PT1367898E - Mistura de bacillus thuringiensis subespécie israelensis e bacillus sphaericus para controlo de resistência a larvicidas de mosquito - Google Patents

Description

ΕΡ 1 367 898 /PT DESCRIÇÃO "Mistura de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis e Bacillus sphaericus para controlo de resistência a larvicidas de mosquito"

Campo do invento 0 invento refere-se a um método para controlar larvas de dípteros ou um método para inibir resistência a larvicida em dipteros, por introdução de uma quantidade eficaz como larvicida de uma combinação de uma estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis e de uma estirpe de Bacillus sphaericus obteníveis por um método de formulação específico descrito infra, num ambiente contendo larvas de dípteros; e uma composição da combinação obtenível pelo referido método. De preferência ambas as estirpes não são geneticamente modificadas.

Antecedentes do invento da ordem gerações são os animais, febre de

Os mosquitos e moscas negras são representantes Diptera que é constituída por pragas que há muitas têm atormentado humanos e animais. Os mosquitos principais vectores para várias doenças humanas e incluindo malária, febre-amarela, encefalite vírica, dengue e filaríase. Têm sido desenvolvidos vários pesticidas químicos com o objectivo de controlar dípteros. Por exemplo, revela-se o tratamento de uma fonte de água com um álcool solúvel em água numa forma miscível com água para eliminação de mosquitos em patente U.S. N° 6 077 521. Contudo, recentemente tem sido mais enfatizada a utilização de biopesticidas. Por exemplo, revelam-se formulações de libertação controlada de pelo menos um ingrediente pesticida biológico em patente U.S. N° 4 865 842; revela-se o controlo de larvas de mosquito com um Bacillus formador de esporos ONR-60A em patente U.S. N° 4 166 112; revelam-se novos isolados de Bacillus thuringiensis com actividade contra pragas de insecto díptero em patentes U.S. N° 5 275 815 e 5 847 079; revela-se uma cultura biologicamente pura de uma estirpe de Bacillus 2 ΕΡ 1 367 898 /PT thuringiensis com actividade contra pragas de insectos da ordem Diptera em patente U.S. N° 5 912 162 e revela-se um biopesticida obtido de modo recombinante activo contra dípteros incluindo cianobactérias transformadas com um plasmideo contendo uma proteína diptericida de B. thuringiensis subsp. israelensis fundida por tradução a uma sequência de gene de regulação forte e altamente activa, nativa de cianobactérias, em patente U.S. N° 5 518 897.

Contudo mesmo esses biopesticidas têm desvantagens pelo que a busca de novos biopesticidas continua. Uma desvantagem de determinados biopesticidas é o potencial desenvolvimento de resistência ao pesticida.

Define-se resistência através de diferenças de susceptibilidade que ocorrem entre populações da mesma espécie expostas a um pesticida continuamente ao longo de um período de tempo. Estas diferenças são identificadas por observação de um desvio estatístico na dose letal (LD) quer para matar 50% quer para matar 95% da população (LD50 ou LD95, respectivamente). Ocorrem diferenças individuais de susceptibilidade dentro de cada espécie e podem estar presentes pragas que são substancialmente menos susceptíveis, geralmente com baixas frequências, em pelo menos algumas das populações selvagens. Na presença do pesticida, são estas pragas substancialmente menos susceptíveis que sobrevivem e se reproduzem. Dado que a sua capacidade de sobreviver é o resultado da sua constituição genética, a sua constituição genética resistente é então passada à sua descendência resultando em alterações na susceptibilidade das populações através de selecção induzida através de pesticida. Tem sido encontrada resistência a larvicidas em determinadas espécies de dípteros.

Especificamente, o desenvolvimento de resistência a Bacillus sphaericus (B.s.) em Culex quinquefasciatus é verificado por Rodcharoen et ai., Journal of Economic Entomology, Vol. 87, N° 5, 1994, p. 1133-1140. Revela-se um método para ultrapassar esta resistência, por combinação de B.s. com cristais CytlA purificados isolados de Bacillus thuringiensis subsp. israelensis ou por combinação de um B.t.i. recombinante com B.s., em Wirth et al., Journal of 3

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Medicai Entomology, Vol. 37, N° 3, 2000, p. 401-407. RU 2 111 667 refere-se a um larvicida biológico utilizado para controlar mosquitos, baseado numa composição incluindo preparados de B. thuringiensis israelensis e B. sphaericus. WO 98/28984 A descreve a preparação, sob a forma de grânulos de gelo, de endotoxinas de B. thuringiensis e/ou B. sphaericus para combater larvas de mosquitos.

Poncet et al. (Applied and environmental Microbiology, vol. 63, n° 11, Novembro de 1997 (1997-11), 4413-4420) assim como Sun Fan et al. (World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2001, 17(4), 385-389 e Zhongguo Bingduxue, 2000, 15(supl.), 116-119) revelam a interacção sinérgica entre B. sphaericus e diferentes toxinas de B. thuringiensis israelensis (por exemplo, CrylAa, Cry4Aa, Cry4Ba e CryllAa) no controlo de larvas de mosquito e nomeadamente na inibição de resistência ao larvicida.

Contudo, seriam desejáveis larvicidas biológicos e composições melhoradas mas derivadas de fontes naturais ou de ocorrência natural para ultrapassar a resistência do mosquito Culex a aplicações de B.s.

Resumo sucinto do invento nao O invento refere-se a um método para preparar uma composição incluindo: uma combinação de uma estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis e uma estirpe de Bacillus sphaericus, incluindo o método as etapas de fermentar as estirpes separadamente, concentrar cada estirpe nos sólidos, concentração ou actividade pretendidos, combinação das estirpes concentradas para formar uma mistura pastosa e secar por pulverização a mistura pastosa para obter partículas individuais. O invento refere-se igualmente ao produto obtenível por este método. A estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis pode não ser modificada geneticamente, ou a estirpe de Bacillus sphaericus pode não ser modificada geneticamente, apesar de uma combinação presentemente preferida incluir uma estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis não modificada 4 ΕΡ 1 367 898 /PT geneticamente e uma estirpe de Bacillus sphaericus nao modificada geneticamente. A combinação pode ter desde cerca de 1:10 a cerca de 10:1 de razão de peso de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis para Bacillus sphaericus; de preferência desde cerca de 1:3 a cerca de 3:1 de razão de peso de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis para Bacillus sphaericus; com maior preferência desde cerca de 1:2 a cerca de 2:1 de razão de peso de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis para Bacillus sphaericus; e com a maior preferência com uma razão de 1:1 de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis para Bacillus sphaericus.

Podem também ser utilizadas componentes adicionais tais como agentes tensioactivos, transportadores inertes, conservantes, humidificantes, estimulantes de alimentação, agentes atractores, agentes de encapsulação, agentes de ligação, emulsionantes, corantes, protectores de U.V., tampões, agentes de controlo de arrastamento, auxiliadores de deposição de aerossol, agentes de escoamento livre ou suas combinações em conjunção com a combinação na composição larvicida. O invento também se refere a um método de controlar larvas de dípteros incluindo a etapa de introdução de uma quantidade eficaz como larvicida de uma combinação de uma estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis e de uma estirpe de Bacillus sphaericus obtenível pelo método definido supra num ambiente contendo larvas de dípteros. Neste método, dípteros podem ser um mosquitos como Culex pipiens, Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti, Culex tarsalis, Culiseta incidens, Anopheles freehorni ou uma sua combinação. O invento refere-se adicionalmente a um método para inibir resistência a larvicida em dípteros incluindo a etapa de introdução de uma quantidade eficaz como larvicida de uma combinação de uma estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis e de uma estirpe de Bacillus sphaericus obtenível pelo método definido supra num ambiente contendo larvas de dípteros. Preferentemente, o díptero é 5

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Culex e a resistência ao larvicida é desenvolvida contra Bacillus sphaericus.

Descrição detalhada do invento 0 invento refere-se a um método para controlar larvas de dípteros ou um método para inibir resistência a larvicida em dípteros por introdução de uma quantidade eficaz como larvicida de uma combinação de uma estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis com uma estirpe de Bacillus sphaericus obtenível por um método tal como definido supra num ambiente contendo larvas de dípteros; e uma composição da combinação obtenível pelo método definido supra. Preferentemente ambas as estirpes não são geneticamente modificadas. Segue-se uma discussão detalhada da composição e dos métodos que utilizam a composição.

As composições larvicidas

Os biopesticidas são uma classe de pesticidas de ocorrência natural frequentemente derivados de organismos unicelulares ou multicelulares que desenvolveram defesas naturais contra outros organismos. 0 grupo de microrganismos patogénicos para insectos é variado e diversificado. A bactéria Gram-positiva do solo Bacillus thuringiensis subsp. israelensis é uma das muitas estirpes de B. thuringiensis capaz de produzir proteínas insecticidas. Estas proteínas, expressas durante o ciclo de esporulação da bactéria formam corpos de inclusão cristalinos no paraesporo. 0 cristal do paraesporo produzido por B. thuringiensis subsp. israelensis é tóxico quando ingerido pelas larvas de dípteros, incluindo mosquitos e moscas negras. Após ingestão, as proteínas de cristal são solubilizadas no mesentério da larva e rompem o epitélio da região do mesentério da larva. 0 inchaço e/ou lise das células epiteliais é seguido de morte da larva por inanição. 0 Bacillus thuringiensis subespécie israelensis (B.t.i.) tem sido utilizado com sucesso em programas de controlo de mosquitos e moscas negras durante muitos anos. B.t.i. é utilizado em habitates de cultura orgânica limpos a moderadamente limpos e é mais eficaz contra a espécie Aedes. 6

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Uma formulação comercial de B.t.i. é reconhecida pela marca registada VECTOBAC, disponível de Valent BioSciences Corp. Constituem formulações comerciais específicas disponíveis do mesmo fornecedor VECTOBAC G, VECTOBAC CG, VECTOBAC 12AS e VECTOBAC WDG. B.t.i. é eficaz contra uma vasta gama de espécies de mosquitos, apresenta baixa toxicidade para os mamíferos e é de fácil aplicação. B.t.i. apresenta também uma muito baixa susceptibilidade ao desenvolvimento de resistência, porque a sua actividade larvicida se baseia em várias toxinas. A probabilidade de que um mosquito em particular pertencente a uma população tratada não seja susceptível a todas as toxinas é extremamente reduzida. 0 Bacillus sphaericus (B.s.) é uma bactéria em forma de bastonete, aeróbica e formadora de esporos habitualmente encontrada no solo e noutros substratos. Até ao presente, foram reveladas pelo menos 16 estirpes que apresentam propriedades mosquitocidas em vários graus. Várias estirpes tais como 1593M, 2362 e 2297 apresentam toxicidade elevada para larvas de mosquito. B.s. estirpe 2362, (VECTOLEX, disponível de Valent BioSciences Corp.) tem sido utilizada com sucesso em muitos países. Constituem formulações comerciais específicas de B.s. disponíveis do mesmo fornecedor VECTOLEX WDG, SPHERIMOS AS e VECTOLEX CG. Além disso, revelou-se que esta estirpe apresentava um bom desempenho no controlo de culturas de mosquitos em vários habitats, especialmente aqueles que apresentam água poluída. 0 B.s. é mais eficaz sobre a espécie Culex. A actividade do B.s. é devida a uma toxina binária e o uso repetido pode levar ao desenvolvimento de resistência.

Contudo, têm sido observados vários níveis de resistência a B.s. por larvas de mosquito em Culex pipiens e Culex quinquefasciatus.

Revelamos agora que uma combinação de B.t.i. e B.s. é uma formulação larvicida eficaz. Utilizam-se componentes não modificadas geneticamente que são desejáveis caso se pretenda utilizar o larvicida num ambiente relacionado com a produção ou recolha de fontes de alimentos tais como colheitas, gado bovino ou suíno. Podem definir-se B.t.i. e B.s. não 7 ΕΡ 1 367 898 /PT modificados geneticamente como estirpes que ocorrem naturalmente e que não são estirpes resultantes de técnicas de ADN recombinante.

Podem combinar-se B.t.i. e B.s. por mistura das formas em pó de cada uma das estirpes individuais ou por mistura das pastas dos meios de fermentação de cada estirpe, na razão pretendida, tal como ilustrado nos exemplos 1 a 6 seguintes. A razão de B.t.i. para B.s. pode ser desde cerca de 10:1 a cerca de 1:10; de preferência desde cerca de 3:1 a cerca de 1:3, com maior preferência desde cerca de 2:1 a cerca de 1:2 e com a maior preferência cerca de 1:1.

As composições reveladas supra podem também incluir componentes adicionais tais como um agente tensioactivo, um transportador inerte, um conservante, um humidificante, um estimulante de alimentação, um agente atractor, um agente de controlo de arrastamento, um auxiliador de deposição de aerossol, um agente de encapsulação, um agente de ligação, um emulsionante, um corante, um protector de U.V., um tampão, um agente de escoamento livre ou qualquer outra componente que estabilize o ingrediente activo e facilite o manuseamento e aplicação do produto para as pragas alvo, nomeadamente, dipteros.

Constituem agentes tensioactivos adequados, entre outros, compostos aniónicos tais como um carboxilato, por exemplo, um carboxilato metálico de um ácido gordo de cadeia longa; um N-acilsarcosinato; monoésteres ou diésteres de ácido fosfórico com etoxilatos de álcool gordo ou sais de tais ésteres; sulfato de álcool gordo tal como dodecilsulfato de sódio, octadecilsulfato de sódio ou acetilsulfato de sódio; sulfatos de álcool gordo etoxilados; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lenhina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquilarilo tais como sulfonatos de alquilbenzeno ou sulfonatos de alquilnaftaleno, em que o alquilo é de baixo peso molecular, por exemplo, sulfonato de butilnaftaleno; condensados de naftalenoformaldeido sob a forma de sais ou sulfonatos; condensados de fenolformaldeido sob a forma de sais ou sulfonatos; ou sulfonatos mais complexos tais como sulfonatos de amida, por exemplo, o produto de condensação sulfonado de ácido oleico e 8

ΕΡ 1 367 898 /PT N-metiltaurina ou os dialquilsulfossuccinatos, por exemplo, o sulfonato de sódio ou o dioctilsuccinato de sódio.

Constituem agentes não iónicos, entre outros, produtos de condensação de ésteres de ácidos gordos, álcoois gordos, amidas de ácidos gordos ou fenóis substituídos com alquilos ou alcenilos gordos com óxido de etileno, ésteres gordos de éteres de álcool poli-hídrico, por exemplo, ésteres de ácidos gordos de sorbitano, produtos de condensação de tais ésteres com óxido de etileno, por exemplo, ésteres de ácidos gordos de polioxietilenossorbitano, copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilénicos tais como 2,4,7,9-tetraetil-5-decino-4,7-diol ou glicóis acetilénicos etoxilados.

Constituem exemplos de um agente tensioactivo catiónico, entre outros, por exemplo, uma monoamida, diamida ou poliamida alifática tal como um acetato, naftenato ou oleato; uma amina contendo oxigénio tal como um óxido de amina de polioxietilenoalquilamina; uma amina ligada através de uma amida preparada por condensação de um ácido carboxílico com uma diamina ou uma poliamina; ou um sal de amónio quaternário.

Constituem exemplos de materiais inertes, entre outros, minerais inorgânicos tais como caulino, mica, gesso, fertilizante, areia, filossilicatos, carbonatos, sulfato ou fosfatos; materiais orgânicos tais como açúcares, amidos ou ciclodextrinas; ou materiais botânicos tais como produtos de madeira, cortiça, maçarocas de milho em pó, cascas de arroz, cascas de amendoins e cascas de noz. A formulação pode também conter agentes de controlo de arrastamento adicionados ou auxiliadores de deposição de aerossóis para controlar o tamanho das gotas e para facilitar a aplicação aérea. Constituem exemplos de compostos adequados para estes fins, entre outros, soluções de polímero de poli(álcool vinílico), soluções de copolímero de poliamida, derivados de ácido acrílico polimerizados e suas misturas, óleos vegetais e suas misturas, óleos de petróleo e suas misturas, assim como polímeros naturais e sintéticos. 9

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Nas formulações, pode ser vantajosamente utilizada mais do que uma das componentes adicionais descritas supra.

As composições do presente invento podem ser aplicadas como um liquido, uma suspensão aquosa, uma suspensão emulsionáveis, ou um sólido por técnicas de aplicação convencionais para cada uma delas. Presentemente preferem-se as formulações sólidas. De um modo geral, a taxa de aplicação da combinação eficaz do larvicida do presente invento entregará uma quantidade de pesticida suficiente para controlar a população de uma praga alvo.

As composições sólidas podem ser formadas por secagem por pulverização das pastas de B.t.i. e de B.s separadamente e combinação do pó ou por combinação das pastas e secagem por pulverização da pasta combinada para formar um pó. A composição do presente invento pode encontrar-se numa forma adequada para aplicação directa ou como um concentrado ou composição primária que necessita diluição com uma quantidade adequada de água ou outro diluente antes da aplicação. A concentração de pesticida variará dependendo da natureza da formulação especifica, nomeadamente, se é um concentrado ou se destina a ser utilizada directamente. A composição pode conter desde cerca de 1 a 98% em peso de um transportador inerte sólido ou liquido e 0,1 a 50% em peso de um tensioactivo. Estas composições serão administradas a uma taxa de cerca de 50 mg (liquido ou seco) a 20 kg ou mais por hectare.

Os métodos A combinação do presente invento pode ser tratada antes de formulação para prolongar a actividade pesticida quando aplicada ao ambiente de uma praga alvo desde que o pré-tratamento não seja danoso para a combinação. Tal tratamento pode ser por métodos químicos e/ou físicos desde que o tratamento não afecte de forma danosa as propriedades da(s) composição(ões) . Constituem exemplos de reagente químicos, entre outros, agentes de halogenação; aldeídos tais como formaldeído e glutaraldeído; agentes anti-infecciosos tais como cloreto de zefiran; álcoois tais como isopropanol e 10

ΕΡ 1 367 898 /PT etanol; e fixantes histológicos, tais como fixante de Bouin e fixante de Helly.

As composições do invento podem ser aplicadas directamente ao ambiente a tratar. Constituem exemplos de ambientes que necessitam de tal tratamento, lagoas, lagos, ribeiros, rios, águas paradas e outras áreas sujeitas a infestação por pragas de dipteros. A composição pode ser aplicada por pulverização, polvilhação, aspersão e difusão, entre outros métodos.

As composições do presente invento podem ser eficazes contra pragas de insectos da ordem Diptera, por exemplo, Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles sp., Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifácies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta sp., Coquillettidia sp., Deino cerities sp., Dacus oleae, Delia antiqua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollas, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossinamoristans centralis, Glossinamorsitans morsitans, Glossinamorsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equines, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mansonia sp., Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ochlerotatus sp., Ophyra aenescens, Orthopodomyia sp., Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Psorophora sp., Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa, Uranotaneia sp. e Wyeomyia sp. Contudo, a composição do invento pode também ser eficaz contra pragas de insecto da ordem Lepidoptera, por exemplo, Achroia grisella, Aderis gloverana, Aderis variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra 11

ΕΡ 1 367 898 /PT por cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisinia americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria díspar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacritia vemata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaumstopoea pityocampa, Tineloa bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Coleoptera, por exemplo, Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhaltaluteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor, Acari, por exemplo, Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Testranychus urticae; Hymenoptera, por exemplo, Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta; Isoptera, por exemplo, Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonaptera, por exemplo, 12

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Ceratophyllus gallinae, niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ct e no cepha lides canis, Ctenocephalid.es felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; e Tylenchida, por exemplo, Melodidogyne incógnita, Pratylenchus penetrans.

Numa concretização específica, as composições do invento são activas contra pragas de insectos da subordem Nematocera da ordem Diptera. Nematocera inclui as famílias Culicidae, Simulidae, Chironomidae, Psychodidae, Sciaridae, Phoridae e Mycetophilidae. A capacidade de combinação do presente invento para inibir resistência ao larvicida é descrita detalhadamente aqui infra nos exemplos. Estes exemplos são apresentados para descrever concretizações preferíveis e utilidades do invento e não pretendem ser limitativos do invento, salvo indicação em contrário nas reivindicações anexas ao presente documento.

Exemplo de referência 1

Formulou-se uma combinação larvicida como uma mistura de duas estirpes disponíveis comercialmente: VECTOBAC CG, uma formulação granular comercial de B.t.i. com uma potência referida no rótulo de 200 ITU/mg e VECTOLEX CG, uma formulação granular comercial de B.s. com uma potência referida no rótulo de 50 B.s. ITU/mg. Tipicamente, o concentrado técnico seco por pulverização de cada estirpe é primeiramente incorporado numa quantidade conhecida de aglutinante de óleo vegetal. A quantidade de aglutinante de óleo vegetal na fórmula dependerá da quantidade de concentrado técnico seco por pulverização de B.t.i. ou B.s. existente na fórmula. A gama típica pode variar de 1% a 15% p/p, dependendo da quantidade de concentrado técnico seco por pulverização de B.t.i. ou B.s. e do tipo, tamanho e propriedade absortiva do transportador granular utilizado na fórmula. Neste exemplo, utilizaram-se grânulos de maçaroca de milho com a classificação de tamanho 10/14 mesh. Contudo, são igualmente adequadas outras gamas de tamanhos tais como 5/8 mesh, 10/20 mesh, 10/40 mesh. A mistura pastosa foi pulverizada sobre o transportador granular ao mesmo tempo que 13 ΕΡ 1 367 898 /PT se misturava num misturador adequado e foi adicionalmente misturada até se obter um produto homogéneo.

Exemplo de referência 2

Preparou-se uma formulação granular de B.t.i. e B.s. Utilizaram-se produtos granulares pré-formulados de B.t.i. e B.s. (VECTOBAC CG e VECTOLEX CG) no desenvolvimento da formulação de combinação. Pretendeu-se atingir um produto granular de combinação resultante contendo B.t.i. a 100 ITU/mg e B.s. a 25 B.s. ITU/mg. O transportador utilizado foi maçaroca de milho de 10/14 mesh.

Para preparar a formulação, carregaram-se 5 kg de VECTOLEX CG e 5 kg de VECTOBAC CG num misturador e misturaram-se. Recuperou-se então a mistura de produto.

Tiraram-se amostras representativas para bioensaio. A tabela 1 apresenta as quantidades de matérias-primas que foram utilizadas para formar a combinação produto

Tabela 1

Matéria-prima % p/p Kg/lote VECTOBAC CG* 50,00 5, 00 VECTOLEX CG** 50,00 5, 00 Total 100,0 10,00 * Formulação granular comercial de B.t.i. com uma potência referida no rótulo de 200 ITU/mg ** Formulação granular comercial de B.s. com uma potência referida no rótulo de 50 B.s. ITU/mg.

Apresentam-se na tabela 2 infra os resultados de bioensaio para as amostras de combinação de B.t.i. e B.s. quando ensaiadas contra a quarta instar de Aedes aegypti e a terceira instar de Culex quinquefaciatus. ITU significa unidades internacionais de toxicidade que se baseiam num material de referência de potência de B.t.i. específica conhecida. 14

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Numa formulação, a razão de pesos de um para um de B.t.i. para B.s. tem uma potência de 100 ITU/mg para B.t.i. e 25 ITU/mg para B.s., que é equivalente a uma razão 4:1 numa base de potência.

Tabela 2

Amostra Potência B.t.i. Potência B.s. VECTOBAC GC 185 ITU/mg 9 B.s. ITU/mg VECTOLEX GC 4 ITU/mg 53 B.s. ITU/mg 1:1 B.t.i. para B.s. 102 ITU/mg 30 B.s. ITU/mg

Exemplo de referência 3

Pode também ser formulado um produto de combinação larvicida por combinação dos niveis adequados dos pós técnicos tanto de B.t.i. como de B.s. no mesmo liquido aglutinante seguido de impregnação ou pulverização sobre o transportador granular tal como maçaroca de milho ou quaisquer outros transportadores adequados.

Para preparar a formulação, ambos os concentrados técnicos secos por pulverização podem ser juntos numa pasta com óleo vegetal como liquido aglutinante e pulverizados sobre transportador granular num misturador adequado e misturados até se obter um produto homogéneo. As componentes teóricas da formulação de combinação contendo B.t.i. a 100 ITU/mg e B.s. a 25 B.s. ITU/mg apresentam-se na tabela 3 infra.

Tabela 3

Componente % p/p kg/lote Objectivo Pó ou concentrado técnico seco por pulverização de B.t.i. (5000 ITU/mg) 2, 00 20,00 Ingrediente activo Pó ou concentrado técnico seco por pulverização de B.s. (1000 ITU/mg) 2,50 25,00 Ingrediente activo Aglutinante de óleo vegetal 10,00 100,00 Aglutinante Transportador granular 85,5 855,00 Transportador 15

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Exemplo 4 A formulação combinada do invento é formada por pré-mistura de borras ou concentrados de pastas de fermentação de Bti e Bs aos niveis pretendidos de sólidos ou de potência e secar por pulverização a mistura pastosa para produzir um concentrado de pó seco por pulverização técnico combinado. Em tal formulação, o concentrado pastoso pode conter conservantes, estabilizantes, tensioactivos, dispersantes e outros aglutinantes. 0 concentrado ou pó técnico seco por pulverização pode ser então utilizado na formulação de um produto granular tal como nos exemplos 2 e 3 ou como pós molháveis, grânulos dispersáveis em água e concentrados aquosos ou não aquosos. Estes concentrados em pó combinados podem também ser utilizados em formulações em peletes e/ou briquetes. Efectuou-se uma experiência de secagem por pulverização por combinação de concentrados pastosos de fermentação de Bti e de Bs a várias razões com base em % de niveis de sólidos em cada um dos concentrados pastosos. Conservou-se primeiramente um concentrado pastoso de Bti com sorbato de potássio a 0,12% p/p e metilparabeno a 0,06% p/p. A % de sólidos no concentrado pastoso de Bti com conservante foi de 11,3% p/p. Similarmente, conservou-se uma mistura pastosa de Bs com sorbato de potássio a 0,12% p/p e metilparabeno a 0,06% p/p. A percentagem de sólidos no concentrado pastoso de Bs com conservante tinha uma % média de sólidos de 10,1% p/p. Apresentam-se na tabela 4 as misturas pastosas preparadas e as suas razões numa base de sólidos.

Tabela 4. Avaliação das misturas pastosas Bti e Bs

Razão de material entre Bti e Bs em base de sólidos 1:0 1:1 3:1 1:3 2:1 1:2 A B C D E F Concentrado pastoso de Bti com conservante 8,85kg 4,42kg 6,64kg 2,21kg 5,89kg 2,95kg Concentrado pastoso de Bs com conservante 5,lOkg 2,55kg 7,65kg 3,41kg 6,80kg Água desionizada 1,15kg 0,48kg 0,81kg 0,14kg 0,70kg 0,25kg Total 10, Okg 10, Okg 10, Okg 10, Okg 10, Okg 10, Okg 16

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Combinaram-se as composições tal como apresentadas na tabela 4 e secaram-se por pulverização utilizando um aerossol Niro. A temperatura de entrada variou entre 180°C e 190°C e a temperatura de saida durante a secagem variou entre 68°C e 81°C. Peneiraram-se os pós técnicos através de um peneiro padrão de 100 mesh e bioensaiaram-se amostras contra L4 Aedes aegypti e L3 Culex quinquefasciatus. Apresentam-se na tabela 5 dados de potência média.

Tabela 5. Valores de potência de pós técnicos secos por pulverização de Bti + Bs afectados pelas suas razões numa base de sólidos. Potência média de pó técnico seco por pulverização de Bti = 7474 ITU/mg. Potência média de pó técnico seco por pulverização de Bs = 3030 Bs. ITU/mg (todos os ensaios são médias das amostras iniciais e de amostras armazenadas 2 meses a 5°C)

Razão entre Bti e Bs em base de sólidos Potência teórica de Bti* (ITU/mg) Potência real de Bti (ITU/mg) Potência real expressa como % de potência teórica na coluna 2 Potência teórica de Bs+ (Bs. ITU/mg) Potência real de Bs (Bs. ITU/mg) Potência real expressa como % de potência teórica na coluna 5 1:1 3737 5174 138% 1515 1642 108% 3:1 5606 6122 109% 758 1088 144% 1:3 1869 4769 255% 2273 2655 117% 2 :1 4983 5499 110% 1009 1479 147% CM \—1 2489 3738 150% 2020 2503 124% Média 3737 5060 1515 1873

Os dados de biopotência apresentados na tabela 5 revelam um aumento interessante mais muito sinérgico da potência real tanto de Bti como de Bs relativamente às potências teóricas, que se baseiam em potências reais de 100% de pó técnico seco por pulverização quer de Bti quer de Bs. Pareceu que a melhor combinação para actividade aumentada tanto em Aedes como em Culex ser quando se combinavam os concentrados pastosos de Bti e de Bs a 1 parte de Bti e 2 partes de Bs numa base de sólidos. Para aumentar a potência de Bs, a melhor combinação foi quando se combinaram duas partes de sólidos de Bti com 1 parte de sólidos de Bs. Nesta combinação, verificou-se 17 ΕΡ 1 367 898 /PT aumento de 47% na potência de Bs relativamente à potência teórica. Por combinação dos concentrado pastosos de Bti e de Bs antes da secagem por pulverização, a potência de Bti apresentou em média um aumento de 35% relativamente à potência média teórica média, enquanto que a potência de Bs apresentou um aumento de 24% relativamente à potência média teórica. Pareceu existir vantagem significativa em combinar os concentrados pastosos antes da secagem por pulverização e posterior formulação destes pós como grânulos, pós molháveis, grânulos dispersáveis em água ou peletes. A melhor explicação possível para estes valores aumentados de potência pareceu ser devida ao facto de que cada partícula seca por pulverização transporta toxinas e esporos tanto de Bti como de Bs. Noutras palavras, estas não são misturas físicas tal como revelado no exemplo 2 ou 3. Assim, é provável que estas novas abordagens de formulação não resultem apenas em actividade de largo espectro mas também minimizem o potencial para desenvolvimento de resistência. Noutras palavras, a gestão da resistência pode também ser conseguida ainda por outra nova abordagem de formulação.

Exemplo de referência 5

Pode também ser preparada uma formulação de combinação larvicida em forma líquida por adição, a um nível pretendido, de VECTOBAC WDG (3000 ITU/mg) e de VECTOLEX WDG (650 ITU/mg) a água num tanque de pulverização e misturar até se obter uma dispersão homogénea. A suspensão assim formada pode ser entregue ao habitat alvo por vários métodos de aplicação. Uma formulação líquida é ideal para operações de pulverização.

Exemplo de referência 6

Pode também ser preparada uma formulação líquida a partir de formulações líquidas de cada estirpe individual. Podem também misturar-se VECTOBAC 12AS e SPHERIMOS AS (formas de produto em suspensão aquosa comercializadas por Valent BioSciences Corp.) em água no tanque de pulverização e aplicada com vários equipamentos de aplicação por pulverização. A formulação de B.t.i. e B.s. como uma formulação aquosa com conservantes, estabilizantes, tensioactivos, dispersantes, diluentes é ainda outro método 18 ΕΡ 1 367 898 /PT preferido para entregar ambas as toxinas aos habitats de mosquitos.

Exemplo de referência 7

Determinou-se no laboratório a alteração de susceptibilidade das colónias laboratoriais de Culex quinquefasciatus que se sabe serem resistentes a B.s., em resposta a selecção com uma mistura de B.t.i. e B.s., do seguinte modo. A selecção refere-se ao tratamento a um nível inferior a LCioo·

Inoculou-se uma colónia de Culex quinquefasciatus resistente a B.s. a partir de larvas susceptíveis recolhidas de uma lagoa de águas residuais de uma indústria leiteira no Oeste dos Estados Unidos da América. As larvas recolhidas no campo foram sujeitas a selecção a LCgo em todas as gerações durante quarenta gerações. Na 40a geração, a colónia apresentou uma resistência de 54,4 vezes e de 14,2 vezes aos níveis de LC50 e LC90, respectivamente. Esta colónia foi utilizada para os ensaios subsequentes.

Constitui uma colónia resistente a que demonstra uma diminuição significativa na susceptibilidade a um determinado pesticida relativamente ao esperado para insectos de tipo selvagem. De um modo geral, uma diminuição de cinco vezes ou mais na susceptibilidade indica resistência. Rodcharoen et al., Journal of Economic Entomology, Vol. 87, N° 5, 1994, p. 1133-1140 exploram o conceito de resistência de um modo mais completo.

Constitui uma colónia susceptível a que é efectivamente morta por um pesticida específico. Por exemplo, em Culex quinquifasciatus, se um pesticida específico, Bacillus sphaericus, tem um valor medido de LC50 inferior a 0,1 ppm, a colónia caracteriza-se como susceptível a esse pesticida.

Prepararam-se suspensões de armazenamento por mistura de 0,2 g de B.t.i. ou B.s. em 20 ml de água destilada para fazer uma suspensão a 1%; fizeram-se misturas por combinação de suspensões de armazenamento na razão pretendida. Diluíram-se 19

ΕΡ 1 367 898 /PT subsequentemente tal como requerido para ensaios de tratamento.

Submeteram-se a bioensaio a colónia parental e a décima geração por colocação de 20 larvas no final do terceiro instar ou no inicio do quarto instar num copo de papel encerado de 116 ml contendo 100 ml de água destilada. Adicionou-se a cada copo uma gota da dieta de larvas (2 g de ração de coelho moída em 20 ml de água destilada). Trataram-se os copos com uma gama de concentrações quer de larvicida sozinho, quer da mistura. Utilizaram-se cinco a sete concentrações diferentes na gama de 0,0001-0,1 ppm em cada bioensaio para produzir mortalidades. Replicou-se cada concentração quatro a cinco vezes em cada ensaio. Mantiveram-se as larvas tratadas a 82-85 F. Para determinar valores de LC5o, contaram-se o número de larvas mortas a intervalos regulares a partir do ponto temporal de tratamento com o larvicida de ensaio. Após a morte de todas as larvas, pode determinar-se a concentração para a qual tinham sido mortas 50%.

Compararam-se colónias tratadas individualmente ao nível de LCso com B.s. (Bacillus sphaericus estirpe 2362, ABG-6184, VECTOLEX, disponível de Valent BioSciences Corp.) ou B.t.i. (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (VECTOBAC disponível de Valent BioSciences Corp.) com uma colónia tratada com uma razão 1:2 de pesos de B.s. (VECTOLEX) para B.t.i. (VECTOBAC) durante cinco gerações ao nível de LCso, seguido de tratamento com uma razão 1:1 de pesos de B.s. (VECTOLEX) para B.t.i. (VECTOBAC) durante mais cinco gerações ao nível de LCso·

Após as primeiras cinco gerações destes tratamentos, obtiveram-se valores médios de B.s. LC5q mais reduzidos para as colónias sujeitas a selecção através da combinação 1:2 comparativamente a qualquer das colónias seleccionadas pelas componentes individuais, indicando um aumento de susceptibilidade e consequentemente uma diminuição da resistência tal como ilustrado na tabela 6. Os valores médios de B.s. LCso continuaram a diminuir sob selecção com uma combinação 1:1 durante as cinco gerações subsequentes. 20

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Tabela 6

Esta tabela apresenta dados do estudo de selecção original até F25. Constituiu uma alteração importante na selecção, o facto da colónia seleccionada por B.t.i. ser mudada para selecção por B.s. após FIO para avaliar estabilidade da susceptibilidade da colónia.

Tabela 6. Alteração de susceptibilidade a B.s. em ppm de uma colónia resistente de B.s. em resposta a selecção com B.t.i., B.s. e misturas

Tratamento LC50 da LC50 de LC50 de LC50 de LC50 de LC50 de colónia 5a 10a 15a 20a 25a parental geração geração geração geração geração B.t.i. 0,49 0,351 0,205 *0,315 *0,366 *0,308 B.s. 0,49 0,452 0,42 0,42 0,554 0,464 B.t.i. e B.s. 0,33 0,273 0,103 0,103 0,035 0,04 *Mudou-se a selecção de novo para B.s. desde a geração 10 até à 25.

Exemplo de referência 8

Utilizou-se o procedimento de bioensaio descrito no exemplo 7 de modo a avaliar a susceptibilidade de colónias de Culex quinquefasciatus resistentes e susceptiveis a B.s. a B.t.i., B.s. e uma mistura 2:1 de B.t.i. e B.s.

Determinaram-se valores médios de LC5o para cada tratamento. Um valor médio de LC50 inferior indica que o tratamento especifico pode ser utilizado eficazmente a uma concentração inferior, o que indica que os organismos são mais susceptiveis ao tratamento.

Apresentam-se os resultados na tabela 7 infra. Tal como esperado, o tratamento com B.s. apresentou o maior valor médio de LC50 para a colónia resistente a B.s. Contudo, a mistura de razão 2:1 apresenta um resultado melhorado relativamente ao resultado para B.t.i. e B.s. sozinhos, tanto em colónias susceptiveis como resistentes, indicando uma maior susceptibilidade e possível sinergia quando se combinam as componentes. 21

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Tabela 7

Susceptibilidade em ppm de duas colónias de laboratório de Culex quinquefasciatus a B.t.i., B.s. e uma mistura 2:1 de B.t.i. para B.s.

Tratamento LC50 médio em colónia resistente LC50 médio em colónia susceptível B.t.i. 0, 025 0, 017 B.s. 0, 330 0, 009 2:1 B.t.i.:B.s. 0, 011 0, 004

Exemplo de referência 9 A eficácia de uma mistura 2:1 de B.t.i. para B.s. em colónias de Culex quinquefasciatus determinadas como susceptiveis a B.s. foi ensaiada como se segue.

Estabeleceu-se uma colónia susceptível mista de Culex quinquefasciatus numa combinação de jangadas de ovo recolhidos de um local no Oeste dos Estados Unidos da América. As jangadas de ovo recolhidas foram transferidas individualmente para copos de papel encerado de 230 ml contendo cada um 200 ml de água da torneira e 0,5 g de ração de coelho como dieta para larva. Chocaram-se as larvas. Removeram-se as pupas para copos com água e colocaram-se em gaiolas com rede onde ocorreu emergência dos adultos. Proporcionou-se aos adultos uma solução de sacarose a 10% e no dia cinco após a emergência, permitiu-se que as fêmeas se alimentassem de pintos em cativeiro. No dia 5 subsequente a esta alimentação de sangue, introduziram-se copos de postura de ovos nas gaiolas para recolher ovos. Para manter a colónia no laboratório, colocaram-se 4-5 jangadas de ovos numa panela de esmalte contendo 2 litros de água da torneira e 2 g de ração de coelho como dieta para larva.

As condições de preparação de amostra, método de bioensaio e determinação de LC5o foram as mesmas que se descreveram no exemplo 7. Apresentam-se os resultados na tabela 8 infra. Os resultados mostram que ao longo do tempo, a colónia de ensaio que era susceptível a B.s., se torna menos susceptível na quinta geração em resposta ao tratamento com B.s. sozinho, dado que o valor de LC5o aumenta. 22

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Contrariamente, a mistura 2:1 não apresenta a mesma tendência com a mesma extensão. Este facto é indicado pelos dados que, ao mesmo tempo que apresentam um aumento de LC5o relativamente à estirpe parental, também apresentam um aumento inferior ao tratamento com B.s. sozinho. Assim, a utilização da mistura 2:1 B.t.i. para B.s. atenuou a resistência ao longo do tempo.

Tabela 8 A tabela 8 também apresenta dados do estudo de selecção original até F20.

Constituiu uma alteração importante na selecção o facto de a colónia seleccionada com mistura ser mudada de 2:1 B.t.i./B.s. (VectoBac WDG/VectoLex WDG) para uma selecção com mistura 1:1 após F5.

Tabela 8. Alteração de susceptibilidade de uma colónia susceptivel de B.s. em resposta a misturas de B.t.i. e B.s.

Tratamento LC50 da LC50 de LC50 de LC50 de LC50 de colónia 5a 10a 15a 20a parental geração geração geração geração B.s. 0,009 0,035 0,066 0,194 0,124 B.t.i. e B.s. 0,009 0,024 0,028 0,013 0,044

Exemplo de referência 10

Efectuou-se a seguinte experiência para demonstrar a utilidade da mistura para controlar mosquitos de diferentes espécies. Neste exemplo, a eficácia da mistura e de cada larvicida individual foi determinada numa população mista de Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti.

Colocaram-se vinte banheiras de criação de plástico no exterior de um local situado no Oeste-médio dos Estados Unidos da América. Encheram-se as banheiras com água desionizada e enriquecida com 2,4 g de ração de porquinho-da-índia moída. Infestaram-se então as banheiras com 100 Culex quinquefasciatus de terceiro instar e 100 Aedes aegypti de terceiro instar. Uma hora após a infestação e imediatamente 23 ΕΡ 1 367 898 /PT antes do tratamento, amostraram-se banheiras e contou-se o número de larvas numa amostra de ensaio de cada banheira para obter um valor de controlo.

Os larvicidas de ensaio incluíram VECTOLEX CG (50 B.s. ITU/mg em grânulos de maçaroca de milho), VECTOBAC CG (200 ITU/mg em grânulos de maçaroca de milho) e uma mistura 1:1 de VECTOLEX CG e VECTOBAC CG, tal como descrito no exemplo 2. Tratou-se cada banheira com uma quantidade apropriada de um dos três larvicidas de ensaio, equivalente a uma taxa de tratamento única de 5, 10 ou 20 libras/acre.

No quinto e décimo segundo dias após tratamento, adicionaram-se a cada banheira 100 Culex quinquefasciatus de terceiro instar e 100 Aedes aegypti de terceiro instar.

Amostraram-se as larvas das banheiras no segundo dia, no sétimo dia e no décimo quarto dia após tratamento para determinar quantas se encontravam ainda vivas. Obtiveram-se os números e compararam-se com o número de larvas vivas antes do tratamento. 100% de redução indica que todas as larvas foram mortas. Um número positivo para a percentagem de redução indica que o larvicida mata de facto. Apresentam-se os resultados na tabela 9 infra, indicativos de que a mistura 1:1 de B.t.i. para B.s. pode controlar larvas de Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti, mesmo ao longo de um período de vários dias, para cada taxa de aplicação ensaiada.

Tabela 9

Percentagem média de redução

Tratamento Taxa de aplicação (libras/acre) % de redução em larvas - dia 2 % de redução em larvas - dia 7 % de redução em larvas - dia 14 1:1 B.t.-.B.s. 5 100 55 56 B.s. 5 95 77 34 B.t.i. 5 100 84 73 1:1 B.t.-.B.s. 10 100 98 91 B.s. 10 81 44 50 B.t.i. 10 100 92 78 1:1 B.t.-.B.s. 20 100 97 90 B.s. 20 88 82 64 B.t.i. 20 100 100 76 24

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Exemplo de referência 11

Efectuou-se outra experiência para demonstrar a utilidade da mistura para matar mosquitos de diferentes espécies. No presente exemplo, determinou-se a eficácia da mistura e de cada larvicida individual em Culex tarsalis. 0 ensaio foi efectuado em mosquitos numa lagoa de águas residuais de uma estação de tratamento de águas residuais no Oeste dos Estados Unidos da América. A lagoa encontrava-se extremamente poluída e ensaios padrão revelaram a presença de Culex tarsalis. Juncos altos cobriam 80% da superfície da água. A fim de efectuar o ensaio, dividiu-se a margem da lagoa em seis talhões com dimensões variando desde 0,1 a 0,2 acres.

Imediatamente antes do tratamento, cada talhão de ensaio foi amostrado e contou-se o número de larvas numa amostra de ensaio de cada talhão, para obter um valor de controlo.

Os larvicidas de ensaio foram as formulações descritas no exemplo 10 e assim cada talhão foi tratado com uma quantidade apropriada de um dos três larvicidas de ensaio, equivalente a uma taxa de tratamento única de 5 ou 10 libras/acre.

Amostraram-se larvas dos talhões de ensaio no segundo dia, no sétimo dia e no décimo quarto dia após tratamento para determinar quantas se encontravam ainda vivas. Obtiveram-se os números e compararam-se com o número de larvas vivas antes do tratamento. 100% de redução indica que todas as larvas foram mortas. Um número positivo para a percentagem de redução indica que o larvicida mata de facto. Apresentam-se os resultados na tabela 10 infra, indicativos de que a mistura 1:1 de B.t.i. para B.s. pode controlar larvas de Culex tarsalis. 25

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Tabela 10

Percentagem média de redução

Tratamento Taxa de aplicação (libras/acre) % de redução em larvas - dia 2 % de redução em larvas - dia 7 % de redução em larvas - dia 14 1:1 B.t.iB.s. 5 9 93 6 B.s. 5 90 100 100 B.t.i. 5 -25 47 28 1:1 B.t.:B.s. 10 88 96 65 B.s. 10 83 98 65

Exemplo de referência 12

Efectuou-se outra experiência para demonstrar a utilidade da mistura para matar mosquitos de diferentes espécies. No presente exemplo, determinou-se a eficácia da mistura e de cada larvicida individual sobre Culex pipiens e Culiseta incidens no exterior, num fosso à beira da estrada. O local do estudo foram duas secções de um fosso à beira da estrada separadas por um caminho no Oeste dos Estados Unidos da América. Os fossos apresentavam vegetação de ervas e plantas aquáticas e recebiam escoamento por infiltração de um sistema séptico assim como água da chuva. Seleccionou-se uma campina pantanosa de drenagem com hidrologia e vegetação semelhantes como controlo não tratado. Populou-se cada local com Culex pipiens e Culiseta incidens na altura do tratamento.

Imediatamente antes do tratamento, cada talhão de ensaio foi amostrado e contou-se o número de larvas numa amostra de ensaio de cada talhão, para obter um valor de controlo.

Os larvicidas de ensaio foram as formulações descritas no exemplo 10 e assim dois dos locais de ensaio foram tratados com uma quantidade apropriada de um dos dois larvicidas de ensaio, equivalente a uma taxa de tratamento única de 20 libras/acre. O local de ensaio remanescente não foi tratado para servir como controlo. 26

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Amostraram-se larvas dos talhões de ensaio no quarto dia e no sétimo dia após tratamento. Obtiveram-se os números e compararam-se com o número de larvas antes do tratamento. 100% de redução indica que todas as larvas foram mortas. Um número positivo para a percentagem de redução indica que o larvicida mata de facto. Apresentam-se os resultados na tabela 11 infra, indicativos de que a mistura 1:1 de B.t.i. para B.s. pode controlar larvas de Culex pipiens e Culiseta incidens.

Tabela 11

Percentagem média de redução

Tratamento % de redução em larvas -dia 4 % de redução em larvas -dia 7 1:1 B.t.:B.s. 100 98 B.s. 100 100

Exemplo de referência 13

Determinou-se a eficácia no campo de uma mistura 2:1 de B.s. (VECTOLEX) para B.t.i. (VECTOBAC) do seguinte modo. O campo de ensaio foi um campo de arroz no Oeste dos Estados Unidos da América, com uma área de 156 acres. Utilizaram-se diques para definir zonas tampão entre os talhões de ensaio. Na altura do tratamento encontravam-se presentes larvas de Anopheles freeborni a uma densidade de 0,5-3,0 por mergulho, de acordo com o ensaio padrão de mergulho de rede. Aplicaram-se cada larvicida individual e a combinação de larvicidas a uma taxa de 12 libras/acre por avião, que aplicou os grânulos a uma velocidade de 85 milhas por hora e com uma amplitude de espalhamento de 60 pés.

Efectuaram-se contagens de larvas nos dias 2, 6 e 15 após o tratamento e relacionaram-se com a contagem de larvas de um talhão de ensaio de controlo não tratado. Apresentam-se os resultados na tabela 12 infra, indicativos de que a mistura 2:1 mata larvas eficazmente, dado que um número positivo para 27 ΕΡ 1 367 898 /PT a percentagem de controlo de larvas indica que o larvicida mata de facto.

Tabela 12

Percentagem média de redução

Tratamento % de controlo % de controlo % de controlo de larvas ao de larvas ao de larvas ao dia 2 dia 6 dia 15 2:1 B.t.i. 50 100 0 para B.s. B.s. 81 87 93 B.t.i. 100 100 90

Exemplo de referência 14

Os estudos seguintes demonstram a susceptibilidade a misturas de diferentes mosquitos susceptiveis e não susceptiveis a B.s. Estes estudos apoiam as reivindicações de misturas como um método de controlar mosquitos e controlar mosquitos resistentes a B.s. Três dos estudos também apoiam o método de misturar pós técnicos antes da formulação de grânulos.

Eficácia de uma mistura 1:1 de formulações de B.t.i. e B.s. para controlo de populações de campo de Culex quinquefasciatus resistentes a B.s., comparativamente com cada formulação separadamente.

Materiais e métodos

Identificou-se uma população de Culex quinquefasciatus altamente resistente em Wat Pikul, distrito de Bang Yai, província de Nonthaburi, Tailândia. Tratou-se esta população com várias doses de VectoBac WDG (3000 Bti ITU) e VectoLex WDG (650 Bs ITU) e uma mistura 1:1 dos dois entre Janeiro e Setembro de 2001. Após cada tratamento, avaliaram-se as alterações de população ao longo do tempo por mergulho de rede e calculou-se a percentagem de controlo de larvas e pupas de instar tardia para os dias após o tratamento. 28

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Resultados

Doses de VectoLex WDG tão elevadas como 200 mg/m2 resultaram em pouco ou nenhum controlo desta população. Verificou-se que VectoBac WDG proporcionou controlo a doses tão reduzidas como 20 mg/m2. Verificou-se que uma mistura 1:1 dos dois produtos era mais eficaz que qualquer dos produtos sozinho a uma dose de 20 mg/m2.

Tabela 13

Percentagem de redução de uma população de campo de Culex quinquefasciatus resistente a B.s. após tratamento com B.s., B.t.i. e uma mistura de B.t.i e B.s.

Tratamento Dia 2 Dia 7 Dia 14 B.s. 650 ITU a 200 mg/m2 13 nd nd B.t.i. 3000 ITU a 20 mg/m2 87 46 -53 Mistura 1:1 (B.s. 325 ITU + B.t.i. 1500 ITU) a 20 mg/m2 97 50 22

Eficácia de duas formulações de combinação B.t.i./B.s. para controlo de Culex pipiens e Culiseta incidens comparativamente com uma formulação padrão de B.s. em talhões artificiais

Materiais e métodos

Estabeleceram-se vinte e oito talhões de ensaio artificiais por utilização de piscinas baixas na zona de parqueamento da instalação distrital de controlo de mosquitos do condado Multonomah, 5235 N. Columbia Blvd, Portland, Orégão, em 27 de Julho de 2001. Estabeleceram-se as piscinas em quatro filas com sete piscinas por fila. Designou-se cada fila como uma série de ensaio. Encheram-se as piscinas até uma profundidade de aproximadamente 8 polegadas com água da torneira do abastecimento distrital de água. Manteve-se esta profundidade ao longo do estudo. Cada piscina tinha uma área superficial aproximada de 0, 785 M2. Enriqueceu-se cada piscina com palha e ração de coelho (100 g) para proporcionar habitat e alimento para as larvas de mosquito. 29

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Deixaram-se as piscinas incubar com a mistura de palha e ração de coelho e para permitir o estabelecimento de populações naturais de mosquitos locais. 0 fornecimento artificial das piscinas de ensaio foi efectuado após as populações de mosquitos locais falharem na produção de populações adequadas nas piscinas para o estudo. Após este fornecimento inicial, as populações de Culex pipiens e de Culiseta incidens auto-mantiveram-se por reinfestação natural.

Neste estudo foram comparadas três formulações, designadas ABG6185, VBC60015 e VBC60019. ABG-6185 consistiu de pó técnico de B.s. formulado em maçaroca de milho e tinha uma potência de 50 B.s. ITU. VBC-60015 e VBC-60019 são combinações de pós técnicos de B.t.i. e B.s. formuladas em maçaroca de milho e tinham potências teóricas de 200 B.t.i./50 B.s. ITU e 100 B.t.i./50 B.s. ITU, respectivamente. Ensaiaram-se formulações a taxas de aplicação de 2,5 kg/ha e 5 kg/ha comparativamente com controlos não tratados. Efectuaram-se quatro replicações para cada taxa de aplicação e UTC com um padrão aleatório ao longo da série de ensaio.

Efectuou-se amostragem por toma de 5 mergulhos por piscina utilizando redes de mergulho de mosquito padrão e concentrando a recolha de larvas com redes de malha apertada. Conservaram-se amostras compósitas em álcool para contagem e identificação da espécie. As contagens de larvas foram registadas como L1-L2, L3-L4 e pupas.

Foram efectuadas contagens antes do tratamento e aplicações do produto de ensaio a 20 de Agosto de 2001 . As contagens iniciais após o tratamento foram efectuadas a 23 de Agosto de 2001 aproximadamente 64 horas após o tratamento. Efectuaram-se contagens de seguimento a 27 de Agosto, 31 de Agosto e uma contagem final a 6 de Setembro de 2001.

Determinou-se o sucesso do controlo por cálculo de números médios de larvas de 3o e 4o estágio e de pupas nas contagens de pré-tratamento e após o tratamento dos quatro replicados de cada ensaio. Calculou-se a percentagem de controlo por aplicação da fórmula de Mulla às médias da população global para cada tratamento. 30

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Resultados

Após o tratamento, as populações médias em todos os talhões tratados diminuíram relativamente aos talhões de controlo não tratados e foram significativamente inferiores (P=0,05 Student-Newman-Keuls) que o UTC aos 7 dias após o tratamento. Ocorreram diferenças numéricas mas não estatisticamente significativas entre tratamentos individuais. As reduções iniciais (3 dias após o tratamento) foram globalmente maiores para as formulações de combinação e verificou-se um controlo semelhante pela formulação ao longo da duração do estudo. Apresentam-se na tabela 14 reduções percentuais dos tratamentos a 2,5 kg/ha.

Tabela 14. Percentagem de redução corrigida de larvas de L3-L4 Culex e de Culesita em talhões artificiais após aplicação de tratamentos a 2,5 kg/ha.*

Tabela 14

Tratamento Dia 3 Dia 7 Dia 11 Dia 17 B.s. 50ITU 33,1 55, 1 71 74, 6 VBC 60015 (B.t.i. 200ITU/B . s . 50ITU) 65,1 97,2 97,2 81,2 VBC 60019 (B.t.i. 1 OOITU/B . s . 50ITU) 82,5 94, 1 85,8 65, 7 * corrigido relativamente a UTC com base em médias de população de 5 réplicas

Eficácia de duas formulações de combinação B.t.i./B.s. para controlo de Culex tarsalis e Culex pipiens comparativamente com uma formulação padrão de B.s. em talhões de campo pequenos

Materiais e métodos O local de ensaio foi um pântano onde um pequeno ribeiro desaguava no rio Yakima perto de Yakima, Washington. Encontravam-se presentes populações naturais de Culex tarsalis e Culex pipiens. A água era essencialmente água estagnada. A profundidade foi de 6-12 polegadas e permaneceu constante ao longo da experiência. A temperatura da água variou entre 72 e 77 ao longo da experiência. A vegetação era constituída principalmente por pasto com ervas daninhas de 31 ΕΡ 1 367 898 /PT folha larga esparsas cobrindo 80% da superfície. A altura das plantas foi de 6-15 polegadas de altura. Verifica-se a pastagem ocasional de gado no local, mas este não se encontrava presente durante o ensaio. A matéria orgânica era muito elevada no local. As populações de predadores eram habitualmente reduzidas nos talhões. O ensaio foi uma experiência bloqueada completa randomizada com três talhões de 1000 pés quadrados por tratamento. Amostraram-se os talhões imediatamente antes da aplicação a 19-7-01 e novamente 48 horas, 7 e 14 dias após a aplicação. Efectuaram-se vinte mergulhos com redes de mergulho de mosquito padrão em cada talhão. Contaram-se para cada mergulho larvas de instar 1-2, larvas de instar 3-4 e pupas.

Compararam-se no estudo três formulações, designadas ABG6185, VBC60015 e VBC60019. ABG-6185 consistiu de um pó técnico de B.s. formulado em maçaroca de milho e tinha uma potência de 50 B.s. ITU, VBC-60015 e VBC-60019 eram combinações de pós técnicos de B.t.i. e B.s. formulados em maçaroca de milho e tinham potências teóricas de 200 B.t.i./50 B.s. ITU e 100 B.t.i./50 B.s. ITU, respectivamente. Ensaiaram-se as formulações a uma taxa de aplicação de 5 libras/acre e compararam-se com controlos não tratados. Analisaram-se dados com análise de variância. Calcularam-se reduções de percentagem com a fórmula de Mulla e basearam-se apenas em larvas grandes e pupas. As médias globais de população para cada tratamento foram utilizadas neste cálculo.

Resultados

Dois dias após o tratamento, todas as três formulações proporcionaram um controlo significativo mas não excelente. A taxa de 5 libras/acres pode ter sido demasiado baixa para este local. O controlo aos 7 e 14 dias não foi significativo principalmente devido à população de larvas no replicado dois do UTC ter uma população muito reduzida. No entanto, a percentagem de controlo foi superior em todos os talhões tratados comparativamente com talhões não tratados aos dias 7 e 14. Ao comparar as formulações, não pareceu existir 32 ΕΡ 1 367 898 /PT qualquer diferença entre tratamentos ao dia 2 mas ambas as formulações VBC foram melhores que ABG-6185 ao dia 7. Apresentam-se na tabela 15 reduções de percentagem corrigidas calculadas utilizando médias de população global de L3-pupas.

Tabela 15. Percentagem de redução corrigida de larvas e pupas de L3-L4 Culex em talhões de campo pequenos após aplicação de tratamentos a 5 libras/acre.*

Tabela 15

Tratamento Dia 2 Dia 7 Dia 14 B.s. 50 ITU 50,0 52,3 17, 3 VBC 60015 (B.t.i. 200 ITU/B.s. 50 ITU) 58,0 73,4 64, 0 VBC 60019 (B.t.i. 100 ITU/B.s. 50 ITU) 59,4 81, 7 38, 4

Eficácia de quatro formulações de combinação B.t.i./B.s. para controlo de Ochlerotatus taeniorhynchus comparativamente com uma formulação padrão de B.t.i. em talhões artificiais

Materiais e métodos

Utilizaram-se no presente estudo vinte e quatro talhões de ensaio artificiais localizados no centro de educação e investigação em entomologia e saúde pública John A. Mulrenan, Sr., em Panama City, Florida. Encheram-se os talhões até uma profundidade de aproximadamente 6 polegadas com água salina 3-5 ppt. Manteve-se esta profundidade ao longo do estudo. Cada talhão tinha uma área superficial aproximada de 8 pés quadrados. Encontravam-se presentes nos talhões ervas emergentes e um substrato de solo arenoso. A temperatura da água foi em média de 75 graus Fahrenheit durante o estudo.

Efectuou-se infestação artificial dos talhões de ensaio antes do tratamento inicial e dia sim, dia não, após os tratamentos. Adicionaram-se aproximadamente 1000 larvas de Ochlerotatus taeniorhynchus de terceiro instar a cada talhão em cada dia de infestação. 33

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Compararam-se no estudo cinco formulações, designadas por ABG6138S, VBC60015, VBC60016, VBC60018 e VBC60019. ABG-6138s consistiu de pó técnico de B.t.i. formulado em maçaroca de milho e tinha uma potência de 200 B.t.i. ITU. VBC-60015, VBC60016, VBC60018 e VBC-60019 eram combinações de pós técnicos de B.t.i. e B.s. formulados em maçaroca de milho e tinham potências teóricas de 200 B.t.i./50 B.s. ITU, 100 B.t.i./25 B.s. ITU, 200 B.t.i./25 B.s. ITU e 100 B.t.i./50 B.s. ITU, respectivamente. Ensaiaram-se formulações a taxas de aplicação de 2,8 kg/ha comparativamente com controlos não tratados. Efectuaram-se quatro replicados para cada taxa de aplicação e UTC em padrão aleatório ao longo das séries de ensaio.

Efectuou-se amostragem por 8 mergulhos por talhão, utilizando redes de mergulho de mosquito padrão. Registaram-se os números de larvas recolhidas de cada talhão. A amostragem inicial foi efectuada um dia após infestação e tratamento iniciais e foi repetida aos dias 2, 3, 5, 7, 10 e 13 após o tratamento.

Determinou-se o sucesso do controlo por comparação do número de larvas recolhidas em talhões tratados com o número recolhido nos talhões UTC. Calculou-se a percentagem de mortalidade para cada tratamento utilizando a seguinte fórmula. % mortalidade = (n° larvas no controlo - n° larvas em tratamento)/ n° larvas no controlo

Resultados

Um dia após o tratamento, as populações em todos os talhões tratados eram significativamente inferiores às dos talhões UTC. As percentagens de redução média no dia um variaram entre 79,7% para VBC60015 e 98,5 % para VBC60018. Não se verificaram diferenças significativas entre os tratamentos neste dia. Os materiais continuaram a apresentar eficácia até ao dia 7 do estudo, após o que a percentagem de controlo declinou rapidamente. Três dos tratamentos de combinação, VBC60015, VBC60018 e VBC60019, proporcionaram percentagens globais de redução significativamente mais 34

ΕΡ 1 367 898 /PT elevadas ao longo do decurso do estudo de 13 dias (teste de comparação múltipla ASMENTOS p=0,05). Apresentam-se na tabela 16 as percentagens de reduções até ao dia 7 de tratamentos a 2,8 kg/ha.

Tabela 16. Percentagens de redução até ao dia 7 de tratamentos a 2,8 kg/ha.

Tabela 16

Tratamento Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 5 Dia 7 B.s. 50 ITU 84,9 58,8 51,6 71, 7 14, 8 VBC 60015 (B.t.i. 200 ITU/B.s. 50 ITU) 79, 7 71,9 76,5 67,3 43,5 VBC 60016 (B.t.i. 100 ITU/B.s. 25 ITU) 84,2 75 19,3 63,8 20,5 VBC 60018 (B.t.i. 200 ITU/B.s. 25 ITU) 98,5 65, 7 64,2 70,3 38 VBC 60019 (B.t.i. 100 ITU/B.s. 50 ITU) 91,3 67, 1 62,7 60, 4 28,1

Lisboa,

Claims (5)

1. ΕΡ 1 367 898 /PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de preparação de uma composição incluindo uma combinação de uma estirpe de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis e de uma estirpe de Bacillus sphaericus, incluindo as etapas de fermentar as estirpes separadamente, concentrar cada estirpe até aos sólidos, concentração ou actividade pretendidos, combinar as estirpes concentradas para formar uma mistura pastosa e secar por pulverização a mistura pastosa para obter partículas individuais que contêm toxinas tanto de Bacillus thuringiensis subespécie israelensis como de Bacillus sphaericus.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as partículas são utilizadas em várias formas de produtos larvicidas seleccionadas do grupo que consiste em pós, grânulos, pós molháveis, grânulos dispersáveis em água, peletes, briquetes, suspensões aquosas, suspensões emulsionáveis e concentrados aquosos ou não aquosos.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, incluindo adição à referida composição de uma componente seleccionada do grupo que consiste num agente tensioactivo, um transportador inerte, um conservante, um humidificante, um estimulante de alimentação, um agente atractor, um agente de encapsulação, um agente de ligação, um emulsionante, um corante, um protector de U.V., um tampão, um agente de controlo de arrastamento, um auxiliador de deposição de aerossol, um agente de escoamento livre e suas combinações.
4. 4. Produto susceptível de produção pelo processo de acordo com a reivindicação 1.
5. 5. Método para controlar larvas de dípteros, incluindo a introdução de uma quantidade eficaz como larvicida de um produto susceptível de produção pelo processo de acordo com a reivindicação 1, num ambiente contendo larvas de dípteros. Lisboa,