PL206597B1 - Sposób otrzymywania kompozycji zawierającej kombinację szczepu Bacillus thuringensis podgatunek israelensis i szczepu Bacillus sphaericus, produkt oraz sposób kontrolowania larw Diptera - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 206597 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 362523 (51) Int.Cl.

(22) Data zgłoszenia: 13.02.2002 A01N 63/00 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

13.02.2002, PCT/US02/004162 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

29.08.2002, WO02/65835

Sposób otrzymywania kompozycji zawierającej kombinację szczepu Bacillus (54) thuringensis podgatunek israelensis i szczepu Bacillus sphaericus, produkt oraz sposób kontrolowania larw Diptera

(30) Pierwszeństwo: 16.02.2001, US, 60/269,513	(73) Uprawniony z patentu: VALENT BIOSCIENCES, CORP., Libertyville, US
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 02.11.2004 BUP 22/04	(72) Twórca(y) wynalazku: PETER DECHANT, Portland, US BALA N. DEVISETTY, Buffalo Grove, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska
31.08.2010 WUP 08/10

PL 206 597 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania kompozycji zawierającej kombinację szczepu Bacillus thuringensis podgatunek israelensis i szczepu Bacillus sphaericus, jego produktu oraz sposobu kontrolowania larw Diptera. Korzystnie oba te szczepy nie są zmodyfikowane genetycznie.

Komary i czarne muchy są przedstawicielami rzędu Diptera, które są szkodnikami trapiącymi od pokoleń człowieka i zwierzęta. Komary są głównymi wektorami wielu chorób ludzi i zwierząt, w tym malarii, żółtej gorączki, wirusowego zapalenia opon mózgowych, dengi i filariozy.

Opracowano różne chemiczne środki owadobójcze w celu kontroli Diptera. Na przykład, traktowanie źródła wody alkoholem rozpuszczalnym w wodzie w formie mieszającej się z wodą dla zmniejszenia ilości komarów jest opisane w US 6,077,521. Jednak od niedawna położono nacisk na stosowanie biopestycydów. Na przykład, formuły o kontrolowanym uwalnianiu przynajmniej jednego składnika szkodnikobójczego są ujawnione w US 4,856,842, kontrola larw komarów tworzącym spory Bacillus ONR-60A jest ujawniona w US 4,166,112, nowe izolaty Bacillus thuringiensis z aktywnością przeciwko owadom szkodnikom z rzędu Diptera są ujawnione w US 5,725,815 i US 5,847,079, biologicznie czysta hodowla szczepu Bacillus thuringiensis z aktywnością przeciwko owadom szkodnikom rzędu Diptera jest ujawniona w US 5,912,162 i pochodzący z rekombinacji biopestycyd aktywny przeciwko Diptera, w tym cyjanobakterie transformowane plazmidem zawierającym białko B. thuringensis subsp. israelensis zabójcze dla Diptera w formie fuzji translacyjnej z silną, wysoce aktywną natywną sekwencją regulatorową genu cyjanobakterii ujawniono w US 5,518,897.

W publikacji WO 98/28984 (EP 0 948 259) opisano szczególne lodowe granulowane preparaty o pewnej kompozycji z endotoksynami pochodzącymi z Bacillus thuringensis podgatunek israelensis i/lub Bacillus sphaericus do kontroli larw komarów. Opisano sposób hamowania oporności na środki larwobójcze u Diptera, obejmujący etap wprowadzania skutecznej larwobójczej ilości kombinacji szczepu Bacillus thuringensis podgatunek israelensis i szczepu Bacillus sphaericus do środowiska zawierającego larwy Diptera w WO 98/28984. Korzystnie przedstawicielem Diptera jest Culex i oporność na środki larwobójcze jest rozwijana przeciwko Bacillus sphaericus.

Jednak wszystkie te biopestycydy mają wady i tak nadal trwa poszukiwanie nowych biopestycydów. Jedną z wad pewnych biopestycydów jest potencjalne narastanie oporności na pestycydy.

Oporność jest definiowana przez różnice we wrażliwości, które powstają wśród populacji tego samego gatunku eksponowanej na pestycyd w sposób ciągły w czasie. Te różnice identyfikuje się przez obserwację przesunięcia statystycznego w letalnej dawce (LD) albo żeby zabić 50% albo 95% populacji (LD50 lub LD95, odpowiednio). Indywidualne różnice we wrażliwości istnieją w każdym gatunku i szkodniki, które są zasadniczo mniej podatne mogą być obecne, na ogół w niskich częstościach w przynajmniej części dzikich populacji. W obecności pestycydu przeżywają i rozmnażają się te zasadniczo mniej wrażliwe szkodniki. Ponieważ ich zdolność do przeżycia jest wynikiem ich budowy genetycznej, ich oporna budowa genetyczna jest następnie przenoszona na ich potomstwo, co daje przesunięcia we wrażliwości populacji przez selekcję indukowaną przez pestycydy. Oporność na środki larwobójcze była spotykana u pewnych gatunków Diptera.

Specyficznie rozwój oporności w Culex quinquefasciatus na Bacillus sphaericus (B.s.) jest odnotowany przez Rodcharoen i wsp., Journal of Economic Ecology, tom 87, 1994, str. 1133-1140. Metoda pokonywania tej oporności przez kombinowanie B.s. z oczyszczonymi kryształami Cyt1A izolowanymi z B. thuringiensis subsp. israelensis lub przez łączenie zrekombinowanego B.t.i. z B.s. jest ujawniona przez Wirth i wsp., Journal of Medical Entomology, tom 37, 2000, str. 401-407. Jednak pożądany byłby ulepszony a pochodzący z naturalnych źródeł lub występujący naturalnie biologiczny środek larwobójczy i kompozycje by pokonać oporność komarów Culex na stosowanie B.s.

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kompozycji zawierającej kombinację szczepu Bacillus thuringensis podgatunek israelensis i szczepu Bacillus sphaericus, który zawiera kolejne etapy. Najpierw prowadzi się osobno fermentację obu szczepów, następnie zatęża się oba szczepy do uzyskania stałego preparatu, stężenia lub aktywności. Kolejno łączy się oba zatężone szczepy i uzyskuje się mieszaninę w postaci papki a następnie suszy się rozpyłowo tę mieszaninę otrzymując osobne cząstki, które zawierają toksyny zarówno z Bacillus thuringensis podgatunek israelensis jak i z Bacillus sphaericus. Otrzymane cząstki wprowadza się następnie do produktów larwobójczych, przy czym produkty te mają postać wybraną z grupy obejmującej: proszki, granulki, zwilżalne proszki, granulki do zawiesin wodnych, granulaty, brykiety, zawiesiny wodne, zawiesiny emulgowane, koncentraty wodne i nie-wodne. Do kompozycji dodaje się składnik wybrany z grupy obejmującej: środek

PL 206 597 B1 powierzchniowo czynny, bierny nośnik, środek konserwujący, środek nawilżający, środek stymulujący żelowanie, środek wabiący (atraktant), środek otoczkujący, środek wiążący, środek emulgujący, barwnik, środek chroniący przed promieniowaniem UV, bufor, środek kontrolujący dryf, środek poprawiający osadzanie się aerozolu, środek wspomagający swobodny przepływ oraz ich kombinacje.

Produkt uzyskany takim sposobem oraz sposób kontrolowania larw Diptera w środowisku gdzie larwy Diptera są obecne, do którego wprowadza się larwobójczo skuteczną ilość produktu uzyskanego opisanym sposobem stanowią także przedmiot wynalazku.

Diptera może być komarem takim jak Culex pipiens, Culex quinquefasciatus, Aedes aegypti, Culex tarsalis, Culiseta incidens, Anopheles freeborni lub ich kombinacje.

Kompozycja obejmuje kombinację szczepu Bacillus thuringiensis podgatunek israelensis i szczepu Bacillus sphaericus.

Szczep Bacillus thuringensis podgatunek israelensis może nie być modyfikowany genetycznie lub szczep Bacillus sphaericus może nie być modyfikowany genetycznie, choć obecnie korzystna kombinacja obejmuje niezmodyfikowany genetycznie szczep Bacillus thuringensis podgatunek israelensis i niezmodyfikowany genetycznie szczep Bacillus sphaericus.

Kombinacja według wynalazku może mieć stosunek wagowy od około 1:10 do około 10:1 Bacillus thuringensis podgatunek israelensis do Bacillus sphaericus, korzystnie od około 1:3 do około 3:1 Bacillus thuringensis podgatunek israelensis do Bacillus sphaericus, bardziej korzystnie około 1:2 do około 2:1 stosunku wagowego Bacillus thuringensis podgatunek israelensis do Bacillus sphaericus a najbardziej korzystnie 1:1 Bacillus thuringensis podgatunek israelensis do Bacillus sphaericus.

Dodatkowe składniki takie jak aktywne czynniki, bierne nośniki, konserwanty, środki nawilżające, stymulator żerowania, atraktant, czynnik do kapsułkowania, środek wiążący, emulgant, barwnik, środek chroniący przed UV, bufor, środek kontrolujący dryf, środek wspomagający depozycję sprayu, czynnik wspomagający przepływ lub ich kombinacje mogą być też stosowane w połączeniu z kombinacją w kompozycji larwobójczej.

Kompozycje larwobójcze

Biopestycydy są klasą naturalnie występujących pestycydów często otrzymywanych z organizmów jednokomórkowych lub wielokomórkowych, które rozwinęły naturalne mechanizmy obrony przeciwko innym organizmom. Grupa mikroorganizmów patogennych dla owadów jest zmienna i różnorodna. Gram-dodatnia bakteria glebowa szczepu Bacillus thuringensis podgatunek israelensis jest jednym z wielu szczepów B. thuringensis zdolnych do produkcji białek owadobójczych. Te białka, wyrażane w czasie cyklu sporulacji bakterii są montowane w parasporowe krystaliczne ciała inkluzyjne. Parasporowy kryształ produkowany przez szczep Bacillus thuringensis podgatunek israelensis jest toksyczny gdy jest spożywany przez larwy Diptera, w tym komary i czarne muchy. Po spożyciu białka kryształów są rozpuszczane w jelicie środkowym larw i rozbijają nabłonek regionu środkowego jelita larwy. Po pęcznieniu i/lub lizie komórek nabłonka na skutek głodu następuje śmierć larw.

Szczep Bacillus thuringensis podgatunek israelensis (B.t.i.) był stosowany z powodzeniem w programach kontroli komara i czarnej muchy od wielu lat. B.t.i. jest stosowany w czystych do umiarkowanie czystych organicznych siedliskach namnażania i jest najbardziej skuteczny na gatunkach Aedes. Handlowa formuła B.t.i. jest znana pod nazwą handlową VECTOBAC dostępną od firmy Valent BioSciences Corp. Specyficzne formuły handlowe dostępne od tego samego dostawcy to VECTOBAC G, VECTOBAC CG, VECTOBAC 12AS i VECTOBAC WDG. B.t.i. jest skuteczny przeciwko szerokiemu zakresowi gatunków komarów, daje niską toksyczność w stosunku do ssaków i jest bardzo łatwe do stosowania. B.t.i. także ma bardzo niską podatność na rozwój oporności, ponieważ jego aktywność larwobójcza jest oparta na wielu toksynach. Szansa, że poszczególne komary w traktowanej populacji nie będą wrażliwe na wszystkie toksyny jest niesłychanie mała.

Bacillus sphaericus (B.s.) jest bakterią w kształcie pałeczki, aerobową, tworzącą spory spotykaną powszechnie w glebie i innych substratach. Dotychczas stwierdzono, że przynajmniej 16 gatunków wykazuje właściwości komarobójcze w różnym stopniu. Kilka szczepów takich jak 1593M, 2362 i 2297 wykazuje wysoką toksyczność w stosunku do larw komara. Szczep B.s. 2362 (VECTOLEX, dostępny od Valent BioSciences Corp.) był z powodzeniem stosowany w wielu krajach. Specyficzne handlowe formuły B.s. dostępne z tego samego źródła to VECTOLEX WDG, SPHERIMOS AS i VECTOLEX CG. Co więcej stwierdzono, że ten szczep zachowuje się równie dobrze w kontrolowaniu komarów rozmnażających się w różnych siedliskach, szczególnie tych ze skażoną wodą.

B.s. jest najbardziej skuteczny na gatunkach Culex. Aktywność B.s. jest wynikiem toksyny binarnej i powtarzane stosowanie może doprowadzić do rozwoju oporności.

PL 206 597 B1

Jednak stwierdzono różne poziomy oporności na B.s. u larw komarów u Culex pipiens i Culex quinquefasciatus.

Obecnie stwierdziliśmy, że kombinacja B.t.i. i B.s. jest skuteczną formułą larwobójczą. Nie modyfikowane genetycznie składniki są stosowane, co jest korzystne jeśli środek larwobójczy ma być stosowany w środowisku związanym z produkcją lub zbieraniem źródeł pokarmu takich jak rośliny uprawne, bydło lub świnie. Nie modyfikowane genetyczne B.t.i. lub B.s. mogą być definiowane jako szczepy, które występują naturalnie i nie są szczepami wynikającymi z technik rekombinacji DNA.

B.t.i. i B.s. mogą być kombinowane przez mieszanie sproszkowanych form każdego z indywidualnych szczepów lub przez mieszanie zawiesin bulionów fermentacyjnych każdego gatunku w pożądanym stosunku, jak zilustrowano w przykładach 1-6, które następują dalej. Stosunek B.t.i. do B.s. może być od około 10:1 do około 1:10, korzystnie od około 3:1 do około 1:3; bardziej korzystnie od około 2:1 do 1:2 i najbardziej korzystnie około 1:1.

Kompozycje ujawnione powyżej mogą obejmować dodatkowe składniki takie jak czynnik powierzchniowo czynny, bierne nośniki, konserwanty, środki nawilżające, stymulator żerowania, atraktant, środek kontrolujący dryf, środek wspomagający depozycję spreju, czynnik do kapsułkowania, środek wiążący, emulgant, barwnik, środek chroniący przed UV, bufor, czynnik wspomagający przepływ lub dowolny inny składnik, który stabilizuje składnik czynny, ułatwia obróbkę produktu i stosowanie dla szczególnych docelowych szkodników Diptera.

Odpowiednie czynniki powierzchniowo czynne obejmują kompozycje anionowe takie jak karboksylan, na przykład metalokarboksylan kwasu tłuszczowego o długim łańcuchu, N-acylo-sarkozynian, mono lub diestry kwasu fosforowego z etoksylanami alkoholi tłuszczowych lub sole takich estrów, siarczan alkoholu tłuszczowego taki jak siarczan sodowy dodecylu, siarczan sodowy oktadecylu lub siarczan sodowy acetylu, etoksylowane siarczany alkoholi tłuszczowych, etoksylowane siarczany alkilofenoli, sulfoniany ligniny, sulfoniany ropy naftowej, sulfoniany alkilu arylu, takie jak sulfoniany alkilobenzenu lub sulfoniany niższych alkilonaftalenów np. sulfonian butylonaftalenu, sole lub sulfonowane kondensaty naftalen-formaldehyd, sole sulfonowanych kondensatów fenol-formaldehyd lub bardziej złożone sulfoniany takie jak sulfoniany amidów np. sulfonowany produkt kondensacji kwasu olejowego i N-metylotauryny lub dialkilo sulfobursztyniany np. sulfonian sodu lub bursztynian dioktylu.

Niejonowe czynniki obejmują produkty kondensacji estrów kwasów tłuszczowych, amidów kwasów tłuszczowych lub tłuszczo-alilo lub alkenylo podstawione fenole z tlenkiem etylenu, estry tłuszczowe lub eterów alkoholi polihydroksylowych np. estry sorbitanu kwasów tłuszczowych, produkty kondensacji takich estrów z tlenkiem etylenu np. estry kwasów tłuszczowych polioksylenu sorbitanu, blokowe kopolimery tlenku etylenu i tlenku propylenu, glikole acetylenowe takie jak 2,4,7,9-tetraetylo-5-decenylo-4,7-diol lub etoksylowane acetylenowe glikole.

Przykłady kationowych czynników powierzchniowo-czynnych obejmują na przykład alifatyczny mono-, di- lub poliamid jako octan, naftenian lub oleinian, zawierającą tlen aminę taką jak tlenek aminy aliloaminy polioksyetylenu, aminę sprzęgniętą z amidem przygotowaną przez kondensację kwasu karboksylowego z di- lub poliaminą lub czwartorzędową sól amonową.

Przykłady biernych materiałów obejmują nieorganiczne minerały takie jak kaolin, mika, gips, nawóz, piasek, filokrzemiany, węglany, siarczan lub fosforany, materiały organiczne takie jak cukry, skrobie lub cyklodekstryny lub botaniczne materiały takie jak produkty drzewne, korek, sproszkowane kaczany kukurydzy, łuski ryżu, łuski orzeszków ziemnych i łuski orzechów włoskich.

Formuła może też zawierać dodane środki kontrolujące dryf lub pomoce w deponowaniu sprayu aby kontrolować wielkość kropelek i ułatwić stosowanie w powietrzu. Przykłady odpowiednich związków do tych celów obejmują roztwory polimerów poliwinyloalkoholu, roztwory kopolimerów poliamidu, pochodne polimeryzowanych kwasów akrylowych i ich mieszaniny, oleje roślinne i ich mieszaniny, oleje naftowe i ich mieszaniny, jak i naturalne i syntetyczne polimery.

W formułach można korzystnie stosować więcej niż jeden z opisanych powyżej związków dodatkowych.

Kompozycje według wynalazku mogą być stosowane jako płyn, wodna zawiesina, emulgowalna zawiesina lub ciało stałe przez konwencjonalne techniki stosowania dla każdego z nich. Formuły stałe są obecnie korzystne. Na ogół podawana dawka skutecznej larwobójczej kombinacji według wynalazku dostarcza pewną ilość pestycydu wystarczającą aby kontrolować populację docelowego szkodnika.

Stałe kompozycje mogą być przygotowane przez suszenie rozpyłowe zawiesin B.t.i. i B.s. oddzielnie i połączenie proszków lub przez połączenie zawiesin i suszenie rozpyłowe połączonej zawiesiny aby wytworzyć proszek.

PL 206 597 B1

Kompozycja według wynalazku może być w odpowiedniej formie dla bezpośredniego stosowania lub jako koncentrat lub pierwotna kompozycja, która wymaga rozcieńczenia odpowiednią ilością wody lub innego rozcieńczalnika przed stosowaniem. Stężenie szkodnikobójcze będzie się zmieniało w zależ ności od natury danej formuły, specyficznie, czy jest koncentratem czy ma być stosowana bezpośrednio. Kompozycja może zawierać od około 1 do 98% wagowo biernego nośnika stałego lub płynnego i 0,1 do 50% wagowo związku powierzchniowo czynnego. Te kompozycje będą podane w dawce okoł o 50 mg (pł yn lub suchy) do 20 kg lub wię cej na hektar.

Metody

Kombinacje według wynalazku mogą być traktowane przed formułowaniem by przedłużyć ich aktywność szkodnikobójczą gdy są stosowane do środowiska docelowego szkodnika o ile wstępne traktowanie nie jest szkodliwe dla kombinacji. Takie traktowanie może być za pomocą sposobów chemicznych i/lub fizycznych o ile traktowanie nie wpływa szkodliwie na właściwości kompozycji. Przykłady chemicznych odczynników obejmują, ale nie są do nich ograniczone, czynniki halogenujące, aldehydy takie jak formaldehyd i glutaraldehyd, czynniki przeciwzakaźne takie jak chlorek zefiranu, alkohole takie jak izopropanol i etanol i utrwalacze histologiczne takie jak utrwalacz Boiuna i utrwalacze Helly'ego.

Kompozycje według wynalazku mogą być stosowane bezpośrednio do środowiska, które ma być traktowane. Stawy, jeziora, strumienie, rzeki, woda stojąca i inne obszary podatne na infestację przez szkodniki dwuskrzydłe są przykładami środowisk potrzebujących takiego traktowania. Kompozycja może być stosowana, między innymi, przez rozpylanie, rozpraszanie, nakrapianie i rozprzestrzenianie.

Kompozycje według wynalazku mogą być skuteczne w stosunku do owadów szkodników należących do rzędu Diptera np. Aedes sp., Andes vittatus, Anastrepha ludens, Anastrepha suspensa, Anopheles sp., Armigeres subalbatus, Calliphora stygian, Calliphora vicina, Ceratitis capitata, Chironomus tentans, Chrysomya rufifacies, Cochliomyia macellaria, Culex sp., Culiseta sp., Coquillettidia sp., Deino cerities sp., Dacus oleae, Delia antiqąua, Delia platura, Delia radicum, Drosophila melanogaster, Eupeodes corollas, Glossina austeni, Glossina brevipalpis, Glossina fuscipes, Glossina moristans centralis, Glossina morsitans morsitans, Glossina morsitans submorsitans, Glossina pallidipes, Glossina palpalis gambiensis, Glossina palpalis palpalis, Glossina tachinoides, Haemagogus equines, Haematobia irritans, Hypoderma bovis, Hypoderma lineatum, Leucopis ninae, Lucilia cuprina, Lucilia sericata, Lutzomyia longlpaipis, Lutzomyia shannoni, Lycoriella mali, Mansonia sp., Mayetiola destructor, Musca autumnalis, Musca domestica, Neobellieria sp., Nephrotoma suturalis, Ochlerotatus sp., Ophyra aenescens, Orthopodomyia sp., Phaenicia sericata, Phlebotomus sp., Phormia regina, Psorophora sp., Sabethes cyaneus, Sarcophaga bullata, Scatophaga stercoraria, Stomoxys calcitrans, Toxorhynchites amboinensis, Tripteroides bambusa, Uranotaneia sp. i Wyeomyia sp. Jednak kompozycja według wynalazku może być też skuteczna przeciw owadom szkodnikom z rzędu Lepidoptera np. Achroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylis hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia funeralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Ephestia elutella, Erannis tiliaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisinia americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacritia vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota sultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplusia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonota ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tineloa bisselliella, Trichoplusia ni, Udea rubigalis, Xylomyges curialis, Yponomeuta padella; Coleoptera, n.p., Leptinotarsa sp., Acanthoscelides obtectus, Callosobruchus

PL 206 597 B1 chinensis, Epilachna varivestis, Pyrrhalta luteola, Cylas formicarius elegantulus, Listronotus oregonensis, Sitophilus sp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Macrodactylus subspinosus, Popillia japonica, Rhizotrogus majalis, Alphitobius diaperinus, Palorus ratzeburgi, Tenebrio molitor, Tenebrio obscurus, Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Tribolius destructor, Acari, n.p., Oligonychus pratensis, Panonychus ulmi, Testranychus urticae; Hymenoptera, n.p., Iridomyrmex humilis, Solenopsis invicta, Isoptera, e.g., Reticulitermes hesperus, Reticulitermes flavipes, Coptotermes formosanus, Zootermopsis angusticollis, Neotermes connexus, Incisitermes minor, Incisitermes immigrans; Siphonaptera, np., Ceratophyllus gallinae, niger, Nosopsyllus fasciatus, Leptopsylla segnis, Ctenocephalides canis, Ctenocephalides felis, Echicnophaga gallinacea, Pulex irritans, Xenopsylla cheopis, Xenopsylla vexabilis, Tunga penetrans; i Tylenchida, n.p. Melodidogyne incognita, Pratylenchus penetrans.

W specyficznym wykonaniu kompozycje według wynalazku są aktywne przeciw owadom szkodnikom z podrzędu Nematocera rzędu Diptera. Nematocera obejmują rodziny Culicidae, Simulidae, Chironomidae, Psychididae, Phoridae i Mycetophilidae.

Zdolność kombinacji według wynalazku do hamowania oporności na środki larwobójcze jest tu szczegółowo opisana w przykładach.

P r z y k ł a d 1

Kombinowany larwicyd według wynalazku formułowano jako mieszaninę dwóch handlowo dostępnych szczepów: VECTOBAC CG, handlowy ziarnisty preparat B.t.i. z mocą według etykiety 200 ITU/mg i VECTOLEX CG, handlowy ziarnisty preparat B.s. z mocą według etykiety 50 B.s. ITU/mg. Typowo wysuszony rozpyłowo koncentrat każdego szczepu jest najpierw włączany do znanej ilości środka wiążącego z oleju roślinnego. Ilość środka wiążącego z oleju roślinnego w formule będzie zależała od ilości sprayu koncentratu technicznego B.t.i. lub B.s. w formule. Typowy zakres może wahać się od 1% do 15% masa/masa w zależności od ilości suszonego rozpyłowo koncentratu technicznego B.t.i. lub B.s. typu, wielkości i właściwości absorpcyjnych nośnika ziarnistego stosowanego w formule. W tym przykładzie stosowano granulki kaczanów kukurydzy o klasyfikacji wielkości sita 10/14. Jednak inne zakresy wielkości takie jak sito 5/8, sito 10/20, sito 10/40 też są odpowiednie. Mieszaninę zawiesiny rozpylano na ziarnisty nośnik podczas mieszania w odpowiednim blenderze i dalej mieszano aż uzyskano homogenny produkt.

P r z y k ł a d 2.

Przygotowano preparat ziarnisty B.t.i. i B.s. do zwiększonej aktywności o szerokim zakresie. Uprzednio formułowane ziarniste produkty B.t.i. i B.s. (VECTOBAC CG i VECTOLEX CG) stosowano w opracowaniu formuły kombinowanej. Powstały kombinowany ziarnisty produkt miał zawierać B.t.i. 100 ITU/mg i B.s. 25 B.s. ITU/mg. Jako nośnik stosowano sito 10/14 kaczan kukurydzy.

Aby przygotować tę formułę po 5 kg VECTOBAC CG i VECTOLEX CG naładowano do blendera i miksowano. Następnie odzyskano zmieszany produkt.

Pobrano reprezentacyjne próbki do bio-oznaczeń.

Tabela 1 przedstawia ilość stosowanych surowców do wytworzenia kombinowanego produktu.

T a b e l a 1

Surowiec	% waga/waga	kg/partia
VECTOBAC CG*	50,00	5,00
VECTOBAC CG**	50,00	5,00
Razem	100,00	10,00

* Handlowy ziarnisty preparat B.t.i. z mocą według etykiety 200 ITU/mg ** Handlowy ziarnisty preparat B.s. z mocą według etykiety 50 B.s. ITU/mg

Wyniki biooznaczeń dla próbek kombinacji B.t.i. i B.s. przy testach larw czwartej wylinki Aedes aegypti i trzeciej wylinki Culex quinquefasciatus przedstawiono w tabeli 2 poniżej. ITU oznacza międzynarodowe jednostki toksyczności (international toxicity units), które są oparte na materiale referencyjnym o znanej mocy B.t.i.

W korzystnej formule stosunek masy jeden do jeden B.t.i. do B.s. ma moc 100 ITU/mg dla B.t.i. i 25 ITU/mg dla B.s., co jest odpowiednikiem stosunku 4:1 na zasadzie mocy.

PL 206 597 B1

T a b e l a 2

Próbka	Moc B.t.i.	Moc B.s.
VECTOBAC CG	185 ITU/mg	9 B.s. ITU/mg
VECTOLEX CG	4 ITU/mg	53 B.s. ITU/mg
1:1 B.t.i. do B.s.	102 ITU/mg	30 B.s. ITU/mg

P r z y k ł a d 3

Produkt kombinacji larwobójczej może też być formułowany przez kombinowanie wymaganych poziomów proszków technicznych zarówno B.t.i. i B.s. w tym samym płynie wiążącym i następnie nasycanie lub rozpylane na nośnik ziarnisty taki jak kaczan kukurydzy lub inne odpowiednie nośniki.

Aby przygotować formułę oba suszone rozpyłowo koncentraty techniczne mogą być zmieszane w płynie wiążącym z oleju roślinnego i rozpylone na ziarnisty nośnik w odpowiednim blenderze i mieszane aż do uzyskania homogennego preparatu. Teoretyczne składniki kombinowanej formuły zawierającej B.t.i. 100 ITU/mg i B.s. 25 B.s. ITU/mg są podane w tabeli 3 poniżej.

T a b e l a 3

Składnik	% waga/waga	kg/partia	cel
B.t.i. suszona rozpyłowo koncentrat techniczny lub proszek (5000 ITU/mg)	2,00	20,00	składnik czynny
B.t.i. suszona rozpyłowo koncentrat techniczny lub proszek (1000 ITU/mg)	2,50	25,00	składnik czynny
Środek wiążący olej roślinny	10,00	100,00	Środek wiążący
Ziarnisty nośnik	85,5	855,00	Nośnik

P r z y k ł a d 4

Kombinowana formuła może być też przygotowana przez wstępne zmieszanie brzeczek fermentacyjnych lub koncentratów zawiesin Bti i Bs na pożądanym poziomie ciał stałych lub mocy i suszenie rozpył owe uzyskanej mieszaniny zawiesiny aby wyprodukować kombinowany koncentrat proszku technicznego. W takiej formule, koncentrat zawiesiny może zawierać konserwanty, stabilizatory, związki powierzchniowo czynne, środki rozpraszające i inne związki wiążące. Suszony rozpyłowo techniczny koncentrat lub proszek może być wówczas stosowany w formułowaniu ziarnistego produktu jak w przykładach 2 i 3 lub jako zwilżalne proszki, dyspergowalne w wodzie granulki i wodne lub nie wodne koncentraty. Te kombinowane koncentraty proszków mogą być też stosowane w formułach w peletach lub brykietach. Przeprowadzono eksperyment z suszeniem rozpyłowym stosując kombinację koncentratów zawiesin fermentacyjnych Bti i Bs w różnych stosunkach w oparciu o poziom procentu związków stałych w każdym z koncentratów zawiesiny. Najpierw konserwowano zawiesinę koncentratu Bti 0,12% masa/masa sorbinianem potasu i 0,06% masa/masa metyloparabenem. Procent ciał stałych w konserwowanym koncentracie zawiesiny Bti wynosił 11,3% masa/masa. Podobnie koncentrat zawiesiny Bs konserwowano 0,12% masa/masa sorbinianem potasu i 0,06% masa/masa metyloparabenem. Procent ciał stałych w konserwowanym koncentracie Bs ma średni procent ciał stałych 10,1% masa/masa. Przygotowane mieszaniny zawiesin i ich proporcje na podstawie ciał stałych podano w tabeli 4.

T a b e l a 4

Ocena mieszanin zawiesin Bti i Bs

Stosunek materiału Bti do Bs na podstawie ciał stałych	1:0	1:1	3:1	1:3	2:1	1:2
1	2	3	4	5	6	7
	A	B	C	D	E	F
Koncentrat zawiesiny konserwowanego Bti	8,85 kg	4,42 kg	6,64 kg	2,21 kg	5,89 kg	2,95 kg

PL 206 597 B1 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5	6	7
Koncentrat zawiesiny konserwowanego Bs	-	5,10 kg	2,55 kg	7,65 kg	3,41 kg	6,80 kg
Woda dejonizowana	1,15 kg	0,4 8 kg	0,81 kg	0,14 kg	0,70 kg	0,25 kg
Razem	10,0 kg	10,0 kg	10,0 kg	10,0 kg	10,0 kg	10,0 kg

Kompozycje jak podano w tabeli 4 połączono i suszono rozpyłowo stosując spray Niro. Temperatura wlotu była w zakresie od 180°C i 190°C a temperatura wylotu w czasie suszenia była w zakresie między 68°C i 81°C. Proszki techniczne przesiano przez standardowe sito 100 i próbki poddano biooznaczeniom w stosunku do L4 Aedes aegypti i L3 Culex quinquefasciatus. Dane o średniej mocy są przedstawione w tabeli 5.

T a b e l a 5

Wartości mocy Btu + Bs, suszone rozpyłowo proszki techniczne wpływ ich stosunku na podstawie ciał stałych. Moc średnia Bti suszonego rozpyłowo proszku = 7474 ITU/mg). Moc średnia Bs suszonego rozpyłowo proszku = 3030 ITU/mg). (Wszystkie oznaczenia są średnią wstępnej próbki i przechowywanej 2 miesiące w 5°C)

Stosunek Bti do Bs na podstawie ciał stałych	Teoretyczna moc* Bti (ITU/mg)	Faktyczna moc* Bti (ITU/mg)	Faktyczna moc wyrażana jako % teoretycznej mocy w kolumnie 2	Teoretyczna moc* Bs (ITU/mg)	Faktyczna moc* Bs (ITU/mg)	Faktyczna moc wyrażana jako % teoretycznej mocy w kolumnie 5
1:1	3737	5174	38%	1515	1642	108%
3:1	5606	6122	109%	778	1088	144%
1:3	1869	4769	255%	2273	2655	117%
2:1	4983	5499	110%	1090	1479	147%
1:2	2489	3738	150%	2020	2503	124%
Średnia	3737	5060		1515	1873

Dane o biomocy przedstawione w tabeli 5 wykazują interesujący ale bardzo synergistyczny przyrost faktycznej mocy zarówno Bti i Bs ponad teoretycznymi mocami, które są oparte o aktualne moce 100% suszonych rozpyłowo proszków technicznych albo Bti albo Bs. Najlepsza kombinacja dla zwiększonej aktywności w stosunku do zarówno Aedes i Culex okazała się gdy koncentraty zawiesin Bti i Bs łączono jako 1 część Bti i 2 części Bs na podstawie ciał stałych. W tej kombinacji moc Bs wykazywała 47% przyrost w stosunku do mocy teoretycznej. Przez kombinację koncentratów zawiesin przed suszeniem rozpyłowym, moc Bti średnio wykazywała przyrost 35% w stosunku do teoretycznej średniej mocy podczas gdy moc Bs wykazywała przyrost 24% w stosunku do teoretycznej średniej mocy. Wydawała się być znacząca korzyść w łączeniu koncentratów zawiesin przed suszeniem rozpyłowym i dalszym formułowaniem tych proszków jako granulki, zwilżalne proszki, granulki dyspergowalne w wodzie lub formuły peletowe. Najlepszym możliwym wytłumaczeniem dla tych zwiększonych wartości mocy wydaje się być to, że każda cząsteczka suszona rozpyłowo zawiera toksyny i spory zarówno Bti i Bs. Inaczej mówiąc to nie są mieszaniny fizyczne, takie jak ujawniono w przykładach 2 i 3. Tak więc te nowe podejście do formuł powinno nie tylko dać aktywność o szerokim zakresie ale także zminimalizować potencjał nagromadzania się oporności. Inaczej mówiąc kontrola oporności może być też uzyskana przez jeszcze jedno nowe podejście do formułowania.

P r z y k ł a d 5

Kombinowana formuła larwicydów może być też przygotowana w formie płynnej przez dodanie na pożądanym poziomie zarówno VECTOBAC WDG (3000 ITU/mg) i VECTOLEX WDG (650 ITU/mg) do wody w tanku rozpylacza i mieszanie aż do uzyskania homogennej dyspersji. Tak wytworzona zawiesina może być dostarczana do docelowych siedlisk za pomocą różnych metod aplikacji. Płynna formuła jest idealna do aplikacji z rozpylaniem.

P r z y k ł a d 6

Płynna formuła może być przygotowana z płynnych formuł każdego indywidualnego szczepu. VECTOBAC 12AS i SPHERIMOS AS (formy produktów w zawiesinie wodnej sprzedawane przez VaPL 206 597 B1 lent BioSciences Corp.) mogą być też zmieszane w wodzie w tanku rozpylacza i stosowane za pomocą różnych urządzeń do rozpylania. Formułowanie B.t.i. i B.s. jako pojedynczej formuły wodnej z konserwantami, stabilizatorami, związkami powierzchniowo czynnymi, związkami do dyspersji, rozcieńczalnikami jest jeszcze jedną korzystną metodą dostarczania obu toksyn do siedlisk komarów.

P r z y k ł a d 7

Zmianę we wrażliwości kolonii Culex quinquefasciatus, o których wiadomo, że są oporne na B.s. w odpowiedzi na selekcję mieszaniną B.t.i. i B.s. określono w laboratorium w następujący sposób. Selekcja dotyczy poziomu traktowania poniżej LC100.

Kolonię Culex quinquefasciatus oporną na B.s. zaczęto od wrażliwych larw zebranych w lagunie wód odpadowych mleczarni w zachodnich Stanach Zjednoczonych. Zebrane w terenie larwy poddano selekcji przy LC90 co generację przez czterdzieści generacji. W 40. generacji kolonia wykazywała 54,4 i 14,2 krotną oporność na poziomach LC50 i LC90 odpowiednio. Tę kolonię stosowano do dalszych testów.

Kolonia oporna to taka, która wykazuje znaczący spadek wrażliwości na dany pestycyd w stosunku do tego oczekiwanego dla owadów typu dzikiego. Na ogół pięciokrotny lub większy spadek wrażliwości wskazuje na oporność. Rodcharoen i wsp., Journal of Economic Entomology, tom 787, Nr 5, 1994 str. 1133-1140 bardziej dokładnie wnikają w koncepcję oporności.

Wrażliwa kolonia to taka, która jest skutecznie zabijana przez dany pestycyd. Na przykład u Culex quinquefasciatus jeśli dany pestycyd, Bacillus sphaericus, ma mierzoną wartość LC50 mniejszą niż 0,1 ppm kolonię charakteryzuje się jako wrażliwą na ten pestycyd.

Przygotowano zawiesiny roztworów wyjściowych przez zmieszanie 0,2 g B.t.i. lub B.s. w 20 ml wody destylowanej aby zrobić 1% zawiesinę; mieszaniny przygotowano przez połączenie zawiesin wyjściowych roztworów w pożądanym stosunku. Zawiesiny następnie rozcieńczono w miarę potrzeby do traktowania testowego.

Rodzicielską kolonię i dziesiąte pokolenie poddano biooznaczeniu przez umieszczenie 20 larw późnej trzeciej lub wczesnej czwartej wylinki w kubku 116 ml z papieru woskowanego zawierającym 100 ml wody destylowanej. Do każdego kubka dodano kroplę diety larw (2 g zmielonych peletów króliczych w 20 ml wody destylowanej). Kubki traktowano zakresem stężeń albo samego larwicydu albo mieszaniną. Pięć do siedmiu różnych stężeń w zakresie 0,0001-0,1 ppm stosowano w każdym biooznaczeniu by określić śmiertelności. Każde stężenie powtarzano cztery do pięciu razy w każdym teście. Traktowane larwy trzymano w temperaturze około 28-29,5°C. Aby oznaczyć wartość LC50 liczono liczbę martwych larw w regularnych odstępach od czasu traktowania testowanym larwicydem. Po śmierci wszystkich larw można było oznaczyć stężenie, przy którym 50% było zabitych.

Kolonie traktowane indywidualnie na poziomie LC80 B.s. (Bacillus sphaericus szczep 2362, ABG-6184, VECTOLEX, dostępny od Valent Biosciences Corp.) lub B.t.i. (Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (VECTOBAC, dostępny od Valent Biosciences Corp.) porównywano z kolonią traktowaną stosunkiem wagowym 1:2 B.s. (VECTOLEX) do B.t.i. (VECTOBAC) przez pięć pokoleń na poziomie LC80 po czym traktowano stosunkiem wagowym 1:1 B.s. (VECTOLEX) do B.t.i. (VECTOBAC) przez pięć kolejnych pokoleń na poziomie LC80.

Po pierwszych pięciu pokoleniach tego traktowania uzyskano niższe średnie wartości B.s. LC50 dla kolonii poddanych selekcji przez kombinację 1:2 niż dla obu kolonii wybranych przez indywidualne składniki i następnie zmniejszoną oporność jak ilustruje tabela 6. Średnie wartości B.s. LC50 dalej spadały przy selekcji kombinacją 1:1 przez następnych pięć pokoleń.

T a b e l a 6

Ta tabela przedstawia dane z oryginalnych doświadczeń selekcji przez F25. Jedną kluczową zmianą w selekcji było, że kolonia wybrana na B.t.i. była przerzucona na selekcję B.s. po F10 aby ocenić stabilność wrażliwości kolonii.

T a b e l a 6

Zmiana we wrażliwości B.s. w ppm kolonii opornej B.s. w odpowiedzi na selekcję B.t.i., B.s. i mieszaninami

Traktowanie	LC50 kolonii rodzicielskiej	LC50 5. generacji	LC50 10. generacji	LC50 15. generacji	LC50 20. generacji	LC50 25. generacji
B.t.i.	0,49	0,351	0,205	*0,315	0,366	*0,308
B.s.	0,49	0,52	0,42	0,42	0,552	0,464
B.t.i. i B.s.	0,33	0,273	0,103	0,153	0,035	0,04

* Selekcję zmieniono z powrotem na B.s. dla pokolenia 10 do 25.

PL 206 597 B1

P r z y k ł a d 8

Procedurę biooznaczenia opisaną w przykładzie 7 stosowano aby ocenić podatność opornych i wrażliwych na B.s. kolonii Culex quinquefasciatus na B.t.i, B.s. i mieszaninę 2:1 B.t.i i B.s.

Po każdym traktowaniu oznaczano wartości średnie LC50. Niższa średnia wartość LC50 oznacza, że dane traktowanie może być stosowane skutecznie przy niższym stężeniu co wskazuje, że organizmy są bardziej wrażliwe na traktowanie.

Wyniki przedstawiono w tabeli 7 poniżej. Jak oczekiwano traktowanie B.s. dało najwyższe średnie LC50 dla kolonii opornej na B.s. Jednak mieszanina w stosunku 2:1 wykazuje poprawiony wynik w stosunku do wyniku dla tylko B.t.i. i B.s. zarówno w koloniach wrażliwych i opornych, wskazując na wyższą wrażliwość i możliwy synergizm, gdy składniki są łączone.

T a b e l a 7

Wrażliwość w ppm dwóch laboratoryjnych kolonii Culex quinquefasciatus na B.t.i, B.s. i mieszaninę 2:1 B.t.i i B.s.

Traktowanie	Średni LC50 w kolonii opornej	Średni LC50 w kolonii wrażliwej
B.t.i.	0,025	0,017
B.s.	0,330	0,009
2:1 B.t.i: B.s.	0,011	0,004

P r z y k ł a d 9

Badano skuteczność mieszaniny 2:1 B.t.i. do B.s. względem kolonii Culex quinquefasciatus uważanych za wrażliwe na B.s.

Mieszaną wrażliwą kolonię Culex quinquefasciatus ustalono z kombinacji skupień jaj zebranych z miejsca w zachodnich Stanach Zjednoczonych. Zebrane skupienia jaj indywidualnie przenoszono do kubka z papieru woskowanego 230 ml zawierającego 200 ml wody wodociągowej i 0,5 g peletów króliczych jako dietę dla larw. Larwom pozwolono na wylęgnięcie. Poczwarki usunięto z kubków z wodą umieszczono w klatkach z siatki gdzie wykluł y się formy dorosł e.

Dorosłym dostarczono 10% roztwór sacharozy i w dniu 5 po wykluciu samicom pozwolono na żerowania na uwiązanych kurczętach.

W dniu 5 po tym spożyciu krwi do klatek wprowadzono kubki do owipozycji do zbierania jaj. Aby utrzymać kolonię w laboratorium umieszczono 4-5 skupień jaj w emaliowanym garnku zawierającym litry wody wodocią gowej i 2 g peletów króliczych jako dietę dla larw.

Warunki przygotowania płytek, metoda biooznaczenia i oznaczenie LC50 były takie same jak opisano w przykładzie 7. Wyniki podano w tabeli 8 poniżej. Wyniki wykazują, że z czasem kolonia testowana, która była wrażliwa na B.s. staje się mniej wrażliwa do piątego pokolenia w odpowiedzi na traktowanie samym B.s., ponieważ wartość LC50 rośnie. Przeciwnie, mieszanina 2:1 nie wykazuje tej samej tendencji w tym samym stopniu. Fakt ten jest wskazywany przez dane, które wykazują przyrost LC50 w stosunku do szczepu rodzicielskiego, także wykazują mniejszy przyrost niż dla traktowania samym B.s. Tak więc stosowanie mieszaniny 2:1 B.t.i. i B.s. spowalniało oporność w miarę upływu czasu.

T a b e l a 8

Tabela 8 także przedstawia dane z oryginalnych badań nad selekcją do F20. Jedną kluczową zmianą w selekcji było to, że selekcjonowaną na mieszaninę kolonie zmieniono z 2:1 B.t.i. /B.s. (VectoBac WDG/VectoLex WDG) do selekcji mieszaniną 1:1 po F5.

T a b e l a 8

Zmiana we wrażliwości kolonii wrażliwej na B.s. w odpowiedzi na mieszaniny B.t.i. i B.s.

Traktowanie	LC50 kolonii rodzicielskiej	LC50 5. generacji	LC50 10. generacji	LC50 15. generacji	LC50 20. generacji
B.s.	0,009	0,035	0,066	0,194	0,24
B.t.i. i B.s.	0,009	0,024	0,028	0,013	0,044

PL 206 597 B1

P r z y k ł a d 10

Przeprowadzono następujący eksperyment by wykazać pożyteczność mieszaniny do kontrolowania komarów różnych gatunków. W przykładzie oznaczano skuteczność mieszaniny i każdego pojedynczego larwicydu na mieszanej populacji Culex quinquefasciatus i Aedes aegypti.

Dwadzieścia plastykowych rynienek do hodowli umieszczono na zewnątrz w miejscu ze środkowo zachodnich Stanach Zjednoczonych. Rynienki wypełniono wodą dejonizowaną i wzbogacono 2,4 g mielonej karmy świnek morskich. Rynienki następnie zakażano 100 larwami trzeciej wylinki Culex quinquefasciatus i 100 larwami trzeciej wylinki Aedes aegypti. Godzinę po zakażeniu i tuż przed traktowaniem, pobrano próbki z rynienek i liczono liczbę larw w próbce testowej by uzyskać wartość kontrolną.

Testowane larwicydy obejmowały VECTOLEX CG (50 B.s. ITU/mg na granulkach z kaczanu kukurydzy), VECTOBAC CG (200 ITU/mg na granulkach z kaczanu kukurydzy) i mieszaninę 1:1 VECTOLEX CG i VECTOBAC CG jak opisano w przykładzie 2. Każdą rynienkę traktowano odpowiednią ilością jednego z trzech testowanych larwicydów, ekwiwalentną stężeniom pojedynczej dawki 5,6x10^-4 kg/m², 1,12x1,10^-3 kg/m² lub 2,24x10^-3 kg/m².

W pią tym i dwunastym dniu po traktowaniu, do każ dej rynienki dodano 100 larw trzeciej wylinki Culex quinquefasciatus i 100 larw trzeciej wylinki Aedes aegypti.

Pobierano próbki larw z rynienek drugiego dnia, siódmego dnia i czternastego dnia po traktowaniu aby określić ile było jeszcze żywych. Liczby uzyskano i porównano do liczby larw żywych przed traktowaniem. 100% zmniejszenia oznacza, że wszystkie larwy były zabite. Dodatnia liczba dla obniżenia procentowego oznacza, że larwicyd zabija. Wyniki przedstawiono w tabeli 9 poniżej, wskazując, że mieszanina 1:1 B.t.i. do B.s. może kontrolować larwy Culex quinquefasciatus i Aedes aegypti nawet przez okres kilku dni, przy każdym badanym stosowanym stężeniu.

T a b e l a 9. Ś redni spadek w procentach

Traktowanie	Tempo podawania kg/m2	% zmniejszenia larw - dzień 2	% zmniejszenia larw - dzień 7	% zmniejszenia larw - dzień 14
1:1 B.t.:B.s.	5,6x10-4	100	55	56
B.s.	5,6x10-4	95	77	34
B.t.i.	5,6x10-4	100	84	73
1:1 B.t.:B.s.	1,12x10-3	100	98	91
B.s.	1,12x10-3	81	44	50
B.t.i.	1,12x10-3	100	92	78
1:1 B.t.:B.s.	2,24x10-3	100	97	90
B.s.	2,24x10-3	88	82	64
B.t.i.	2,24x10-3	100	100	76

P r z y k ł a d 11

Przeprowadzono inne doświadczenie aby wykazać pożyteczność mieszaniny w zabijaniu komarów różnych gatunków. W tym przykładzie skuteczność mieszaniny i każdy indywidualny larwicyd oznaczono na Culex tarsalis.

Test przeprowadzono na komarach w stawie wód odpadowych stacji uzdatniania wody odpadowej w zachodnich Stanach Zjednoczonych. Staw był silnie zanieczyszczony i standardowe testy wykazały obecność Culex tarsalis. 80% powierzchni wody pokrywały wysokie szuwary. Brzeg stawu podzielono na sześć poletek o powierzchni od 0,1 do 0,2 akra dla celu tego testu.

Tuż przed traktowaniem pobierano próbkę z każdego poletka testowego i liczono liczbę larw w próbce aby uzyskać wartość kontroli.

Testowanymi larwicydami były formuły opisane w przykładzie 10, i następnie każde poletko traktowano odpowiednią ilością jednego z trzech testowanych larwicydów, ekwiwalentną pojedynczej dawce 5 lub 10 funtów/akr.

PL 206 597 B1

Próbki larw pobierano z poletek testowych drugiego dnia, siódmego dnia i czternastego dnia po traktowaniu aby ocenić jak wiele jeszcze było żywych. Liczby uzyskano i porównano do liczby larw przed traktowaniem. 100% obniżenia oznacza, że wszystkie larwy były zabite. Dodatnia liczba dla obniżenia procent oznacza, że larwicyd zabija. Wyniki przedstawiono w tabeli 10 poniżej, wskazując, że mieszanina 1:1 B.t.i. do B.s. może kontrolować larwy Culex tarsalis.

T a b e l a 10

Średnie, spadek w procentach

Traktowanie	Tempo podawania	% spadku larw - dzień 2	% spadku larw - dzień 7	% spadku larw - dzień 14
1:1 B.t.:B.s.	5	9	93	6
B.s.	5	90	100	100
B.t.i.	5	25	47	28
1:1 B.t.:B.s.	10	88	96	65
B.s.	10	83	98	65

P r z y k ł a d 12

Przeprowadzono inne doświadczenie aby wykazać pożyteczność mieszaniny do zabijania komarów różnych gatunków. W tym doświadczeniu badano skuteczność mieszaniny i każdego pojedynczego larwicydu na Culex pipiens i Culiseta incidens w terenie, w rowie przy drodze.

Dwie części rowu przy drodze rozdzielone przez jezdnię w zachodnich Stanach Zjednoczonych były miejscem badań. Rowy były zasiane trawami i roślinami wodnymi i otrzymały odpływ z systemu septycznego jak i opad deszczu. Dół odwadniający z podobną hydrologią roślinności były wybrane jako kontrola nietraktowana. Każde miejsce było zasiedlone Culex pipiens i Culiseta incidens w czasie traktowania. Tuż przed traktowaniem pobierano próbki z każdego poletka badawczego i liczono liczbę larw w próbce testowanej z każdego poletka aby uzyskać wartość kontrolną.

Testowane larwicydy były formułami opisanymi w przykładzie 10 i następnie dwa z miejsc testowanych traktowane odpowiednią ilością jednego z dwóch testowanych larwicydów odpowiadającej pojedynczej dawce 20 funtów/akr.

Pozostałe miejsce testowane nie było traktowane aby służyć jako kontrola.

Pobierano próbki larw z poletek testowych w czwartym dniu i siedmiu dniu po traktowaniu. Uzyskane liczby porównano z liczbą larw przed traktowaniem. 100% obniżenie wskazuje, że wszystkie larwy były zabite. Dodatnia liczba dla procentu spadku oznacza, że larwicyd zabija. Wyniki przedstawiono w tabeli 11 poniżej, wskazując, że mieszanina 1:1 B.t.i. do B.s. może kontrolować larwy Culex pipiens i Culiseta incidens.

T a b e l a 11. Średnie obniżenie w procentach

Traktowanie	% spadku larw -dzień 4	% spadku larw -dzień 7
1:1 B.t.:B.s.	100	98
B.s.	100	100

P r z y k ł a d 13

Skuteczność mieszaniny 2:1 B.s. (VECTOLEX) do B.t.i. (VECTOBAC) określono w polu w następujący sposób.

Pole testowe było polem ryżowym w zachodnich Stanach Zjednoczonych mierzącym 63,13 ha (156 akrów). Stosowano groble jako zony buforowe między poletkami testowymi. W czasie traktowania larwy Anopheles freeborni były obecne przy gęstości 0,5-3,0 na czerpnięcie według standardowego testu czerpania. Każdy resztkowy larwicyd i kombinacja larwobójcza były stosowane z szybkością 1,345x10^-3 kg/m² samolotem, który zrzucał granulki przy szybkości 40 m/s i szerokości 18 m.

Liczby larw badano w dniach 2,6 i 15 po traktowaniu i mierzono względem liczby larw nie traktowanego kontrolnego pola testowego. Wyniki przedstawione w tabeli 12 poniżej ilustrują, że mieszaPL 206 597 B1 nina 2:1 skutecznie zabija larwy, jako dodatnia liczba dla procentu kontroli larw wskazuje, że larwicyd zabija.

T a b e l a 12. Średni spadek w procentach

Traktowanie	% spadku larw - dzień 2	% spadku larw - dzień 6	% spadku larw - dzień 15
2:1 B.t.i.:B.s.	50	100	0
B.s.	81	87	93
B.t.i.	100	100	90

P r z y k ł a d 14

Następujące badania wykazują wrażliwość różnych komarów wrażliwych i niewrażliwych na B.s. na mieszaniny. Popierają one twierdzenie, że mieszaniny są sposobem kontroli komarów oraz kontroli komarów opornych na B.s. Trzy z badań także popierają sposób mieszania technicznych proszków przed formułowaniem granulek.

Skuteczność mieszaniny formuł 1:1 B.t.i. i B.s. dla kontroli opornych na B.s. populacji Culex quinquefasciatus w porównaniu z każdą formułą oddzielnie.

Materiał i metody

Wysoce oporna populacja Culex quinquefasciatus była zidentyfikowana w Wat Pikul, Bang Yai District, Prowincja Nonthaburi, Tajlandia. Tę populację traktowano różnymi dawkami VectoBag WDG (3000 Bti ITU) i VectoLex WDG (650 Bs ITU) i mieszaniną 1:1 obu pomiędzy styczniem i wrześniem 2001. Po każdym traktowaniu oceniano zmiany populacji w czasie przez zaczerpnięcie i procent kontroli larw i poczwarek późnej wylinki i liczono dla dni po traktowaniu.

Wyniki ₂

Dawki VectoLex WDG tak wysokie jak 200 mg/m² dały niewiele lub brak kontroli populacji. VectoBac WDG okazał się dawać kontrolę w dawkach tak niskich jak 20 mg/m². Mieszanina 1:1 dwóch produktów okazała się być bardziej skuteczna niż każdy produkt oddzielnie w dawce 20 mg/m².

T a b e l a 13

Procent spadku opornej populacji polowej Culex quinquefasciatus po traktowaniu B.s., B.t.i. i mieszaniną B.t.i. i B.s.

Traktowanie	Dzień 2	Dzień 7	Dzień 14
B.s. 650 ITU @ 200 mg/m2	13	nd	nd
B.t.i. 3000 ITU @ 20 mg/m2	87	46	-53
mieszanina 1:1 (B.s. 325 ITU + B.t.i. 1500 ITU @ 20 mg/m2	97	50	22

Skuteczność dwóch kombinowanych formuł B.t.i./B.s. dla kontroli Culex pipiens i Culiseta incidens w porównaniu ze standardową formułą B.s. na sztucznych poletkach

Materiały i metody

Ustanowiono 28 sztucznych testowych poletek stosując sadzawki do brodzenia w obszarze parkingu instalacji Multonomah County Mosquito Control District na 5235 N. Columbia Blvd. Portland OR, 27 lipca 2001. Sadzawki umieszczono w czterech rzędach z siedmioma sadzawkami na rząd. Każdy rząd określono jako serię testową. Sadzawki wypełniono do głębokości około 0,2 m wodą wodociągową od dostarczyciela wody do instalacji. Tę głębokość utrzymano w czasie całych badań. Każda sadzawka miała przybliżoną powierzchnię 0,785m². Każdą sadzawkę wzbogacono słomą i karmą dla królików (100 gr) aby dostarczy ć siedlisko i po ż ywienie dla larw komarów.

Sadzawki pozostawiono aby postarzyć mieszaninę siano/karma dla królików i by pozwolić na ustanowienie naturalnych populacji lokalnych komarów. Sztuczne zasiedlanie testowych sadzawek przeprowadzono po tym gdy lokalne populacje komarów nie dały dostatecznych populacji w pulach dla badań. Po tym inicjalnym zasiedleniu populację Culex pipiens i Culiseta incidens utrzymywały się przez naturalną infestację.

W badaniach porównywano trzy formuły określone jako ABG-6185, VBC60015 i VBC60019. ABG-6186 było złożone z proszku technicznego B.s. formułowanego na kaczanie kukurydzy i ma moc 50 B.s. ITU. VBC-60015 i VBC-60019 były kombinacjami technicznych proszków B.t.i. i B.s. formułowanych na kaczanie kukurydzy i miały teoretyczne moce 2000 B.t.i./50 B.s. ITU i 100 B.t.i./50 B.s. ITU odpowiednio. Formuły testowano przy stężeniach 2,5 kg/ha i 5 kg/ha w porównaniu z nie traktowanymi

PL 206 597 B1 kontrolami. Zrobiono cztery repliki dla każdego stosowanego stężenia i nie traktowanej kontroli w losowym wzorze w serii.

Pobieranie próbek przeprowadzono przez pobranie w 5 zaczerpnięciach na sadzawkę stosując standardowe czerpaki do komarów i zatężanie złowionych larw sitem o gęstych oczkach. Złożone próbki konserwowano w alkoholu do liczenia i identyfikacji gatunków. Liczby larw zapisywano jako L1-L2, L3-L4 i poczwarki.

Zliczenia przed traktowaniem, i aplikacje produktu testowanego robiono 20 sierpnia, 2001. Wstępne zliczenia larw po traktowaniu zrobiono 23 sierpnia 2001 około 64 godziny po traktowaniu. Następne zliczenia zrobiono 27 sierpnia, 31 sierpnia i ostateczne zliczenie 6 września 2001.

Sukces kontroli określano przez liczenie średniej liczby larw 3. i 4. stadium i poczwarek w zliczeniach przed i po traktowaniu z czterech powtórzeń każdego testu. Procent kontroli zliczono przez stosowanie formuły Mulla w ogólnej populacji średniej dla każdej traktowania.

Wyniki

Po traktowaniu średnie populacje na wszystkich poletkach zmniejszyły się względem kontrolnych nietraktowanych poletek i były znacząco niższe (P=0,05 Student-Newman-Keuls) niż nie traktowane kontrole w 7 dni po traktowaniu. Wystąpiły liczbowe ale nie znaczące statystycznie różnice między indywidualnymi traktowaniami. Wstępne obniżenie (3 dni po traktowaniu) były ogólnie najwyższe dla formuł kombinowanych i podobną kontrolę dla tych z formuły przez cały czas trwania badań. Procent obniżenia po traktowaniu przy 2,5 kg/ha przedstawiono w tabeli 14.

T a b e l a 14

Skorygowany procent spadku larw Culex i Culesita L3 i L4 w sztucznych poletkach po stosowaniu traktowania przy 2,5 kg/ha*

Traktowanie	Dzień 2	Dzień 7	Dzień 11	Dzień 17
B.s. 150 ITU	33,1	55,1	71	74,6
VBC 60015 (B.t.i. 200 ITU/B.s. 50 ITU)	65,1	97,2	97,2	81,2
VBC 60019 (B.t.i. 100 ITU/B.s. 50 ITU)	82,5	94,1	85,8	65,7

* korekta wobec nie traktowanej kontroli w oparciu n ś rednich dla populacji z 5 powtórzeń

Skuteczność dwóch formuł kombinowanych B.t.i./B.s. dla kontroli Culex tarsalis i Culex pipiens w porównaniu ze standardowymi formuł ami B.s. na mał ych poletkach w terenie.

Materiały i Metody

Miejscem testu było bagno gdzie mały strumień wpadał do rzeki Yakima w pobliżu Yakima, Washington. Były obecne naturalne populacje Culex tarsalis i Culex pipiens. Woda była zasadniczo stojąca. Głębokość wynosiła 0,15-0,30 m i pozostała stała w czasie eksperymentu. Temperatura wody wynosiła między 22 i 25°C w czasie eksperymentu. Wegetacja była przede wszystkim trawą z rozproszonymi chwastami szerokolistnymi pokrywającymi 80% na powierzchni, wysokość roślin 0,15-0,38 m. Bydło czasem żerowało na tym polu ale nie było obecne w czasie testu. Substancje organiczne były na wysokim poziomie w tym miejscu. Populacje drapieżników na poletkach były na ogół niskie.

₂

Test był randomizowanym całkowitym eksperymentem blokowym z trzema poletkami około 93 m² na traktowanie. Próby z poletek pobierano bezpośrednio przed podaniem aplikacji 19 lipca 2001 i 48 godzin, 7 dni i 14 dni po stosowaniu. Dwadzieścia zaczerpnięć standardowym czerpakiem komarów robiono na każdym poletku. Larwy wylinki 1-2, larwy wylinki 3-4 i poczwarki liczono w każdym czerpaku.

W tych badaniach porównywano trzy formuł y okreś lone jako ABG6185, VBC60015 i VBC60019 porównywano. ABG-6185 było złożone z proszku technicznego B.s. formułowanego na kaczanie kukurydzy i miał moc 50 B.s. ITU. VBC-60015 i VBC-60019 były kombinacjami technicznych proszków B.t.i. i B.s. formułowanych na kaczanach kukurydzy i miały teoretyczne moce 200 B.t.i./50 B.s. ITU i 100 B.t.i./50 B.s. ITU odpowiednio. Formuł y testowano przy stężeniu 5,6x10^-4 kg/m² i porównywano z nietraktowanymi kontrolami. Dane analizowano za pomoc ą analizy wariancji. Procent spadku liczono z formułą Mulla i był oparty tylko na duż ych larwach i poczwarkach. Ogólne ś rednie dla populacji dla każdego traktowania stosowano w tych wyliczeniach.

Wyniki

Po dwóch dniach po traktowaniu wszystkie trzy formuły dały znaczącą choć nie wyjątkową kontrolę. Stężenie 5,6x10^-4 kg/m² może było nieco za niskie dla tego miejsca. Kontrola w dniu 7 i 14 nie

PL 206 597 B1 była znacząca głównie dlatego, że populacja larw w drugim powtórzeniu nie traktowanej kontroli miała bardzo małą populację. Tym niemniej procent kontroli był wyższy we wszystkich traktowanych poletkach niż w nie traktowanych poletkach w dniu 7 i 14. Przy porównaniu formuł nie wydawało się być różnicy między traktowaniami w dniu 2 ale obie formuły VBC były lepsze niż ABG-6185 w dniu 7. Skorygowane spadki w procentach wyliczone stosując średnie populacji dla poczwarek L-3 przedstawiono w tabeli 15.

T a b e l a 15

Skorygowany procent spadku larw i poczwarek Culex L3-L4 w małych poletkach terenowych po stosowaniu traktowania przy 5,6x10^-4 kg/m² *.

Traktowanie	Dzień 2	Dzień 7	Dzień 14
B.s. 500 ITU	50	52,3	17,3
VBC 60015 (B.t.i. 200 ITU/B.s. 50 ITU)	58,0	73,4	64,0
VBC 60019 (B.t.i. 100 ITU/B.s. 50 ITU)	59,4	81,7	38,4

Skuteczność czterech kombinowanych formuł dla kontroli Ochlerotatus taeniorhynchus w porównaniu ze standardową formułą B.t.u. na sztucznych poletkach.

Materiały i metody

Dwadzieścia cztery sztuczne poletka testowe umieszczone w Centrum Badań Zdrowia Publicznego i Edukacji John A. Mulrenan Sr. w Panama City, Floryda, były stosowane w tych badaniach. Poletka wypełniono wodą do głębokości około 0,15 m przy zasoleniu wody 3-5 ppt. Tę głębokość utrzymywano w całych badaniach. Każde poletko miało przybliżoną powierzchnię 0,743 m². Pojawiające się trawy i substrat z piaszczystej gleby były obecne na poletkach. Temperatura wody była średnio 24°C w czasie badań.

Syntetyczną infestację poletek testowych przeprowadzono przed wstępnym traktowaniem i co drugi dzień po traktowaniu. Około 1000 larw trzeciej wylinki Ochleroratus taeniorhynchus dodano do każdego poletka w każdym dniu infestacji.

Pięć formuł określonych jako ABG638s, VBC60015, VBC60016, VBC60018 i VBC60019 porównywano w badaniach. ABG-6138s był złożony z technicznego proszku B.t.i. formułowanego na kaczanie kukurydzy i miał moc 200 B.t.i. ITU. VBC60015, VBC60016, VBC60018 i VBC60019 były kombinacjami technicznych proszków B.t.i. i B.s. formułowanych na kaczanie kukurydzy i miały teoretyczne moce 200B.t.i./50B.s. ITU, 100B.t.i./25B.s. ITU, 200B.t.i./25B.s. ITU i 100B.t.i./50B.s. ITU, odpowiednio. Formuły testowano przy stężeniach 2,8 kg/ha w porównaniu z nie traktowanymi kontrolami. Przeprowadzono cztery powtórzenia dla każdej stosowanej dawki i nie traktowanej kontroli w losowym wzorze w całej serii testowej.

Pobieranie próbek robiono pobierając 8 prób na poletko, stosując standardowe czerpaki do komarów. Liczby larw zebranych z każdego poletka zapisywano. Wstępne pobieranie próbek przeprowadzono w dniu 2, 3, 5, 7, 10 i 13 po traktowaniu.

Powodzenie kontroli oznaczono przez porównanie liczby larw zebranych z traktowanych poletek do liczby zebranych z poletek UTC.

Procent śmiertelności wyliczono dla każdego traktowania stosując następujący wzór.

% śmiertelności = (liczba larw w kontroli - liczba larw w próbce traktowanej)/liczba larw w kontroli

Wyniki

Jeden dzień po traktowaniu populacje we wszystkich polach były znacząco niższe niż na polach nie traktowanej kontroli. Średni procent zmniejszenia w dniu pierwszym był w zakresie od 17,9% dla VBC60015 do 98,5% dla VBC60018. Nie było znaczących różnic między traktowaniami tego dnia. Materiały kontynuowały wykazywanie skuteczności do 7 dnia badań, po którym to czasie procent kontroli spadał szybko. Trzy z kombinowanych traktowań VBC60015, VBC60018 i VBC60019 dostarczyły znacząco wyższy ogólny procent spadku w trakcie 13 dniowych badań (LSMEANSS wielokrotne porównania test p = 0,05). Procent spadku do dnia 7 od traktowań przy 2,8 kg/ha przedstawiono w tabeli 16.

PL 206 597 B1

T a b e l a 16

Procent spadku do dnia 7 przez traktowanie przy 2,8 kg/ha

Traktowanie	Dzień 1	Dzień 2	Dzień 3	Dzień 5	Dzień 7
B.s. 500 ITU	84,9	58,8	51,6	71,7	14,8
VBC 60015 (B.t.i. 200 ITU/B.s. 50 ITU)	79,7	71,9	76,5	67,3	43,5
VBC 60016 (B.t.i. 100 ITU/B.s. 25 ITU)	84,2	75	19,3	63,8	20,5
VBC 60018 (B.t.i. 200 ITU/B.s. 25 ITU)	98,5	65,7	64,2	70,3	38
VBC 60019 (B.t.i. 100 ITU/B.s. 50 ITU)	91,3	67,1	62,7	60,4	28,1

Obecny wynalazek jest zilustrowany przez opis i przykłady. Opis ma być nieograniczającą ilustracją, ponieważ wiele wariantów w ich świetle stanie się widocznych dla osób biegłych w dziedzinie. Celem jest by wszystkie takie warianty były objęte zakresem zastrzeżeń.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania kompozycji zawierającej kombinację szczepu Bacillus thuringensis podgatunek israelensis i szczepu Bacillus sphaericus, znamienny tym, że zawiera kolejne etapy, najpierw prowadzi się osobno fermentację obu szczepów, następnie zatęża się oba szczepy do uzyskania stałego preparatu, stężenia lub aktywności, kolejno łączy się oba zatężone szczepy i uzyskuje się mieszaninę w postaci papki a następnie suszy się rozpyłowo tę mieszaninę otrzymując osobne cząstki, które zawierają toksyny zarówno z Bacillus thuringensis podgatunek israelensis jak i z Bacillus sphaericus.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymane cząstki wprowadza się następnie do produktów larwobójczych, przy czym produkty te mają postać wybraną z grupy obejmującej: proszki, granulki, zwilżalne proszki, granulki do zawiesin wodnych, granulaty, brykiety, zawiesiny wodne, zawiesiny emulgowane, koncentraty wodne i niewodne.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do kompozycji dodaje się składnik wybrany z grupy obejmują cej: ś rodek powierzchniowo czynny, bierny noś nik, ś rodek konserwują cy, ś rodek nawilżający, środek stymulujący żelowanie, środek wabiący (atraktant), środek otoczkujący, środek wiążący, środek emulgujący, barwnik, środek chroniący przed promieniowaniem UV, bufor, środek kontrolujący dryf, środek poprawiający osadzanie się aerozolu, środek wspomagający swobodny przepływ oraz ich kombinacje.
4. 4. Produkt uzyskany sposobem według zastrz. 1.
5. 5. Sposób kontrolowania larw Diptera, znamienny tym, że do środowiska, w którym obecne są larwy Diptera wprowadza się larwobójczo skuteczną ilość produktu uzyskanego sposobem opisanym w zastrz. 1.