与无蠕虫的对照相比，Foxp3也在定殖H.polygyrus的IL10-/-小鼠的LPMC中增加(3倍)。已知仅调节性T细胞表达Foxp3(Hori，S.，T.Nomura，andS.Sakaguchi.2003.Control of regulatory T cell development by the transcription factorFoxp3.Science.299：1057-1061)。MLN和LPMC中Foxp3表达增加支持蠕虫诱导调节性T细胞协同消退已建立结肠炎的假说。

免疫调节因子的其它转录本也被定殖H.polygyrus改变。Smad7是阻断TGFβ信号传递的转录因子。经实时RT-PCR测定，定殖H.polygyrus将MLN细胞的Smad7表达降低4.5倍(图22)。Smad7转录本在LPMC中也降低。Smad7的降低将允许细胞对免疫调节性TGFβ更好应答。而且，Smad7表达降低显示多重调节机制可能在IL10-/-结肠炎消退中发挥功能。

Smad7的引物和探针是TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC(SEQ ID NO.4)，GAGTAAGGAGGAGGGGGAGA(SEQ ID NO.5)，和FAM-TTGATCTTCCCGTAAGATTCACAGCAACA-TAMRA(SEQ ID NO.6)。Foxp3和Smad7mRNA的表达用HPRT进行校正。HPRT的引物和探针是TGAAGAGCTACTGTAATGATCAGTCAAC(SEQ ID NO.7)，GCAAGCTTGCAACCTTAACCAT(SEQ ID NO.8)，和TET-TGCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACAGCCC-TAMRA(SEQ ID NO.9)。

其它实施方案

前述实施例给出了本发明人在完成和实施本发明的过程中进行和考虑的实验。可以认为这些实施例包括用于告知本发明实践领域并证明其有用性的技术内容。本领域技术人员将明白本文公开的技术和实施方案只是优选实施方案，一般来说可以使用很多等价方法和技术来实现相同结果。

上述提到的所有参考文献通过引用而明确并入本文，这些参考文献的引用程度描述、设定、提供实现组合物和/或方法的基础，对于本发明中一个或多个实施方案的实施是重要的。

特别地，本发明涉及以下技术方案：

1.筛选改变调节性T细胞活性的蠕虫类寄生虫制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)获得蠕虫类寄生虫制剂；

(b)使所述蠕虫类寄生虫制剂与目标物接触；和

(c)测定所述接触以后所述目标物中调节性T细胞活性的内部标志物的水平，其中所述接触以后所述内部标志物的所述水平的改变是所述蠕虫类寄生虫制剂改变调节性T细胞活性的指标。

2.1的方法，其中所述内部标志物是转录因子。

3.2的方法，其中所述转录因子是Scurfin、Smad7、Gata3或Tbet(Tbx21)。

4.2的方法，其中所述转录因子的所述水平在其蛋白质或mRNA水平测定。

5.筛选改变调节性T细胞活性的蠕虫类寄生虫制剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)获得蠕虫类寄生虫制剂；

(b)使所述蠕虫类寄生虫制剂与目标物接触；和

(c)测定所述接触以后所述目标物中调节性T细胞活性的细胞表面标志物的水平，其中所述接触以后所述细胞表面标志物的所述水平的改变是所述蠕虫类寄生虫制剂改变调节性T细胞活性的指标。

6.5的方法，其中所述细胞表面标志物选自：CD4、CD45RB^1o、CD45Rc、溶细胞性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、Ox40、4-1BB、CD25、CD103、CD62L、αEβ整合素、潜伏相关肽(LAP)或糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白(GITR)、趋化因子受体CCR5、TI-ST2。

7.6的方法，其中所述表面标志物的所述水平在其蛋白质或mRNA水平测定。

8.治疗患有Th1或Th2相关疾病的动物的方法，包括向所述动物施用改变调节性T细胞活性的蠕虫类寄生虫制剂。

9.监测蠕虫类寄生虫制剂对于动物自身免疫或变态反应疾病的治疗效果的方法，包括：

(a)向所述动物施用包含蠕虫类寄生虫制剂或其级分的组合物；和

(b)测定所述施用后在所述动物中调节性T细胞活性的水平，其中所述施用后所述调节性T细胞活性的所述水平增加是所述蠕虫类寄生虫制剂的治疗效果的指标。

10.9的方法，其中所述调节性T细胞活性通过测定调节性T细胞标志物的水平而测定。

11.10的方法，其中所述调节性T细胞标志物是内部标志物。

12.11的方法，其中所述内部标志物是Scurfin、Smad7、Gata3或Tbet(Tbx21)。

13.10的方法，其中所述调节性T细胞标志物是细胞表面标志物。

14.13的方法，其中所述细胞表面标志物选自：CD4、CD45RB^1o、CD45Rc、溶细胞性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、Ox40、4-1BB、CD25、CD103、CD62L、αEβ整合素、潜伏相关肽(LAP)或糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白(GITR)、趋化因子受体CCR5、TI-ST2。

15.10的方法，其中所述调节性T细胞标志物是分泌型标志物。

16.15的方法，其中所述分泌型标志物是IL4、IL13、IL-5、IL-10或TGFβ、PgE2。以下部分对应于母案附图中的注释：

图1：感染鸟分枝杆菌、曼氏血吸虫或同时感染两种生物的小鼠脾细胞上清液中IFNγ、IL-4和IL-5的浓度。脾细胞(4×10⁵/孔)于37℃在200μl培养基中体外培养48小时，其中培养基中存在或缺少最适浓度的PPD或可溶性血吸虫卵抗原(SEA)。细胞因子分泌用ELISA定量。

图2：感染鸟分枝杆菌、曼氏血吸虫或同时感染两种生物的小鼠肉芽肿细胞上清液中IFNγ和IL-4浓度。肉芽肿细胞(4×10⁵/孔)于37℃在200μl培养基中体外培养48小时，其中培养基中存在或缺少最适浓度的PPD或可溶性血吸虫卵抗原(SEA)。细胞因子分泌用ELISA定量。

图3：如上述感染鸟分枝杆菌、曼氏血吸虫或同时感染(共感染)两种生物的小鼠中血清IgG1、IgE和IgG2a水平。免疫球蛋白浓度用ELISA测定。

图4：IL-4治疗能治愈慢性H.polygyrus感染的小鼠。处死前12天开始小鼠接受三次IL-4复合物注射。数据是多次测定的平均值±SE。

图5：预先定殖肠道蠕虫的小鼠发生较弱的TNBS结肠炎。

图6：定殖H.polygyrus抑制粘膜INF γ应答。

图7：H.polygyrus阻断粘膜IL12合成。

图8：定殖H.polygyrus促进粘膜IL10生成。

图9：阻断IL10R增强IPMC IFNγ生成。

图10：定殖H.polygyrus促进粘膜PGE2生成。

图11：定殖H.polygyrus促进粘膜IL4、IL5和IL13生成。

图12：定殖H.polygyrus促进粘膜TGFβ生成。

图13：在健康WT小鼠的肠粘膜中T细胞生成IFNγ。

图14：从携带H.polygyrus的小鼠向未感染WT小鼠转移MLN细胞抑制LPMC IFNγ应答。

图15：转入WT接受体时携带H.polygyrus的小鼠的MLN T细胞进入肠粘膜。

图16：IL10-/-小鼠中吡罗昔康诱导的结肠炎。

图17：H.polygyrus逆转已形成的活性吡罗昔康诱导的IL10-/-结肠炎。

图18：H.polygyrus阻断IL10-/-结肠炎中LPMC IFNγ和IL12生成。

图19：H.polygyrus提高IL10-/-结肠炎中LPMC IL4和IL13生成。

图20：定殖H.polygyrus的IL10KO小鼠的MLN细胞抑制活性IL10KO IBD。

图21：经实时RT-PCR测量，H.polygyrus提高MLN细胞表达Foxp3mRNA。

图22：经实时RT-PCR测量，H.polygyrus降低MLN细胞表达Smad7mRNA。

图23：抗原-提取步骤示意图。

Claims

1.蠕虫类寄生虫制剂用于制备用于治疗Th1和Th2相关疾病的药物的用途，

其中，在所述制备中，所述寄生虫制剂的剂量通过测定目标物中调节性T细胞应答来监测，其中所述目标物选自培养组织、培养细胞以及转录和/或翻译提取物，其中所述寄生虫制剂与目标物接触时将目标物中调节性T细胞活性改变至少40％，其中所述寄生虫制剂包含以下中的任一种：完整寄生虫、寄生虫提取物、寄生虫卵、寄生虫卵提取物、寄生虫蛋、寄生虫蛋提取物、寄生虫幼虫、寄生虫幼虫提取物、寄生虫尾蚴和寄生虫尾蚴提取物，

其中所述术语“Th1相关疾病”表示这样的疾病，其中Th1细胞支持、引起或介导疾病过程，或其中Th1细胞参与治愈或减缓疾病症状，这通过Th1活性的增强或降低而表现出来，并且其中所述术语“Th2相关疾病”表示这样的任何疾病，其中Th2细胞支持、引起或介导疾病过程，或其中Th2细胞参与治愈或减缓疾病症状，这通过Th2活性的增强或降低而表现出来。

2.权利要求1的用途，其中所述调节性T细胞应答使用内部标志物、细胞表面标志物或分泌型标志物来测定。

3.权利要求2的用途，其中所述内部标志物是转录因子。

4.权利要求3的用途，其中所述转录因子是Scurfin、Smad7、Gata3或Tbet(Tbx21)。

5.权利要求3的用途，其中所述转录因子的水平在其蛋白质或mRNA水平测定。

6.权利要求2的用途，其中所述细胞表面标志物选自：CD4、CD45RB^1o、CD45Rc、溶细胞性T淋巴细胞相关抗原4、Ox40、4-1BB、CD25、CD103、CD62L、α_Eβ整合素、潜伏相关肽或糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白、趋化因子受体CCR5和TI-ST2。

7.权利要求2的用途，其中所述分泌型标志物选自IL-5、IL-10和TGFβ。