PT1490106E - Utilização de um lipopéptido ou de uma lipoproteína como adjuvante na vacinação terapêutica ou profiláctica - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE UM LIPOPÉPTIDO OU DE UMA LIPOPROTEÍNA COMO ADJUVANTE NA VACINAÇÃO TERAPÊUTICA OU PROFILÁCTICA" A invenção refere-se à utilização de um lipopéptido ou de uma lipoproteina como adjuvante na vacinação terapêutica ou profiláctica por via das mucosas, por conseguinte, também adjuvante da mucosa.

Um terço de todos os casos de morte anuais no mundo é ainda provocado por doenças infecciosas, as quais são, além disso, responsáveis por pelo menos 15% das novas doenças cancerosas. Para além disso, as doenças infecciosas devem estar envolvidas na fisiologia de diversas doenças crónicas, do tipo inflamatório, vascular ou degenerativo. As doenças infecciosas causam, à comunidade, elevados custos, devido a custos de tratamento e falta ao trabalho por parte dos doentes.

Para a defesa contra as doenças infecciosas são, geralmente, seguidos dois caminhos, nomeadamente, terapia e profilaxia.

Assim, as vacinações tornaram-se uma arma eficaz contra as doenças infecciosas. No entanto, existem ainda muitas doenças infecciosas, para as quais ainda não se encontram disponíveis quaisquer vacinas ou para as quais não pode ser alcançada uma imunização suficiente. Muitas vacinas são insuficientes devido a eficiência reduzida, efeitos secundários graves, estabilidade reduzida ou custos elevados. Existe, por conseguinte, uma grande necessidade de vacinas (vacinas) novas e melhoradas. 2

Tradicionalmente, as vacinas foram utilizadas para a profilaxia no caso de doenças infecciosas e estão, nesta área, bem introduzidas para muitas doenças. Novos conhecimentos dão conta de que as vacinações são, para além disso, um meio bastante apropriado no caso da imunoterapia de outras doenças transmissíveis, para as quais ainda não se vacinou, como hepatite virai, infecções de Helicobacter-pylori, infecções do vírus da herpes, etc. Outra área de aplicação é a integração de vacinas no caso de imunoterapias e imunoprofilaxias contra doenças auto-imunes, doenças inflamatórias, tumores, alergias, e para a contracepção nos humanos e animais. Parcialmente (em particular, também, no último caso mencionado) , a utilidade das vacinas parece estar associada a uma administração por via da mucosa eficiente e à, com ela associada, capacidade de originar uma boa reacção imune da mucosa. A maioria das infecções são ou limitadas às mucosas, ou os agentes patogénicos têm de passar as mucosas durante as fases precoces da infecção. É, por conseguinte, necessariamente desejável que no caso de uma vacinação seja obtida não só uma resposta imune sistémica, mas sobretudo, também uma resposta imune da mucosa, para com isso parar primariamente tanto a infecção (colonização) , como a formação da doença. Uma boa resposta imune da mucosa iria reduzir nitidamente o perigo de transmissão.

Dado que, na realidade, o sistema imune sistémico e o da mucosa se sobrepõem parcialmente, mas não são idênticos, as vacinas para a protecção contra agentes patogénicos das mucosas, administradas por via parentérica, são menos eficazes (McGhee, Mestecky et ai., "The mucosal immune System: from fundamental concepts to vaccine development", 3

Vaccine 10, 75-88(1992)). Na realidade, as vacinas administradas por via parentérica estimulam, essencialmente, respostas imunes sistémicas, enquanto que vacinas administradas por via da mucosa, por conseguinte, através das mucosas originam uma resposta imune, tal como a causada por meio de infecções naturais. Deste modo, a imunização por via da mucosa conduz a respostas imunes sistémicas e da mucosa totalmente eficazes.

Para além disso, é de esperar que a administração de vacinas por via da mucosa traga menos efeitos secundários e seja bem aceite por parte dos pacientes. As vacinas são mais facilmente administradas por via da mucosa e mais facilmente de fazer coincidir com protocolos de vacinação. A sua disponibilização está associada a reduzidos custos. A administração de antigene por via da mucosa está, até ao presente, associada a algumas dificuldades. Um problema principal consiste no facto de os antigenes assim administrados serem frequentemente pouco imunogénios. Isto deve-se a diferentes mecanismos, como (i) eliminação acelerada do antigene, por meio de mecanismos de "Clearance" não específicos do hospedeiro (por exemplo, actividade de cílios, peristáltica), (ii) degradação do antigene, por meio de enzimas de acção local, (i ii) alteração do antigene e/ou modificação estrutural na sequência de valores de pH extremos (meio ácido no estômago, meio alcalino no tracto intestinal), (iv) fraca permeabilidade ao antigene por parte das mucosas, assim como (v) acesso apenas limitado às células que apresentam o antigene. 4

Para ultrapassar estas dificuldades, são utilizadas diferentes estratégias, por exemplo, inclusão ou associação do antigene a partículas(micropartículas, nanopartículas, bactérias ou fragmentos de bactérias)como agentes veiculares, utilização de estruturas do tipo virai, utilização de lipossomas ou ISCOMS (complexos imuno-estimuladores) ou virossomas, utilização de plantas transgénicas, produção de antigenes por meio de veículos virais ou bacterianos enfraquecidos, quer como vectores usuais, quer como veículos para vacinas de ácido nucleico e/ou a administração destes agentes auxiliares com adjuvantes da mucosa. Apesar dos esforços intensivos nesta área, não foram, até ao presente, levados à prática, quase nenhuns adjuvantes da mucosa suficientemente eficazes e simultaneamente compatíveis.

Como "adjuvantes" são designadas substâncias que, no caso de uma imunização, são adicionadas ao antigene (por conseguinte, à substância que provoca a reacção imune desejada), para reforçar a resposta imune humoral e/ou a resposta imune mediada pelas células ("Lexikon der Biochemie und Molekularbiologie", Io Volume, Spektrum Akademischer Verlag 199S) . a utilização de muitos adjuvantes baseia-se apenas na experiência, sendo que o efeito não é exactamente reconhecido, nem previsível. Tradicionalmente, são sobretudo utilizados os seguintes grupos de adjuvantes: hidróxido de alumínio, emulsões de óleos minerais, saponinas, detergentes, compostos de silício, tioureia, endotoxinas de bactérias gram negativas, exotoxinas de bactérias gram positivas, bactérias mortas ou partes das mesmas. 5

No caso da vacinação, a utilização de adjuvantes óptimos desempenha um papel decisivo. Antigenes administrados sem adjuvantes produzem, apenas raramente, uma resposta imune suficiente. Para além disso, não depende só da intensidade da resposta imune provocada, mas também da sua qualidade. A estimulação de um padrão de imunização incorrecto, pode conduzir a reacções imunopatológicas e deterioramento dos sintomas da infecção. Neste contexto, o adjuvante pode ajudar a suportar a reacção imune pretendida.

Os adjuvantes concedidos para humanos são limitados. Um dos poucos adjuvantes para humanos aceites pelas autoridades de concessão é o hidróxido de aluminio. Do facto de um adjuvante ser activo por aplicação sistémica, portanto suportar a acção de um antigene, não se pode concluir que isto seja válido também para outras vias de aplicação. Um exemplo típico é o hidróxido de alumínio, o qual pode suportar a imunogenicidade de uma substância por administração intramuscular, subcutânea, intraperitoneal ou intradérmica, mas que por administração por via da mucosa é totalmente ineficaz.

Nos últimos anos, tem-se procurado intensivamente novos adjuvantes, também daqueles para a administração por via da mucosa. Foram apenas encontradas poucas substâncias, que têm a capacidade de reforçar a resposta da mucosa. Entre estas, algumas actuam como veículos, às quais os antigenes têm de ser ligados ou fundidos com as mesmas. Muito menos foram encontrados adjuvantes "verdadeiros" de utilização universal, os quais são misturados com o antigene.

Como adjuvante da mucosa verdadeiro foi encontrada a toxina termoestável de Escherichia coli e a toxina da cólera de 6

Vibrio cholerae. De ambas foi descrita uma eficácia como adjuvantes da mucosa (Holmgren et ai., "Cholera toxin and cholera B subunit as oral-mucosal adjuvant and antigenvector system", Vaccine 1179-1184, 1993 e Douce et ai., "Mutants of Escherichia coli heat-labile toxin lacking ADP-ribosyltransferase activity act as nontoxic, mucosal adjuvants", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 1644-1648). No entanto, a sua toxicidade inerente e os potenciais efeitos secundários limitam a sua utilidade no âmbito da vacinação de humanos. Embora tenham sido produzidos derivados não tóxicos destas moléculas por meio de técnicas genéticas, ainda são divulgados fortes efeitos secundários não toleráveis, como alterações patológicas da mucosa respiratória e infiltração da toxina no cérebro (N. Garçon, apresentação no congresso "Word Vaccine Congress", Genebra, 26 a 28 de Setembro de 1999; e: van Ginkel, F.B. et al., "cutting edge: The Mucosal Adjuvant Cholera Toxin Redirects Vaccine Proteins into Olfactory Tissues", J. Immunol. 2000, 165, 4778-4782).

Por conseguinte, ainda persiste uma necessidade urgente de novos adjuvantes da mucosa, compatíveis e eficazes.

Consequentemente, a invenção teve como objectivo desenvolver uma palete de novos adjuvantes da mucosa, altamente eficazes e não tóxicos para os humanos, os quais podem ser utilizados com os mais variados componentes activos a suportar, em vacinas usuais ou de novo tipo, como, em particular, vacinas profilácticas ou terapêuticas, incluindo vacinas para o cancro e de ADN.

Para alcançar este objectivo, é prevista a utilização de um lipopéptido ou de uma lipoproteína de estrutura (I), como 7 adjuvante da mucosa na vacinação terapêutica ou profilática através das mucosas,

em que

Ri e R2, os quais podem ser iguais ou diferentes, representam C7-25-alquilo, C7-25-alcenilo ou C7-25-alcinilo X representa S, 0 ou CH2, R3 e R4, independentemente um do outro, representa H ou metilo e Y representa uma sequência de aminoácidos fisiologicamente compatível e não imunogénica per se na espécie utilizada, constituída por 1 a 25 resíduos de aminoácidos, e o átomo de carbono assimétrico marcado com * possui a configuração R absoluta, de acordo com a regra de Cahn-Ingold-Prelog.

Na realidade, na DE 19652586 AI já foi mencionada a utilização de um determinado péptido de S-(2,3-di-hidroxipropil)-cisteí na com dois ácidos gordos do tipo éster ligados ao grupo di-hidroxipropilo, como adjuvante de vacinas, no entanto, puramente hipotético e sem relação com adjuvantes da mucosa, de forma que se pressupõe uma via de vacinação usual.

De preferência, a sequência de aminoácidos (Y) carboxi-terminal, ligada ao aminoácido substituído por 2,3-diaciloxipropilo, é seleccionada a partir das seguintes sequências: 8 a) GQTNT, b) SKKKK, C) GNNDESNISFKEK ou d) GQTDNNSSQSAAPGSGTTNT.

Nesse caso, especialmente preferido é um péptido S-[2,3-bispalmitoiloxi-(2R)-propil]cisteínilo, em que a cadeia peptidica pode, por sua vez, ser uma sequência de aminoácidos fisiologicamente compatível, não imunogénica per se na espécie utilizada, constituída por 1 a 25 resíduos de aminoácidos.

Após este reconhecimento, a cadeia peptidica carboxiterminal poderia ter uma função controladora e eventualmente modificadora da hidrofilidade ou lipofilidade do lipopéptido, de modo que, em geral, todas as cadeias peptídicas ou proteicas, que - consoante o fim para o qual as vacinas são utilizadas - satisfazem este critério, podem ser utilizadas. A cadeia peptidica deve ser fisiologicamente compatível e, em particular, não ser imunogénica per se na espécie utilizada (por conseguinte, na espécie vacinada, quer humana, quer animal).

Como decisivo para a eficácia como adjuvante da mucosa é, presentemente, indicada a estrutura de acordo com a fórmula (I), em que o centro assimétrico no local indicado parece ter um significado crucial. 0 adjuvante da mucosa de acordo com a invenção pode ser ligado, por meio de todos os métodos conhecidos do perito na técnica, ao antigene ou molécula activa previsto para a vacinação, incorporado em conjunto com os mesmos em 9 partículas físicas (por exemplo, micropartículas, nanopartículas, lipossomas, ISCOMS, polímeros) ou biológicas (bactérias, partes de bactérias) ou virossomas, ou misturado com o antigene. No caso da ligação a agentes veiculares, podem também ser previstas moléculas de transporte ou proteínas de transporte como agentes veiculares.

De preferência, a lipoproteína ou lipopéptido segundo a fórmula (I) acima mencionada, utilizado de acordo com a invenção, existe na preparação com os componentes de vacinação activos (por exemplo, com o antigene) , a qual é apropriada e está prevista para aplicação intranasal, intra-NALT ("nasal associated lymphoid tissue"), aerossol, oral, intrarectal, conjunctival, intravaginal, intrauretral ou para a aplicação nos canais de leite da mama feminina. Em alternativa, o adjuvante da mucosa de acordo com a invenção pode existir num kit para a co-aplicação com uma vacina por uma das vias anteriormente mencionadas e, eventualmente, ajustado para tal. 0 lipopéptido ou lipoproteína segundo a invenção é, em especial, obtida por via sintética. Os lipopéptidos de acordo com a invenção poderiam também ser obtidos por processos geralmente conhecidos na área, a partir de um clone de micoplasma e, com especial vantagem, a partir de um clone de Mykoplasma-fermentans. Os lipopéptidos de acordo com a invenção são igualmente designados por MALP, nomeadamente, como "macrophage-activating lipopetides". Para tal interessam diferentes variantes, das quais MALP-2 é um lipopéptido de 2kDa de acordo com a fórmula (I), com Y = GNNDESNISFKEK; R3, R4 = H e Ri, R2 = palmitoil (C15) (S-(2,3-bispalmitoiloxipropil)-cisteínil-GNNDESNISFKEK). 10 A síntese dos lipopéptidos e lipoproteínas de acordo com a invenção pode ser realizada, com vantagem, segundo as indicações em "Synthesis of Να-Fmoc protected derivatives of S-(2,3-dihydroxylpropyl)-cysteine and their application in peptide synthesis", J.W. Metzger, K.-H. Wiesmuller, G. Jung em: Int. J. Peptide Proteine Res. 38, 1991, 545-554". Ai são, aliás, designados erradamente como S-configurados os lipopéptidos correspondentes aos naturais (por exemplo, obtidos a partir de um clone de micoplasma), embora os mesmos compostos devessem de ser designados como R-configurados de acordo com a nomenclatura internacional válida segundo Cahn-Ingold-Prelog (vide, por exemplo, D. Chapman em "Introduction to lipids", McGraw-Hill, Londres, 1969, pág. 67 para "Phosphoglycerides", Burgos, et ai., J. Org. Chem. 1987, 52 4973-4977; Morr et ai., Eur. J. Immunol. 2002, 32:3337-3347).

No desenvolvimento da invenção, o lipopéptido ou a lipoproteina pode existir numa preparação com pelo menos um adjuvante adicional e/ou antigene. Em particular, pode ser administrado em conjunto com uma ou mais substâncias anti-inflamatórias, anti-angiogénicas, citotóxicas ou imunomoduladoras ou ligandos (por exemplo, quemoquinas, citoquinas, ligando CD40) ou com anticorpos, ou adicionado a uma preparação com os mesmos.

Tal como mencionado acima, o lipopéptido ou a lipoproteina pode também ser associado ou ligado a um agente veicular físico ou biológico. Para além disso, pode estar contido e ser utilizado numa preparação com outras substâncias aditivas e auxiliares, em particular, substâncias conservantes ou estabilizadores. 11 A invenção representa um grande progresso no esforço para a disponibilização de adjuvantes da mucosa eficazes. No âmbito da fórmula (I), o lipopéptido pode ser modificado e, assim, variado na sua eficácia qualitativa e quantitativa e ajustado à utilização pretendida. Comparativamente, é produzido de forma pouco dispendiosa e não é tóxico para os humanos. Na maior parte dos casos são suficientes quantidades de mistura comparativamente reduzidas para a obtenção de efeitos de reforço nítidos. Os lipopéptidos de acordo com a invenção encontram-se bem caracterizados relativamente às suas propriedades químicas e bioquímicas e são obteníveis de forma suficientemente pura, em particular, por vias sintéticas (Muhlradt, P.F., M. Kless, H. Meyer, R. Sussmuth, G. Jung (1997), Isolation, structure, elucidation, and synthesis of a macrophage stimulatory lipopeptide from Muycoplasma fermentans acting at picomolar concentration"; J. exp. Med. 185: 1951; and Takeuchl, 0., A. Kaufmann, K. Grote, T. Kawal, K. Hoshino, M. Morr, P.F. Muhlradt, and S. Akira (2000); "Cutting edge: Preferentially the R-sterioismoser of the mycoplasmal lipopeptide macrophage-activating lipopeptide-2 activates imune cells through a toll-like receptor 2-and MyD88-dependent signaling pathway"; J. Immunol. 164:554, U. Deiters, P.F. Muhlradt (1999) Mycoplasmal Lipopeptide MALP-2 induces the chemoattractant proteins ΜΙΡ-Ια, MCP-1 and MIP-2 and promotes leukocytes infiltration in mice, infect Immun, 67 (7) , 3390-3398) , pelo que não são de esperar efeitos secundários, segundo o conhecimento actual.

Outra vantagem da invenção consiste no facto de, no caso da imunização mediante a mistura do adjuvante da mucosa de acordo com a invenção, terem sido encontradas elevadas concentrações de IgA nas secreções das mucosas de animais 12 de laboratório tratados. Esta espécie de anticorpos é de especial significado para a protecção das mucosas contra infecções.

Dado que actualmente não são concedidos quaisquer adjuvantes eficazes para a imunização intranasal de pacientes humanos, a invenção representa um importante desenvolvimento da medicina nesta área.

Os lipopéptidos ou lipoproteinas de estrutura geral (I) descritos nesta invenção podem também ser utilizados como adjuvantes em geral, por conseguinte por outras vias diferentes da mucosa, incluindo aplicações especiais para vacinas de ADN e vacinas para o cancro, vacinas contra doenças não infecciosas e semelhantes, por exemplo, através das vias de vacinação usuais (intramuscular, subcutânea, intradérmica, intraperitoneal).

Os adjuvantes de acordo com a invenção podem ser combinados com os mais diferentes antigenes para a vacinação. Como antigenes podem ser seleccionados, em particular, antigenes alvo para a profilaxia e tratamento de doenças infecciosas, tumores, doenças auto-imunes, alergias, assim como doenças inflamatórias crónicas ou agudas. A selecção pode, entre outros, ocorrer a partir do conjunto de antigenes de agentes causadores de infecções, como vírus, bactérias, parasitas, riquétsia, micoplasma, fungos e semelhantes. Por uma vacinação também se deve entender um tratamento com antigenes para o controlo da fertilidade em populações humanas ou animais. 13

As propriedades vantajosas do adjuvante da mucosa de acordo com a invenção que se podem retirar dos exemplos, não podem ser derivadas de nenhuma divulgação anterior a este pedido.

Abordagem metódica para as experiências/análises A montante, foram primeiramente realizados estudos de "Screening" ín vitro, para poder estimar o potencial dos lipopéptidos analisados, relativamente à activação de células com antigene. Como células alvo foram utilizadas células dendriticas derivadas de medula óssea, as quais foram obtidas a partir de percursores com auxilio de GM-CSF. Contrariamente ao que poderia ser esperado, devido à actividade de MALP-2 relativamente a macrófagos, o MALP-2 apresentou apenas uma fraca actividade relativamente às células denditricas primárias. Em comparação com as amostras de controlo, as quais foram incubadas na presença de lipopolissacáridos de E. coli (LPS, 10 ng/mL) , foi observada uma activação denditrica muito fraca, de células tratadas com 5 ng/mL de MALP-2.

Devido a estas análises prévias não pôde ser esperada para o MALP-2 e para o correspondente lipopéptido qualquer aplicabilidade como adjuvante, uma vez que é pressuposta uma determinada capacidade para a activação de células denditricas por parte dos adjuvantes. As células denditricas são, na realidade, o grupo principal de células que apresentam antigenes. Elas desempenham na resposta imune primária um papel central, sendo que as mesmas (1.) representam as células que apresentam antigenes mais eficazes, (2.) são a fonte de epitopos mais importante para clones de células T específicas, e (3.) são as principais activadoras de células T em repouso, as quais são capazes de gerar respostas imunes primárias in vivo. Enquanto que 14 células dendítricas tratadas com LPS apresentam uma forte sobre-regulação ou multiplicação de CD40, incluindo CD80 e CD86, no caso de células dendítricas tratadas com MALP-2 pode ser detectado apenas um efeito fraco, se é que algum.

Isto era, em parte, de esperar e estava em concordância com os resultados obtidos em macrófagos. Aí, verificou-se que após uma fase de sobre-regulação inicial, no caso de tratamento contínuo com MALP-2, surgia uma maior conversão e uma expressão menor de moléculas MHC de classe II, as quais são essenciais para a apresentação de antigene correcta (M. Frisch et al., Eur. J. Immunol. (1996) 26, 1050-1057). Ainda mais surpreendente é a acção do adjuvante verificada.

Por conseguinte, os resultados dos ensaios estavam, primeiramente, contra uma possível actividade como adjuvantes dos lipopéptidos e lipoproteínas analisados na presente.

Embora estes estudos in vitro sugerissem que os lipopéptidos em questão não prometiam qualquer sucesso, os mesmos foram incluídos em estudos in vivo realizados pelo inventor, como amostras de controlo negativas, nomeadamente como exemplos de substâncias activadoras de macrófagos de fraca actividade, uma vez que as substâncias estavam disponíveis de ensaios anteriores.

Surpreendentemente, já que em completa contradição com os ensaios in vitro, verificou-se que, por exemplo, o MALP-2 por administração conjunta com o antigene modelo β-galactosidase, quer por via intranasal (i.n.), quer por via intraperitoneal (i.p. (nota: no modelo animal)), numa dose 15 de apenas 0,5 pg por animal por dose, foi capaz de elevar o titulo sérico da IgG especifica para a β-galactosidase em cerca de 675 a 3560 vezes (i.n.) e em 64 a 128 vezes (i.p.). Por utilização dos lipopéptidos de acordo com a invenção, podem ser geradas respostas IgG aproximadamente máximas, já após a primeira imunização, sendo que estes títulos de IgG correspondem àqueles resultantes da administração de 10 pg (excesso trimolar)de subunidade B da toxina da cólera (CTB), um adjuvante da mucosa bem caracterizado. Resultados semelhantes são observados por administração intradérmica ou subcutânea dos lipopéptidos e lipoproteínas de acordo com a invenção. Assim, é de supor que a administração dos lipopéptidos e lipoproteínas de acordo com a invenção pode e deve ocorrer numa concentração pelo menos 3 vezes menor (molar) , comparativamente aos adjuvantes usuais.

Também pôde ser demonstrado que a administração dos lipopéptidos de acordo com a invenção por vias intranasais, conduz a uma estimulação eficaz de todo o sistema imune da mucosa. Assim, no caso da administração de MALP-2 como adjuvante ao antigene modelo, foram verificados 36% e 23% de IgA específica para o antigene, relativamente à IgA total, em lavagens pulmonares e vaginais. Isto mostra que os lipopéptidos de acordo com a invenção, não só conseguem produzir respostas imunes da mucosa locais, mas também que a difusão das células produtoras de IgA para outras áreas de mucosas distantes ocorre de tal forma que conduz a boas respostas imunes da mucosa. Este efeito está associado às vias de administração através das mucosas. A co-administração dos lipopéptidos de acordo com a invenção ao antigene também originou respostas imunes 16 celulares mais fortes, como CTB, tanto regionalmente em nódulos linfáticos, como no baço (p < 0,05) . A análise de isotipos IgG específicos para a β-galactosidase e os perfis das citoquinas secretadas por células estimuladas in vitro mostraram que a co-administração dos lipopéptidos originava um padrão de resposta Th2 dominante. Por conseguinte, os resultados das análises confirmam que os lipopéptidos de acordo com a invenção representam adjuvantes eficazes para a administração por via da mucosa de antigenes em vacinas.

Um aspecto importante, que deve ser salientado na presente, corresponde ao facto de um aumento incremental da dose de lipopéptido (a partir das doses óptimas mencionadas na presente), conduzir a uma redução constante da resposta imune. Este efeito contrário é inesperado e não podia ser derivado do estado da técnica. PARTE DE EXEMPLOS Geral

As análises apresentadas nos exemplos foram primeiramente realizadas com um lipopéptido sintético, derivado de micoplasma, essencialmente correspondente ao MALP-2, como adjuvante da mucosa, em conjunto com β-galactosidase, como antigene modelo. Este lipopéptido exemplo especial foi seleccionado devido às suas propriedades intrínsecas previamente determinadas (propriedades bioquímicas, actividade estimuladora de macrófagos) . Desde que não seja indicado nada em contrário, o lipopéptido utilizado nos exemplos é S-[2,3-bispalmitoiloxipropil]cisteínil-GNNDESNISFKEK, a seguir designado simplesmente por "MALP-2". 17

As doses para o MALP-2 foram, primeiramente, delimitadas por meio de estudos prévios, nos quais MALP-2 foi administrado por via subcutânea, intradérmica, intranasal ou intraperitoneal a ratos. Em todos os protocolos, a administração simultânea ou conjunta de MALP-2 com β-galactosidase conduziu a um aumento significativo da produção de anticorpos específicos para a β-galactosidase. As respostas imunes induzidas, as quais foram obtidas na presença de MLP-2 após a vacinação por via intranasal ou intraperitoneal, foram depois analisadas e comparadas com as obtidas nos ensaios de comparação com CTB como adj uvante.

Os exemplos indicam que a utilização de MALP-2 numa dose de apenas 0,5 pg por administração conduzia a um aumento significativo tanto das respostas humorais, como das respostas celulares específicas para a β-galactosidase. Já a administração intraperitoneal conduziu a uma resposta imune melhorada, contudo a via intranasal demonstrou ser ainda mais eficaz. Contrariamente a isto, foi necessário um excesso molar de CTB triplo para se obter respostas sistémicas ou humorais da mucosa comparativas. Relativamente às respostas celulares, as células de baço de ratos imunizados com MALP-2 mostraram uma proliferação nitidamente mais elevada (p < 0,05) que aquelas de animais que foram vacinados com um excesso molar de CTB triplo. A resposta primária obtida com MALP-2 como adjuvante administrado por via intranasal foi, relativamente à cinética da resposta de anticorpos específicos para a β-galactosidase, caracterizada pela presença de um título de anticorpo elevado, o qual alcançava quase o nível máximo já após a primeira imunização. Respostas humorais e 18 celulares eram mais intensas após vacinação por via i.n., o que sugere uma acção local diferenciada por parte do MALP-2, a qual poderia ser atribuída ou à sua biodisponibilidade ou à distribuição espacial dos receptores específicos nas células alvo. Tal como já descrito, foram também detectadas respostas imunes nítidas em tecidos de mucosas não directamente alcançáveis pela via da vacinação, nomeadamente IgA específica para β-galactosidase em lavagens pulmonares e vaginais.

Por conseguinte, as análises no âmbito da invenção resultam no facto de os lipopéptidos de acordo com a invenção serem novos e potentes adjuvantes da mucosa, em que a necessidade de conjugar o antígene alvo com o lipopéptido activo deixa de existir, contrariamente ao que acontece com outros lipopéptidos.

Durante todo o decorrer das experiências não foram observados quaisquer efeitos secundários graves ou indícios de toxicidade crónica ou aguda nos animais vacinados. Devido à unidade peptídica relativamente curta nos lipopéptidos de acordo com a invenção, persiste uma imunogenicidade relativamente reduzida, o que minimiza o perigo de surgirem respostas imunes contra os próprios lipopéptidos. Isto representa uma nítida vantagem relativamente a proteínas como adjuvantes. Após administração intranasal de MALP-2 como adjuvante, não puderam ser detectados quaisquer anticorpos anti-MALP-2. Isto representa uma clara vantagem relativamente a proteínas como adjuvantes, uma vez que uma resposta imune contra o próprio adjuvante, pode comprometer uma resposta imune posterior com outra vacina, a qual foi administrada com o mesmo adjuvante. Os lipopéptidos de acordo com a 19 invenção podem ser utilizados em vacinas contra diferentes agentes patogénicos, assim como em vacinas contra o cancro ou vacinas para o controlo da fertilidade. Vantagens adicionais da invenção residem na boa estabilidade dos lipopéptidos durante o armazenamento, maior pureza dos lipopéptidos que podem ser produzidos por via sintética e comportamento químico e bioquímico controlável.

Legendas das figuras:

Fig. 1. Análises in vitro com células dendítricas primárias: células dendítricas primárias de medula óssea de ratos BALB/c foram obtidas por meio da utilização de GM-CSF recombinante (5 x 104 U/mL) por maturação in vitro de percursores. As células dendítricas maduras foram estimuladas com 10 ng/mL de lipopolissacárido de E. coli (LPS), ou 5 ng/mL de MALP-2. Subsequentemente, as células foram marcadas duplamente com anticorpos específicos para CDllc (marcador de células dendítricas) em combinação com anti-CD40 ou anti-CD80 ou anti-CD86. A expressão de CD40, CD80 ou CD86 em células marcadas com CDllc foi analisada com auxílio da citometria de fluxo. Os resultados são expressos em percentagem de células positivas, relativamente à população CDllc positiva total.

Fig. 2. Análise de células dendítricas após tratamento com MALP-2 com auxílio de citometria de fluxo (FACScan): Células dendítricas primárias de medula óssea de ratos BALB/c foram obtidas por meio da utilização de GM-CSF recombinante (5 x 104 U/mL) por maturação in vitro de percursores. As células dendítricas maduras foram 20 estimuladas com 10 ng/mL de lipopolissacárido de E. coli (LPS), ou 5 ng/mL de MALP-2. Subsequentemente, as células foram marcadas duplamente com anticorpos específicos para CDllc (marcador de células dendítricas) em combinação com anti-CD40 ou anti-CD80 ou anti-CD86, e as células analisadas por meio de citometria de fluxo. Os "gates" foram fixados com base numa marcação com isótopos de anticorpos de controlo não relacionados.

Fig. 3. Respostas humorais, provocadas após uma vacinação com MALP-2 como adjuvante:

Ratos foram imunizados por via subcutânea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intradérmica (i.d.) e intranasal (i.n.), quer com β-galactosidase pura (40 pg) ou β-galactosidase misturada com MALP-2 (0,5 pg) , nos dias 0, 7 e 14. No dia 28, após a primeira imunização, foram recolhidas amostras de soro e o título de anticorpos específicos para a β-galactosidase foi determinado por meio de ELISA. Os resultados encontram-se representados como o log2 recíproco da média geométrica do título final. Para controlo utilizamos um grupo, no qual os animais foram imunizados pela via com β-galactosidase, mediante a utilização de hidróxido de alumínio como adjuvante.

Fig. 4. Respostas humorais, provocadas após a vacinação mediante a utilização de MALP-2 como adjuvante, numa dose de 1 pg por animal e imunização:

Ratos foram imunizados pela via intraperitoneal (i.p.) e intranasal (i.n.), quer com β-galactosidase pura (40 pg/dose) ou β-galactosidase misturada com MALP-2 (1 pg/dose) , nos dias 0, 7 e 14. No dia 28, após a primeira 21 imunização, foram recolhidas amostras de soro e o titulo de anticorpos específicos para a β-galactosidase foi determinado por meio de ELISA. Os resultados encontram-se apresentados como valor de absorvência (DO 405 nm).

Fig. 5. Reacções celulares provocadas após uma vacinação, mediante a utilização de diferentes concentrações de MALP-2 como adjuvante.

Respostas de proliferação de células T específicas para a β-galactosidase de células de baço de ratos, imunizados pelas vias i.p. ou i.n., quer com β-galactosidase pura (40 pg/dose), quer com β-galactosidase misturada com MALP-2 (1 ou 0,5 pg/dose), nos dias 0, 7 e 14. No dia 28, após a primeira imunização, os animais foram mortos e as células de baço foram re-estimuladas in vítro, durante quatro dias, na presença de 20 pg/mL de β-galactosidase solúvel. Os resultados encontram-se apresentados como índices de estimulação (cpm amostras/cpm em células de controlo não estimuladas).

Fig. 6. Cinética de respostas de IgG específicas para β-gal em soros de ratos vacinados:

Grupos de animais (n=5) foram vacinados, quer por via i.n. (A) ou i.p. (B) com 50 pg de β-gal (), β-gal mais 10 pg de CTB (), β-gal mais 0,5 pg de MALP-2 () ou solução tampão pura (). Os dias da vacinação (dia 0, 14 e 21) encontram-se marcados com as setas. Os resultados encontram-se representados como log2 recíproco do título final geométrico, a SEM (desvio padrão médio) encontra-se indicado por meio linhas verticais. 22

Fig. 7. IgA específica para a β-galactosidase em lavagens pulmonares e vaginais de ratos vacinados por via i.n.:

Os resultados encontram-se representados como percentagem de IgA específica para a β-galactosidase, relativamente à IgA total presente. 0 SEM encontra-se indicado por meio de linhas verticais.

Fig. 8. Determinação dos níveis de IgE no soro após imunização mediante a utilização de MALP-2 como adjuvante:

Ratos foram vacinados por via intraperitoneal (i.p.) e intranasal (i.n.), quer com β-galactosidase pura (40 pg) , sem MALP-2, ou com β-galactosidase misturada com MALP-2 (0,5 pg) , nos dias 0, 7 e 14. No dia 28, após a primeira imunização, foram recolhidas amostras de soro, e os níveis de IgE foram determinados por meio de "Capture-ELISAs". Os resultados encontram-se apresentados como concentrações de IgE (ng/mL).

Fig. 9. Respostas de proliferação de células T específicas para a β-galactosidase do baço (A e B) e de células de nódulos linfáticos regionais (C) de ratos vacinados por via i.p. ou i.n.:

As células re-estimuladas in vitro durante quatro dias, com diferentes concentrações de β-galactosidase solúvel. Os resultados encontram-se apresentados como valor cpm médio subtraído do valor base de células não estimuladas de triplicados. O SEM encontra-se representado por linhas verticais.

Fig. 10. Perfis de Th estimulados em ratos vacinados: 23

Isotipos e citoquinas de IgG específicos para a β-galactosidase sérica, separados de células de baço estimuladas in vitro, foram determinados por meio de ELISA nos ratos vacinados. Os resultados encontram-se representados como relações de concentração de IgGl/IgG2a e IL-10/IL-2 (as citoquinas encontradas mais frequentemente).

Fig. 11. Citoquinas separadas de células estimuladas in vitro de ratos vacinados: A produção de citoquinas foi medida por meio de ELISA no sobrenadante líquido de células, as quais foram cultivadas durante 48 (IL-2) e 96 horas (IFNy, IL-4 e IL-10) , na presença de β-gal (20 μg/mL). Os resultados encontram-se apresentados como a relação entre as quantidades de citoquinas encontradas nos grupos vacinados, em comparação com os ratos de controlo não vacinados.

Fig. 12: Respostas humorais estimuladas após a vacinação com MALP-2 como adjuvante, numa dose de 2 μρ por animal por imunização. Os ratos foram imunizados por via oral quer com β-galactosidase sozinha (100 μg/dose), quer com β-galactosidase misturada com MALP-2 (2 μg/dose), nos dias 0, 7, 14 e 31. No dia 45, após a primeira imunização, foram recolhidas amostras de soro, e os títulos de anticorpos específicos para a β-galactosidase determinados por ELISA.

Exemplo 1: Estimulação in vitro por meio de MALP-2 de células denditricas de roedente obtidas primeiramente a partir de medula óssea. 24

Protocolo do ensaio: culturas de células dendítricas obtidas primeiramente a partir de medula óssea foram obtidas de ratos BALB/c, após maturação in vitro de percursores, na presença de GM-CSF recombinantes (5 x 104 U/mL), segundo o processo usual. As células dendítricas maduras foram estimuladas com lipopolissacárido de E. coli (LPS) ou com 5 ng/mL de MALP2. Após 12 ou 24 horas de estimulação, as células foram analisadas com auxílio da citometria de fluxo, para verificar a expressão de marcadores superficiais, os quais são relevantes para a capacidade de apresentação de anticorpos.

Para encontrar compostos, que, no caso da utilização in vitro, possuem um potencial como adjuvantes na área da vacinação, foi realizada uma primeira análise in vitro com culturas primárias de células dendítricas derivadas de medula óssea. Foram seleccionadas células dendítricas, uma vez que estas são as células apresentadoras de antigenes mais eficazes e desempenham um papel chave na resposta imune primária. Na realidade são o único tipo de células, que in vivo é capaz de activar células T em repouso, para iniciar uma resposta imune primária. Por conseguinte, as células dendítricas foram tratadas com as unidades analisadas ou com LPS, o que serviu de controlo.

Foram recolhidas amostras em diferentes alturas, marcadas com anticorpos marcados com fluorescência, que são específicos para marcadores celulares, os quais são decisivos para a capacidade de apresentar antigenes das células dendítricas, e analisadas por meio de citometria de fluxo. Os resultados observados (Fig. 1 e 2) mostram que, em contraste com o grupo de controlo positivo, a expressão de CD40 e da molécula co-estimulada CD86 nas células 25 dendítricas tratadas com MALP-2, não estava aumentada. A acção sobre a expressão da molécula co-estimulada CD80 foi reduzida, se é que existente. As moléculas co-estimuladas enviam sinais, os quais são adicionalmente essenciais para a apresentação dos epitopos em questão, no contexto da molécula MHC, para a activação eficaz das células T. Já foi anteriormente divulgado que a acção de adjuvantes das mucosas aprovados (adjuvantes da mucosa), como por exemplo, a toxina da cólera, está relacionada com uma intensificação selectiva da expressão de moléculas co-estimuladas. Consequentemente, os resultados observados in vitro apontam fortemente para o facto de o MALP-2 não apresentar nenhum ou apresentar um reduzido potencial como adjuvante das mucosas.

Exemplo 2: Respostas humorais provocadas após uma vacinação por meio de diferentes vias, mediante a utilização de MALP-2 como adjuvante, em diferentes concentrações.

Protocolo do ensaio: Ratos BALB/c-(H-2d) fêmea, com seis a oito semanas de idade, foram comprados à Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemanha), e tratados conforme as directrizes locais e da UE. Grupos de 5 ratos cada foram vacinados, quer com 40 μς de β-galactosidase pura (Boehringer, Mannheim, Alemanha) , quer em mistura com 1 ou 0. 5 μρ de MALP-2 sintético, nos dias 1, 7 e 14. Para a administração intranasal (i.n) são aplicados 10 μΡ em cada fossa nasal, enquanto que, no caso da injecção i.p., s.c. e 1. d., a β-galactosidase, com ou sem MALP-2, foi ressuspendida em 400, 100 ou 100 μΕ de PBS. 28 dias após a vacinação foram recolhidas amostras de soro e guardadas a -20°C até à determinação dos anticorpos específicos para a 26 β-gal. Placas de teste Nunc-Immuno MaxiSorp com 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 μρ de β-galactosidase (Boehringer, Mannheim, Alemanha) com 5 μg/mL em tampão carbonato 0,05 M (pH 8,2) por poço. Foram adicionadas (100 μg/poço) diluições de soro com 1% de BSA e 0,05% de Tween-20 em PBS, e as placas incubadas a 37°C, durante 24 horas. Após a lavagem, foi adicionada IgG anti-rato de cabra biotinilada especifica para a cadeia γ (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemanha) e as placas foram incubadas durante mais uma hora a 37°C. Após quatro lavagens, foram adicionados às células 100 μ-L de estreptavidina conjugada com peroxidase (Pharmingen) e as placas foram incubadas durante 30 minutos, a 37°C. Após quatro lavagens, as reacções foram reveladas com ABTS em tampão citrato fosfato 0,1 M (pH 4,35), o qual continha 0,01% de H202. Os resultados foram representados ou segundo a absorvência a 405 nm ou segundo os títulos finais (log2 recíproco da última diluição, a qual, após uma incubação de 30 minutos a 405 nm, originou uma densidade óptica de 0,1 unidades nos valores do grupo de controlo negativo).

Apesar dos resultados decepcionantes, que foram observados na análise in vitro de células dendítricas primárias, mediante a utilização de MALP-2, decidimos incluir, na análise secundária in vivo, grupos de animais que foram vacinados mediante a utilização de MALP-2 como adjuvante. Assim, os ratos foram vacinados, quer com o antigene modelo β-galactosidase puro, quer com o antigene mais MALP-2, por via i.p., s.c., i.d. e i.n. Ao contrário do esperado, verificou-se uma forte acção adjuvante, quando o antigene estava misturado com 0,5 μg de MALP-2 e, na realidade, independentemente do tipo e via de aplicação (Fig. 3) . As 27 reacções mais intensas foram verificadas para as vacinações i.p. e i.n. No entanto, as respostas foram sempre pelo menos tão intensas (i.d.) ou mais intensas que no caso da utilização de hidróxido de alumínio como adjuvante padrão, para a injecção s.c. (Fig. 3).

Uma vez que, para as análises anteriores, mediante a utilização de lipopéptidos convencionais, foram administradas concentrações substancialmente superiores dos componentes utilizados como adjuvante, era de analisar o efeito de doses superiores de MALP-2. Para este fim, foram vacinados animais com 1 μς de MALP-2, como adjuvante, com β-galactosidase, através das duas vias de imunização mais eficazes (i.p. e i.n.). Ao contrário do esperado, o aumento da dose de MALP-2 conduziu a uma anulação da acção do adjuvante (Fig. 4) . Isto demonstrou que, no caso de uma utilização das concentrações padrão, as quais se encontram indicadas na literatura para outros lipopéptidos, não estávamos na posição de verificar um efeito adjuvante ao nível das respostas humorais para análises in vivo de MALP-2 .

Exemplo 3: Respostas humorais provocadas após a vacinação por meio de diferentes vias, mediante a utilização de MALP-2 como adjuvante, em diferentes concentrações.

Protocolo do ensaio: Ratos BALB/c-(H-2d) fêmea, com seis a oito semanas de idade, foram comprados à Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemanha), e tratados conforme as directrizes locais e da UE. Grupos de 5 ratos cada foram vacinados, quer com 40 μς de β-galactosidase pura (Boehringer, Mannheim, Alemanha) , quer em mistura com 1 ou 28 0,5 μg de MALP-2 sintético, nos dias 1, 7 e 14. Para a administração intranasal (i.n) foram aplicados 10 μΡ em cada fossa nasal, enquanto que, no caso da injecção i.p. a β-galactosidase, com ou sem MALP-2, foi ressuspendida em 400 μΡ de PBS. Os baços foram removidos e juntos (reunidos) para a determinação das reacções imunes celulares. As células foram cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina, 50 μg/mL de estreptomicina, 5 x 10~5 M de 2-mercaptoetanol e 1 mM de L-glutamina (GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemanha) , a 37°C, numa atmosfera húmida com 5% de CO2. As suspensões de células de baço foram ajustadas para 5 x 106 células/mL em meio total. Estas foram introduzidas para 100 μΕ/poço, numa placa de microtitulação de fundo plano (Nunc) de 96 poços, e estas placas foram incubadas durante 4 dias, mediante a adição de 20 μρ/ιηΕ de β-galactosidase solúvel. Durante as últimas 18 horas de cultivo, foi adicionado a cada poço 1 μΟί de [3H]timidina (Amersham International, Freiburg, Alemanha). As células foram, em seguida, colhidas para um papel de filtro (Filtermat A; Wallac, Freiburg, Alemanha) com um colector de células (Inotech, Wohlen, Suíça) e a quantidade de [3H]timidina incorporada no DNS das células multiplicadas foi determinada com auxílio de um contador de cintilações γ (Wallac 1450, Micro-trilux). Os resultados encontram-se representados como a média aritmética da absorção de [3H]timidina em cpm. Os resultados encontram-se indicados como índices de estimulação (SI, cpm em amostras/cpm em células de controlo não estimuladas).

Mediante a observação da diminuição surpreendente do efeito do adjuvante ao nível da resposta humoral, a qual foi observada por utilização de dosagens maiores de MALP-2, 29 decidiu-se verificar se era possível observar-se um efeito semelhante ao nível das respostas imunes celulares. Por conseguinte, foram imunizados ratos, quer com β-galactosidase pura, quer com β-galactosidase misturada com 1 μρ de MALP-2. Vinte e oito dias após a imunização, os baços foram purificados, re-estimulados in vitro com 20 μg/mL de β-galactosidase, e a sua capacidade de multiplicação foi determinada com auxílio da medida de incorporação de [3H]timidina no seu DNS, por meio de um contador de cintilações γ. Os resultados alcançados (Fig. 5) confirmam que a utilização de MALP-2 em dosagens maiores conduz não só ao facto de não poderem ser mais verificadas quaisquer respostas humorais, mas também ao facto de a imunização mediada por meio das células ser reduzida.

Exemplo 4: Administração intranasal e intraperitoneal conjunta de MALP-2 com um antigene solúvel estimula respostas humorais sistémicas eficazes.

Protocolo do ensaio: Ratos BALB/c-(H-2d) fêmea, com seis a oito semanas de idade, foram comprados à Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemanha), e tratados conforme as directrizes locais e da UE. Grupos de 5 ratos cada foram vacinados, quer com 40 μg de β-galactosidase pura (Boehringer, Mannheim, Alemanha), quer em mistura com 0,5 μg de MALP-2 sintético ou 10 μg de subunidade B da toxina da cólera (CTB; ICN Biochemicals Inc., Ohio), como adjuvante padrão, nos dias 1, 14 e 21. Para a administração intranasal (i.n) foram aplicados 10 μΒ em cada fossa nasal, enquanto que, no caso da injecção i.p. a β-galactosidase, com ou sem MALP-2, foi ressuspendida em 400, 100 ou 100 μΒ de PBS. Foram recolhidas amostras de soro em diferentes 30 alturas (dia 0, 13, 20 e 30) e guardadas a -20°C até à determinação do anticorpo especifico para a β-galactosidase. Placas de teste Nunc-imumno MaxiSorp, com 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca), foram revestidas com 100 μΒ de β-gal (Boehringer, Mannheim, Alemanha), com 5 μρ/ητιΒ em 0,05 M de tampão carbonato (pH 8,2), por poço. Às mesmas foram adicionadas diluições duplas em série dos soros ou lavagens em PBS com 1% de BSA e 0,05% de Tween-20 (100 μΒ/poço), e as placas foram incubadas durante 24 horas a 37°C. Após a lavagem foi adicionada IgG anti-rato de cabra biotinilada especifica para a cadeia γ (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemanha) e as placas foram incubadas durante mais uma hora a 37 °C. Após quatro lavagens foram adicionados às células 100 μΒ de estreptavidina conjugada com peroxidase (Pharmigen), e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Após quatro lavagens, as reacções foram reveladas por meio de ABTS em tampão citrato fosfato 0,1 M (pH 4,35), o qual continha 0,01% de H2O2. Os resultados foram representados como o log2 reciproco da última diluição, a qual, após uma incubação de 30 minutos, originou uma densidade óptima a 405 nm de 0,1 unidades, em comparação com os valores do grupo de controlo negativo.

Devido aos resultados encorajadores dos pré-ensaios, decidimos analisar em detalhe as reacções imunes verificadas aquando a utilização de MABP-2 como adjuvante, através de ambas as vias de imunização mais eficazes, e compará-las com as de um adjuvante da mucosa aprovado. Por conseguinte, foi avaliada a capacidade do MABP-2 em provocar uma reacção imune humoral eficaz, na medida em que foram determinados os títulos séricos de anticorpos específicos para a β-galactosidase, em ratos vacinados. Tal 31 como apresentado na Fig. 6, a administração de β-galactosidase pura (50 μρ/άοεβ) provocou a indução de títulos de anticorpo muito reduzidos, mesmo após um segundo reforço (título final cerca de 1000) . Em comparação, a administração de β-galactosidase, mediante a utilização de MALP-2 i.n., induziu já para uma dose simples um título muito elevado (> 60 000) de IgG específica, em todos os ratos, e no final do protocolo de imunização, os títulos situavam-se acima dos 500 000 (Fig. 6) . A cinética e a eficácia conjunta das reacções dos anticorpos, que foram enriquecidos com 0,5 μρ de MALP-2, foram bastante semelhantes àquelas que foram alcançadas com a administração da β-galactosidase com 10 μρ de CTB, um adjuvante da mucosa aprovado, o qual foi utilizado como substância de controlo positivo.

Foi igualmente observado um nítido efeito adjuvante, quando o MALP-2 foi aplicado i.p. Em especial, a co-injecção de MALP-2 conduziu a um aumento do título de IgG específica para a β-galactosidase de 100 vezes, comparativamente ao título no caso de animais que foram imunizados com β-galactosidase pura (Fig. 6B). Esta diferença era já verificada após a primeira imunização e foi mantida após uma injecção de reforço. No 31° dia, foram observados títulos de anticorpos semelhantes nos animais que foram imunizados quer i.n, quer i.p. No entanto, as reacções primárias após a co-injecção de MALP-2, por meio da vacinação i.n, foram mais pronunciadas.

Exemplo 5: Co-administração intranasal de MALP-2 com um antigene solúvel estimula respostas de anticorpos nas mucosas eficazes. 32

Protocolo do ensaio: No 31° dia os ratos foram sacrificados e foram retiradas as mostras finais. Foram obtidas lavagens vaginais e pulmonares, na medida em que os órgãos foram lavados com 1 mL de PBS, suplementado com 50 mM de EDTA, 0,1% de BSA e 10 mM de PMSF. As lavagens foram, subsequentemente, centrifugadas para eliminar detritos tecidulares (10 mins a 3000 g) , e o liquido residual foi guardado a -20°C. Para determinar a concentração total de IgA no liquido de lavagem dos pulmões e da vagina, foram incubadas em placas de microtitulação diluições em série das amostras correspondentes, sendo que estas placas foram previamente revestidas com IgA anti-rato de cabra (Sigma Chemie), como anticorpo de captura (100 μΒ/ροςο). Foram utilizadas diluições em série de IgA de rato purificada (Sigma Chemie), para a construção de uma curva padrão.

Para analisar a capacidade do MALP-2 para estimular respostas da mucosa contra antigenes, que foram co-administrados por via i.n, foi analisada a produção de IgA específica para a β-galactosidase no líquido de lavagem pulmonar e vaginal dos animais imunizados. Enquanto que após a vacinação por via i.n com β-galactosidase pura não ocorreu qualquer produção de IgA específica para a β-galactosidase no líquido de lavagem pulmonar em quantidades detectáveis, no caso dos animais imunizados com β-galactosidase e MALP-2 verificou-se um aumento significativo dos níveis de IgA específica para o antigene (Fig. 7). A co-administração de MALP-2 conduziu à estimulação de uma produção de IgA eficaz também em mucosas distantes, como comprovado pela presença de concentrações significativas de IgA específica para a β-galactosidase no líquido de lavagem vaginal (Fig. 7). Não foram verificadas 33 quaisquer diferenças estatisticamente significativas nos níveis de anticorpos específicos para a β-galactosidase nas mucosas, entre animais que foram imunizados com 0,5 μg de MALP-2 ou 10 μg de CTB.

Exemplo 6: A imunização mediante a utilização de MA1P-2 como adjuvante não conduziu a mais IgE sérica.

Protocolo do ensaio: Para a determinação da concentração da IgE total no soro de animais de controlo e imunizados, foram incubadas diluições em série das amostras correspondentes em placas de microtitulação, as quais foram previamente revestidas com IgE anti-rato (100 μΕ/poço), como anticorpo de captura. Após bloqueamento com PBS com 1% de BSA e 0,05% de Tween-20, durante duas horas à temperatura ambiente, foi adicionada uma diluição de 1:100 do soro em PBS-Tween (100 μΕ/poço) , e as placas foram incubadas durante uma hora a 37 °C. Após a lavagem, foi adicionada IgE anti-rato biotinilada e as placas foram incubadas durante mais uma hora a 37°C. Após quatro lavagens, foram adicionados ao poço 100 μΕ de estreptavidina conjugada com peroxidase (Pharmingen) e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Após quatro lavagens, as reacções foram reveladas com ABTS em tampão citrato fosfato 0,1 M (pH 4,35) e um teor de 0,01% de H2C>2. Foram utilizadas diluições em série de IgE de rato purificada para construir uma curva padrão. É um facto conhecido que a utilização de determinados adjuvantes da mucosa pode conduzir a reacções alérgicas, devido a um aumento da produção de IgE. Para analisar esta hipótese, começámos por testar o efeito da administração de 34 MALP-2 no teor de IgE no soro. Como pode ser observado pela Fig. 8, a administração de MALP-2, por via parentérica (i.p.) ou por via da mucosa, não conduz a um aumento do teor de IgE no soro. Ao contrário, a presença de MALP-2 até parece ter um efeito positivo sobre o aumento do teor de IgE, como foi observado no 28° dia, após a vacinação com β-galactosidase pura, por via i.p.

Exemplo 7: MALP-2 estimula de forma eficaz reacções de proliferação medidas por células T, quando é administrado em conjunto com um antigene solúvel.

Protocolo do ensaio: Os nódulos linfáticos situados abaixo da mandíbula inferior e os baços foram removidos e reunidos para a análise das reacções imunes celulares. As células foram multiplicadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 10 U/mL de penicilina, 50 μρ/πιΕ de estreptomicina, 5 x 10"5 M de 2-mercaptoetanol e 1 mM de L-glutamina (GIBCO BRL, Karlsruhe, Alemanha) e guardadas a 37°C, numa atmosfera húmida com 5% de C02. As suspensões de células dos nódulos linfáticos e de baço foram ajustadas para 5 x 106 células/mL em meio total, introduzidas com 100 μΕ/ροςο, numa placa de microtitulação de fundo plano (Nunc) de 96 poços, e estas placas incubadas durante 4 dias, na presença de diferentes concentrações de β-galactosidase solúvel. Cada concentração foi testada em três grupos. Durante as últimas 18 horas de incubação, foi adicionado a cada poço 1 μΟί de [3H]timidina (Amersham International, Freiburg, Alemanha). As células foram, em seguida, colhidas para um papel de filtro (Filtermat A; Wallac, Freiburg, Alemanha) mediante a utilização de um colector de células (Inotech, Wohlen, Suíça) e a quantidade de [3H]timidina 35 incorporada no DNS das células multiplicadas foi determinada com auxilio de um contador de cintilações γ (Wallac 1450, Micro-trilux). Os resultados foram representados como a média aritmética da absorção de [3H]timidina em cpm.

As reacções imunes das células T foram analisadas ao 31° dia, na medida em que foi determinada a multiplicação das células, as quais foram obtidas a partir de nódulos linfáticos regionais e baços, após a re-estimulação in vitro com β-galactosidase. As células de baço de animais que haviam sido vacinados por via i.p. com β-galactosidase pura, foram utilizadas como grupo de controlo positivo, e apresentaram uma reacção de multiplicação significativa, em comparação com o grupo não imunizado (Fig.9A). Foi verificado um aumento adicional da proliferação, no caso das células de baço, que provinham de animais que haviam levado uma co-injecção de MALP-2 e antigene (p < 0,05). Enquanto que a administração i.n. de β-galactosidase pura não provocou qualquer multiplicação celular detectável, a co-administração de MALP-2 conduziu a uma resposta de proliferação efectiva, quer a nivel regional (células de nódulos linfáticos) , quer a nivel sistémico (células de baço) (Fig. 9B e C) . Notável é o facto que a proliferação de células T mais forte tenha sido observada em células de baço de ratos, nos quais o MALP-2 e a β-galactosidase foram aplicados por via i.n. (Fig. 9B) . Em todos os casos, foi observado um efeito nítido dependente da dose, por meio do aumento da concentração de β-galactosidase durante a re-estimulação (5, 10, 20 μΡ/πΛ). Finalmente, a utilização de MALP-2 (0,5 μg) como adjuvante, conduziu a um aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) da multiplicação 36 das células T, em comparação à imunização por via i.n. com (10 μς) mais β-galactosidase (Fig. 8B).

Exemplo 8: Análise de padrões de auxiliares T, provocados por meio da utilização de MALP-2 como adjuvante.

Protocolo do ensaio: Placas de teste Nunc-Immuno MaxiSorp com 96 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 μ]9 de β-galactosidase (Boehringer, Mannheim, Alemanha), para 5 μΒ/πΛ em tampão carbonato 0,05 M (pH 8,2), por poço. Foram adicionadas diluições duplas em série de soro ou liquido de lavagem em PBS, com 1% de BSA e 0,05% de Tween 20 (100 μΐ,/poço) , e as placas foram incubadas durante 2 horas a 37°C. Após a lavagem, foram adicionadas IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3 anti-rato de ratazana, conjugadas com biotina (Pharmingen, Hamburgo, Alemanha) , para determinar as subclasses de Ig. As placas foram incubadas durante mais uma hora a 37°C. Após quatro lavagens, foram adicionados às células 100 μΐ, de estreptavidina conjugada com peroxidase (Pharmingen) , e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Após quatro lavagens, as reacções foram reveladas com ABTS em tampão citrato fosfato 0,1 M (pH 4,35), o qual continha 0,01% de H202. Para determinar a concentração das subclasses de IgG no soro, foram construídas curvas padrão, na medida em que os poços foram revestidos com uma IgG anti-rato de cabra específica para um isotipo e, depois, incubados com anticorpos para IgGl, IgG2a, IgG2b ou IgG3 de rato purificados (Dianova, Hamburgo, Alemanha).

Os sobrenadantes líquidos de culturas de células que se multiplicam foram recolhidos nos dias 2 e 4, e guardados a 37 -70°C. A determinação de IFN-γ IL-2, IL-4 e IL-10 foi realizada por meio de ELISA, em que foram utilizados anticorpos comerciais da Pharmingen, de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, placas de microtitulação de 96 poços foram revestidas, durante a noite, a 4°C, com os mABs IFN-y-anti-rato de ratazana, anti-IL-2, anti-IL-4 ou anti-ILlO (Pharmingen). Após três lavagens, as placas foram bloqueadas e os sobrenadantes líquidos foram introduzidos nos poços. Para cada citoquina, foi construída uma curva padrão, na medida em que foram utilizadas as correspondentes citoquinas recombinantes de roedentes (Pharmingen). As placas foram incubadas durante 4 horas à temperatura ambiente. Após a lavagem, foram adicionados ao poço os mABs IFN-γ anti-rato de ratazana biotinilado IL-2, IL-4 ou IL-10, e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. Após seis lavagens, foi adicionado o conjugado estreptavidina-peroxidase e as placas foram incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as placas foram reveladas com ABTS como acima descrito.

Em primeiro lugar foi determinada a distribuição das subunidades da IgG específica para a β-galactosidase, a qual estava presente no soro dos ratos imunizados. Como indicado na Tabela 1, o tipo principal do isotipo de Igl específico para a β-galactosidase foi a IgGl, independentemente do protocolo de imunização. Este padrão de reacção das Th2 dominante podia já ser reconhecido após a primeira dose de vacina e mantém-se durante os reforços posteriores. A IgGl foi o único isotipo, que foi verificado no caso da administração de β-galactosidase pura, enquanto que a co-administração com CTB ou MALP-2 levou à 38 verificação de outros isotipos específicos para a β-galactosidase, nomeadamente IgG2a (tipo Thl), IgG2b (Tipo Th2) e IgG3 (tipo Thl). Mesmo assim a proporção de IgGl/2a (Fig. 10), IgGl/2b ou IgGl/3 manteve-se maior do que 100.

Tabela 1. Isotipo de IgG específico para a β-galactosidase no soro de ratos imunizados3

Grupo de imunização IgGl IgG2a IgG2b IgG3 β-gal (i.n.) 22,6+/-21,3 0,7+/-0,5 0,3+/-0,1 0,6+/-0,0 β-gal+MALP-2(i.n.) 6439,0+/-1775, 20,8+/-5,4 43,3+/-18,9 2,4+/-0,5 β-gal+CTB (i.n.) 4108,3+/-1437, 31,9+/-9,5 49,2+/-17,3 2,4+/-0,6 β-gal (i.p.) 191,5+/-132,1 0,1+/-0,0 0,5+/-0,1 0,6+/-0,0 p-gal+MALP-2 (i.p.) 2829,7+/-1119, 10,0+/-2,8 15,8+/-6,2 2,3+/-0,6 Grupo de controlo 0,4+/-0,0 0,23+/-0,0 0,1+/-0,0 0,4+/-0,0 a Os resultados por grupo) são apresentados como a média ^g/mL) ± SEM (5 ratos

Para caracterizar adicionalmente o tipo da reacção de Th, a qual foi provocada por meio da imunização, foi medido o teor de IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 nos sobrenadantes líquidos de células de baço estimuladas ín vitro (Fig. 11A) . Verificou-se que, destas quatro citoquinas, a IL-10 era a mais representada, o que indica que foi gerado um padrão de resposta Th2. O teor de IL-10 foi significativamente maior nos ratos, que haviam sido imunizados com MALP-2, do que no grupo de controlo (2,2 ng/mL em comparação com 0,009 ng/mL, p < 0,005) e, também em comparação com animais, nos quais havia sido utilizado CTB como adjuvante da mucosa (0,6 ng/mL, p < 0,05) . O padrão de resposta observado com uma citoquina dominante do 39 tipo Th2 estava de acordo com a verificação da IgGl especifica para a β-galactosidase, nos mesmos animais (Fig. 10) . Na realidade, a forte estimulação da IL-10 está de acordo com o papel que esta citoquina desempenha na inibição da síntese de citoquinas por células Thl, no melhoramento da proliferação de células B e na estimulação da produção de IgA.

Apesar do facto de no meio de cultura celular de células, que são obtidas a partir de nódulos linfáticos regionais, terem sido verificados reduzidos valores absolutos da concentração de citoquina, o padrão geral igualou o verificado para as culturas de células de baço (Fig. 10) . Interessante é, na realidade, o facto de a secreção de IL-10 e IL-4 também ter sido estimulada nas células de ratos, que haviam sido imunizados por via i.p. com β-galactosidase pura, mas as citoquinas de Thl, IL-2 e IFN-γ terem ficado abaixo do limite de detecção. Em contrapartida, a IL-2 e o IFN-γ foram também observados em ratos, que haviam obtido o antigene misturado com CTB ou MALP-2 (Fig. 10) . Estes resultados estão de acordo com os padrões de isotipos de IgG verificados (Tabela 1) e confirmam que, embora dominem tipos de reacção Th2, o MAPL-2 também suporta a estimulação de células Thl.

Exemplo 9: Imunização oral com o antigene modelo β-galactosidase, mediante a utilização de MALP-2 como adjuvante da mucosa.

Ratos BALB/c-(H-2d) fêmea, com seis a oito semanas de idade, foram comprados à Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemanha), e tratados conforme as directrizes locais e as directrizes da União Europeia. Grupos de 5 ratos cada foram 40 imunizados por via oral (dose 25 μΙΟ , com 100 μς de β-gal (Boehringer, Mannheim, Alemanha), quer sozinha ou com 2 μg de MALP-2 sintético, como adjuvante, nos dias 1, 14, 21 e 31. No dia 45 foram recolhidas amostras de soro e guardadas a -20°C, até à determinação de anticorpos específicos para a β-gal. Placas de teste de 96 poços Nunc-Immuno MaxiSorp® (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas com 100 μ]1 de β-gal, para 5 μg/mL em tampão carbonato 0,05 M (pH 8,2) por poço. Foram adicionadas (100 pL/poço) diluições duplas em série dos soros ou lavagens em PBS, com 1% de BSA e 0,05% de Tween 20, e as placas foram incubadas 2 horas a 37°C. Após a lavagem, foi adicionada IgG anti-rato de cabra biotinilada específica para a cadeia γ (Sigma Chemie, Deisenhofen, Alemanha), e as placas foram incubadas durante mais uma hora a 37°C. Após várias lavagens, foram adicionados às células 100 μΒ de estreptavidina conjugada com peroxidase (Pharmingen) , e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 37°C. Após quatro passos de lavagem, as reacções foram reveladas com ABTS em tampão citrato fosfato 0,1 M (pH 4,35), o qual continha 0,01% de H2O2. Os títulos finais foram expressos como os valores logarítmicos-log2 recíprocos da última diluição, o que após 30 minutos de incubação originou uma densidade óptica a 405 nm de 0,1 Unidades nos valores do controlo negativo. Respostas imunes contra β-gal foram apenas observadas em animais que haviam sido imunizados ou vacinados com MALP-2 como adjuvante da mucosa (vide Fig. 12). É de esperar que sejam provocadas reacções imunes também para diferentes dosagens, quer no fluido corporal, quer nas células, que são mais eficazes que as provocadas por administração sozinha do antigene. Para além disso, podem 41 ser verificadas reacções das mucosas especificas para o antigene, pelo menos localmente nos intestinos (por conseguinte, a presença de IgA de secreção especifica para o antigene em lavagens de intestino). Além disso, é de esperar que possam ser verificadas reacções secretoras em mucosas distantes.

Lisboa, 26 de Agosto de 2008

Claims (11)

1 REIVNDICAÇÕES 1. Utilização de um lipopéptido ou de uma lipoproteinas de estrutura (I)

em que Ri e R2, os quais podem ser iguais ou diferentes, representam C7_25-alquilo, C7-25-alcenilo ou C7-25-alcinilo X representa S, 0 ou CH2, R3 e R4, independentemente um do outro, representam H ou metilo e Y representa uma sequência de aminoácidos fisiologicamente compatível e não imunogénica per se na espécie utilizada, constituída por 1 a 25 resíduos de aminoácidos, e o átomo de carbono assimétrico marcado com * possui a configuração R absoluta, de acordo com a regra de Cahn-Ingold-Prelog, como adjuvante da mucosa na vacinação terapêutica ou profiláctica por via das mucosas.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de Y consistir de 12 a 25 aminoácidos.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de a sequência de aminoácidos Y ser seleccionada de entre: 2 a) GQTNT, b) SKKKK, C) GNNDESNISFKEK d) GQTDNNS SQSAAPGSGTTNT.

4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de a lipoproteina ou o lipopéptido de acordo com a estrutura (I) ser um péptido S-[2,3 bispalmitoiloxi-(2R)-propil]cisteinilo.

5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de o adjuvante da mucosa existir numa preparação com um componente de vacinação real, o qual está previsto para uma aplicação intranasal, intra-NALT, aerossol, oral, intrarectal, conjunctival, intravaginal ou intrauretral, ou uma aplicação nos canais de leite da mama feminina.

6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo facto de o adjuvante da mucosa existir num kit para a co- aplicação com uma vacina nos canais de leite da mama feminina, por via intranasal, intra-NALT, aerossol, oral, intrarectal, conjunctival, intravaginal ou intrauretral.

7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo facto de o lipopéptido ou a lipoproteina existir numa preparação com pelo menos outro adjuvante adicional e/ou antigene. 3

8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo facto de o lipopéptido ou a lipoproteina estar associado ou ligado a um agente veicular físico ou biológico.

9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo facto de o lipopéptido ou a lipoproteina ser administrado em conjunto com um ou mais anti-inflamatórios, anti-angiogénicos, substâncias citotóxicas ou imunomoduladoras, ou ligandos, ou com anticorpos, ou existir com os mesmos numa preparação.

10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo facto de o lipopéptido ou a lipoproteina existir numa preparação, a qual compreende aditivos e substâncias auxiliares adicionais, em particular, conservantes ou estabilizadores.

11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo facto de a vacina, a qual é acompanhada pelo adjuvante, na forma de péptidos, proteínas, ADN, polissacáridos, glicolípidos ou glicoproteínas. Lisboa, 26 de Agosto de 2008