ES2939783B2 - Bioinsecticida con base en bacillus thuringiencis var israelensis en una matriz de micelio agotado de hongo pleurotus spp. y su metodo de obtencion - Google Patents
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Classifications
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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Description
DESCRIPCIÓN
Bioinsecticida con base en Bacillus thuríngiencis var israelensis en una matriz de micelio agotado de hongo Pleurotus spp y su método de obtención
Campo de aplicación
Se identificaron los grupos generales en la clasificación:
Dentro del primer nivel, la presente tecnología pertenece a la clase internacional general A qué se refiere a NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA
En el segundo nivel, la presente tecnología pertenece a la subclase A01 que se refiere a AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA
Para el tercer nivel se identificó la subclase A01N que se refiere a CONSERVACION DE CUERPOS HUMANOS O ANIMALES O DE VEGETALES O DE PARTES DE ELLOS
(conservación de alimentos o productos alimenticios A23); BIOCIDAS, p. ej. EN TANTO QUE SEAN DESINFECTANTES, PESTICIDAS O HERBICIDAS (preparaciones de uso médico, dental o para el aseo que eliminan o previenen el crecimiento o la proliferación de organismos no deseados A61K); PRODUCTOS QUE ATRAEN O REPELEN A LOS ANIMALES; REGULADORES DEL CRECIMIENTO DE LOS VEGETALES (mezclas de pesticidas con fertilizantes C05G)
Dentro del cuarto nivel se identificó la subclase A01N63/00 que se refiere a Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos, virus, hongos microscópicos, animales, p. ej. nematodos, o sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos, virus, hongos microscópicos o animales, p. ej. encimas o productos de fermentación (que contienen compuestos de constitución determinada A01N 27/00-A01N 59/00) [2006.01] Dentro del quinto nivel se encontró la subclase A01N63/02 que se refiere a Sustancias producidas por, u obtenidas a partir de microorganismos o animales [2006.01]
Otras clasificaciones dentro de la misma raíz
A01N25/12
Biocidas, productos que repelen o atraen a los animales perjudiciales, o reguladores del crecimiento de los vegetales, caracterizados por su forma, ingredientes inactivos o modos de aplicación (papel fungicida, bactericida, insecticida, desinfectante o antiséptico D21H); Sustancias que reducen los efectos nocivos de los ingredientes activos en organismos distintos a los perjudiciales [2006.01]
Polvos o granulados.
1. Descripción breve
La presente invención hace referencia a un bioinsecticida-larvicida con base en un Bacillus thuringiensis var israeliensis en una matriz de micelio agotado de hongo Pleurotus spp. y su método de obtención, para el control de larvas de mosquitos vectores. Se puede añadir
tusa de maíz en la mezcla, pero la ventaja del micelio es que no hay riesgo de contaminación por otros hongos micromicetos invasores, además mantiene una actividad acuosa Aw mínima, dando una consistencia que facilita la molienda y una vida útil superior a 2 años.
Este bioinsecticida-larvicida se compone de tres procedimientos o procesos principales: a) Método de tratamiento de la materia prima (micelio agotado del hongo Orellana Pleurotus spp)
b) Procedimiento para la elaboración del caldo (Medio líquido-triptona para mezclar con la materia prima)
c) Procedimiento para la selección de las cepas de trabajo y su posterior criopreservación en crioperlas
d) Proceso para la implementación de mezcla entre el caldo con la materia prima (gránulos de micelio agotado de hongo Pleurotus spp tusa de maíz dado el caso)
Dichos procesos en resumen utilizan residuos agrícolas como el sustrato agotado de micelio del hongo Orellana Pleurotus spp. Este es triturado a través del tamiz con poro de 3/8" 9,53 mm 0 0,38 pulgadas con la ayuda del molino de martillos.
También la tusa del maíz como materia prima, los cuales a través de un tratamiento previo permiten obtener pellets que conforman el granulado dónde vamos a inocular las esporas que se encuentran en el caldo.
Con dichos procesos y materias primas permiten obtener un producto que es un matriz soporte estructural para las esporas de Bacillus thuringiensis var. israeliensis para su aplicación directa en el agua, para el control de larvas o mosquitos vectores.
2. Estado de la técnica
En la agricultura moderna se hace necesario emplear productos insecticidas o larvicidas que no tengan efectos contra la salud humana ni contra los ecosistemas agrícolas (ejemplo, los insectos beneficiosos), el medio ambiente, en su sentido más amplio y las especies que no son el objetivo, así como paisajes y comunidades. En este contexto es posible encontrar ejemplos donde los insecticidas han tenido un impacto desastroso en todas aquellas variables y otros ejemplos donde los peligros que representaban han sido mitigados, en general las consecuencias ecológicas del uso de insecticidas, particularmente químicos, causan gran preocupación.
Los insecticidas se encuentran entre las herramientas agrícolas que están más asociadas con el daño ambiental, debido a que su objetivo específico es matar plagas de insectos y por consecuencia puede que tenga un impacto letal o subletal en organismos que no son su objetivo (por ejemplo, recicladores de nutrientes del suelo, polinizadores de plantas y depredadores de plagas) y reducir o contaminar productos alimenticios.
Los bioinsecticidas hacen uso de agentes patógenos naturales para combatir los insectos de la manera más efectiva y selectiva debido a que solamente matan a los insectos a los que están destinados.
Se han evidenciado varias soluciones las cuales a través de sus composiciones permiten acabar con las larvas, pero que no funcionan en todos los climas debido a sus gránulos congelados, otros productos involucran soluciones pastosas, así mismo, otras formulaciones de bioinsecticida son secas y han sido una forma alternativa para resolver los problemas de larvas ya que son fáciles de almacenar, empacar y llevar a áreas infestadas.
A continuación, se hace una relación de las invenciones encontradas que apuntan a resolver el problema técnico planteado, así como sus principales diferencias y limitaciones con el concepto inventivo propuesto en la presente solicitud:
3. Descripción detallada:
La invención hace referencia a un larvicida que utiliza como materia prima subproductos agrícolas pero su uso es exclusivamente ambiental, por si no combate una plaga que afecté a un cultivo en concreto, su funcionalidad se debe a las esporas de Bacillus thuringiensis var.israeliensis que contiene unas proteínas en forma de cristales 5-endotoxina que presentan una toxicidad específica cuando son ingeridos por las larvas filtradoras de mosquitos vectores.
Para lograr el efecto larvicida, la larva debe ingerir suficientes cristales para producir un desbalance osmótico que altere el sistema digestivo y que provoca que la larva colapse y muera.
La novedad del uso de la matriz compuesta de micelio agotado de hongo orellana Pleurotus spp, se hizo una proyección de pruebas en banco de hidráulica básica donde se evalúo las siguientes variables arrastre, flotabilidad, precipitación vs caudal.
Se puede decir que hay 3 factores críticos que determinan la ingesta-efectividad del producto por las larvas:
1. Fotolisis: Los cristales 5-endotoxina son muy sensibles a la luz solar, pero se ha comprobado que la matriz de micelio agotado de orellana, al tratarse de un material poroso se va liberando lentamente y queda más protegido de los rayos solares.
2. Flotabilidad: La flotabilidad positiva permite que el principio activo se vaya liberando poco a poco en la parte superficial, dónde pasan la mayor parte del tiempo las larvas alimentándose. El producto tiene una residualidad de 1 mes desde su aplicación.
3. Dosificación: Es necesario aplicar 2,2 gramos por metro cuadrado (m2 ) del espejo de agua, es importante aclarar que el producto se puede aplicar en seco y se activaría cuando se inunde. También no está de más decir que no se tiene en cuenta la profundidad por las larvas encontrarse en la mayor parte del tiempo en la parte superficial.
Los bioinsecticidas hacen uso de agentes patógenos naturales como control biológico para combatir los insectos de la manera más efectiva y selectiva debido a que solamente matan a los insectos a los que están destinados. En cambio, los insecticidas puede que tenga un impacto letal o subletal en organismos que no son su objetivo (por ejemplo, recicladores de nutrientes del suelo, polinizadores de plantas y depredadores de plagas) y reducir o contaminar productos alimenticios.
Aplicación preferida
La presente invención revela un bioinsecticida-larvicida con base en un Bacillus thuringiencis var israelensis y su proceso de fabricación para el control de larvas o mosquitos vectores.
El proceso de fabricación se compone de tres procedimientos principales:
a) Método de tratamiento de la materia prima (micelio del hongo Orellana Pleurotus spp)
- La tusa o micelio del hongo Orellana Pleurotus spp se recibe en bultos, en el caso de a tusa está previamente limpia, es decir sin granos de maíz, seca y libre de cualquier plaga.
- Se le aplica un proceso de molienda, el cual incluye verter la materia prima en un molino de martillos iniciando un movimiento de tornillo sinfín, ejecutando un tamiz de 3/8" 1.94 cm.
- El molino proyecta las partículas hacía un silo, dónde se recolecta, cuando está lleno el silo, se transporta en una carreta con sacos de estopa.
- Posteriormente, la materia prima se vierte en la zaranda vibratoria para separar los residuos y establecer la granulometría deseada para el producto.
- Una vez realizado el tamizaje se recolecta en garrafas de 50 galones (Capacidad máxima 200 litros y 10,8 kg), estos pueden estar dispuestos o no sobre estibas. El peso neto con el producto son aproximadamente 47 kg. El molino tiene una capacidad para moler 85.2 kg/media hora por ciclo x 3 ciclos/día equivale a 1022 kg/día. Más de una tonelada.
- La tusa va a ser usada en los dos procesos siguientes, tanto para dejar el inóculo con las esporas y para ser usada como medio de soporte de la matriz estructural.
b) Procedimiento para la elaboración del caldo (Medio líquido- triptona de soya para mezclar con la materia prima)
- Además del caldo triptona de soya (TSB) también se puede utilizar el caldo Triptona Soja Extracto de Levadura (TSYEB) con resultados similares.
- Se utiliza la tusa ya previamente tratada para dejar el inóculo con las esporas durante toda la noche (equivale a 12 horas) en caldo triptona levadura (Medio liquido) a temperatura ambiente (22°C ± 2), para tener como resultado que las esporas se activen y pasen a fase germinativa.
Descripción detallada del proceso en el que las bacterias se encuentran en fase germinativa con crecimiento vegetativo (exponencial) y están preparadas para su inoculación en la matriz (tusa de maíz):
1. Se pesan todos los componentes de la mezcla, dependiendo el tipo de caldo utilizado, en el punto 4 se expone el comportamiento que siguieron ambos medios. El motivo de utilizar 2 tipos de caldo diferentes es para tener alternativas con los proveedores, ya que los medios pueden tardar hasta 60 días en la importación. Podemos utilizar frasco Pyrex borosilicato de 500 ml o 250 ml.
Vamos a exponer el de 500 ml, este es aforado con agua destilada hasta la curva del frasco y todos los componentes que se pesaron en una balanza volumétrica con precisión (d = 0,001 gr) y un peso máximo de 250 gr:
2. Una vez se vierte cada uno de los ingredientes de la mezcla se afora con agua destilada.
3. Se coloca el frasco en la plancha térmica durante 15 min a 155°C y una velocidad de 7,7 rpm. Además, es necesario ubicar un magneto con una longitud equivalente a la base del frasco, dejando 1 cm a ambos lados de la pared del frasco.
4. Se procede a la lectura del espectrofotómetro utilizando unas cubetas de cuarzo, como blanco se utiliza caldo de cultivo previamente esterilizado en autoclave 15 min a 15 libras de presión a 121°C para tal fin podemos utilizar frasco pyrex borosilicato de 250 ml (tapa azul) y después se hace una lectura cada 24 horas, hasta que alcancé una absorbancia de 0,6 a una longitud de onda de 600 nm, esto queda en el espectro del visible.
En la siguiente tabla se muestra en qué tiempo llega a esa absorbancia y en qué momento se alcanzó esa absorbancia y que por lo tanto es el momento óptimo para la nebulización.
5. Se selecciona el caldo cuando se encuentra en su máximo crecimiento, ya que es el momento clave para la nebulización.
6. El contenido se vierte para realizar el proceso de nebulización del caldo con las bacterias en crecimiento exponencial Bacillus thuringiensis con tecnología spraying system con flujo/hora bajo. Este proceso se enlaza con el flujograma del proceso de la materia prima enviado anteriormente.
- El proceso indica que se coloca un frasco en una plancha térmica durante 15 min a 155°C y una velocidad de 7,7 rpm. Además, es necesario ubicar un magneto con una longitud equivalente a la base del frasco, dejando 1 cm a ambos lados de la pared del frasco.
- Se pone a crecer en un tubo de ensayo de 20ml (el motivo de utilizar un volumen pequeño es tener suficientes muestras por si hay alguna contaminación) estos se ponen a 37 grados con un agitador (200 rpm), hasta la mitad de la fase según la lectura del espectrofotómetro utilizando unas cubetas de cuarzo, como blanco se utiliza agua destilada y después se hace una lectura cada 24 horas, hasta que alcancé una absorbancia de 0,6 a una longitud de onda de 600 nm, esto queda en el espectro del visible, esto es para tener un análisis cuantitativo y cualitativo de las bacterias, es decir, se selecciona el caldo cuando se encuentra en su máximo crecimiento, ya que es el momento clave para la nebulización.
- Finalmente, el caldo se filtra con una bomba de vacío o por gravedad, en ambos procedimientos con malla de 120 qm para quitar trozos de micelio para obtener el líquido libre de residuos (caldo bacterias).
c) Procedimiento para la selección de las cepas de trabajo y su posterior criopreservación en crioperlas
- Una vez alcanzamos 0,6 de absorbancia se hace una dilución seriada 1:100 (10-2 ) en fase exponencial (se pueden hacer otras diluciones pero se ha demostrado que se obtienen suficientes bacterias resuspendidas en dilución 1:100) a continuación colocamos las crioperlas en crioviales de 2 ml, previamente tenemos que seguir los siguientes pasos:
1. Tomar una pipeta de vidrio estéril, pipetear asépticamente 1,8 mL de la dilución -2 del inóculo con las bacterias resuspendidas más el caldo y añadir 0,2 ml de glicerol (criopreservante). Esta solución se compone:
• 0,2 ml de glicerol
• 1,8 ml de caldo TSB o TSEYB con bacterias resuspendidas (inóculo).
2. En total serán 2 ml de la solución que será vertida en una caja de petri vidrio o plástica de 9 cm de diámetro.
3. A continuación, vertemos las crioperlas, en el caso de caja de petri de vidrio con el movimiento de nuestra muñeca realizando oscilaciones será suficiente, en caso de caja de petri plástica se puede utilizar un asa plana estéril para que rueden las crioperlas.
4. Los viales con crioperlas de cepas de trabajo, cuando van a ser usados, se debe sacar las perlas necesarias y en el menor tiempo posible debe ser guardado, nuevamente, el vial en el congelador. Se utilizan crioviales de 2 mililitros con crioperlas, ya que estas aumentan la relación superficie/volumen y además impide que se tenga que descongelar toda la muestra del crioviales y sólo se tomé lo necesario para inocular al medio que se dispone en el tanque.
5. Una vez a la semana hay que valorar la viabilidad y pureza estableciendo la dilución mínima reduciendo la necesidad de realizar las diluciones seriadas y reduciendo tiempos.
Para conservar las cepas de trabajo se requiere tener la información sobre la procedencia, # pase (en este caso sería quinto pase) y fecha de congelación.
Se utiliza un congelador de -80 grados Criopreservación con caldo TSY o TSEYB a la dilución 2 1:100 20% del volumen de glicerol. (4 días se requieren para bajar gradualmente la temperatura):
Mediante este proceso conseguimos aumentar la vida útil de las cepas de trabajo, estas pueden ser viables de 5 a 10 años a -80°C. Si se mantiene a -20°C o menos duran máximo 1 año.
Se conservan en crioviales de 2 ml correctamente marcados con número del lote (PTODDMMAA) está información facilitará la procedencia. Vamos a desglosar la información implícita en este número de lote:
• P Proveedor de materia prima (micelio agotado orellana u otros residuos agrícolas).
• T Turno de trabajo (1-2-3 donde se inoculó el caldo con las esporas)
• Número del técnico/operario del proceso de criopreservación.
• DDMMAA Fecha de congelación que se aíslo la cepa de trabajo, procedencia, # pase (en este caso sería quinto pase) y fecha de congelación (determinar fecha de caducidad a -80°C en 10 años y a -20°C en 1 año).
d) Proceso para la implementación de mezcla entre el caldo con la materia prima
1. Se utiliza el caldo con las bacterias resuspendidas Bacillus thuringiensis var.israeliensis filtrado resultante, para realizar un proceso de nebulización (dividir en partes pequeñas), dicho caldo se agrega a un tanque (presurizado en acero Inoxidable de 5 galones con Boquilla atomizada con aire en bronce niquelado) para aplicar a través de tecnología spraying system con flujo/hora bajo, al micelio agotado de Orellana, el cual va a ser utilizado como medio de soporte de matriz estructural.
2. Operación de la boquilla manual:
Prueba de Caudal
Medición del Caudal de salida de la pieza a diferentes presiones de trabajo:
1. Prueba de Cobertura
Medición del Ángulo
Altura de referencia: 100 mm
En la parte final de la tabla están los procesos óptimos para cumplir con los intervalos entre la molienda según la capacidad instalada para la fabricación del producto final.
• Los modelos 11005 combinan las características de las JN y las JCO ofreciendo una combinación de aguja de cierre y limpieza:
• Cuenta con una aguja de cierre manual que permite que se cierre el flujo del líquido a la boquilla. Ideal para aplicaciones de aspersión intermitentes donde el líquido se puede llegar a secar en el orificio entre usos.
• La aspersión del caldo a través de una cinta continua o puede ser por caída por gravedad en un codo PVC de 32” y ángulo de 45%. La ubicación del cabezal de la boquilla es ese punto es para evitar el impacto del chorro de manera perpendicular a la pared lo que produce que queden pegados la materia prima y puede llegar a taponar la tubería, además que habría sobredosificación del caldo, no respetando la concentración garantizada de 2,8% esporas Bacillus thuringiensis.
Producto final
1. Una vez realizada la nebulización se deja secar en un espacio seco por 24 o más horas a una temperatura de 30 grados y humedad relativa menor del 50%. Se han realizado pruebas de vida útil durante 2 años, en los que se apreció que no ha crecido ningún tipo de hongo o levadura oportunista que dañe el producto. Se determinó que la microestructura de estos pellets es un material suficientemente poroso para albergar estos microorganismos, importante ya que mantienen una actividad de agua “Aw” mínima para impedir que puedan colonizar microorganismos oportunistas como mesófilos, mohos y levaduras.
2. Composición. Para calcular este valor nos basamos al peso del producto terminado con la correspondiente materia prima que se muele en un turno, eso equivale a 341 kg/ 2 horas (duración de la molienda) incorporación del principio activo por lo tanto equivale a 344,2 kg. En el molino se introducirán ambas matrices en la proporción que aparece en la descripción inferior 60/40:
• Micelio agotado de orellana:
o Densidad 382 kg/m3
o Volumen 0,53 m3 « 530 litros
o Masa 205 kg « 60%
• Tusa de maíz
o Densidad 480 kg/m3
o Volumen 0,28 m3 « 280 litros
o Masa 136 kg « 40%
Una vez se ha obtenido el tamaño del gránulo deseado a través del tamiz se ubica en una cinta sin fin de 10 centímetros de anchura dónde a continuación se realizará la aspersión.
• Concentración ingrediente activo: 2,8% esporas Bacillus thuringiensis var.israeliensis (concentración garantizada).
o 3253 gramos / 341 kg (materia prima total: micelio agotado de orellana tusa de maíz)
A modo de resumen por cada kg de producto terminado tenemos:
1. 586 gramos micelio agotado de orellana
2. 386 gramos tusa de maíz
3. 28 gramos ingrediente activo esporas Bacillus thuringiensis var.israeliensis
La producción total semanal que se procesa para 15 turnos serían 5115 kg de producto terminado.
Finalmente se obtiene un producto granulado listo para empacar el cual se utiliza en unidad de estopa laminada con polietileno interno de dimensiones de 90 cm x 60 cm, debe asegurarse una protección de la humedad, el uso del micelio agotado de orellana mantiene la actividad de agua al mínimo, esto evita el crecimiento de mohos y levadura que puedan dañar el producto, el peso neto de cada bulto serán 20 kg. Adicionalmente también se pueden obtener muestras comerciales del producto cuyo peso es 26,4 gr.
El producto es sostenible ecológicamente por lo cual reduce los residuos agrícolas brindando un valor agregado.
El producto granulado tiene dos tamaños dependiendo de la masa de agua donde se va a aplicar
- Aguas estancadas (Pocetas de enfriamiento, depósitos y reservorios de agua al aire libre, pozos sépticos, bidones de obra, bocas de riego) donde se implementa un molinillo universal con un diámetro tamiz de 1 mm
- Aguas a escorrentía por lluvia (Sumideros y sistemas de acueducto con leve movimiento) donde se utiliza un diámetro tamiz de 4 mm
En general el producto brinda los beneficios de ser eficaz en el control de larvas de mosquitos vectores, debido a que se puede esparcir fácilmente de forma manual y en pequeñas cantidades por unidad de superficie.
Claims (2)
1. Bioinsecticida-larvicida con base en un Bacillus thuringiencis var israelensis para el control de larvas o mosquitos vectores, caracterizado porque comprende:
• Micelio agotado de pleurotus spp:
- Con una densidad de al menos 382 kg/m3
- Con un volumen de al menos 0,53 m3 « 530 litros
- Con una Masa de al menos 205 kg « 60%
• Tusa de maíz
- Con una densidad de al menos 480 kg/m3
- Con un volumen de al menos 0,28 m3 « 280 litros
- Con una masa de al menos 136 kg«40%
• Concentración ingrediente activo: 2,8% esporas Bacillus thuringiensis var.israeliensis.
- Al menos 3253 gramos / 341 kg
2. Método de obtención de un Bioinsecticida-larvicida con base en un Bacillus thuringiencis var israelensis para el control de larvas o mosquitos vectores caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a) Realizar el tratamiento de la materia prima (micelio agotado del hongo Pleurotus spp):
Este tratamiento comprende:
- Aplicar un proceso de molienda al micelio del hongo Pleurotus spp que implica verter la materia prima, en un molino de martillos, iniciando un movimiento de tornillo sinfín, ejecutando un tamiz de 3/8” 1.94 cm.
- Recolectar las partículas proyectadas por el molino en un silo.
- Verter la materia prima en una zaranda vibratoria y separar los residuos.
- Recolectar en garrafas de 50 galones con Capacidad máxima de 200 litros y 10,8 kg.
b) Elaborar el caldo:
- Mezclar la tusa ya previamente tratada para dejar el inóculo con las esporas durante en caldo triptona levadura (Medio liquido) a temperatura ambiente.
- Realizar una dilución seriada 1:100
Colocar un frasco en una plancha térmica, durante 15 minutos, a 155°C y una velocidad preferida de 7,7 rpm.
- Ubicar un magneto con una longitud, equivalente a la base del frasco, dejando 1 cm a ambos lados de la pared del frasco.
- Se pone a crecer en un tubo de ensayo de 20ml a 37 grados con un agitador (200 rpm), hasta la mitad de la fase según la lectura del espectrofotómetro utilizando unas cubetas de cu a rzo, com o blanco se utiliza agua destilada y después se hace una lectura cada 24 horas, hasta que alcance una absorbancia de 0,6 a una longitud de onda de 600 nm, esto queda en el espectro del visible,
- Seleccionar el caldo cuando se encuentra en su máximo crecimiento.
- Filtrar el caldo con una bomba de vacío o malla.
c) Implementar la mezcla entre el caldo con la materia prima
- Realizar un proceso de nebulización utilizando el caldo con las cepas Bacillus thuringiensis del filtrado resultante.
- Agregar dicho caldo a un tanque presurizado en acero Inoxidable de 5 galones con Boquilla atomizada con aire en bronce niquelado.
- Aplicar el caldo a través de tecnología spraying system con flujo/hora bajo, a la tusa de maíz o al micelo de pleumtus spp.
- Dejar secar en un espacio seco por al menos 24 horas, a una temperatura preferida de 30 grados y humedad relativa preferida de menor del 50%.
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