CN109071591A - 新的pRNA三向接合 - Google Patents

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CN109071591A CN201780026258.0A CN201780026258A CN109071591A CN 109071591 A CN109071591 A CN 109071591A CN 201780026258 A CN201780026258 A CN 201780026258A CN 109071591 A CN109071591 A CN 109071591A
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阿利萨·C·希尔
S.J.施勒德
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Abstract

描述了源自phi29、M2、SF5和GA1 pRNA并具有高稳定性的三向接合(3WJ) RNA支架。pRNA 3WJ支架可用于形成为治疗和/或诊断功能而递送活性剂的化合物、缀合物、组合物和纳米颗粒。

Description

新的pRNA三向接合
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月26日提交的美国临时申请号62/300,517的优先权，其明确地通过引用以其整体结合到本文中。
政府资助
本发明在由美国国家科学基金会(National Science Foundation)授予的资助号2012174160和0844913的政府资助下完成。政府对本发明具有一定权利。
背景
之前的研究已经证明，包装(或前头)核糖核酸(pRNA)三向接合(3WJ)基序在生物技术中具有应用，例如靶向人免疫缺陷病毒(HIV)和癌症。例如，phi29噬菌体pRNA 3WJ纳米基序已被广泛研究，和在具有例如癌症靶向功能的纳米结构的合理设计中成功地用作结构单元(例如参见美国专利9,297,013 B2)。
附图简述
本公开内容的数个实施方案在附图中藉此说明。然而应注意，附图仅说明了数个实施方案，因此不意图视为限制本公开内容的范围。
图1A描述了前头或包装RNA (pRNA)的球棍模型，其中球代表环和棍代表螺旋。中央的三向接合(3WJ)部分，其不包括A、CE和D凸起，在盒内呈现。3WJ可从以近似等摩尔浓度混合的三个单一RNA寡核苷酸链(表示为3WJa、3WJb和3WJc)装配。pRNA 3WJ纳米基序插入物包含链3WJa、3WJb和3WJc，它们根据Watson-Crick碱基配对进行碱基配对，除了某些不配对核苷酸之外；
图1B表明当碱基配对为3WJ构建体时，每个3WJa、3WJb和3WJc寡核苷酸链的5’-3’方向；
图2显示phi29和GA1 pRNA 3WJ构建体的一级和二级结构。不形成Watson-Crick碱基对的核苷酸显示为单碱基。phi29构建体包含SEQ ID NO:1-3。GA1构建体包含SEQ ID NO:4-6；
图3显示SF5和M2 pRNA 3WJ构建体的一级和二级结构。不形成Watson-Crick碱基对的核苷酸显示为单碱基。SF5构建体包含SEQ ID NO:7-9。M2构建体包含SEQ ID NO:10-12；
图4A显示以31.2 µM收集的图2的phi29 3WJ构建体的非线性解链曲线拟合(R2 >0.99)，表明急剧的协作转变。数据点以6/s的速率收集，加热速率为1℃/min；
图4B是phi29 3WJ解链数据(R2 > 0.99)的van’t Hoff曲线图，其中斜率是–∆H/R和y-截距是∆S/R。数据使用Marquardt-Levenberg方法在Meltwin中拟合；
图5A显示使用RNA Structure、RNAfold、mfold和RNAsoft预测的以及实验测量的各种pRNA 3WJ构建体(母体phi29、GA1、SF5、M2)的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大。*由于计算机运行时间限制，RNAsoft未输出对于GA1 pRNA 3WJ的二级结构自由能；
图5B显示使用RNA Structure、RNAfold、mfold和RNAsoft预测的以及实验测量的各种phi29 pRNA 3WJ突变体构建体的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大；
图6A比较使用图5A-5B的程序预测的和实验测量的各种pRNA 3WJ (phi29、GA1、SF5、M2)的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大。*由于计算机运行时间限制，RNAsoft未输出GA1 pRNA 3WJ的二级结构自由能；
图6B比较使用图5A-5B的程序预测的和实验测量的各种phi29 pRNA突变体3WJ的热力学稳定性。-△G越大表明稳定性越大；
图7显示金属离子对四种pRNA 3WJ构建体的影响。在100 mM Na+和10 mM Mg2+中GA13WJ的光学解链不满足≥ 0.90的van’t Hoff曲线线性拟合度截止标准；
图8显示50 bp梯(泳道i和viii)、phi29链3WJa (泳道ii)、phi29链3WJa + 3WJb (泳道iii)、phi29 3WJ构建体(泳道iv)、GA1 3WJ构建体(泳道v)、SF5 3WJ构建体(泳道vi)、M23WJ构建体(泳道vii)、phi29∆U29构建体(泳道ix)、phi29∆U29/∆U72构建体(泳道x)、phi29∆U29/∆U72-73构建体(泳道xi)、phi29∆U29/∆U72-73-74构建体(泳道xii)、phi29∆U72构建体(泳道xiii)、phi29∆U72-73构建体(泳道xiv)和phi29∆U72-73-74构建体(泳道xv)的凝胶迁移率。在标准解链缓冲液(1 M氯化钠、10 mM二甲胂酸钠、0.5 mM EDTA、pH 7)中进行装配以证实在光学解链条件下3WJ构建体的形成。Phi29链3WJa (泳道ii)和链3WJa + 3WJb (泳道iii)作为参考包括在内。所有3WJ构建体以近似相同的速率运行；
图9显示使用由(A) Gu和Schroeder (Gu X, Schroeder S. 2011. Differentsequences show similar quaternary interaction stabilities in prohead viralRNA self-assembly. Journal of Biological Chemistry286: 14419-14426)和(B) Hao和Kieft (Hao Y, Kieft JS. 2014. Diverse self-association properties within afamily of phage packaging RNAs. RNA20: 1-16)报道的序列的Nearest NeighborDatabase计算的联锁环稳定性提供的实验3WJ数据。提供每个pRNA的联锁环序列。确定在1M氯化钠中的RNA的实验稳定性数据和计算稳定性数据二者；
图10A显示在10-分钟暴露于100-倍稀释的人血清后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2% (w/v)琼脂糖中10 μM装配3WJ构建体的凝胶迁移率。所有反应在37°C进行。泳道(i)50 bp DNA梯、(ii) 在标准解链缓冲液中的phi29 3WJ构建体 + 1个单位RNA酶T1(阳性降解对照)、(iii) phi29 3WJ构建体、(iv) GA1 3WJ构建体、(v) SF5 3WJ构建体、(vi) M23WJ构建体、(vii) phi29∆U29/∆U72-73 3WJ构建体、(viii) phi29∆U29/∆U72-73-74 3WJ构建体；
图10B显示在10-分钟暴露于来自第二血液供体的100-倍稀释的人血清后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2% (w/v)琼脂糖中10 μM装配3WJ构建体的另外的凝胶迁移率结果。所有反应在37°C进行。泳道(i) 50 bp DNA梯、(ii) 在标准解链缓冲液中的phi29 3WJ构建体(阴性降解对照)、(iii) phi29 3WJ构建体、(iv) M2 3WJ构建体、(v) SF5 3WJ构建体、(vi) SF5∆G31 3WJ构建体、(vii) SF5∆G69 3WJ构建体、(viii) SF5∆G31/∆G69 3WJ构建体；
图11显示在暴露于1000-倍稀释的人血清中10分钟、30分钟和1小时后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2% (w/v)琼脂糖中10 μM phi29、SF5和M2装配的3WJ构建体的凝胶迁移率的比较。所有反应在37°C进行。泳道(i) 50 bp DNA梯、(ii) 在标准解链缓冲液(1 M氯化钠、10 mM二甲胂酸钠、0.5 EDTA、pH 7)中1小时的3WJ构建体(阴性降解对照)、(iii) 在1000-倍稀释的血清中10分钟的3WJ构建体、(iv) 在1000-倍稀释的血清中30分钟的3WJ构建体、(v) 在1000-倍稀释的血清中1小时的3WJ构建体；
图12描述了根据本公开内容的突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图13描述了根据本公开内容的备选突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73-74)；
图14描述了源自野生型M2的在位置36、37和79处具有不配对核苷酸的pRNA 3WJ构建体；
图15描述了根据本公开内容的截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图16描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图17描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图18描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图19描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图20描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图21描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图22描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图23描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图24描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图25描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图26描述了根据本公开内容的备选截短突变体phi29 pRNA 3WJ构建体(phi29∆U29/∆U72-73)；
图27描述了根据本公开内容的突变体M2 pRNA 3WJ构建体(M2∆A36U37/A79)；
图28描述了根据本公开内容的截短突变体M2 pRNA 3WJ构建体(M2∆A36U37/A79)；
图29描述了根据本公开内容的备选截短突变体M2 pRNA 3WJ构建体(M2∆A36U37/A79)；
图30描述了根据本公开内容的备选截短突变体M2 pRNA 3WJ构建体(M2∆A36U37/A79)；
图31描述了根据本公开内容的备选截短突变体M2 pRNA 3WJ构建体(M2∆A36U37/A79)；
图32描述了根据本公开内容的突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31)；
图33描述了根据本公开内容的截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31)；
图34描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31)；
图35描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31)；
图36描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31)；
图37描述了根据本公开内容的突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G69)；
图38描述了根据本公开内容的截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G69)；
图39描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G69)；
图40描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G69)；
图41描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G69)；
图42描述了根据本公开内容的突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31/∆G69)；
图43描述了根据本公开内容的截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31/∆G69)；
图44描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31/∆G69)；
图45描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31/∆G69)；
图46描述了根据本公开内容的备选截短突变体SF5 pRNA 3WJ构建体(SF5∆G31/∆G69)；
图47描述了根据本公开内容的GA1 pRNA 3WJ构建体；
图48描述了根据本公开内容的通用突变体phi29 pRNA 3WJ构建体。W和C代表配对的核苷酸和在3WJb链中的N代表不配对核苷酸；
图49描述了根据本公开内容的通用突变体phi29 pRNA 3WJ构建体。W和C代表配对的核苷酸和在3WJc链中的N代表不配对核苷酸；
图50描述了根据本公开内容的通用突变体M2 pRNA 3WJ构建体。W和C代表配对的核苷酸和在3WJa、3WJb和3WJc链中的N代表不配对核苷酸；
图51描述了根据本公开内容的通用突变体SF5 pRNA 3WJ构建体。W和C代表配对的核苷酸和在3WJa和3WJb链中的N代表不配对核苷酸；
图52描述了根据本公开内容的通用突变体SF5 pRNA 3WJ构建体。W和C代表配对的核苷酸和在3WJb链中的N代表不配对核苷酸；
图53描述了根据本公开内容的通用突变体SF5 pRNA 3WJ构建体。W和C代表配对的核苷酸和在3WJa和3WJb链中的N代表不配对核苷酸；和
图54描述了根据本公开内容的通用突变体GA1 pRNA 3WJ构建体。W和C代表配对的核苷酸和在3WJa和3WJc链中的N代表不配对核苷酸。
详细描述
在合理设计诊断剂和治疗剂中使用RNA纳米基序例如pRNA 3WJ作为结构单元的一个障碍是它们特有的低稳定性。本文公开了新的三叉pRNA 3WJ基序和它们用于构建化合物的方法，其可用于治疗应用和生物技术应用，包括但不限于治疗性递送、诊断疾病、促进RNA结晶或产生稳定的RNA适体。该新的3WJ的稳定性有助于pRNA的自装配性质。因此，本文公开的pRNA 3WJ基序指示用于基于pRNA的纳米技术的新支架。
使用为UV光学解链而设计的三组分RNA系统，测量了11种pRNA 3WJ (包括7种突变的phi29 pRNA 3WJ)的热力学参数。下文进一步论述的结果表明本文所述的某些3WJ例如GA1、SF5和M2 pRNA 3WJ具有比在基于RNA的纳米技术中通常用作支架的母体phi29 pRNA3WJ更大的热力学稳定性。此外，相对于母体phi29 pRNA 3WJ，在phi29 pRNA 3WJ中的某些缺失显示增加其稳定性。此外，金属离子显示对pRNA 3WJ具有差别的稳定影响。
在通过示例性描述、实施例和结果的方式进一步更详细描述本公开内容的三叉pRNA 3WJ构建体、纳米颗粒、化合物、组合物和方法的各个实施方案之前，应理解本公开内容的构建体、纳米颗粒、化合物、组合物和方法在应用中不限于随后的描述中阐明的特定实施方案和实施例的细节。本文提供的描述仅旨在说明的目的，和不旨在以限制性含义解释。因此，意欲给予本文使用的语言最广泛的可能范围和含义；和实施方案和实施例意指是示例性的，而非穷举的。还应理解，本文使用的措词和术语为描述的目的，和不应视为限制性的，除非另外如此指示。此外，在随后的详细描述中，为提供本公开内容的更全面理解而阐明许多特定的细节。然而，对于本领域普通技术人员将显而易见的是，本公开内容可在无需这些特定的细节的情况下实施。在其它情况下，未详细描述本领域普通技术人员众所周知的特征以避免不必要的描述复杂化。预期对于本领域普通技术人员显而易见的所有备选方案、替换、修饰和等同方案包括在本公开内容的范围内。根据本公开内容，可进行和执行本文公开的所有构建体、纳米颗粒、化合物、组合物和其生产和应用和使用方法，而无需过度实验。因此，尽管本公开内容的构建体、纳米颗粒、化合物、组合物和方法已根据具体的实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在未脱离本发明概念的构思、精神和范围的情况下，可对本文所述的构建体、纳米颗粒、化合物、组合物和/或方法和在步骤中或在方法步骤的顺序中应用变化。
在说明书中提及的或在本申请的任何部分中引用的所有专利、公布的专利申请和非专利出版物，包括美国专利9,297,013、美国专利8,088,912和美国临时专利申请号62/300,517，通过引用以其整体明确地结合到本文中，至如同每个单独的专利或出版物明确和单独地被指示通过引用并入的相同程度。
除非本文另外定义，结合本公开内容使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数，和复数术语应包括单数。在本文中使用时，特定术语“单一”仅限于“一个”。
根据本公开内容的方法、化合物和组合物使用时，除非另外指示，以下术语应理解为具有以下含义：
当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，词语“a”或“an”的使用可意指“一个”，但其也符合“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义。在权利要求书中术语“或”的使用用于指“和/或”，除非明确表明仅指可选方案或当可选方案相互排他时，尽管本公开内容支持仅指可选方案的定义和“和/或”。术语“至少一个”的使用将理解为包括一个以及超过一个的任何量，包括但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100或其中包括的任何整数。术语“至少一个”可延伸至100或1000或更多，取决于其所连接的术语；此外，100/1000的量不应视为是限制性的，因为更高的极限也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z的至少一个”的使用将理解为包括仅X、仅Y和仅Z，以及X、Y和Z的任何组合。
如本文使用的，所有数值或范围包括所述值的分数和在这样的范围内的整数和在这样的范围内的整数的分数，除非上下文明确另外指示。因此，为举例说明，提及数值范围例如1-10，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等，等等。提及范围1-50因此包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等，直至和包括50，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5等、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5等，等等。提及一系列范围包括组合该系列内不同范围的边界的值的范围。因此，为举例说明，提及一系列范围，例如1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000，包括例如范围1-20、10-50、50-100、100-500和500-1,000。
如本说明书和权利要求书中使用的，词语“包含(comprising)” (和包含的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)” (和具有的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)” (和包括的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)” (和含有的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的，和不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
本文使用的术语“或其组合”是指该术语之前所列举的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意图包括以下的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，和如果在特定情况下顺序是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括包含一个或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员将理解，在任何组合中对项目或术语的数量通常没有限制，除非根据上下文另外显而易见。
在本申请全文中，术语“约”用于表示值包括对于组合物、用于给予组合物的方法的固有误差变化，或在研究对象中存在的变化。如本文使用的，限定词“约”或“近似”不仅意图包括准确的值、量、程度、方向或其它合格的特征或值，而且意图包括由于例如测量误差、制造公差、在各个部分或部件上施加的应力、观察者误差、消耗和磨损以及其组合导致的一些略微的变化。术语“约”或“近似”在本文使用时，当涉及可测量的值例如量、持续时间等，意指包括例如从指定值± 20%、或± 10%、或 ± 5%、或± 1%、或± 0.1%的变化，因为这样的变化适合于进行所公开的方法，并且如本领域普通技术人员所理解的。如本文使用的，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况完全发生，或随后描述的事件或情况在很大限度或程度上发生。例如，术语“基本上”意指随后描述的事件或情况发生至少90%的时间、或至少95%的时间、或至少98%的时间。
如本文使用的，对“一个实施方案”或“实施方案”的任何提及意指结合实施方案描述的特定要素、特征、结构或特性被包括在至少一个实施方案中和可包括在其它实施方案中。在说明书的各个位置出现词语“在一个实施方案中”不必然全部是指相同的实施方案和不必然限于单个或特定的实施方案。
术语“药学上可接受的”是指适合给予人和/或动物，没有过度不良副作用例如毒性、刺激性和/或过敏反应，与合理的收益/风险比相称的化合物和组合物。本公开内容的化合物或缀合物可与一种或多种药学上可接受的赋形剂(包括载体、媒介和稀释剂)组合，所述赋形剂可改进化合物或其缀合物的溶解度、可递送性、分散、稳定性和/或构象完整性。
所谓的“生物学活性”是指活性剂改进生物体的生理系统的能力，不涉及活性剂如何产生其生理效果。
如本文使用的，“纯的”或“基本上纯的”意指目标物类是存在的主要物类(即，在质量基础上，它比其组合物中的任何其它目标物类更丰富)，和特别地，基本上纯化的部分是其中目标物类占存在的所有大分子物类的至少约50%(在质量基础上)的组合物。一般而言，基本上纯的组合物将占组合物中存在的所有大分子物类的超过约80%、更特别是超过约85%、超过约90%、超过约95%、或超过约99%。术语“纯的”或“基本上纯的”还指这样的制剂，其中目标物类是至少60% (w/w)纯的、或至少70% (w/w)纯的、或至少75% (w/w)纯的、或至少80% (w/w)纯的、或至少85% (w/w)纯的、或至少90% (w/w)纯的、或至少92% (w/w)纯的、或至少95% (w/w)纯的、或至少96% (w/w)纯的、或至少97% (w/w)纯的、或至少98% (w/w)纯的、或至少99% (w/w)纯的、或100% (w/w)纯的。
在该术语的范围和含义内动物的非限制性实例包括狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠、栗鼠、马、山羊、牛、绵羊、动物园动物、旧世界和新世界猴、非人灵长类动物和人。
“治疗”是指治疗性治疗。“预防”是指预防性或防治性治疗措施或减少病况或疾病的发生。术语“治疗”是指为治疗目的和/或为预防而给予受试者组合物。
术语“治疗组合物”和“药物组合物”是指含活性剂的组合物，其可通过本领域已知的或本文以其他方式考虑的任何方法给予受试者，其中给予组合物产生本文他处所述的治疗效果。此外，本公开内容的组合物可使用本领域众所周知的制剂技术，经设计以提供延迟、控制、延长和/或持续的释放。
术语“有效量”是指当以本公开内容的方式使用时，足以在受试者中显示可检测的治疗性或治疗效果，没有过度不良副作用(例如明显的毒性、刺激性和过敏反应)，与合理的收益/风险比相称的活性剂的量。对于受试者的有效量将取决于受试者的类型、大小和健康，待治疗的病况的性质和严重性，给药方法，治疗持续时间，并行疗法(如果有的话)的性质、使用的特定制剂等。因此，提前规定准确的有效量是不可能的。然而，对于给定情况的有效量可根据本文提供的信息，使用常规实验，由本领域普通技术人员确定。
术语“改善”意指受试者的病况、疾病或其症状的可检测或可测量的改进。可检测或可测量的改进包括病况或疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间的主观或客观的降低、减少、抑制、压抑、限制或控制，或疾病的症状或潜在原因或结果的改善，或疾病的逆转。成功的治疗结果可在受试者中导致改善、降低、减少、抑制、压抑、限制、控制或预防疾病或病况的发生、频率、严重性、进展或持续时间，或疾病或病况的结果的“治疗效果”或“益处”。
恶化的减少或降低，例如稳定病况或疾病，也是一种成功的治疗结果。因此，治疗益处不需要是完全消除或逆转疾病或病况，或与疾病或病况有关的任何一个、大多数或所有不良症状、并发症、结果或潜在原因。因此，当在短或长的持续时间内(数小时、数天、数周、数月等)存在发生、频率、严重性、进展或持续时间的逐渐改进，例如部分降低、减少、抑制、压抑、限制、控制或预防，或病况或疾病的抑制或逆转(例如，稳定)时，可以达到令人满意的终点。方法或用途(例如提供病况或疾病的潜在治疗益处或改进的治疗)的有效性可通过各种方法和试验测定法确定。
在本文使用时，术语“三向接合” (“3WJ”)或“三叉”支架(或结构域)是指从三个RNA序列装配的pRNA构建体。pRNA 3WJ从三个(5’→ 3’) RNA链(称为3WJa、3WJb和3WJc，如图1所示)构建，它们当以等摩尔浓度混合时进行碱基配对。更具体地，称为3WJa的第一(5’→ 3’) RNA寡核苷酸序列、称为3WJb的第二(5’→ 3’) RNA寡核苷酸序列和称为3WJc的第三(5’→ 3’) RNA寡核苷酸序列经组合和碱基配对，以形成三叉pRNA 3WJ，其中3WJ结构域的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，3WJ结构域的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，和3WJ结构域的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，其中所述第一、第二和第三分支各自包含具有多个RNA核苷酸对的螺旋区，所述多个RNA核苷酸对形成标准的Watson-Crick键。本公开内容的3WJ的一个、两个和/或三个分支也可包括非Watson-Crick核苷酸对，例如但不限于G-U。
在某些非限制性实施方案中，本公开内容的pRNA 3WJ支架的3WJa、3WJb和3WJc寡核苷酸序列可各自独立地包含8-36个核苷酸(例如，8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个核苷酸)，其不包括RNA接头或与pRNA 3WJ支架缀合的生物学活性部分的RNA部分。
在本公开内容全文中，提及突变体构建体时，包括“∆”的下标代表在突变体中已被缺失的相应野生型pRNA的核苷酸位置。术语“结构域”可用于替换“构建体”。术语“下游”当提及寡核苷酸序列而使用时，是指朝向序列的3’端的方向，和“上游”是指朝向序列的5’端的方向。
对某些本文公开的phi29 pRNA 3WJ缺失突变体构建体、M2 pRNA 3WJ缺失突变体构建体和SF5 pRNA 3WJ缺失突变体构建体的生物物理学研究显示，它们相对于野生型(WT)phi29 pRNA的3WJ部分(在本文中亦称为“母体”)的稳定性提高。因此，所述的缺失突变体构建体可用作对利用WT phi29 pRNA 3WJ母体作为多价的纳米级递送系统的结构单元的当前技术的更稳健的备选方案。本公开的新的pRNA 3WJ构建体由于其比当前使用的技术、例如之前指示的WT phi29 pRNA 3WJ基序提高的稳定性，具有作为改进的药物递送支架的至少一种用途。使用本文公开的稳定性提高的phi29 pRNA 3WJ缺失突变体或本文公开的M2、SF5或GA1 pRNA 3WJ设计的功能性RNA包括但不限于：携带各种治疗性、靶向性或诊断性分子(包括但不限于siRNA、核酶、核糖开关(riboswitch)、适体和反义RNA)的治疗性递送媒介，和用于连接这样的治疗性、靶向性或诊断性分子的接头，例如但不限于美国专利9,297,013B2中所示的那些。野生型phi29、SF5、M2和GA1 pRNA的完整序列显示于美国专利8,088,912。
例如，在非限制性实施方案中，与3WJ支架功能(共价)连接的siRNA螺旋可包含10-30、15-27或20-25个核苷酸，和通过称为RISC (RNA-诱导的沉默复合物)的蛋白/RNA复合物切割mRNA干扰基因表达，如也在上文论述的。siRNA特异性地(例如，相对于不相关结构的合适对照，具有统计学显著性)抑制靶蛋白的表达，所述靶蛋白的mRNA包括与siRNA的有义链相同的序列。
在非限制性实施方案中，核酶可包含具有酶促活性的RNA分子。通过截断和切割RNA底物、例如含有与核酶的催化中心互补的序列的mRNA或病毒基因组RNA，核酶具有显著的治疗潜力和可能够调节基因功能。
在非限制性实施方案中，RNA适体可以是在其通过形成结合袋而特异性识别配体(例如，有机化合物、核苷酸或肽)的能力方面具有类似于抗体的功能的寡核苷酸家族的成员。通过指数富集的配体系统进化(SELEX)是一种用于从体外开发的随机化RNA库筛选具有所需的结合特异性的适体的方法。使用该技术，可选择用于靶向与疾病有关的标记物的各种适体。
在非限制性实施方案中，核糖开关可包括结合小分子和控制基因表达的RNA元件。作为一种生物学控制机制，核糖开关可识别代谢物，诱导mRNA转录的过早终止，阻断核糖体翻译mRNA，切割mRNA，甚至触发mRNA破坏。
在非限制性实施方案中，这样的RNA部分，包括siRNA、核酶、反义RNA、适体和核糖开关以及其它催化或编辑RNA，根据公认的方法可容易地与3WJ支架融合或缀合，以提供用于装配RNA纳米颗粒的模块系统。本文公开的化合物、组合物和方法(例如用于RNA纳米药物)的优点包括以下属性：自装配、高物理化学和生理稳定性、多价、靶向递送、无蛋白(包括与无免疫原性、无炎性、无毒、不引发淋巴因子、趋化因子或细胞因子反应例如干扰素反应有关的优点)、纳米级尺寸、确定结构和立体化学的受控合成、将治疗和疗效检测组合到一个颗粒中。
在非限制性实施方案中，3WJ支架的每个分支可单独地被功能化以携带不同的治疗有效负荷、报告子和/或靶向配体，从而形成多价化合物。靶向的化合物使得细胞类型特异性递送成为可能，导致给予较低浓度的药物，因此减少副作用。多价方法允许某些实施方案包含治疗剂的混合物(例如，通过可装配成本文装配的3WJ纳米颗粒复合物的不同亚单位递送的不同药物)，从而产生协同效果。在这些和/或其它预期的实施方案中多价提供另外的优点，其允许治疗与疗效检测一起，组合到以单次给予引入的一个纳米颗粒中。
在非限制性实施方案中，包含本文公开的3WJ支架的RNA纳米颗粒的尺寸通常和有利地可以在纳米级。在非限制性实施方案中，范围为10-50 nm的颗粒是合适的，因为它们足够大而能被身体保留，但足够小而能通过细胞表面受体介导的胞吞作用来穿过细胞膜。本文描述的纳米颗粒递送因此改进治疗剂和/或诊断剂的药代动力学、药效学、生物分布和安全性。另外，本文公开的治疗性化合物的无蛋白性质导致这些纳米颗粒是基本上无免疫原性的；通过避免在接受者中诱导抗体，这些实施方案允许安全地重复给予纳米颗粒以治疗慢性疾病，包括癌症、病毒感染和遗传疾病。
在非限制性实施方案中，两个或三个或甚至更多个RNA纳米结构结构域(例如，相似或不同的结构域，例如含生物学活性部分或其它功能性结构域，例如siRNA、分子靶向部分、核酶、反义RNA和适体)可共价连接至本文公开的3WJ支架。
实验
材料和方法
pRNA 3WJ构建体设计
pRNA 3WJ可从以近似等摩尔浓度混合的三种RNA寡聚体装配。在本研究中研究的pRNA构建体从称为3WJa、3WJb和3WJc的三个RNA链装配(图1A-B)。构建体经设计以包含折叠pRNA的中央3WJ区域，其不包括A、CE和D凸起(图1A)，以形成具有近似相同自由能的三个螺旋。本文利用的pRNA 3WJ构建体在3WJ “核心”处保留与野生型的基本序列同一性，并且在某些构建体中包括远离3WJ “核心”的变化(例如，图2-3)，以确保对于每个分支的螺旋形成的自由能在0.1 kcal/mol内。对于每个3WJ构建体的三个寡核苷酸序列显示于表1。对于每个分支双链体预测的自由能包括假定两条链独立汇合的螺旋起始项。这是在形成的第三分支中螺旋形成的罚分的过高估计，因为该分支不应在3WJ中具有相同的熵罚分。因此，下文(例如，表2)显示的计算的3WJ自由能实际上低估了3WJ的稳定性。寡核苷酸购自Integrated DNATechnologies (IDT)和根据生产商的说明书准备。纯度通过32P标记和凝胶电泳证实为>95%。
表1. 对于测试的每个pRNA构建体的组分3WJa、3WJb和3WJc RNA序列(图5A、5B、6A和6B)。在3WJ构建体中不配对的凸起核苷酸用下划线表示。下标代表在突变体中已被缺失的相应野生型pRNA的核苷酸位置。
UV光学解链
对于每个3WJ构建体，三种RNA寡聚体3WJa、3WJb和3WJc以近似等摩尔浓度混合，所述浓度跨越范围从0.4 μM至40 μM的100倍稀释。UV光学解链按之前所述进行(Schroeder和Turner 2009)，变化在于对三组分RNA系统的分析。简言之，使用Beckman Coulter DU-800分光光度计，在标准解链缓冲液条件下(1 M氯化钠、10 mM二甲胂酸钠、0.5 mM EDTA、pH7.0) (Gu等2013)进行解链。260和280 nm的吸光度作为从4°C至90°C的温度的函数测量，该温度是最大可测量的温度范围以及中点和构建体的预期T m s近似相等的范围。为了可重复地形成最低能量结构，在解链或添加镁之前将RNA样品加热至90°C和缓慢冷却。对于用10mM金属离子的解链，将氯化钠浓度减少一个数量级，但所有其它条件保持相同。由于EDTA的存在，有效Mg2+浓度可略微低于10 mM。对于每个构建体，还进行单个RNA链3WJa、3WJb和3WJc和所有成对组合的光学解链。解链曲线使用Meltwin拟合，以测定解链温度，和热力学参数从van't Hoff曲线测定，其中平衡常数K eq 通过Eq. 1提供：
其中C T = 总链浓度和对于包括非-自互补序列的具有平衡的三分子离解反应，n = 3，和其中线性拟合度(误差的良好评估)是≥ 0.90。解链转变的锐度和van’t Hoff曲线的直线性表明两状态解链；然而，未严格遵循∆Cp = 0的假设。尽管焓表明一定的温度依赖性，但在焓和热容量值方面存在大范围误差。焓和熵的误差是相关的，因此，自由能仍提供有用的预测值。此外，对热容量的温度依赖性变化的修正对于多分支环基序的最终自由能具有小的影响，在该值的误差内，即，< 0.5 kcal/mol。pRNA 3WJ纳米基序的热力学稳定性通过减去RNA螺旋的稳定性贡献来计算，如根据Nearest Neighbor Database计算的(表2，图6A-6B)。
pRNA 3WJ二级结构和自由能预测
每个pRNA构建体的二级结构和稳定性使用四种RNA二级结构预测程序进行预测：RNAStructure、RNAfold、mfold和RNAsoft。对于RNA Structure、RNAfold和mfold的预测，将pRNA链3WJa和3WJb以及3WJb和3WJc用5' – aaaa – 3'发夹连接，然后构建体折叠为单一链。自由能预测不受发夹位置的影响，即，无论发夹位于链3WJa和3WJb和链3WJb和3WJc之间，链3WJb和3WJc和链3WJc和3WJa之间，还是链3WJc和3WJa和链3WJa和3WJb之间。对于RNAsoft的预测，将pRNA链3WJa和3WJb用5' – aaaa – 3'发夹连接，和与链3WJc折叠。同样，自由能预测不受发夹位置的影响，即，无论发夹位于链3WJa和3WJb之间，链3WJb和3WJc之间，还是链3WJc和3WJa之间。对于每个构建体，通过每个程序输出的最稳定的结构是设计的结构。不使用强制的碱基对或单链约束。为修正加入的发夹，从通过RNA Structure、RNAfold和mfold输出的二级结构稳定性减去两个5' – aaaa – 3'发夹罚分。对于通过RNAsoft预测的稳定性，减去一个5' – aaaa – 3'发夹罚分。因为计算考虑了3WJ的初始项，所以它们的自由能是准确的，在误差内，无论是在单链RNA、双链体还是三组分系统的情况下。将两个寡聚体汇合的熵罚分包括在初始项的自由能中。开始RNA发夹和RNA分子间相互作用的自由能分别是5.4±0.2 kcal/mol至6.4 ± 0.2 kcal/mol (跨越环长度n=3至n=9)和4.09 ± 0.2 kcal/mol。因此，尽管与单链自折叠相比在将三个寡核苷酸链汇合方面存在显著的熵能量差异，但是多分支环的自由能的计算考虑这种差异和进行在不同情况下相当的3WJ基序的比较。
电泳凝胶迁移率改变测定法
pRNA 3WJ构建体的形成使用电泳凝胶迁移率改变测定法(EMSA)监测。在MJ ResearchPTC-200 Peltier Thermal Cycler中，将在标准解链缓冲液(1 M氯化钠、10 mM二甲胂酸钠、0.5 mM EDTA、pH 7.0)中浓度为40 μM的RNA加热至80°C，持续10s，然后以速率0.1°C/s冷却至4°C。将RNA与蔗糖加样染料混合和在TAE缓冲液中以50V和4°C在用溴化乙锭染色的预冷却的2% (w/v)琼脂糖中运行。监测单一RNA链(phi29 3WJa)、成对组合(phi29 3WJa +3WJb)和所有装配的pRNA 3WJ的迁移率。
结果
pRNA 3WJ纳米基序稳定性
对于每个构建体和其各自的3WJ纳米基序，通过UV光学解链测定的热力学参数在表2中报告。GA1、SF5和M2 pRNA 3WJ显示比母体phi29 pRNA 3WJ更大的稳定性(表2)。
表2. 对于pRNA 3WJ构建体和纳米基序的热力学参数。焓、熵和自由能的误差分别估算为10%、10%和5%。
解链曲线显示非常尖锐的转变，支持了从RNA三链体至单链RNA的协作转变的假设(图4A)。单链或成对组合解链无一显示与3WJ竞争的明显转变(数据未显示)。例如，phi29链3WJa和3WJb的解链显示51°C的解链温度的转变，而完整的3WJ (即，链3WJa、3WJb和3WJc一起)显示56°C的解链温度的转变。然而，当所有三个链存在时3WJ的形成是有利的。如之前对于非-自互补RNA双链体所示的，如果焓对于非-自互补双链体更有利，将形成非-自互补双链体，甚至当形成自互补双链体的单链的可选构象的T m 具有更高T m 时。3WJ构建体的自由能从van’t Hoff曲线计算，其中对于所有解链，线性拟合度是≥ 0.90 (图4B)。pRNA 3WJ纳米基序的热力学稳定性通过减去RNA螺旋的稳定性贡献计算，如从Nearest NeighborDatabase计算的(表2，图6A-6B)。研究的3WJ的自由能范围是-9.9 kcal/mol至10.2 kcal/mol (表2)。通过比较，在37°C下1.4 kcal/mol近似是结合常数的一个数量级。因此，在结合常数方面，研究的3WJ的形成的自由能范围跨越14个数量级。
当某些尿嘧啶(U)残基从接合处缺失时，phi29 pRNA 3WJ是稳定的。具体地，相对于WT phi29 pRNA 3WJ，以下两个缺失组合增加稳定性：(1) 链3WJa中单个U凸起(U29)以及链3WJb中三U凸起(即，U72-73-74)的三个U残基的两个的缺失；和(2) 3WJ的所有凸起U残基(即，U29/U72-73-74)的缺失(表2，图2)。研究的其它缺失不显著影响phi29 pRNA 3WJ的稳定性或有效地使其不稳定(表2)。
使用的四个RNA二级结构预测程序中，无一准确预测接合的实际自由能或突变体phi29 pRNA 3WJ稳定性的变化(图5A-5B)。最佳预测范围是从测量的自由能的1 kcal/mol内(对于phi29∆U29/∆U72-73-74，通过RNAsoft)至9 kcal/mol (对于phi29∆U72-73，通过RNAfold)，而最差预测范围是从1 kcal/mol内(对于phi29∆U29/∆U72-73-74，通过RNAsoft)至11kcal/mol (对于phi29∆U72-73，通过RNAfold)。至多，预测程序偏离测量的自由能的平均值为4 (± 2) kcal/mol。
金属离子结合
Na+、Mg2+和亚精胺(一种3+荷电物类)对pRNA 3WJ构建体稳定性的影响显示于图7。相对于100 mM NaCl，phi29 pRNA 3WJ构建体因Mg2+和亚精胺而几乎同样稳定，而GA1、SF5和M2pRNA 3WJ构建体受到这些离子不同地影响。加入Mg2+稳定SF5和M2 pRNA 3WJ构建体二者。加入亚精胺分别对GA1、SF5和M2 pRNA 3WJ构建体具有递增的稳定影响(图7)。
电泳凝胶迁移率改变测定法
描述相对于单链(phi29 3WJa)和成对组合(phi29 3WJa + 3WJb)在标准解链缓冲液条件下(1 M氯化钠、10 mM二甲胂酸钠、0.5 mM EDTA、pH 7.0)所有pRNA 3WJ构建体的迁移率的凝胶显示于图8。所有3WJ构建体以近似相同速率运行。另外，将描述相对于每个单一RNA链和所有成对组合在TMS缓冲液(50 mM Tris-HCl、pH 7.8、100 mM NaCl、10 mM MgCl2)中每个pRNA 3WJ构建体的迁移率的凝胶与关于各种生物学RNA的装配和稳定性公布的先前工作比较(数据未显示)。对于每个凝胶，随着加入RNA系统的更多组分，迁移率降低，表明形成更高分子量的复合物。相对于当存在所有三个RNA 3WJ链时出现的缓慢迁移带，单链显示最快迁移，和成对组合显示中等迁移(图8)，表明三个RNA组分比任何两个组分更有利地相互作用，和证实了从链3WJa、3WJb和3WJc形成pRNA 3WJ。
关于环-环相互作用稳定性和自装配的3WJ稳定性
在研究的pRNA 3WJ构建体中，SF5和M2 pRNA 3WJ是热力学最稳定的，这使得它们成为对用于基于pRNA的纳米技术的母体phi29 pRNA 3WJ支架的有吸引力的代替物。引人注意的是，这些pRNA还显示在迄今为止研究的实验室条件下对自装配的最高倾向。我们用从由Gu和Schroeder (Gu和Schroeder 2011，同前)和Hao和Kieft (Hao和Kieft 2014，同前)提供的序列计算的环-环相互作用稳定性测量的3WJ稳定性的分析提供3WJ纳米基序在稳定pRNA中是否起补偿作用的见解。分析表明，尽管环-环相互作用都是有利的，但3WJ具有更广范围的稳定性(图9A-B)。特别地，phi29和GA1 pRNA具有更不有利的3WJ稳定性，而M2和SF5 pRNA具有更有利的3WJ稳定性(图9A-B)。对于phi29和GA1 pRNA，环-环相互作用稳定性被3WJ稳定性抵消，而对于SF5和M2 pRNA，环-环相互作用和3WJ均是稳定的。稳定纳米基序的组合可有助于解释仅SF5和M2 pRNA体外显示更高级多聚体自装配的原因。与它们相对于phi29增加的热力学稳定性和装配成更高级多聚体的倾向一致，为了自装配，SF5和M2序列可均采用3WJ预组构，其不需要破坏已有的共轴堆积或其它有利的相互作用。
此处我们证明，在phi29 pRNA 3WJ中∆U29/∆U72-73和∆U29/∆U72-73-74缺失是有稳定作用的(表2)，表明在合理设计功能性RNA中对母体phi29 pRNA 3WJ支架的代替。
在pRNA 3WJ中的结构-能量学关系
本文提供的新的热力学数据提供了关于RNA结构-能量学关系的推论的基础，特别是对于3WJ的四个凸起U残基。非Watson-Crick碱基配对在RNA 3D结构中占优势，形成有利于RNA-RNA相互作用并结合配体的基序。phi29 3WJ晶体结构显示，在U29和U72的Watson-Crick边缘之间形成顺式碱基对以及在U29和U74之间形成碱基堆积。通过比较，其中U29和三U凸起(即，U72-73-74)的三个U残基的至少一个得到保留的phi29 pRNA 3WJ构建体不显示具有等效的热力学稳定性，尽管在这些构建体的3WJ之间碱基对形成的可能性。然而，其中U29和三U凸起的三个U残基的两个得到保留的3WJ的稳定性几乎等于母体phi29 pRNA3WJ (分别为4.7和4.6 kcal/mol)。引人注意的是，仅当三U凸起的U残基之一得到保留时(-3.3 kcal/mol)，或当3WJ的所有凸起U残基缺失时(0.6 kcal/mol)，发生phi29 pRNA 3WJ的稳定性的显著增加。这些3WJ均不允许观察到在跨越接合处的U残基之间的碱基配对或碱基堆积，表明配对和堆积不是稳定接合的唯一有利的三级相互作用。这些突变可允许不同的、有利螺旋共轴堆积相互作用，这可有助于观察到稳定性差异。
通过RNA二级结构预测程序的自由能输出不是准确预测的。尽管在本研究中实施的所有程序利用相同的自由能数据库，但预测多分支环的方式在不同的RNA结构预测程序中不同。预测可考虑共轴堆积的所有可能的构象，仅包括单一最有利的共轴堆积排列，或包括来自已知二级结构的分析的基于知识的参数。无一算法能够解释在本文研究的3WJ的测量的稳定性之间观察到的差异幅度。所有程序过高估计phi29和GA1 pRNA 3WJ构建体的稳定性和低估了SF5和M2 pRNA 3WJ构建体的稳定性(图5A-6B)。此外，无一程序的预测区别了具有母体phi29 pRNA 3WJ中的缺失的构建体的稳定性。例如，显示具有最高稳定性的突变体和显示具有最低稳定性的突变体均未如此预测(图5A-6B)。而是，缺失突变体全部预测具有大致相同的自由能(在~1 kcal/mol内)。
前头RNA (pRNA)是phi29-样噬菌体DNA包装马达的重要组分。由于其稳定性和体外自装配性质，在合理设计功能性RNA超分子结构中pRNA已成功用作支架。在本公开的工作之前，除了phi29 pRNA之外的pRNA序列的稳定性相对研究不足。本文的结果证实，某些母体和突变的pRNA 3WJ比母体phi29 pRNA 3WJ更稳定。
血清稳定性
在获自在标准解链缓冲液条件下的UV光学解链研究的结果中，相对于母体phi29 3WJ(图2)，至少5种3WJ经证实是热力学更加稳定的(即，具有更加负的∆G37)，包括GA1 3WJ (图2)、SF5 3WJ (图3)、M2 3WJ (图3)、phi29∆U29/∆U72-73 3WJ (图12)、phi29∆U29/∆U72-73-74 3WJ(图13) (表2)。这些构建体，包含3WJa、3WJb和3WJc序列，因此证实在标准解链缓冲液条件下与母体phi29 3WJ构建体(图2)比较，是高度稳定的。为了探查通过在标准解链缓冲液中UV光学解链测定的体外稳定性和在生物学流体中的稳定性之间的关系，在生理温度下在暴露于人血清后监测上述热稳定的pRNA 3WJ构建体的降解。RNA链3WJa、3WJb和3WJc以近似等摩尔浓度混合，和在37°C与人血清孵育。3WJ使用苯酚提取/乙醇沉淀回收和重悬于标准解链缓冲液中。在与上文对于EMSA所述的相同条件下使用凝胶电泳分析降解。
图10A显示在10分钟暴露于100-倍稀释的人血清后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2% (w/v)琼脂糖中10 μM的热稳定的3WJ构建体的降解结果。所有反应在37°C进行。泳道(i) 50 bp DNA梯、(ii) 在标准解链缓冲液中的phi29 3WJ构建体 + 1个单位RNA酶T1(阳性降解对照)、(iii) phi29 3WJ构建体(图2)、(iv) GA1 3WJ构建体(图2)、(v) SF5 3WJ构建体(图3)、(vi) M2 3WJ构建体(图3)、(vii) phi29∆U29/∆U72-73 3WJ构建体(图12A)、(viii) phi29∆U29/∆U72-73-74 3WJ构建体(图12B)。标准解链缓冲液是1 M氯化钠、10 mM二甲胂酸钠和0.5 EDTA、pH 7。相对于母体phi29 3WJ构建体(图2)，至少两种3WJ构建体显示更少降解，因此证实在人血清中更加稳定，包括但不限于SF5 3WJ构建体(图3)和M2 3WJ构建体(图3)。这些构建体，包含3WJa、3WJb和3WJc序列，因此证实与母体phi29 3WJ构建体(图2)相比高度稳定。图10B显示在10分钟暴露于来自第二血液供体的100-倍稀释的人血清后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2% (w/v)琼脂糖中10 μM的之前证实的血清-稳定的3WJ构建体和突变体SF5 3WJ构建体的进一步降解结果。所有反应在37°C进行。泳道(i) 50 bpDNA梯、(ii) 在标准解链缓冲液中的phi29 3WJ构建体(阴性降解对照)、(iii) phi29 3WJ构建体、(iv) M2 3WJ构建体、(v) SF5 3WJ构建体、(vi) SF5∆G31 3WJ构建体、(vii) SF5∆G693WJ构建体、(viii) SF5∆G31/∆G69 3WJ构建体。突变体SF5 3WJ构建体SF5∆G31和SF5∆G31/∆G69显示相对于SF5 3WJ构建体在人血清中改进的稳定性。
图10A-10B比较了在来自两个不同供体的人血清中pRNA 3WJ构建体的稳定性。这些血清稳定性测定结果表明，SF5和M2 3WJ构建体和SF5∆G31和SF5∆G31/∆G69缺失突变体3WJ构建体在人血清中比母体phi29 3WJ构建体更稳定。SF5和M2 3WJ构建体还表明比GA1 3WJ构建体和phi29∆U29/∆U72-73和phi29∆U29/U72-73-74缺失突变体3WJ构建体更大的稳定性。
对母体phi29 3WJ (图2)、SF5 3WJ (图3)和M2 3WJ (图3)构建体进行进一步的时程分析。凝胶迁移率结果显示于图11。在暴露于1000-倍稀释的人血清10分钟、30分钟和1小时后，在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的2% (w/v)琼脂糖中分析3WJ构建体(10 μM)。所有反应在37°C进行。泳道(i) 50 bp DNA梯、(ii) 在标准解链缓冲液(1 M氯化钠、10 mM二甲胂酸钠、0.5 EDTA、pH 7)中1小时的3WJ构建体、(iii) 在1000-倍稀释的血清中10分钟的3WJ构建体、(iv) 在1000-倍稀释的血清中30分钟的3WJ构建体、(v) 在1000-倍稀释的血清中1小时的3WJ构建体。M2和SF5 3WJ构建体二者均证实在人血清中随时间比母体phi29 3WJ构建体更稳定。
解链温度
近似40 μM的各种3WJ构建体的解链温度(T m )通过UV光学解链测定，如上所述(表3)。T m 的误差估算为±1°C。在40 μM时，SF5、M2、phi29∆U29/∆U72-73、SF5∆G69和SF5∆G31/∆G69 3WJ构建体具有比母体phi29 3WJ构建体显著更高的解链温度，表明更高的稳定性。
表3. 各种3WJ构建体的T m
*M2和SF5∆G31的解链温度分别在25 μM和33 μM的浓度下报告。
实施例
本公开内容的发明构思现在已大体上得到描述，参考以下其它实施例和实施方案将更容易得到理解，所述其它实施例和实施方案仅为说明某些方面和其实施方案的目的而包括，和不意图是限制性的。如上所述，以下详细的实施例应仅解释为说明性的，无论如何而不以任何方式限制本公开内容。本领域技术人员会立刻意识到从各种构建体、纳米颗粒、组合物、组分、程序和方法的合适改变。
下文的非限制性实施例包括pRNA寡核苷酸的三序列组(3WJa、3WJb和3WJc序列链，5’→ 3’)，其可用于装配可根据本公开内容的教导形成和使用的各种3WJ构建体。下文或本文他处所述的任何三序列组可装配成3WJ支架，生物学活性部分与其共价连接(通过连接至3WJ的一个或多个分支)以形成根据本公开内容使用的缀合物。
在至少一个实施方案中，本公开内容涉及RNA接合支架，其包含：三向接合(3WJ)构建体，所述3WJ构建体包含：包含第一RNA寡核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA寡核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA寡核苷酸的3WJc序列，其中3WJ构建体的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，3WJ构建体的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，和3WJ构建体的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，其中所述分支各自包含具有多个RNA核苷酸对的螺旋区，所述核苷酸对形成标准的Watson-Crick键。
在RNA接合支架的至少一个实施方案中，3WJb序列在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置，或在3WJc序列中在第一分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含单个不配对核苷酸(例如，U)。
在RNA接合支架的至少一个实施方案中，3WJa序列在第二分支中包含仅两个相邻的不配对核苷酸(例如，CA)，3WJb序列在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含单个不配对核苷酸(例如，C)，和3WJc序列在第一分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含仅两个相邻的不配对核苷酸(例如，CU)。
在RNA接合支架的至少一个实施方案中，3WJa序列在第二分支中包含单个不配对核苷酸(例如，G)，和3WJb序列在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含仅两个不配对核苷酸(例如，GG)。
在RNA接合支架的至少一个实施方案中，3WJa序列在第二分支中不存在不配对核苷酸，和3WJb序列在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含仅两个不配对核苷酸(例如，GG)。
在RNA接合支架的至少一个实施方案中，3WJa序列在第二分支中不存在不配对核苷酸，和3WJb序列在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含仅单个不配对核苷酸(例如，G)。
在RNA接合支架的至少一个实施方案中，3WJa序列包含单个不配对核苷酸(例如，G)，和3WJb序列在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含单个不配对核苷酸(例如，G)。
在RNA接合支架的至少一个实施方案中，3WJa序列在第一分支的螺旋区和第二分支的螺旋区之间的位置包含单个不配对核苷酸(例如，G)，和在第二分支的部分中第一螺旋区的下游包含单个不配对核苷酸(例如，G)，和3WJc序列在第一分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含单个不配对核苷酸(例如，A)。
源自野生型phi29 pRNA的母体phi29 pRNA 3WJ构建体(图2)在3WJb序列中在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置在对应于完整野生型phi29 pRNA的位置72、73和74的位置包含三个不配对核苷酸(UUU)，并在3WJa序列中在第一分支的螺旋区和第二分支的螺旋区之间的位置在对应于野生型phi29 pRNA的位置29的位置包含不配对核苷酸U(其中位置编号对应于完整野生型phi29 pRNA的序列)。本公开内容的至少一个实施方案涉及phi29 pRNA 3WJ缺失突变体构建体(phi29∆U29/∆U72-73，图12)，其在3WJb序列中在第二螺旋区和第三螺旋区之间的位置不存在两个不配对核苷酸U (U72和U73)，和在3WJa序列中在第一螺旋区和第二螺旋区之间不存在单个不配对核苷酸U (U29)。
源自野生型M2 pRNA的母体M2 3WJ构建体(图14)包含在第二分支的M2 3WJa序列中位于位置36和37的两个相邻的不配对核苷酸(AU)，和在构建体的第三分支的M2 3WJb序列中位于位置79的不配对核苷酸(A) (位置编号对应于完整野生型M2 pRNA的序列)。本公开内容的至少一个实施方案涉及M2 pRNA 3WJ缺失突变体构建体(M2∆AUA，图3)，其不存在对应于第二分支的WT 3WJa序列的位置36和37的两个不配对核苷酸AU，和不存在对应于构建体的第三分支的WT 3WJb序列的位置79的不配对核苷酸A。
母体SF5 3WJ构建体(图3)在第二分支的3WJa序列的位置31包含不配对核苷酸(G)和在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置在3WJb序列的位置69和70包含两个相邻的不配对核苷酸(GG) (位置编号对应于完整野生型SF5 pRNA的序列)。本公开内容的某些实施方案涉及SF5 pRNA 3WJ缺失突变体构建体，其不存在SF5 3WJ的3WJa和3WJb序列的一个、两个或三个不配对核苷酸，例如3WJa序列的G31 (SF5∆G31) (例如，图32)、3WJB序列的G69 (SF5∆G69) (例如，图37)、3WJa和3WJb序列的G31和G69 (SF5∆G31/∆G69) (例如，图42)、或3WJa和3WJb序列的G31、G69和G70 (SF5∆G31/∆G69-70)。
源自野生型GA1 pRNA的母体GA1 3WJ构建体(图2)包含在第一分支的螺旋区和第二分支的螺旋区之间的位置位于3WJa序列的位置27的单个不配对核苷酸(G)、在构建体的第二分支中的位置位于3WJa序列的位置32的单个不配对核苷酸(G)和在第一分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置位于3WJc序列的位置89的单个不配对核苷酸(A) (位置编号对应于完整野生型GA1 pRNA的序列)。本公开内容的至少一个实施方案涉及GA1 pRNA3WJ缺失突变体构建体，其在位置27、32或89之一不存在不配对核苷酸，或在位置27和32、或27和89、或32和89不存在两个不配对核苷酸。
以下是phi29 pRNA三序列组(3WJa、3WJb和3WJc序列链，5’→ 3’)的非限制性实施例，其可用于碱基配对本公开内容的各种3WJ构建体(实施例1-13在图12、13和15-26中提供，和在图48-49中一般性提供)：
1. (图12)
3WJa: CUUGUCAUGGUAUGUUGCC (SEQ ID NO:13)
3WJb: GGCACAUACUGUUGAUAGG (SEQ ID NO:15)
3WJc: CCUGUCAAUCAUGGCAAG (SEQ ID NO:3)
2. (图13)
3WJa: CUUGUCAUGGUAUGUUGCC (SEQ ID NO:13)
3WJb: GGCACAUACGUUGAUAGG (SEQ ID NO:16)
3WJc: CCUGUCAAUCAUGGCAAG (SEQ ID NO:3)
2. (图15)
3WJa: UUGUCAUGGUAUGUUGCC (SEQ ID NO:17)
3WJb: GGCACAUACUGUUGAUAGG (SEQ ID NO:15)
3WJc: CCUGUCAAUCAUGGCAA (SEQ ID NO:18)
3. (图16)
3WJa: UUGUCAUGGUAUGUUGC (SEQ ID NO:19)
3WJb: GCACAUACUGUUGAUAGG (SEQ ID NO:20)
3WJc: CCUGUCAAUCAUGGCAA (SEQ ID NO:18)
4. (图17)
3WJa: UUGUCAUGGUAUGUUGC (SEQ ID NO:19)
3WJb: GCACAUACUGUUGAUAG (SEQ ID NO:21)
3WJc: CUGUCAAUCAUGGCAA (SEQ ID NO:22)
5. (图18)
3WJa: UGUCAUGGUAUGUUGC (SEQ ID NO:23)
3WJb: GCACAUACUGUUGAUAG (SEQ ID NO:21)
3WJc: CUGUCAAUCAUGGCA (SEQ ID NO:24)
6. (图19)
3WJa: UGUCAUGGUAUGUUG (SEQ ID NO:25)
3WJb: CACAUACUGUUGAUAG (SEQ ID NO:26)
3WJc: CUGUCAAUCAUGGCA (SEQ ID NO:24)
7. (图20)
3WJa: UGUCAUGGUAUGUUG (SEQ ID NO:25)
3WJb: CACAUACUGUUGAUA (SEQ ID NO:27)
3WJc: UGUCAAUCAUGGCA (SEQ ID NO:28)
8. (图21)
3WJa: GUCAUGGUAUGUUG (SEQ ID NO:29)
3WJb: CACAUACUGUUGAUA (SEQ ID NO:27)
3WJc: UGUCAAUCAUGGC (SEQ ID NO:30)
9. (图22)
3WJa: GUCAUGGUAUGUU (SEQ ID NO:31)
3WJb: ACAUACUGUUGAUA (SEQ ID NO:32)
3WJc: UGUCAAUCAUGGC (SEQ ID NO:30)
10. (图23)
3WJa: GUCAUGGUAUGUU (SEQ ID NO:31)
3WJb: ACAUACUGUUGAU (SEQ ID NO:33)
3WJc: GUCAAUCAUGGC (SEQ ID NO:34)
11. (图24)
3WJa: UCAUGGUAUGUU (SEQ ID NO:35)
3WJb: ACAUACUGUUGAU (SEQ ID NO:33)
3WJc: GUCAAUCAUGG (SEQ ID NO:36)
12. (图25)
3WJa: UCAUGGUAUG (SEQ ID NO:37)
3WJb: CAUACUGUUGAU (SEQ ID NO:38)
3WJc: GUCAAUCAUGG (SEQ ID NO:36)
13. (图26)
3WJa: UCAUGGUAUG (SEQ ID NO:37)
3WJb: CAUACUGUUGA (SEQ ID NO:39)
3WJc: UCAAUCAUGG (SEQ ID NO:40)
以下实施例14-32是M2 pRNA三序列组(3WJa、3WJb和3WJc序列链，5’→3’)的非限制性实施例，其可用于碱基配对本公开内容的各种3WJ构建体(实施例14、29-31和27分别在图3和27-31提供，和在图50中一般性提供)：
14: (图3)
3WJa: GCAAUAGUAUGGCACAUGUGC (SEQ ID NO:10)
3WJb: GCACAUGUCACGGGGUAGG (SEQ ID NO:11)
3WJc: CCUACCCUCUUACUAUUGC (SEQ ID NO:12)
15:
3WJa: CAAUAGUAUGGCACAUGUGC (SEQ ID NO:41)
3WJb: GCACAUGUCACGGGGUAGG (SEQ ID NO:11)
3WJc: CCUACCCUCUUACUAUUG (SEQ ID NO:42)
16:
3WJa: CAAUAGUAUGGCACAUGUG (SEQ ID NO:43)
3WJb: CACAUGUCACGGGGUAGG (SEQ ID NO:44)
3WJc: CCUACCCUCUUACUAUUG (SEQ ID NO:42)
17:
3WJa: CAAUAGUAUGGCACAUGUG (SEQ ID NO:43)
3WJb: CACAUGUCACGGGGUAGG (SEQ ID NO:45)
3WJc: CUACCCUCUUACUAUUG (SEQ ID NO:46)
18.
3WJa: AAUAGUAUGGCACAUGUG (SEQ ID NO:47)
3WJb: CACAUGUCACGGGGUAGG (SEQ ID NO:45)
3WJc: CUACCCUCUUACUAUU (SEQ ID NO:48)
19.
3WJa: AAUAGUAUGGCACAUGU (SEQ ID NO:49)
3WJb: ACAUGUCACGGGGUAGG (SEQ ID NO:50)
3WJc: CUACCCUCUUACUAUU (SEQ ID NO:48)
20.
3WJa: AAUAGUAUGGCACAUGU (SEQ ID NO:49)
3WJb: ACAUGUCACGGGGUAG (SEQ ID NO:51)
3WJc: UACCCUCUUACUAUU (SEQ ID NO:52)
21.
3WJa: AUAGUAUGGCACAUGU (SEQ ID NO:53)
3WJb: ACAUGUCACGGGGUAG (SEQ ID NO:51)
3WJc: UACCCUCUUACUAU (SEQ ID NO:54)
22.
3WJa: AUAGUAUGGCACAUG (SEQ ID NO:55)
3WJb: CAUGUCACGGGGUAG (SEQ ID NO:56)
3WJc: UACCCUCUUACUAU (SEQ ID NO:54)
23.
3WJa: AUAGUAUGGCACAUG (SEQ ID NO:55)
3WJb: CAUGUCACGGGGUA (SEQ ID NO:57)
3WJc: ACCCUCUUACUAU (SEQ ID NO:58)
24.
3WJa: UAGUAUGGCACAUG (SEQ ID NO:59)
3WJb: CAUGUCACGGGGUA (SEQ ID NO:57)
3WJc: ACCCUCUUACUA (SEQ ID NO:60)
25.
3WJa: UAGUAUGGCACAU (SEQ ID NO:61)
3WJb: AUGUCACGGGGUA (SEQ ID NO:62)
3WJc: ACCCUCUUACUA (SEQ ID NO:60)
26.
3WJa: UAGUAUGGCACAU (SEQ ID NO:61)
3WJb: AUGUCACGGGG (SEQ ID NO:63)
3WJc: CCCUCUUACUA (SEQ ID NO:64)
27. (图30)
3WJa: UAGUAUGGCACA (SEQ ID NO:65)
3WJb: UGUCACGGGG (SEQ ID NO:66)
3WJc: CCCUCUUACUA (SEQ ID NO:64)
28.
3WJa: UAGUAUGGCACA (SEQ ID NO:65)
3WJb: UGUCACGGG (SEQ ID NO:67)
3WJc: CCUCUUACUA (SEQ ID NO:68)
29: (图27)
3WJa: CAAUAGUAUGGCACAUGUG (SEQ ID NO:43)
3WJb: CACAUGUCACGGGGUAG (SEQ ID NO:69)
3WJc: CUACCCUCUUACUAUUG (SEQ ID NO:46)
30. (图28)
3WJa: AAUAGUAUGGCACAUGUG (SEQ ID NO:47)
3WJb: CACAUGUCACGGGGUA (SEQ ID NO:70)
3WJc: UACCCUCUUACUAUU (SEQ ID NO:52)
31. (图29)
3WJa: AUAGUAUGGCACAUG (SEQ ID NO:55)
3WJb: CAUGUCACGGGG (SEQ ID NO:71)
3WJc: CCCUCUUACUAU (SEQ ID NO:72)
32. (图31)
3WJa: AGUAUGGCAC (SEQ ID NO:73)
3WJb: GUCACGGG (SEQ ID NO:74)
3WJc: CCUCUUAC (SEQ ID NO:75)
以下实施例33-47是SF5 pRNA三序列组(3WJa、3WJb和3WJc序列链，5’→3’)的非限制性实施例，其可用于碱基配对本公开内容的各种3WJ构建体(实施例33-47分别在图32-46中提供，和在图51-53中一般性提供)：
以下实施例48是GA1 pRNA三序列组(3WJa、3WJb和3WJc序列链，5’→3’)的非限制性实施例，其可用于碱基配对本公开内容的各种3WJ构建体(实施例48在图47中提供，和在图54中一般性提供)：
48. (图47)
3WJa: UAUAGGCUGUGCA (SEQ ID NO:99)
3WJb: UGACAGGUUGU (SEQ ID NO:100)
3WJc: GCAAUACUAUA (SEQ ID NO:101)
以下实施例49-56是pRNA三序列组(3WJa、3WJb和3WJc序列链，5’→ 3’)的非限制性一般性表示，其可用于碱基配对本公开内容的各种3WJ构建体，包括对于phi29 3WJ的实施例49-50 (图48-49)、对于M2 3WJ的实施例51 (图50)、对于SF5 3WJ的实施例52-55 (图51-53)和对于GA1 3WJ的实施例56 (图54)。W和C代表当在3WJ中从3WJa、3WJb和3WJc链装配时形成对的核苷酸，和N代表在装配的3WJ中的不配对核苷酸。
49. (图48)
3WJa: WWWWWWWWWW (SEQ ID NO:102)
3WJb: CCCCCNCCCCC (SEQ ID NO:103)
3WJc: WWWWWCCCCC (SEQ ID NO:104)
50. (图49)
3WJa: WWWWWWWWWW (SEQ ID NO:102)
3WJb: CCCCCCCCCC (SEQ ID NO:105)
3WJc: WWWWWNCCCCC (SEQ ID NO:106)
51. (图50)
3WJa: WWWWWWWWNNWW (SEQ ID NO:107)
3WJb: CCCCCNCCCCC (SEQ ID NO:103)
3WJc: WWWWWNNCCCCC (SEQ ID NO:108)
52. (图51)
3WJa: WWWWWWWWNWW (SEQ ID NO:109)
3WJb: CCCCCNNCCCCC (SEQ ID NO:110)
3WJc: WWWWWCCCCC (SEQ ID NO:104)
53. (图52)
3WJa: WWWWWWWWWW (SEQ ID NO:102)
3WJb: CCCCCNNCCCCC (SEQ ID NO:110)
3WJc: WWWWWCCCCC (SEQ ID NO:104)
54. (图53)
3WJa: WWWWWWWWNWW (SEQ ID NO:109)
3WJb: CCCCCNCCCCC (SEQ ID NO:103)
3WJc: WWWWWCCCCC (SEQ ID NO:104)
55.
3WJa: WWWWWWWWWW (SEQ ID NO:102)
3WJb: CCCCCNCCCCC (SEQ ID NO:103)
3WJc: WWWWWCCCCC (SEQ ID NO:104)
56. (图54)
3WJa: WWWWWWWWNWW (SEQ ID NO:109)
3WJb: CCCCCCCCCC (SEQ ID NO:105)
3WJc: WWWWWNCCCCC (SEQ ID NO:106)
图48-49 (实施例49-50)描述本公开内容的一般性phi29 pRNA 3WJ突变体构建体的实施方案。如上所解释的，每个3WJ构建体包含三个分支，各自包含螺旋区，其中每个螺旋区包含形成标准的Watson-Crick键(例如，G-C、C-G、U-A、A-U)的多个核苷酸碱基对(W-C)，和其也可在3WJb序列中第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置(如图48所示)，或在3WJc序列中第一分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置(如图49所示)，包含单个不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)。可存在于图48和49的3WJ的一个或多个分支中的非Watson-Crick核苷酸碱基对包括例如G-U、U-G、U-C、C-U、G-A、A-G、A-C和C-A。
图50 (实施例51)描述了本公开内容的一般性M2 pRNA 3WJ突变体构建体的实施方案。M2 3WJ构建体包含三个分支，每个包含螺旋区，其中每个螺旋区包含形成标准的Watson-Crick键(例如，G-C、C-G、U-A、A-U)的多个核苷酸碱基对(W-C)，和其也包含在第二分支的3WJa中的两个相邻的不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)、在3WJb序列中第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置的单个不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)，以及在3WJc序列中第三分支的螺旋区和第一分支的螺旋区之间的位置的一对相邻的不配对核苷酸N(例如，选自C、G、A和U)，如图50所示。可存在于图50的3WJ的一个或多个分支中的非Watson-Crick核苷酸碱基对包括例如G-U、U-G、U-C、C-U、G-A、A-G、A-C和C-A。
图51-53 (实施例52-55)描述本公开内容的一般性SF5 pRNA 3WJ突变体构建体的实施方案。SF5 3WJ构建体包含三个分支，每个包含螺旋区，其中每个螺旋区包含形成标准的Watson-Crick键(例如，G-C、C-G、U-A、A-U)的多个核苷酸碱基对(W-C)。图51的实施方案包含在第二分支的3WJa中的单个不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)和在3WJb中在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置的两个相邻的不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)。图52的实施方案包含在3WJb中在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置的两个相邻的不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)。图53的实施方案包含在第二分支的3WJa中的单个不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)和在3WJb中在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置的单个不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)。实施例54的实施方案类似于图51-53，不同之处在于3WJ构建体在3WJb中在第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置包含仅单个不配对核苷酸N (即，C、G、A、或U)，和不存在对应于第二分支的G31和第二分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置的G69的不配对核苷酸。可存在于图51-53和实施例54的3WJ的一个或多个分支中的非Watson-Crick核苷酸碱基对包括例如G-U、U-G、U-C、C-U、G-A、A-G、A-C和C-A。
图54 (实施例56)描述了本公开内容的一般性GA1 pRNA 3WJ突变体构建体的实施方案。GA1 3WJ构建体包含三个分支，每个包含螺旋区，其中每个螺旋区包含形成标准的Watson-Crick键(例如，G-C、C-G、U-A、A-U)的多个核苷酸碱基对(W-C)。图54的实施方案包含在3WJa中在第一分支的螺旋区和第二分支的螺旋区之间的位置的单个不配对核苷酸N(即，C、G、A或U)、在第二分支的3WJa中的单个不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)和在3WJc中在第一分支的螺旋区和第三分支的螺旋区之间的位置的单个不配对核苷酸N (即，C、G、A或U)。
此外，本文公开的各个3WJa、3WJb和3WJc链可以不同于实施例中明确显示的组合的三序列组组合。例如，对于可选的M2 3WJ构建体，可组合SEQ ID NO: 61、63和64，或可组合SEQ ID NO: 65、63和60。对于phi29和SF5 3WJ构建体可进行类似的可选组合。
如上所述，上文描述的pRNA 3WJ构建体可用作支架，至少一个生物学活性部分通过一个或多个分支与其连接，以形成缀合物、复合物或纳米颗粒。本公开内容的至少一个实施方案涉及多价寡聚体复合物，其包含多个单体，每个单体包含RNA 3WJ支架，至少一个生物学活性部分与其连接。如本文他处所述，生物学活性部分可以是治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和/或适体。治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和/或适体可直接或通过接头分子例如寡核苷酸连接至三个寡核苷酸序列3WJa、3WJb或3WJc之一，然后三个寡核苷酸序列3WJa、3WJb和3WJc组合成混合物和自装配成3WJ。寡核苷酸序列3WJa、3WJb和3WJc中的一个、两个或三个可连接至治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和/或适体以形成缀合物、复合物或纳米颗粒。非-RNA部分可以任何合适的方式连接至pRNA 3WJ结构域。例如，叶酸可通过1,6-己二胺连键缀合至腺苷5'-单磷酸(AMP)。在反相HPLC以达到93%纯度后，叶酸-AMP可掺入phi29 pRNA的5'-端。例如，在转录中16:1比率的叶酸-AMP和ATP导致超过60%的pRNA包含叶酸(Gene Ther. 2006 May;13(10):814-20.)。缀合化学物质至RNA的许多其它方法是本领域普通技术人员已知的，例如显示于Chem Soc Rev. 2010 Jun;39(6):2054-70。其它连接方法和生物学活性部分显示于美国专利9,297,013 B2。
根据前述内容，在至少某些实施方案中本公开内容涉及：
条款1：一种RNA接合支架，包含三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中3WJ结构域的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，并包含第一螺旋区，3WJ结构域的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，并包含第二螺旋区，和3WJ结构域的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 3WJa序列不存在位于第一螺旋区和第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和两个不配对核苷酸位于第二分支的3WJa序列中，和(ii) 两个相邻的不配对核苷酸位于第一螺旋区和第三螺旋区之间的3WJc序列，和一个不配对核苷酸位于第二螺旋区和第三螺旋区之间的3WJb序列。
条款2：条款1的RNA接合支架，其中3WJa序列包含SEQ ID NO:73，3WJb序列包含SEQID NO:74，和3WJc序列包含SEQ ID NO:75。
条款3：条款1或2的RNA接合支架，其中第二分支在分别对应于野生型M2 pRNA的位置36和37的不配对腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸的位置不存在相邻的不配对核苷酸，和其中第三分支在对应于所述野生型M2 pRNA的位置79的不配对腺嘌呤核苷酸的位置不存在不配对核苷酸。
条款4：条款1-3的任一项的RNA接合支架，其在3WJa序列中存在的两个不配对核苷酸下游的3WJa序列中不存在一个或多个不配对核苷酸。
条款5：条款1-4的任一项的RNA接合支架，其在3WJb序列中存在的不配对核苷酸下游的3WJb序列中不存在不配对核苷酸。
条款6：条款1-5的任一项的RNA接合支架，其在3WJa序列中存在的两个不配对核苷酸下游的3WJa序列中不存在一个或多个不配对核苷酸，和在3WJb序列中存在的不配对核苷酸下游的3WJb序列中不存在不配对核苷酸。
条款7：一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中3WJ结构域的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，并包含第一螺旋区，3WJ结构域的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，并包含第二螺旋区，和3WJ结构域的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 3WJa序列不存在位于第一螺旋区和第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和一个不配对核苷酸位于第二分支的3WJa序列中，和(ii) 两个相邻的不配对核苷酸位于第二螺旋区和第三螺旋区之间的3WJb序列中。
条款8：一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中3WJ结构域的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，并包含第一螺旋区，3WJ结构域的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，并包含第二螺旋区，和3WJ结构域的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中3WJa序列不存在位于第一螺旋区和第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和不存在以下的至少一项：(1) 在对应于野生型SF5 pRNA的位置31的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置的不配对核苷酸，和(2) 在对应于所述野生型SF5 pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置的不配对核苷酸。
条款9：条款8的RNA接合支架，其在对应于野生型SF5 pRNA的位置31的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置不存在不配对核苷酸。
条款10：条款8或9的RNA接合支架，其中3WJa序列包含SEQ ID NO:86，3WJb序列包含SEQ ID NO:87，和3WJc序列包含SEQ ID NO:88。
条款11：条款8-10的任一项的RNA接合支架，其在对应于所述野生型SF5 pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置不存在不配对核苷酸。
条款12：条款8-11的任一项的RNA接合支架，其中3WJa序列包含SEQ ID NO:97，3WJb序列包含SEQ ID NO:98，和3WJc序列包含SEQ ID NO:88。
条款13：条款8-12的任一项的RNA接合支架，其不存在(1) 在对应于野生型SF5pRNA的位置31的不配对核苷酸的位置的不配对核苷酸，和(2) 在对应于所述野生型SF5pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置的不配对鸟嘌呤核苷酸。
条款14：条款8-13的任一项的RNA接合支架，其中3WJa序列包含SEQ ID NO:86，3WJb序列包含SEQ ID NO:98，和3WJc序列包含SEQ ID NO:88。
条款15：一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中3WJ结构域的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，并包含第一螺旋区，3WJ结构域的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，并包含第二螺旋区，和3WJ结构域的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中3WJa序列在第一螺旋区和第二螺旋区之间对应于定位的野生型phi29 pRNA的位置29的不配对尿嘧啶核苷酸的位置不存在不配对核苷酸，和在对应于所述野生型phi29pRNA的位置72和73的两个不配对尿嘧啶核苷酸的位置不存在两个不配对核苷酸。
条款16：条款15的RNA接合支架，其中3WJa序列包含SEQ ID NO:37，3WJb序列包含SEQ ID NO:39，和3WJc序列包含SEQ ID NO:40。
条款17：一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中3WJ结构域的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，并包含第一螺旋区，3WJ结构域的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，并包含第二螺旋区，和3WJ结构域的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 3WJa序列包含位于第一螺旋区和第二螺旋区之间的单个不配对核苷酸和在第二分支的3WJa序列中位于第一螺旋区和第二螺旋区之间的所述不配对核苷酸下游的不配对核苷酸，和(ii) 单个不配对核苷酸位于第一螺旋区和第三螺旋区之间的3WJc序列中。
条款18：条款17的RNA接合支架，其中3WJa序列包含SEQ ID NO:99，3WJb序列包含SEQ ID NO:100，和3WJc序列包含SEQ ID NO:101。
条款19：一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中3WJ结构域的第一分支从3WJa序列的5’部分和3WJc序列的3’部分形成，并包含第一螺旋区，3WJ结构域的第二分支从3WJa序列的3’部分和3WJb序列的5’部分形成，并包含第二螺旋区，和3WJ结构域的第三分支从3WJb序列的3’部分和3WJc序列的5’部分形成，并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 零或一个不配对核苷酸位于第一螺旋区和第二螺旋区之间的3WJa序列中，和/或一个或两个不配对核苷酸位于第二分支的3WJa序列中，和(ii) 一个不配对或两个相邻的不配对核苷酸位于第一螺旋区和第三螺旋区之间的3WJc序列中，和/或一个不配对或两个相邻的不配对核苷酸位于第二螺旋区和第三螺旋区之间的3WJb序列中。
条款20：一种缀合物，包含连接至至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分的条款1-19的任一项的RNA 3WJ支架。
条款21：一种组合物，包含条款20的缀合物和药学上可接受的媒介、载体或稀释剂。
条款22：条款1-19的任一项的RNA接合支架，其中3WJa、3WJb和3WJc序列各自独立地包含8-36个核苷酸，其不包括RNA接头或与RNA支架缀合的生物学活性部分的RNA部分。
本文公开的pRNA 3WJ支架、化合物、缀合物、组合物、纳米颗粒以及其生产和应用方法可根据本公开内容进行和执行，而无需过度实验。尽管本公开内容已结合某些实施方案进行描述，以致其各方面可更全面地得到理解和认识，但不预期本公开内容限于这些特定的实施方案。相反地，预期所有可选方案、修饰和等同方案包括在本公开内容的范围内。因此，上述包括特定实施方案的实施例将用于说明本公开内容的实践，应理解所示的细节通过实例的方式提供，和仅为说明性论述特定实施方案的目的，和为了提供被认为是最有用和容易理解地描述程序以及本公开的方法和组合物的原理和概念方面的内容而呈现。在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，本文所述的各种组合物的制剂、本文所述的方法或本文所述的步骤或方法步骤的顺序可进行变化。

Claims (28)

1. 一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 所述3WJa序列不存在位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和两个不配对核苷酸位于所述第二分支的所述3WJa序列中，和(ii) 两个相邻的不配对核苷酸位于所述第一螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJc序列中，和一个不配对核苷酸位于所述第二螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJb序列中。
2. 权利要求1的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQ ID NO:73，所述3WJb序列包含SEQ ID NO:74，和所述3WJc序列包含SEQ ID NO:75。
3. 权利要求1的RNA接合支架，其中所述第二分支在分别对应于野生型M2 pRNA的位置36和37的不配对腺嘌呤和尿嘧啶核苷酸的位置处不存在相邻的不配对核苷酸，和其中所述第三分支在对应于所述野生型M2 pRNA的位置79的不配对腺嘌呤核苷酸的位置处不存在不配对核苷酸。
4.权利要求1的RNA接合支架，其在所述3WJa序列中存在的两个不配对核苷酸的下游的所述3WJa序列中不存在一个或多个不配对核苷酸。
5.权利要求1的RNA接合支架，其在所述3WJb序列中存在的不配对核苷酸的下游的所述3WJb序列中不存在不配对核苷酸。
6.权利要求1的RNA接合支架，其在所述3WJa序列中存在的两个不配对核苷酸的下游的所述3WJa序列中不存在一个或多个不配对核苷酸，和在所述3WJb序列中存在的不配对核苷酸的下游的所述3WJb序列中不存在不配对核苷酸。
7. 一种缀合物，包含权利要求1的RNA 3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。
8.一种组合物，包含权利要求7的缀合物和药学上可接受的媒介、载体或稀释剂。
9. 一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 所述3WJa序列不存在位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和一个不配对核苷酸位于所述第二分支的所述3WJa序列中，和(ii) 两个相邻的不配对核苷酸位于所述第二螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJb序列中。
10. 一种缀合物，包含权利要求9的RNA 3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。
11. 一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中所述3WJa序列不存在位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸，和不存在以下的至少一项：(1) 在对应于野生型SF5 pRNA的位置31的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处的不配对核苷酸，和(2) 在对应于所述野生型SF5 pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处的不配对核苷酸。
12. 权利要求11的RNA接合支架，其在对应于野生型SF5 pRNA的位置31的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处不存在不配对核苷酸。
13. 权利要求12的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQ ID NO:86，所述3WJb序列包含SEQ ID NO:87，和所述3WJc序列包含SEQ ID NO:88。
14. 权利要求11的RNA接合支架，其在对应于所述野生型SF5 pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处不存在不配对核苷酸。
15. 权利要求14的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQ ID NO:97，所述3WJb序列包含SEQ ID NO:98，和所述3WJc序列包含SEQ ID NO:88。
16. 权利要求11的RNA接合支架，其不存在(1) 在对应于野生型SF5 pRNA的位置31的不配对核苷酸的位置处的不配对核苷酸，和(2) 在对应于所述野生型SF5 pRNA的位置69的不配对鸟嘌呤核苷酸的位置处的不配对鸟嘌呤核苷酸。
17. 权利要求16的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQ ID NO:86，所述3WJb序列包含SEQ ID NO:98，和所述3WJc序列包含SEQ ID NO:88。
18. 一种缀合物，包含权利要求11的RNA 3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。
19. 一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中所述3WJa序列在所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间对应于定位的野生型phi29 pRNA的位置29的不配对尿嘧啶核苷酸的位置处不存在不配对核苷酸，和在对应于所述野生型phi29 pRNA的位置72和73的两个不配对尿嘧啶核苷酸的位置处不存在两个不配对核苷酸。
20. 权利要求19的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQ ID NO:37，所述3WJb序列包含SEQ ID NO:39，和所述3WJc序列包含SEQ ID NO:40。
21. 一种缀合物，包含权利要求19的RNA 3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。
22. 一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 所述3WJa序列包含位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的单个不配对核苷酸，和位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的不配对核苷酸下游的位于所述第二分支的所述3WJa序列中的不配对核苷酸，和(ii) 位于所述第一螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJc序列中的单个不配对核苷酸。
23. 权利要求22的RNA接合支架，其中所述3WJa序列包含SEQ ID NO:99，所述3WJb序列包含SEQ ID NO:100，和所述3WJc序列包含SEQ ID NO:101。
24. 一种缀合物，包含权利要求22的RNA 3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。
25. 一种RNA接合支架，包含：三向接合(3WJ)结构域，所述3WJ结构域包含：包含第一RNA多核苷酸的3WJa序列、包含第二RNA多核苷酸的3WJb序列和包含第三RNA多核苷酸的3WJc序列，其中所述3WJ结构域的第一分支由所述3WJa序列的5’部分和所述3WJc序列的3’部分形成并包含第一螺旋区，所述3WJ结构域的第二分支由所述3WJa序列的3’部分和所述3WJb序列的5’部分形成并包含第二螺旋区，和所述3WJ结构域的第三分支由所述3WJb序列的3’部分和所述3WJc序列的5’部分形成并包含第三螺旋区，其中所述螺旋区各自包含形成标准的Watson-Crick键的多个RNA核苷酸对，和其中(i) 零或一个不配对核苷酸位于所述第一螺旋区和所述第二螺旋区之间的所述3WJa序列中，和/或一个或两个不配对核苷酸位于所述第二分支的所述3WJa序列中，和(ii) 一个不配对或两个相邻的不配对核苷酸位于所述第一螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJc序列中，和/或一个不配对或两个相邻的不配对核苷酸位于所述第二螺旋区和所述第三螺旋区之间的所述3WJb序列中。
26. 一种缀合物，包含权利要求25的RNA 3WJ支架，所述支架与至少一个选自治疗性药物、抗体、标记物、染料、siRNA、核酶、核糖开关和适体的部分连接。
27.一种组合物，包含权利要求25的缀合物和药学上可接受的媒介、载体或稀释剂。
28.权利要求25的RNA接合支架，其中所述3WJa、3WJb和3WJc序列各自独立地包含8-36个核苷酸，其不包括RNA接头或与RNA支架缀合的生物学活性部分的RNA部分。
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