ES2291342T3 - Quimera de arnp. - Google Patents
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Abstract
Una quimera de ARNp que comprende: (a) una región de ARNp; y (b) una región espaciadora que comprende un ARN biológicamente activo, estando la región espaciadora enlazada covalentemente en sus extremos 5'' y 3'' con la región de ARNp; en donde la región de ARNp comprende: (i) en la dirección de 5'' a 3'', comenzando en el enlace covalente del ARNp con el extremo 3'' de la región espaciadora, un primer bucle (22); un segundo bucle (24); y una estructura de bucle y tronco inferior que comprende un pandeo (25), una primera sección de tronco (26) y un tercer bucle (27); (ii) una segunda sección de tronco (20) interpuesta entre la región espaciadora y la estructura de bucle y tronco; (iii) una tercera sección de tronco (21) interpuesta entre la estructura de bucle y tronco y el primer bucle (22); (iv) una cuarta sección de tronco (23) interpuesta entre el primer bucle (22) y el segundo bucle (24); y (v) una abertura que define los extremos 5'' y 3'' de la quimera de ARNp.
Description
Quimera de ARNp.
Una ribozima es una enzima de ARN capaz de
disociar a una molécula de ARN diana. Estructuralmente, ella es un
ARN monocatenario caracterizado por dos "brazos" colocados en
cualquiera de los lados de un pequeño bucle. La ribozima aparea
bases con una región situada en el ARN diana, que es complementaria
con la secuencia de nucleótidos de sus dos brazos. La región de
bucle sirve como un centro catalítico activo que realiza la función
de disociación en el ARN diana (Fig. 1).
El uso de ribozimas para el tratamiento y la
prevención de enfermedades en plantas, seres humanos y animales
tiene el potencial de revolucionar a la biotecnología. Las ribozimas
de cabeza de martillo se han usado, por ejemplo, para disociar un
ARN en plantas y animales transgénicas/os. Sin embargo, a pesar de
numerosas publicaciones que informan acerca de los resultados de
investigaciones en tubos de ensayo, son relativamente pocos los
informes sobre el uso con éxito de ribozimas de cabeza de martillo
en organismos vivos (Perriman y colaboradores., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92:6175-6179 (1995)). Aunque ha
quedado claro que las ribozimas de cabeza de martillo pueden
disociar a un específico ARN vírico o ARNm (mensajero) en tubos de
ensayo, la eficiencia de disociación en células se reduce
espectacularmente debido a la inestabilidad y al mal plegamiento de
la ribozima en células.
Una causa principal de la inestabilidad de las
ribozimas en un entono intracelular es la degradación de la
respectiva ribozima por una exonucleasa presente en las células
(Cotton y colaboradores, EMBO J. 8:3861-3866
(1989)). Las exonucleasas son enzimas que arreglan de una manera
inespecífica a un ARN desde ambos extremos. Un método, que se ha
usado para bloquear la degradación intracelular de las ribozimas,
consiste en proteger a la respectiva ribozima conectándola en un
extremo con un ARN de vector, tal como un ARNt (de transferencia).
Sin embargo, debido al replegamiento de los ARN quiméricos
resultantes, la ribozima variaba en cuanto a eficiencia en
comparación con la ribozima sin proteger (Bertrand y colaboradores,
RNA 3:75-88 (1997)). Se ha informado también
de la atadura de una ribozima en ambos extremos de un ARNt, pero se
comprometían el plegamiento y/o la actividad (Vaish y
colaboradores, Nucl. Acids Res. 26:5237-5242
(1998)).
Taira y Nishikawa (Gene Regulation,. Biology of
Antisense RNA and DNA.[Regulación de genes. Biología de ARN y ADN
antisentido] Erickson RP e Izant JG, coordinadores de edición, Raven
Press, Ltd., Nueva York 1992, págs. 35-54)
describen también moléculas de ribozimas que son estabilizadas
mediante imbibición en ARNt's. En el documento de Solicitud de
Patente Internacional WO 99/15755, se indica que la estructura del
orden más alto del ARNt puede proteger a la ribozima con respecto a
la degradación por nucleasas celulares.
Además, Zhang y colaboradores (RNA 3 (1997),
315-323) han informado sobre un análisis funcional
de la estructura de pandeo y bucle de un ARNp usando una permutación
circular.
El potencial para tratar una enfermedad mediante
el uso de ribozimas para disociar a un ARN implicado en infecciones
de cáncer y con patógenos es tremendo. La disponibilidad de una
ribozima estabilizada, que fuese resistente a la degradación y
estuviese plegada correctamente de manera tal que permanezca activa
en un entorno intracelular, podría abrir el camino para el
desarrollo de muchas importantes terapias médicas.
El invento proporciona una molécula de ARNp
quimérico permutado circularmente, que lleva un ARN biológicamente
activo, apropiadamente plegado y estabilizado. La quimera de ARNp es
formada a partir de una región de ARNp permutado circularmente, y
de una región espaciadora que incluye el ARN biológicamente activo.
El ARN biológicamente activo es preferiblemente una ribozima o un
ARN antisentido. La región espaciadora está enlazada covalentemente
en sus extremos 5' y 3' con la región de ARNp. Opcionalmente, la
región espaciadora incluye unas sartas primera y segunda de
nucleótidos, que están interpuestas entre el resto biológicamente
activo y la región de ARNp.
La región de ARNp tiene una estructura
secundaria estable y compacta, que es característica de secuencias
de ARNp de bacteriófagos. Por lo tanto, en una forma de realización
de la quimera de ARNp, la región de ARNp incluye un ARNp permutado
circularmente de un bacteriófago seleccionado entre el grupo que
consiste en \phi29, SF5', B103, PZA, M2, NF y GA1. En otra forma
de realización de la quimera de ARNp, la región de ARNp incluye:
- (i)
- en la dirección de 5' a 3' comenzando en el enlace covalente del ARNp con el extremo 3' de la región espaciadora
- un primer bucle 22;
- un segundo bucle 24; y
- una estructura de bucle y tronco inferior que comprende un pandeo,
- una primera sección de tronco 26 y un tercer bucle 27;
- (ii)
- una segunda sección de tronco 20 interpuesta entre la región espaciadora y la estructura de tronco y bucle;
- (iii)
- una tercera sección de tronco 21 interpuesta entre la estructura de bucle y tronco y el primer bucle 22;
- (iv)
- una cuarta sección de tronco 23 interpuesta entre el primer bucle 22 y el segundo bucle 24; y
- (v)
- una abertura que define los extremos 5' y 3' de la quimera de ARNp, colocados en cualquier situación dentro de la región de ARNp.
El invento proporciona también un método para
producir una quimera de ARNp del invento. Un ADN, que codifica una
quimera de ARNp, que contiene una región de ARNp y una región
espaciadora que incluye un ARN biológicamente activo, es transcrito
in vitro para proporcionar la quimera de ARNp. Opcionalmente,
el ADN que codifica la quimera de ARNp es generado usando una
reacción en cadena de la polimerasa sobre un molde de ADN, o el ADN
es generado clonando el ADN en el seno de un plásmido y replicando
el plásmido.
El invento proporciona además un método para
determinar si una molécula de ARN interactúa con una molécula de
ensayo. Una quimera de ARNp, que incluye la molécula de ARN que
interesa, es inmovilizada sobre un substrato, y luego puesta en
contacto con la molécula de ensayo. Se detecta entonces si la
molécula de ensayo interactúa o no con el ARN que interesa, por
ejemplo por unión del ARN que interesa.
El invento proporciona también una molécula de
ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una
quimera de ARNp que contiene una región de ARNp y una región
espaciadora que incluye un ARN biológicamente activo.
Se proporciona también por el invento un método
para suministrar in vitro un ARN biológicamente activo a una
célula, preferiblemente a una célula vegetal o a una célula animal,
tal como una célula humana. Alternativamente, el invento
proporciona un método para suministrar un ARN biológicamente activo
a una célula que no es animal. En una forma de realización, una
molécula de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica
operativamente a una quimera de ARNp del invento, es introducida en
la célula y transcrita para proporcionar el ARN biológicamente
activo. En otra forma de realización, la quimera de ARNp es
transfectada directamente dentro de la
célula.
célula.
La Figura 1 es una representación esquemática de
la disociación de un ARN diana por una ribozima representativa.
La Figura 2 representa la secuencia de
nucleótidos (SEQ ID NO:1) y una estructura secundaria de un ARNp de
\phi29 (phi29) de tipo salvaje, que indica la situación y la
nomenclatura de los bucles y pandeos (Zhang y colaboradores,
RNA 3:315-323 (1997)).
La Figura 3 representa las secuencias de
nucleótidos de varios ARNp's antes de una permutación circular: (a)
el bacteriófago SF' ((SEQ ID NO:11), (b) el bacteriófago B103 (SEQ
ID NO:12), (c) los bacteriófagos \phi29 y PZA (SEQ ID NO:1); (d)
los bacteriófagos M2 y NF (SEQ ID NO:14), y (e) el bacteriófago GA1
(SEQ ID NO:15) (Chen y colaboradores, RNA
5:805-818 (1999)); y (f) un aptpRNA (SEQ ID
NO:16).
La Figura 4 es una representación esquemática de
diversas características estructurales de una quimera de ARNp del
invento: (a) una quimera de ARNp entero; (b) un componente de una
región espaciadora; (c) un componente de una región de ARNp.
La Figura 5 es una representación esquemática de
(a) el diseño de una forma de realización de la quimera de ARNp del
invento; y (b) moléculas ilustrativas de ARNp permutados
circularmente (ARNpc), que muestran diversas situaciones para las
aberturas del círculo.
La Figura 6 es una representación esquemática de
un posible mecanismo de la actividad de disociación de una ribozima
de ARNp.
La Figura 7 representa (a) la construcción de
moldes de ADN en tándem para la síntesis de diversos ARNpc's
(permutados circularmente) (Zhang y colaboradores, Virology
207:442-451 (1995); y (b) una estructura
generalizada de un ARNp permutado circularmente (SEQ ID NO:2) con
unas flechas que indican diversas nuevas aberturas (Zhang y
colaboradores, RNA 3:315-323 (1997)).
La Figura 8 representa una quimera de ARN (SEQ
ID NO:3) unida a una porción del substrato U7ARNsn (= ARNnp (nuclear
pequeño) de U/) (SEQ ID NO:4).
La Figura 9 muestra un gel desnaturalizador de
urea, que evidencia una disociación con éxito del substrato U7ARNsn
en sus productos de disociación 69 mero y 25 mero esperados, tanto
por la ribozima (Rz) como por la quimera de ARNp y ribozima
(ARNp-Rz), usando diferentes concentraciones de
reaccionantes para (a) y (b) como se describe en el texto.
La Figura 10 muestra un gel desnaturalizador de
urea que evidencia una disociación con éxito del substrato
HBV-polyA en sus productos de disociación 67 mero y
70 mero esperados, que discurre como una única banda, por la quimera
de un ARNp y una ribozima, RzApRNA.
La Figura 11 representa una ribozima
anti-12-LOX (SEQ ID NO: 5) unida a
un ARN de substrato (SEQ ID NO:6).
El bacteriófago \phi29 (phi29) es un virus de
ADN bicatenario. En 1987, uno de los autores de este invento, el
Dr. Peixuan Guo, descubrió un ARN de 120 bases codificado por un
virus, que desempeña un cometido clave en el empaquetamiento del
ADN del bacteriófago \phi29 (Guo y colaboradores, Science
236:690-694) (1987). Este ARN es denominado ARN de
empaquetamiento o "ARNp". Éste se une a procápsidas víricas en
el vértice portal (el sitio en donde el ADN entra en la procápsida)
(Guo y colaboradores, Nucl. Acid Res.
15:7081-7090 (1997)) y no está presente en el virión
de \phi29 maduro.
El ARNp contiene dos dominios funcionales: uno
para la unión con una procápsida y el otro para un cometido que
todavía se ha de definir en la translocación de un ADN (Trottier y
colaboradores, J. Virol. 71: 487-494 (1997);
Trottier y colaboradores, J. Virol. 70: 55-61
(1996); Zhang y colaboradores, Virology 201:
77-85 (1994)). Se necesitan seis copias de un ARNp
para empaquetar un ADN genómico (Trottier y colaboradores, J.
Virol. 70:55-61 (1996); Trottier y
colaboradores, J. Virol. 71, 487-494 (1997);
Guo y colaboradores, Mol. Cell. 2, 149-155
(1998)). El empaquetamiento de un ADN es completamente bloqueado
cuando una de las seis aberturas o rendijas está ocupada por un
ARNp inactivo con una mutación en el extremo 5' o 3' (Trottier y
colaboradores, J. Virol. 70:55-61 (1996);
Trottier y colaboradores, J. Virol.
71:487-494 (1997)). El ARNp del bacteriófago
\phi29 es asociado con procápsidas durante el proceso de
translocación de un ADN (Chen y colaboradores, J. Virol.
71:3864-3871 (1997)). Los datos de inhibición
también sugieren que el ARNp desempeña un cometido esencial en la
translocación de un ADN (Trottier y colaboradores, J. Virol.
71:487-494 (1997); Trottier y colaboradores, J.
Virol. 70:55-6 (1996)). Un cambio en la
conformación, inducido por Mg^{2+}, de un ARNp conduce a su unión
en el vértice portal (Chen y colaboradores, J. Virol. 71,
495-500 (1997)). También se ha informado acerca de
la estructura terciaria del monómero y del dímero del ARNp (Zhang y
colaboradores, Virology 81:281-93 (2001);
Trottier y colaboradores, RNA
6(9):1257-1266 (2000); Chen y colaboradores,
J. Biol. Chem. 275(23): 17510-17516
(2000); Garver y colaboradores, J. Biol. Chem. 275(4):
2817-2824 (2000)).
La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) de un
ARNp de \phi29 de plena longitud, natural (Guo y colaboradores,
Nucl. Acids. Res. 15:7081-7090 (1987)), así
como su estructura secundaria apareada con bases, que se ha
predicho, se muestran en la Figura 2(a) (Zhang y
colaboradores, RNA 3:315-323 (1997); Zhang y
colaboradores, Virology 207:442-451 (1995)).
La estructura secundaria predicha ha sido confirmada parcialmente
(Zhang y colaboradores, RNA 1:1041-1050
(1995); Reid y colaboradores, J. Biol. Chem.
269:18656-18661 (1994); Zhang y colaboradores,
Virology 2o1:77-85 (1994); Chen y
colaboradores, J. Virol. 71: 495-500
(1997)).
Un análisis filogenético de los ARNp's
procedentes de los fagos SF5, B103, \phi29, PZA, M2, NF y GA1
(Chen y colaboradores, RNA 5:805-818 (1999))
muestra una muy baja identidad entre secuencias y pocas bases
conservadas, y además la familia de los ARNp's manifiesta que éstos
tienen unas estructuras secundarias predichas llamativamente
similares y estables (3.3). Los ARNp's procedentes de los
bacteriófagos SF5' (SEQ ID NO:11), B103 (SEQ ID NO:12),
\phi29/PZA (SEQ ID NO:1), M2/NF (SEQ ID NO:14), GA1 (SEQ ID NO:15)
de Bacillus subtilis (Chen y colaboradores,
RNA5:805-818 (1999), y aptpRNA (ARNp aptámero) (SEQ
ID NO:16) están todos ellos predichos como que tienen una
estructura secundaria que exhibe esencialmente las mismas
particularidades estructurales que se muestran en la Figura 2 para
el ARNp de \phi29 (Chen y colaboradores, RNA
5:805-818 (1999). Todos ellos tienen unos extremos
5' y 3' naturales en el extremo izquierdo de una estructura de
tronco (como se muestra en la Figura 3) y contienen las mismas
particularidades estructurales situadas en las mismas situaciones
relativas.
Los ARNp de estos bacteriófagos, que comparten,
tal como lo hacen, una única estructura secundaria estable,
proporcionan el armazón para la quimera de ARNp del invento.
La estructura secundaria en una molécula de ARN
es formada por apareamiento de bases entre ribonucleótidos. Los
pares de bases de ARN incluyen G-C,
A-T y U-G. Las predicciones de una
estructura secundaria se hacen preferiblemente de acuerdo con el
método de Zuker y Jaeger, por ejemplo usando un programa conocido
por la designación comercial RNASTRUCTURE 3.6, redactado por David
H. Mathews (Mathews y colaboradores, J. Mol. Biol.
288:911-940 (1999); véase también Zuker,
Science 244:48-52 (1989); Jaeger y
colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:7706-7710 (1989); Jaeger y colaboradores,
Meth. Enzymol. 183:281-306 (1990)). Este
programa está disponible públicamente en la web mundial en la página
(homepage) del laboratorio de Douglas Turner de la Universidad de
Rochester en rna.chem.rochester.edu/RNAstructure.html y se
desarrolla en MS Windows 95, 06, ME, 200 y NT4. El programa está
disponible públicamente en la web mundial en la página de Michael
Zuker en el Instituto Politécnico de Rensselaer
(bioinfo.math.rpi.edu/\simzukerm/home.html); su página ofrece un
plegamiento en línea y una versión del algoritmo que puede ser
compilado en Silicon Graphics, Sun, o en los centros de trabajo de
DEC Alpha. Se escoge la estructura con la más baja energía (es
decir, la estructura óptima).
Las estructuras secundarias de un ARN pueden ser
caracterizadas por troncos, bucles y pandeos. Un "tronco" es
una sección bicatenaria de dos longitudes de ribonucleótidos
apareados con bases. Las secciones de tronco contienen por lo menos
2 pares de bases y están limitadas en su tamaño solamente por la
longitud de la molécula de ARN. Un "bucle" es una sección
monocatenaria que incluye típicamente por lo menos 3 ribonucleótidos
y está limitada en su tamaño también solamente por la longitud de
la molécula de ARN. En un "bucle y tronco" los extremos 5' y
3' del bucle coinciden con el extremo de una sección de tronco
apareada con bases. En un "bucle de pandeo", el bucle emerge
desde a lo largo de la longitud de una sección de tronco. Los
extremos 5' y 3' de un bucle de pandeo no son típicamente apareados
con bases aunque pueden potencialmente serlo (véanse, p.ej., G40 y
C48 del bucle de pandeo en la estructura del ARNp de \phi29;
Figura 2). Un "pandeo" es una sección monocatenaria no
apareada de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 ribonucleótidos,
presentes a lo largo de la longitud de (o entre) secciones de
tronco. Obsérvese que no hay ninguna línea clara de distinción entre
un "pandeo" grande y un pequeño "bucle de pandeo". Aquí,
cuando se usa el término "pandeo" éste incluye también un
pequeño "bucle de pandeo" (es decir, un bucle de pandeo con
menos que aproximadamente 7 ribonucleótidos).
La estructura secundaria de una molécula de ARN
es determinada por la naturaleza y la situación de las opciones de
apareamiento de bases a lo largo de su longitud. La estructura
secundaria del ARN es degenerada; es decir, que unas diferentes
secuencias primarias de ribonucleótidos pueden proporcionar las
mismas configuraciones de apareamiento de bases y por lo tanto la
misma estructura secundaria. Dicho de una manera, esto es semejante
a decir que múltiples secuencias de aminoácidos pueden producir la
misma estructura secundaria, por ejemplo una hélice \alpha.
Una única estructura secundaria es dictada por
un cierto número de diferentes secuencias primarias de unas maneras
predecibles y bien comprendidas. Por ejemplo, se pueden añadir,
retirar o sustituir generalmente nucleótidos únicos o pares de
nucleótidos sin alterar las interacciones globales de apareamiento
de bases dentro de la molécula de ARN y sin interferir con su
función biológica. Esto es particularmente cierto si se suprime,
añade o sustituye un par de bases o unos pocos pares de bases de
nucleótidos a lo largo de la longitud hibridada bicatenaria de la
molécula, o si se suprimen, añaden o sustituyen uno o más
nucleótidos en las regiones de bucles monocatenarios. Por ejemplo,
aún cuando los pares de bases GC y los pares de bases AT difieren
ligeramente en su estabilidad termodinámica, generalmente uno de
ellos se puede reemplazar por el otro en un sitio dentro de la
longitud bicatenaria, sin alterar la estructura secundaria de una
molécula de ARN. Los pares de bases GC son preferidos en la región
de tronco, debido a su estabilidad añadida. Unos cambios en la
estructura secundaria como un resultado de la adición, supresión o
modificación de nucleótidos se pueden comprobar con facilidad
aplicando el algoritmo de Zuker y Jaeger para la predicción de
estructuras secundarias, que se describe anteriormente. La región
de ARNp de la quimera de ARN puede acomodar una variación sustancial
en una secuencia primaria, sin ningún cambio apreciable en una
estructura secundaria.
La quimera de ARNp del invento consiste
esencialmente en una región de ARNp que tiene la estructura
secundaria ilustrada como ejemplo en la Figura 3 (y descrita
esquemáticamente en la Figura 4, como se detalla seguidamente),
interrumpida por (es decir, flanqueando a) una región espaciadora
heteróloga que contiene un resto biológicamente activo, tal como
una ribozima. La estructura secundaria de la región de ARNp de la
quimera de ARNp es la estructura secundaria común que caracteriza a
los ARNp procedentes de los bacteriófagos \phi29, SF5', B103, PZA,
M2, NF y GS1. La región espaciadora se denomina "heteróloga"
puesto que la totalidad, o una porción, de su secuencia de
nucleótidos, ha sido tratada por ingeniería genética, o se obtiene a
partir de un organismo distinto del bacteriófago. Es la presencia
de la región espaciadora heteróloga la que hace que la construcción
artificial sea "quimérica" para las finalidades de este
invento. La quimera de ARNp es útil como un vehículo para
transportar y suministrar una ribozima u otro resto biológicamente
activo hasta una molécula o situación diana. Puesto que ambos
extremos de la ribozima están conectados a un ARNp, se espera que el
enlace proteja a la sensible ribozima con respecto de una
degradación y que ayude al resto biológicamente activo a plegarse de
una manera apropiada.
Notablemente, la capacidad de la quimera de ARNp
para realizar su función pretendida de proteger y transportar un
resto biológicamente activo depende, no de la secuencia primaria de
nucleótidos de la región de ARNp (la estructura primaria), sino de
la estructura secundaria (interacciones de apareamiento de bases)
que la región de ARNp adopta como un resultado de su secuencia
primaria de nucleótidos. La "región de ARNp" de la quimera de
ARNp se denomina así porque tiene una estructura secundaria, aunque
no necesariamente una secuencia de ARN, característica de una
molécula natural de un ARNp de bacteriófago. Por lo tanto, a menos
que se especifique otra cosa distinta, la expresión "región de
ARNp" como se usa aquí, incluye secuencias de ARNp presentes en
la naturaleza (naturales), secuencias no presentes en la naturaleza
(no naturales), y combinaciones de las mismas, con tal de que ellas
proporcionen la estructura secundaria característica de un ARNp de
bacteriófago presente en la naturaleza (natural), como aquí se
describe. Dicho de otra manera, no se pretende que la expresión
"región de ARNp" esté limitada solamente a las secuencias de
nucleótidos particulares que son naturales para un ARNp. La región
de ARNp puede contener, por lo tanto, cualquier secuencia de
nucleótidos que dé como resultado la estructura secundaria mostrada
en la Figura 4. Las secuencias de nucleótidos, que se pliegan para
dar la estructura secundaria anteriormente mencionada, incluyen
secuencias presentes en la naturaleza, las que se han derivado
modificando secuencias de ARNp presentes en la naturaleza, y las que
son diseñadas de novo (de nuevas), así como combinaciones de
las mismas. Un experto en la especialidad puede determinar
fácilmente si una secuencia de nucleótidos se plegará para dar la
estructura secundaria mostrada en la Figura 4 y descrita aquí, por
aplicación de un algoritmo para estructuras secundarias, tal como el
RNASTRUCTURE que se describe anteriormente, a la secuencia de
nucleótidos.
Ejemplos de secuencias de nucleótidos que,
cuando están plegadas, proporcionan la estructura secundaria de la
región de ARNp de la quimera de ARNp del invento, se muestran en la
Figura 3. Ellas incluyen secuencias de ARNp procedentes de los
bacteriófagos SF5' (SEQ ID NO:11), B103 (SEQ ID NO:12), \phi29/PZA
(SEQ ID NO:1), M2/NF (SEQ ID NO:14), GA1 (SEQ ID NO:15) así como el
aptpRNA (SEQ ID NO:16).
En las formas de realización de la quimera de
ARNp, en las que la región de ARNp incluye o se deriva de un ARNp
presente en la naturaleza, la región espaciadora de la quimera de
ARNp está enlazada covalentemente a la región de ARNp, en los que
se pueden considerar como los extremos "naturales" 5' y 3' de
una secuencia de ARNp, uniendo de esta manera a los extremos
naturales de la región de ARNp. La región de ARNp de la quimera de
ARNp está opcionalmente truncada cuando se la compara con el ARNp de
bacteriófago natural; en estas formas de realización, y en las que
como resultado los extremos "naturales" 5' y 3' de la región de
ARNp simplemente se refieren a los nucleótidos que terminan o
comprenden el extremo real del ARNp natural truncado. Se forma una
abertura en la región de ARNp truncada para linealizar la quimera de
ARNp resultante, efectuando una "permutación circular" del
ARNp, como se detalla más adelante. Se deberá entender, no obstante,
que la expresión "región de ARNp circularmente permutado" no
está limitada a los ARNp's presentes en la naturaleza que han sido
permutados circularmente, sino que en vez de esto se pretende que
tenga el significado más amplio de un ARN que tiene una estructura
secundaria similar a la de un ARNp como se muestra en la Figura
4(c), que incluye una abertura en la región de ARNp que
forma los extremos 5' y 3' de la quimera de ARNp.
Ejemplos de quimeras de ARNp del invento son las
formadas a partir de los ARNp's de los bacteriófagos SF5' (SEQ ID
NO:11): B103 (SEQ ID NO:12); \phi29/PZA (SEQ ID NO:1); M2/NF (SEQ
ID NO:14); GA1 (SEQ ID NO:15) así como el aptpRNA (SEQ ID NO:16)
uniendo los extremos 5' y 3' naturales con la región espaciadora e
introduciendo una abertura en cualquier situación en la región de
ARNp, como se describe aquí. Otro ejemplo de una quimera de ARNp del
invento es:
- \quad
- 5'-GUUGAUN_{j}GUCAAUCAUGGCAA - región espaciadora - UUGUCAUGUGUAUGUUGGGGAUUAN_{4}CU GAUUGAGUUCAGCCCACAUAC-3' {}\hskip0.5cm (SEQ ID NO:7)
en la que N representa cualquier
nucleótido, sin limitación, y j es un número entero comprendido
entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8, de manera preferida
aproximadamente 5. La región espaciadora está representada por
N_{m} - B- N_{n} en donde N_{n} y N_{m} son sartas de
nucleótidos que están opcionalmente incluidas en la región
espaciadora, y B incluye el resto biológicamente activo.
Preferiblemente, B es una secuencia de ribonucleótidos que incluye
un ARN biológicamente activo. Tanto m como n pueden ser
independientemente cero o cualquier número entero. De manera
preferida, m y n son independientemente por lo menos aproximadamente
3, de manera más preferida por lo menos aproximadamente 5, y de
manera sumamente preferida por lo menos aproximadamente 10. Además,
m y n son independientemente, de manera preferida a lo sumo
aproximadamente 300, de manera más preferida a lo sumo
aproximadamente 50, y de manera sumamente preferida a lo sumo
aproximadamente
30.
Además, puesto que la región de ARNp de la
quimera de ARNp es definida por su estructura secundaria, se pueden
dar todavía otros ejemplos de una quimera de ARNp mediante
"mezcladura y emparejamiento" de fragmentos de nucleótidos
procedentes, por ejemplo, de las SEQ ID NOs: 1, 2, 7, 11, 12, 14, 15
y 16, que se pliegan para dar características estructurales
secundarias particulares (pandeos, bucles, bucles y troncos, etc.)
con tal de que la resultante secuencia de nucleótidos se pliegue
para dar la estructura secundaria global que se muestra en la
Figura 4. Por ejemplo, unos nucleótidos que codifiquen el bucle 22
de pandeo a partir del ARNp del bacteriófago SF5' (SEQ ID NO:11) se
podrían sustituir por los nucleótidos que codifiquen el bucle 22 de
pandeo en el ARNp de \phi29 (SEQ ID NO:1) para proporcionar una
región de ARNp como se describe aquí. Similarmente, se pueden
sustituir cualquier número de secuencias artificiales en las SEQ ID
NOs. 1, 2, 7, 11, 12, 14, 15 y 16 para reemplazar a las secuencias
de nucleótidos que se pliegan para dar una o más características
estructurales (o porciones de las mismas) con el fin de formar una
región de ARNp como se describe aquí. Véase, por ejemplo, un
aptpRNA (Figura 3(f)) que se derivaba en esta particularidad
del ARNp de \phi29. El principio de jerarquía consiste en que la
estructura secundaria global de la región de ARNp es la estructura
secundaria común para los ARNp's del bacteriófago, como se
representa esquemáticamente en la Figura 4.
De modo importante, la quimera de ARNp
resultante no es una molécula circular; en vez de esto, ella está
linealizada debido a una permutación circular de la región de ARNp
(Zhang y colaboradores, RNA 3:315-323 (1997);
Zhang y colaboradores, Virology 297:442-451
(1995)). Dicho brevemente, se proporciona una abertura (es decir,
una disociación o un punto de rotura) en la región de ARNp en
cualquier sitio designado para formar los extremos 5' y 3' reales
de la quimera de ARN. Estos extremos 5' y 3' están en posiciones
"no naturales" con respecto a un ARNp lineal que se presenta en
la naturaleza.
La Figura 5(a) muestra cómo una quimera
de ARNp del invento se puede formar a partir de una ribozima y de
una región de ARNp. Los extremos 5' y 3' del ARNp se pueden tratar
por ingeniería genética en cualquier sitio deseado de la quimera de
ARNp permutado circularmente. La Figura 5(b) muestra
moléculas ilustrativas de ARN permutados circularmente, que muestran
diversas situaciones para las aberturas de los círculos.
La Figura 4 representa diversas características
estructurales que caracterizan a una quimera de ARNp del invento.
Como se muestra en la Figura 4(a), la molécula lineal incluye
una región de ARNp 1 y una región espaciadora 2. La región
espaciadora 2 contiene un resto biológicamente activo 3, en este
caso una ribozima, flanqueada por sartas de nucleótidos 4. La
región de ARNp 1 está bifurcada; ella incluye un primer segmento de
ARNp 5 que tiene un extremo 3' 6 y un extremo 5' 7 "natural",
y un segundo segmento de ARNp 8 que tiene un extremo 3' 9
"natural" y un extremo 5' 10. Los extremos 6 y 10 son los
extremos terminales reales de la quimera de ARNp. La abertura 11
convierte a la molécula en lineal y puede ser colocada en cualquier
situación en la región de ARNp 1 por recolocación de los extremos 6
y 10.
La región espaciadora 2 se muestra con detalle
en la Figura 4(b). La ribozima 3 se compone de un dominio
catalítico 15, flanqueado por secuencias 16 de unión a dianas.
La región de ARNp 1 se muestra con detalle en la
Figura 4(c). De manera global, la región de ARNp 1 está
caracterizada por una estructura secundaria de bucle y tronco, en
la que el bucle 24 es relativamente pequeño y el apareamiento de
bases en el tronco (esencialmente las secciones de tronco 20, 21 y
23) está interrumpido por estructuras situadas en cualquiera de los
lados del bucle 24. El bucle 22 de pandeo está situado en 5' del
bucle 24. Colocada en 3' del bucle 24 se encuentra una estructura
de bucle y tronco, que contiene el pandeo 25, el tronco 26 y el
bucle 27.
La sección de tronco 20 puede tener una longitud
de cualquier número de ribonucleótidos y puede contener un número
ilimitado de pandeos, con la condición de que todavía sea capaz de
aparear bases. De manera preferida, la sección de tronco 20
contiene por lo menos aproximadamente 4, de manera más preferida por
lo menos aproximadamente 10, pares de bases; además, ella contiene
de manera preferida a lo sumo aproximadamente 50, de manera más
preferida a lo sumo aproximadamente 40, pares de bases. De manera
preferida, la sección de tronco 20 contiene de aproximadamente 0 a
aproximadamente 8 pandeos; de manera más preferida ella contiene de
aproximadamente 0 a aproximadamente 4 pandeos.
La sección de tronco 21 contiene preferiblemente
5-13 pares de bases y 0-2
pandeos.
El bucle 22 de pandeo contiene preferiblemente
5-12 bases.
La sección de tronco 23 contiene preferiblemente
3-12 pares de bases y 0-2
pandeos.
El bucle 24 contiene preferiblemente
3-8 bases.
El pandeo 25 contiene preferiblemente
0-5 bases.
El tronco 26 contiene preferiblemente
4-8 pares de bases y 0-2
pandeos.
El bucle 27 contiene preferiblemente
3-10 bases.
Unas interacciones terciarias dentro de una
molécula de ARN pueden resultar de unas interacciones no locales de
zonas de la molécula de ARN que no están próximas entre sí en la
secuencia primaria. Aunque parece que un ARNp de bacteriófago
natural manifiesta exhibir interacciones terciarias entre el bucle
22 de pandeo y el bucle 27 (Chen y colaboradores, ARN
5:805-818 (1999); Guo y colaboradores, Mol.
Cell. 2:149-155 (1998)), deberá entenderse que
la quimera de ARNp del invento no está limitada a moléculas que ARN
que exhiban cualesquiera interacciones terciarias particulares.
En una forma de realización, la quimera de ARNp
del invento contiene por lo menos 8, más preferiblemente por lo
menos 15, lo más preferiblemente por lo menos 30 ribonucleótidos
consecutivos encontrados en un ARNp de SF5' (Figura 3(a)),
un ARNp de B103 (Figura 3(b)); un ARNp de \phi29/PZA
(Figura 3(c)); un ARNp de M2/NF (Figura 3(d)); un
ARNp de GA1 (Figura 3(e)) o un aptpRNA (Figura 3(f))
natural, preferiblemente el ARNp de \phi29 natural. Lo más
preferiblemente, la región de ARNp de la quimera de ARNp contiene
por lo menos una secuencia de ARNp de \phi29, que comienza en el
ribonucleótido 23, preferiblemente en el ribonucleótido 20, y
termina en el ribonucleótido 95, preferiblemente en el
ribonucleótido 97, en la secuencia del ARNp de \phi29 (Figura 2).
Además, o de manera alternativa, la secuencia de nucleótidos de la
región de ARNp de la quimera de ARNp es idéntica preferiblemente en
por lo menos un 60%, más preferiblemente por lo menos en un 80%,
incluso más preferiblemente en un 90%, y lo más preferiblemente en
un 95% a la secuencia de nucleótidos de una quimera natural
correspondiente de un ARNp de SF5' (Figura 3(a)), un ARNp de
B103 (Figura 3(b)); un ARNp de \phi29/PZA (Figura
3(c)); un ARNp de M2/NF (Figura 3(d)); un ARNp de GA1
(Figura 3(e)) o un aptpRNA (Figura 3(f)) natural, lo
más preferiblemente un ARNp de \phi29 (particularmente las bases
20-97).
La identidad porcentual es determinada alineando
dos polinucleótidos con el fin de optimizar el número de
nucleótidos idénticos a lo largo de las longitudes de sus
secuencias; se permiten unos intersticios en cualquiera o en ambas
de las secuencias al producir la alineación con el fin de optimizar
el números de nucleótidos compartidos, aunque los ribonucleótidos
en cada una de las secuencias deben permanecer, no obstante, en su
orden apropiado. Por ejemplo, las dos secuencias de nucleótidos son
comparadas con facilidad usando el programa Blastn del algoritmo de
búsqueda BLAST 2, como se describe por Tatusova y colaboradores
(FEMS Microbiol Lett 1999, 174:247-250).
Preferiblemente, se usan los valores en defecto para todos los
parámetros de búsqueda BLAST 2, incluyendo un premio para un
apareamiento = 1, un castigo para un mal apareamiento = -2, un
castigo para un intersticio abierto = 5, un castigo para un
intersticio de prolongación = 2, una caída x intersticio = 50, una
esperanza = 10, un tamaño de palabra = 11, y una filtración.
Los enlaces covalentes entre el resto
biológicamente activo y la región de ARNp pueden ser directos o
indirectos, pero preferiblemente son indirectos. En un enlace
indirecto, la región espaciadora incluye una o varias
sarta(s) adicional(es) de ribonucleótidos en uno o
ambos extremos del resto biológicamente activo. Estas sartas de
ribonucleótidos, si están presentes, contienen de manera preferida
por lo menos aproximadamente 3 ribonucleótidos; y de manera
preferida contienen a lo sumo aproximadamente 300, de manera más
preferida a lo sumo aproximadamente 30 ribonucleótidos. En cuanto a
la composición, las sartas pueden contener cualesquiera
ribonucleótidos deseados, sin embargo, es preferible que las
composiciones de ribonucleótidos se seleccionen de manera tal que se
impida que las sartas de ribonucleótidos situadas en cualquiera de
los lados del resto biológico apareen bases unas con otras o con
otras partes de la quimera de ARNp.
Preferiblemente, la actividad biológica del ARN
biológicamente activo es una actividad enzimática o una actividad
de unión, o ambas cosas; por ejemplo, el resto biológicamente activo
puede actuar como, o codificar, una ribozima u otro resto
catalítico.
Se deberá entender que los términos
"nucleótido", "oligonucleótido" y "polinucleótido",
como se usan aquí, abarcan unos ADN, unos ARN, o combinaciones de
los mismos, a menos que se indique otra cosa distinta. Además,
deberá entenderse que los términos ADN y ARN incluyen no solamente
ácidos nucleicos presentes en la naturaleza, sino también
secuencias que contienen compuestos análogos a nucleótidos o
nucleótidos modificados, tales como los que han sido modificados
química o enzimáticamente, por ejemplo fósforotioatos de ADN,
fósforotioatos de ARN y 2'-O-metil
ribonucleótidos.
Un ARN biológicamente activo, preferido, es una
ribozima tal como una ribozima de cabeza de martillo o una ribozima
de horquilla. Son también preferidos los ARN antisentido y otros
ARN's bioactivos.
Una ribozima es caracterizada generalmente
por:
brazo 1 -
centro activo de la enzima - brazo
2
en donde el brazo 1 y el brazo 2
son secuencias complementarias con el substrato diana que ha de ser
disociado por la ribozima, y el centro activo de la enzima es el
centro catalítico que disocia al ARN diana. Los "brazos" de la
ribozima contienen típicamente por lo menos aproximadamente 7
nucleótidos, de manera preferible por lo menos aproximadamente 12
nucleótidos, y típicamente contienen a lo sumo aproximadamente 100
nucleótidos, de manera preferible a lo sumo aproximadamente 30
nucleótidos. La secuencia de nucleótidos de los brazos puede ser
tratada por ingeniería genética para hibridarse con la secuencia de
nucleótidos de cualquier ácido nucleico diana
deseado.
Ventajosamente, el hecho de incorporar un ARN
biológicamente activo, p.ej., una ribozima, en la quimera de ARNp
del invento protege a los extremos de la ribozima, haciendo de esta
manera que ésta sea resistente a la degradación por exonucleasas.
Además, la estructura secundaria de un ARNp es compacta y muy
estable. Un dominio de ARNp definido por los nucleótidos
30-91 de un ARNp de \phi29 es especialmente
estable. La compacidad y la estabilidad de un ARNp permite que la
región de ARNp y la ribozima se plieguen independientemente. Un
plegamiento apropiado del ARN introducido es facilitado, preservando
de esta manera su actividad biológica. Es retenida de igual manera
la estructura estable de la región de soporte del ARNp. Un obstáculo
principal para diseñar moléculas que suministren ribozimas, es
decir, un mal plegamiento de la ribozima y de la región de soporte
como un resultado de interacciones entre ellas, se ha superado de
esta manera utilizando la molécula de ARNp muy estable como el
soporte. El hecho de que la actividad de la ribozima es retenida en
la quimera de ARNp permutado circularmente, es especialmente
importante, puesto que ello significa que los nuevos extremos 5' y
3' de la quimera de ARNp pueden estar colocados de manera tal que se
los "entierre" en la estructura de ARNp plegada, protegiendo
de esta manera adicionalmente a la quimera de ARNp con respecto de
una degradación. Estas particularidades sugieren una gran promesa
para el uso de una quimera de ARNp del invento como un vehículo de
suministro de ribozimas en aplicaciones médicas y veterinarias.
La quimera de ARNp del invento emplea una
"permutación circular" de un ARNp de bacteriófago. Una molécula
de ARNp "permutado circularmente" (ARNpc) es una molécula de
ARN lineal en la que los extremos 5' y 3' naturales están enlazados
covalentemente. El enlace puede ser directo, o puede ser indirecto
mediante el uso de una región espaciadora. Puesto que una molécula
de ARNpc es lineal, unos nuevos extremos 5' y 3' no naturales son
creados por formación de una abertura en la molécula (es decir, una
discontinuidad en la secuencia de ARNp) en una situación diferente.
La quimera de ARNp del invento es lineal como resultado de una
abertura no natural en el armazón de ARNp de bacteriófago en un
sitio designado, que permuta circularmente el armazón de
bacteriófago y forma los extremos 5' y 3' reales de la quimera de
ARNp. Como ya se ha señalado, la abertura no natural puede estar en
cualquier situación deseada en la región de ARNp. Ejemplos de
situaciones seleccionadas, por ejemplo, en un ARNp de \phi29, se
pueden encontrar en las citas de Zhang y colaboradores, RNA
3:315-232 (1997) y Zhang y colaboradores,
Virology 207:442-451 (1995). Véanse también
las citas de Garver y colaboradores, J. Biol. Chem.
275:2817-2824 (2000); Chen y colaboradores, J.
Virology 71:495-500 (1997); Trottier y
colaboradores, RNA 6:1257-1266 (2000); y
Zhang y colaboradores, Virology 281:271-293
(2001)).
La quimera de ARNp del invento se puede
sintetizar química o enzimáticamente usando protocolos clásicos de
laboratorio. La región de ARNp es preferiblemente transcrita a
partir de un molde de ADN que la codifica, aunque si se desea se
puede sintetizar químicamente. Si se sintetiza químicamente, la
región de ARNp contiene opcionalmente nucleótidos no naturales
(p.ej., nucleótidos derivatizados o sustituidos) y/o enlaces no
naturales análogos a los enlaces con fosfodiésteres que
caracterizan a los ácidos nucleicos presentes en la naturaleza.
Preferiblemente, la región de ARNp es transcrita
o sintetizada como una única molécula de ARN. En una forma de
realización del método, la región espaciadora es enlazada química o
enzimáticamente a los extremos "naturales" de la región de
ARNp para formar una molécula quimérica circular. El ARNp es luego
disociado en un sitio previamente determinado para formar la
quimera lineal de ARNp permutado circularmente.
Cuando la región espaciadora es un ARN, otra
forma de realización del método incluye transcribir la quimera
entera de ARNp a partir de un único molde de ADN que codifica la
molécula quimérica entera. En otra forma de realización del método,
la región espaciadora de ARN se produce por separado, ya sea por
medio de una transcripción a partir de su propio molde o por
síntesis química, después de lo cual ella es ligada a la región de
ARNp.
También se incluye en el invento una molécula de
ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica la
quimera de ARNp del invento. La región espaciadora de la quimera
codificada es necesariamente un ARN en este aspecto del invento. La
molécula de ADN puede ser lineal o circular. Ella puede ser
bicatenaria o monocatenaria; si es monocatenaria, su complemento
también está incluido en el término "molécula de ADN". Una
molécula de ADN para su uso en la introducción de un ARNp en una
célula, contiene preferiblemente elementos reguladores de manera
tal que la quimera de ARNp es codificada operativamente. Una quimera
de ARNp es "codificada operativamente" por una molécula de
ADN, cuando la molécula de ADN contiene elementos reguladores que
permiten que la quimera de ARNp sea producida por transcripción de
la molécula de ADN dentro de la célula. Tales elementos reguladores
incluyen por lo menos un promotor. Opcionalmente, la molécula de ADN
incluye motivos reguladores adicionales que favorecen la
transcripción de la quimera de ARN, tal como, pero sin limitarse a,
un intensificador. La molécula de ADN se puede introducir en la
célula anfitriona usando un suministro mediado por lípidos aniónicos
o catiónicos o por otros mecanismos de transfección clásicos,
incluyendo una electroporación, una adsorción, un bombardeo con
partículas o una microinyección, o mediante el uso de un vector
vírico o retrovírico.
Se deberá señalar que la quimera de ARNp puede
ser introducida, si se desea, directamente en la célula anfitriona.
Por ejemplo, un producto disponible bajo la denominación comercial
TRANSMESSENGER TRANSFECTION REAGENT (REACTIVO DE TRANSFECCIÓN
TRANSMENSAJERO) (disponible de Qiagen), que es una formulación
basada en lípidos, que se usa en conjunción con un específico
intensificador condensador de ARN y un tampón optimizado, se puede
usar para transfectar la quimera de ARNp dentro de células
eucarióticas.
Opcionalmente, la molécula de ADN puede contener
una o más particularidades que la permiten integrarse dentro del
genoma de las células. Por ejemplo, se puede suministrar en la forma
de un transposón, de un retrotransposón, o de un vector integrador;
alternativamente, puede contener secuencias que sean homólogas con
secuencias genómicas que la permiten integrarse por medio de una
recombinación homóloga. Por otro lado, la molécula de ADN puede ser
diseñada para que exista dentro de una célula como un ADN no
genómico, p.ej., como un plásmido, un cósmido, un episoma y
similares.
La transcripción a partir de un molde de ADN que
codifica la molécula de ARN quimérica entera, se puede realizar
in vitro o dentro de una célula. La célula puede estar en un
cultivo de células, o en un organismo (in vivo) tal como una
planta, entonces es una célula no animal, o en una célula explantada
a partir de un organismo (ex vivo).
Ventajosamente, la quimera de ARNp del invento
puede ser usada para suministrar una molécula de ARN biológicamente
activo a una diana dentro de una célula. Una molécula de ADN que
tiene una secuencia de nucleótidos, que codifica operativamente una
región de ARNp permutado circularmente y una región espaciadora, es
introducida dentro de una célula. La región espaciadora incluye un
ARN biológicamente activo, y la transcripción del ADN para
proporcionar el ARN biológicamente activo. La molécula
biológicamente activa suministrada de este modo es preferiblemente
una ribozima, y la diana es preferiblemente vírica o un ARNm
asociado con un gen cuya expansión es deseable reducir. La Figura 6
muestra un mecanismo propuesto para la disociación de un ARN diana
por una quimera de ribozima de ARNp. Un ARN antisentido, que puede
estar dirigido hacia una diana de ADN o ARN intracelular, es
preferido también como la molécula biológicamente activa.
De manera sorprendente, una conjugación de una
ribozima con una región bifurcada del ARNp, de tal manera que ambos
extremos de la ribozima estén enlazados covalentemente a la región
de ARNp, no hace inactiva a la ribozima, ni parece que interfiera
con el plegamiento independiente de la región de ARNp o de la región
de ribozima. Puesto que se espera que la atadura de ambos extremos
del ARN de ribozima impida también una degradación por una
exonucleasa, se espera que la resultante quimera de ARNp y ribozima
sea útil para disociar ARN's indeseados en plantas y animales,
incluyendo a los seres humanos. Adicionalmente, se pueden
desarrollar plantas y animales transgénicas/os con resistencia a
enfermedades, por introducción de un ADN que codifica la quimera de
ARNp y ribozima dentro del ADN genómico de la célula.
La quimera de ARNp del invento es también útil
in vitro, por ejemplo, para la caracterización de moléculas
de ARN. Ciertas moléculas de ARN, particularmente pequeñas moléculas
de ARN, pueden ser estabilizadas o "acompañadas" mediante
inclusión en la región espaciadora de una quimera de ARNp del
invento, que asegura que ellas permanezcan apropiadamente plegadas,
activas y expuestas. Por ejemplo, una quimera de ARNp que contenga
un ARN que interese, puede ser inmovilizada, covalente o no
covalentemente, sobre un substrato, de manera tal que se presente el
ARN que interese. La quimera de ARNp inmovilizada puede ser luego
puesta en contacto con moléculas de ensayo, tales como extractos o
componentes celulares, para identificar los constituyentes con los
que el ARN que interesa se une o interactúa de otra manera. Esto es
preferible para inmovilizar al ARN que interesa directamente en el
substrato, puesto que una inmovilización directa puede interferir
con el plegamiento del ARN que interesa y también bloquear a
porciones de la estructura con respecto de un contacto con las
moléculas de ensayo. La quimera de ARNp también se puede usar para
estabilizar ARN's en solución para su uso en ensayos de unión,
ensayos de disociación, diagnósticos y similares.
\vskip1.000000\baselineskip
El presente invento se ilustra por los
siguientes Ejemplos. Se ha de entender que los ejemplos, los
materiales, las cantidades y los procesos particulares se han de
interpretar en un sentido amplio, de acuerdo con el alcance y con el
espíritu del invento, como aquí se expone.
\vskip1.000000\baselineskip
Un ARNp permutado circularmente (ARNpc)
procedente del bacteriófago \phi29 fue sintetizado por la vía de
una transcripción a partir de un molde de ADN. La Figura 7(a)
describe la construcción de moldes de ADN en tándem para la
síntesis de diversos ARNpc's (Zhang y colaboradores, Virology
207:442-451 (1995)). Los plásmidos cpDNA3A (I) y
cpDNApcT7 (II) que contienen una secuencia de codificación de ARNp
en tándem se conectaron por bucles sintéticos de 3 o 17
nucleótidos, respectivamente. Cuatro cebadores directos P38, P55,
P78 y P82, que se componían de un promotor de SP_{6} (de 17
nucleótidos) seguido por los residuos 38-54,
55-71, 78-94 y
82-98 del gen de ARNp, y cuatro cebadores inversos,
que eran complementarios con los residuos 37-21,
54-38, 77-59 y
81-65 del gen de ARNp, se usaron para generar
fragmentos de PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA). Los
fragmentos de ADN para PCR se usaron directamente como moldes para
una transcripción in vitro con la polimerasa de ARN de
SP_{6}. Cuatro ARNpc's, cpRNA3A-38,
cpRNA3A-55, cpRNA3A-78 y
cpRNA3A-82 se generaron a partir del molde de ADN
cpDNA3A. Otros cuatro ARNpc's, cpRNAT_{7}-38,
cpRNAT_{7}-55, cpRNAT_{7}-78 y
cpRNAT_{7}-82 se sintetizaron a partir del molde
de ADN cpDNAT_{7}. El resultante transcrito de ARNpc lineal
enlazaba el extremo 5' natural del ARNp con su extremo 3' a través
de un pequeño bucle (loop): AAA en el caso del molde de ADN cpDNA3A
y TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO:8) en el caso del molde de ADN
pcDNApcT_{7}.
Otros ARNpc's evaluados fueron unidos por un
bucle AAAU. La Figura 7(b) muestra una estructura
generalizada de ARNp permutado circularmente (SEQ ID NO:2) con unas
flechas que indican varias nuevas aberturas (Zhang y colaboradores,
RNA 3:315-323 (1997)). Las secuencias de tipo
salvaje de 5'U1C2 y 3'A117G116 fueron cambiadas a G1G2 y C116C117,
respectivamente, en relación con un ARNp de tipo salvaje.
Para nuestra sorpresa, hemos encontrado que una
introducción de secuencias para enlazar los extremos 5' y 3'
naturales de la molécula de ARNp y una recolocación de los extremos
5' y 3' en cualquier situación en la molécula, no interfieren con
la actividad de un ARNp, puesto que el ARNpc es todavía capaz de
catalizar el ensamble de \phi29.
\vskip1.000000\baselineskip
El bucle usado para conectar los terminales
naturales del ARNp en el Ejemplo 1 no posee por sí mismo ninguna
actividad biológica. Sin embargo, nos hemos preguntado si una
secuencia de ARN con actividad biológica retendría su actividad si
fuese atada en ambos extremos a unos ARNp. Se decidió ensayar una
ribozima de cabeza de martillo como la secuencia de bucle.
Un sistema de modelo in vitro (Figura 8),
como se describe con anterioridad en la cita de Cotton y
colaboradores (EMBO J. 8:3861-3866) (1989))
fue modificado y usado como un testigo para ensayar la funcionalidad
de una quimera de un ARNp y de una ribozima. Se seleccionó el
U7snRNA (ARNnp de U7) (SEQ ID NO:4) como el ARN diana. Se sintetizó
una molécula quimérica de ARN, pRNA-Rz de ARNp y Rz
(SEQ ID NO:3).
Los ARN's usados en estos experimentos fueron
generados por una transcripción in vitro con la polimerasa de
T7 ya sea usando una PCR o clonándola dentro de un plásmido. Los
productos de la transcripción son como sigue:
\newpage
La transcripción con T7 de una
pRNA-Rz proporciona el 167 mero:
\vskip1.000000\baselineskip
La transcripción con T7 de un molde de U7
proporciona el 94 mero:
\vskip1.000000\baselineskip
La transcripción con T7 de un molde de Rz
proporciona el 47 mero:
Se compararon las capacidades de una Rz (de 47
bases) (SEQ ID NO:10) y de una pRNA-Rz (de 167
bases) (SEQ ID NO:3) para disociar a un U7snRNA (SEQ ID NO:9). La
reacción de disociación con una Rz se llevó a cabo como un
experimento testigo para demostrar que las reacciones con ribozimas
trabajan correctamente sin modificaciones de ningún tipo. La
reacción de disociación usando una pRNA-Rz se llevó
a cabo para confirmar que un ARNp podría ser usado con éxito como
una molécula de vehículo para ribozimas.
Las reacciones de disociación se llevaron a cabo
a 37ºC durante 90 minutos en presencia de 20 mM de Tris, de pH 7,5,
150 mM de NaCl y 20 mM de MgCl_{2}. Se realizaron reacciones
testigos reemplazando por agua el ARN omitido. Por ejemplo, un
testigo con Rz no tiene un U7snRNARNA, pero tiene agua para
completar el volumen.
Para la reacción mostrada en la Figura
9(a), las reacciones de disociación usaron 10 pmol de Rz o de
pRNA-Rz para disociar a 15 pmol de U7snRNA. Las
muestras se hicieron pasar luego sobre un gel desnaturalizador de
16% de Page/urea 8 M en TBE. El gel se tiñó con bromuro de etidio y
se visualizó usando un EAGLE EYE II de Stratagene. La Figura
9(a) muestra los resultados satisfactorios de la reacción de
disociación. Se pueden observar los productos de disociación 69 mero
y 25 mero predichos.
Para la reacción mostrada en la Figura
9(b), las reacciones de disociación usaron 48,58 pmol de una
Rz o de una pRNA-Rz para disociar a 97,16 pmol de
U7snRNA Las muestras se hicieron pasar luego sobre un gel
desnaturalizador de 16% de Page/urea 8 M en TBE. El gel se tiñó con
bromuro de etidio y se visualizó usando un EAGLE EYE II de
Stratagene. Se puede observar en la Figura 9(b) el producto
de disociación de 25 bases predicho. El producto de 69 bases
predicho está oculto por el U7snRNA no cortado.
Este experimento confirmó el uso satisfactorio
de un ARNp como una molécula de soporte para ribozimas. El hallazgo
de que la ribozima de cabeza de martillo retiene una actividad en la
construcción artificial de un pRNA-Rz tiene
implicaciones importantes. Un plegamiento independiente de un ARNp
permite manifiesta y ventajosamente que la ribozima se pliegue para
dar la estructura correcta y desarrolle su función de disociar un
ARN diana. Además, puesto que ambos extremos de la ribozima están
conectados con unos ARNp, se espera que el enlace proteja a la
ribozima con respecto de una digestión con una exonucleasa en la
célula. Por lo tanto, la ribozima será estable después de su
expresión en las plantas o animales transgénicos, resolviendo un
problema persistente que había cerrado el paso al uso terapéutico de
las ribozimas.
La hepatitis es una grave enfermedad que está
extendida y predomina en muchos países del mundo. El virus de la
hepatitis B (HBV) es un agente causante de esta enfermedad. El HBV
es un virus de ARN. El genoma de ARN del HBV se usó como diana para
ensayar la funcionalidad de una quimera de un ARNp y una ribozima.
Este trabajo es importante, puesto que proporciona un potencial
para el tratamiento de esta grave enfermedad infecciosa.
La ribozima de cabeza de martillo diseñada por
Feng y colaboradores (Biol. Chem. 382:655-660
(2001) disocia a un substrato HBV-polyA de 137
nucleótidos en dos fragmentos de 70 y 67 nucleótidos
respectivamente. Hemos ensayado dos versiones de esta ribozima: la
RzApRNA, que contenía un resto de ARNp, y la RzA, que no lo
contenía.
contenía.
El ARN del substrato HBV-polyA
se generó por una polimerasa de T7 en una transcripción in
vitro usando un plásmido linealizado como un molde para los
transcritos salientes. Este plásmido fue proporcionado amablemente
por los laboratorios dirigidos por los Profesores Yuan Wang y
Guorong Qi en el Instituto de Bioquímica de Shanghai, Academia
Nacional China de las Ciencias.
Un fragmento de ADNds (bicatenario) que codifica
la quimera de ARNp, RzApRNA, fue producido por una PCR a partir de
un transcrito linealizado. La secuencia se introdujo en un plásmido,
y la RzApRNA fue transcrita por la polimerasa de T7. Este producto
de transcripción RzApRNA se sometió luego a una reacción de
disociación en cis para liberarse por sí mismo de secuencias
flanqueadoras de ARN ajenas. Una "disociación cis" significa
una reacción de disociación en donde tanto la ribozima como el
substrato son partes constituyentes de la misma molécula. Esta
reacción de disociación cis fue realizada por dos ribozimas que
flanqueaban a la secuencia de la quimera. Una ribozima cis estaba
en 5' con respecto a la quimera, mientras que la otra ribozima cis
estaba en 3' con respecto a la quimera. La reacción de disociación
cis se realizó predominantemente durante el tiempo en que se
producía la RzApRNA. El producto del transcrito disociado como cis
era el 188 mero:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción de disociación se realizó a 37ºC
durante 60 minutos en presencia de 20 mM de Tris, de pH 7,5, y de
20 mM de MgCl_{2}. Un RzApRNA (0,539 nmol) se usó para disociar al
HBV-polyA (0,117 nmol). Unas reacciones testigos se
realizaron reemplazando por agua a ciertos ARN. El ARN que había
sido reemplazado por agua se omitió del nombre del testigo. Por
ejemplo, el testigo de RzApRNA no tiene HBV-polyA.
Las muestras fueron dializadas frente a un TE (10 mM de Tris, 1 mM
de EDTA, de pH 8,0) durante 30 minutos en una membrana de Millipore
de 0,025 \mum del tipo VS. Se añadió a las muestras 2x tampón de
carga (8 M de urea, TBE, 0,.08% de azul de bromofenol, 0,08% de
xileno cianol) antes de cargarlas en un gel desnaturalizador de 15%
de PAGE/urea 8 M en TBE (0,09 M de Tris-borato,
0,002 M de EDTA). El gel fue tratado a 100 voltios hasta que el
xileno cianol estuviera a 1,5 cm del fondo del gel. El gel se tiñó
con bromuro de etidio y se visualizó usando el EAGLE EYE II
de
Stratagene.
Stratagene.
La disociación del substrato
HBV-polyA por la quimera funcional RzApRNA se
muestra en la Figura 10. La pista marcada como RzApRNA muestra una
reacción testigo que no contiene el HBV-polyA, y la
pista marcada como HBV-polyA muestra una reacción
testigo que no contiene el RzApRNA. Los productos de disociación de
67 bases y 70 bases predichos, son vistos como una banda para la
reacción de disociación que incluía tanto el
HBV-polyA como el RzApRNA.
La comparación de la eficiencia de disociación
de la ribozima con y sin el vector de ARNp reveló una diferencia
significativa. La ribozima RzApRNA, que contiene un resto de ARNp,
era capaz de disociar al substrato HBV-polyA con
una eficiencia de casi 100%. Sin embargo, la ribozima RzA sin el
resto de ARNp disociaba al substrato con una eficiencia mucho más
baja que 70% (no mostrado).
\newpage
Un plásmido pCRzA se obtuvo del Profesor Guorong
Qi en Shanghai. Este plásmido contiene unas secuencias que
codifican una ribozima de cabeza de martillo que actúa como cis,
flanqueada por dos secuencias que dirigen la señal polyA del virus
de la hepatitis B. Cuando este plásmido fue concomitantemente
transfectado dentro de células HepG2 con el genoma del HBV, se
disminuyó el nivel de ARN de HBV, y la replicación del virus de la
hepatitis B se inhibió de una manera dependiente de la dosis.
Los autores del invento hemos construido un
plásmido pCRzApRNA sustancialmente de acuerdo con el Ejemplo 2. En
el pCRzApRNA, la ribozima de cabeza de martillo y su secuencia
flanqueadora se soportaron y transportaron por el ARNp de phi29,
generando una quimera de ARNp.
La comparación de la eficiencia de ribozimas con
y sin el resto de ARNp (RzApRNA y RzA, respectivamente) está en
realización usando los ensayos descritos en la cita de Feng y
colaboradores (Biol. Chem. 382:655-660
(2001)). Se está usando una transfección concomitante transitoria de
ADN para ensayar la eficiencia intracelular de la ribozima
quimérica. Los resultados de este estudio serán determinados por un
ensayo de transferencia Northern Blot. Se espera plenamente que la
quimera de ARNp RzApRNA mostrará un rendimiento aumentado en
relación con el de la RzA para disminuir los niveles de ARN de HBV
así como para inhibir la replicación de HBV.
El crecimiento y la metástasis de tumores
sólidos requieren una angiogénesis persistente. La angiogénesis es
un importante proceso mediante el cual se forman nuevos vasos
sanguíneos. La proteína lipoxigenasa del tipo 12
(12-LOX) en plaquetas produce el
12-HETE (ácido
12-hidroxi-5,8,10,14-eicosatetraenoico)
añadiendo O_{2} al ácido araquidónico C-12. La
12-LOX y sus metabolitos pueden ser importantes
factores en la angiogénesis de tumores. La aplicación de esta
investigación podría restringir el crecimiento de tumores,
impidiendo que células cancerosas inciten el crecimiento de vasos
sanguíneos en el tejido circundante.
Los estudios in vitro realizados por Liu
y colaboradores, han mostrado que esta ribozima, 12loxRz, disociaba
eficientemente al substrato (Cancer Gene Ther.
7:671-675 (2000)). La eficiencia fue aumentada
cuando se cambió la temperatura de reacción desde 37ºC hasta 50ºC.
Unos estudios in vivo en un cultivo de células mostraron que
las células que expresaban la ribozima a partir de un plásmido
tenían un nivel tan disminuido del ARNm de 12-LOX
que éste era indetectable mediante una transferencia Northern blot.
Un grupo testigo de células, que solamente tenía una ribozima
mutante no funcional, tenía solamente un ligero descenso en el nivel
de ARNm de 12-LOX. Esta ligera reducción en la
expresión del ARNm de 12-LOX podría haber sido el
resultado de un efecto antisentido por la ribozima mutante
meramente por unión al ARNm de 12-LOX sin
disociarlo. El extracto de células fue analizado en cuanto a la
actividad de la enzima 12-LOX. Las células que
expresaban las ribozimas tenían un 13% de la actividad de la enzima
12-LOX después de 6 meses en comparación con células
parentales. Las células que expresaban la ribozima no funcional
mutante tenían un 80% de la actividad de la enzima
12-LOX en comparación con células parentales (Liu y
colaboradores, Cancer Gene Ther., 7:671-675,
2000). Esto demuestra la actividad de la ribozima.
Un ARNm de 12-lipoxigenasa
(12-lox) del tipo de plaquetas (Figura 11) se
seleccionó como una diana para ensayar si una quimera de ribozima
de cabeza de martillo puede actuar para suprimir niveles de ARNm en
células de eritroleucemia humana (HEL). Habíamos obtenido los
plásmidos in vitro e in vivo, que codificaban la
ribozima, del Profesor Tien, Director del Nationa Key Lab of Virus
Research en donde el inventor Peixuan Guo es el Profesor Consejero
y Visitador. La ribozima de cabeza de martillo se introdujo en
nuestro ARNp usando esencialmente el método descrito en el Ejemplo
2. Habíamos creado la ribozima quimérica, 12loxRzpRNA, en primer
lugar construyendo un molde de ADNds en una reacción de PCR de dos
etapas a partir de oligonucleótidos que codifican el promotor de T7
y la 12loxRz introducida en la secuencia de ARNp. Este molde fue
subsiguientemente transcrito para dar el 12loxRzpRNA.
Los experimentos para ensayar la actividad del
12loxRzpRNA se llevarán a cabo. Para los experimentos in
vitro, la 12loxRz y un fragmento de ARN diana del ARNm de
12-lox (el substrato de ARNm) se producen a partir
de oligonucleótidos usando esencialmente el método descrito en el
Ejemplo 2. La 12loxRz y el ARN de substrato se transcriben en cada
caso a partir de su propio conjunto de dos oligonucleótidos de ADN
hibridados. Uno de ellos codifica el promotor de la polimerasa T7
en sentido negativo y la secuencia del substrato o la secuencia de
12loxRz. El otro oligonucleótido codifica la secuencia del promotor
de T7 en sentido positivo. El substrato de ARN es marcado
radiológicamente usando una fosfatasa de intestino de ternero (CIP)
y luego una polinucleótido cinasa (PNK) con
[\gamma^{32}P]-ATP.
La eficiencia de disociación de dos ribozimas
con y sin el resto de ARNp será evaluada tanto in vitro como
con células (cultivo de células). Para el estudio in vitro,
nosotros compararemos la estabilidad de la resistencia de ribozimas
al pH, a la concentración de iones, a la RNasa y al material lisado
celular. Éstos son factores que afectan a la estabilidad de la
ribozima y a la función en la célula.
Las células HEL que expresan la
12-lox serán usadas para los experimentos en cultivo
de células. Una secuencia casete de expresión vacía o el
12loxRzpRNA en una secuencia casete de expresión que codifica el
promotor de ARNt^{val}, la quimera de 12loxRzpRNA, y la secuencia
terminadora de la polimerasa III de eucariotas (residuos de 5 T)
serán suministradas por transfección usando una electroporación. La
expresión de la quimera de 12loxRzpRNA y del ARNm de
12-lox en las células será detectada por una
transferencia Northern blot. Las células HEL no transfectadas serán
usadas como un testigo. La actividad de la enzima
12-LOX será evaluada mediante la determinación de
si hay una reducción en la producción de 12-HETE en
células HEL.
Para los experimentos tanto in vitro como
de cultivo de células, se usarán una 12loxRz mutante y un testigo
de quimera de 12loxRzpRNA mutante como un segundo testigo. La
12loxRz mutante tiene reemplazado por otra base uno de sus
nucleótidos en su dominio del núcleo catalítico conservado, haciendo
que la ribozima sea incapaz de disociar al ARN de substrato. El uso
de las ribozimas mutantes no catalíticas como un segundo testigo
está diseñado para revelar si la ribozima natural es capaz de
inhibir la traducción por unión al substrato de ARN (es decir, un
efecto antisentido), en vez de disociarlo.
- 1
- nombre del organismo: Bacteriófago phi29/PZA
- 2
- ARNp permutado circularmente procedente del bacteriófago phi29
- 3
- quimera de ARN que contiene el ARNp de phi29 y una ribozima de cabeza de martillo
- 4
- substrato de U7snRNA
- 5
- ribozima anti-12-Lox
- 6
- ARN de substrato
- 7
- quimera de ARNp
- 8
- bucle enlazador
- 9
- substrato de U7
- 10
- ribozima de cabeza de martillo
- 11
- nombre del organismo: Bacteriófago SF5'
- 12
- nombre del organismo: Bacteriófago B103
- 13
- (no usado)
- 14
- nombre del organismo: Bacteriófago M2/NF
- 15
- nombre del organismo: Bacteriófago GA1
- 16
- aptpRNA
- 17
- pRzApRNA
<110> GUO, Peixuan
\hskip1cmHOEPRICH, Stephen M
\hskip1cmSHU, Dan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> QUIMERA DE ARNp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-00042.P1.us
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Sin asignar
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
23-08-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/227.393
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-08-2000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago phi29/PZA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARNp permutado circularmente
procedente del bacteriófago phi29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 167
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de ARNp que contiene el ARNp
de phi29 y una ribozima de cabeza de martillo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Substrato de U7snRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipguguuacagc ucuuuuagaa uuug
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ribozima
anti-12-Lox
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgcgguugu accugaugag uccgugagga cgaaacccgg agaaga
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ARN de substrato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipucuucuccgg gucguacaac cgcgu
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Quimera de ARNp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7)..(11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (26)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> región espaciadora
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica diversa
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (51)..(54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier nucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> bucle enlazador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactata
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Substrato de U7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Ribozima de cabeza de martillo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggcaaauucu aaaacugaug aguccgugag gacgaaagcu guaacac
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 116
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago SF5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 121
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago B103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 0
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> (no usado)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 120
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago M2/NF
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacteriófago GA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 124
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> aptpRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> pRzApRNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (25)
1. Una quimera de ARNp que comprende:
- (a)
- una región de ARNp; y
- (b)
- una región espaciadora que comprende un ARN biológicamente activo, estando la región espaciadora enlazada covalentemente en sus extremos 5' y 3' con la región de ARNp;
en donde la región de ARNp comprende:
- (i)
- en la dirección de 5' a 3', comenzando en el enlace covalente del ARNp con el extremo 3' de la región espaciadora,
- un primer bucle (22);
- un segundo bucle (24); y
- una estructura de bucle y tronco inferior que comprende un pandeo (25), una primera sección de tronco (26) y un tercer bucle (27);
- (ii)
- una segunda sección de tronco (20) interpuesta entre la región espaciadora y la estructura de bucle y tronco;
- (iii)
- una tercera sección de tronco (21) interpuesta entre la estructura de bucle y tronco y el primer bucle (22);
- (iv)
- una cuarta sección de tronco (23) interpuesta entre el primer bucle (22) y el segundo bucle (24); y
- (v)
- una abertura que define los extremos 5' y 3' de la quimera de ARNp.
2. La quimera de ARNp de la reivindicación 1, en
la que la región de ARNp comprende un ARNp permutado circularmente
de un bacteriófago seleccionado entre el grupo que consiste en los
bacteriófagos \phi29, SF5', B103, PZA, M2, NF y GA1.
3. La quimera de ARNp de la reivindicación 1 ó
2, en la que el ARN biológicamente activo se selecciona entre el
grupo que consiste en una ribozima y un ARN antisentido.
4. La quimera de ARNp de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en la que la región espaciadora comprende un
ARN biológicamente activo que comprende una ribozima y unas primeras
y segundas sartas de nucleótidos interpuestas entre la ribozima y la
región de ARNp.
5. Una molécula de ADN que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica una quimera de ARNp de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Un método in vitro para producir una
quimera de ARNp, que comprende transcribir el ADN de la
reivindicación 5 para proporcionar la quimera de ARNp.
7. Un método para producir una quimera de ARNp,
que comprende transcribir el ADN de la reivindicación 5 en una
célula que no es animal para proporcionar la quimera de ARNp.
8. El método de la reivindicación 6 ó 7, en el
que la transcripción se realiza en una célula presente en un cultivo
de células o en una célula explantada de un organismo.
9. El método de la reivindicación 7, en el que
la transcripción se realiza en una célula presente en un
organismo.
10. El método de la reivindicación 8, en el que
la transcripción se realiza in vitro, y el método comprende
además usar una reacción en cadena de la polimerasa en un molde de
ADN para generar el ADN que codifica la quimera de ARNp.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, que comprende además generar el ADN que
codifica la quimera de ARNp clonando el ADN en un plásmido y
replicando el plásmido.
12. Un método para determinar si una molécula de
ARN interactúa con una molécula de ensayo, comprendiendo el
método:
proporcionar una quimera de ARNp de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una
región de ARNp que flanquea a una región espaciadora que comprende
la molécula de ARN;
inmovilizar a la quimera de ARNp sobre un
substrato;
poner en contacto la quimera de ARNp
inmovilizada con una molécula de ensayo; y
detectar si la molécula de ensayo interactúa con
la molécula de ARN.
13. Un método in vitro para suministrar
un ARN biológicamente activo a una célula, que comprende introducir
en la célula una quimera de ARNp de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4.
14. Un método para suministrar un ARN
biológicamente activo a una célula que no es animal, que comprende
introducir en la célula una quimera de ARNp de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
15. El método de la reivindicación 14, en el que
la célula está presente en un organismo.
16. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en el que la introducción de la quimera de
ARNp en la célula comprende:
transfectar la célula con una molécula de ADN
que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
operativamente la quimera de ARNp y
causar una transcripción de la molécula de ADN
en la célula para proporcionar el ARN biológicamente activo.
17. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 15, en el que la quimera de ARNp es
transfectada directamente dentro de la célula.
18. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 13, 14, 16 y 17, en el que la célula está presente
en un cultivo de células, o es explantada a partir de un
organismo.
19. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 18, en el que la célula es una célula vegetal,
o de las reivindicaciones 13 ó 16 a 18, en el que la célula es una
célula animal.
20. La quimera de ARNp de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para su uso en la terapia o para su uso en
el suministro de un ARN biológicamente activo a una célula.
21. La molécula de ADN de la reivindicación 5,
para su uso en la terapia o para su uso en la producción de una
quimera de ARNp como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
22. Uso de la quimera de ARNp de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en la producción de un medicamento
para el tratamiento de un cáncer o de una infección con
patógenos.
23. Uso de una molécula de ADN de la
reivindicación 5, en la producción de un medicamento para el
tratamiento de un cáncer o de una infección con patógenos.
24. Una composición farmacéutica que comprende
la quimera de ARNp de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
para el suministro de un ARN biológicamente activo a una célula.
25. Una composición farmacéutica que comprende
la molécula de ADN de la reivindicación 5, para su uso en la
producción de una quimera de ARNp como se ha definido en una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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