PT1328271E - Tratamento de distúrbios neurológicos e neuropsicológicos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS NEUROLÓGICOS E NEUROPSICOLÓGICOS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à manutenção ou potenciação de efeitos neurológicos e neuropsicológicos endógenos dos sistemas do neuropéptido Y (NPY) do cérebro por administração de inibidores de dipeptidilpeptidase IV (DPIV). A invenção refere-se ainda ao tratamento de ansiedade através de uma potenciação dos efeitos mediados pelo receptor de NPY Yl no sistema nervoso central (SNC).

Antecedentes da Técnica

DP IV e NPY DP IV (CD26; EC 3.4.14.5) é uma exopeptidase com um triplo papel funcional. A DP IV está envolvida na libertação de dipéptidos Xaa-Pro do terminal N dos polipéptidos, hormonas em circulação e quimiocinas (Mentlein et al., 1999; Pauly et al., 1999), em respostas imunitárias dependentes de células T (Kahne et al., 1999; Korom et al., 1997) e em metástase (Cheng et al., 1998; 2000) . A DP IV cliva selectivamente os péptidos após os penúltimos resíduos N-terminais prolina e alanina. Substratos endógenos para esta enzima incluem as incretinas, tais como polipéptidos insulinotrópicos dependentes da glucose, como GIP e GLP-1. Na presença de DP IV, estas hormonas são enzimaticamente degradadas para formas inactivadas.

Descoberta do NPY 0 neuropéptido Y (NPY), um péptido de 36 aminoácidos pertencendo à familia do polipéptido pancreático, foi primeiro isolado a partir de cérebro porcino em 1982 (Tatemoto e Mutt, 1982) . 0 NPY está presente em todos os nervos do simpático que enervam o sistema cardiovascular e é o péptido mais abundante no cérebro e no coração. Adicionalmente, em ratos, mas não em humanos, o NPY também se encontra extraneuronalmente nas plaquetas e no endotélio (Zukovska-Grojec et al., 1993).

Originalmente, o NPY era conhecido como um potente vasoconstritor e um neuromodulador. Libertado pelo stresse, exercício e isquémia do miocárdio, o NPY tinha sido implicado na doença coronária cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva e hipertensão (Zukovska-Grojec et al, 1998). Mais recentemente, devido à capacidade potente do NPY para estimular a ingestão de comida, suspeita-se que desempenhe um papel na obesidade e na diabetes (Kalra et al., 1999). As últimas descobertas indicam que o NPY é também um mitogénio para as células do músculo liso vascular da aorta de rato (Zukovska-Grojec et al., 1999). A investigação relacionada com NPY tem-se focado em, pelo menos, três direcções principais: (1) Co-transmissão e vasoconstrição do simpático, devido à sua co-expressão com noradrenalina; (2) neurotransmissão e função no SNC, devido aos seus efeitos potentes confirmados; e (3) evolução de NPY, uma 2

vez que o NPY é um dos péptidos bioactivos mais altamente conservados conhecidos (Colmers e Wahlestedt, 1993; Lundberg, 1996; Wahlestedt e Reis, 1993; Wettstein et al., 1996). 0 NPY actua em, pelo menos, seis receptores (Y1-Y6), com farmacologia do péptido variável e distribuição distinta no SNC (Gehlert, 1998) (Tab. 1) .

Distribuição de NPY, subtipos de receptor de NPY e ARNm A distribuição do próprio NPY, da proteína do receptor de NPY e do seu ARNm no SNC de cérebro humano e de rato foi recentemente revista (Dumont Y, Jacques D, St-Pierre, J.-A., Tong, Y., Parker, R., Herzog H. e Qurion, R., 2000; em Handbook of Chemical Neuroanatomy, Vol. 16: Peptide Receptors, Parte 1; Quirion, R., Bjõrklund, A. e Hõkfeld,T., editores). Uma exposição sumária é apresentada na Tab. 1.

Os neurónios contendo NPY são evidentes na mucosa nasal de várias espécies, incluindo o homem, frequentemente associado a ácinos glandulares e vasos sanguíneos (Baraniuk et. al., 1990; Grunditz et al., 1994). A estimulação da alimentação do nervo parassimpático à mucosa nasal (nervo vidiano) em cães aumenta o fluxo sanguíneo na região e provoca principalmente resistência à atropina. A administração intravenosa de NPY reduz a vasodilatação devido à estimulação do nervo parassimpático, um efeito que não foi mimetizado pelo agonista selectivo de NPY Yl [Leu31, Pro34]NPY, mas foi mimetizado por administração do agonista do receptor de NPY Y2 N-acetil[Leu28, Leu3lJNPY(24-36) (Lacroix et al., 1994). Isto é consistente com uma inibição mediada pelo receptor do tipo NPY Y2 de pré-junção da libertação do transmissor dos terminais do nervo parassimpático. 3

Função do receptor de NPY 0 NPY é indiscutivelmente o neuropéptido mais abundante descoberto até à data, com uma vasta distribuição no SNC e sistema nervoso periférico (PNS). 0 NPY forma uma família de péptidos juntamente com o péptido TY (PYY) (aproximadamente 70% de homologia) e polipéptido pancreático (PP) (aproximadamente 50% de homologia) ; tanto NPY como PYY são extremamente bioactivos, enquanto que PP é geralmente muito menos activo (Gehlert, 1998; Wahlestedt e Reis, 1993) (Tab. 2).

Dois subtipos de receptor de NPY foram denominados neuropéptido Y Yl (pós-junção) e neuropéptido Y Y2 (pré-junção) na base das diferentes respostas a um análogo truncado do péptido relacionado YY-(13-36), quando comparado com o neuropéptido Y em sistemas de ensaio in vitro (Wahlestedt et al., 1986). A activação de receptores de NPY de pré-junção neuronais inibem geralmente a actividade do nervo, reduzindo a libertação dos neurotransmissores em resposta aos impulsos nervosos e em resposta a factores locais actuando para libertar os neurotransmissores (Wahlestedt et al., 1986). A classificação do receptor de pré-junção ou neuropéptido Y Y2 foi baseada nas acções do péptido YY (13-36) mas em muitos sistemas esta molécula, assim como o neuropéptido Y-(13-36), apresenta actividade de agente hipertensor (Rioux et al., 1986; Lundberg, et al., 1988; Potter et al., 1989). Isto foi interpretado por alguns como indicador de que em alguns leitos vasculares existem dois tipos de receptores do neuropéptido Y (o neuropéptido YYj e o neuropéptido Y2) em membranas pós-junção (Schwartz et al., 1989) . Todavia, a falta de selectividade destas moléculas pode ser devida à retenção de actividade agonística parcial em 4 receptores de Yj, que permite que produzam uma resposta funcional reduzida. Previamente, foi descrito um análogo 13-36 do neuropéptido Y, (Leu 17, Glu", Ala21, Ala 22, Glu 23, LeU28, LeU31) neuropéptido Y-(13-36) (neuropéptido ANA Y-(13-36)) que apresentou actividade de pré-junção equivalente à molécula de neuropéptido Y total em estudos in vivo (Potter et al., 1989).

Para além destes receptores de neuropéptido Y historicamente bem definidos, foi sugerida a existência de vários outros subtipos (Y3, Y4, Y5 e Y6) numa base farmacológica (Michel et al., 1998) e foram publicados detalhes da clonagem de receptores correspondendo a Yl, Y2, Y4 e Y5 (Herzog et al., 1992; Gerald et al., 1995; Bard et al., 1995; Gerald et al., 1996) (Tab. 1) . A distribuição e relevância fisiológica destes vários subtipos de receptor ainda não foram definidas. Embora tenha existido alguma controvérsia acerca da selectividade de formas truncadas de neuropéptido Y para um ou outro subtipo de receptor (Potter et al., 1989), a imagem emergente suporta a classificação inicial em subtipos de receptor de pré e pós-junção. Foram desenvolvidas linhas celulares que expressam especificamente um subtipo de receptor de neuropéptido Y e o desenvolvimento de análogos selectivos do receptor do

neuropéptido Y focou-se principalmente nas caracteristicas de ligação nestas linhas celulares (Sheikh et al., 1989; Aakerlund et al., 1990; Fuhlendorff et al., 1990). Mais recentemente, foi clonado um ADNc codificando o receptor do neuropéptido Y Yl e foram analisadas linhas celulares expressando o receptor clonado tanto para a ligação especifica de análogos do neuropéptido Y (Herzog et al., 1992) como para respostas funcionais produzidas por análogos específicos. A partir destes estudos de ligação, combinados com estudos subsequentes in vivo, foram identificados dois análogos como actuando especificamente no receptor do 5 neuropéptido Y Yl de pós-junção. Estes análogos selectivos dos receptores do neuropéptido Y Y, (Pro 34) neuropéptido Y e (Leu", Pro 34) neuropéptido Y, mimetizam a acção do neuropéptido Y ao subir a pressão sanguínea, e também partilham ligação semelhante às linhas celulares que expressam apenas os receptores do neuropéptido Y Y, e. g., a linha celular de neuroblastoma humana SK-N-MC e as linhas de fibroblasto expressando o receptor do neuropéptido Y Y clonado, (Herzoget al., 1992). Nenhum apresenta a acção do receptor do neuropéptido Y Y2 de inibição da acção vagoal cardíaca in vivo, uma manifestação de inibição da libertação de acetilcolina (Potter et al., 1991; Potter e McCloskey, 1992) . TABELA L: DISTRIBUIÇÃO E FUNÇÃO DE SUBTIPOS DE RECEPTOR DE ΝΡΪ NO SNC Receptor -subtipo Expressão no SNC Função Agonista Selectivo Agonista Selectivo ou selectividade Yl Cortéx, etc. Ansiólise, Libertação de LHRH N-Terminal: [Leu31,Pro34]NPY Intacto BIBP3226; BIBO3304 Y2 Hipocampo, Hipotálamo Antiamnésico Extremidade C-terminal:PYY3-36; PYY13-36 T4[NPY(33-36)]4; BIIE0246 Y3 Ncl. Tractus Solitarius (NTS) Bradicardia, Hipotensão NPY>>PYY,[Leu31, Pro34]NPY PYY - Insensibilidade Y4 Complexo vagai dorsal (DVC) Emético PP»NPY, PYY PP - Preferência Y5(a) Hipotálamo Alimentação NPY, PYY, [Leu31,Pro34 ] NPY [Leu31,Pro34]NPY -sensível, BIBP3226- não-reversível Y5 (b) ou Y6 Hipotálamo 9 . • / Específico para a Espécie 7 7 6

Tab. 1: subtipos de receptor de NPY no SNC; ? = desconhecido ou não investigado 0 desenvolvimento dos antagonistas não-peptídicos de NPY de elevada afinidade, BIBP3226 e BIBO3304, facilitaram a caracterização funcional dos receptores de NPY, na medida em que este composto apresenta selectividade para YlR, sendo desprovido de actividade em, pelo menos, Y2R, Y3R e Y4R (Doods et al., 1996) . Recentemente, foi descrito um antagonista de receptor de dois Y2. Um é uma molécula de TASP (Grouzmann et al., 1997), o outro é um antagonista não-peptídico (Wieland et al., 1999) e outros compostos específicos para o receptor não-peptídico ficaram disponíveis (Daniels et al., 1995). Assim, o bloqueamento do receptor específico no cérebro iria permitir a caracterização funcional de efeitos comportamentais e fisiológicos mediados por receptores de NPY centrais. Adicionalmente, foram criados e estão disponíveis murganhos sem o YlR (Pedrazzini et al., 1998). Os neurónios apresentando imunorreactividade do tipo NPY e expressão de receptor de NPY são abundantes no SNC (Tab. 1), e talvez sejam mais notórios nas estruturas hipotalâmicas e denominadas límbicas, mas também estão co-localizadas com neurónios monoaminérgicos do tronco cerebral e neurónios GABA-érgicos corticais (Chronwall, 1985; Dumont et al., 1996). 7 TABELA 2: SUBTIPOS DE RECEPTOR E SELECTIVIDADE DE PÉPTIDOS Subtipo de receptor Potência do péptido tipo Yl Y1 NPY=PYY=Pro34-NPY>PP>NPYi3_36 Y4 PP>>NPY=PYY=LP-NPY>NPYi3^36 Y6 NPY=PYY= Pro34-NPY >NPYi3_36>PP tipo Y2 Y2 NPY=PYY=NPYi3_36 > Pro34-NPY >PP tipo Y5 Y5 NPY=PYY= Pro34-NPY >NPYi3_36>PP Não clonado receptor PP PP >> PYY = NPY Y3 NPY = Pro34-NPY = NPYi3_36» PYY Preferência de PYY PYY >NPY>> NPYi3_36 » Pro34-NPY Tab. 2: Subtipos de receptor 5 selectividade de péptidos de acordo com Gehlert, 1998. νρυ, ansiedade e depressão

Os efeitos de tipo ansiolitico de NPY foram demonstrados utilizando o teste de elevação adicional do labirinto (Montgomery), o teste de bebida castigada (Vogel), e o teste de resposta castigada (Geller-Seifter), com potência e eficácia semelhantes às das benzodiazepinas (Griebel, 1999; Heilig et al., 1989; Wettstein et al., 1995). 0 NPY aumenta a assimilação de sacarose, reduz a assimilação de etanol, e reduz a ansiedade em linhas de ratos de consumo de álcool elevado e baixo (HAD1/ LAD1) (Badia-Elder, N.E. et al., Effects of neuropeptide Y (NPY) on ethanol intake and anxiety in high and low alcohol drinking (HADl/LADl) rats, Alcoholism Clinicai and Experimental Research, 24 (2000) 82A. O NPY actua de forma ansiolítica na resposta a novidade (Heilig e Murison, 1987; von Hõrsten et al., 1998b), e produz efeitos de forma ansiolítica no labirinto de elevação adicional e outros testes relacionados com a ansiedade (Wahlstedt e Reis, 1993; Wahlestedt et ai., 1993). Um facto interessante é que ratos tratados com o receptor anti-sentido Yl apresentaram comportamentos relacionados com a ansiedade acentuados, sem alterações de actividade locomotora e ingestão de comida (Wahlestedt et ai., 1993). Adicionalmente, na estirpe de rato Flinder, um modelo genético de depressão, a expressão de ARNm do receptor de Yl foi diminuída em diferentes regiões corticais e o girus dentatus do hipocampo, enquanto que a expressão do ARNm do receptor de Y2 não diferiu dos controlos (Caberlotto et ai., 1998). A bulbectomia olfactória no rato foi desenvolvida como um modelo de depressão (Leonard e Tuite, 1981). Neste modelo, a maioria das alterações parecem-se com as encontradas em doentes deprimidos (Song et al., 1996). Uma administração durante 7 dias por i.c.v. de NPY em ratos bulbectomizados olfactórios atenuou os défices de comportamento e de neurotransmissores neste modelo (Song et ai., 1996). Os NPY Yl, Y2, e possivelmente receptores Y5, parecem estar envolvidos na regulação dos níveis de ansiedade em roedores, sendo os mais bem caracterizados os efeitos mediados por Yl (Heilig et al., 1993; Kasket et al., 1998b). Pode ser concluído, por isso, que o NPY endógeno contractua o stresse e a ansiedade (Heilig et al., 1994). Além disso, estes dados sugerem que o subtipo do receptor Yl pode estar implicado em comportamentos relacionados com a ansiedade e depressão. Adicionalmente, Kask et al. (1996) relataram que a injecção i.c.v. do antagonista de Yl, BIBP3226, produziu efeitos do tipo ansiogénicos no teste de elevação adicional do labirinto , sem qualquer défice locomotor. Este 9 efeito pode ser reproduzido pela administração de BIBP3226 na matéria cinzenta periaqueductal dorsal, mas não no locus coeruleus ou no núcleo paraventricular do hipotálamo (Kask et al., 1998c). Para além disso, BIBP3226 e GR231118 administrados na matéria cinzenta periaqueductal dorsal diminuíram o tempo gasto na interacção sicial activa em ratos (Kask et al., 1998d) . As regiões do cérebro que são importantes para a acção anti-stresse de NPY incluem, mas podem não estar limitadas a amígdala (Sajdyk et al., 1999, Thorsell et al., 1999), locus coeruleus (Kask et al., 1998c) e matéria cinzenta periaqueductal dorsal (Kask et al., 1998a,b). 0 NPY da amígdala não é libertado em condições de baixo stresse uma vez que o bloqueamento de NPY de YlR com BIBP3226 ou BIBO3304 não aumentou a ansiedade como medido nos testes de labirinto de elevação adicional e de interacção social (Kask et al., 1998b; Sajdyk, 1999) . Um tom NPY-érgico constante, todavia, parece existir na matéria cinzenta periaqueductal dorsal, em que o antagonista de NPY Yi tinha tido efeitos do tipo ansiogénico em ambos os modelos de ansiedade experimentais (Kask et al., 1998a,b). Assim, em certas regiões do cérebro, pode haver uma regulação de ansiedade tónica através dos sistemas NPY.

Efeitos neurológicos e psicofisiológicos dos sistemas NPY no SNC: Pleiotropia

Assim, foram realizados numerosos estudos sobre as funções fisiológicas de NPY e seus congéneres no SNC (para revisões, ver: Kalra e Crowley, 1992; Dumont et al., 1992; Stanley, 1993; Wahlestedt e Reis, 1993; Grundemar et al., 1993; Gehlert, 1994, 1998; Colmers e Bleakman, 1994; Wettstein et al., 1995; Heilig e

Widerlow, 1995; Munglani et al., 1996; Inui, 1999; Bischoff e 10

Michel, 1999; Vezzani et al., 1999) e demonstraram uma vasta gama de efeitos. Não existem abordagens farmacológicas, no presente, para ganhar vantagem destas várias funções fisiológicas.

Problemas correntes no tratamento de distúrbios relacionados com a ansiedade utilizando benzodiazepinas ou NPY

Os métodos correntes para o tratamento de ansiedade são acompanhados por vários problemas:

As benzodiazepinas que são normalmente utilizadas como agentes ansioliticos são compostos não naturais com uma baixa ou nenhuma selectividade. Apesar da sua actividade ansiolitica, as benzodiazepinas apresentam efeitos sedativos e anti-epilépticos e são suspeitos de influenciar a relaxação muscular. Infelizmente, eles estão associados a vários efeitos colaterais indesejáveis, nomeadamente cansaço, sonolência, falta de concentração, redução da capacidade de atenção e reactividade. A aplicação crónica de benzodiazepinas provoca distúrbios neurológicos, como ataxia, tonturas, perda de reflexo, distúrbios musculares e da linguagem. Um tratamento a longo termo com benzodiazepinas é previsível que provoque dependência e viciação. A administração directa de neuropéptido Y por i.c.v. para o tratamento a longo termo da ansiedade em doentes não é prática. 0 documento WO 0053171 descreve a utilização de metformina na preparação de composições farmacêuticas úteis para inibir a 11 enzima dipeptidilpeptidase IV, em particular para aumentar a concentração no plasma de Péptido-1 do tipo Glucagão. 0 modelo de utilidade Alemão registado, DE 29909210 Ul, refere-se a isoleucil-tiazolidida e isoleucil-pirrolidida, e seus sais e a composições farmacêuticas contendo, pelo menos, um dos compostos listados acima ou um seu sal, opcionalmente, em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou solventes, úteis para baixar a glucose no sangue no soro de um mamífero e para o tratamento de Diabetes mellitus, tolerância à glucose diminuída, hiperlipidemia, aidose metabólica, neuropatia e nefropatia diabética.

Presença de actividade do tipo DP IV e DP IV no cérebro de mamíferos

Hartel-Schenk et al., 1990, estudaram a ocorrência de DP IV durante o desenvolvimento em órgãos de ratos Wistar no dia 10, 16 e 21 da gestação e nos dias 1, 4, 8, 13, 21, 26 e 60 após o nascimento compararando a imuno-histoquímica e a histoquímica da actividade. Em todos os tecidos investigados, a imunorreactividade com o anticorpo policlonal apareceu mais cedo do que a actividade de DP IV e já estava presente no dia 10 da gestação nas membranas plasmáticas de células embrionárias e extra-embrionárias (deciduais). Nestes e noutros locais, e. g., endotélio capilar do cérebro e epitélio traqueal ou brônquico, a imunorreactividade com o anticorpo monoclonal diminuiu ou desapareceu após o nascimento e a actividade enzimática nunca se desenvolveu. A imunorreactividade com os anticorpos monoclonais surgiu mais tarde do que com o anticorpo policlonal, e principalmente, nas estruturas em que a actividade de DP IV foi 12 encontrada subsequentemente. 0 anticorpo monoclonal contra o epitopo D apresentou uma reactividade elevada no dueto epididimal, duetos de recolha renal e em todos os domínios da membrana plasmática do hepatócito, em que nem a actividade de DP IV nem a imunorreactividade com os outros anticorpos foram observadas. Os seus resultados também sugerem que a DP iv pode estar presente como uma molécula antes de se tornar cataliticamente activa e que a imunorreactividade ocorre em mais sítios do que a actividade de DP IV. Por meio de técnicas imuno-histoquímicas Bernstein et al, 1987, investigaram a presença de imunorreactividade de dipeptidilaminopeptidase IV em material do cérebro derivado de fetos humanos, recém-nascidos e pessoas idosas. Foi revelado que a proteína da enzima está presente abundantemente no SNC humano imaturo. Pelo contrário o cérebro humano adulto contém muito menos imunorreactividade de dipeptidilaminopeptidase IV. Especula-se que a enzima pode desempenhar um papel importante na proliferação e/ou diferenciação neuronal, especialmente em relação à sua possível acção em certos péptidos neuronotróficos (IGF II, hormona do crescimento). A aminopeptidase M( APM), aminopeptidase A (APA), dipeptidilpeptidase IV (DP IV) e gama-glutamil transferase (GGT) demonstraram histoquimicamente em secções de criostato do cérebro de rato apresentar o padrão de reacção de epêndima, plexus coróide e leptomeninges. GGT foi apenas demonstrável nas membranas celulares de células ependimais e nas leptomeninges; todavia, APA, APM e DP IV apresentaram um grau variável de actividade no endotélio capilar do plexus coróide, bem como em leptomeninges. (Mitro & Lojda, 1988). Kato et al., 1979 encontraram actividade de x-prolil dipeptidilaminopeptidase em cérebro de rato e examinaram as alterações de desenvolvimento em várias idades. A actividade enzimática total por cérebro aumentou até às 4 semanas de idade, e depois diminuiu durante a 13 maturação. A actividade específica em cérebro de rato jovem foi superior à de um cérebro de rato adulto. As propriedades da enzima no cérebro foram diferentes das da pituitária e outros tecidos. Nássel et al., 2000, investigaram a ocorrência de actividade de DP IV específica para a prolina em tecidos de barata. A actividade de DP IV parcialmente purificada foi caracteriza a partir do cérebro e da região média do tracto digestivo de L. maderae utilizando Gly-Pro-4-nitroanilida como um substrato. A actividade mais elevada foi obtida a partir da fracção da membrana do intestino; cerca de 10 vezes menos actividade (por miligrama de proteína) foi obtida de membranas cérebro. Foi relatado que embora 55% da actividade total pós-prolina dipeptidilaminopeptidase em cérebro de cobaia esteja associada com a fracção solúvel das células, a restante actividade é vastamente distribuída ao longo das fracções particuladas. Uma porção significativa desta actividade particulada está, todavia, associada a uma fracção da membrana sinaptossomal. (0'Connor & 0'Cuinn, 1986). A investigação histoquímica por meio de microscopia óptica e electrónica revelou a presença de actividade de dipeptidilpeptidase IV em corpúsculos de Meissner da pele glabra de macaco. A actividade enzimática foi encontrada em células do tipo fibroblasto formando uma cápsula incompleta em redor do corpúsculo de Meissner. O produto de reacção electrodenso distinto devido á actividade de dipeptidilpeptidase IV foi consistentemente localizado na membrana plasmática de células de Schwann, especializadas envolvendo a porção não mielinada dos axónios sensoriais. O seu axolema era desprovido de produto de reacção de dipeptidilpeptidase IV. (Dubovy, 1988).

De Bault & Mitro, 1994, examinaram a localização de proteases de membrana glutamil aminopeptidase (EAP), alanil 14 aminopeptidase microssomal (mAAP), dipeptidilpeptidase IV (DP IV) e gama-glutamil transpeptidase (gama-GTP) em vasos do órgão subfornical de rato (SFO), epêndima que cobre a superfície de SFO, e estruturas do cérebro adjacentes. Os resultados das reacções histoquímicas enzimáticas apresentaram forte actividade para EAP, mAAP, e gama-GTP, mas, em contraste com as descobertas acima, a ausência de DP IV em microfrascos de SFO. A epêndima que cobre o SFO foi positiva para gama-GTP, mas negativa para outras proteases estudadas. Os presentes resultados demonstram que o espectro de enzima na maioria dos vasos de SFO é semelhante à dos microvasos do tecido de cérebro adjacente que foram positivos para EAP, mAAP, e gama-GTP, mas negativos para DP IV. Utilizando anticorpos contra e ADNc para DP IV. Hong et ai., 1989, avaliaram a distribuição de DP iv no tecido por abordagens moleculares em rato. Análises de imunotransferência demonstraram que a DP IV está presente no rim, pulmão, e intestino delgado a níveis elevados, no fígado e baço a níveis moderados, e no coração a níveis baixos. Os níveis mais elevados de ARNm para DP IV foram detectados no rim e no intestino delgado, em comparação com os níveis moderados encontrados no pulmão, fígado, e baço. Os níveis mais baixos de ARNm de DP IV foram encontrados no estômago, testículo, coração, músculo e cérebro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objectivo da presente invenção proporcionar um medicamento benéfico para efeitos neurológicos e psicofisiológicos, í. e., para proporcionar um medicamento para o tratamento da ansiedade. 15

Adicionalmente, é um objectivo da presente invenção superar ou reduzir os problemas da técnica anterior descritos acima, proporcionando uma abordagem farmacológica que resulta numa actividade mantida ou prolongada e/ou efeito de NPY no cérebro de mamíferos.

Estes objectivos são resolvidos através da utilização de um inibidor de dipeptidilpeptidase IV (DP IV ou CD26) para a produção de um medicamento para tratamento a ansiedade.

Isto resulta na ampliação de efeitos neurológicos ou neuropsicológicos endógenos mediados pelos receptores de NPY Yl, resultando numa redução da ansiedade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 apresenta a actividade enzimática de DP IV no soro de subestirpes de rato Fischer 344 (F344) de produtores de Hannover (HAN), Estados Unidos (EUA), Alemanha (AL) e Japoneses (JAP). Os resultados são médias (±SEM) de 4-5 animais com a mesma idade por genótipo. A análise de variância revelou um efeito significativo da "subestirpe" com F(3, 15): 50,4, p<0, 0001. Os asteriscos indicam efeitos post hoc de PLSD significativos vs. as subestirpes "tipo selvagem" F344USA e F344HAN ("***" = p<0,0001). A Figura 2 apresenta o tempo gasto em interacção social activa (SI) em subestirpes de ratos Fischer 344 (F344) de produtores Japoneses (JAP), dos Estados Unidos (EUA) e Alemanha (AL). Um amento do tempo SI no teste de ansiedade da interacção social do rato é interpretado como uma 16 resposta do tipo ansiolítico. Os resultados são médias (±SEM) de 12 animais da mesma idade por genótipo. As análises de variância revelaram um efeito significativo da "subestirpe" com F(2, 32): 8,8, p=0,0009. Os asteriscos indicam efeitos post hoc de PLSD significativos vs. ratos F344USA "de tipo selvagem" ("**" = p<0,01; "***" = p<0,001). A Figura 3 apresenta a alteração de peso corporal após stresse em três dias consecutivos. Em três dias consecutivos, animais da mesma idade de produtores Japoneses (JAP), dos Estados Unidos (EUA) e Alemanha (AL) foram transportados individualmente para uma nova sala e permaneceram lá durante 1 h. No primeiro dia, foi utilizada uma nova gaiola contendo serradura e os animais foram colocados numa estante para gaiolas de animais convencional. No Segundo dia, o processo foi o mesmo, com a excepção de que a gaiola não tinha serradura. 0 processo de stresse no terceiro dia foi igual ao do dia 2, excepto que a gaiola foi colocada no fundo de uma nova sala. A análise de variância para as repetições de medição revelou um efeito significativo da "subestirpe" com F (2, 30): 13,5, p=0, 0004. Os asteriscos indicam efeitos post hoc de PLSD significativos um factor ANOVAs separado por dia vs. F344USA "tipo selvagem" ("*" = p<0,05; "**" = p<0,01). A Figura 4 apresenta o efeito do tratamento por i.c.v. com isoleuciltiazolidina na distância percorrida em quatro minutos consecutivos de teste em campo aberto. A análise de variância para repetições de medição não revelaram efeito significativo do tratamento neste parâmetro de actividade (F(3, 78): 0,7, p=0,5; n.s.). 17 A Figura 5 apresenta o efeito do tratamento por i.c.v. com isoleuciltiazolidina sobre o tempo gasto próximo da parede como uma soma de quatro minutos consecutivos de teste em campo aberto. A análise de variância revelou um efeito significativo do "tratamento" com F(3, 26): 4,1, p=0,015. Os asteriscos indicam efeitos post hoc de PLSD significativos vs. controlos "aCFS" ("*" = p<0,05). A Figura 6 apresenta o efeito de tratamento por i.c.v. com isoleuciltiazolidina sobre a percentagem de tempo gasto nos braços abertos do teste de elevação adicional do labirinto (EPM). A análise de variância revelou um efeito significativo de "tratamento" com F (3, 26): 3,0, p=0, 048. Os asteriscos indicam efeitos post hoc de plsd significativos vs. controlos "aCFS" ("*" = p<0,05). A Figura 7 apresenta o efeito de tratamento combinado por i.c.v. utilizando aCSF, isoleuciltiazolidina e NPY em combinações a diferentes dosagens (isoleuciltiazolidina: 5 pmol-500 nmol; NPY: 50 pmol-1,6 nmol). Foi medido o tempo gasto na interacção social activa (tempo SI) no teste de ansiedade de interacção social. Um aumento do tempo SI é indicativo de um efeito do tipo ansiolítico. Após habituação ao processo do teste, os animais foram testados repetidamente com tratamento escolhido aleatoriamente e sempre com novos parceiros de interacção. Os testes foram separados com pelo menos 4 dias uns dos outros. Para cada teste, estendendo-se por quatro grupos de 5-6 animais por condição, a análise de variância revelou os seguintes efeitos significativos de "tratamento" (aCSF+aCSF; aCSF+NPY; isoleuciltiazolidina+aCSF; isoleuciltiazolidina+NPY) desde a

esquerda para a direita: isoleuciltiazolidina 5 pmol+NPY 18 50 pmol: F(3, 18): 0,25, p=0,8, n.s.; isoleuciltiazolidina 50 pmol+NPY 100 pmol: F(3, 18): 22,4, p<0, 0001; isoleuciltiazolidina 500 pmol+NPY 200 pmol: F (3, 20): 8,6, p=0,007; isoleuciltiazolidina 50 nmol+NPY 0,8 nmol: F(3, 20) : 23, 3, p<0,0001; e isoleuciltiazolidina 500 nmol+NPY 1,6 nmol: F (3, 20) : 11,2, p=0, 0008 . Os asteriscos indicam efeitos post hoc de PLSD significativos vs. controlos "aCFS+aCSF" e como indicado por barras entre aCSF+NPY vs. isoleuciltiazolidina+NPY ("*" = p<0,05). A Figura 8 apresenta o efeito de tratamento combinado por i.c.v. utilizando aCSF, isoleuciltiazolidina e NPY em combinações a dosagens diferentes (isoleuciltiazolidina: 5 pmol-500 nmol; NPY: 50 pmol-1,6 nmol). Foi medida a quantidade de comida ingerida em 1 h. Os animais foram repetidamente testados com tratamentos escolhidos aleatoriamente. Os testes foram separados por pelo menos 4 dias uns dos outros. Para cada teste, estendendo-se por quatro grupos de 5-6 animais por estado, a análise de variância revelou os seguintes efeitos significativos de "tratamento" (aCSF+aCSF; aCSF+NPY; isoleuciltiazolidina+aCSF; isoleuciltiazolidina+NPY) da esquerda para a direita: isoleuciltiazolidina 5 pmol+NPY 50 pmol: F (3, 18): 7,0, p=0, 0025; isoleuciltiazolidina 50 pmol+NPY 100 pmol: F(3, 20): 4,5, p=0:016; isoleuciltiazolidina 500 pmol+NPY 200 pmol:F(3, 20): 4,4, p=0,015; isoleuciltiazolidina 50 nmol+NPY 0,8 nmol: F (3, 20): 6,6, p=0, 0027; e isoleuciltiazolidina 500 nmol+NPY 1,6 nmol: F (3, 20): 13,7, p<0,0001. Os asteriscos indicam efeitos post hoc de PLSD significativos vs. controlos "aCFS+aCSF" e como indicado por barras entre aCSF+NPY vs. isoleuciltiazolidina+NPY ("*" = p<0.05). 19 A Figura 9 apresenta o efeito de tratamento combinado por i.c.v. utilizando aCSF, isoleuciltiazolidina e NPY em combinações a dosagens diferentes (isoleuciltiazolidina: 5 pmol-500 nmol; NPY: 50 pmol-1,6 nmol). Foi medida a quantidade de comida ingerida dentro de 12 h. Para cada teste, estendendo-se por quatro grupos de 5-6 animais por estado, a análise de variância revelou os seguintes efeitos significativos de "tratamento" (aCSF+aCSF; aCSF+NPY; isoleuciltiazolidina+aCSF; isoleuciltiazolidina+NPY) da esquerda para a direita: isoleuciltiazolidina 5 pmol+NPY 50 pmol: F(3, 18): 0,5, p=0,7, n.s.; isoleuciltiazolidina 50 pmol+NPY 100 pmol: F (3, 20): 0,17, p=0,9, n.s.; isoleuciltiazolidina 500 pmol+NPY 200 pmol: F(3,20): 1,1, p=0,34, n.s.; isoleuciltiazolidina 50 nmol+NPY 0,8 nmol:

F(3, 20): 1,2, p=0,3; e isoleuciltiazolidina 500 nmol+NPY 1,6 nmol: F (3, 20): 3,4, p=0,039. Os asteriscos indicam efeitos post hoc de PLSD significativos vs. controlos "aCFS+aCSF" e como indicado pelas barras entre aCSF+NPY vs. isoleuciltiazolidina+NPY ("*" = p<0,05). A Figura 10 apresenta o efeito de tratamento combinado i.c.v. utilizando o antagonista de YlR BIBP3226, isoleuciltiazolidina e NPY em combinações (BIBP3226: 100 nmol; isoleuciltiazolidina: 50 nmol; NPY: 0,8 nmol). Foi medido o tempo gasto na interacção social activa (tempo SI) no teste de ansiedade de interacção social. Um aumento do tempo SI é indicador de um efeito do tipo ansiolitico. Após habituação ao processo de teste, os animais foram distribuídos aleatoriamente pelos protocolos de tratamento por i.c.v. e os mesmos parceiros de interacção no tratamento. Os testes estendem-se por dois consecutivos com 20 um total de 6-8 animais por estado de tratamento. A análise de variância revelou um efeito significativo de "tratamento" com F(7, 44):33,6, p<0,0001 que se estendem pelos seguintes grupos: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP +aCSF+aCSF; (3)

aCSF+isoleuciltiazolidina+aCSF; (4) BIBP

+isoleuciltiazolidina+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP +aCSF+NPY; (7) aCSF+P32/89+NPY; (8) BIBP +isoleuciltiazolidina+NPY. 0 nivel de significância em comparações de post hoc vs. controlos (aCSF+aCSF+aCSF) é indicado por asteriscos com "*" = p<0,05; "**" = p<0,01; "***" p<0,001) e vs. correspondendo ao tratamento antagonistico (BIBP +n.n.) por símbolos "#"com "#" = p<0,05; "##" = p<0,01; "###" = p<0,001). Todos os resultados foram apresentados como médias ± s.e.m. A Figura 11 apresenta o efeito de tratamento combinado por i.c.v. na ingestão de comida em 1 h utilizando o antagonista de YlR BIBP3226, isoleuciltiazolidina e NPY em combinações (BIBP3226: 100 nmol; isoleuciltiazolidina: 50 nmol; NPY: 0,8 nmol). Após habituação ao processo de teste, os animais foram distribuídos aleatoriamente pelos protocolos de tratamento por i.c.v. e os mesmos parceiros de interacção de tratamento. Os testes estenderam-se por dois consecutivos com um total de 6-8 animais por estado de tratamento. A análise de variância revelou um efeito significativo de "tratamento" com F (7, 44): 5,4, p<0, 0002 que se estende

pelos seguintes grupos: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP

+aCSF+aCSF; (3) aCSF+isoleuciltiazolidina+aCSF; (4) BIBP +isoleuciltiazolidina+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP +aCSF+NPY; (7) aCSF+P32/89+NPY; (8) BIBP +isoleuciltiazolidina+NPY. O nível de significância em comparações post hoc vs. controlos (aCSF+aCSF+aCSF) é 21 indicado por asteriscos com = p<0,05; "**" = p<0,01; "***" = p<0,001) e vs. tratamento antagonistico correspondente (BlBP+n.n.) por símbolos "#"com "#" = p<0,05; "##" = p<0,01; "###" = p<0,001). Todos os resultados são apresentados como médias ± S.E.M.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em contraste com outros métodos propostos na técnica, a presente invenção proporciona uma terapia oral disponível com inibidores de peso molecular baixo de dipeptidilpeptidase IV. A presente invenção representa uma nova abordagem para o tratamento da ansiedade em mamíferos. É amigável para o utilizador, comercialmente útil e adequado para utilização num regime terapêutico, especialmente referente a doença humana.

Exemplos para inibidores de dipeptidilpeptidase IV de baixo peso molecular oralmente disponíveis são agentes tais como, N-(glicil substituído em N')-2-cianopirrolidinas, L-treo-isoleuciltiazolidina, L-alo-isoleuciltiazolidina, L-treo-isoleucil pirrolidina, L-alo-isoleuciltiazolidina, e L-alo-isoleucil pirrolidina. Estes são descritos nos documentos US 6001155, W099/61431, WO 99/67278, WO 99/67279, DE 19834591, WO 97/40832, DE 19616486 C2, WO 98/19998, WO 00/07617, WO99/38501, e WO 99/46272, cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência na sua totalidade. 0 objective destes agentes é inibir DP IV; e ao faze-lo, baixar os níveis de glucose no sangue, tratando deste modo eficazmente hiperglicemia e a doença auxiliar associada a níveis elevados de glucose no sangue. 22 DP IV é uma enzima que é uma exopeptidase, que cliva selectivamente péptidos após a penúltima prolina N-terminal e residuos de alanina. Os substratos endógenos para esta enzima incluem as incretinas, tais como polipéptidos insulinotrópicos dependentes da glucose, como GIP e GLP-1 truncado. Na presença de DP iv, estas hormonas são reduzidas enzimaticamente em formas inactivas. A forma inactiva de GIP e GLP-1 não pode induzir a secreção de insulina, assim, os niveis de glucose no sangue são elevados, especialmente no estado hiperglicémico. Os niveis elevados de glucose no sangue foram associados a muitas patologias diferentes, incluindo diabetes mellitus (Tipo 1 e 2) e a sequela que acompanha diabetes mellitus.

Também foi descoberto que a DP IV desempenha um papel nas respostas imunitárias mediadas por células T, por exemplo, no transplante de órgãos. A inibição de DP IV demonstrou prolongar aloenxertos cardíacos. Adicionalmente, a inibição de DP IV contribuiu para a supressão da artrite reumatóide. Também foi atribuído à DP IV um papel na penetração do HIV nas células T (células T auxiliares).

Estes vários efeitos de inibidores de dipeptidilpeptidase IV implicam o seu impacto nos tecidos e órgãos saudáveis normais, quando eles são utilizados para o tratamento de um tecido patologicamente alterado. 0 objectivo da presente invenção é o desenvolvimento de agentes do cérebro direccionados que mantém, aumenta ou prolonga o efeito ou actividade de NPY e que apresenta uma elevada biodisponibilidade e um tempo de actividade exactamente previsível no tecido alvo.

Os exemplos de agentes de baixo peso molecular e específicos alvo, oralmente disponíveis são os pró-fármacos de inibidores 23

estáveis e instáveis de dipeptidilpeptidase IV que compreendem a fórmula geral A-B-C, em que A representa um aminoácido, B representa a ligação quimica entre A e C ou um aminoácido, e C representa inibidor estável ou instável de dipeptidilpeptidase IV, respectivamente. Estes são descritos em WO 99/67278, WO 99/67279 cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência na sua totalidade. E aqui divulgado que a administração de um inibidor da enzima dipeptidilpeptidase (DP iv ou CD 26) no cérebro de mamíferos leva, como consequência causal a uma degradação reduzida do neuropéptido Y (NPY). Este tratamento resultará numa redução ou atraso no decréscimo da concentração de NPY (1-36) funcionalmente activo.

De acordo com a presente invenção, verificou-se que o efeito e/ou actividade de NPY no cérebro de mamífero, especialmente humanos, pode ser mantida ou prolongada pela administração de inibidores de dipeptidilpeptidase IV (DP IV) . Deste modo, a degradação de NPY no cérebro pode ser reduzida. A presente invenção representa especialmente uma nova abordagem para o tratamento de ansiedade. É amigável para o utilizador, comercialmente útil e adequado para a utilização num regime terapêutico, especialmente relacionado com a doença humana. A observação de que a administração de inibidores de DP IV pode evitar ou abrandar a degradação de NPY no cérebro é particularmente surpreendente pelas seguintes razões: Hong et al., 1989, avaliaram a distribuição em tecidos de DP IV em tecidos de rato, utilizando anticorpos contra e ADNc para DP IV. A análise por imunotransferência demonstrou que a DP IV está presente no rim, pulmão e intestino delgado a elevados níveis, no fígado e baço a níveis moderados, e no coração a baixos 24 níveis. Os níveis de ARNm mais elevados para DP IV foram detectados no rim e intestino delgado como comparado com os níveis moderados encontrados no pulmão, fígado, e baço. Os níveis mais baixos de ARNm de DP IV foram encontrados no estômago, testículos, coração, músculo e cérebro.

Hartel-Schenk et al., 1990, estudaram a ocorrência de DP IV durante o desenvolvimento em órgãos de rato Wistar no dia 10, 16 e 21 de gestação e no dia 1, 4, 8, 13, 21, 26 e 60 após o nascimento comparando a imuno-histoquímica e a actividade histoquímica. Em todos os tecidos investigados, a imunorreactividade com o anticorpo policlonal apareceu mais cedo do que a actividade de DPIV já estava prontamente presente no dia 10 de gestação mas membranas plasmáticas de células embrionárias e extra-embrionárias (deciduais). Neste e noutros sítios, e. g. endotélio capilar do cérebro e epitélio da traqueia ou dos brônquios, a imunorreactividade com o anticorpo policlonal diminuiu ou desapareceu após o nascimento e nunca desenvolveu actividade enzimática. A imunorreactividade com os anticorpos monoclonais apareceu mais tarde do que com o anticorpo policlonal e, principalmente, nestas estruturas em que a actividade de DP IV foi subsequentemente encontrada. O anticorpo monoclonal contra o epitopo D apresentou uma elevada reactividade no dueto do epidídimo, duetos de recolha renais e em todos os domínios da membrana plasmática do hepatócito, em que não foi observada nem actividade de DP IV nem imunorreactividade com os outros anticorpos. Os seus resultados também sugerem que a DP IV possa estar presente como uma molécula antes de se tornar cataliticamente activa e que a imunorreactividade ocorre em mais sítios do que na actividade de DP IV. Através de técnicas imuno-histoquímicas, Bernstein et al., 1987, investigaram a presença de imunorreactividade de 25 dipeptidilaminopeptidase IV em material cerebral derivado de fetos humanos, recém nascidos e pessoas idosas. Foi revelado que a proteina enzimática está abundantemente presente no SNC imaturo humano. Pelo contrário, o cérebro humano de adulto contém muito menos imunorreactividade com dipeptidilaminopeptidase. É especulado que a enzima pode desempenhar um papel importante na proliferação neuronal e/ou diferenciação, especialmente, em relação á sua possível acção em certos péptidos neuronotróficos (IGF II, hormona do crescimento) . De Bault & Mitro, 1994, examinaram a localização proteases glutamilaminopeptidase (EAP) de membrana, alanilaminopeptidase (mAAP) microssómicas, dipeptidilpeptidase IV (DP IV) e gama-glutamiltranspeptidase (gama-GTP) em vasos do órgão subfornical do rato (SFO), epêndima que cobre a superfície do SFO, e estruturas cerebrais adjacentes. Os resultados das reacções enzimáticas histoquimicas mostram uma forte actividade para EAP, mAAP, e gama-GTP, mas, em contraste com as observações acima, a ausência de DP IV em microvasos de SFO. 0 epêndima que cobre a SFO foi positiva para gama-GTP, mas negativa para outras proteases estudadas. Os seus resultados mostram que o espectro das enzimas na maioria dos vasos de SFO é semelhante ao dos microvasos do tecido cerebral adjacente que foi positivo para EAP, mAAP, e gama-GTP, mas negativo para DP IV. Utilizando anticorpos contra ADNc para DP IV.

Contrariamente a estas observações, a presente invenção mostra que a administração de inibidores de DP IV como isoleuciltiazolidina produz um efeito ansiolitico em ratos. Surpreendentemente, a presente invenção mostra que, a administração do inibidor de DP IV isoleuciltiazolidina exibe um efeito ansiolitico em ratos. 26

Como uma consequência da estabilidade melhorada resultante de NPY endógeno (1-36) causada pela administração de inibidores de DP IV, a actividade de NPY é mantida, aumentada ou prolongada resultando na actividade do receptor Yl de NPY funcionalmente activo facilitando efeitos ansioliticos (ver acima). 0 método da presente invenção para tratamento de ansiedade num animal, incluindo humanos, em necessidade deste, compreende a potenciação da presença de NPY através da administração de inibidores de DP IV, ou actividades enzimáticas relacionadas. A administração oral de um inibidor de DP IV pode ser preferível na maioria das circunstâncias. Através da administração de um inibidor de DP IV ou de actividade de enzimas do tipo DP IV, a semi-vida da forma activa de NPY será estendida de modo considerável, aumentada ou mantida sob condições fisiológicas. A presença estendida de NPY activo melhorará a actividade do receptor Yl de NPY. São também reveladas composições farmacêuticas. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente (ou profilacticamente) eficaz do inibidor (e/ou um comprimido de açúcar para acompanhar a administração de um inibidor de DP IV), e um veículo ou excipiente farmaceuticamente eficaz, especialmente adaptado para se dirigir ao cérebro. Os veículos adequados incluem, mas não são limitados a, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose, água, glicerol, etanol, e suas combinações. 0 veículo e composição são, de um modo preferido, produzidos sob condições de boas práticas de laboratório e de um modo muito preferido, são estéreis. A formulação é idealmente seleccionada para se adaptar ao modo de administração, de acordo com a prática convencional. 27

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, água, soluções salinas (por exemplo, NaCl), álcoois, goma arábica, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietilenoglicóis, gelatina, carbo-hidratos tais como lactose, amilose ou amido, estearato de magnésio, talco, parafina viscosa, óleo de perfume, ésteres de ácido gordo, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona, etc. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizadores, agentes de humedecimento, emulsificantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, substâncias corantes, aromatizantes e/ou aromáticos e semelhantes, que não reagem de forma prejudicial com os compostos activos, mas que melhora a estabilidade, capacidade de produção e/ou atracção estética.

As composições, se desejado, podem também conter quantidades menores de agentes de humedecimento ou de emulsificação, ou agentes de tamponação de pH. Adicionalmente, a composição pode ser uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de libertação sustentada, ou pó. Adicionalmente, a composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais tais como triglicéridos. As formulações orais podem incluir veículos convencionais, tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio etc., de grau farmacêutico.

Além disso, as composições podem ser formuladas de acordo com processos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são 28 soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Quando necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local para aliviar a dor no sitio da injecção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em conjunto na forma de dosagens unitárias, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou concentrado isento de água num recipiente hermeticamente selado, tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de composto activo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril, salino ou dextrose/água de grau farmacêutico. Quando a composição é administrada por injecção, pode ser fornecida uma ampola de água estéril ou soro fisiológico para injecção de modo a que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

Finalmente, as composições podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com grupos amino livres, tais como os derivados de ácido clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc. A quantidade de composição que será eficaz no tratamento de ansiedade pode ser determinada por técnicas clínicas convencionais. Adicionalmente, os ensaios in vitro e/ou in vivo podem opcionalmente ser empregues para ajudar a identificar os intervalos de dosagem óptimos. A dose precisa para ser empregue na formulação dependerá, também, da via de administração e a seriedade da doença ou distúrbio, e devem ser decididas de 29 acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada doente. A presente invenção será agora ilustrada com referência aos exemplos que se seguem focando na acção ansiolitica e protectora de stress num modelo genético de deficiência em DP iv (exemplo 1), a acção ansiolitica de doses farmacológicas de inibidores de DP IV no SNC (exemplo 2), a interacção e potenciação de efeitos ansioliticos mediados por NPY (exemplo 3), e a caracterização de um mecanismo ansiolitico baseado na potenciação dos efeitos mediados pelo receptor Yl de NPY (Exemplo 4). EXEMPLOS DA INVENÇÃO Exemplo 1

As mutações espontâneas do gene DP IV observadas nas subestirpes de ratos Fischer (F344) proporcionam um modelo para o estudo do papel de DP IV na regulação do comportamento e adaptação ao stresse. As mutações em ratos F344 resultam numa ausência de actividade enzimática do tipo de DP IV e são encontradas em subestirpes da Alemanha (AL) e Japão (JAP) (Thompson et ai.,1991; Tsuji et al., 1992) enquanto ratos dos criadores de US (EUA) e Hannover (HAN) apresentam uma actividade enzimática significativa. Em ratos F344JAP, uma substituição G633R na proteína CD26 causa uma expressão altamente reduzida de uma enzima mutante inactiva (Tsuji et al.r 1992; Cheng et al., 1999) enquanto a outra subestirpe F344GER negativa para DP IV expressa uma enzima mutante não activa (Thompson et al., 1991). 0 rato F344JAP é, deste modo, considerado como um modelo de 30 "proteína desactivada" (Cheng et al., 1999) enquanto a subestirpe F344GER pode representar um modelo de "sobreexpressão de proteína" (Shingu, Helfritz, Meyer, Schmidt, Mentlein, von Hõrsten, submetido). Na base destas observações, uma comparação directa do mutante F344JAP e subestirpes F344GER com os ratos F344USA do "tipo selvagem" permitirá a diferenciação entre o papel da expressão de DP IV e a actividade na regulação do comportamento e outras funções neurológicas e psicofisiológicas in vivo. No presente exemplo é reportado que as subestirpes F344 deficientes em DP iv são menos ansiosas e produzem menos respostas às alterações fisiológicas induzidas pelo stresse.

Animais. As subestirpes F344USA, F344JAP e F344GER foram obtidas de diferentes países através de Charles River Alemanha, os ratos F344Han, inicialmente derivados da subestirpe F344USA, foram obtidos de uma colónia de criação no Central Animal Laboratory na Hannover Medicai School (para mais informação, ver: http://www.mh-hannover.de/institut/tierlabor/f344.htm).

Todas as subestirpes foram criadas durante uma geração no Central Animal Laboratory em Hannover e mantidas numa instalação específica isenta de patogénicos a 25 °C sob um ciclo de 12 h luz-12 h escuro (luz acesa às 07.00 h), com acesso ad libitum a comida e água. Para as experiências foi utilizada a descendência Fl com as mesmas semanas de idade de todas as subestirpes. 0 Governo Distrital, Hannover, Alemanha, aprovou todos os processos de pesquisa e cuidados animais.

Quantificação da actividade DP IV em tecido de subestirpe F344. Plasma, pulmão e várias outras amostras de tecido foram mantidas a -80 °C até utilização. O tecido foi homogeneizado e a actividade da enzima DP IV foi detectada por incubação do substrato, glicilprolina p-nitroanilida (gli-Pro-pNA, 1 mg/mL em 31 PBS) (Bachem. Alemanha), e o desenvolvimento de cor foi medido a 405 nm.

Teste de interacção social (SI). O teste SI foi efectuado como inicialmente descrito por File (1980) e foi inicialmente validado no laboratório (Kask, Nguyen. Pabst, von Hõrsten, submetido). Dois ratos, com genótipo e peso corporal coincidentes, foram removidos das gaiolas habituais e expostos ao ambiente de teste. A arena foi um campo aberto em quadrado (50 x 50 x 50 cm) feito de alumínio, colocado dentro de uma caixa com isolamento de som (Coulbourn Instruments, Lehigh Valley, PA) . Para detalhes do equipamento ver o nosso estudo prévio (von Horsten et ai., 1998c). O campo aberto foi iluminado por uma lâmpada vermelha de fotografia (Philips PF712E; 1.3 Lux). Os ratos não estavam familiarizados com o equipamento. O comportamento foi monitorizado utilizando uma câmara vídeo colocada acima do campo dentro caixa de teste/isolamento. O comportamento SI de ambos os ratos foi registado em tempo real a partir de um monitor colocado fora no topo da caixa. Os parâmetros que se seguem foram avaliados por um observador (HPN) desconhecedor da subestirpe de ratos: duração do tempo gasto a fungar, em seguida, rastejamento sob e sobre outros ratos, mas não o contacto corporal passivo (repouso, sono) . Um aumento do tempo SI é considerado um tipo ansiolítico resposta.

Stresse induziu perda de peso corporal. Em três dias consecutivos, os animais com a mesma idade de criadores Japoneses (JAP), Estados Unidos (EUA) e Alemanha (AL) foram individualmente transportados para um novo compartimento e aí permaneceram durante 1 h. No primeiro dia, foi utilizada uma nova gaiola contendo serradura e os animais colocados num suporte de gaiolas convencional. No segundo dia o processo foi o 32 mesmo, excepto que a gaiola não continha serradura. 0 processo de stresse no terceiro foi o mesmo do dia 2 excepto que a gaiola foi colocada no fundo do novo compartimento.

Análise estatística. Os dados das observações repetidas foram analisados por análises de variância de duas vias para medições repetidas (ANOVA) (factores: "subestirpe" e "alteração de peso corporal após stresse" como medição repetida). Os dados obtidos de medições simples, tais como a actividade de DP IV ou tempo de Si foram analisados por ANOVA de uma via (factor: "subestirpe"). Os asteriscos indicam efeitos post hoc significativos vs. subestirpe F344USA (Controlo) obtido por PLSD de Fisher. Todos os dados são apresentados como médias ± S.E.M.

Actividade DP IV em subestirpes F344. Correspondendo à literatura, as subestirpes F344GER e F344JAP não possuem actividade endógena de DP iv (Fig. 1) . Deste modo, estes ratos proporcionam um modelo genético para a investigação do papel fisiológico da actividade de DP IV na regulação do comportamento.

Ansiedade no teste de interacção social; estas subestirpes F344 subestirpes que não possuem actividade DP IV (F344JAP e F344GER) gastam significativamente mais tempo na interacção social activa com uma nova arena (Fig. 2). Deste modo, a ausência de actividade endógena do tipo DPIV medeia os efeitos do tipo ansiolitico.

Perda de peso corporal induzida por stresse: F344JAP e F344GER perdem significativamente menos peso corporal após stresse de transporte repetido durante lh. Deste modo, a ausência de actividade endógena do tipo DP IV nestas subestirpes 33 reduz as alterações fisiológicas induzidas por stresse moderado (Fig.3).

Em conjunto, estes dados demonstram que no modelo genético de ratos F344 deficientes em DP IV a ausência de actividade DP iv endógena causa efeitos do tipo ansioliticos e efeitos de protecção ao stresse.

Exemplo 2

No exemplo anterior foi demonstrado que a incapacidade de resposta a ansiedade e stresse foram reduzidas num modelo genético de deficiência em DP IV. No presente exemplo, reporta-se que a administração central (i.c.v.) do inibidor de DP IV isoleuciltiazolidina levou a efeitos do tipo ansiolítico num teste de ansiedade bem estabelecido em roedores, o teste da elevação adicional do labirinto. Reporta-se ainda que também a capacidade de emoção de ratos em resposta à novidade, conforme medido pelo paradigma de campo aberto (Denenberg et al., 1968) é menos pronunciada em ratos tratados com isoleuciltiazolidina sem afectar a actividade.

Animais. Ratos machos WistarF/Han (WF) (Central Animal Laboratory, Hannover Medicai School, Hannover, Alemanha, ver http://www.mh-hannover.de/institut/tierlabor/wf.htm para detalhes), pesando 350-390 g, foram colocados em gaiolas à prova de som, temperatura ambiente controlada (24,0±0,5 °C) sob condições especificas de ausência de patogénicos com um ciclo de 12/12 h escuro/luz (luzes acesas às 07.00 com um nível de iluminação de 80 Lux) . A comida (ração de laboratório prensada

Altromin) e água da torneira foram disponibilizadas ad libitum. 34

Sob anestesia de quetamina/xilasina (100/5 mg/kg, i.p.), os ratos foram fixos numa estrutura estereotáxica de Kopf e implantados com cânulas (Plastic One, Inc., Roanoke, VA, USA) acima do ventrículo lateral. Todos os processos de pesquisa e de cuidados animais foram aprovados pelo governo do distrito de Lower Saxony (Hannover, Alemanha) e seguiram os princípios descritos na Directiva do Conselho da Comunidade Europeia de 24 de Novembro de 1986 (86/609/EEC) .

Cirurgia e aplicações i.c.v. Para cirurgia, os ratos foram anestesiados e preparados com cânulas i.c.v. (coordenadas: A:-0,7 mm caudal, L:l,4 mm lateral em relação a bregma; e V:3,2 mm ventral em relação à superfície do cérebro; barra de dentes +3,0 acima da barra das orelhas) utilizando processos estereotáxicos convencionais como descrito em detalhe noutro trabalho (von Horsten et al., 1998a, b, c) . Após um período de recuperação de 7 dias, o sucesso da canulação do ventrículo foi confirmada por uma resposta de bebida à angiotensina (von Horsten et al., 1998a). Os ratos apresentando uma resposta de bebida positiva (n=40) foram então habituados à manipulação experimental através de injecções diárias simuladas durante sete dias.

Os animais foram aleatoriamente divididos em quatro grupos experimentais (n=8-10/grupo), que completaram diferentes testes de comportamento de ansiedade experimental. Os animais em cada grupo foram tratados de uma forma idêntica em cada fase, recebendo injecções i.c.v. -60 min antes do teste de comportamento: Fluido artificial cerebrospinal (aCSF) (Controlo), isoleuciltiazolidina (0,05 nmol), isoleuciltiazolidina (5 nmol) e isoleuciltiazolidina (500 nmol), a isoleuciltiazolidina foi ajustada para a concentração final 35 utilizando aCSF tamponado e aplicado num volume de 5 pL/min no ventrículo lateral direito. A cânula foi ligada à micro-seringa com aproximadamente 30 cm de tubagem de polietileno e todos os compostos foram submetidos a infusão a um caudal de 5,0 mL/min utilizando uma bomba de infusão multicanal TSE(Bad Homburg, Alemanha).

Resposta à novidade (teste em campo aberto). As diferenças na resposta à novidade induzidas pelo antagonismo central de DP IV foram estudadas utilizando um teste de campo aberto (OF) . O processo geral foi descrito noutro trabalho em detalhe (von Hõrsten et al., 1993, 1998d). Contudo, foram aplicadas as modificações que se seguem: Durante a fase escura, os ratos foram colocados num quadrado 50x50cm OF numa caixa com isolamento de som iluminada por uma luz vermelha de fotografia. A actividade espontânea durante uma simples sessão de teste continua de 15 min foi registada utilizando um sistema de análise de video (E61-21 Video Path Analyser system, Coulbourn Instruments, PA, E.U.A.). O sistema de análise determina o comportamento a 15 intervalos de um min, analisando 14 elementos de dados: Parede-, esquina-, quadrante 1-4-, locomoção-, repouso-, e tempo de empinamento (todos em seg.), estéreo-, empinamento-, rotação no sentido do relógio- e eventos contra o sentido do relógio (todos inteiros), e distância viajada (cm). Além disso, a incidência total de boli fecais foi contada após cada sessão e a incidência e duração (seg) do comportamento alimentar foi simultaneamente registado a partir de um monitor video por uma pessoa cega para o tratamento de animais (von Hõrsten et al., 1998c).

Teste de labirinto de elevação adicional (EPM). O dispositivo de labirinto de elevação adicional e o processo de 36 teste foi adaptado de acordo com Fernandes e File 1996 com base nas considerações gerais e validação para utilização com ratos. 0 equipamento E+ (TSE Systems, Bad Homburg, Alemanha) foi feito com plástico cinzento e possui dois braços abertos (50 x lOcm) e dois braços fechados do mesmo tamanho com paredes com 40 cm de altura, elevadas 50 cm acima do chão. O labirinto foi equipado com sensores de feixes de luz que permitem a medição computorizada do desempenho E+. O labirinto foi iluminado com uma lâmpada de luz vermelha (Philips PF712E; 1,5 Lux) colocada 30 cm acima do labirinto de uma forma que os braços fechados permaneciam na sombra. No início da experiência, o rato foi colocado numa plataforma central (10 x 10 cm), com a sua cabeça virada para o braço fechado, e foram deixados a explorar livremente o labirinto durante 5 min. Os parâmetros que se seguem foram calculados: Número total de entradas do braço (TA); entradas nos braços fechados (CA); entradas para abrir os braços (OA) ; frequência da percentagem de entradas para abrir os braços (%OA: OAx 100/TA); duração total do ensaio (TT): 300s; duração da estadia nos braços fechados (tempo fechado; CLT); partilha da percentagem de CLT na duração total da estadia nos braços (CLTxl00/AT); duração da estadia em braços abertos (tempo aberto; OT) e partilha da percentagem de OT na duração total da estadia em braços (%OT: OTxl00/AT). Adicionalmente às medições espaço-temporais convencionais, "tempo gasto e percentagem de tempo no quadrado central" foram registados (tempo no centro, CT: duração da estadia na plataforma em segundos; partilha de percentagem de CT na duração do ensaio, %CT: CTx 100/TT) . Um aumento do tempo gasto nos braços abertos é interpretado como uma resposta ansiolítica, um decréscimo neste pârametro uma resposta ansiogénica, enquanto o número de entradas nos braços fechados proporciona uma indicação de actividade geral (Pellow et al., 1985) . 37

Análise estatística. Para análise estatística, os dados brutos de comportamento de todos os minutos dos testes foram analisados por análise de variância de duas vias (ANOVA) para medições repetidas (factores: tratamento e tempo como uma medida repetida). Os dados obtidos como totais de uma sessão foram analisados por ANOVA de uma via (factor: tratamento). Os efeitos significativos post hoc vs. aCSF (Controlo) obtido por PLSD de Fisher estão indicados por um asterisco. Todos os dados são apresentados como médias +S.E.M.

Resposta a isoleuciltiazolidina em campo aberto: a isoleuciltiazolidina não produziu efeito na actividade no campo aberto numa vasta gama de dosagens (Fig. 4). Como na característica de emocionalidade reduzida no campo aberto, verificou-se uma redução dependente da dose do tempo gasto no fecho da parede induzido pela isoleuciltiazolidina (Fig.5). foi prontamente eficaz uma dosagem baixa de 50 pmol.

Resposta a isoleuciltiazolidina no EPM: isoleuciltiazolidina a dose baixa (50 pmol) aumentou a percentagem de tempo gasto na abertura dos braços do labirinto sendo indicativo de um efeito do tipo ansiolítico (Fig. 6) . Em conjunto, estes dados indicam pela primeira vez que a administração de doses farmacológicas do inibidor de DP IV isoleuciltiazolidina produzem efeito do tipo ansiolítico dependente da dose em dois modelos animais de ansiedade. 38

Exemplo 3

No presente exemplo, é reportado que a administração central (i.c.v.) do próprio inibidor de DP IV isoleuciltiazolidina possui também efeitos ansiolíticos dependentes da dose no teste de interacção social de ansiedade. É também reportado que a magnitude da ansiólise pela isoleuciltiazolidina é semelhante à que é produzida por NPY. Adicionalmente, mostra-se que a aplicação combinada de isoleuciltiazolidina e NPY possui efeitos ansiolíticos aditivos no teste Si. Finalmente, é mostrado que a ingestão de comida a 1 h e 12 h é menos afectada pelo tratamento com apenas isoleuciltiazolidina e em combinações.

Animais. Ratos machos WistarF/Han (WF) (Central Animal

Laboratory, Hannover Medicai School, Hannover, Alemanha, ver http://www.mh-hannover,de/institut/tierlaborlwf.htm para detalhes), pesando 330-370 g, foram colocados em gaiolas à prova de som, temperatura ambiente controlada (24,0±0,5 °C) sob condições específicas na ausência de patogénicos com um ciclo 12/12 h de luz/escuro (luzes acesas às 07.00 com um nível de iluminação de 80 Lux). A comida (ração de laboratório prensada Altromin) e água da torneira foram disponibilizadas a d libitum. Sob anestesia com quetamina/xilasina (100/5 mg/kg, i.p.), os ratos foram fixos numa estrutura estereotáxica de Kopf e implantados com cânulas (Plastic One, Inc., Roanoke. VA, EUA) acima do ventrículo lateral. Todos os processos de pesquisa e de cuidados animais foram aprovados pelo governo do distrito de Lower Saxony (Hannover, Alemanha) e seguiram os princípios descritos na Directiva do conselho da Comunidade Europeia de 24 de Novembro de 1986 (86/609/EEC). 39

Cirurgia e aplicação i.c.v. Para cirurgia, os ratos foram anestesiados e preparados com cânula i.c.v. (coordenadas: A:-0,7 mm caudal, L: 1,4 mm lateral em relação a bregma; e V3,2 mm ventral em relação à superfície do crânio; barra de dentes +3,0 acima da barra das orelhas) utilizando processos estereotáxicos convencionais como descrito em detalhe noutro trabalho (von Hõrsten et ai., 1998a, b, c) . Após um período de recuperação de 7 dias, o sucesso da cânulação ventricular foi confirmado através de uma resposta de bebida a angiotensina (von Hõrsten et al., 1998a). Os ratos que apresentam uma resposta de bebida positiva (n=59) foram depois habituados à manipulação experimental através de injecções simuladas diárias durante sete dias.

Os animais foram aleatoriamente divididos em dois conjuntos de quatro grupos experimentais (n=5-6/grupo), que completaram os diferentes testes SI de ansiedade consecutivos. Os animais em cada grupo foram tratados de forma idêntica em cada fase, recebendo injecções i.c.v. -60mins e -45min antes do teste comportamental com diferentes dosagens (isoleuciltiazolidina: 5 pmol-500 nmol; NPY: 50 pmol-1.6 nmol), a isoleuciltiazolidina foi ajustada para uma concentração final utilizando aCSF tamponado e aplicado num volume de 5 mL/min no lado direito do ventrículo. A cânula foi ligada a uma micro-seringa com aproximadamente 30 cm de tubagem de polietileno e todos os compostos foram submetidos a infusão num volume total de 5,0 mL a um caudal de 5,0 mL/min utilizando uma bomba de infusão multicanal TSE (Bad Homburg, Alemanha). Foram medidos o tempo gasto na interacção social activa (tempo Si), a ingestão de comida a 1 h e 12 h. Os animais foram repetidamente testados com tratamento aleatoriamente escolhido e sempre com novos parceiros de interacção. Os testes foram separados com, pelo menos, 4 dias 40 um do outro e sempre conduzidos no ciclo escuro. Foram efectuados cinco séries de testes. Cada teste foi realizado em quatro grupos (aCSF+aCSF; aCSF+NPY; isoleuciltiazolidina+aCSF; isoleuciltiazolidina+NPY) de 5-6 animais por estado.

Teste de interacção social (Si). 0 teste SI foi efectuado como inicialmente descrito por File (1980) e foi inicialmente validado no laboratório (Kask, Nguyen, Pabst, von Hõrsten, submetido). Dois ratos, coincidentes no genótipo e peso corporal, foram removidos das gaiolas habituais e expostos ao ambiente de teste. A arena foi um campo aberto em quadrado (50 x 50 x 50cm) feito de alumínio, colocado entro de uma caixa com isolamento de som (Coulbourn Instruments, Lehigh Valley, PA) . Para detalhes do equipamento ver o nosso estudo prévio (von Hõrsten et al., 1998c). O campo aberto foi iluminado por uma lâmpada vermelha de fotografia (Philips PF712E; 1.3 Lux). Os ratos não estavam familiarizados com o equipamento. O comportamento foi monitorizado utilizando uma câmara video colocada acima do campo dentro da caixa de teste/isolamento. O comportamento SI de ambos os ratos foi registado em tempo real a partir de um monitor colocado fora no topo da caixa. Os parâmetros que se seguem foram avaliados por um observador (HPN) desconhecedor da subespécie de ratos: duração do tempo gasto a fungar, seguindo-se, rastejamento sob e sobre outros ratos, mas não o contacto corporal passivo (repouso, sono). Um aumento do tempo SI é considerado uma resposta do tipo ansiolítico.

Análise estatística. Os dados de observações repetidas (ingestão de comida) foram analisadas por análises de variância de duas vias para medidas repetidas (ANOVA) (factores: "subespécie" e "ingestão de comida" como medidas repetidas). Os

dados obtidos de medidas simples tais como a actividade de DP IV 41 ou tempo SI foram analisadas por ANOVA de uma via (factor: "subespécie"). Os asteriscos indicam efeitos significativos post hoc vs. aCSF+aCSF (Controlo) obtido por PLSD de Fisher. Todos os dados são apresentados como médias ± S.E.M.

Ansiólise dependente da dose no teste SI da isoleuciltiazolidina. A administração central do inibidor de DP IV isoleuciltiazolidina (grupo: aCSF+isoleuciltiazolidina: 5 pmol-500 nmol) produziu efeitos tipo ansiolitico "em forma de sino" dependentes da dose no teste da interacção social de ansiedade (Fig. 7) . Isto demonstra que a isoleuciltiazolidina actua também no teste SI como um potente composto do tipo ansiolitico - semelhante ao EPM e os testes em campo aberto (ver exemplo 2). A aplicação i.c.v. de NPY (0,05-1,6 nmol) teve um efeito do tipo ansiolitico semelhante (Fig. 7). Esta verificação replica a conhecida de NPY do tipo ansiolitico, como descrito nos antecedentes da técnica. A comparação dos efeitos mediados por isoleuciltiazolidina com os de NPY indicam que o inibidor é de potência semelhante. Interessantemente, o pré-tratamento de isoleuciltiazolidina seguido por NPY produziu um efeito aditivo ao longo de uma vasta gama de dosagens (Fig. 7), sugerindo que estes compostos actuam através do mesmo mecanismo. Como descrito na técnica anterior, estes mecanismos são, mais provavelmente, a activação de receptores Y 1 do SNC.

Efeitos Menores da isoleuciltiazolidina na alimentação. A Fig. 8 e a Fig. 9 demonstram que alho NPY produziu um efeito de alimentação em "forma de u" dependente da dose (Fig. 8) . A isoleuciltiazolidina produziu um efeito moderado na alimentação em que apenas a uma dose de 0,05 nmol dose atinge significado (Fig.8). O tratamento combinado de isoleuciltiazolidina seguido por NPY não diferiu do com NPY isolado (excepto em dosagens 42 superiores não fisiológicas), sugerindo que o efeito na alimentação de NPY não é mediado através de um mecanismo que é afectado por isoleuciltiazolidina. A maioria dos dados da técnica anterior indicam que o efeito de NPY na alimentação no ciclo escuro é primariamente mediado pelo receptor Y5. a ingestão de alimentos durante a noite não foi afectada por qualquer tratamento, excepto em dosagens extremamente elevadas (Fig. 9). Deste modo, a aplicação central do inibidor da DP IV isoleuciltiazolidina não afecta os principais sistemas reguladores da alimentação (i. e. o receptor Y5 de NPY).

Exemplo 4

No presente exemplo é reportado no mecanismo para a potenciação de efeitos mediados por NPY do tipo ansiolítico em dosagens moderadas (isoleuciltiazolidina, 50 nmol; NPY, 0,8 nmol) como apresentado na Fig. 7 do Exemplo 3. É confirmado que o pré-tratamento utilizando o antagonista BIBP3226 do receptor Yl de NPY pode bloquear a potenciação do efeito tipo ansiolítico mediado por NPY induzido por isoleuciltiazolidina no comportamento SI e deste modo, mostra que os efeitos na alimentação a 1 h são apenas parcialmente afectados pelo bloqueio do YlR.

Animais. Ratos machos WistarF/Han (WF) (Central Animal Laboratory. Hannover Medicai School, Hannover, Alemanha, ver http://www.mh-hannover.de/institut/tierlabor/wf,htm para detalhes), pesando 330±31 g±SD, foram colocados em gaiolas à prova de som, com temperatura ambiente controlada (24,0±0,5 °C) sob condições específicas de ausência de patogénicos com um ciclo de luz 12/12 h escuro/luz (luzes acesas às 07.00 num nível 43 de iluminação de 80 Lux). A comida (ração prensada de laboratório Altromin) e água da torneira foram disponibilizadas ad. libitum. Sob anestesia de quetamina/xilasina (100/5 mg/kg, i.p.), os ratos foram fixados numa estrutura estereotáxica de Kopf e implantados com cânulas (Plastic One, Inc., Roanoke, VA, EUA) acima do ventrículo lateral. Todos os processos de pesquisa e de cuidados animais foram aprovados pelo governo do distrito de Lower Saxony (Hannover, Alemanha) e seguiram os princípios descritos na Directiva do Concelho da Comunidade Europeia de 24 de Novembro de 1986 (86/609/EEC).

Cirurgia e aplicação i.c.v. para a cirurgia, os ratos foram anestesiados e preparados com cânula i.c.v. (coordenadas: A:-0,7 mm caudal, L:l,4 mm lateral a bregma; e V3,2 mm ventral em relação à superfície do crânio; barra dentária +3,0 acima das barras das orelhas) utilizando processos estereotáxicos convencionais como descrito em detalhe noutro local (von Hõrsten et al., 1998a, b, c) . Após um período de recuperação de 7 dias, a canulação bem sucedida do ventrículo foi confirmado por uma resposta de bebida a angiotensina (von Hõrstenet al., 1998a). os ratos que apresentam uma resposta de bebida positiva (n=56) foram depois habituados a manipulação experimental através de injecções diárias simuladas durante sete dias.

Os animais foram aleatoriamente divididos em oito grupos experimentais (n=6-8/grupo), que completaram um teste SI de ansiedade: (1) aCSF+aCSF+aCSF; (2) BIBP+aCSF+aCSF; (3) aCSF+isoleuciltiazolidina+aCSF; (4)

BlBP+isoleuciltiazolidina+aCSF; (5) aCSF+aCSF+NPY; (6) BIBP+aCSF+NPY; (7) aCSF+P32/89+NPY; (8) BIBP+isoleuciltiazolidina+NPY. Os animais em cada grupo foram tratados de uma forma idêntica em cada fase, recebendo injecções 44 i.c.v. -60 min e-55 min antes do teste de comportamento. As experiências duraram duas noites com grupos de contrabalanço em ambos os ciclos de escuro. A cânula de injecção foi ligada a uma micro-seringa de Hamilton com aproximadamente 30 cm de tubagem de polietileno e todos os compostos foram submetidos a infusão num volume total de 5,0 pL a um caudal de 5,0 mL/min utilizando uma bomba de infusão multicanal TSE (Bad Homburg, Alemanha). Foram medidos o tempo gasto na interacção social activa (tempo SI), e a ingestão de alimentos a 1 h, e 12 h. Péptidos e Antagonistas. O neuropéptido de rato Yl-36 foi obtido de Polipeptide Laboratories (Wolfenbuttel, Alemanha). O antagonista do receptor Yl de NPY BIBP3226 foi adguirido a American Peptide Company, Sunnyvale, CA, EUA (Cat N°:60-1-22B) . Todos fármacos foram dissolvidos em água estéril e as diluições finais foram preparadas com aCSF.

Teste de interacção social (SI). O teste SI foi efectuado como inicialmente descrito por File (1980) e foi inicialmente validado no laboratório (Kask, Nguyen, Pabst, von Horsten, submetido). Dois ratos, coincidentes com o tratamento, foram removidos das gaiolas e expostos ao ambiente de teste. A arena foi um campo aberto em quadrado (50 x 50 x 50 cm) feito de alumínio, colocado dentro de uma caixa de isolamento de som (Coulbourn Instruments. Lehigh Valley, PA). Para detalhes sobre o equipamento ver o nosso estudo prévio (von Horsten et al., 1998c). O campo aberto foi iluminado com uma lâmpada vermelha de fotografia (Philips PF712E; 1,3 Lux). Os ratos não estavam familiarizados com o equipamento. O comportamento foi monitorizado utilizando uma câmara de vídeo acima do campo dentro da caixa de teste/isolamento. O comportamento SI de ambos os ratos foi registado em tempo real através de um monitor 45 colocado fora no topo da caixa. Foram avaliados os seguintes parâmetros por um observador (HPN) que desconhecia a subestirpe de ratos: duração do tempo gasto em fungar, seguindo-se o rastejar sob e por cima de outros ratos, mas não contacto corporal passivo (repouso, sono) . Um aumento do tempo de SI é considerado uma resposta de tipo ansiolitico.

Análise estatística. Os dados obtidos das medições do tempo SI e I h de ingestão de comida foram analisados por ANOVA de uma via (factor: "tratamento"). Adicionalmente, foram efectuadas três ANOVA factorial (factores: "Antagonista", "Inibidor", "NPY") para confirmar as conclusões gerais (dados não apresentados). Os asteriscos indicam significativos efeitos post hoc vs. aCSF+aCSF+aCSF (Controlo) enquanto o sinal "#" indica uma diferença significativa do tratamento com o antagonista de Y IR vs. o correspondente tratamento sem antagonista obtido por PLSD de Fisher. 0 nivel de significância nas comparações post hoc é indicado por asteriscos com "*" = p<0,05; "**" = p<0,01; "***" = p<0,001) e por simbolos "#"com "#" = p<0,05; "##" =p<0,01; "###" = p<0,001). Todos os dados são apresentados como médias ± S.E.M.

Potenciação mediada pelo receptor NPY Y1 da induzida por NPY ansiólise no teste SI por pré-tratamento com isoleuciltiazolidina. A administração central combinada de isoleuciltiazolidina a uma dose de 50 nmol e NPY a uma dose de 0,8 nmol potenciou dramaticamente o efeito, do tipo ansiolitico, de NPY no teste SI (Fig. 10) . Esta constatação replica, em dosagens correspondentes, a observação apresentada na Fig. 7. A esta dose o tratamento com apenas hemifumarato de isoleuciltiazolidina (p32/98) não actua como o tipo ansiolitico. Contudo, o comportamento social endógeno investigado, o tipo 46 ansiolítico e o efeito induzido de ansiólise potenciada de NPY por tratamento combinado com isoleuciltiazolidina+NPY foram todos antagonizados pelo bloqueio do receptor Yl. Isto indica uma regulação tónica dos niveis de ansiedade através do receptor Yl de NPY no SNC e, deste modo, prova que o efeito de NPY do tipo ansiolitico assim como a ansiólise potenciada induzida pelo tratamento combinado, são todos mediados, primariamente pelo receptor Yl. A ingestão espontânea e a ingestão induzida por NPY são mediadas, apenas em parte, pelo YlR e o ligeiro aumento não significativo da ingestão induzida pelo tratamento com isoleuciltiazolidina é bloqueada pelos antagonismos de YlR (Fig. 11).

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Lisboa, 12 de Agosto de 2008 73

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor de dipeptidilpeptidase IV (DP IV ou CD 26) para a produção de um medicamento para o tratamento de ansiedade.
2. 2. Utilização de acordo com reivindicação 1, em que o medicamento reduz a degradação do neuropéptido Y (NPY) endógeno, localizado no SNC.
3. 3. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por os inibidores serem utilizados em combinação com neuropéptido Y.
4. 4. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por os inibidores estarem presentes num veículo de distribuição de fármacos fisiologicamente compatível.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o inibidor da dipeptidilpeptidase IV é seleccionado de N-(glicilo substituído em Ν')-2-cianopirrolidinas, L-treo-isoleuciltiazolidina, L-alo-isoleuciltiazolidina, L-treo-isoleucilpirrolidina e L-alo-isoleucilpirrolidina.
6. 6/11 % de Visitas aos braços abertos 80-, *

   P32/98 (nmol) 7/11 Sl-tempo (seg) 350-1

   250- 200- 100- 50- 0 150-

   0.005 0.05 0.5 DaCSF+ aCSF IaCSF+ NPY |! P32/98+ H aCSF |j P32/98+ i NPY 0.05 0.1 0.2 50 500 P32/98 (nmol) 0.8 1.6 NPY (nmol)

   6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o inibidor de dipeptidilpeptidase IV é L-treoisoleuciltiazolidina. 1
7. 7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por os inibidores serem formulados como pró-fármacos de fórmula geral A-B-C, em que A representa um aminoácido, B representa uma ligação quimica entre A e C ou um aminoácido, e C representa um inibidor estável ou instável de dipeptidilpeptidase IV.
8. 8/11 Gramas ingeridas/1 h 6-i 4- 2- 0

   aCSF+ aCSF aCSF+ NPY P32/98+ aCSF P32/98+ NPY 0.005 0.05 0.5 50 500 P32/98 (nmol) 0.05 0.1 0.2 0.8 1.6 NPY (nmol)

   8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por os inibidores serem utilizados parentericamente, entericamente, oralmente, por inalação ou como um supositório.

   9. Inibidor da dipeptidilpeptidase IV (DP IV ou CD 26) para o tratamento de ansiedade.

   10. Inibidor da dipeptidilpeptidase IV da reivindicação 9, caracterizado por ser reduzida a degradação do neuropéptido Y (NPY) endógeno, localizado no SNC.

   11. Inibidor de dipeptidilpeptidase IV de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por o inibidor ser utilizado em combinação com o neuropéptido Y.

   12. Inibidor da dipeptidilpeptidase IV de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por o inibidor estar presente num veículo de distribuição de fármacos fisiologicamente compatível. 13. inibidor da dipeptidilpeptidase iv de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado por o inibidor ser seleccionado de N-(glicilo substituído em Ν')-2-cianopirrolidinas, L-treo-isoleuciltiazolidina, 2 L-alo-isoleuciltiazolidina, L-treo-isoleucilpirrolidina, e L-alo-isoleucilpirrolidina.

   14. Inibidor da dipeptidilpeptidase IV de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado por o inibidor ser L-treo-isoleuciltiazolidina.

   15. Inibidor da dipeptidilpeptidase IV de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizado por o inibidor ser formulado como pró-fármaco de fórmula geral A-B-C, em que A representa um aminoácido, B representa uma ligação química entre A e C ou um aminoácido, e C representa um inibidor estável ou instável da dipeptidilpeptidase IV.

   16. Inibidor da dipeptidilpeptidase IV de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado por o inibidor ser utilizado parentericamente, entericamente, oralmente, por inalação ou como um supositório. Lisboa, 12 de Agosto de 2008 3 1/11

   *** ** Serum DPIV activity | F344HAN [j F344GER Actividade de DPIV no soro 2/11

   γ«6· Ζ 3/11 delta BW (g) 1n | F344JAP 0- -1- -2- -3-

   Stresse de transporte 4/11 Distância percorrida (cm)

   P32/98 (5nmol) P32/98 (500nmol) aCSF P32/98 (SOpmol) intervalos de teste (min) 5/11 Tempo passado junto à parede (seg) 100η 80-

   *

   i i 0,05 5 P32/98 (nmol) 500 60- 40- 20- 0-
9. 9/11 Gramas ingeridas/12 h 16—1 12-

   0.005 0.05

   □aCSF+ aCSF IaCSF+ NPY D P32/98+ i aCSF I P32/98+ | NPY 0.5 50 500 P32/98 (nmol) 0.05 0.1 0.2 0.8 1.6 NPY (nmol) % Τ,β·3 10/11 Sl-tempo (seg)

   aCSF+aCSF+ aCSF BBIBP+aCSF+ aCSF BaCSF+P32/98+ aCSF IBIBP+P32/98+ aCSF IaCSF+aCSF+ NPY | BIBP+aCSF+ IaCSF+P32/89+ NPY BBIBP+P32/98+ NPY 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 100 BIBP (nmol) 0.0 0.0 50 50 0.0 0.0 50 50 P32/98 (nmol) 0.0 0.0 0.0 0.0 0.8 0.8 0.8 0.8 NPY (nmol) Í6.10 11/11 gramas ingeridas/1 h 7-i ** 6- ** □aCSF+aCSF+ aCSF n.s. n.s. I BIBP+aCSF+ aCSF 5- 4- 3- 2- 0 1

   *#

   BIBP+aCSF+ NPY aCSF+P32/89+ NPY BIBP+P32/98+ NPY aCSF+P32/98+ aCSF BIBP+P32/98+ aCSF aCSF+aCSF+ NPY 0.0 100 0.0 100 0.0 100 0.0 0.0 50 50 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.8 0.8 0.0 100 BIBP (nmol) 50 50 P32/98 (nmol) 0.8 0.8 NPY (nmol) f'6· U