PT1366151E - Quimera de arnp - Google Patents

Description

Descrição

Antecedentes dm Invenção

Uma ribozima é uma enzima de ARN capaz de cindir uma molécula de ARN alvo. Estruturalmente é um ARN de cadeia simples caracterizado por dois "braços" posicionados de cada lado de uma pequena laçada. A base da ribozima emparelha com uma região do ARN alvo que é complementar a sequência nucleótidica dos seus dois braços. A região da laçada serve como um centro catalítico activo que efectua a função de clivagem no ARN alvo (Fig. I). A utilização de ribozimas para o tratamento e prevenção de doenças em plantas, seres humanos, e animais tem o potencial de revolucionar a biotecnologia. Ribozimas "cabeça de martelo" ttm sido por exemplo utilizados para cindir ARN em plantas e animais transgénicos. Contudo, apesar das numerosas publicações que reportam os resultados das investigações em tubos de ensaio, relatórios sobre a utilização com êxito de ribozimas cabeça de martelo em organismos vivos são relativamente poucos (Perriman et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 6175-6179 (1995)). Apesar de ser claro que ribozimas de cabeça de martelo podem cindir ARN virai específico ou ARNm em tubos de ensaio a eficiência da cisão em células é dramaticamente reduzida devido a Instabilidade e a conformação errada (expressão inglesa misfolding) da ribozima em aêlútmi

Uma causa principal para a instabilidade das ribozimas num meio intracelular é a degradação da ribozima, através da exonuclease presente nas células (Cotton et «1.;.,· EMBO J. 8:3861-3866. (1989)). Exonucleases dão enzimas que cortam ARN de forma não específica em ambas as , Um método que tem sido utilizado para bloquear a degradação intracelular de ribozimas consiste em proteger a ribozima ligando uma sua extremidade a um vector de ARN, tal como ARNt. Contudo, devido 6 nova conformação (expressão ingiesa refolding) do ARN quimérico resultante, a ribozima variou em termos de eficiência, quando comparada com a ribozima não protegida (Bertrand et a^·, ARN 3:75-88 (1997);;. Também foi reportado a ligação de uma ribozima a ambas as extremidades de um ARNt, mas a conformação e/ ou actividade encontrava-se comprometida (Vaish et al., Nucl. Acids Res. 26:523, 7-5242 (1998)).

Taira e Nishikawa (Gene i on, Eiology of Antisense RNA and DNA. Erickson RP e Izant JG, eds., Raven Press, Lda, Nova Iorque 1992, pág. 35-54) também descrevem moléculas de ribozima que são estabilizadas através de incorporação em ARNst. Na ê indicado que a estrutura de ordem mais elevada do ARNt pode proteger a ribozima da degradação por nucleases celulares.

Além disso, Zhang et al. (RNA 3 (1997), 315-323) reportam uma análise funcional da estrutura protuberância/ laçada de ARNp utilizando permutação circular. 0 potencial para tratar a doença através da utilização de ribozimas para quebrar o ARN envolvido no cancro e infecção por patogenio é tremendo. A disponibilidade de uma ribozima estabilizada que e resistente á- degradação e se encontra na conformação correcta de modo a permanecer activa num meio intracelular abriria o caminho para o desenvolvimento de muitas terapias médicas importantes. iísmáselíS da Invenção A invenção disponibiliza « molécula ARNp quimérica permutada circularmente que transporta um ARN estabilizado do conformação adequada biologicamente activo, A quimera ·& ARNp é formada a partir de uma região de ARNp permutada circularmente, e uma região de espaçamento que inclui o ARN biologicamente activo, 0 ARN biologicamente activo é preferencialmente uma rih-âaims ou um ARN anti-sentido. A região espaçadora encontra-se covalentemente ligada às extremidades 5? e 3' da região ARNp. Opcionalmente a região espaçadora inclui a primeira e segunda sequências nucleótidicas interpostas entre o resíduo biologicamente activo e a região ARNp. A região ARNp possui uma estrutura secundaria compacta estável característica de sequências de ARNp bacteriófagas.

Assim, numa concretização da quimera ARNp, a região ARNp inclui um ARNp permutado circularmente de um bactericfago seleccionado no grupo que consiste em φ29, B103, PZA, M2, NF e GA1. Noutra concretização da quimera de ARNp, a região de ARNp inclui: (i) na direcção de 5' para 3' começando na ligação covalente do ARNp com a extremidade 3' da região espaçadora uma primeira laçada 22; uma segunda laçada 24; e uma segunda estrutura inferior de uma laçada com uma haste compreendendo uma protuberância, uma primeira secção de haste 26 e uma terceira laçada 27; ;1:.U uma segunda secção de haste 20 interposta entre a região espaçadora e a estrutura em haste- laçada; (iii) uma terceira secção de haste 21 interposta entre a estrutura em haste- laçada e a primeira laçada 22; (iv) uma quarta secção de haste 23 interposta entre a primeira laçada 22 e a segunda laçada 24; e 1:·.ύ uma abertura definindo as extremidades e 3' da qulítCtA de ARNp, posicionada em qualquer lado na região A i.-ucriváo também disponibiliza um método para fazer ivívja quimera de ARNp da iuvauieào. Um ADN qa* codifica para uma quimera de ARNp contendo uma região de ARNp e uma região de espaçamento que inclui um ARN biologicamente activo é transcrito in vitro para dar a quimera de ARNp. Opcionalmente, o ADN aue codifica para a quimera de ARNp è gerado utilizando uma reacção em cadeia da polimerase numa estrutura base de ADN, ou o ADN é gerado através da clonagem de ADN num plasmídeo e replicando esse plasmídeo. A invenção disponibiliza ainda um método para determinar se uma molécula de ARN interage com uma molécula teste. Uma quimera de ARNp que inclui a molécula de ARN de interesse é imobilizada num substracto depois feita contactar com a molécula teste. E então detectado se a molécula teste se liga ou não com o ARN de interesse, ta.1 como através da ligação com o ARN de interesse. A invenção também disponibiliza uma molécula e ADN que inclui uma seyuência nucleótidica que codifica para uma quimera de ARNp contendo uma região de ARNp e uma região de espaçamento que inclui um ARN biologicamente activo. É também disponibilízado pela invenção um método para administrar um ARN biologicamente activo a uma célula, preferencialmente uma célula de planta ou uma célula animal, tal como uma célula humana, in vitro. Alternativamente, a invenção disponibiliza um método para administrar um ARN biologicamente activo a uma célula não animal. Numa concretização, uma molécula de ADN que possui uma sequência que codifica operacionalmente uma quimera de ARNp da invenção é introduzida na célula e transcrita para dar origem ao ARN biologicamente activo. Numa outra concretização, a quimera de ARNp é transfectada directamente para a célula.

BrbVt Descrição das Figuras A figura 1 é uma representação esquemática de uma cisão de ARN através de uma ribozima representativa. A figura 2 representa a sequência nucleótidíca (SEQ ID sf*ql) e a estrutura secundária de ARNp de $29 do tipo selvagem indicando a localização e nomenclatura das laçadas e protuberâncias (Zhang et al., RNA 3:315-323 (1997)). A figura 3 representa sequências nucleótídicas de vários âRHps antes de uma permuta circular: (a) bacteriófago SF5' (SEQ ID N° 11íf (b) bacteriófago B103 (SEQ ID N°: 12), (c ) bacteriófagos $29 e PZA (SEQ ID (d) bacteriófago M2

e NF (SEQ ID N°:14), e is) bacteriófago GA1 (SEQ ID N°:15) (Chen et al., ARN 5:805-818 (1999); e (f) âlldpip (SEÇ ID N ° : 16) . A figura 4 e uma representação esquemática de várias caracteristicas estruturais de uma quimera de ARNp da invenção (a) uma quimera de ARNp completa; (b) uma região espaçadora componente (c ) uma região de ARNp componente. A figura 5 á uma representação esquemática de (a) o desenho de uma concretização da quimera de ARNp da invenção; e (b) moléculas de ARNp permutadas circularmente (ARNpc) a título de exemplo mostrando varias localizações para as aberturas do círculo. A figura 6 e uma representação esquemática de um mecanismo possível da actividade de cisão de ARNp- ribozima. A figura 7 representa (a) construção de estruturas base de ADN ligadas em série para a síntese de várias ARNpc (Zhang et al., Virology 207:442-451 (1995)); e (b) estrutura de ARNp permutada circularmente generalizada (SEQ ID N° 2) com setas indicando várias novoo aberturas (Zhang et al., ARN 3:315-323 (1997)), A flgurs 8 representa uma quimera de ARN (ç7Q ID N° 5) ligada a usos porção de substracto U7snARN . ID N°: 4). A figura 9 apresenta um gel de ureia desnaturante que evidencia uma cisão com êxito do èmbstbsçfm bcuARN voe seus produtos de cisão esperados de 69 meros e 25 meros tanto pela ribozima (Rz) e pela quimera de ARNp- ribozima (ARN-Rz), utilizando diferentes concentrações de reagentes paro (a) e (b) como descrito no texto. A figura 10 apresenta um gel de ureia desnaturante evidenciando uma cisão com êxito do substracto HBV-polyA nos seus produtos ae cisão esperados ae 6 7 mercs e 70 meros, que correm como uma banda única pela quimera ARNp-ribozima RzAARNp. A figura 11 representa uma ribozima anti-12-LOX (SEQ ID N°: 5) ligada a um substracto de ARN (SEQ ID N° 6) .

Descrição Detalhada da invenção O bacteriófago φ29 (fi29) é um virus de dupla hélice de ADN. Em 1987, um dos inventores Dr. Peixuan Guo, verificou que um ARN de 120 bases codificado por um virus desempenha um papel chave no empacotamento do ADN bacteriófago (Guo et al. Science 236:690-694 (1987)). Este ARN ê designado de ARN de empacotamento ou "ARNp" (da expressão inglesa packaging RNA ou pRNA). Liga-se as procápsides virais no vértice da porta (o local onde o ADN entra na procápside) (Guo et al., Nucl. Acids Res. 15:7081-7090 (1987)) e não se encontra presente no virião maduro φ2 9. 0 Mlp contem dois domínios funcionais: um para a ligação à procápside e o outro para um papel ainda a ser definido trans locação do ADN (Trottier et al., J. Vi rol. C? ADN de empacotamento 71: 487-494 (1997); Trottier et al., J. Virol. 70:55-61 (1996); Zhang et al., Virology 201: 77-85 (1994)) . Seis <s&pí'âÉ de ARNp são ;ç#csíV;iutlí\!ãs:; para o empacotamento de um ADN yenómico ϊχζοίΧ i-ti et ai., J. r 70:55-61 (1996); Trottier et al., J. Virol. 71, 487-494 (1997); Guo òt al., Moi. Cell. 2, 149-155 (1998)). encontra-se completamente bloqueado, quando um dos seis sulcos e ocupado por uss ARNp inactivo com uma mutação na extremidade 5' ou 3' (Trottíer et al., J. Virol. 70:55-61 (1996); Trottier et al., J. Virol. 71:487-494 (1997)). 0 bacteriófago <J>29 está associado a procápsides durante o processo de translocação de ADN (Chen et al., J. Virol. 71:3864-3871 1 9 9). Dados de inibição tâ&Mm sugerem que o ARNp desempenha um papel essencial na translocação de ADN (Trottier et al., J. Virol. 71:487-494 (1997)); Trottier et al. J. Virol. 70:55-6 (1996)). Uma alteração conformacional de ARNp induzida por i>hr * conduziu a sua ligação a porta do vértice (Chen et al. J. Virol. 71, 495-500 (1997)). A estrutura terciária do monómero de ARNp e do dimero foi também reportada (Zhang et al., Virology 81:281-93 (2001); Trottier et al., RNA 6(9); 1257-1266 (2000); Chen et al. J. Biol. Chem. 275 (23):17510-17516 (2000); Garver et al., -J. Biol. Chem. 275(4):2817-2824 (2000)). A sequência nucleótidica completa (SEQ ID N° 1) de ARNp nativo de φ29 (Guo et al. Nucl. Aciâs Res. 15:7081-7090 (1987)), assim como a sua estrutura secundária de pares de base prevista é apresentada na Fig. 2(a) (Zhang et al. RRN 3:315-323 (1997); Zhang et al., Virology 207: 442-451 (1995)). a estrutura secundária prevista foi parcialmente confirmada (Zhang et al., RNA 1:1041-1050 (1995); Reid et al., J. Biol. Chem. 263:18656-18661 (1994); Zhang et al., Virology 201:77-85 (1994); Chen et al., J. Virol. 71:495-500 (1997)). A análise filogenética de de fagos SF5, B103, #2.1* PZA, M2, NF e GA1 (Chen et ai., ARN 5: 805-818 (1999)) apresenta uma baixa Identidade de sequência e poucas bases conservadas, no entanto s família de ARNps parece ier m&

marcante e estruturas secundárias estáveis previstas (3.3). As ARNps de bacteriófagos SFS' (SEQ ID {SEQ ID N° :14), GA1 (SEQ ID N°: 15) de Bacíllus subtillus (Chen et al., RNA hi-¥àh~4i¥ê (1999); e ARNaptp (SEQ ID 16) são previstas terem todas uma estrutura secundária que exibe essencialmente as mesmas caracteristicas estruturais como indicado na Fig. 2 para o ARNp de φ29 (Chen et al. ARN 5: 805-818 (1999)). Todos têm extremidades nativas 5' e 3' no terminal esquerdo de uma estrutura em haste (como indicado na Fig 3) e contêm as mesmas caracteristicas estruturais posicionadas nas mesmas localizações relativas. O ARNp destes bacteriófagos que partilham uma estrutura secundária única estável fornece a estrutura para a quimera de ARNp da invenção. A estrutura secundária numa molécula de AKN é formada pelo emparelhamento de bases entre os ribonucleótidos. Os pares de bases de ARN incluem G-C, A-T e U-G. As previsses da estrutura secundária são realizadas previsivelmente de acordo com o método de Zuker e Jaeger, por exemplo utilizando um programa conhecido no comércio pela designação comercial RNASTRUCTURE 3.6, escrito por David H. Mathews (Mathews et al., J. Mol. Biol. 288:911-940 (1999); ver também Zuker, Science 244:48-52 (1989); Jaeger et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. DBA 86:7706-7710 (1989); Jaeger et al., Meth. Enzymol. 183:281-306 (1990)). Este programa encontra-se disponível ao público na internet no sitio do laboratório Douglas Turner na Universidade de Rochester em rna.chem.rochester.edu/RNAstructure.html e corre em MS Windows 95, 96, ME 2000 e NT4. O programa também se encontra disponível ao público na internet na página de Michael Zuker no Instituto Rensselaer Polytechnic (bioinfo. fiatn. n;ú v iyú;/^:Éuke:m/hi:;sis a sua |:;âúiu« oferece a conformação online e uma mriúo do algoritmo que pode ser compilado em estações de trabalho da Silicon Graphics, Sun, ou DEC Alpha. S escolhida a estrutura de menor energia (i.e. estrutura

As estruturas secundárias de ARN podem ser caracterizadas por hastes, laçadas e protuberâncias. Uma "haste" é ume secção de cadeia dupla de dois comprimentos de ribonucleótidos em que as bases èStla emparelhadas. As secções de haste contêm pelo menos dois pares de bases e estão limitadas em tamanho apenas pelo comprimento da molécula de ARN. Uma "laçada" ê uma secção de cadeia simples que inclui tipicamente pelo menos 3 ribonucleótidos e está também limitado em tamanho apenas pelo comprimento da molécula de ARN. Numa "haste laçada" as extremidades 5' e 3' da laçada coincidem com a extremidade de uma secção haste com bases emparelhadas. Numa "protuberância laçada" a iaçada emerge ao longo do comprimento de uma secção de haste. Nos terminais 5' e 3' de uma protuberância Laçada as bases não se encontram tipicamente emparelhadas, apesar de potencialmente poderem estar (ver por ex. G40 e C48 da protuberância laçada na estrutura de ARNp de $29; Fig. 2). Uma protuberância e uma secção de cadeia simples não emparelnada de cerca de 1 a cerca de 6 ribonucleótidos presentes ao longo do comprimento (ou entre) secções haste. De notar que não existe uma linha clara entre uma grande "protuberância" e uma pequena "protuberância laçada". Aqui onde o termo "protuberância" é utilizado também inclui uma pequena "protuberância iaçada" (i.e. uma protuberância laçada de menos do que cerca de 7 ribonucleótidos). A estrutura secundaria de uma molecuia de ARN é determinada pela natureza e localização das opções de emparelhamento de bases ao longo do seu comprimento. A estrutura secundaria do ARN ê degenerada; isto é sequências de ribonucleótidos primários diferentes pode dar origem às mesmas configurações de emparelhamento de bases e assim à mesma estrutura gachbdária.. De um certo modo à semelhante ao modo como sequências de aminoácidos múltiplas podem produzir a mesma estrutura secundária, por exemplo hélice a.

Uma estrutura secundária única é ditada por um numero de «íptfsiss: primárias diferentes de formas previsível e bem compreendida. Por exemplo, nucleótidos únicos ou em pares podem geralmente ser adicionados, removidos, ou substituídos sem alterar as interacções de emparelhamento de bases globais na molécula de ARN e sem interferir com a sua função biológica. Isto é particularmente verdade se um ou alguns pares de bases de nucieótidos são removidos, adicionados ou substituídos ão longo da cadeia dupla do comprimento hibridizado da molécula, ou se um ou vários nucleótidos são removidos, adicionados ou substituídos nas regiões da laçada de cadeia simples. Por exemplo, apesar dos pares de bases GC e pares de bases AT diferirem ligeiramente na sua estabilidade termodinâmica uma pode geralmente ser substituída pela outra num local dentro do comprimento da dupla cadeia sem alterar a estrutura secundária de uma molécula de ARN. São preferidos pares de bases GC na região da haste devido a sua estabilidade adicional. Alterações na estrutura secundária como resultado de adição, supressão ou modificação de nucleótidos podem ser facilmente avaliadas aplicando o algoritmo de previsão da estrutura secundaria de Zuker e Jaeger como descrito acima. A região de ARNp da quimera de ARN pode acomodar uma variação substancial na sequência primária sem uma alteração apreciável na estrutura secundária.

A quimera de ARNp da invenção consiste essencialmente numa região de ARNp que possui a estrutura secundária exemplificada na Fíg. 3 (e esquematicamente representada na Fig, 4, como detalhado abaixo), interrompida por (i.e. flanqueando) uma região espaçadora heteróloga que contém um resíduo biológico activo, tal com uma ribozima. A estrutura secundária da regiãc aa ARNp da quimera de ARNp é a estrutura secundária comum que caracteriza a ARNp de bacteriófagos <j>29, SF5', B103, PZ A, M2, NF e GA1. A região espaçadora ê designada "het;irôXC>;|l''' porque toda ou uma |>0bçib da sua sequência nucleótidica e submetida a engenharia, ou è obtida a partir de um organismo diferente do bíNÇMrsiâf ag;;, e a presença da região espaçadora heteróloga que torna a construção "quimérica" para os objectivos desta invenção. A quimera de ARNp é útil como veiculo para transportar e fornecer uma ribozima ou outro resíduo biologicamente activo a umã molécula alvo ou localização. Como ambas as extremidades da ribozima encontram-se ligadas a ARNp, espera-se que a ligação proteja a ribozima sensível da degradação e que auxilie o resíduo biologicamente activo a tomar a conformação apropriada.

Em particular, a capacidade da quimera de ARNp para efectuar a sua função desejada de proteger e transportar um resíduo biologicamente activo não depende da sequência nucleótidica primaria da região ARNp (estrutura primária), mas da estrutura secundária (interacções de emparelhamento de bases) que a região ARNp assume como resultado da sua sequência ribonucleótidica primária. A "região ARNp" da quimera ARNp é designada deste modo porque possui uma estrutura secundária, apesar de não necessariamente uma sequência de ARN, característica de uma molécula de ARNp bacteriófaga nativa, Por isso, a não ser quando especificado de outro modo, o termo "região ARNp", quando aqui utilizado, emprega sequências de ARNp (nativas) de ocorrência natural, sequências que não ocorrem naturalmente (que não são nativas), e suas combinações desde que vãs dar origem sequência secundária característica do bacteriófago ARNp que ocorre naturalmente (nativo) como aqui descrito. Dito de outro modo, não se pretende que c termo "região de ARNp" esteja limitado apenas aquelas sequências nucleótidicas particulares nativas a ARNp. A região ARNp pode assim conter qualquer sequência nucleótidica que resulta na estrutura secundária apresentada na Fig. 4. Sequências nucleótidicas que tomam a ccciiorsftaçáo da estrutura secundária anteriormente mencionada incluem sequências de ocorrência natural, aquelas que são derivadas modificando as sequências de ARNp que ocorrem naturalmente, e aquelas que são designadas de novo, assim como as suas combinações. Um perito no estado da técnica pode facilmente determinar se uma sequência nucleótidica vai tomar a conformação da estrutura secundaria apresentada na Fig. 4 e aqui descrita aplicando um algoritmos de estrutura secundária a sequência nucleótidica, tal como a RNASTRUCTURE descrita acima.

Exemplos de sequências nucleótidicas que quando tomam uma conformação dão origem a estrutura secundária da região ARNp da quimera de ARNp da invenção são indicadas na Fig. 3. Estas incluem sequências de ARNp de bacteriófagos SF5' (SEQ ID N°: 11) , B103 fdECI ID N°:12), (SEQ ID N° 1}* M2/NF (SEQ ID N°: 14), GAl (SEQ ID N° 15), assim como a ARNaptp (SEQ ID N°:16).

Nas concretizações da quimera de ARNp, em que a região ARNp inclui ou deriva de uma ARNp de ocorrência natural, a região de espaçamento da quimera de ARNp encontra-se ligada covalentemente à região de ARNp no que pode ser considerado as extremidades "nativas" 5' e 3' de uma sequência de ARNp, ligando deste modo as extremidades "nativas" da região de ARNp. A região da ARNp da quimera ARNp encontra-se truncada opcionalmente, quando comparada com a do bacteriófago nativo ARNp; naquelas concretizações, e que como resultado as extremidades "nativas" 5r e 3' da região de ARNp referem-se simplesmente aos nucleótídos que terminam, ou que compreendem a extremidade real do ARNp nativo truncado, I formada uma abertura na região de ARNp para linearizar a quimera de ARNp resultante, efectuando uma "permutação circular" do ARNp como detalhado abaixo. Devera no entanto ser entendido que o termo "região de ARNp permutado circularmente'' não se encontra limitado a ARNps de ocorrência natural que foram permutados circularmente, mas em vez disso pretende-se que possua o significado mais geral de ARN que possui uma estrutura secundaria semelhante a ARNp como Indicado na Fig. 4(c ), incluindo uma abertura na região ARNp que forma as extremidades 5' e 3' da quimera de ARNp.

Exemplos da quimera ARNp da invenção são aqueles formados a partir dos ARNs dos bacteriófagos SF5' (SEQ ID N° 11), 1103 10¾ ID N°12) , Φ33/113 (SEQ ID N°:l), tft/m (SEQ 13 N°: 14) , GAl (SEQ ID N°:15), assim como a ARNaptp (SEQ ID N°: 16) ligando as extremidades nativas 5'e 3'a região de espaçamento e introduzindo uma abertura noutro lugar na região ARNp, como aqui descrito. Outro exemplo de uma quimera de ARNp da invenção é:

MIM em que N representa qualquer nucleótido, sem limitação e J e um inteiro entre 4 a cerca de 8, preferencialmente a cerca de 5. A região de espaçamento é representada por Nm- D-N,, em que Nn e são cadeias nucleótidicas que se encontram incluídas opcionalmente na região de tqma/ÇRPiermcq e B incluí o resíduo biologicamente activo. 3bo33trÉ;tt:3 Alsatnim B é uma sequência c ? <-··« : rclui um '13-; 5;': - a.cfifc m e n podem ser ttrca de 3, mais preferencialmente cerca de 5, e ainda mais preferencialmente cerca de 10. Aiém disso, nem são independentemente preferencialmente no máximo cerca de 300, ruais preferencialmente no máximo cerca de 50, e ainda mais preferencialmente no máximo cerca de 30.

Alem disso, uma vez que a região de ARNp da quimera de ARNp está definida pela sua estrutura secundária, podem ainda ser dados outros exemplos de uma quimera de ARNp "misturando e emparelhando" fragmentos de nucleótidos de por exemplo, SEÇ ID N°s: 1, 2, 7, 11, 12, 14, 15, 16 que tomam a conformação de estruturas secundárias particulares (protuberâncias, laçadas, haste -laçadas, etc.), desde que a sequência nucleótidica resultante tome a conformação das estruturas secundarias globais indicadas na Fig. 4. Por exemplo, os nucleótidos que codificam para a protuberância laçada 22 no ARNp de φ29 (SEQ ID N°l) para dar uma região de ARNp como aqui descrito. De forma semelhante, qualquer número de sequências artificiais pode ser substituído nas SEQ ID N°s: 1, 2, 7, 11, 14, 15 e 16 para substituir sequências nucleótidicas que se dobram numa ou várias características estruturais (ou suas porções) para formar uma região ARNp como aqui descrito. Ver por exemplo ARNaptp (Fig. 3 (f)) que foi derivada desta maneira de ARNp de $29. O princípio de sobre-arqueamento consiste no facto da estrutura secundaria global da região de ARNp ser a estrutura secundária comum aos ÂRNps dos bacteriófagos, como representado esquematicamente na Fig. 4. É importante salientar que a quimera de ARNp resultante da invenção não é uma molécula linear, pelo contrário é linearizada devido a uma permutação circular da túgihv ARNp (Zhang et ai,, RNA 3:315-323 (1997); Zhang et ti, 207:442-451 (1995)). Resumidamente, uma ahtilizta (í.e. uma cisão, ou um ponto de quebra) t futtipcido na região de ÂRNP em qualquer local designado para formar as extremidades 5' e 3' da quimera de ARN. Estas extremidades 5' e 3' em posições não nativas em relação a um ARNp linear de ocorrência natural. A Fig. 5 (a) mostra como uma quimera ARNp da invenção pode ser formada a partir de uma ribozima e uma região de ARNp. As extremidades 5'e 3'de ARNp podem ser submetidas a engenharia em qualquer local desejado da quimera de ARNp permutada circularmente. A Fig. 5 (b) apresenta a titulo de exemplo moléculas de ARN de permutação circular apresentando várias localizações para as aberturas do circulo. A Fig. 4 apresenta várias caracteristicas estruturais que caracterizam uma quimera de ARNp da invenção. Como indicado na Fig. 4 (a) a molecular linear inclui uma região de ARNp e uma região espaçadora 2. A região espaçadora 2 contém um resíduo biologicamente activo 3, neste caso uma ribozima, flanqueada por cadeias de ribonucleótidos 4. A região I de ARNp é bifurcada; inclui um primeiro segmento 5 de ARNp possuindo a extremidade 3', 6 e a extremidade "nativa" 1'’ , 7, e um segundo segmento 8 de ARNp possuindo a extremidade "nativa" 3', 9 e a extremidade 5', 10. As extremidades 6 e 10 são as verdadeiras extremidades terminais da quimera de ARNp. A abertura 11 torna a molécula linear e pode ser posicionada em qualquer lado na região ARNp I pela nova localização das extremidades 6 e 10. A região espaçadora 2 é apresentada em detalhe na Fig. 4(b). A ribozima 3 é composta por um domínio catalítico 15 flanqueado pelas sequências que se ligam ao alvo 16. A região ARNp « apresentada em detalhe na Fig. 4 (c . Em geral c região ARNp 1 é caracterizada por urra mfíméáriíi e · laçada, em que a laçada 24 ã relativamente pequena e o emparelhamento dás bases na haste (essencialraente nas secções da haste 20, 21 e 23) está interrompida pelas estruturas em cada lado da laçada 24. A protuberância iaçada 22 encontra-se posicionaao 5' da laçada 24. a posição 3' da laçada 24 é mm estrutura de haste- laçada que contém a protuberância 25, haste 26 e laçada 27. A secção 20 da baste pode ter qualquer número de ríbonuc! eótidos de comprimento e pode conter um número ilimitado de protuberâncias desde que seja ainda capaz de emparelhamento de bases. Preferencialmente a secção da haste 20 contém pelo menos 4, mais preferencialmente pelo mencs cerca de 10 pares de base; contém ainda preferencialmente no máximo 50, mais preferencialmente no máximo cerca de 40 pares de bases. Preferencialmente a secção haste 20 contem cerca de 0 a cerca de 8 protuberâncias; mais preferencialmente contém cerca de 3 a cerca de 4 protuberâncias. A secção da haste 21 contém preferencialmente 5-13 pares de bases e protuberâncias 0-2. Protuberância laçada 22 contém preferencialmente 5-12 bases. A secção de laçada 23 contém preferencialmente 3-12 pares de bases e protuberâncias 0-2. A laçada 24 contém preferencialmente 3-8 bases. A laçada 25 contém preferencialmente 0-5 bases. A laçada 26 contém preferencialmente 4-8 pares de bases e protuberâncias 0-2. A laçada 27 contém preferencialmente 3-10 bases.

Interacções terciárias com a molécula de ARN pode resultar de interacções não Locais de áreas da molécula de ARN que não se encontram próximas umas das outras na sequência primária. Apesar do bacteriófago nativo IJSp parecer exibir interacções terciárias entre c protuberância laçada 22 e laçada 27 íCHeu et ai., Aill S; uOr-" i:i;J (1 999); encontra entendido que a quimera de ARNp da invenção não ce limitada a moléculas de ARN que exibem quaisquer interacções terciárias particuiares.

Numa concretização, a quimera de ARNp da invenção contém pelo menos 8, mais preferencialmente 15, e ainda mais preferencialmente pelo menos 30 ribonucleótidos consecutivos encontrados no ARNp do SF5' (Fig·. 3 (a)), B103 ARNp (Fig. 3 (b) $ t φ2 i/fSlí ÚHdp (Fig. 3 n? )), Hu/tP ARNp (Fig. 3 (d)), GA1 ARNp (Fig. ou ARNaptp (Fig. 3 ill S > preferencialmente ARNp de φ29 nativo. Mais preferencialmente, a região de ARNp da quimera de ARNp contem pelo menos uma sequência de ARNp de $29 que se inicia no ribonucleótido 23, preferencialmente no ribonucleótido 20, e termina no ribonucleótido 95, preferencialmente no ribonucleótido 97, na sequência ARNp de $29 (Fig.2). Adicionalmente, ou em alternativa, a sequência nucleótidica da região de ARNp da quimera de ARNp e pelo menos idêntica em 60% a, mais preferencialmente idêntica a 80% e mesmo mais preferencialmente idêntica em 908 à sequência nucleótidica de um ARNp nativo de SF5' correspondente (Fig. 3(a)), ARNp de B1Q3 (Fig. 3(b)), $29 PZA ARNp (Fig. 3 (c) ) , ARNp de M2/NF (Fig. 3 (d) ) , ARNp de GA1 (Fig. 3 £&.) ou a quimera de ARNaptp (Fig. 3 (f) ), mais preferencialmente ARNp de $29 (mais particularmente as bases 20-97). A percentagem de identidade ê determinada por alinhamento de dois polinucleótidos para optimizar o número de nucleótidos idênticos ao longo do comprimento das suas faltas em cada uma ou em ambas as sequências são permitidas para fazer o alinhamento de modo a optimizar o número de nucleótidos partilhados, apesar dos nucleótidos em cada sequência terem em todo o caça de permanecer na sua ordem própria. Por exemplo, as duas sequências jvúcli oioiiddsd;* são facilmente comparadas utilizando c programa Blastn do algoritmo de pesquisa BLAST 2 como descrito por Tatusova et ai. (FEMS Microbiol Lett 1999, 174247-250). Preferencialmente, são utilizados os valores por defeito para iodos os parâmetros de pesquisa ao BLAST 2, incluindo um prémio para um emparelhamento ~1 e uma penalidade para um não emparelhamento =-2, penalidade para uma falta aberta =5, penalidade para uma falta de extensão, falta x :Vr i n.1.:,v ';·0, esperado-10, tamanho da palavia = ll e filtro ligado.

As ligações covalentes entre o resíduo biologicamente activo e a região ARNp podem ser directas ou indirectas, mas preferencialmente são indirectas. Numa ligação indirecta, a região espaçadora inclui cadeia (s) adicionais de ribonucleótidos num ou em amhas as extremidades do resíduo biologicamente activo. Estas cadeias de ribonucleótidos se presentes, contêm preferencialmente pelo menos cerca de 3 ribonucleótidos; e preferencialmente contêm no máximo cerca de 300, mais preferencialmente no máximo cerca de 30 ribonucleótidos. Em termos de composição as cadeias podem conter qualquer ribonucleótido desejado, contudo é preferível que composições ribonucleótidicas sejam seleccionadas de modo a evitar as cadeias de ribonucleótidos de cada lado do resíduo biológico de se emparelharem uma com a outra através das bõses ou com outras partes da quimera de ARNp.

Preferencialmente a actividade biológica do ARN biologicamente activo é uma actividade enzimática ou actividade de ligação ou ambas; por exemplo, o resíduo biologicamente activo pode funcionar ou codificar para. uma ríbozima ou outro resíduo catalítico.

Deverá ser compreendido que o termo "nucleótido", compreende ADN, ARN, ou suas cçMtdçnçsKns a não sei que

indicado de outro modo. Mio disso, os temos ADN e ARN deveriam ser compreendidos como incluindo não apenas os ácidos nucleicos de ocorrência natural, mas também as sequências contendo os nucleótidos análogos ou nucleótidos modificados, tais como os que foram modificados quimicamente ou enzimaticamente, por exemplo fosforotioatcs de ADN, fosfcrotioatos de ARN, e ribonucleótidos 2' -0-rnetil. Um ARN preferido biologicamente activo é uma ribozima, tal como uma ribozima cabeça de martelo ou ribozima cabeça de alfinete. ARN anti-sentido e outros MUls bioactivos são também preferidos.

Uma ribozima é geralmente caracterizada por: braço 1 - centro activo da enzima - braço 2 em que o braço 1 braço 2 são sequências complementares ao substracto alvo a serem cindidos pela ribozima e o centro activo da enzima é o centro catalítico que quebra o ARN alvo. Os "braços" da ribozima contêm tipicamente pelo menos 7 nucleótidos, preferencialmente pelo menos cerca de 12 nucleótidos; e contêm tipicamente no máximo cerca de 100 nucleótidos, preferencialmente no máximo cerca de 30 nucleótidos. A sequência nucleotidica dos braços pode ser submetida a engenharia para hibridizar com a sequência nucleotidica de qualquer ácido nucleico alvo.

Vantajosamente, a incorporação de um ARN biologicamente activo, por ex. uma ribozima na quimera de ARNp da invenção protege as extremidades da ribozima tornando-a deste modo resistente a degradação pela exonuclease. Além disso, a estrutura secundária de ARNp é compacta e muito estável. Um domínio de ARNp definido pelos nucleótidos 30-91 de ARNp de <1)29 é especialmente estável. O grau de compactação e estabilidade de ARNp permite à região de .ARNp e à ribozima tomarem uma conformação independentemente, Uma conformação adequada do ARN inmítiMj é facilitada deste modo preservando a sua actívidade biológica, A estrutura estável ds região do òupct.ãa do Mdp é também retida. 0 maior obstáculo no desenho de moléculas para administrar ribozimas, i.e. una má conformação da ribozima e da região de suporte como resultado das interacções entre elas foi assim ultrapassada pela utilização da molécula de ARNp muito estável como veiculo. I especialmente significativo que a actividade da ribozima seja retida no ARNp permutado circularmente porque significa que as novas extremidades 5' e 3' da quimera de ARNp podem ser posicionadas de modo a "enterrá-las" na estrutura de ARNp dobrada protegendo ainda deste modo a quimera de ARNp da degradação. Estas carãcteristicas sugerem um futuro promissor para a utilização da quimera de ARNp da invenção como um veiculo de administração de ribozima em aplicações médicas e veterinárias. A quimera de ARNp da invenção utiliza "uma permutação circular" de um bacteriófago de ARNp. Uma molécula de ARN "permutada circularmente" (ARNpc) é uma molécula de ARN linear em que as extremidades 5' e 3' encontram-se ligadas covalentemente, A ligação pode ser directa, ou pode ser indirecta utilizando uma região espaçadora. Uma vez que a molecuia de ARNpc e linear, as extremidades novas 5' e 3' não nativas são criadas através da formação de uma abertura na molécula ( i . . , uma discontinuidade na sequência de ARNp) numa localização diferente. A quimera de ARNp da invenção é linear como resultado de uma abertura não nativa na estrutura do ARNp do bacteriófago e forma as extremidades s 3' da quimera de ARNp. Como já Foi referido, a abertura não nativa pode-se situar em qualquer desejada na região de ARNp. Podem ser encontrados exemplos de localizações seleccionadas, por exemplo era ARNp de φ29 em Zhang et ai,, RNA 3:315-323 (1997) e Zhang et al., Virology 207: 442-451 (1995) . Ver também Garver et a]., J. Biol. Chem. / 1’’ 7 - (Ic·:; 0 ::. ........ : ... ..... .... y .7.'Λ :-.-:¾ ;¥ ; lil") ;· f rtíff lbr st al., RNA 6:1257-1266 (2000); e Zhang et al., Virology 282:281-293 (2001). A quimera de ARNp da invenção pode ser sintetizada quimicamente, ou enzimaticamente utilizando protocolos laboratoriais padrão. A região de ARNp é preferencialmente transcrita a partir de uma estrutura base de ADN que a codifica, apesar de poder ser sintetizado quimicamente se desejado. Quando sintetizada quimicamente, a região de ARNp contém opcionalmente nucleótidos não nativos (por ex. nucleótidos derivatizados ou substituídos) e ou ligações não nativas análogas as ligações fosfodiester que caracterizam os ácidos nucleicos de ocorrência natural.

Preferencialmente, a região ARNp é transcrita, ou sintetizada como um molécula de ARN única. Numa concretização do método, a região espaçadora é ligada quimicamente, ou enzimaticamente as extremidades "nativas" da região de ARNp para formar a molécula quimérica circular. A ARNp é então cindida num local pré-determinado para formar a quimera de ARNp permutada circularmente.

Quando a região espaçadora #: ARN, outra concretização do método inclui a transcrição da quimera de ARNp completa a partir de uma única estrutura base de ADN que codifica para a molécula quimérica completa. Noutra concretização do método, a região espaçadora de ARN É produzida separadamente, a partir de transcrição da sua estrutura base, ou por síntese química, sendo a seguir ligada a região ARNp.

Também incluída na invenção encontra-se uma molécula de ADN que inclui uma sequência nucleótidica que codifica para a quimera de ARNp da invenção. A região espaçadora da quimera codificada é necessariamente ARN neste aspecto da invenção. A m&IéznlM de AÍM pode ser linear ou circular, Pode ser de cadeia dupla, ou de cadeia simples; se for de cadeia simples, o seu . ' encontra-se também incluído no termo "molécula de ADN". Uma molécula de ADN para sei utilizada na introdução de cm ARNp numa célula contém preferencialmente elementos reguladores de modo que a quimera de ARNp seja codificada operacionalmente. Uma quimera de ARNp ê "codificada operacionalmente" por uma molécula de ADN quando â molécula de ADN contem elementos reguladores que permitem que a quimera de ARNp seja produzida por transcrição da molécula de ADN no interior da célula. Tais elementos reguladores incluem pelo menos um promotor. Opcionalmente a molécula de ADN inclui motivos reguladores adicionais que promovem a transcrição da quimera de ARN, tal como, mas Alo limitada a um amplificador. A molécula de ADN pode ser introduzida numa célula hospedeira utilizando administração aniónica, ou catiónica mediada por lípido, ou outros mecanismos padrão de transfecção, incluindo electroporação, adsorção, bombardeamento de partículas, ou microinjecção, ou através da utilização de um vector virai ou retroviral.

Deverá ser salientado que a quimera de ARNp pode se desejado, ser introduzida na célula hospedeira directamente- Por exemplo, um produto disponibilizado sob a designação comercial TRANSMESSENGER TRANSFECTION REAGENT (disponível na Qiagen), que é uma formulação a base de lípidos que á utilizada em conjunto com um amplificador especifico de condensação de ARN e um tampão optimízado podem ser utilizados para transfectar a quimera de ARNp em células eucarióticas.

Opcionalmente, a molécula de ACN pode conter uma ou mais características para permitir a sua integração no genoma celular. Por exemplo, pode ser administrada na forma de um transposão, retrotransposão, ou s vector de 1 alternativamente pode conter sequências que são homólogas em relação a sequências oauinutóv· que a permitem integrar, através de nammrnm, Por outro lado, a molécula de ADN pode ser desenhada para existir dentro da célula como ADN não genómico, por ex. como um plasmídeo, cosmideo, epissoma e semelhantes. A transcrição de uma estrutura base de ADN que codifica para a molécula de ARN quimérica completa pode ocorrer in vitro, ou dentro de uma célula. A célula pode estar na cultura celular, ou num organismo (in w£Wj tal como uma planta, depois é uma célula não animal, ou numa célula explantada de um organismo (ex. vivo).

Vantajosamente, a quimera de ARNp da invenção pode ser utilizada para fornecer uma molécula de ARN biologicamente activo a um alvo dentro da célula. E introduzida numa célula uma molécula de ADN que possui uma sequência nucleótidica que codifica operacionalmente para uma região de ARNp permutado circularmente e uma região eçpaçadora. A região espaçadora inclui um ARN biologicamente activo e a transcrição do ADN dá origem ao ARN biologicamente activo. A molécula biologicamente activa assim administrada é preferencialmente uma ribozima, e o alvo é preferencialmente virai ou ARNm associado com um gene, cuja expressão é desejável reduzir. Fig. 6 apresenta um mecanismo proposto para a cisão de um ARN alvo por uma quimera de ribozima de ARNp. Um ARN anti-sentido que pode tomar como alvo o ADN intracelular ou ARN é também preferido como a molécula biologicamente activa.

Surpreendentemente, a conjugação de uma ribozima com uma região de ARNp bifurcada de tal modo que ambos as extremidades da ribozima encontram-se ligadas covalentemente com uma região de ARNp não torna a ribozima inactiva, nem. parece interferir com a dobragem independente da região c ou com a região da ribozima. Devido li ligação de as extremidades do ARN da ribozima é esperado também se evite a dégxabvçáo pela exonuclease, espera-se que a quimera resultante de ARNp -ribozima seja útil para ®straf ARN indesejáveis em plantas e animais, incluindo seres humanos. Adicionalmente, plantas transgénicas e animais com resistência a doenças podem ser desenvolvidas através da introdução de ADN que codifica para a quimera de ARNp de ribozima no ADN genómíco da célula-. A quimera de ARNp da invenção é também útil in vitro para a caracterização de moléculas de ARN. Moléculas de ARN, particularmente pequenas moléculas de ARN podem ser estabilizadas ou "terem um chaperon" através da inclusão na região espaçadora de uma quimera de ARNp da invenção, que assegura que permaneçam na conformação adequada, activas e expostas. Por exemplo, a quimera de ARNp contendo um ARN de interesse pode ser imobilizada covalentemente, ou não covalentemente num substracto, de modo a que o ARN de interesse seja apresentado. A quimera de ARNp imobilizada pode ser feita contactar com moléculas teste, tais como extractos celulares ou componentes para identificar os constituintes aos quais o ARN de interesse se liga ou interage de outro modo. Isto é preferível a imobilizar o ARN de interesse directamente sobre o substracto, porque a imobilização directa pode interferir com a conformação do ARN de interesse e bloquear também porções da estrutura a partir do contacto com moléculas teste. A quimera de ARNp pode tâMâim ser utilizada para estabilizar ARNs em solução para ser utilizada em ensaios de ligação, ensaios de cisão, diagnóstico e semelhantes. A presente é ilustrada através dos exemplos

Entende-se que os exemplos em natt iculav-, materiais, quantidades e procedimentos são para ser interpretados de forma geral de acordo com o âmbito e espirito da invenção como aqui apresentado.

Exemplo 1 ARNp permutado circularmente de φ29 0 ARNp permutado circularmente do bacteriófago $29 foi sintetizado, atravks da transcrição a partir de uma estrutura base de ADN. A Fig. 7(a) representa a construção de estruturas base de ADN ligadas em série para a síntese de vários ARNpc (Zhang et al., Virology 207:442-451 (1995);. Os plasmídeos ADN3A pC (I) e ADNT7pc (II) contendo uma sequência de codificação de ARNp ligada em série foram ligados às laçadas de nucleótidos sintéticos 3 ou 17 respectivamente. Quatro iniciadores directos P38, P55, P78 e P82 que consistiram num promotor SP6 (17 nucleótidos) seguidos dos resíduos 38-54, 55-71, 78-94 e 82-98 do gene de ARNp, e quatro iniciadores inversos complementares aos resíduos 37-21, 54-38, 77-59 e 81-65 do gene de ARNp foram utilizados para gerar fragmentos de PCR. Os fragmentos de ADN de PCR foram utilizados directamente como estruturas base para a transcrição in vitro com SP6 ARN polimerase. Foram gerados quatro ARNpc, APdf.?-/Apt, aRNÍ;"55p<·, ARNT7-78pc e ARNT7-82 foram sintetizados a partir de uma estrutura base de ADN ADNT7-pc. 0 transcrito ARNpc linear resultante ligado ã extremidade 5' nativa do ARNp com o seu terminal 3', através de uma pequena laçada: AAA no caso da estrutura base de ADN de ADN3Apc e TAATACGACTCACTATA (SEQ ID N° 8) no caso da estrutara base de ADN de ADNT7pc.

Outros ARNspc avaliados foram ligados atravks de uma laçada AAA u A Fig. 7 (b) apresenta uma estrutura de ARNp permutada circularmente generalizada (SEQ ID II®: 2) asas setas indicando várias novas aberturas (Zhang et al., RNA 3:315-323 tlidllK Sequências do tipo selvagem de 5'U1C2 e 3'Μ170116 foram alteradas para G1G2 e C116C117, respectivamente, relativamente ao ARNp do tipo selvagem.

Para nossa surpresa constatámos que a inserção de sequências para Ligar às extremidades 5'e 3' da molécula de ARNp e relocalização às extremidades 5' e 3' noutro lugar da molécula não interfere com a actividade de ARNp, uma vez que ARNcp ainda era capaz de catalisar a construção de φ29.

Exemplo 2. Actividade in vitro da quimera de ARNp- ribozima A laçada utilizada para ligar os terminais nativos do ARNp no Exemplo 1 não possui ela própria qualquer actividade biológica, Contudo perguntámo-nos se uma sequência de ARN com actividade biológica iria reter a sua actividade se ligada a ambos os terminais a ARNp. Decidiu-se testar uma ribozima cabeça de martelo como sequência da laçada.

Um sistema modelo in vitro (Fig. 8) como descrito anteriormente em Cotton et al. (EMBO J. 8:3861-3866 (1989)) foi modificado e utilizado como um controlo para testar a funcionalidade de uma quimera de ARNp-ribozima. ARNU7sn (SEQ ID Nc:4) foi seleccionada como ARN alvo. A molécula de ARN quimérica, ARNp-Rz (SEQ ID N°:3), foi sintetizada.

Os ARNs utilizados nestas experiências foram gerados por transcrição in vitro da polimerase T7 utilizando PCR, ou através de clonagem num plasmídeo. Os produtos de transcrição são cs seguintes: A transcrição por T7 de ARNp-Rz da origem ao produto de 167 meros:

fCEiuqâOT0ocTO

AACACAÀAAGCAAUGGUACGGUACUUCCAUUGUCAUOIJGUAUGU (SE Q ff) ND:3) A transcrição por T7 da estrutura base U7 dá origem ao produto de 94 meros:

AGGUUUUCUGACUUCGGUCGGAAAACGCCUAACGUUGCAUGCCU GCAGGUC3' (SEQ ÍD NO:9)

A transcrição por T7 da estrutura base de Rz dá origem ao produto de 47 meros: 5'GGCAAAUUCUAAAACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGCUGUA ACAC3' (SEQ ID N0:105 .

As capacidades de Rz (47 bases) (SEQ ID N°:10) e ARNp-Ri (167 bases) (SEQ ID N°:3) para cindir o ARNU7sn (SEQ ID N°:9) foram comparadas. A reacção de clivagem de RS foi efectuada como uma experiência de controlo para demonstrar gue as reacções da ribozima funcionam correctamente sem quaisquer modificações. A reacção de cisão que utiliza ARNp-Rz foi efectuada para confirmar que o ARNp poderia ser utilizado com êxito como molécula de suporte para as ribozimas.

As reacções de clivagem foram efectuadas a 37°C durante 90 minutos na presença de Tris 20 mM a PH 7,5, NaCl 150 mM, e 20 MlL As de controlo foram efectuadas substituindo a água pelo ARN omitido. Por exemplo, o controlo de M não possui ARNU7sn, mas possui água para perfazer o volume.

Par*: a reacção indicada na Fig. as reacções de clivagem utilizaram 10 pmol de Rz ou ARNp-Rz para quebrar 15pmol de ARNU7sn. As amostras foram então corridas num gel desnaturante 16% Page / ureia 8M em SEE. O gel foi corado com brometo do etídio e visualizado utilizando EAGLE ΕΥΕ II da Stratagene. A Fig. 9 (a) apresenta os resultadeç bem sucedidos da reacção de quebra. Podem ser: observados os produtos de clivagem de 69 meros e 25 meros previstos.

Para a reacção apresentada na Fig. 9(b), as reacções de clivagem utilizaram 48,58 pmol de Rz ou ARNp-Rz para quebrar 97,16 pmol de ARNU7sn. As amostras foram então corridas num gel desnaturante 15% Page / ureia 8 M em TBE. O gel foi corado com brometo de etídio e visualizado utilizando EAGLE ΕΥΕ II da Stratagene. O produto de cisão de 25 bases previsto pode ser observado na Fig. 9(b). O produto previsto de 69 bases está escondido pelo ARNU7sn não cortado.

Esta experiência confirmou a utilização com êxito de ARNp como uma molécula de suporte para as ribozimas. A constatação de que a ribozima de cabeça de martelo retem a actividade na construção ARNp-Rz possui implicações importantes. A dobragem independente de ARNp permite aparentemente e vantajosamente que a ribozima se dobre na estrutura correcta e efectue a sua função de quebrar o ARN alvo. Além disso, como ambas as extremidades da ribozima estão ligadas a ARNp, é esperado que a ligação proteja a ribozima da digestão da exonuclease na célula. Assim, a ribozima ficará estável após a expressão em plantas transgénicas ou em animais resolvendo o problema persistente que era o obstáculo para o uso terapêutico das

Exemplo 3. Actividade in vi.t.r.a. do quimera de ARNp-ribozima contra c virus da hepatite B A hepatite ê uma doença grave que prevalece em muitos paises em todo o mundo. 0 virus da hepatite B (HBV) é um agente provccador desta doença. 0 HBV e um virus de ARN. 0 ARN genómico de HBV foi utilizado como um alvo para testar a funcionalidade de uma quimera de ARNp-ribozima. Este trabalho ê importante porque fornece potencial para o tratamento desta grave doença infecciosa. A ribozima cabeça de martelo desenhada por Feng et al. (Bicl. Chem. 382:655-660 (2001)) quebra um nucleótido 137 de substracto HBV-poliA em dois fragmentos de 70 e 67 nucleótidos. Testamos duas versões desta ribozima: RzApARN, que contém um residuo de ARNp e RzA que não contém. O ARN do substracto HBV-poliA foi gerado pela transcrição in vitro pela polimerase T7 utilizando um plasrnideo lineãrizado como estrutura base para os transcritos "run-off". O plasrnideo foi gentilmente cedido pelos laboratórios chefiados pelo Professor Yuan Wang e Guorong Qi do Instituto de Bioquímica de Shangai, Academia Nacional Chinesa das Ciências.

Um fragmento de ADNds que codifica para a quimera de ARNp, RzApARN foi feito por PCR a partir de um transcrito linearizado. Este produto de transcrição RzApARN foi submetido a uma reacção de clivagem eis para se libertar de sequências flanqueadoras de ARN estranhas. "Clivagem-cis" significa uma de clivagem em que quer a ribozima, quer o substracto fazem parte da mesma molécula. A reacção de clivagem cis foi efectuada por duas ribozimas que flanqueavam a sequência quimérica. Uma ribozima cis era 5'em relação a quimera, enquanto que a outra cis-ribozima era 3' em relação a quimera. Esta reacção de clivagem cis ocorreu predominantemente durante o tempo em que a RZApARN foi efectuada. O produto do transcrito de cisão cis rinha 188 meros: .Ot!A^#A€CIOOs fSBO 10 fclT) A reacção de clivagem foi efectuada a 37°C durante 60 minutos na presença de Tris 20 mM pH 7,5 e MgCla 20 mM. Foi utilizado RzApARN (0,539 nmol) para cindir HBV-polyA (0,117 nmol). Foram efectuadas reacções de controlo substituindo a água por determinados ARN. O ARN substituído pela água foi omitido no nome do controlo. Por exemplo, o controlo RzApARN não possui nenhum HBV-poliA. As amostras foram dializadas contra TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) durante 30 minutos numa membrana Milipore 0, 025 μπι do tipo VS. Foi adicionado tampão de carga 2x (ureia 8 Μ, TBE, azul de bromofenol 0,08%, xileno cianol 0,08%) as amostras antes de as carregar num gel de desnaturação 15% PAGE / 8 M ureia em TBE (Tris-borato 0,09 M, EDTA 0, 002 M) . o gel foi corrido a 100 voltes ate o xileno cianol estar a 1,5 cm da base do gel. O gel foi corado com brometo de etídio e visuaiizado utilizando EAGLE ΕΥΕ II por Stratagene. O substrato HBV-poliA cindido pela quimera funcional RzApARN é mostrado na Fig. 10. A banda marcada RzAARNp mostra uma reacção de controlo que não continha HBV-poliA, e a banda marcada HBV-poliA apresenta uma reacção de controlo que não continha RzAARNp. Os produtos de cisão previstos de 67 bases e 70 bases foram vistos como uma banda da reacção de tá.tlh que incluía tanto o HBV-polyA e RzAARNp.

Comparação da eficiência de sisâo da ribozima com e sem o vector ARNp revelou :¾¾.¾ diferença significativa. A ribozima RzAARNp que contem um resíduo ARNp foi capaz de cindir o substracto HBV-poliA com quase 100% de eficiência. Contudo a ribozima RzA sem o resíduo ARNp quebrou o substracto com uma eficiência muito inferior a 70% (não indicado).

Exemplo 4. Actívidade in vivo da Quimera de ARNp-ribozima contra o Vírus da Hepatite B

Um plasmideo pCRzA foi cedido pelo Professor Guorong Qí em Shangai. Este plasmideo contém sequências que codificam para uma ribozima cabeça de martelo de acção cis flanqueada por duas sequências tendo como alvo o sinal poly A do vírus da hepatite B. Quando este plasmideo foi cotransfectado para células HepG2 com o genoma HBV, o nível do ARN de HBV diminuiu e a replicação do vírus da hepatite B foi inibida de uma maneira dependente da dose.

Construímos um plasmideo pCRzApARN substancialmente de acordo com o Exemplo 2. No pCRzApARN a ribozima cabeça de martelo e a sua sequência flanqueadora foi transportada pelo ARNp de fi29, gerando uma quimera ARNp.

Comparação da eficiência das ribozimas com e sem o resíduo de ARNp (RzAARNp e RzA, respectivamente) está em curso utilizando utilizando os ensaios descritos em Feng et al. (Biol. Chem. 382:655-660 (2001)). A cotransfecção de ADN transiente está a ser utilizada para testar a eficácia intracelular da ribozima quimérica. Os resultados deste estudo serão determinados pelo ensaio de transferência de Northern. E completamente esperado que a quimera de RzAARNp irá mostrar um comportamento melhorado em tM:$çâú a RzA na diminuição de níveis de RNA de HBV, assim como a inibir a de HBV.

Exemplo 5. Actividade da Quimera de ARNp-ribozima contra o

Cancro em Cultura de Células

Crescimento e metátese de tumores sólidos necessita de angiogénese persistente. A angiogénese e um processo importante através do qual são formados novos vasos sanguíneos. A proteina lipoxigenase do tipo 12 (12-LOX) nas plaquetas faz 12-KETE (acido 12-hidróxi- 5,8,10,14-eicosatetraenoico) adicionando (¾ ao acido araquidónico C12. 12-LOX e os seus metabolitos podem ser factores importantes na angiogénese tumoral. A aplicação desta investigação poderia restringir o crescimento de tumores evitando que as células cancerígenas actuem em vasos sanguíneos para crescerem no tecido circundante.

Estudos ín vitro por Liu et al. Mostraram que esta ribozima 121oxRz quebrou eficientemente o substracto (Câncer Gene Ther. 7:671-675 (2000). A eficácia foi alterada quando se alterou a temperatura reaccional de 37°C para 50°C. Estudos in vitro em culturas celulares mostraram que células que expressam o ribozima a partir de um plasmídeo possuíam um nível de 12-LOX ARNm de tal maneira diminuído que não foi detectável por transferência de Northern. Um grupo de controlo de células que possuíam apenas uma ribozima mutante não funcional teve apenas uma pequena diminuição no nível de 12-LOX ARNm. Esta ligeira redução na expressão de 12-LOX ARNm poderia ter sido o resultado de um efeito anti-sentido pelo ribozima mutante, através da mesa ligação ao 12-LOX ARNm sem o quebrar. Extracto de célula foi testado, quanto à actividade enzimática 12-LOX. As células que expressam ribozimas possuíam 13% de actividade 12-LOX da enzima após 6 meses, quando comparada com células parentais. Células que expressam a ribozima mutante não possuíam 80% de actividade enzimática 12-LOX comparada com as células parentais (My et al., Câncer Gene Ther., 7:671-675, 2000). Isto demonstra a actividade da ribozima. ARNm de plaquetas do tipo 12-lipooxigenase (12-Iox) (Fig. 11) foi seleccionado como alvo para testar se a quimera aa ribozima cabeça de martelo pode funcionar para suprimir níveis de ARNm em células humanas de eritroleucemia (HEL) . Foram cedidos os plasmídeos in v·!tro e in vivo que codificam a ribozima pelo Professor Tien, Director do National Key Lab of Virus Research em que o inventor Peixun Guo é consultor e Professor Visitante. A ribozima cabeça de martelo foi inserida no nosso ARNp utilizando essencialmente o método descrito no Exemplo 2. Criámos a ribozima quimérica 121oxRzARNp, construindo primeiro uma estrutura base de ADN numa reacção de PCR em dois passos a partir de oligonucleótidos que codificam para o promotor T7 e do 121oxRz inserido na sequência de ARNp. Esta estrutura base foi posteriormente transcrita para dar o 12IoxRzARNp.

Experiências para testar a actividade de 12IoxRzARNp serão efectuadas. Para as experiências in vitro, 12loxRz e um fragmento de ARNm alvo de 12-IOX (o substracto de ARNm) são produzidos a partir de oligonucleótidos utilizando essencialmente o método descrito no Exemplo 2. C 12Iox e o substracto ARN são cada um transcritos a partir do seu próprio conjunto de dois oligonucleótidos de ADN híbridizados. Um codifica para o promotor de polimerase T7 de sentido negativo e para a sequência do substracto ou para a sequência 121oxRz. 0 outro oligonucleótido codifica para a sequência do promotor T7 de sentido positivo. O substracto de ARN é marcado radioactivamente utilizando a fosfatase do intestino da vitela (CIP o inglês calf intestine phosphatase) e depois a polinucleótido cinase (PNK -do inglês polynucleotide kinase) com |γf ? |· 7çtl· . A eficiência da cisão de duas ribozimas com e sem resíduo de ARNp será avaliada tanto in vitro e s células (cultura de células). Para o estudo in vitro vamos comparar a estabilidade da resistência das ribozimas com pH, concentração ióníca, RNase e lisado celular. Estes são factores que afectam a estabilidade da ribozirna e funcionam na celuia.

Serão utilizadas as células HEL que expressam 12-Iox nas experiências de cultura de células. Uma caçsette de expressão vazia ou c 12IoxRzARNp numa cassette de expressão que codifica para o promotor a quimera 12loxRzARNpr e a sequência de terminação da polimerase III eucariótica (resíduos 5 Tj serão fornecidos por trançfecção utilizando electioporação. A expressão da quimera 121oxRzARNp e 12-Iox ARNm nas células será detectada por transferência de Northern. Células HEL não transfectadas serão utilizadas como controlo. Será avaliada a actividade enzimática 12-LOX determinando se há uma redução na produção de 12-HETE em células HEL.

Tanto nas experiências in vitro e de cultura de células, será utilizado um mutante 121oxRz e um mutante 121oxRzARNp como segundo controlo. 0 mutante 121oxRz possui um dos seus nucleótidos no seu núcleo catalítico conservado substituído com outra base, tornando a ribozirna incapaz de eindir o substracto ARN. 0 uso de ribozimas mutantes catalíticas como um segundo controlo e desenhado para revelar se a ribozirna nativa é capaz de inibir a tradução através da ligação ao substracto de ARN e um efeito anti-sentido), em oposição â sua cisão.

Texto da taxa da listagem de sequências L nome do organismo: bacteriófago ΠΐΑΑίΙΰΑ 2 ARNp permutado circuiarmente de bacteriófago £i29 3 guimera de ARNp contendo ARNp de fi29 e uma ribozima de cabeça de martelo

4 substracto U7snARN 5 ribozima anti-12-Lox

6 substracto de ARN 7 guimera de ARNp 8 laçada de ligação 9 substracto U7 10 ribozima cabeça de martelo 11 nome do organismo: bacteriófago SF5' 12 nome do organismo: bacteriófago B1Q3 13 (não utilizado) 14 nome do organismo: bacteriófago M2/NF 15 nome do organismo: bacteriófago GAi L6 ARNaptp 17 pRzAARNp <110> Guo, Peixuan HOEPRICH, Stephen M SHU, Dan <120> Quimera de ARNp <130> P-00042.Pl.us <14Q> não atribuído <141> 17 <170> Patentin versxon 3.1 2 <ut> m

1 1M <213> bacteriófago

TicaauggHDC gguacuucca migucaugug uauguugggg anuaaacccu gauugagunc 60 agcccacaua cuuuguugau ugguugucaa ucanggcaaa agugcacgcu acimugauaa J20

<210> 2 <211> 121 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> ARN permutado circularmente do bacteriófago fi29 <400> 2 sispbâtípf si ^gp^gggi ammsÊíbíaÍ jjfMgym & a§gts»ps®. mmmm ιψψ&φ mmmm $9 * 131"

<210> 3 <211> 16 7 <212> ARN <213> Sequência artificial <223> quimera de ARN contendo ARNp de f 129 e ribozima de cabeça de martelo pppasigp 5ipm%U-C3B ;stâ5âefiâ»ç #p ugaugagucc gugaggacga aagcaguaac acaaaaucaa uggu acggua cuuccamigu 120 «spipmg !#

<2l3> 4 <211> 24 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> substracto U7snARN <400> 4 guguuacagc ucuuuuagaa uuug 24

<210> 5 <211> 46 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> ribozima anti-12-Lox <400> 5 acgcgguugu accugaugag uccgugagga cgaaacccgg agaaga 46

<212> ARN <213> Sequência artificial <223> substracto de ARN 14031 6 x;:í;- 1.5 ..i;u<:vcgg gucgxirnxmc cqcmi <210> 7

<211> 77 <212 > ARN <213> Sequência artificial <220> <223> quimera de ARNp <220> <221 > caracteristica ....misc <222> (7j..(11) <223> qualquer nucleótido <220> <221> caracteristica ....misc <222> (26)..(26) <223> reqião espaçadora <220> <221> caracteristica ...misc <222> (51) . . (54) <223> qualquer nucleótido <400> 7 guuganrainn ggcaanuugu caugnguaug uuggggauua nnnacugauu gg <210> 8 <211> 17

<212> ADN <213> Sequência artificial <i<22> laçada de

<210> 9 <211> 94 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> subsLracto U7 pMtapcss ® »g»p| gpd 94

<210> 10 <211> 47 <212> ARN <2I3> Sequência artificial <220> <223> ribozima de cabeça de martelo <400> 10 ggcaaauucu aaaacugaug aguccgugag gacgaaagcu guaacac 47 <210> 11 <211> 116 <2!2> ARN <213> Bacteríófago SF5' gugagacanc guauuuacua is®gsí$iig:K gugucggguu guuuucggau ugagnuccgc 60 cgacagcagg ggagcguaaa acacucuogc auuaaaaaua ugacugauuu cgcuac 116

<210> 12 <211> 121 <212> ARM <213> Bacteriófago BJ03

M

sgsmmm «gâ®®pcsii: eaffi«p|«pi çi^pepss! 1M n m

<2 ISA 13 <211> 0 <212> ARN <213> não utilizado

<m>: 13 OS 3 <21Q> 14 <211> 120 <212> ARN <213> Bacteriófago

SpSÍMíf Íi^llgpií i|e;gíi P!«S|Í|S®S 1¾ 21D> •:í í; p. ·..« mi> 1 iò :---:- v <x-P- 1. <>· ··'' .·:· ·2-2·<ν s».^^«gi3 msstgptpe S0 guugacaggo nguugcgugg aagcaauaco auaaauacnc ucucucgmiu uauaa j 25

<-210> 16 <211> 124 <212> ARN <213> Sequência artificial <220> <223> ARNaptp <4 20> lê V^VO^Ckj. P«|ítil3âgip

<210> 17 <211 :> 188 <212< ARN <213> Sequência artificial <222>

<223> pip2A®P gcuaguucua gagougauug guugucaauc auggcaaaag ugcacgcuac nuugcaaaac 60 aaanocnuua ííspispps cgugaggacg aaacggguca aaagcaaugg uacggaacuu 120 «isip® ppw§9»g: <S^|py§% «aps» «sf paes ! ® «ίϊρερε lll

Lisboa, 12 de Dezembro de 2007

Claims (25)

1. Reivindicações 1. Quimera de ARNp compreendendo: (a) uma região de ARNp; e (b) uma regiãc espaçadora compreendendo um ARN , biologicamente activo, estando a região espaçadora ligada de forma covalente nas suas extremidades 5' e 3' a região do ARNp; compreendendo a região de ARNp: (í)na direcção de 5' para 3' começando na ligação covalente de ARNp com a extremidade 3' da região espaçadora, uma primeira laçada (22); uma segunda laçada (24); e uma estrutura haste- laçada inferior compreendendo uma protuberância(25), uma primeira secção da haste (26) e uma terceira Laçada (27); (ii) uma segunda secção de haste (20) entroposta entre uma região espaçadora e a estrutura haste- laçada; (iii) uma terceira secção de haste (21) entreposta entre a estrutura haste -laçada e a primeira laçada (22); (iv) uma quarta secção de haste (23) entreposta entre a primeira laçada (22) e a segunda laçada (24); e (v) uma abertura definindo as extremidades 5' e 3' da quimera de ARNp.
2. 2. Quimera de ARNp da reivindicação 1, caracterizada por a região de ARNp compreender um ARNp permutado circularmente de um bacteriófago seleccionado a partir do grupe que consiste no bacteriófago φ29, StS* , B103, PZA, M2, NF e
3. 3. Quimera de ARNp de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizada por o ARN biologicamente activo ser seleccionado a partir do grupo que consiste numa ribozima e num ARN anti-sentido.
4. 4. Quimera de ARNp de acordo com qualquer uma das reivindicações I a 3, caracterizada por a região espaçadora compreender um ARN biologicamente activo compreendendo uma ribozima e uma primeira cadeia e segunda cadeia nucleótidica interposta entre a ribozima e a região ARNp.
5. 5. Molécula de ADN caracterizada por compreender uma sequência nucleótidica que codifica para a quimera de ARNp de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
6. 6. Processo in vitro para preparar uma quimera de ARNp compreendendo a transcrição de ADN de acordo com a reivindicação 5 para dar origem a quimera de ARNp.
7. 7. Processo para preparar uma quimera de ARNp compreendendo a transcrição de ADN de acordo com a reivindicação 5 numa célula não animal para dar a quimera de ARNp.
8. 8. Processo de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizado por a transcrição ocorrer numa célula presente numa cultura celular, ou numa célula explantada de um organismo.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a transcrição ocorrer numa célula presente num organismo.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a transcrição ocorrer in vitro, compreendendo ainda o processo a utilização da reacção em cadeia da polimerase numa estrutura base de ADN para gerar o ADN que codifica para a quimera de ARNp.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, compreendendo ainda a preparação de ADN que codifica para a quimera de ARNp, através da clonagem do ADN num plasmídeo e replicando o plasnrídeo.
12. 12. Processo para determinar se' uma molécula de ARN interage com uma molécula teste, compreendendo o método: a disponibilização de uma quimera de ARNp de acordo 'com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo uma região de ARNp * flanqueando uma região espaçadora compreendendo a molécula de ARN; imobilização da quimera ARNp num substracto; fazer contactar a quimera de ARNp imobilizada com uma molécula teste; e detectar se a molécula teste interage com a molécula de ARN.
13. 13. Processo in vitro para administrar um ARN biologicamente activo a uma célula que compreende a introdução de uma quimera de ARNp de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 na célula.
14. 14. Processo para administrar um ARN biologicamente activo a uma célula não animal compreendendo a introdução de uma quimera de ARNp de acordo com' qualquer uma das reivindicações 1 a 4 na célula.
15. 15. • Processo de acordo císk a : v i αόΆ'ύς/Ρό 14, caracterizado por a célula se encontrar presente num organismo.
16. 16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado por a introdução da quimera de ARNp na célula compreender: a transfecção da célula com uma molécula de ADN compreendendo uma sequência nucleótídica que codifica operacionalmence para a quimera de ARNp e provoca a transcrição da molécula de ADN na célula para dar origem ao ARN biologicamente activo.
17. 17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado por a quimera de ARNp ser transfectada directamente para a célula.
18. 18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, 14, 16 e 17, caracterizado por a célula se encontrar presente numa cultura celular, ou ser explantada a partir de um organismo.
19. 19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18 caracterizado por a célula ser uma célula de planta, ou de acordo com as reivindicações 13, ou 16 a 18 a célula ser uma célula animal.
20. 20. Quimera de ARNp de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para ser utilizada em terapia ou para ser utilizada na administração de um ARN biologicamente activo a uma célula.
21. 21. MbléctJs de ADN de acordo com a reivindicação 5 para ser utilizada em terapia , ou para ser utilizada na preparação de ama quimera de MIp como definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
22. 22. Uso cit uma quimera de ARNp de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para o fabrico de um medicamento ou para o tratamento do cancro, ou ét uma infecção patogénica.
23. 23. Uso de uma molécula de ADN de acordo com a reivindicação 5 para o fabrico de um medicamento para o tratamento do cancro, ou de uma infecção patogénica.
24. 24. Composição farmacêutica compreendendo a quimera de ARNp de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 para a administração de um ARN biologicamente activo a uma célula.
25. 25. Composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ADN de acordo com a reivindicação 5, para uso na preparação de uma quimera de ARNp como definido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4. Lisboa, 12 de Dezembro de 2007