PT1315831E - Estearoil-coa dessaturase para identificar agentes terapêuticos que reduzem triglicéridos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ESTEAROIL-COA DESSATURASE PARA IDENTIFICAR AGENTES TERAPÊUTICOS QUE REDUZEM TRIGLICÉRIDOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de um modo geral, ao campo da estearoil-CoA dessaturase e ao seu envolvimento em várias doenças humanas. A estearoil-CoA dessaturase é útil para a identificação e desenvolvimento de agentes terapêuticos para o tratamento dessas doenças.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As enzimas acil dessaturase catalisam a formação de ligações duplas em ácidos gordos derivados de fontes da dieta ou da sintese de novo no figado. Os mamíferos sintetizam quatro dessaturases de especificidade de comprimento de cadeia diferente que catalisam a adição de ligações duplas nas posições Δ9, Δβ, Δ5 e Δ4. As estearoil-CoA dessaturases (SCD) introduzem uma ligação dupla na posição Δ9 de ácidos gordos saturados. Os substratos preferidos são palmitoil-CoA (16:0) e estearoil-CoA (18:0), que são convertidos em palmitoleoil-CoA (16:1) e oleoil-CoA (18:1), respectivamente. Os ácidos gordos monoinsaturados resultantes são substratos para incorporação em fosfolipidos, triglicéridos e ésteres de colesterol. 1

Foram clonados vários genes de SCD de mamífero. Por exemplo, foram clonados dois genes de rato (SCDl, SCD2) e foram isolados quatro genes de SCD de murganho (SCDl, 2, 3, e 4). Foi caracterizado um gene único de SCD, SCDl, em humanos.

Embora o papel bioquímico básico da SCD seja bem conhecido em ratos e em murganhos desde a década de 1970 (Jeffcoat R. e James, AT. 1984. Elsevier Science, 4: 85-112; de Antueno, RJ. 1993. Lipids 28(4)285-290), ainda não foi, até data anterior a esta invenção, directamente implicado em processos de doença humana. Estudos em animais não humanos tornaram obscuro 0 entendimento sobre o papel de SCD em humanos devido às diferenças bem documentadas nos processos bioquímicos em espécies diferentes. Em roedores, por exemplo, o metabolismo dos lípidos e colesterol é particularmente obscurecido pela ausência da Proteína de Transporte do Éster de Colesterol (CETP) (ver Foger, B. et al.r 1999. J. Biol. Chem. 274(52) 36912).

Além disso, a existência de múltiplos genes de SCD em murganhos e ratos adiciona complexidade adicional para determinar o papel específico de cada um destes genes em processos de doença. As diferenças nos perfis de expressão em tecidos, especificidade de substrato, regulação genética e estabilidade enzimática podem ser importantes na elucidação de que gene SCD desempenha o papel dominante em cada distúrbio. A maioria dos estudos anteriores de SCD analisa a função do gene SCD através da medição dos níveis de ARNm ou através da medição dos níveis de ácidos gordos monoinsaturados como uma medida indirecta da actividade da enzima SCD. Em ambos estes casos, esta análise pode ser enganadora. Neste último método tem sido particularmente enganador e difícil discernir a contribuição relativa de SCDl para o índice de insaturação no plasma (a 2 proporção de ácidos gordos monoinsaturados em relação a ácidos gordos saturados de um comprimento de cadeia específico) devido ao facto de poderem contribuir múltiplas enzimas SCD para a produção de ácidos gordos monoinsaturados. Antes desta invenção, as contribuições relativas das múltiplas isoformas de SCD para o índice de insaturação era desconhecida. Em resumo, os estudos anteriores não diferenciaram quais as isoformas de SCD que desempenham o papel principal na actividade de dessaturase total conforme medida pelo índice de insaturação.

Um trabalho recente em cultura celular de hepatócitos de galinha, in vitro, relaciona a actividade da dessaturase delta-9 com a secreção de triacilglicerol alterada (Legrand, P. e Hermier, D. (1992) Int. J. Obesity 16, 289-294; Legrand, P.,

Mallard, J., Bernard-Griffiths, M.A., Douaire, M. e Lemarchal, P. Comp. Biochem. Physiol. 87B, 789-792; Legrand, P., Catheline, D., Fichot, M.-C., Lemarchal, P. (1997) J. Nutr. 127, 249-256). Este trabalho não distinguiu as isoformas de dessaturase delta-9 que podem existir na galinha, uma vez mais não conseguindo implicar directamente uma enzima SDC específica como sendo responsável por um efeito biológico particular, neste caso, a da secreção de triglicéridos alterada.

Nem este trabalho in vitro faz bem a correlação com humanos porque existem diferenças substanciais entre o metabolismo de lipoproteínas em galinhas e em humanos in vivo. Essas diferenças incluem a presença, em galinhas, de lipoproteínas totalmente diferentes, tais como vitelogenina, e processos distintos tais como a indução massiva da síntese hepática de triglicéridos durante a ovulação. Outras diferenças, tais como o tipo de lipoproteínas utilizadas para o transporte de colesterol e o processo de secreção de triglicéridos dietéticos em quilomícrons 3 estão bem documentados. Estas diferenças principais entre aves e mamíferos significam que a extrapolação de aves para mamíferos na área do metabolismo dos triglicéridos deve ser considerada provisória, dependendo da confirmação em humanos.

Duas outras áreas da técnica anterior formam uma base importante para a presente invenção. Em primeiro lugar, esta invenção refere-se ao colesterol e ao metabolismo dos lípidos, que nos humanos tem sido estudado intensamente. Uma vez que o colesterol é altamente apoiar, é transportado através da corrente sanguínea na forma de lipoproteínas que consistem essencialmente num núcleo de moléculas apoiares, tais como éster de colesterol e triglicérido rodeadas por um envelope de lípidos anfifílicos, principalmente fosfolípidos. Em humanos, aproximadamente 66% do colesterol é transportado em partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL), cerca de 20% em partículas de lipoproteína de elevada densidade (HDL) e o restante em partículas de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL). Uma referência excelente à bioquímica básica do metabolismo do colesterol em humanos e outros organismos encontra-se em "Biology of Colesterol". Ed. Yeagle, P. CRC Press, Boca Raton, Fia., 1988.

Em segundo lugar, esta invenção tira partido de novas descobertas com murganhos Asebia (Gates, et al. (1965) Science. 148:1471-3). Este murganho é uma variante genética de murganho que ocorre naturalmente, que possui um defeito bem conhecido nas glândulas sebáceas, resultando na perda de pelo e pele escamosa. O murganho Asebia foi recentemente relatado como possuindo uma deleção em SCDl resultando na formação de um sítio de terminação precoce no exão 3 do gene SCDl. Os animais homozigóticos para esta mutação, ou com um alelo removido distinto que compreende 4 os exões 1-4, não expressa quantidades detectáveis do transcrito de ARNm de SCDl de tipo selvagem (Novembro de 1999. Nature Genetics. 23:268 et seq.; e a publicação da patente PCT WO 00/09754)] . Uma vez que a extensão total desta deleção que ocorre naturalmente é desconhecida, é também desconhecido se outros genes na vizinhança de SCDl, ou noutro local no genoma, podem também estar envolvidos no fenótipo de Asebia. De modo a estudar especificamente a actividade de SCDl nestes processos de doença, é necessário um murganho com SCDl desactivado especifico. O trabalho anterior nesta variante focou-se no papel desta mutação em distúrbios na pele e não no metabolismo dos triglicéridos ou VLDL. J. Biol. Chem. Vol. 251, N° 23, pp. 7468 a 7473, 1976 é dirigido a uma investigação de oxigenases microssomais de processos biossintéticos. O documento US 5336496 é dirigido a um método para inibidor a delta 5-dessaturase num animal. J. Biol. Chem. Vol. 275, N° 39, pp. 30132 a 30138, 2000 é dirigido à biossintese de ésteres de colesterol e triglicéridos hepáticos que é alterada em murganhos com uma interrupção do gene para a estearoil-CoA dessaturase 1. É um objectivo da presente invenção identificar doenças e distúrbios que estão ligados especificamente à actividade biológica de SCDl em humanos e, numa forma de realização preferida, doenças e distúrbios do metabolismo dos triglicéridos. É um outro objectivo desenvolver ensaios de rastreio para identificar e desenvolver fármacos para tratar essas doenças, distúrbios e estados relacionados. Além disso, é um objectivo desta invenção proporcionar composições para utilização no tratamento dessas doenças, distúrbios e estados relacionados. 5

BREVE SUMARIO DA INVENÇÃO A invenção é dirigida a um método para identificar um agente de modulação da estearoil-CoA dessaturase (SCDl), como reivindicado na reivindicação 1. Formas de realização preferidas são especificadas nas reivindicações 2 a 10.

Esta invenção divulga, pela primeira vez, o papel da estearoil-CoA dessaturase-1 humana ("hSCDl") numa vasta gama de doenças humanas e distúrbios. Em particular, a actividade biológica de SCDl em humanos está directamente relacionada com os níveis séricos de triglicéridos e VLDL. Adicionalmente, a actividade biológica de SCDl também afecta os níveis séricos de HDL, LDL e/ou colesterol total, transporte reverso de colesterol, e a produção de secreções a partir de membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera, e/ou semelhantes. É um objectivo da presente invenção proporcionar um processo ou ensaio de rastreio para identificar, a partir de uma biblioteca de compostos de teste, um agente terapêutico que modula a actividade biológica da referida estearoil-CoA dessaturase humana (hSCDl) e é útil no tratamento de um distúrbio ou estado humano relacionado com os níveis séricos de triglicérido ou VLDL. De um modo preferido, o ensaio de rastreio identifica inibidores de hSCDl que baixam os níveis de triglicérido e proporcionam um benefício cardioprotector importante para humanos. 6 É também um objectivo da presente invenção proporcionar um processo ou ensaio de rastreio para identificar, a partir de uma biblioteca de compostos de teste, um agente terapêutico que modula a actividade biológica da referida estearoil-CoA dessaturase humana (hSCDl) e é útil no tratamento de um distúrbio ou estado humano relacionado com os níveis séricos de HDL, LDL e/ou colesterol total, transporte reverso de colesterol ou a produção de secreções das membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera e/ou semelhantes.

Num aspecto, a presente invenção utiliza vectores que compreendem genes de estearoil-CoA dessaturase humana (hSCDl) e sequências promotoras, e células eucarióticas recombinantes e linhas celulares, de um modo preferido células de mamíferos e de um modo muito preferido, células humanas e linhas celulares, transfectadas de modo a compreender esses vectores e/ou os referidos polinucleótidos e em que as referidas células expressam hSCDl. É aqui divulgada a sequência promotora de tamanho total para hSCDl, a SEQ ID. N° 1. É também um objectivo da presente invenção proporcionar agentes capazes de modular a actividade e/ou expressão de estearoil-CoA dessaturase humana 1 (hSCDl) como aqui divulgado, especialmente quando a referida capacidade de modulação foi primeiro determinada utilizando um ensaio compreendendo actividade biológica de hSCDl ou um gene que codifica hSCDl. Composições farmacêuticas compreendendo esses agentes estão especificamente contempladas. É ainda um outro objectivo da presente invenção proporcionar agentes em que o referido agente é útil no tratamento, prevenção 7 e/ou diagnóstico da doença ou estado relacionado com a actividade biológica de hSCDl.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Produção de murganhos nulos para SCDl (A) Estratégia de direccionamento para SCDl. É apresentado um mapa parcial do locus genómico que rodeia o locus Scdl. A recombinação homóloga resultou na substituição dos exões 1-6 pelo gene neo 7. Foram verificados os eventos de direccionamento do gene por análise de transferência de Southern utilizando EcoRI e a sonda A ou B ou por análise de PCR. (B) Análise de PCR demonstrando murganhos SCD -/-. Ao cruzar heterozigotos, nasceram, heterozigotos e homozigotos selvagens de um modo Mendeliano (+/+: +/-: -/-= 21: 43: 20 x2=0, 395). (C) Análise de transferência de Northern. Foram isolados 20 pg de ARN total a partir do figado e foi sujeito a análise de transferência de Northern. As transferências foram rastreadas com sonda com um SCDl de murganho e 2 fragmentos de ADNc. (D) A análise de imunotransferência do fígado demonstrou a ausência de SCD imunorreactivo em murganhos SCD1 -/-, enquanto que a proteína SCDl foi detectada no tecido do fígado tanto de murganhos selvagens como heterozigóticos de um modo dependente da dosagem do gene. (E) A actividade de SCD no fígado foi anulada em murganhos SCD -/-. Como mencionado acima, os heterozigóticos apresentam num fenótipo intermédio quando comparados com os parceiros de ninhada selvagens e nulos. A actividade enzimática é representada como nanomoles de substrato dessaturado por miligrama de proteína por minuto. Os resultados são apresentados como a média ± SD (n=3).

Figura 2. Os perfis de lipoproteina no plasma em Murganhos Machos com SCDl desactivado e Asebia. Os dois quadros de cima descrevem o conteúdo em triglicéridos das fracções de lipoproteina, os dois quadros do fundo descrevem o conteúdo em colesterol das fracções de lipoproteina.

Figura 3. Niveis de VLDL-triglicérido em murganhos Asebia (SCDl-/-) e SCD1+/-. As lipoproteinas do plasma foram separadas por cromatografia liquida de desempenho rápido e a distribuição de triglicéridos entre as lipoproteinas nas várias fracções de densidade dos murganhos (n=3) foram medidas. SCD-/- (círculos brancos), SCD1+/- (círculos a cheio). Os picos de lipoproteina para VLDL, LDL e HDL estão indicados.

Figura 4. A proporção de ácido gordo monoinsaturado para saturado no plasma de murganho (o índice de insaturação) diminui de um modo directamente proporcional ao nível de actividade I de SCD. Comparação de murganhos com SCDl desactivado e murganhos asebia com os seus respectivos controlos. A Figura 5 apresenta uma análise de regressão linear utilizando um conjunto de resultados em humanos. A proporção de 18:1/18:0 apresentou uma relação significativa para os níveis de TG (r2=0,39, p<0,0001) (Quadro A), assim como correlações significativas com os níveis de HDL (r2=0,12, p=0,0006) (Quadro B). Os detalhes experimentais são ainda descritos no Exemplo 2.

A Figura 6 apresenta uma análise de regressão linear indicando que foi observada uma relação fraca entre o nível relativo de 16:1/16:0 com os níveis de TG no plasma TG (r2=0,05, p=0,03). Os detalhes experimentais estão no Exemplo 2. 9 A Figura 7 apresenta uma análise de regressão linear dos indivíduos com um fenótipo de HDL elevado (>percentil 90) . Estes indivíduos demonstraram uma relação significativa entre a proporção de 18:1/18:0 e os níveis de TG (r2=0,40, p<0,005). A Figura 8 apresenta uma relação observada entre 18:1/18:0 e os níveis de TG foi observada numa família (HA-1) que segrega um fenótipo de HDL elevado. Utilizando análise de regressão linear, foi observada uma relação significativa entre 18:1/18:0 e TG (r2=0,36, p=0,005 (Quadro A)). O quadro B apresenta uma relação significativa entre a proporção 18:1/18:0 e os níveis de HDL nesta família (r2=0,32, p=0,009). A Figura 9 apresenta a relação observada entre a proporção 18:1/18:0 e os níveis de TG (r2=0,49, p=0,0009) quando são consideradas apenas as pessoas com baixo HDL (<percentil 5). A Figura 10 apresenta uma análise de uma família (NL-001), que segregou um fenótipo de baixo HDL de etiologia genética desconhecida e tendeu em direcção às relações observadas nas Figuras 5-9. A Figura 11 apresenta uma análise da família NL-0020 que segregou uma mutação ABCAl e tendeu em direcção às relações apresentadas nas Figuras 5-9. A Figura 12 é uma análise de ácidos gordos no plasma apresentando a relação entre a proporção 18:1/18:0 e os níveis de TG (r2=0,56, p=0,02) (Quadro A), níveis de HDL (r2=0,64, p=0,0095) (Quadro B) e níveis de colesterol total 10 (r2=0,50, p=0,03) em nove pessoas com Hiperlipidemia Combinada Familiar (FCHL) (Quadro C). A Figura 13 é uma análise de ácidos gordos no plasma apresentando uma proporção significativamente elevada 18:1/18:0 em murganhos hiperlipidémicos (HcB-19) em comparação com controlos não afectados da estirpe parental (C3H).

Figura 14. Localização de sequências reguladoras e sítios de ligação na região homóloga do promotor de SCDl de murganho e de SCDl humano e regiões flanqueadoras 5'. A escala do topo representa a posição relativa para o sítio do início de transcrição. São indicados elementos de sequência do promotor importantes.

Figura 15. As células de HepG2 humanas cultivadas e tratadas com uma gama de doses de ácido araquidónico, D HA ou 10 pg/mL de colesterol ou EPA como indicado. O ARNm total foi isolado e quantificado.

Figura 16. TLC de extractos lipídicos da pele (A e B) e pálpebras (C e D) de murganhos de tipo selvagem, heterozigóticos e SCD Os lípidos totais foram extraídos a partir das pálpebras de murganhos de tipo selvagem, heterozigóticos e SCD -/-. Os extractos lipídicos foram reunidos e analisados por TLC de desempenho elevado (HPTLC, A e C; éter de hexano/éter/ácido acético=90:25:1, B e D; Benzeno: hexano; 65:35). As mesmas quantidades de extracto lipídico (a partir de 0,5 mg de pálpebra) foram submetidas em cada pista. Cada pista representa lípidos das pálpebras dos dois murganhos. 11 A Figura 17 apresenta um ensaio para a actividade de dessaturase SCDl quantificando a transferência de 3H de estearato para a água. A figura apresenta um curso de tempo de produção de 3H-água à temperatura ambiente. Foram utilizados microssomas de fígados de tipo selvagem para esta experiência. Foi estimado um número de processamento para a actividade de SCDl nessas condições a 2 nmol/min/mg de proteína, que é cerca de metade do observado a 37 °C. A Figura 18 apresenta a validação de que o ensaio monitoriza especificamente a insaturação dependente de SCDl de estearoil-CoA. Os fígados foram recolhidos a partir de murganhos de tipo selvagem e com SCDl desactivado após 3 dias, numa dieta isenta de gorduras e rica em hidrato de carbono (isto induz a expressão de SCDl no fígado em cerca de 50 vezes), homogeneizados e foi utilizada uma porção para purificação de microssomas. A produção de 3H-água foi determinada durante 15 minutos à TA (temperatura ambiente) em ambas as preparações de homogenatos e de microssomas a concentração de proteína equivalente, seguido por interrupção da reacção com ácido e utilizando carvão para separar o substrato do produto. Interromper a amostra com ácido antes da adição de substrato oferece um branco, ou controlo contendo radioactividade de fundo sem qualquer reacção de insaturação. A figura demonstra que a actividade de insaturação nos microssomas é fortemente enriquecida em comparação com o homogenato para fígados de tipo selvagem, enquanto os microssomas do animal com -/- SCDl desactivado tem muito pouca actividade. A "janela" ou insaturação dependente de SCDl neste ensaio, é uma diferença altamente visível e significativa de 160 vezes entre microssomas de tipo selvagem e com SCDl desactivado. 12 A Figura 19 demonstra a inibição de SCDl com 3 inibidores de ácido gordo conhecidos. Os microssomas de murganhos de tipo selvagem foram utilizados para testar a eficácia de três inibidores de SCDl conhecidos: ácido linoleico conjugado (CLA), ácido 9-tiaesteárico (9-tia) e ácido estercúlico (SA). 0

Quadro A demonstra que quando adicionado como o ácido gordo livre nenhum foi eficaz para suprimir actividade de SCDl. Todavia, o quadro B demonstra que se pré-conjugado com CoA (realizado incubando os microssomas com CoA e ATP antes da adição de 3H-estearoil CoA) os três inibidores apresentaram inibição graduada de SCDl com ácido estercúlico suprimindo quase 100% da actividade para o estado de pré-incubação. Esta experiência estabelece que a actividade de SCDl pode ser inibida com inibidores conhecidos mas eles parecem necessitar de conjugação com CoA. Uma utilização importante deste ensaio de rastreio é encontrar moléculas pequenas que são inibidores de actividade biológica de SCDl potente sem conjugação com CoA.

Figura 20 (A) Demonstração que a massa de estearoil-CoA limita a cinética e a magnitude do sinal de produção de 3H que se está a registar como uma medida de insaturação dependente de SCDl. Esta experiência é essencialmente uma repetição da apresentada na Fig 17 com a excepção de, aos 30 mins, ter sido adicionada uma fracção adicional de massa de estearoil-CoA/radioactividade, resultando na segunda produção exponencial do sinal 3H. Isto demonstra que a quantidade de estearoil-CoA limita a reacção como esperado para a insaturação catalisada por SCDl. (B) Demonstração que a experiência é adaptável a elevado desempenho. Todas as experiências anteriores foram realizadas quando o volume de reacção total foi de 1,1 mL (0,2 mL de tampão de reacção contendo microssomas, 0,2 mL de PCA a 6% para interromper a reacção e 0,7 mL de solução de carvão a 10% para 13 sedimentar o substrato não reagido) . A experiência ilustrada em B foi realizada com um volume de reacção total reacção de 0,31 mL (0,1 mL de tampão de reacção com microssomas, 0,01 mL de PCA a 60% para interromper e 0,2 mL de carvão a 10% para sedimentar).

DEFINIÇÕES "Isolado" no contexto da presente invenção em relação aos polipéptidos ou polinucleótidos, significa que o material é removido a partir do seu ambiente original (e. g., o ambiente natural se ocorre naturalmente). Por exemplo, um polinucleótido ou polipéptido que ocorre naturalmente, presente num organismo vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleótido ou polipéptido, separado a partir de alguns ou de todos os materiais co-existentes no sistema natural, é isolado. Esses polinucleótidos podem ser parte de um vector e/ou esses polinucleótidos ou polipéptidos podem ser parte de uma composição e, ainda assim, ser isolados nesse vector ou composição não é parte do seu ambiente natural. Os polipéptidos e polinucleótidos da presente invenção são, de um modo preferido, proporcionados numa forma isolada e, de um modo preferido, são purificados até à homogeneidade.

Os produtos de expressão dos ácidos nucleicos e polipéptidos divulgados de acordo com a presente invenção, assim como os vectores de expressão que contêm esses ácidos nucleicos e/ou esses polipéptidos, podem estar na "forma enriquecida". Como aqui utilizado, o termo "enriquecido" significa que a concentração do material é, pelo menos, cerca de 2, 5, 10, 100 ou 1000 vezes a sua concentração natural (por exemplo), 14 vantajosamente 0,01%, em peso, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 0,1% em peso. Estão também contempladas preparações enriquecidas de cerca de 0,5%, 1%, 5%, 10%, e 20% em peso. As sequências, construções, vectores, clones e outros materiais compreendendo a presente invenção podem vantajosamente estar na forma enriquecida ou isolada.

Os polinucleótidos, e polipéptidos recombinantes ou imunogénicos, divulgados de acordo com a presente invenção podem também estar na forma "purificada". O termo "purificado" não necessita de pureza absoluta; em vez disso, é encarado como uma definição relativa e pode incluir preparações que estão altamente purificadas ou preparações que estão apenas parcialmente purificadas, como aqueles termos são entendidos pelos especialistas na técnica relevante. Por exemplo, clones individuais isolados a partir de uma biblioteca de ADNc foram purificados convencionalmente até à homogeneidade electroforética. A purificação do material de partida ou material natural até, pelo menos, uma ordem de magnitude, de um modo preferido, duas ou três ordens e, de um modo mais preferido, quatro ou cinco ordens de magnitude está expressamente contemplado. Além disso, o polipéptido reivindicado que possui uma pureza de, de um modo preferido, 0,001% ou, pelo menos, 0,01% ou 0,1%; e ainda desejavelmente 1% em peso ou superior está expressamente contemplado. O termo "região codificante" refere-se à porção de um gene que codifica naturalmente ou normalmente para o produto de expressão do gene no seu ambiente genómico natural, i. e., a região que codifica in vivo o produto de expressão nativo do gene. A região codificante pode ser de um gene normal, mutado ou alterado ou pode ainda ser de uma sequência de ADN, ou gene, 15 totalmente sintetizado no laboratório utilizando métodos bem conhecidos dos especialistas na técnica da sintese o ADN.

De acordo com a presente invenção, o termo "sequência de nucleótidos" refere-se a um heteropolímero de desoxirribonucleótidos (para ADN) ou ribonucleótidos (para ARN) . Geralmente, os segmentos de ADN que codificam as proteínas proporcionadas por esta invenção são montados a partir de fragmentos de ADNc e ligantes oligonucleotídicos curtos ou a partir de uma série de oligonucleótidos, para proporcionar um gene sintético que é capaz de ser expresso numa unidade de transcrição recombinante, compreendendo elementos reguladores derivados de um operão microbiano ou virai. 0 termo "produto de expressão" significa aquele polipéptido ou proteína que é o produto de tradução natural do gene e qualquer sequência de ácido nucleico que codifica equivalentes resultando da degeneração do código genético e assim codificando para o(s) mesmo(s) aminoácido(s). 0 termo "fragmento", quando se refere a uma sequência codificante, significa uma porção de ADN compreendendo menos do que a região codificante completa cujo produto de expressão retém essencialmente a mesma função ou actividade biológica que o produto de expressão da região codificante completa. 0 termo "iniciador" significa uma sequência de ácido nucleico curta que é emparelhada com uma cadeia de ADN e proporciona uma extremidade 3ΌΗ livre, na qual uma polimerase de ADN começa a síntese de uma cadeia desoxirribonucleotídica. 16 0 termo "promotor" significa uma região de ADN que envolvida na ligação da polimerase de ARN para iniciar a transcrição e inclui todos os nucleótidos a montante (5') do sitio de iniciação da transcrição.

Como aqui utilizada, a referência a uma sequência de ADN inclui ambos os ADN de cadeia simples e de ligação dupla. Assim, a sequência especifica, salvo se o contexto indique o contrário, refere-se ao ADN de cadeia simples dessa sequência, o duplex dessa sequência com o seu complemento (ADN de ligação dupla) e o complemento dessa sequência. A presente invenção refere-se ainda a um polipéptido que possui a sequência de aminoácidos deduzida, assim como fragmentos, análogos e derivados desse polipéptido.

Os termos "fragmento", "derivado" e "análogo", quando se refere ao polipéptido, significa um polipéptido que retém essencialmente a mesma função ou actividade biológica que esse polipéptido. Por isso, um análogo inclui uma pró-proteina que pode ser activada através da clivagem da porção de pró-proteina para produzir um polipéptido maduro activo. Esses fragmentos, derivados e análogos devem possuir semelhança suficiente com o polipéptida SCDl de modo a que a actividade do polipéptido nativo seja retida. 0 polipéptido da presente invenção pode ser um polipéptido recombinante, um polipéptido natural ou um polipéptido sintético e é, de um modo preferido, um polipéptido recombinante. 0 fragmento, derivado ou análogo do polipéptida SCDl pode ser (i) um no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos são 17 substituídos com um resíduo de aminoácidos conservados ou não conservados (de um modo preferido um resíduo de aminoácidos conservado) e esse resíduo de aminoácidos substituído pode, ser ou não, um codificado pelo código genético ou (ii) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos inclui um grupo substituinte, ou (iii) um em que o polipéptido maduro é fundido com outro composto, tal como um composto para aumentar a semi-vida do polipéptido (por exemplo, polietilenoglicol) ou (iv) um em que os aminoácidos adicionais são fundidos com o polipéptido maduro, tal como uma sequência líder ou secretora ou uma sequência que é empregue para a purificação do polipéptido maduro ou uma sequência de pró-proteína. Esses fragmentos, derivados e análogos são considerados como estando dentro do âmbito dos especialistas na técnica dos ensinamentos aqui apresentados.

Como é conhecido na técnica, a "semelhança" entre dois polipéptidos é determinada comparando a sequência de aminoácidos e os seus substitutos de aminoácidos conservados de um polipéptido com a sequência de um segundo polipéptido.

De acordo com o acima mencionado, a presente invenção também se refere a uma estearoil-CoA dessaturase isolada codificada pelo polinucleótido isolado da invenção.

Podem ser empregues fragmentos ou porções dos polipéptidos da presente invenção para produzir o correspondente polipéptido de tamanho total através de síntese de péptidos; por isso, os fragmentos podem ser empregues como intermediários para produzir os polipéptidos de tamanho total. Os fragmentos ou porções dos polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados para 18 sintetizar os polinucleótidos de tamanho total da presente invenção.

Como aqui utilizado, os termos "porção", "segmento" e "fragmento", quando utilizados em relação aos polipéptidos, referem-se a uma sequência de resíduos contínua, tal como resíduos de aminoácidos, cuja sequência forma um subconjunto de uma sequência maior. Por exemplo, se um polipéptido for sujeito a tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns, tal como tripsina ou quimotripsina, os oligopéptidos resultantes desse tratamento iriam representar porções, segmentos ou fragmentos do polipéptido inicial. Quando utilizados em relação aos polinucleótidos, esses termos referem-se aos produtos produzidos pelo tratamento dos referidos polinucleótidos com qualquer uma das endonucleases comuns.

SUMÁRIO DETALHADO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à actividade de estearoil-CoA dessaturase-1 humana em processos de doença humana. De acordo com isto, os compostos que modulam especificamente a actividade ou nível de expressão da estearoil-CoA dessaturase-1 humana são úteis no tratamento de um distúrbio ou estado humanos relacionados com os níveis de triglicéridos ou VLDL no soro e proporcionam um benefício cardioprotector importante quando administrado a humanos. Os compostos que modulam a actividade ou expressão de hSCDl são também úteis para modular os níveis no soro de HDL, ldl, e/ou colesterol total e/ou transporte reverso de colesterol . Finalmente, os compostos que modulam a actividade ou expressão de hSCDl são também úteis para modular a 19 produção de secreções a partir das membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera e semelhantes. 0 Gene e a Proteína SCDl

Estearoil-CoA dessaturase-1 humana (também denominada SCDl, hSCD e hSCDl) foi identificada com a sequência de ADNc completa primeiro introduzida no GenBank como Acesso a GenBank Y13647 (também NM005063) datado em 6 de Junho de 1997. Outras descrições de SCDl, incluindo sequências parciais de promotor podem ser encontradas no GenBank com seguintes números de acesso: gb|AF097514.1|AF097514; dbj|AB032261.1|AB032261; gb |AF116616.1 |AF116616; ref|XM_005719.1|; gb|AF113690.1|AF113690; e gb|S70284.1|S70284.

Num aspecto, a presente invenção refere-se a utilizações de um polinucleótido isolado, compreendendo um polinucleótido não genómico possuindo, pelo menos, 90% de identidade, de um modo preferido, 95% de identidade, de um modo muito preferido, pelo menos, uma identidade de 98% com a sequência de estearoil-CoA redutase-1 humana, especialmente quando as referidas sequências são a mesma e incluindo qualquer um dos complementos de qualquer um dos mencionados acima. A sequência promotora completa de hSCDl é SEQ ID. N° 1 e a Figura 14 ilustra os elementos funcionais conservados entre as regiões do promotor de SCDl de murganho e humano

Num aspecto, a presente invenção refere-se a utilizações de um polipéptido isolado possuindo, pelo menos, 90% de identidade, de um modo preferido, 95% de identidade, de um modo muito 20 preferido, pelo menos uma identidade de 98% com a estearoil-CoA redutase-1 humana, especialmente quando as referidas sequências são a mesma. A sequência de polipéptido foi divulgada anteriormente e pode ser encontrada na seguinte série de acesso na base de dados SwissProtein: N° de ACESSO 000767; PID g3023241; VERSÃO 000767 GI:3023241; DBSOURCE: swissprot: locus ACOD_HUMAN, acesso 000767. Alternativamente, a sequência de polipéptido pode ser determinada a partir das referências de sequência de ADNc aqui fornecidas. SCDl em Processos de Doença Humana

Como aqui divulgado, várias doenças humanas e distúrbios são o resultado de actividade biológica de SCDl aberrante e podem ser melhoradas por modulação da actividade biológica de SCDl utilizando agentes terapêuticos. 0 ensinamento mais significativo da presente divulgação refere-se ao papel da SCDl na modulação dos niveis de triglicéridos e VLDL no soro em humanos. São aqui estabelecidas descobertas principais. Primeiramente, o Exemplo 1 abaixo demonstra que os perfis de lipoproteina de murganhos com SCDl desactivado demonstram uma redução de 65% nos niveis de triglicéridos e VLDL no soro. Estes correspondem com os perfis de lipoproteina de murganhos Asebia que são também aqui incluídos. Os perfis de lipoproteina de ambos os murganhos

Asebia e os murganhos com SCDl desactivado não eram previamente conhecidos, mas, devido à natureza direccionada e especifica da mutação modificada, a correlação da actividade de SCDl e os niveis de triglicéridos no soro podem ser retirados com segurança. Embora outras isoformas de SCD possam desempenhar um 21 papel nos níveis de triglicéridos, estes resultados indicam que o SCDl, especificamente, desempenha o papel principal neste processo.

Existem diferenças significativas no metabolismo de lipoproteínas entre murganho e humanos e, embora os dados precedentes sejam convincentes no murganho para um papel principal e específico para SCDl na modulação dos níveis de triglicéridos, isto ainda precisa de experiências confirmatórias em humanos. A segunda descoberta principal, por isso, apresentada no Exemplo 2, abaixo, demonstra uma correlação significativa entre a actividade de SCD em humanos e os níveis de triglicéridos no soro. Foi assim verificado que a actividade biológica de SCDl em humanos está directamente relacionada com os niveis de triglicéridos no soro.

De acordo com a presente invenção, o fenótipo de murganho Asebia (primeiro descrito por Gates, et al. (1965) Science. 148:1471-3) apresenta uma alteração principal e significativa no perfil de lipoproteínas no soro incluindo uma grande redução nos níveis de triglicéridos e VLDL. Adicionalmente, estes animais possuem um grande decréscimo no conteúdo de ésteres de colesterol no figado. De acordo com isso, a inibição eficaz da actividade de SCDl conduziria a uma redução nos níveis de triglicéridos, devido à disponibilidade diminuída de ácidos gordos monoinsaturados. Os ácidos gordos monoinsaturados são o substrato preferido para a enzima responsável pela síntese de triglicéridos (TG) a partir de ácidos gordos e glicerolfosfato (víz., glicerolfosfato acil transferase (GPAT)).

Também de acordo com a divulgação aqui apresentada, a esterificação aumentada do colesterol previne a acumulação 22 tóxica de colesterol livre no fígado e o aumento na disponibilidade de ésteres de colesterol e triglicéridos também facilita a sua secreção na forma de VLDL. A esterificação de colesterol aumentada em macrófagos pode também aumentar a formação de células de espuma e desse modo contribuir para o desenvolvimento de lesão aterosclerótica. Assim, a inibição da actividade de SCD pode possuir o efeito adicional de reduzir o nível de partículas de VLDL na corrente sanguínea e inibir a aterosclerose.

Ainda de acordo com a presente invenção, a inibição de SCDl é também vantajosa no aumento da formação de HDL nos tecidos periféricos. Num indivíduo saudável, o colesterol celular está predominantemente na forma esterifiçada, com níveis baixos do colesterol livre. A Acil-CoA:colesterol aciltransferase (ACAT) é a enzima responsável pela esterificação do colesterol utilizando acil-CoA gordos monoinsaturados como um substrato preferido. A SCD gera os produtos monoinsaturados, que estão então disponíveis para esterificação de colesterol por ACAT. Pensa-se que o fluxo aumentado do colesterol livre fora das células e através do HDL seja terapeuticamente benéfico porque isso significaria um aumento do "transporte reverso de colesterol " (RCT). A inibição de SCDl é também útil no aumento do transporte do colesterol reverso (RCT) sem aumentar necessariamente o nível de HDL no soro. 0 nível de HDL no soro é um marcador substituto para o processo de RCT, que de facto, de um modo preferido, é medido através do fluxo global de colesterol a partir dos tecidos periféricos para o fígado. A invenção identifica moduladores de actividade biológica de SCDl como agentes terapêuticos eficazes para aumentar RCT. 0 RCT pode ser medido 23 directamente, por exemplo, injectando éter de colesterol marcado radioactivamente, incorporado em partículas de HDL directamente no sangue, e medindo a taxa de desaparecimento (a taxa à qual é incorporado no fígado de um organismo).

De acordo com a presente invenção, foi observado que a modulação da actividade de SCD1 no fígado e outros tecidos resulta num aumento em SR-B1, um receptor do fígado que remove a HDL da circulação, aumentando, desse modo, o RCT com menos efeitos óbvios nos níveis de HDL no sangue. A ligação entre a actividade biológica de SCD1 e a expressão de ARNm de SR-Bl não foi previamente identificada. Trabalho anterior estabeleceu que os murganhos que sobre-expressam SR-Bl estão cardioprotegidos, demonstrando aterogénese reduzida e doença cardiovascular reduzida. Este entendimento também sugere, pela primeira vez, que certos agentes terapêuticos, tais como inibidores de actividade biológica de SCDl, podem aumentar RCT sem quaisquer alterações óbvias nos níveis de HDL. Isto é alcançado obtendo-se um aumento equilibrado na formação de HDL em tecidos periféricos e a remoção de HDL pelo fígado. A experiência comparou a expressão de ARNm de SR-Bl no fígado de murganhos SCDl de +/+ versus -/- (estirpes como descrito nos Exemplos abaixo) . Quando expressos em relação ao animal +/+ em dieta de ração, os resultados apresentam as seguintes alterações nos níveis de ARNm de ABCAl e SR-Bl:

Genótipo Dieta ABC1 SR-Bl + /+ Ração 1 1 -/- Ração 0,7 11 + /+ Colesterol Elevado 1,1 27 -/- Colesterol Elevado 0,4 27 24

As alterações em ABCl não são significativas, enquanto que aquelas apresentadas para SR-B1 numa dieta de ração o são. Um aumento na expressão de SRBl indica fluxo aumentado ou RCT, de colesterol para o figado e pode explicar porque é que não há observação de HDL-C elevado no plasma de murganho -/- SCD1. 0 aumento de RCT é ainda confirmado pela verificação de que animais -/- indivíduos a uma dieta de colesterol elevado possuem uma vesícula biliar aproximadamente 10 vezes o tamanho dos animais +/+ e que são ingurgitadas com a bílis. Estas observações são consistentes com o aumento da remoção do colesterol pelo fígado, daí o aumento de RCT. Além disso, o aumento aparentemente idêntico em SR-Bl em murganhos +/+ e -/-pode não reflectir um fenótipo ou processo biológico idêntico nestes animais. A inibição da expressão de SCD pode também afectar a composição de ácido gordo dos fosfolípidos da membrana, assim como triglicéridos e ésteres de colesterol. A composição em ácidos gordos dos fosfolípidos em última análise determina a fluidez da membrana, embora os efeitos na composição de triglicéridos e ésteres de colesterol possa afectar o metabolismo de lipoproteína e a adiposidade. A presente invenção também se refere ao envolvimento de SCDl noutros distúrbios ou estados humanos relacionados com os níveis no soro de HDL, LDL e colesterol total, assim como o papel de SCDl noutros distúrbios ou estados humanos relacionados com a produção de secreções de membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera e semelhantes. A invenção engloba moduladores de SCDl que são úteis para tratar esses distúrbios. 25

Trabalho anterior não utilizando indivíduos humanos demonstraram que a actividade biológica aberrante de SCD nestes organismos (mas não especificando que isoforma de SCD foi responsável) pode estar implicada em várias doenças da pele, assim como doenças diversas, como o cancro e esclerose múltipla, diabetes mellitus não dependente da insulina, hipertensão, doenças neurológicas, doenças da pele, doenças dos olhos, distúrbios imunitários e cancro. Moduladores descobertos utilizando os processos da presente invenção iriam por isso também encontrar utilidade no tratamento dessas doenças e distúrbios em indivíduos humanos.

No Exemplo 4, são identificadas proteínas de regulação de transcrição para SCD1. Estas proteínas são alvos para compostos que aumentam ou diminuem a expressão de SCDl nas células, influenciando desse modo, quer positivamente ou negativamente, a actividade biológica de SCDl das células. PPAR-gamma e SREBP são exemplos. Compostos que são conhecidos por actuar através desses reguladores de transcrição podem ser agora identificados como relevantes para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com SCDl agora identificados em humanos.

Ensaios de Rastreio A presente invenção proporciona ensaios de rastreio que empregam o gene e/ou proteína de hSCDl para utilização na identificação de agentes terapêuticos para utilização no tratamento de um distúrbio ou estado relacionado com os níveis de soro de triglicéridos, VLDL, HDL, LDL, colesterol total, transporte reverso de colesterol , a produção das secreções das 26 membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera e semelhantes. "Actividade Biológica de SCDl" "Actividade biológica de SCDl" como aqui utilizado, relacionando-se especialmente com ensaios de rastreio, é interpretada de um modo lato e contempla todas as actividades biológicas directamente ou indirectamente mensuráveis e identificáveis do gene e proteina SCDl. Relacionando-se com a proteína de SCDl purificada, a actividade biológica de SCDl inclui, mas não está limitada a, todos os processos biológicos, interacções, comportamento de ligação, relações de actividade de ligação, pKa, pD, cinética enzimática, estabilidade e avaliações funcionais da proteina. Em relação à actividade biológica de SCDl em fracções celulares, fracções celulares reconstituídas ou células totais, cujas actividades incluem, mas não estão limitados à taxa à qual o SCD introduz uma ligação dupla cis nos seus substratos palmitoil-CoA (16:0) e estearoil-CoA (18:0), que são convertidos com palmitoleoil-CoA (16:1) e oleoil-CoA (18:1), respectivamente, e todas as consequências mensuráveis deste efeito, tal como triglicérido, colesterol, ou outra síntese de lípidos, composição e comportamento de membranas, crescimento celular, desenvolvimento ou comportamento e outros efeitos directos ou indirectos da actividade de SCDl. Em relação aos genes e transcrição de SCDl, a actividade biológica de SCDl inclui a taxa, escala ou âmbito da transcrição de ADN genómico para gerar ARN; o efeito das proteínas reguladoras nessa transcrição, o efeito de moduladores dessas proteínas reguladoras nessa transcrição; mais a estabilidade e comportamento de transcritos de ARNm, processamento de 27 pós-transcrição, quantidades e processamento de ARNm, e todas as medições de tradução do ARNm em sequências polipeptidicas. Em relação à actividade biológica de SCD1 em organismos, isto inclui, mas não está limitado a actividades biológicas que são identificadas pela sua ausência ou deficiência nos processos de doença ou distúrbios provocados por actividade biológica de SCDl aberrante nesses organismos. Falando num sentido lato, a actividade biológica de SCDl pode ser determinada por todos estes e outros meios para analisar as propriedades biológicas de proteínas e genes que são conhecidos na técnica.

Os ensaios de rastreio contemplado pela presente invenção podem também empregar isoformas de SCD de humanos ou outros organismos que demonstram actividade biológica semelhante a hSCDl desde que tenham sucesso na identificação de agentes terapêuticos para doenças humanas. A equivalência funcional de delta-9 dessaturases de vertebrados tem sido reconhecida pelos especialistas na técnica. Consequentemente, as formas de realização especificas da presente invenção podem empregar uma ou mais enzimas funcionalmente equivalentes a delta-9 dessaturase de outra espécie de vertebrados, para identificar agentes terapêuticos úteis para humanos. Dessaturases funcionalmente equivalentes incluem todas as SCD de murganho, rato, vaca, porco ou galinha identificadas acima, adicionalmente aos genes identificados em UniGene Cluster Hs.119597 SCD para Estearoil-CoA dessaturase (delta-9-dessaturase). Ver também LocusLink: 6319; OMIM: 604031 ou HomoloGene: Hs. 119597. Outras dessaturases delta-9 conhecidas incluem as de porco: 002858 (swiss-prot); e vaca: AF188710 (NCBI, [6651449, Genbank]) 28 SEMELHANÇAS DE PROTEÍNAS COM O ORGANISMO MODELO SELECCIONADO (organismo, referência da proteína e percentagem de identidade e comprimento da região de aminoácidos (aa) alinhados) H. sapiens: SP :000767- 100%/358aa M. musculus: PIR:A32115- 83%/357aa R. norvegicus: SP:P07308- 84%/357aa D. melanogaster. PID:gl621653- 57%/301aa C. elegans: PID:g3881877- 52%/284aa S. cerevisiae: PID:e243949- 36%/291aa B. Taurus 002858 85%/359aa S. scrofa 6651449 86%/334aa

Concepção e desenvolvimento de ensaios de rastreio de SCD A presente divulgação facilita o desenvolvimento de ensaios de rastreio que podem ser ensaios baseados na célula, extracto celular (í. e., ensaios microssomais), isentos de célula (í. e. de transcrição) e ensaios de actividade de proteína substancialmente purificada. Esses ensaios são tipicamente baseados em radioactividade ou fluorescência (í. e., polarização de fluorescência ou transferência de energia de ressonância de fluorescência ou FRET) ou eles podem medir o comportamento celular (viabilidade, crescimento, actividade, forma, fluidez de membrana, sensibilidade á temperatura, etc.). Os ensaios de rastreio podem ser ensaios manuais ou de baixo desempenho, ou podem ser rastreios de elevado desempenho que são incrementados mecanicamente/roboticamente.

Os processos acima mencionados constituem a base para processos de rastreio, incluindo processos de rastreio de 29 elevado desempenho, para determinar a eficácia de fármacos com potencial terapêutico e de diagnóstico para tratar as doenças aqui descritas, de um modo preferido, doenças nas quais a actividade ou expressão aumentada ou diminuida de estearoil-COA dessaturase (hSCDl da invenção) desempenha um papel chave na mediação dessa doença.

Como tal, esta invenção refere-se a um método para identificação, tal como a partir de uma biblioteca de compostos de teste, um agente terapêutico que é útil em humanos para o tratamento de um distúrbio ou estado relacionado com os niveis séricos de triglicérido, VLDL, HDL, LDL, colesterol total ou produção de secreções a partir das membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera e semelhantes, compreendendo a) proporcionar um ensaio de rastreio possuindo actividade biológica de SCDl; b) contactar o referido ensaio de rastreio com um composto de teste; e c) subsequentemente medir a referida actividade biológica; em que um composto de teste que modula a referida actividade biológica é o referido agente terapêutico ou um seu análogo.

Num aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para identificar, a partir de uma biblioteca de compostos de teste, um agente terapêutico que é útil em humanos para o tratamento de um distúrbio ou estado relacionado com os niveis séricosde triglicérido ou lipoproteina de densidade muito baixa (VLDL) compreendendo 30 a) proporcionar um ensaio de rastreio possuindo actividade biológica de estearoil-Coenzima A dessaturase tipo 1 (SCDl) como um seu componente; b) contactar a referida actividade de SCDl com um composto de teste; c) administrar a um humano um composto que se observa modular a referida actividade em (b); e (d) detectar uma alteração no nivel sérico de triglicérido ou VLDL no referido humano após a referida administração; identificando desse modo um agente útil no tratamento de um distúrbio ou estado relacionado com os niveis de triglicérido ou lipoproteina de muito baixa densidade (VLDL) no soro.

Numa forma de realização, o referido agente é um antagonista ou inibidor da actividade biológica de SCDl. Noutra forma de realização específica deste, o referido agente é um agonista da actividade biológica de SCDl.

Noutra forma de realização, quando o referido modulador é um inibidor, o referido inibidor não inibe a actividade biológica num humano de uma delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase ou sintetase de ácido gordo.

Numa forma de realização da presente invenção, o processo de ensaio ainda compreende o passo de ensaiar o referido agente terapêutico para seleccionar, ainda mais, compostos que não inibem num humano a actividade de delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase ou sintetase de ácidos gordos. 31

Em formas de realização específicas, a presente invenção também compreende um processo em que a referida actividade biológica de SCD1 é medida através de um ensaio seleccionado de: a) afinidade de ligação ao polipéptido de SCDl; b) actividade de SCDl dessaturase em microssomas; c) actividade de SCDl dessaturase num ensaio em célula total d) quantificação do nível de expressão de SCDl; e e) quantificação do nível de proteína de SCDl.

Formas de realização específicas de um tal ensaio podem empregar uma célula recombinante como aqui divulgado. A presente invenção também se refere a um processo em que o composto identificado é ainda seleccionado de aqueles compostos que não inibem em humanos a actividade biológica de delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase ou sintetase de ácidos gordos.

Noutras formas de realização específicas, a presente invenção contempla o emprego de ácido nucleico de SCDl como aqui divulgado e/ou polipéptida SCDl como aqui divulgado para utilização na identificação de compostos úteis para o tratamento de um distúrbio ou estado relacionado com os níveis de triglicérido ou VLDL no soro.

Os ensaios aqui divulgados requerem essencialmente a medição, directamente ou indirectamente, de uma actividade biológica de SCDl. Os especialistas na técnica podem desenvolver os ensaios baseados em modelos bem conhecidos e existem muitos ensaios potenciais. Para medir a actividade de SCDl directamente na célula total, os métodos que podem ser utilizados para medir 32 quantitativamente a actividade da SCD incluem, por exemplo, medir cromatografias de camada fina de produtos de reacção de SCD ao longo do tempo. Este método e outros métodos adequados para medir a actividade de SCD são bem conhecidos (Henderson Henderson RJ, et al. 1992. Lipid Analysis: A Practical Approach. Hamilton S. Eds. New York e Tokyo, Oxford University Press, pp 65-111.) A cromatografia gasosa é também útil para distinguir mononinsaturados de saturados, por exemplo, oleato (18:1) e estearato (18:0) podem ser distinguidos utilizando este método. Uma descrição deste método está nos exemplos abaixo. Estas técnicas podem ser utilizadas para determinar se um composto de teste influenciou a actividade biológica de SCDl ou a taxa à qual a SCD introduz uma ligação dupla cis no seu substrato palmitato (16:0) ou estearato (18:0) para produzir palmitolieoil-CoA (16:1) ou oleioil-CoA (18:1), respectivamente.

Numa forma de realização preferida, a invenção emprega um ensaio microssomal possuindo uma actividade biológica de SCDl mensurável. Um ensaio adequado pode ser realizado para modificar e aumentar a escala do ensaio microssomal de figado de rato, essencialmente como descrito por Shimomura et al. (Shimomura, I., Shimano, H., Korn, B. S., Bashmakov, Y. e Horton, j. D. (1998). Os tecidos são homogeneizados em 10 vol. de tampão A (tampão potássio a 0,1 M, pH 7,4). As fracções de membrana microssomal (sedimentação a 100000 X g) são isoladas por centrifugação sequencial. As reacções são realizadas a 37 °C durante 5 min com 100 pg de homogenato de proteína e 60 μΜ de [ 1—14C] -estearoil-CoA (60000 dpm), 2 mM de NADH, 0,1 M de tampão Tris/HCl (pH 7,2). Após a reacção, os ácidos gordos são extraídos e depois metilados com 10% de cloreto acético/metanol. Ésteres de metilo de ácido gordo saturado e ácido gordo monoinsaturado são separados por TLC impregnada com AgN03 a 10%, 33 utilizando hexano/éter dietilico (9:1) como solução reveladora. As placas são aspergidas com 0,2% de 2',7'-diclorofluoresceína em etanol a 95% e os lipidos são identificados sob luz uv. As fracções são raspadas da placa e a radioactividade é medida utilizando um contador de cintilações liquidas.

Formas de realização especificas desse ensaio de actividade biológica de SCDl tiram partido do facto de a reacção de SCD produzir, adicionalmente ao produto acil-CoA de ácido gordo monoinsaturado, H20. Se é introduzido 3H nas posições C-9 e C-10 do substrato acil-CoA gordo, então alguns dos protões radioactivos desta reacção acabarão em água. Assim, a medição da actividade iria envolver a medição da água radioactiva. De modo a separar a água marcada do estearato, os investigadores podem empregar substratos tais como carvão, esferas hidrofóbicas ou apenas solventes simples antiquados em pH ácido.

Numa forma de realização preferida, os ensaios de rastreio medem a actividade biológica de SCDl indirectamente. Os ensaios de rastreio de elevado desempenho convencionais centram-se em ensaios de ligando-receptor. Estes podem ser baseados na fluorescência ou luminescência ou na detecção por marcação radioactiva. Os imunoensaios enzimáticos podem ser corridos numa vasta variedade de formatos para identificar compostos que interagem com proteínas SCDl. Estes ensaios podem empregar imunoensaios de fluorescência imediata ou de fluorescência ao longo do tempo que são bem conhecidos. É tipicamente utilizado ATP marcado com P32 para ensaios de cinase de proteína. Os produtos fosforilados podem ser separados para contagem através de uma variedade de métodos. A tecnologia do ensaio de proximidade de cintilação é um método melhorado de ensaio por marcação radioactiva. Todos estes tipos de ensaios são 34 particularmente apropriados para ensaios de compostos que interagem com proteína SCDl purificada ou semi-purifiçada.

Numa forma de realização preferida, o ensaio tira partido de 3H-estearoil CoA (com o 3H nos átomos de carbono 9 e 10), o substrato para SCDl. A insaturação por SCDl, produz oleoil CoA e moléculas de 3H-água. A reacção é corrida à temperatura ambiente, interrompida com ácido e depois é utilizado carvão activado para separar o substrato não reagido do produto de água radioactiva. O carvão é sedimentado e a quantidade de radioactividade no sobrenadante é determinada por contagem de cintilação em líquido. Este ensaio é específico para a insaturação dependente de SCDl como avaliado pela diferença observada quando se compara a actividade em tecidos selvagens e com SCDl desactivado. Além disso, o método é facilmente adaptado ao elevado desempenho na medida em que é isento de células, realizado à temperatura ambiente e é relativamente rápido (período de tempo de reacção de 1 hora versus o período anterior de 2 dias). Este processo é ilustrado mais completamente nas Figuras 17 a 20.

Embora a presente divulgação apresente uma forma de realização de trabalho eficaz da invenção, os especialistas na técnica são capazes de optimizar o ensaio numa variedade de formas, estando todas elas compreendidas pela invenção. Por exemplo, o carvão é muito eficiente (>98%) a remover a porção não utilizada do estearoil-CoA mas tem a desvantagem de ser confusa e em algumas condições difícil de pipetar. Pode não ser necessário utilizar carvão se o complexo estearoil-CoA agregar suficientemente quando acidificado e sedimentar sob força g moderada. Isto pode ser testado medindo a proporção sinal/ruído com e sem carvão após uma reacção de insaturação. Existem também 35 outros reagentes que iriam sedimentar eficientemente a estearoil-CoA para a separar do produto 3H-água.

Como apresentado na Fig. 20 (Quadro A) a quantidade de estearoil-CoA limita a cinética e a magnitude do sinal de 3H-DPM monitorizado como actividade de insaturação dependente de SCDl. Contudo, nem toda a estearoil-CoA foi consumida por SCDl; >90% permanece indisponível para SCDl seja porque outras enzimas presentes nos microssomas (e. g., reacções de acil transferase) a utilizam como um substrato e competem com SCDl e/ou porque a estearoil-CoA é instável nas condições da experiência. Estas possibilidades podem ser examinadas através da monitorização da incorporação do marcador nos fosfolípidos ou incluindo uma mistura de tampões (Mg++, ATP e CoA) que iriam regenerar a estearoil-CoA de estearato e CoA.

Como apresentado na Fig. 20 (Quadro B) o ensaio pode ser realizado num volume pequeno apropriado para rastreio de elevado desempenho. Uma forma de realização preferida empregaria uma microcentrífuga satisfatória para centrifugar placas de 96 poços.

Os ensaios seguintes são também adequados para medir a actividade biológica de SCDl na presença de agentes terapêuticos potenciais. Estes ensaios são também valiosos como rastreios secundários para seleccionar ainda moduladores, inibidores ou agonistas específicos para SCDl a partir de uma biblioteca de agentes terapêuticos potenciais.

Também podem ser utilizados ensaios de insaturação com base celular. Monitorizando a conversão do estearato em oleato nas células (os adipócitos 3T3L.1 são conhecidos por possuírem 36 expressão elevada de SCDl e incorporarem rapidamente estearato quando complexados com BSA) podem avaliar-se os compostos que se verificou serem inibidores no rastreio primário para as qualidades ou caracteristicas adicionais, tais como se são permeáveis às células, letais para as células e/ou competentes para inibir actividade de SCDl nas células. Este ensaio de base celular pode empregar uma linha celular recombinante contendo uma delta-9 dessaturase, de um modo preferido, hSCDl (SCDl humana). O gene recombinante está opcionalmente sob o controlo de um promotor indutivel e a linha celular, de um modo preferido, sobre-expressa a proteína SCDl.

Podem ser desenvolvidos outros ensaios para monitorizar outras isoformas de SCD. Por exemplo, s SCD 2 de rato e de murganho é expressa no cérebro. Numa forma de realização preferida, uma preparação de microssomas é realizada a partir do cérebro, como previamente realizado para SCDl a partir do fígado. 0 objectivo pode ser encontrar compostos que seriam específicos para SCDl. Este rastreio iria comparar o efeito inibidor do composto para SCDl versus SCD2.

Embora improvável, é possível que um composto "hit" no ensaio de SCDl possa resultar da estimulação de uma enzima presente na preparação de microssoma que utiliza competitivamente estearoil-CoA às custas daquela disponível para a insaturação dependente de SCDl. Isto iria ser interpretado erradamente como inibição de SCDl. Uma possibilidade para examinar este problema seria a incorporação em fosfolípidos do lípido insaturado (estearato) . Determinando os efeitos dos compostos na estimulação da incorporação do estearato nos lípidos, os investigadores são capazes de avaliar esta possibilidade. 37

Podem ser preferidos ensaios à base de células, porque eles deixam o gene SCD1 no seu formato nativo. Particularmente promissores para a análise de SCDl nestes tipos de ensaios são os ensaios de polarização de fluorescência. A extensão até onde a luz permanece polarizada depende do grau até ao qual o marcador foi rodado no intervalo de tempo entre a excitação e a emissão. Uma vez que a medição é sensível à taxa de queda das moléculas, pode ser utilizada para medir as alterações nas características de fluidez da membrana que são induzidas pela actividade de SCDl - nomeadamente a actividade de delta-9 insaturação da célula. Um ensaio alternativo para SCDl envolve um ensaio de FRET. Os ensaios de FRET medem a transferência de energia de ressonância de fluorescência que ocorre entre um dador de molécula fluorescente e um aceitador ou interruptor. Um tal ensaio pode ser adequado para medir as alterações na fluidez da membrana ou características de sensibilidade à temperatura induzidas pela actividade biológica de SCDl.

Os ensaios de rastreio da invenção podem ser realizados utilizando sistemas robóticos de elevado desempenho. No futuro, os ensaios preferidos podem incluir dispositivos de chip desenvolvidos por, entre outros, Caliper, Inc., ACLARA BioSciences, Cellomics, Inc., Aurora Biosciences Inc. e outros.

Noutras formas de realização da presente invenção, a actividade biológica de SCDl também pode ser medida através de um ensaio de efluxo de colesterol que mede a capacidade das células para transferir o colesterol para uma molécula aceitadora extracelular e está dependente da função de ABCA1. Um ensaio de efluxo de colesterol convencional é estabelecido em 38

Marcil et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:159-169, 1999, aqui incorporado por referência para todos os objectivos.

Os ensaios preferidos são rapidamente adaptados ao formato utilizado para o rastreio de fármacos, que pode consistir num formato de multi-poços (e. g., 96-poços, 384 poços ou 1536 poços ou superior). A modificação do ensaio para optimizá-la para o rastreio de fármacos deve incluir a redução de escala e a racionalização do processo, modificando o método de marcação, alterando a incubação tempo e alterar o método de cálculo da actividade biológica de SCDl etc. Em todos estes casos, a actividade biológica dos ensaios de SCDl permanece conceptualmente a mesma, embora possam ser realizadas modificações experimentais.

Outro ensaio preferido à base de células é um ensaio de viabilidade celular para o isolamento de inibidores de SCDl. A sobre-expressão de SCD diminui a viabilidade celular. Este fenótipo pode ser explorado para identificar os compostos inibidores. Esta citotoxicidade pode ser devida à alteração da composição em ácidos gordos da membrana plasmática. Numa forma de realização preferida, o ADNc de SCDl humana deve ser colocado sob o controlo de um promotor indutivel, tal como o sistema de expressão genética Tet-On Tet-Off (Clontech). Este sistema envolve produzir uma linha celular estável dupla. A primeira transfecção introduz um plasmideo regulador e a segunda iria introduzir a construção da expressão de SCD indutivel. A integração cromossómica de ambas as construções no genoma do hospedeiro favoreceria colocar as células transfectadas sob pressão selectiva na presença do antibiótico apropriado. Uma vez estabelecida a linha celular duplamente estável, a expressão de SCDl deve ser induzida utilizando a tetraciclina ou um derivado 39

Doxiciclina). Uma vez induzida a de tetraciclina (e. g., expressão de SCDl, as células seriam expostas a uma biblioteca de compostos químicos para HTS de potenciais inibidores. Após um período de tempo definido, a viabilidade celular seria então medida por meio de um corante fluorescente ou outra abordagem (e. g., turbidez do meio de cultura de tecido). As células expostas aos compostos que actua como inibidor da actividade de SCDl apresentariam uma viabilidade aumentada, acima da sobrevivência de fundo. Assim, um tal ensaio seria uma selecção positiva para inibidores da actividade de SCDl baseada na expressão indutível de SCDl e medição da viabilidade celular.

Uma abordagem alternativa é interferir com o sistema de dessaturase. 0 sistema da dessaturase possui três proteínas principais: citocromo b5, NADH (P)-citocromo b5 redutase, e dessaturase terminal sensível ao cianeto. A dessaturase terminal sensível ao cianeto é o produto do gene SCD. A actividade de SCD depende da formação de um composto estável entre os três componentes acima mencionados. Assim, qualquer agente que interfere com a formação deste complexo ou qualquer agente que interfere com a função adequada de qualquer um dos três componentes do complexo iria inibir eficazmente a actividade de SCD.

Outro tipo de modulador da actividade de SCDl envolve um domínio de desestabilização de 33 aminoácidos localizado na extremidade do terminal amino da pré-proteína SCDl (Mziaut et al., PNAS 2000, 97: p 8883-8888). É possível que este domínio possa ser clivado a partir da proteína SCDl por uma protease ainda desconhecida. Esta putativa actividade proteolítica iria por isso actuar aumentando a estabilidade e semi-vida de SCDl. A inibição da protease putativa, por outro lado, iria provocar uma 40 diminuição na estabilidade e na semi-vida da SCDl. Os compostos que bloqueiam ou modulam a remoção do domínio de desestabilização levará por isso a reduções nos níveis de proteína SCDl numa célula. Por isso, em certas formas de realização da invenção, um ensaio de rastreio empregará uma medida da actividade de protease para identificar moduladores da actividade de protease de SCDl. 0 primeiro passo é identificar a protease específica que é responsável pela clivagem de SCDl. Esta protease pode ser então integrada num ensaio de rastreio. Ensaios de protease clássicos baseiam-se frequentemente no encaixe de um sítio de clivagem da protease (i. e., um péptido contendo a sequência clivável pertencente à protease em questão) numa proteína, que é desactivado quando ocorre a clivagem. Pode ser utilizado para este efeito uma proteína de efluxo de tetraciclina. É expressa em E. coli uma quimera contendo a sequência inserida. Quando a proteína é clivada, a resistência à tetraciclina perde-se para essa bactéria. Foram desenvolvidos ensaios in vitro nos quais um péptido que contém um sítio de clivagem apropriado é imobilizado numa extremidade numa fase sólida. A outra extremidade é marcada com um isótopo radioactivo, fluoróforo, ou outro marcador. A perda de sinal mediada pela enzima a partir da fase sólida tem paralelo com a actividade de protease. Estas técnicas podem ser utilizadas tanto para identificar a protease responsável por criar a proteína SCDl madura e também para identificar moduladores desta protease para utilização na diminuição dos níveis de SCDl numa célula.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para determinar a capacidade de um agente para modular a actividade de uma estearoil-CoA dessaturase humana, compreendendo os passos de: 41 (a) colocar em contacto o agente em condições adequadas com a estearoil-CoA dessaturase humana da invenção a um nível pré-determinado do referido agente;

(b) determinar se a actividade da referida estearoil-CoA dessaturase se altera após o referido contacto, determinando desse modo se o referido agente modulou a referida actividade.

Esse ensaio pode ser realizado como um ensaio isento de células que emprega um fraccionamento celular, tal como uma fracção microssomal, obtida através de métodos convencionais de fraccionamento celular diferencial, de um modo muito comum através de métodos de ultracentrifugação. Em formas de realização específicas, essa modulação pode ser um aumento ou diminuição na actividade da dessaturase.

Estes resultados sugerem que os inibidores da actividade biológica de SCD, tal como hSCDl, num humano, pode ter o efeito benéfico de reduzir triglicéridos e/ou aumentar os níveis de HDL. Adicionalmente, a actividade aumentada de SCD está também associada com o aumento do índice de peso corporal. Este resultado identifica a hSCDl como um alvo útil para identificar agentes para modular a obesidade e estados relacionados. Nestes resultados de dados com humanos, a actividade biológica de SCD foi medida através de um marcador substituto da proporção de 18:1 até 18:0 de ácidos gordos na fracção de lípidos totais no plasma. Este marcador mede indirectamente a actividade biológica de hSCDl.

Num outro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para determinar a capacidade de um agente para modular a actividade de uma estearoil-CoA dessaturase humana em células 42 que expressam a estearoil-CoA dessaturase humana da invenção, compreendendo os passos de: (a) colocar em contacto o agente em condições adequadas com uma célula eucariótica que expressa a estearoil-CoA dessaturase humana da invenção num nivel pré-determinado do referido agente e em condições em que o referido agente pode ou não modular o nivel de expressão da referida dessaturase; (b) determinar se a actividade da referida estearoil-CoA dessaturase se altera após o referido contacto, determinando, desse modo, se o referido agente modulou o referido nivel de expressão.

Em formas de realização especificas dos referidos processes, a modulação pode ser um aumento ou diminuição na actividade da dessaturase e as células úteis nestes processos são, de um modo preferido, células de mamíferos, de um modo muito preferido células humanas e incluem qualquer uma das células recombinantes aqui divulgadas.

Linhas celulares de SCDl recombinante

Em certas formas de realização, a presente invenção contempla a utilização de um gene ou proteína SCDl numa linha celular recombinante. As linhas celulares de SCDl recombinante podem ser criadas utilizando técnicas conhecidas na área, e aquelas mais especificamente apresentadas abaixo. A presente invenção também se refere a vectores que contêm polinucleótidos da presente invenção e células hospedeiras que 43 são geneticamente modificadas com vectores da invenção, especialmente quando essas células resultam numa linha celular que pode ser utilizada para ensaio da actividade de hSCDl e produção dos polipéptidos de SCD1 através de técnicas recombinantes.

As células hospedeiras são, de um modo preferido, células eucarióticas, de um modo preferido, células de insecto da espécie Spodoptera, mais especialmente células SF9. As células hospedeiras são geneticamente modificadas (transduzidas ou transformadas ou transfectadas) com os vectores, especialmente baculovirus) desta invenção que pode ser, por exemplo, um vector de clonagem ou um vector de expressão. Esses vectors podem incluir plasmideos, vírus e semelhantes. As células hospedeiras modificadas são cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para activar promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes da presente invenção. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, são aquelas utilizadas previamente com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão óbvias para o especialista na técnica.

Os polinucleótidos da presente invenção podem ser empregues para produzir polipéptidos através de técnicas recombinantes. Assim, por exemplo, o polinucleótido pode ser incluído em qualquer um de uma variedade de vectores de expressão para expressar um polipéptido. Esses vectores incluem sequências de ADN cromossómico, não cromossómico e sintético, e. g., derivados de SV40; plasmideos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plasmideos de leveduras; vectores derivados de combinações de plasmideos e o ADN de fago, ADN virai tal como de vaccinia, adenovírus, vírus da varíola aviária e pseudoraiva. Todavia, 44 pode ser utilizado qualquer outro vector desde que seja replicável e viável no hospedeiro. A sequência de ADN apropriada pode ser inserida no vector através de uma variedade de processos. Em geral, a sequência de ADN é inserida num(em) sitio (s) de endonuclease de restrição apropriado(s) através de processos conhecidos na técnica. Esses processos e outros são considerados como estando dentro do âmbito do conhecimento dos especialistas na técnica. A sequência de ADN no vector de expressão está ligada operacionalmente a uma sequência (s) de controlo de expressão apropriada(s) (promotor) para controlar a síntese directa de ARNm. Como exemplos representativos desses promotores, podem ser mencionados: promotor de LTR ou SV40, o lac ou trp de E. coli., o promotor do fago lambda PL e outros promotores conhecidos por controlarem a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus. 0 vector de expressão também contém um sítio de ligação ao ribossoma para iniciação de tradução e um terminador de transcrição. 0 vector pode também incluir sequências apropriadas para amplificar a expressão.

Adicionalmente, os vectores de expressão, de um modo preferido, contêm um ou mais genes marcadores de selecção para proporcionar uma característica fenotípica para a selecção de células hospedeiras transformadas, tais como di-hidrofolato redutase ou resistência a neomicina para cultura de células eucarióticas ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli. 0 vector que contém a sequência de ADN apropriada como aqui descrito acima, assim como um promotor ou sequência de controlo 45 apropriados, podem ser empregues para transformar um hospedeiro apropriado para permitir que o hospedeiro expresse a proteína. Essa transformação será permanente e, desse modo, dará origem a uma linha celular que pode ser utilizada para testes futuros. Essas linhas celulares utilizadas para testes serão normalmente células de mamíferos, especialmente células humanas.

Como exemplos representativos de hospedeiros apropriados, podem ser mencionadas Sf9 de Spodoptera (e outros sistemas de expressão em insectos) e células animais, tais como CHO, COS ou melanoma de Bowes; adenovírus; células vegetais, e ainda células bacterianas, etc., todas as quais são capazes de expressar os polinucleótidos aqui divulgados. A selecção de um hospedeiro apropriado é considerado como estando dentro do conhecimento dos especialistas na técnica com base nos ensinamentos aqui apresentados. Para utilização nos métodos de ensaio aqui divulgados, são preferidas células de mamíferos, especialmente humanos.

Mais particularmente, a presente invenção também inclui construções recombinantes compreendendo uma ou mais das sequências como vastamente descritas acima. As construções compreendem um vector, tal como um vector plasmídico ou virai, especialmente quando é utilizado Baculovírus/SF9 vector/sistema de expressão, no qual foi inserida uma sequência da invenção, numa orientação em sentido directo ou reverso. Num aspecto preferido desta forma de realização, a construção compreende ainda sequências reguladoras, incluindo, por exemplo, um promotor ligado operacionalmente à sequência. São conhecidos dos especialistas na técnica números elevados de vectores e promotores adequados e estão disponíveis comercialmente. Os vectores seguintes são proporcionados a título de exemplo; 4 6

Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pDIO, phagescript, psixl74, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNHl6a, pNHl8A, PNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Todavia, pode ser utilizado qualquer outro plasmídeo ou vector desde que seja replicável e viável no hospedeiro.

Podem ser seleccionadas regiões de promotor a partir de qualquer gene desejado, utilizando vectores CAT (cloranfenicol transferase) ou outros vectores com marcadores de selecção. Dois vectores apropriados são pKK232-8 e pCM7. Promotores bacterianos designados particulares incluem lacl, lacZ, T3, T7, gpt, PR, PL e trp de lambda. Promotores eucarióticos incluem CMV precoce imediato, cinase de timidina de HSV, SV40 precoce e tardio, LTR de retrovirus, e metalotioneina-I de murganho. A selecção do vector e promotor apropriados está bem dentro do nível de conhecimentos de um especialista na técnica.

Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se a células hospedeiras que contêm as construções acima descritas. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de levedura ou a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução da construção na célula hospedeira pode ser realizada através da transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrano ou electroporação (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Uma forma de realização preferida utiliza a expressão de células de insectos, especialmente células SF9 de Spodoptera frugiperda. 47

As construções em células hospedeiras podem ser utilizadas de um modo convencional para produzir o produto genético codificado pela sequência recombinante. Alternativamente, os polipéptidos da invenção podem ser produzidos sinteticamente através de sintetizadores de péptidos convencionais.

As proteinas maduras podem ser expressas em células de mamíferos, leveduras, bactérias ou outras células sob o controlo de promotores apropriados. Podem também ser empregues sistemas de tradução sem células, para produzir essas proteinas utilizando ARN derivados das construções de ADN da presente invenção. Vectores de clonagem e expressão apropriados e para utilização com hospedeiros procarióticos e eucarióticos são descritos por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Wu et al, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Nova Iorque, NY, 1997), Recombinant Gene Expression Protocols, em Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997), e Current Protocols in Molecular Biology, (Ausabel et al, Eds.,), John Wiley & Sons, NY (1994-1999), cujas revelações são deste modo incorporados por referência na sua totalidade. A transcrição do ADN que codifica os polipéptidos da presente invenção por células eucarióticas, especialmente células de mamíferos, muito especialmente células humanas, é aumentada através da inserção de uma sequência intensificadora no vector. Os intensificadores são elementos de actuação cis do ADN, normalmente de cerca de 10 até 300 pb que actuam num promotor para aumentar a sua transcrição. Exemplos incluem o intensificador SV40 no lado tardio da origem de replicação, pb 48 100 a 270, um intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador do polioma no lado tardio da origem de replicação e os intensificadores de adenovirus.

Geralmente, os vectores de expressão recombinante incluirão origens de replicação e marcadores de selecção que permitem a transformação da célula hospedeira, e. g., o gene de resistência à ampicilina de E. coli e S. cerevisiae o gene Trpl e um promotor derivado de um gene de expressão elevada para controlar a transcrição de uma sequência estrutural a jusante. Esses promotores podem ser derivados dos operões que codificam enzimas glicoliticas, tais como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), factor a, fosfatase ácida ou proteínas de choque térmico, entre outras. A sequência estrutural heteróloga é montada numa fase apropriada com sequências de iniciação e terminação de tradução e, de um modo preferido, uma sequência líder capaz de controlar a secreção da proteína traduzida para o espaço periplásmico ou meio extracelular. Opcionalmente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão que inclui um péptido de identificação N-terminal ou C-terminal que transmite as características desejadas, e. g., estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso. A utilização de um sistema de expressão à base de Baculovírus é um método preferido e conveniente para formar os recombinantes aqui divulgados. Os Baculovírus representam uma grande família de vírus de ADN que infectam principalmente insectos. O protótipo é o vírus da poliedrose nuclear (AcMNPV) de Autographa californica, que infecta várias espécies de lepidópteros. Uma vantagem do sistema de baculovírus é que o baculovírus recombinante pode ser produzido in vivo. Após cotransfecção com o plasmídeo de transferência, a maior 49 descendência tende a ser de tipo selvagem e uma boa parte do processamento subsequente envolve rastreio. Para ajudar a identificar as placas, estão disponíveis sistemas especiais que utilizam mutantes de deleção. A titulo de exemplo não limitante, foi relatado na literatura um derivado de AcMNPV recombinante (denominado BacPAK6) que inclui sitios alvo para a nuclease de restrição Bsu36l a montante do gene da poliedrina (e na ORF 1629) que codifica um gene da cápside (essencial para a viabilidade do vírus). Bsf36l não corta noutro local no genoma e a digestão de SacPAK6 elimina uma porção da ORF1629, tornando desse modo o vírus não viável. Assim, com um protocolo envolvendo um sistema como o ADN de BacPAK6 cortado com Bsu361, a maioria da descendência são virus não viáveis de modo a que apenas a descendência obtida após co-transfecção com o plasmídeo de transferência e BacPAK6 digerido é recombinante porque o plasmideo de transferência, contendo o ADN exógeno, é inserido no sitio Bsu36l tornando assim os recombinantes resistentes à enzima, [ver Kitts e Possee, A method for producing baculovirus expression vectors at high frequency, BioTechniques, 14, 810-817 (1993) . Para processos gerais, ver King e Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman and Hall, Nova Iorque (1992) e Recombinant Gene Expression Protocols, em Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997), no Capítulo 19, pp. 235-246.

De acordo com o precedente, a presente invenção utiliza vectores compreendendo um polinucleótido da invenção e células eucarióticas recombinantes que expressam a estearoil-CoA dessaturase da presente invenção, de um modo preferido, em que a referida célula é uma célula de mamífero, de um modo muito preferido, uma célula humana. 50 A presente invenção refere-se ainda a processos para utilizar os polinucleótidos, enzimas e células aqui divulgados num processo para determinar a capacidade de um agente para modular a expressão da referida estearoil-CoA dessaturase humana em células que expressam a referida estearoil-CoA dessaturase humana da invenção, compreendendo os passos de: (a) colocar em contacto o agente em condições adequadas com uma célula eucariótica que expressa a estearoil-CoA dessaturase humana da invenção num nível pré-determinado do referido agente; (b) determinar se o nível de expressão da referida estearoil-CoA dessaturase se altera após o referido contacto, determinando, desse modo, se o referido agente modulou o referido nível de expressão.

Alternativamente, o ensaio de rastreio pode empregar uma construção de vector compreendendo a sequência do promotor hSCDl de SEQ ID. N° 3 ligada operacionalmente a um gene repórter. Esse vector pode ser utilizado para estudar o efeito de potenciais proteínas reguladoras de transcrição e o efeito de compostos que modulam o efeito dessas proteínas reguladoras, na transcrição de SCDl. Um exemplo deste tipo de vector é o plasmídeo pSCD-500 descrito nos exemplos abaixo. As construções do gene repórter , tais como estas, são normalmente utilizadas para indicar se um composto de teste teve sucesso na activação da transcrição dos genes sob o controlo de um promotor particular.

Em formas de realização específicas, a presente invenção contempla um processo em que a referida modulação é um aumento ou diminuição no referido nível de expressão e em que a referida célula pode ser uma célula de mamíferos, especialmente uma 51 célula humana, incluindo qualquer uma das células recombinantes aqui divulgadas. Numa forma de realização, o nivel de expressão é determinado através da determinação do nivel de ARN mensageiro produzido após o contacto da referida célula com o referido agente.

Os factores que podem modular a expressão genética incluem factores de transcrição, tais como, mas não limitados a, receptores de retinóide X (RXR), receptor activado pela proliferação peroxissomal (PPAR) factores de transcrição, as proteínas de ligação ao elemento de respostas de esteróide (SREBP-1 e SREBP-2), REV-ERBa, ADD-1, EBPa, proteína de ligação a CREB, P300, HNF 4, RAR, LXR, e RORa, NF-Y, C/EBPalpha, PUFA-RE e proteínas relacionadas e reguladores de transcrição. Ensaios de rastreio designados para avaliar a capacidade dos compostos de teste para modular a capacidade destes factores de transcrição para transcrever SCDl estão também contemplados por esta invenção.

Os benefícios fisiológicos de um aumento ou diminuição na actividade ou expressão de hSCDl incluem, mas não estão limitados a, diminuir os triglicéridos no plasma e/ou aumentar HDL no plasma conduzindo a benefício cardioprotector, benefício terapêutico na diabetes de tipo II, perda de peso, melhoramento das secreções glandulares e diminuição das hipóteses de doença. Assim, a determinação da capacidade dos agentes para modular essa actividade ou expressão constitui uma oportunidade para descobrir agentes terapêuticos úteis que produzem esses efeitos.

Adicionalmente, as variações na expressão, função, estabilidade, actividade catalítica e outras características do gene hSCDl podem ser devidas às variações alélicas nas 52 sequências polinucleotídicas que codificam essas enzimas. Os processos divulgados de acordo com a presente invenção podem, de igual modo, ser utilizados para determinar esses efeitos genómicos na expressão de hSCDl. Utilizando os processos da presente invenção, essas variações podem ser determinadas ao nível do polimorfismo do ADN no gene hSCDl e/ou sequências promotoras. Esses efeitos levam à elucidação de associações entre esses polimorfismos e predisposição para o cancro, doença neurológica, doença da pele, obesidade, diabetes, função imunitária e metabolismo dos lípidos através de análises genéticas à população e com base na família.

Finalmente, os especialistas na técnica são capazes de confirmar a relevância da hSCDl para a saúde humana por analogia com modelos animais. Pode ser utilizados modelos da doença em animais bem conhecidos para verificar o efeito de um modulador de hSCDl no crescimento, desenvolvimento ou processo de doença nestes animais. Adicionalmente, os modelos incluem animais multicelulares geneticamente modificados, tais como murganhos desactivados ou activados (como detalhado nos exemplos abaixo). Num aspecto geral, a presente invenção refere-se a um processo para identificar um agente de modulação de SCD1, compreendendo: a) colocar em contacto em condições fisiológicas um agente químico e uma molécula que possui ou induz actividade de SCD1; b) detectar uma alteração na actividade da referida molécula que possui ou induz actividade de SCD1 após o referido contacto; identificando desse modo um agente de modulação de SCD1. 53

Em formas de realização específicas da invenção, a referida molécula que possui ou induz actividade de SCDl é um polipéptido que possui essa actividade ou um polinucleótido que codifica um polipéptido que possui essa actividade ou um polipéptido que modula a actividade de um polinucleótido que codifica um polipéptido que possui essa actividade.

Em formas de realização específicas, a referida alteração na actividade é um aumento na actividade ou é uma diminuição na actividade.

Em processos in vivo, a referida alteração na actividade de SCDl no referido animal é uma diminuição na actividade, de um modo preferido, em que o referido agente de modulação de SCDl não inibe substancialmente a actividade biológica de uma delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase ou sintetase de ácidos gordos.

Nesses processos, como agora divulgado, a alteração detectada na actividade de SCDl é detectada através da detecção de uma alteração em qualquer um, algum ou todos os seguintes: a) afinidade de ligação ao polipéptida SCDl; b) actividade de dessaturase de SCDl em microssomas; c) actividade de dessaturase de SCDl numa célula total; d) expressão do gene SCDl; ou e) nivel de proteina SCDl.

De acordo com o precedente, a presente invenção também utiliza uma linha celular recombinante compreendendo uma proteina SCDl recombinante, como aqui divulgado. Numa tal forma de realização, a célula total de (c) acima é derivada de uma tal linha celular, de um modo preferido, em que o referido agente de 54 modulação de SCDl não iniba em humanos a actividade biológica de delta-5 dessaturase, delta-β dessaturase ou sintetase de ácidos gordos. A linha celular recombinante da invenção pode também compreender a sequência de ácido nucleico do promotor de SCDl da SEQ ID N° 1 ligada operacionalmente a uma construção do gene repórter. Numa sua forma de realização especifica, a célula total de (c) acima é derivada de uma célula recombinante dessa linha celular.

De acordo com a divulgação aqui apresentada, a presente invenção faz também uso de uma estearoil-CoA dessaturase isolada, codificada pela sequência polinucleotidica compreendendo SEQ ID N° [ADNc de SCDl] assim como uma construção de gene repórter compreendendo a sequência de ácido nucleico do promotor de SCDl de SEQ ID N° 1 ligada operacionalmente a um gene repórter, incluindo vantajosamente vectores utilizáveis compreendendo esses ácidos nucleicos e suas construções. Do mesmo modo, a presente invenção também contempla um polipéptido isolado que possui actividade de estearoil-CoA redutase e um processo como aqui divulgado que identifica com sucesso um agente quimico que se liga a ou interage com esse polipéptido, cujo processo compreende: a) colocar em contacto um tal polipéptido ou uma célula que expressa esse polipéptido, com um agente quimico; e b) detectar a ligação ou interacção do agente quimico com o referido polipéptido. 55

Em formas de realização específicas do processo agora descrito, a ligação do agente químico ao polipéptido é detectada por um método seleccionado do grupo que consiste em: a) detecção directa químico/polipéptido; da ligação ao agente b) detecção da ligação competição; e através de ensaio de ligação de c) detecção da ligação biológica de SCDl. através de ensaio para a actividade

Nesses processos, a modulação da actividade desse polipéptido é detectada através de um processo compreendendo colocar em contacto o polipéptido ou uma célula que expressa o polipéptido com um composto que se liga ao polipéptido numa quantidade suficiente para modular a actividade do polipéptido. Em formas de realização específicas deste processo, a molécula que possui ou induz a actividade de SCD1 é seleccionada do grupo que consiste num ácido nucleico de SCD1 e/ou polipéptida SCD1 como aqui divulgado.

Após identificação dos agentes químicos que possuem a actividade de modulação desejada, estes podem ser utilizados num processo de tratamento de um animal, especialmente um humano, tal como um doente humano, afligido com uma doença ou estado relacionado com os níveis de triglicéridos ou VLDL no soro compreendendo actividade de inibição de SCDl no referido humano Numa forma de realização preferida, a referida inibição da actividade de SCDl não é acompanhada pela inibição da actividade de delta-5 dessaturase, delta-6 dessaturase ou sintetase de ácidos gordos. Um doente humano afligido com um distúrbio ou estado relacionado com níveis de triglicérido ou VLDL no soro 56 pode ser tratado pela administração ao referido doente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente cuja actividade terapêutica foi primeiro identificada pelo processo da invenção.

De acordo com o acima referido, a presente invenção também se refere a um modulador da actividade de SCDl e que é útil em humanos para tratamento de um distúrbio ou estado relacionado com os niveis de triglicéridos ou VLDL no soro em que a referida actividade foi primeiro identificada pela sua capacidade para modular a actividade de SCDl, especialmente quando essa modulação foi primeiro detectada utilizando um processo como aqui divulgado, de acordo com a presente invenção. Numa sua forma de realização preferida, esse agente de modulação não inibe a sintetase de ácidos gordos, delta-5 dessaturase ou delta-6 dessaturase de humanos.

Assim, a presente invenção também se refere a um processo para identificar um agente de modulação de delta-9 estearoil-CoA dessaturase de vertebrados, compreendendo: a) colocar em contacto, em condições fisiológicas, um agente químico e uma molécula que possui ou induz actividade de delta-9 estearoil-CoA dessaturase de vertebrados; b) detectar uma alteração na actividade da referida molécula que possui ou induz actividade de delta-9 estearoil-CoA dessaturase de vertebrados após o referido contacto; identificando, desse modo, um agente de modulação de delta-9 estearoil-CoA dessaturase de vertebrados. 57

De acordo com o precedente, o agente de modulação de SCDl identificado pelo método da presente invenção pode ser utilizado num processo para tratamento de um doente humano afligido com uma doença ou estado relacionado como os niveis de triglicéridos, VLDL, HDL, LDL, colesterol total, transporte reverso de colesterol no soro ou produção ou secreção de membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera e parâmetros semelhantes, compreendendo administrar ao referido doente humano uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente para o qual essa actividade terapêutica foi identificada por um processo como aqui divulgado de acordo com a invenção.

Numa forma de realização preferida desse processo, o agente de modulação não inibe substancialmente a sintetase de ácidos gordos, delta-5 dessaturase ou delta-6 dessaturase de humanos.

Compostos de Teste/Moduladores/Fontes de Bibliotecas

De acordo com o precedente, a presente invenção também se refere a agentes terapêuticos e/ou de diagnóstico, independentemente do tamanho molecular ou peso, eficaz no tratamento e/ou diagnóstico e/ou prevenção de qualquer uma das doenças aqui divulgados, de um modo preferido, quando esses agentes possuem a capacidade para modular a actividade e/ou expressão de hSCDl aqui divulgada e, de um modo muito preferido quando foi determinado que os referidos agentes possuem essa actividade através de pelo menos um dos ensaios de rastreio divulgados de acordo com a presente invenção. 58

Os compostos de teste são geralmente compilados em bibliotecas desses compostos e um objectivo chave dos ensaios de rastreio da invenção é seleccionar quais os compostos que são relevantes das bibliotecas que possuem centenas de milhares ou milhões de compostos, que possuem eficácia terapêutica desconhecida.

Os especialistas no campo da descoberta e desenvolvimento de fármacos entenderão que a fonte precisa dos extractos ou compostos de teste não é critica para o(s) processo (s) de rastreio da invenção. Consequentemente, virtualmente qualquer número de extractos ou compostos químicos podem ser rastreados utilizando os métodos exemplares aqui descritos. Exemplos desses extractos ou compostos incluem, mas não estão limitados a, extractos à base de plantas, fungos, procariotas ou animais, caldos de fermentação e compostos sintéticos, assim como modificação de compostos existentes. Estão também disponíveis numerosos métodos para criar síntese aleatória ou dirigida (e. g., semi-síntese ou síntese total) de qualquer número de compostos químicos, incluindo, mas não limitados a, compostos à base de sacáridos, lípidos, péptidos e ácidos nucleicos. Estão disponíveis comercialmente bibliotecas de compostos sintéticos a partir de Brandon Associates (Merrimack, NH) e Aldrich Chemical (Milwaukee, WI) . Alternativamente, estão disponíveis comercialmente bibliotecas de compostos naturais na forma de extractos de bactérias, fungo, plantas e animais a partir de várias fontes, incluindo Biotics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FL), e PharmaMar, E.U.A. (Cambridge, MA). Adicionalmente, são produzidas bibliotecas naturais e produzidas sinteticamente, se desejado, de acordo com métodos conhecidos na técnica, e. g., através de métodos convencionais de extracção e fraccionamento. 59

Além disso, se desejado, qualquer biblioteca ou composto é rapidamente modificado utilizando métodos convencionais químicos, físicos ou bioquímicos.

Assim, num aspecto, a presente invenção refere-se a agentes capazes de modular a actividade e/ou expressão de estearoil-CoA dessaturase humana 1 (hSCDl) como aqui divulgados, especialmente quando a referida capacidade de modulação foi primeiro determinada utilizando um ensaio compreendendo hSCDl ou um gene que codifica hSCDl ou um ensaio que mede a actividade de hSCDl. Como aqui utilizado, o termo "capaz de modular" refere-se à característica de um tal agente através da qual o referido agente possui o efeito de alterar a actividade biológica global de hSCDl, quer aumentando ou diminuindo a referida actividade, em condições adequadas de temperatura, pressão, pH e semelhantes de modo a facilitar essa modulação até um ponto em que pode ser detectado quer qualitativamente ou quantitativamente e em que essa modulação pode ocorrer num ambiente in vitro ou in vivo. Adicionalmente, embora o termo "modulação" seja aqui utilizado para significar uma alteração da actividade, mais especificamente quer seja um aumento ou diminuição dessa actividade, o termo "actividade" não deve estar limitado apenas à actividade enzimática específica (por exemplo, como medido em unidades por miligrama ou alguma outra unidade adequada de actividade específica), mas inclui outros efeitos directos e indirectos da proteína, incluindo aumentos na actividade enzimática devido não a alterações na actividade enzimática específica, mas devido a alterações (i. e., modulação) da expressão dos polinucleótidos que codificam e que expressam a referida enzima hSCDl. A actividade de SCDl humana também pode ser influenciada por agentes que se ligam especificamente aos como aqui substratos de hSCDl. Assim, o termo "modulação", 60 utilizado, significa uma alteração na actividade de hSCDl independentemente do nivel genético molecular da referida modulação, seja um efeito na enzima per se ou um efeito nos genes que codificam a enzima ou no ARN, especialmente ARNm, envolvido na expressão dos genes que codificam a referida enzima. Assim, a modulação por esses agentes pode ocorrer ao nivel do ADN, ARN ou da proteina enzimática e pode ser determinada in vivo ou ex vivo.

Nas suas formas de realização especificas, o referido ensaio é qualquer um dos ensaios aqui divulgados de acordo com a invenção. Adicionalmente, o(s) agente(s) contemplado(s) pela presente divulgação incluem agentes de qualquer tamanho ou carácter quimico, sejam moléculas grandes ou pequenas, incluindo proteínas, tais como anticorpos, ácidos nucleicos, quer ARN ou ADN, e estruturas químicas pequenas, tais como moléculas orgânicas pequenas.

Noutros aspectos, a presente invenção contempla agentes em que o referido agente é útil no tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de uma doença ou estado que é identificado como estando relacionado com SCD1 de acordo com esta invenção. Formas de realização especificas estão dirigidas a situações em que a doença ou estado inclui, mas não está limitado a, niveis de triglicéridos, VLDL, HDL, LDL, colesterol total, no soro, transporte reverso de colesterol ou produção de secreções das membranas mucosas, ácidos gordos monoinsaturados, ésteres de cera e semelhantes, colesterol distúrbios, lipidemias, doença cardiovascular, diabetes, obesidade, calvicie, doenças da pele, cancro e esclerose múltipla, especialmente quando a doença é uma doença cardiovascular ou uma doença da pele ou quando a condição é a calvície. Numa forma de realização preferida, esses agentes 61 irão aumentar os níveis de HDL num doente e/ou diminuir os níveis de triglicéridos num doente. Qualquer um deles, ou ambos os efeitos, estão directamente associados com o risco reduzido de doença cardiovascular e doença da artéria coronária.

Alguns dos moduladores conhecidos da actividade de SCDl incluem ácido linoleico conjugado, especialmente trans-10, cis-12 isómero e compostos de tiazoladinadiona, tais como troglitazona.

Embora esteja contemplado que possa ser utilizado qualquer mecanismo adequado para a inibição ou modulação da actividade de SCDl, estão contemplados três exemplos específicos de classes de inibidores. Uma classe inclui os inibidores que inibem eficazmente a expressão de SCDl, tal como compostos de tiazoladinadiona e ácidos gordos polinsaturados. Uma segunda classe inclui aqueles inibidores que inibem eficazmente a actividade enzimática de SCDl, tal como tia-ácidos gordos, ácidos gordos do ácido ciclopropenóide e certos isómeros de ácido linoleico conjugado. Finalmente, a terceira classe de inibidores inclui os agentes que são capazes de interferir com as proteínas essenciais para o sistema de dessaturase, tal como os agentes que interferem com o citocromo bs, NADH (P)-citocromo b5 redutase, e dessaturase terminal sensível ao cianeto.

Para inibir eficazmente a expressão do gene SCDl, está contemplado que pode ser utilizado qualquer agente capaz de interromper a transcrição do gene SCDl. Uma vez que a SCDl é regulada por vários factores de transcrição conhecidos (e. g. PPAR-γ, SREBP), qualquer agente que afecta a actividade desses factores de transcrição pode ser utilizado para alterar a expressão do gene SCDl. Um grupo desses agentes inclui compostos 62 de tiazoladina que são conhecidos por activar PPAR-γ e inibir a transcrição de SCDl. Estes compostos incluem Pioglitazona, Ciglitazona, Englitazona, Troglitazona e BRL49653. Outros agentes inibidores podem incluir ácidos gordos polinsaturados, tais como ácido linoleico, ácido araquidónico e ácido dodeca-hexanóico, que também inibe a transcrição de SCDl.

Para inibir eficazmente a actividade enzimática da proteína SCDl, está contemplado que pode ser utilizado qualquer agente capaz de destruir a actividade da proteína SCDl. Por exemplo, certos isómeros de ácido linoleico conjugados são inibidores de actividade de SCDl eficazes. Especificamente, é conhecido que o Cis-12, ácido linoleico trans-10 conjugado inibe eficazmente a actividade da enzima SCD e reduzir a abundância de ARNm de SCDl enquanto que Cis-9, ácido linoleico trans-11 conjugado não o faz. Ácidos gordos cicloprenóides, tais como aqueles que se encontram em sementes de stercula e algodão, são também conhecidos para inibir a actividade de SCD. Por exemplo, o ácido estercúlico (ácido 8-(2-octil-ciclopropenil)octanóico) e ácido Malválico (ácido 7-(2-octil-ciclopropenil)heptanóico) são derivados C18 e C16 de ácidos gordos de esterculoil- e malvaloil, respectivamente, possuindo anéis de ciclopropeno na sua posição Δ9. Estes agentes inibem a actividade de SCD por inibição da insaturação de Δ9. Outros agentes incluem tia-ácidos gordos, tais como ácido 9-tiasteárico (também denominado ácido 8-noniltiooctanóico) e outros ácidos gordos com uma unidade sulfoxilo.

Os moduladores conhecidos da actividade de delta-9 dessaturase ou não são conhecidos como sendo úteis para o tratamento das doenças e distúrbios ligadas à actividade biológica de SCDl como reivindicado nesta invenção, ou são, por 63 outro lado, agentes terapêuticos insatisfatórios. Os tia-ácidos gordos, ácidos linoleicos conjugados e ácidos gordos de ciclopropeno (ácido malválico e ácido estercúlico) não são úteis em doses fisiológicas razoáveis, nem são inibidores específicos de actividade biológica de SCDl, em vez disso, demonstram inibição cruzada de outras dessaturases, em particular as dessaturases delta-5 e delta-6 pelos ácidos gordos de ciclopropeno Estes compostos podem ser úteis para estabelecer os moduladores de controlo ou de teste dos ensaios de rastreio da invenção, mas não estão indivíduos às reivindicações desta invenção. Moduladores de SCDl preferidos da invenção não têm impacto significativo ou substancial em classes de proteínas não relacionadas. Em alguns casos, os ensaios específicos para as outras proteínas, tais como actividade de delta-5 e delta-6, também terão que ser testados para assegurar que os compostos da invenção identificados não demonstram inibição cruzada significativa ou substancial.

Os inibidores de SCDl não específicos conhecidos podem ser úteis na concepção racional de um agente terapêutico adequado para a inibição de SCDl. Todos os três inibidores possuem várias substituições entre os carbonos N° 9 e N° 10; adicionalmente eles requerem conjugação com Co-A para serem eficazes; e estão provavelmente situados num sítio activo relativamente hidrofóbico. Esta informação combinada com as coordenadas de raios X conhecidas para o sítio activo para SCD de plantas (solúvel) poder assistir ao processo "in silico" de concepção racional de fármacos para inibidores terapeuticamente aceitáveis específicos para SCDl.

Esta invenção também proporciona um anticorpo que se liga especificamente a SCDl humana possuindo a sequência de 64 aminoácidos conhecida nos números de acesso de SwissProt listados acima e que, desse modo, inibe a actividade de SCDl. O presente anticorpo pode ser anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação a SCD. Numa forma de realização, o anticorpo é isolado, i. e., um anticorpo isento de quaisquer outros anticorpos. Os métodos de fabrico e isolamento de anticorpos são bem conhecidos na técnica (Harlow, et al. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, NI, Cold Spring Harbor Laboratory).

Esta invenção também proporciona um oligonucleótido anti-sentido que especificamente a ARNm de SCDl humano e que reduz por isso o nivel de transcrição do gene SCDl. Métodos de produção e utilização de moléculas anti-sentido contra genes alvo conhecidos são conhecidos na técnica (Agarwal, S. (1996) Antisense Therapeutics. Totowa, NJ, Humana Press, Inc.)

Química Combinatória e Medicinal

Tipicamente, um ensaio de rastreio, tal como um ensaio de rastreio de elevado desempenho, irá identificar vários ou mesmo muito compostos que modulam a actividade da proteína do ensaio. 0 composto identificado pelo ensaio de rastreio pode ser ainda modificado antes de ser utilizado em humanos com o agente terapêutico. Tipicamente, a química combinatória é realizada no modulador, para identificar possíveis variantes que melhoraram a absorção, biodistribuição, metabolismo e/ou excreção ou outros aspectos terapêuticos importantes. Uma invariante essencial é que os compostos melhorados partilham um grupo ou grupos activos particulares que são necessários para a modulação desejada da proteína alvo. Muitas técnicas de química combinatória e 65 medicinal são bem conhecidas na técnica. Cada um adiciona ou elimina uma ou mais unidades constituintes do composto para criar um análogo modificado, cujo análogo é novamente ensaiado para identificar os compostos da invenção. Assim, como utilizado nesta invenção, os compostos terapêuticos identificados utilizando um ensaio de rastreio de SCDl da invenção incluem os compostos actuais assim identificados e quaisquer análogos ou modificações combinatórias produzidos para um composto que é assim identificado que são úteis para o tratamento dos distúrbios aqui reivindicados.

Preparações e Dosagens Farmacêuticas

Noutro aspecto, a presente invenção é dirigida para composições compreendendo os polinucleótidos, polipéptidos ou outros agentes quimicos, incluindo agentes terapêuticos, profilácticos ou de diagnóstico, tal como pequenas moléculas orgânicas, aqui divulgadas de acordo com a presente invenção, em que os referidos polinucleótidos, polipéptidos ou outros agentes são suspensos num veiculo farmacologicamente aceitável, cujo veiculo inclui qualquer diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, líquidos como a água, solução salina, glicerol e etanol e semelhantes, incluindo veículos úteis na formação de sprays para distribuição nasal e noutros tractos respiratórios ou para distribuição ao sistema oftálmico. Uma discussão exaustiva de veículos, diluentes e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis é apresentada em REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co. , N.J. edição actual). 66

Os inibidores utilizados acima podem ser distribuídos a um indivíduo utilizando qualquer um dos sistemas de distribuição normalmente utilizados conhecidos na técnica, como apropriado para o inibidor escolhido. Os sistemas de distribuição preferidos incluem injecção intravenosa ou distribuição oral, dependendo da capacidade do inibidor seleccionado para ser adsorvido no tracto digestivo. Qualquer outro sistema de distribuição apropriado para distribuição de moléculas pequenas, tais como pensos para a pele, também podem ser utilizados conforme apropriado.

Diagnóstico & Farmacogenómica

Ao realizar os processos da presente invenção deve ser obviamente entendido que a referência a tampões, meios, reagentes, células, condições de cultura particulares e semelhantes não pretendem ser limitantes, mas devem ser encarados de modo a incluir todos os materiais relacionados que um especialista na técnica reconheceria como sendo de interesse ou valor no contexto particular no qual a discussão é apresentada. Por exemplo, é frequentemente possível substituir um sistema de tampão ou meio de cultura por outro e, ainda assim, alcançar resultados semelhantes, se não idênticos. Os especialistas na técnica possuirão conhecimento suficiente desses sistemas e metodologias de modo a serem capazes, sem experimentação supérflua, de fazer essas substituições que irão servir optimamente os seus objectivos utilizando os métodos e processos aqui divulgados.

Ao aplicar a divulgação, deve ser mantido claramente na mente que outras e diferentes formas de realização dos métodos 67 divulgados de acordo com a presente invenção irão sem dúvida sugerir-se elas próprias aos especialistas na técnica.

Exemplo 1

Ruptura do gene de Estearoil-CoA Dessaturase 1 em murganhos provoca diminuição dos níveis de triglicéridos no plasma, assim como outros defeitos no metabolismo lipídico

Este exemplo identifica, pela primeira vez, actividades biológicas especificas de SCDl em murganhos por caracterização de um murganho com o gene SCDl específico desactivado.

Para investigar as funções fisiológicas de SCD, foram criados murganhos SCDl nulos (SCDl -/-). 0 perfil de lipoproteína de murganhos SCDl nulos (desactivados) demonstra uma diminuição surpreendente nos níveis de triglicéridos (i. e., VLDL) enquanto mantém os níveis de HDL e LDL aproximadamente normais. Este resultado confirma que uma mutação em SCDl é uma mutação causadora de um perfil de lipoproteína triglicérido (TG) em murganhos e é distinto de outras isoformas de SCD no murganho a este respeito. Devido à gravidade deste fenótipo é claro que é pouco provável que outras isoformas de SCD afectem os níveis de TG para uma tão grande extensão.

Ruptura Direccionada do Gene SCDl A Figura IA apresenta a estratégia utilizada para desactivar o gene SCDl. 0 gene SCDl de murganho inclui 6 exões. Os primeiros 6 exões do gene foram substituídos por uma cassete de 68 resistência a neomicina por recombinação homóloga, resultando na substituição da região codificante completa do gene SCDl (Fig. IA). 0 vector foi electroporado para dentro de células estaminais embrionárias e os clones que integraram a cassete neo foram seleccionados por cultura em geneticina. Os clones ES direccionados foram injectados em blastocistos C57BI/6 que produzem quatro linhas de murganhos quiméricos que transmitiram o alelo desactivado através da linha germinal. Os murganhos mutantes eram viáveis e férteis e reproduziram-se com distribuições Mendelianas previstas. Um rastreio à base de PCR para ensaiar com sucesso o direccionamento de genes do locus SCDl é observado na Fig. 1B. Para determinar se a expressão do gene SCDl foi eliminada foi realizada a análise de transferência de Northern (Fig. 1C) o ARNm de SCDl é indetectável no fígado de murganhos SCDl-/- e reduzido em aproximadamente 50% em murganhos SCD +/-. O ARNm de SCD2 foi expressa a niveis baixo em ambos os murganhos SCDl-/- e murganhos de tipo selvagem. Consistente com os resultados na análise de Northern, a análise da transferência de Western não apresentou proteína de SCD imunorreactiva no fígado de murganhos SCD -/-, enquanto que a proteína SCDl foi detectável em ambos os tecido de figado heterozigótico e de tipo selvagem de um modo dependente da dosagem do gene. A actividade da enzima SCD no figado, conforme medida pela taxa de conversão de [ 1—14C] estearoil-CoA para [ 1—14C] oleato (Fig. 1E) foi elevada nos murganhos de tipo selvagem mas foi indetectável nos extractos totais de fígados dos murganhos SCDl-/-.

Análise de Lípidos A análise éster de colesterol do fígado (0,8 ± 0,1 vs. 0,3 ± 0,1 mg/g fígado) e triglicéridos do fígado 69 (12,6 ± 0,3 vs. 7,5 ± 0,6 mg/g de fígado) demonstrou que os animais SCDl KO possuem quantidades inferiores de ésteres de colesterol e triglicéridos do que os controlos selvagens. A análise de lipoproteína do plasma demonstrou uma diminuição dos triglicéridos do plasma (120,6 ± 6,8 vs. 45,4 ± 3,8) em murganhos SCD -/- em comparação com os controlos normais. Estas verificações são semelhantes às verificações em murganhos asebia. A Figura 2 regista o perfil de lipoproteína no plasma obtido utilizando cromatografia líquida de desempenho rápido. Murganhos SCDl Desactivados apresentaram uma redução de 65% de triglicéridos na fracção VLDL; mas nenhuma diferença ou insignificante nos niveis de LDL ou HDL.

Os murganhos Asebia são comparados com os murganhos de SCDl desactivado na Figura 2. As verificações são invulgarmente semelhantes. As lipoproteinas no plasma de murganhos Asebia foram separadas por cromatografia liquida de desempenho rápido e a distribuição de triglicéridos entre as lipoproteinas nas várias fracções de densidade dos murganhos (n=3) são apresentadas. A Figura 3 apresenta um exemplo adicional de um perfil de lipoproteína de murganho Asebia. Estes perfis apresentaram uma diferença principal na distribuição de triglicéridos na fracção de VLDL dos murganhos SCD-/- e SCD-/+. Os níveis dos triglicéridos nos SCD-/+ foram de 25 mg/dL em VLDL, com níveis muito baixos nas fracções de LDL e HDL. Em contraste os SCD-/- tinham níveis muito baixos de triglicéridos nas três fracções de lipoproteína. 70

Análise de Ácidos Gordos

Também foram determinados os níveis de ácidos gordos monoinsaturados em vários tecidos. A tabela 1 apresenta a composição em ácidos gordos de vários tecidos em murganhos de tipo selvagem e murganhos SCD -/-. As quantidades relativas de palmitoleato (16:ln—7) no fígado e no plasma de murganhos SCD -/- diminuíram em 55% e 47% enquanto que os do oleato (18:ln-9) diminuíram em 35% e 32%, respectivamente. A quantidade relativa de palmitoleato no tecido branco adiposo e pele de murganhos SCD -/- foram diminuídos em mais do que 70%, enquanto que a redução de oleato nestes tecidos foi inferior a 20% embora a redução seja estatisticamente significativa. Estas alterações nos níveis de ácidos gordos monoinsaturados resultaram na redução de índices de insaturação indicando redução na actividade da dessaturase. Em contraste com estes tecidos, o cérebro, que expressa predominantemente a isoforma SCD2, possui uma composição semelhante em ácidos gordos e índice de insaturação inalterado em ambos os murganhos de tipo selvagem e SCD-/-. As requerentes concluíram que a SCD1 desempenha um papel principal na produção de ácidos gordos monoinsaturados no fígado. 71

Tabela 1

Composição em ácidos gordos de vários tecidos de murganhos de SCD1 desactivado

Foram extraídos os lípidos totais do tecido de cada murganho. Os lípidos foram metil esterifiçados e quantificados por GLC como descrito em Processos Experimentais. Os erros convencionais para todos os valores foram inferiores a 25% da média e foram omitidos da tabela para clareza. Os valores a negrito representam uma significância estatística de p<0,05 entre murganhos de tipo selvagem e SCD -/- (teste t de Student). Os valores de ácidos gordos monoinsaturados/saturados foram calculados a partir do valor médio. 14:0 16:0 16: ln-7 18:0 18: ln-9 18: ln-7 18: 2n-6 20:0 20: ln-9 20:1 ln-7 20: 4n-6 22: 6n-3 16: 1/16: 0 18: ln-9/18: 018: ln- 718: 020: ln-9/20: C20: ln- 7120: 0 Fígado +/+ 0,8 25,9 1,1 16,1 16,2 1,6 16,3 0,0 0,0 0,0 9,2 7,8 0,041 1,006 0,100 0,000 0,000 1,0 27,2 0,5 22,8 10,6 1,0 13,9 0,0 0,0 0,0 6,8 8,8 0,018 0,465 0,044 0,000 0,000 Pálpebra +/+ 1,3 15,0 2,4 9,3 19,6 3,4 5,2 5,2 24,1 9,6 0,9 0,8 0,160 2,108 0,366 4,635 1,846 1,9 22,4 1,5 20,3 16,1 3,7 6,8 7,5 3,7 7,4 1,7 1,5 0,067 0,793 0,182 0,493 0,987 WA1 +/+ 3,3 27,6 5,2 5,7 35,1 1,9 19,5 0,0 0,0 0,0 0,3 0,2 0,190 6,211 0,340 0,000 0,000 2,7 29,2 1,5 14,8 29,1 1,7 18,7 0,0 0,0 0,0 0,4 0,8 0,050 1,967 0,115 0,000 0,000 Pele +/+ 3,5 29,3 4,0 9,7 32,4 2,1 15,0 0,0 0,0 0,0 0,9 0,7 0,136 3,351 0,219 0,000 0,000 3,1 30,7 1,4 14,2 28,1 1,8 17,6 0,0 0,0 0,0 0,9 0,8 0,045 1,982 0,128 0,000 0,000 Cérebro 1,1 25,7 0,8 21,6 16,5 3,1 1,1 0,0 0,0 0,0 9,4 12,4 0,032 0,764 0,145 0,000 0,000 +/+ -/- 1,1 Globo ocular 26,2 0,8 21,1 15,8 3,3 1,2 0,0 0,0 0,0 9,5 13,1 0,030 0,752 0,154 0,000 0,000 +/+ -/- 2,9 31,3 1,6 28,5 19,1 2,6 0,0 0,0 0,0 0,0 2,9 7,2 0,051 0,671 0,091 0,000 0,000 3,2 32,3 1,5 29,8 18,8 2,4 0,0 0,0 0,0 0, 0 2,3 5,8 0,046 0,632 0,081 0,000 0,000 A Figura 4 (quantificado na Tabela 2) demonstra que a SCDl é um contribuinte principal para os índices de insaturação no plasma (proporção de plasma 18:1/18:0 ou 16:1/16:0 na fracção lipídica total), como avaliado pela análise de ácidos gordos no plasma de ambos os murganhos SCDl KO e asebia. Em ambos os modelos animais, observa-se uma redução de, aproximadamente, 50% ou superior nos índices de insaturação no plasma. Isto demonstra que o índice de insaturação no plasma está altamente dependente da função de SCDl

Tabela 2. índices de insaturação de ácidos gordos em mutantes asebia e heterozigóticos

Sexo/genótipo 18:1/18:0 16:1/16:0 Macho +/- 1,393 0,044 Macho -/- 0,732 0,018 Fêmea +/- 1,434 0,074 Fêmea -/- 0,642 0,021 Fêmea + /- 1,203 0,081 Fêmea -/- 0,574 0,022 PROCESSOS EXPERIMENTAIS para murganhos inactivados:

Criação dos murganhos SCDl inactivados. O ADN genómico de murganho para o vector de direccionamento foi clonado a partir da biblioteca genómica 129/SV. A construção do vector de direccionamento foi criada por inserção de um fragmento de 1,8-kb Xba I/Sac I com homologia 3' como um braço curto e um fragmento de 4,4-kb Cia 1/ Hind III com homologia 5' clonado adjacente à cassete de expressão neo. A construção também contém uma cassete de cinase de timidina HSV 3' em relação ao braço 1,8-kb de homologia, permitindo uma selecção 74 positiva/negativa. 0 vector de direccionamento foi linearizado

por Not I e electroporado para células estaminais embrionárias. Foi realizada selecção com geneticina e ganciclovior. Os clones resistentes a ambos geneticina e ganciclovior foram analisados por Southern blot após digestão com a enzima de restrição £coRI e hibridada com uma sonda de 0,4-kb localizada a jusante das sequências do vector. Para genotipagem por PCR, o ADN genómico foi amplificado com o iniciador A 5'-GGGTGAGCATGGTGCTCAGTCCCT-3' (SEQ ID N°: 2)

que está localizado no exão 6, iniciador B 5'-ATAGCAGGCATGCTGGGGAT-3' (SEQ ID N°: 3)

que está localizado no gene neo (produto de 425 pb, alelo alvo) e iniciador C 5'-CACACCATATCTGTCCCCGACAAATGTC-3' (SEQ ID N°: 4) que está localizado a jusante do gene alvo (produto de 600 pb, alelo selvagem). As condições de PCR foram 35 ciclos, cada um de 45 seg a 94 °C, 30 seg a 62 °C e 1 min a 72 °C. As células alvo foram microinjectadas para blastocistos C57BI/6, e os murganhos quiméricos foram cruzados com fêmeas Taconia C57BL/6 ou 129/SvEv e produziram uma transmissão de linha germinal. Os murganhos foram mantidos num ciclo de luz/escuro de 12-h e foram alimentados com dieta de ração, uma dieta semi-purificada ou uma dieta contendo 50% (% de ácidos gordos totais) trioleina, tripalmitoleina ou trieicosenoina. A dieta semi-purificada foi adquirida a Harlan Teklad (Madison, WI) e continha: 20% caseína sem vitamina, 5% óleo de soja, 0,3% L-cistina, 13,2% 75

Maltodextrina, 51,7% sacarose, 5% celulose, 3,5% mistura mineral (AIN-93G-MX), 1,0% mistura de vitaminas (AIN-93-VX), 0,3% bitartarato de colina. A composição em ácidos gordos das dietas experimentais foi determinada através de cromatografia gás liquido. A dieta de controlo continha 11% ácido palmitico (16:0), 23% ácido oleico (18:ln-9), 53% ácido linoleico (18:2n— 6) e 8% ácido linolénico (18:3n-3). A dieta elevada em trioleina continha 7% 16:0, 50% 18:1 n-9, 35% 18:2n-6 e 5% 18:3n-3.

Materiais O [-32P]dCTP radioactivo (3000 Ci/mmol) foi obtido da Dupont Corp. (Wilmington, DE). As placas de cromatografia em camada fina (TLC Sílica Gel G60) foram da Merck (Darmstadt, Alemanha). A [1-14C]-estearoil-CoA foi adquirida à American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St Louis, MO). As membranas de transferência Immobilon-P foram da Millipore (Danvers, MA) . O kit de detecção de transferência de Western ECL foi da Amersham-Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ). Todos os outros reagentes químicos foram adquiridos à Sigma (St Louis, MO).

Análise de Lipidos

Os lipidos totais foram extraídos do fígado e do plasma de acordo com o método de Bligh e Dyer (Bligh e Dyer e os fosfolípidos, ésteres de cera, colesterol livre, triglicéridos e ésteres de colesterol foram separados por TLC em gel de sílica de elevado desempenho. Foi utilizado hexano de petróleo/éter dietílico/ácido acético (80:30:1) ou benzeno/hexano (65:35) como solvente de divulgação (Nicolaides e Santos, 1985) . As manchas 76 foram visualizadas por 0,2% 2 ',7'-diclorofluoreceina em etanol a 95% ou por 10% de sulfato cúprico em ácido fosfórico a 8%. As manchas de triéster de cera, éster de colesterol e triglicérido foram raspadas, foi adicionado 1 mL de HCl-metanol a 5% e aquecido a 100 °C durante 1 h (Miyazaki et al., 2000) . Os ésteres de metilo foram analisados por cromatografia gás-liquido utilizando heptadecanoato de colesterol, tri-heptadecanoato e ácido heptadecanoico como padrão interno O colesterol livre, éster de colesterol e teores de triglicéridos da pálpebra e do plasma foram determinados por ensaios enzimáticos (Sigma St Louis, MO e Wako Chemicals, Japão).

Isolamento e Análise de ARN O ARN total foi isolado a partir de fígados utilizando o método de extracção de guanidinio ácido-fenol-clorofórmio (Bernlohr et al., 1985). Foram separados 20 microgramas de ARN total por electroforese em gel de agarose a 1%/formaldeído a 2,2 M e transferidos para uma membrana de nylon. A membrana foi hibridada com sondas de SCDl e SCD2 marcadas com 32P. A sonda pAL15 foi utilizada como controlo para uma carga igual (Miyazaki, M., Kim, Y. C., Gray-Keller, Μ. P., Attie, A. D., e

Ntambi, J. M. (2000) . The biosynthesis of hepatic cholesterol esters and triglycerides is impaired in mice with a disruption of the gene for stearoyl-CoA desaturase 1. J Biol Chem 275, 30132-8) . 77

Ensaio de actividade de SCO A actividade de estearoil-CoA dessaturase foi medida em microssomas do fígado, essencialmente como descrito por Shimomura et al. (Shimomura, I., Shimano, H., Korn, B. S., Bashmakov, Y., e Horton, j. D. (1998). Nuclear sterol regulatory element-binding proteins activate genes responsible for the entire program of unsaturated fatty acid biosynthesis in transgenic mouse liver. J Biol Chem 273, 35299-306.). Os tecidos foram homogeneizados em 10 vol. de tampão A (tampão potássio a 0,1 M, pH 7,4). As fracções de membrana microssomal (sedimento a 100000 X g) foram isoladas por centrifugação sequencial. As reacções foram realizadas a 37 °C durante 5 min com 100 pg de homogenato de proteína e 60 μΜ de [ 1—14C] -estearoil-CoA (60000 dpm), NADH a 2 mM de, 0,1 M de tampão Tris/HCl (pH 7,2). Após a reacção, os ácidos gordos foram extraídos e depois metilados com cloreto acético a 10%/metanol. Os ésteres metílicos de ácido gordo saturado e ácido gordo monoinsaturado foram separados por TLC impregnada com AgN03 a 10% utilizando hexano/éter dietílico (9:1) como solução de divulgação. As placas foram aspergidas com 0,2% de 2',7'-diclorofluoresceína em etanol a 95% e os lípidos foram identificados sob luz UV. As fracções foram raspadas da placa e a radioactividade foi medida utilizando um contador de cintilação líquido. A actividade enzimática foi expressa com nmole min-1 mg-1 de proteína.

Imunotransferência

As membranas de fígado reunidas de 3 murganhos de cada grupo foram preparadas como descrito por Heinemann et al. (Heinemann e

Ozols, 1998) . A mesma quantidade de proteína (25 pg) de cada 78 fracção foi sujeita a electroforese em gel de poliacrilamida a 10% na presença de SDS e transferida para membranas de transferência Immobilon-P a 4 °C. Após bloqueamento com leite magro a 10% em tampão TBS (pH 8,0) mais Tween a 4 °C durante a noite, a membrana foi lavada e incubada com anticorpo anti-SCD de rato, de coelho como anticorpo primário e conjugado de anti-IgG de coelho, de cabra-HRP como o anticorpo secundário. A visualização da proteína SCD foi realizada com o kit ECL de detecção de transferência de Western.

Histologia

Os tecidos foram fixados com formalina tamponada neutra, embebida em parafina, seccionada e corada com hematoxilina e eosina.

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da afiliada de Wisconsin da American Heart Association e em parte pela bolsa N° DAMD17-99-9451 de DOD.

Processos Experimentais para Murganhos Asebia:

Animais e Dietas - Os murganhos homozigóticos Asebia (ab J /ab J ou -/-) e heterozigóticos (+/ab J ou +/-) foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos na University of Wisconsin Animal Care Facility. Neste estudo, as comparações são feitas entre os murganhos homozigóticos (-/-) e os heterozigóticos ( + /-) uma vez que os últimos não se distinguem dos murganhos normais. Os murganhos foram mantidos numa instalação com barreira, livre de agentes patogénicos, operando 79 num ciclo de luz de 12-h luz/12-h escuridão. Às 3 semanas de idade, estes murganhos foram alimentados ad libitum durante 2 semanas ou 2 meses, em dieta de ração de laboratório ou numa dieta semipurifiçada contendo 50% (% de ácidos gordos totais) trioleina ou tripalmitoleina. A dieta semi-purificada foi adquirida a Harlan Teklad (Madison, WI) e continha: 18% de caseína sem vitamina, 5% óleo de soja, 33,55% amido de milho, 33,55% sacarose, 5% celulose, 0,3% L-metionina, 0,1% cloreto de colina, mistura de sais (AIN-76A) e mistura de vitaminas (AIN-76A). A composição em ácidos gordos das dietas experimentais foi determinada por cromatografia gás líquido. A dieta de controlo continha 11% de ácido palmítico (16:0), 23% de ácido oleico (18:ln-9), 53% de ácido linoleico (18:2n-6) e 8% de ácido linoleico (18:3n-3). A dieta elevada em trioleina continha 7% de 16:0, 50% 18:ln-9, 35% 18:2n-6 e 5% 18:3n-3. A dieta rica em tripalmitoleina continha 6% de 16:0, 49% de ácido palmitoleico (16:ln-7), 12% de 18:ln-9, 27% de 18:2n-6 e 4% de 18:3n-3.

Os animais foram anestesiados cerca das 10:00 a.m. através de injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (0,08 mg/g de peso corporal) Nembutal, Abbot, North Chicago, IL) . O fígado foi isolado imediatamente, pesado e mantido em azoto líquido. As amostras de sangue foram obtidas através da veia abdominal.

Materiais - [a-32P]dCTP radioactivo (3000 Ci/mmol) foi obtido de Dupont Corp. (Wilmington, DE) . As placas de cromatografia em camada fina (TLC Silica Gel G60) foram da Merck (Darmstadt, Alemanha). [1—14C ]-estearoil-CoA, [3H] colesterol e [1—14C]oleoil-CoA foram adquiridos de American Radiolabeled

Chemicals, Inc. (St Louis, MO) . As membranas de transferência 80

Immobilon-P foram de Millipore (Danvers, MA) . 0 kit de detecção ECL Transferência de Western foi da Amersham- Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ) . 0 reagente de transfecção LT-1 foi de

PanVera (Madison, WI) . Todos os outros reagentes químicos foram adquiridos à Sigma (St Louis, MO) . 0 anticorpo para SCD de microssoma de fígado de rato foi fornecido pelo Dr. Juris Ozols do University of Connecticut Health Center. 0 vector de expressão de SCDl pcDNA3-l foi fornecido pelo Dr. Trabis Knight da Iowa State university.

Análise de Lípidos - Os lipidos totais foram extraídos do fígado e do plasma de acordo com o método de Bligh e Dyer (Bligh, e. g., e Dyer, W.J. (1959) Can J Biochem Physiol 37, 911-917.), e os fosfolípidos, colesterol livre, triglicéridos e ésteres de colesterol foram separados por TLC em gel de sílica. Foi utilizado éter de petróleo/éter dietílico/ácido acético (80:30:1) como um solvente de divulgação. As manchas foram visualizadas por 0,2% 2', 7'-diclorofluoreceina em etanol a 95% ou por sulfato cúprico a 10% em ácido fosfórico a 8%. As manchas de fosfolípido, éster de colesterol e triglicérido foram raspadas, 1 mL de HCl-metanol a 5% adicionadas e aquecidas a 100 °C durante 1 h. Os ésteres de metilo foram analisados por cromatografia gás-líquido utilizando heptadecanoato de colesterol como padrão interno (Lee, K. N., Pariza, M. W. e Ntambi, J. M. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 817-821; Miyazaki, M., Huang, Μ. Z., Takemura, N., Watanabe, e Okuyama, H. (1998) Lipids 33, 655-61). Os conteúdos colesterol, éster de colesterol e triglicéridos no fígado plasma foram determinados através de ensaios enzimáticos (Sigma St Louis, MO e Wako Chemicals, Japão). 81

Análise de Llpoproteína no Plasma - Os murganhos estiveram em jejum durante um mínimo de 4 horas e sacrificados por asfixia com C02 e/ou deslocamento da cervical. 0 sangue foi recolhido assepticamente por punção cardíaca directa e centrifugado (13000 X g, 5 min, 4 °C) para recolher o plasma. As lipoproteínas foram fraccionadas numa coluna de Superose 6hr 10/30 FPLC (Pharmacia). As amostras de plasma foram diluídas 1:1 com PBS, filtradas (filtro de seringa Cameo 3AS, 0,22 pm) e injectadas na coluna que tinha sido equilibrada com PBS contendo edta a 1 mM e NaN3 a 0,02% O equivalente a 100 pL de plasma foi injectado na coluna. A taxa de fluxo foi mantida constante a 0,3 mL/min. Foram recolhidas fracções de 500 pL e utilizadas para medições de triglicérido total (Sigma). Os valores relatados são para uma massa de triglicéridos total por fracção. As identidades das lipoproteínas foram confirmadas utilizando imunorreactividade anti-ApoB para LDL e imunorreactividade Anti-Apo Al para HDL (não apresentado).

Exemplo 2

Demonstração de correlação significativa entre a proporção de 18:1/18:0 FFA e os níveis de TG/HDL em humanos

Este exemplo demonstra, pela primeira vez, que a actividade de delta-9 dessaturase em humanos está directamente correlacionada com os níveis de triglicérido (VLDL) no soro e inversamente com o nível de HDL no soro e colesterol total no soro. 82

Design Experimental: 0 plasma de um total de 97 indivíduos foi analisado para o conteúdo em ácidos gordos por cromatografia gasosa (GC). 0 conteúdo em ácidos gordos totais livres (FFA) foi medido e as proporções de oleato para estearato (18:1/18:0) e palmitoleato para palmitato (16:1/16:0) foram computorizadas, definidas como os índices de insaturação, como acima. Pensou-se encontrar uma relação entre estas proporções e três indicadores clínicos; níveis de TG no plasma (triglicérido), níveis de HDL (lipoproteína de elevada densidade) no plasma e colesterol total no plasma.

Amostra de Doente: A amostra de doente foi escolhida para maximizar a diversidade fenotípica em termos de HDL. No grupo das requerentes, 21 indivíduos apresentaram um fenótipo de elevado HDL (>percentil 90 para idade e sexo), 12 indivíduos apresentaram um fenótipo de baixo HDL de etiologia desconhecida (<percentil 5 para idade e sexo), enquanto que seis apresentaram um fenótipo de baixo HDL devido às mutações no gene ABCAl. 33 indivíduos caem dentro dos parâmetros normais de HDL (<percentil 90 e >percentil 5 para idade e sexo).

As requerentes também tentaram diversificar a amostra em termos dos níveis de TG, incluindo 9 indivíduos com Hiperlipidemia Familiar Combinada (FCHL) que têm TG e/ou colesterol elevado, assim como 16 indivíduos de controlo adicionais com níveis de TG normais. 83

Em alguns casos, foram testados múltiplos indivíduos da mesma família. Cinco dos seis indivíduos com uma mutação ABCAl são parte da mesma família (NL-020) . Foram também testados múltiplos indivíduos de outros pedigrees que segregam um fenótipo de baixo HDL que não está geneticamente ligado a ABCAl. Nesta categoria, dois indivíduos afectados foram testados a partir de NL-008, enquanto quatro indivíduos afectados foram testados a partir de NL-001. Os restantes seis indivíduos com um fenótipo de baixo HDL não estão relacionados uns com os outros, e foram escolhidos a partir de pedigrees distintos. Dos indivíduos com HDL elevado, sete deles não eram relacionados uns com os outros. Ainda não é claro se o HDL elevado observado nestes indivíduos possui uma base genética clara no membros da família. Os restantes 14 indivíduos com um fenótipo de HDL elevado, seis deles são da família HA-1 e oito são de uma família distinta, HA-3. Também foram testados indivíduos não afectados relacionados com ambos HDL baixo e elevado.

Este grupo apresentou uma variação muito lata nos níveis de TG e HDL. Em geral, os indivíduos com baixo HDL possuem níveis de TG elevados e aqueles com níveis de TG elevados tendem a possuir níveis de HDL baixos. Esta relação entre TG e HDL foi previamente observada na literatura (Davis et al., 1980). A análise de ésteres de ácido gordo foi determinada como se segue. As células das amostras de doente foram lavadas duas vezes com solução salina fria tamponada com fosfato e os lípidos celulares totais foram extraídos três vezes com CHCl3/MeOH (2:1 v/v). As três extracções lipídicas foram combinadas num tubo de vidro com rolha de rosca, seco sob gás N2 a 40 °C num bloco aquecido e ressuspenso em tolueno Os ésteres metílicos de ácido gordo foram produzidos a partir de BCl3/MeOH (Alltech, 84

Deerfield IL), extraídos com hexano, secos, e ressuspensos em hexano Os ésteres de ácido gordo foram identificados utilizando um cromatógrafo gasoso Hewlett-Packard 6890 equipado com um autoinjector 7683 e uma coluna HP-5 (30 m ' 0,25 mm, espessura de filme de 0,25 pm) ligado a um detector de ionização de chama ajustado a 275 °C. O injector foi mantido a 250 °C. A temperatura da coluna foi mantida a 180 °C durante 2 min após injecção, aumentou para 200 °C a 8 °C/min, mantida a 200 °C durante 15 min, e depois aumentou para 250 °C a 8 °C/min. Nestas condições, as ?9?16:1?, 16:0?, ?9?18:1— e 18:0-ésteres de metilo eluíram a 9,2 min, 9,7 min, 15,3 min, e 16,4 min, respectivamente. Ver Lee et al. (1998). Biochem. Biophys. Res. Commun. 248: 817-821; Miyazaki et al. (1998) Lipids 33:655-661; e Miyazaki M, Kim YC, Gray-Keller MP, Attie AD, Ntambi JM. 2000. J Biol Chem.275(39):30132-8.

Resultados A análise de regressão linear foi realizada utilizando o conjunto inteiro de dados humanos. A proporção de 18:1/18:0 apresentou uma relação significativa com os níveis de TG (r2=0,39, p<0,0001) (Figura 5a), assim como correlações significativas com os níveis de HDL (r2=0,12, p=0,0006) (Figura 5b). A proporção de ácidos gordos no plasma de 16:1/16:0 foi medida de um modo semelhante, embora os resultados não tenham sido impressionantes. Observou-se uma relação fraca entre o nível relativo de 16:1/16:0 para os níveis de TG no plasma (r2=0,05, p=0,03) (Figura 6), enquanto que a relação entre a proporção 16:1/16:0 e os níveis de HDL não alcançaram 85 significância relativa (não apresentado). Em contraste com a proporção 18:1/18:0, a proporção 16:1/16:0 não explica a porção da variância nos níveis de colesterol total (r2=0,06, p=0,02)(não apresentado).

Globalmente, a proporção 18:1/18:0 foi responsável por 18% da variância no conteúdo em ácidos gordos totais no plasma (p=0,005) enquanto que a proporção de 16:1/16:0 foi responsável por 8% da variação neste valor (p=0,02), quando os indivíduos com FCHL e os seus controlos associados foram excluídos da análise (não apresentado na Figura).

Finalmente, para a porção da presente amostra para as quais os valores do índice de Massa Corporal (BMI) estavam disponíveis, as requerentes mediram uma correlação positiva entre proporções de 18:1/18:0 e BMI (r2=0,13, p=0,00) (resultados não apresentados). A amostra foi estratificada com base nos níveis de HDL para determinar se a relação entre a actividade de SCD (como medido pela proporção 18:1/18:0) e os níveis de TG foram independentes da causa primária da dislipidemia observada.

Foi observada uma correlação positiva entre 18:1/18:0 e TG em pessoas com HDL elevado. A análise dos indivíduos com um fenótipo de HDL elevado (>percentil 90) demonstrou uma relação significativa entre a proporção 18:1/18:0 e níveis TG (r2=0,40, p<0,005) (Figura 7). As relações entre a proporção 18:1/18:0 e os níveis de HDL neste grupo não atingiram significância (resultados não apresentados). A proporção 16:1/16:0 não foi responsável por uma proporção 86 significativa da variância nos niveis de colesterol total, TG ou HDL neste subconjunto do grupo.

De modo a determinar se uma relação mais forte entre o indice de 18:1/18:0 e os níveis de TG seria aparente num fundo geneticamente homogéneo, foram analisadas as famílias ha-1 e HÁ-3 separadamente. Os membros de ambas as famílias afectadas e não afectadas foram incluídos na análise. Em ambas as famílias, foi observada uma relação semelhante entre 18:1/18:0 e os níveis de TG (HA-1: r2=0,36, p=0,005 (Figura 8a), HA-3: r2=0,32, p=0,009 (não apresentado na figura)). A força destas relações foi semelhante à observada no grupo inteiro. As proporções 18:1/18:0 também estavam correlacionadas com os níveis de HDL em HA-1, embora esta relação não tenha alcançado significância em HA-3 (HA-1: r2=0,32, p=0,009 (Figura 8b), HA-3: r2=0,10, p=0,22 (não apresentado)).

Foi também observada uma correlação positiva entre 18:1/18:0 e TG naqueles com HDL baixa. Quando todos os indivíduos com HDL baixo (<percentil 5) foram analisados como um grupo, foi observada uma relação significativa entre a proporção 18:1/18: e os níveis de TG (r2=0,49, p=0,0009) (Figura 9). Como observado na análise das requerentes do subconjunto de doentes de HDL elevado, a relação entre a proporção 18:1/18:0 e HDL não encontraram significância no grupo de HDL baixo (resultados não apresentados). Adicionalmente, não se observou nenhum resultado significativo quando a proporção de 16:1/16:0 foi regredida com os valores de HDL, TG e colesterol total. A análise da família NL-001, que segregou um fenótipo de baixo HDL de etiologia genética desconhecida e a família NL-0020, que segregou uma mutação ABCAl, tendeu para a relação 87 apresentada acima entre proporções de ácidos gordos e parâmetros lipidicos quando foram considerados indivíduos afectados em cada família. Contudo, estes resultados não atingiram significância estatística devido ao pequeno número de indivíduos analisados em cada caso (NL-001: Figura 10 a, b e NL0020: Figura 11a, b) . Foi observada uma tendência geral em direcção a proporções superiores 18:1/18:0 em doentes Tangiers. Este pode ser um efeito independente da doença, embora não tenha sido observado um efeito dependente da idade na proporção 18:1/18:0 em qualquer uma das famílias HA-1 e HA-3 nem no grupo inteiro (não apresentado na Figura 11). A Figura 12 apresenta a relação entre a proporção 18:1/18:0 e os níveis de TG (r2=0,56, p=0,03) (Figura 12a), níveis de HDL (r2=0,64, p=0,009) (Figura 12b) e níveis de colesterol total (r2=0,50, p=0,03) em pessoas com Hiperlipidemia Familiar Combinada (FCHL) (Figura 12c). A presente análise é a primeira demonstração em humanos que a função de SCD, como medida pelos índices de insaturação 16:1/16:0 e 18: 1/18:0, está correlacionada positivamente com os níveis de TG no plasma e inversamente com HDL no plasma. Facto importante, observou-se esta correlação independentemente da causa subjacente de hiper- ou hipo-trigliceridomia, sugerindo que a relação entre a actividade de SCD e os níveis de TG é um efeito generalizado. Por isso, a inibição da actividade de SCD em humanos está ligada aos níveis de TG (ou VLDL) diminuídos no soro, aumentou os níveis de colesterol total, aumentou os níveis de HDL e diminuiu o índice de massa corporal (BMI), independentemente da causa principal da elevação de TG. Facto importante, os inibidores de SCDl podem ser utilizados como uma terapia de combinação em doentes que também estão a ser tratados para FCHL.

Em resumo, quando analisados em conjunto, os Exemplos 1 e 2 estabelecem pela primeira vez uma correlação positiva entre a actividade de SCDl e os níveis de TG em mamíferos, assim como uma correlação inversa entre a actividade de SCDl e HDL em humanos. A análise das requerentes de asebia e SCDl KO são definitivas na sua implicação de SCDl como sendo o contribuinte principal para o índice de insaturação. As requerentes utilizarem este índice como um substituto para a actividade de SCDl nos estudos dos autores em humanos. Assim, é provável que os inibidores da função de SCDl em mamíferos, incluindo humanos, baixem ambos TG e subam hdl.

Exemplo 3

Análise de Ácidos Gordos no Plasma num modelo animal de dislipidemia

De modo a confirmar a relação acima descrita observada em humanos entre o índice de insaturação 18:1/18:0 e os níveis de TG. As requerentes também realizaram análise de ácidos gordos no plasma num modelo de murganho da doença FCHL humana. Na estirpe hiperlipidémica de murganhos ("hyplip") os níveis de TG são elevados em comparação com o tipo selvagem. O murganho hiperlipidémico HcB-19 apresentou um índice de insaturação elevado 18:1/18:0. Este modelo de murganho de hiperlipidemia familiar combinada (HcB-19) apresenta níveis elevados de TG, colesterol, assim como secreção aumentada de 89 VLDL e apoB (Castellani et al., Mapping a gene for combined hyperlipidaemia in a mutant mouse strain. Nat Genet; 18(4):374-7 (1998) . A análise de ácidos gordos no plasma demonstrou que estes animais possuem uma proporção significativamente elevada 18:1/18:0 quando comparada com controlos não afectados da estirpe parental (Figura 13) . Os animais HcB-19, todavia, não apresentaram um aumento significativo do índice 16:1/16:0 quando comparados com os controlos. Por isso, observou-se uma correlação positiva entre o índice de insaturação 18:1/18:0 e os niveis de TG neste modelo animal de FCHL.

Exemplo 4

Reguladores da transcrição de SCDl e sua utilização como alvo de rastreio de fármacos.

Este exemplo reporta, pela primeira vez, a sequência genómica completa do promotor da SCDl humana. Este promotor é aqui utilizado para identificar elementos de regulação que modulam e controlam a expressão de SCDl em humanos e identifica proteínas reguladoras que são alvos adequados para a intervenção de pequenas moléculas para modular a expressão de SCDl em humanos. A sequência do promotor da SCDl humana é apresentada na SEQ ID N° 1. Esta sequência não foi anotada com precisão no Genbank e foi reportada como 5'UTR em vários registos. 90 A Figura 14 ilustra a localização de sequências reguladoras e sítios de ligação na região homóloga da SCDl de murganho e promotor de SCDl humana e regiões de flanco 5'. A escala no topo denota a posição relativa do sítio de início de transcrição. São indicados elementos importantes da sequência do promotor. A estrutura do promotor de SCDl humana é semelhante à isoforma de SCDl de murganho e contém sequências reguladoras conservadas para a ligação de vários factores de transcrição, incluindo a proteína de ligação do elemento regulador esterol (SREBP), proteína-alfa de ligação ao estimulador CCAAT (C/EBPa) e factor-lnuclear (NF-1) que demonstrou transactivar a transcrição do gene de SCD de murganho. 0 colesterol e os ácidos gordos polinsaturados (PUFA) diminuíram a actividade do promotor de SCD de luciferase quando transientemente transfectados em células HepG2. A diminuição na actividade do promotor na construção repórter correlacionou com decréscimos no ARNm de SCD endógeno e níveis de proteína. A co-transfecção trasiente em células HepG2 da construção do promotor de SCD humano-gene da luciferase, em conjunto com um vector de expressão para SREBP, revelou que SREBP trans-activa o promotor de SCD humana. Estes estudos indicam que como o gene de SCDl de murganho, o gene de SCD humana é regulado por ácidos gordos polinsaturados e colesterol ao nível da transcrição do gene e que SREBP desempenha um papel na activação da transcrição deste gene.

Construção do plasmideo quimérico do promotor de luciferase

Uma biblioteca genómica de placenta humana em bactéria-fago I EMBL3 foi pesquisada com uma inserção de 2,0 kb em Pstl de ADNc de pC3 de murganho (Ntambi, J. M., Buhrow, S. A., Kaestner, 91 Κ. Η., Christy, R. J., Sibley, E., Kelly, T. J. Jr. e M. D. Lane. 1988. Differentiation-induced gene expression in 3T3-L1 preadipocytes: Characterization of a differentially expressed gene encoding estearoyl-CoA desaturase. J. Biol. Chem. 263: 17291-17300.) como uma sonda radioactiva e foram isoladas sete placas. Duas destas placas foram purificadas até a homogeneidade, o ADN foi isolado e designado HSCDl e HSCD3. Um iniciador de ADN baseado na sequência correspondente ao primeiro exão do ADNc do gene publicado da estearoil-CoA dessaturase humana (Zhang, L., G. E. Lan, S. Parimoo, K. Stenn e S. M. Proutey. 1999. Human stearoyl-CoA desaturase: alternative transcripts generated from a single gene by usage of tandem polyadenylation sites. Biochem. J. 340: 255-264) foi sintetizado e utilizado para sequenciar os dois clones fágicos pelo método de terminação de cadeia com didesoxinucleótidos. Foi produzida uma sequência preliminar e os iniciadores a montante 5' NNNNGGTACCTTNNGAAAAGAACAGCGCCC 3' SEQ ID N° 5 e a jusante: 5' NNNNAGATCTGTGCGTGGAGGTCCCCG 3' SEQ ID N° 6 foram concebidos para amplificar aproximadamente 540 bases da região do promotor a montante do sitio de inicio de transcrição: estes iniciadores contêm sitios de enzimas de restrição inseridos (sublinhados), Kpnl para o a montante, e Bgllll a jusante, com uma região de extensão de 4 bases para permitir a digestão com a enzima de restrição. A PCR foi então efectuada nos clones de fago e o fragmento amplificado de 500 pb foi isolado a partir de um gel de agarose a 1% agarose. O fragmento amplificado foi digerido com Kpnl e BglII e depois clonado nos sitios Kpnl e BglII do vector básico pGL3 92 (Promega) que contém o gene repórter luciferase e transformado em células E. coli DH5 competentes. 0 ADN plasmídico foi purificado em colunas Qiagen e sequenciado pelo método de terminação de cadeia com didesoxinucleótido utilizando iniciadores correspondentes às sequências de ADN no sitio múltiplo de clonagem mas flanqueantes do ADN inserido. A construção do gene de luciferase com o promotor de SCD que foi produzida foi designada como pSCD-500. isolamento e Análise de ARN- 0 ARN total foi isolado a partir de células HepG2 utilizando o método de extracção com guanidinio ácido-fenol-clorofórmio. Vinte microgramas de ARN total foram separados através de electroforese em gel a 0,8% de agarose/2,2 M de formaldeido e transferidos para membrana de nylon. A membrana foi hibridada com a sonda de ADNc de SCD humana marcada com 32P produzida por PCR como se segue: a sonda pALl5 foi utilizada como controlo para equalização da carga.

Imunotransferência - Os extractos celulares foram preparados a partir de células HepG2 que tinham sido tratadas com os vários ácidos gordos ou colesterol como descrito por Heinemann et al (17). A mesma quantidade de proteína (60 pg) de cada fracção foi sujeita a electroforese em gel de 10% SDS-poliacrilamida e transferida para membranas de transferência Immobilon-P a 4 °C. Após bloqueamento com 10% de leite magro em tampão TBS (pH 8,0) mais 0,5% de Tween a 4 °C durante a noite, a membrana foi lavada e incubada com anti-SCD de rato de coelho como anticorpo primário (17) e conjugado de anti-IgG de coelho de cabra-HRP como o anticorpo secundário. A visualização da proteína SCD foi efectuada com o kit ECL de detecção de transferência de western. 93

Efeito de colesterol, ácidos gordos polinsaturados e ácido araquidónico na expressão de hSCDl

Cultura de células e transfecções de ADN - células HepG2, foram cultivadas em DMEM com Baixa Glucose suplementada com 10% de Soro Fetal de Bovino e solução de 1% de

Penicilina/Estreptomicina e mantida a 37 °C, 5% de CO2 numa incubadora humidificada. As células foram passadas em placas de 6 cm para produzir 40-70% de confluência em cerca de 12-16 horas. As células foram então transfectadas com 5 pg de ADN plasmídico por placa de pSCD-500 ou o repórter Básico PGL3 assim como o controlo interno pRL-TK (Promega), utilizando o agente de transfecção LT-1 (Pan Vera). Após 48 horas, células foram lavadas com pbs e depois tratadas em Meio E de Williams, um meio isento de ácidos gordos, contendo insulina, dexametasona, e concentrações apropriadas de ácidos gordos conjugados com albumina como indicado em figuras e legendas. As células foram também tratadas com etanol isolado (como controlo) ou colesterol (10 pg/mL) e 25-OH colesterol (1 pg/mL) dissolvido em etanol. Após mais 24h, os extractos foram preparados e ensaiados quanto a actividade de luciferase. As células não transfectadas foram utilizadas como o branco e a Luciferase Renilla foi utilizada como um controlo interno Os extractos celulares foram ensaiados quanto a proteína de acordo com Lowry e todos os resultados foram normalizados para a concentração de proteína, assim como para as contagens de luciferase renilla. Cada experiência foi repetida, pelo menos, três vezes, e todos os dados são expressos como médias + SEM. 94 RESULTADOS: A sequência da região do promotor amplificada do gene SCDl é apresentada na SEQ ID. N° 1.

Quando se comparou com a sequência do promotor de SCDl de murganho, verificou-se que várias sequências funcionais de regulação identificadas no promotor de SCDl de murganho são absolutamente conservadas ao nivel dos nucleótidos e também com respeito ao seu espaçamento nos promotores proximais dos dois genes (Fig 14) . A homologia TTAATA, a C/EBPa e NF-1 tem a mesma localização tanto nos promotores de SCDl de murganho como no humano Mais a montante o elemento regulador esterol (SRE) e os dois motivos CCAAT de caixa são encontrados no elemento responsivo de ácidos gordos polinsaturados (PUFA-RE) dos promotores de SCDl e SCD2 de murganho. 0 espaçamento destes elementos é conservado nos três promotores.

Testou-se se a expressão do gene de SCD humana foi também reprimida pelo colesterol e ácidos gordos polinsaturados. As células humanas HepG2 foram cultivadas e depois tratadas com 100 μΜ de ácido araquidónico, DHA ou 10 pg/mL colesterol e 1 pg/mL, de 25-hidroxicolesterol colesterol como descrito anteriormente. O ARNm total foi isolado e sujeito a análise de transferência de northern utilizando uma sonda correspondente ao ADNc humano e produzido pelo método de PCR utilizando iniciadores com base na sequência publicada de ADNc da SCD humana. A Figura 15 mostra que AA, DHA e colesterol diminuíram a expressão do ARNm da SCD humana numa forma dependente da dose. A transferência de western dos extractos de proteína das células tratadas com PUFA e colesterol mostra que PUFA e o colesterol 95 diminuíram também os níveis da proteína SCD (dados não apresentados).

Para verificar o possível efeito da ligação de SREBP na actividade do promotor de SCD humano a construção de promotor humano da luciferase foi co-transfectada em células HepG2 em conjunto com um vector de expressão contendo SREBPla. Após 72 h, extractos das células transfectadas foram ensaiados para a actividade de luciferase. Os dados foram normalizados para o extracto das células que expressam a luciferase Renilla como um controlo interno Como apresentado na figura, SREBP transactiva o promotor numa forma dependente da dose dando origem a um aumento até 40-vezes. Esta experiência mostra que SREBP desempenha um papel na regulação do gene de SCD humano

Relatórios publicados indicam que a forma madura de SREBP, em adição à activação dos genes lipogénicos, também medeia a repressão dos genes lipogénicos por PUFA e colesterol, incluinda SCDl de murganho. Para observar os efeitos reguladores de SREBP-la e PUFA maduros na actividade dos promotores de SCD, células hepáticas HepG2 foram transientemente co-transfectadas com 20 ng (por placa de 6-cm) de AND plasmídico contendo o promotor de SCD humano como descrito acima mas, nesta altura, as transfecções foram realizadas na presença de colesterol para inibir a maturação da SREBP endógena e assegurar, deste modo, que existia pouca forma madura da SREBP endógena presente nas células. Após transfecção, as células foram então tratadas com, ácido araquidónico, EPA e DHA como complexos de albumina e actividade de luciferase foi então testada utilizando um luminómetro. Se a SREBP medeia a repressão de PUFA do gene da SCD humana, a actividade do promotor de SCD não diminuiria após tratamento das células transfectadas com PUFA. Contudo, a adição 96 de AA, EPA ou D HA continuou a reprimir a actividade do promotor de SCD apenas com uma suave atenuação (dados não apresentados). Deste modo, a maturação de SREBP não parece exibir a selectividade necessária para explicar o controlo de PUFA sobre a transcrição do gene de SCD sugerindo que PUFA pode utilizar uma diferente proteína em adição à SREBP para reprimir a transcrição do gene de SCD humana.

Estes resultados estabelecem que hSCDl é transcricionalmente regulada por SREBP, nf-y, C/EBPalpha, PUFA-RE e proteínas e reguladores de transcrição alternados. Cada uma destas proteínas é, deste modo, um atractivo alvo de rastreio de fármaco para identificar compostos que modulam a expressão de SCDl numa célula; sendo, deste modo, útil para tratar as doenças, distúrbios e estados humanos que são apresentadas pela presente invenção. EXEMPLO 5 A SCDl Inactivada Apresenta Anomalias Cutâneas e Oculares.

Para investigar as funções fisiológicas de SCD, produziram-se murganhos com SCDl inactivada (SCDl -/-). Verificou-se que os níveis de C16:1 foram dramaticamente diminuídos nos tecidos de murganhos SCDl -/- enquanto foi notada uma dramática diminuição em C18:l apenas no fígado, onde é normalmente expressa a SCDl isolada e não a SCD2. Em tecidos tais como a pálpebra, adipose e pele em que ambas as SCDl e SCD2 são expressas, 18:1 foi apenas levemente diminuídas. Os níveis de ácidos gordos monoinsaturados do cérebro e globo ocular, que não expressam SCDl, não foram alterados. 0 fígado e pele dos murganhos SCD -/- foram 97 deficientes em ésteres de colesterol e triglicéridos, enquanto adicionalmente a pálpebra foi deficiente em ésteres de cera de ácidos gordos monoinsaturados de cadeia longa, principalmente C20:l específicos da pálpebra. Adicionalmente, a pálpebra dos murganhos SCD -/- possuía niveis elevados de colesterol livre. Os murganhos SCD -/- exibiram anomalias cutâneas com glândula sebácea atrófica e fissuras finas do olho com glândula meibomiana atrófica que é semelhante à sindrome do olho seco em humanos. Estes resultados indicam que deficiência em SCDl pode afectar a sintese não apenas de ácidos gordos monoinsaturados como dos componentes de tecido éster de colesterol e triglicéridos, mas de outros lípidos tais como ésteres de cera da pálpebra.

Patologia Grosseira e Exame Histológico de Murganhos com SCD -/- Inactivada.

Os murganhos SCD -/- foram saudáveis e férteis mas estes têm anomalias cutâneas. Estas anomalias tiveram início por volta da idade do desmame (3-4 semanas) com pele seca, descamação epidérmica fina e perda de pêlo que se torna mais grave com o envelhecimento. Adicionalmente, os murganhos exibiram finas fissuras no olho. 0 exame patológico da pele e pálpebras mostrou que os murganhos do tipo selvagem possuíam umas glândulas sebáceas e meibomianas proeminente e bem diferenciadas (dados não apresentados). Por outro lado, na pele e pálpebra dos SC -/-apareceram células acinares atróficas nas glândulas sebáceas e meibomianas (dados não apresentados). Não foram encontradas anomalias na córnea e retina (dados não apresentados). 98

Murganhos SCD -/- possuem Níveis Baixos de Lípidos Neutros da Pálpebra e Pele

Mediram-se os conteúdos em colesterol livre (FC) e éster de colesterol (CE), triglicéridos e éster de cera na pálpebra. A cromatografia em camada fina (TLC) de lípidos extraídos da pálpebra de murganhos SCDl -/- demonstrou níveis marcadamente reduzidos de éster de colesterol e triglicérido e éster de cera em comparação com o dos lípidos extraídos da pálpebra de murganhos do tipo selvagem (Fig. 16A). A Tabela 3 compara os conteúdos de lípido na pálpebra entre murganhos SCD -/- e do tipo selvagem.

Tabela 3.

Genótipo +/+ -/-

Conteúdo em éster de 18,1 ±0,7 4,8 ± 0,3 colesterol (mg/g de pálpebra)

Conteúdo em colesterol livre 5,3 ± 0,5 8,4 ± 0,2 (mg/g de pálpebra)

Tri-éster de cera ((mg/g de 36,8 ±4,4 10,3 ±0,8 pálpebra)

Triglicéridos (mg/g de 13,8 ± 0,6 5,5 ± 0,4 pálpebra)_

Cada valor da tabela denota a média ± SP (n=4). Todos os murganhos tinham 6 semanas de idade e alimentados com dieta de ração. Os valores a negrito denotam uma significância estatística (p<0,01) entre os murganhos do tipo selvagem e os SCD -/-_

Como apresentado na Tabela 3, e mostra que o conteúdo em éster de colesterol na pálpebra e pele de murganhos SCDl -/- foi diminuído em 74%, enquanto o colesterol livre aumentou em 1,75-vezes. Existiu uma redução no nível de CE e triglicérido também no fígado da SCD-/- mas não existiu diferença no conteúdo

de colesterol livre no fígado (dados não apresentados). O conteúdo em triglicérido e éster de cera na pálpebra dos respectivamente. murganhos SCD -/- diminuiu em 60% e 75%, 99 A Fig. 16B utiliza um solvente diferente de acordo com Nicolaids et al (Nicolaides, N., e Santos, E. C. (1985). The di-and triesters of the lipids of steer and human meibomian glands. Lipids 20, 454-67) consistindo em hexano/benzeno (45:65), foi utilizado para separar os diferentes ésteres de cera mostra que o tri-éster é o principal éster de cera. Estes tri-ésteres assim como os di-ésteres, foram diminuídos em 72% nos murganhos SCD-/-. O conteúdo em tri-éster de cera da pálpebra diminuiu em 72% nos murganhos SCD-/-. De modo semelhante à pálpebra, o conteúdo em éster de colesterol e triglicéridos na pele de murganhos SCD -/- diminuiu em 43% e 53%, respectivamente enquanto o colesterol livre aumentou em 1,9-vezes (Tabela 3, e Fig. 16A e B) . Finalmente, o conteúdo em ácidos gordos monoinsaturados absoluto em cada fracção foi dramaticamente reduzido nos murganhos SCDl -/- com aumentos correspondentes nos ácidos gordos saturados (dados não apresentados).

Dieta de 18:1 Não Restaura as Anomalias da Pele e Pálpebra em Murganhos SCD -/- 0 oleato é um dos ácidos gordos mais abundantes na dieta. Os ácidos gordos monoinsaturados celulares utilizados para a síntese de éster de colesterol e triglicéridos, podem ser sintetizados de novo através da Sintase de Ácidos Gordos e SCD ou através da incorporação de oleato exógeno indirectamente da dieta. Para determinar se o oleato da dieta pode substituir o oleato endogenamente sintetizados e restaurar as anomalias do pêlo, pele e olho dos murganhos SCD-/-, suplementou-se as dietas de murganho semi-purificadas com níveis elevados de 18:1 n-9 (50% da gordura total) como trioleína e, depois, 100 administraram-se as dietas a murganhos SCD -/- durante 2 semanas. Contudo, estas anomalias não foram restauradas por estas dietas que continham os ácidos gordos monoinsaturados elevados. Isto sugere que SCD1 inibidores específicos actuam para reduzir os níveis de TG apesar da dieta. Por sua vez, os níveis de éster de colesterol, éster de cera e triglicérido nas pálpebras de murganhos SCD -/- alimentados com 18:1 n-9 elevados foram ainda inferiores aos de murganhos SCD +/+ (dados não apresentados), sugerindo que os ácidos gordos monoinsaturados sintetizados endogenamente são necessários para a síntese dos ésteres de colesterol triglicéridos e ésteres de cera de mebum.

No presente estudo, estabeleceram-se murganhos SCDl nulos e mostrou-se que a deficiência em SCD causava expressão selectiva para o substrato e selectiva para o tecido. 0 nível de palmitoleato em murganhos SCD -/- é diminuído em mais do que 50% em todos os tecidos incluindo fígado, que expressa SCDl murganhos do tipo selvagem. Por outro lado, as alternâncias do nível de oleato foram específicas para o tecido.

De modo semelhante aos murganhos asebia que possuem uma mutação espontânea de SCDl, os murganhos SCD -/- exibiram anomalias no crescimento do pelo, pele e olho com penetração completa. Estes fenótipos foram perceptíveis a partir da idade do desmame. O exame histológico da pele e pálpebra mostrou que a glândula sebácea atrópica na pele e a glândula meibomiana na borda da pálpebra em que a SCDl é abundantemente expressa, não possuía os lípidos sebáceos e meibomianos segregados, os denominados, sebo e mebum, respectivamente. De facto, verificou-se que os lípidos neutrais incluindo triglicéridos, vários tipos de ésteres de cera e ésteres de colesterol que são conhecidos por serem componentes de sebo e mebum, foram 101

marcadamente reduzidos na pálpebra e também na epiderme (dados não apresentados) dos murganhos SCD A blefarite crónica semelhante às anomalias da pálpebra que se descreveu nos murganhos SCD -/-, é uma das doenças comuns mais frustrante em humanos. Shine e McCulley (Shine, w. E., e McCulley, J. P. (1998). Keratoconjunctivitis sicca associated with meibomian secretion polar lipid abnormality. Arch Ophthalmol 116, 849-52) reportaram que a blefatite crónica pode ser devida a anomalias de lipidos no mebum. A natureza destas anomalias de lipidos não foi caracterizada em detalhe. Contudo, estes verificaram que o mebum de doentes com ceratoconjuntivite meibomiana tem niveis diminuídos de ácido oleico, um produto principal de SCD enquanto que doentes com seborreia meibomiana têm niveis aumentados de 18:1. Estas observações, em conjunto com este estudo, sugerem que a alternância da actividade de SCD pode estar implicada na blefarite crónica. Deste modo, a SCD pode tornar-se um potencial alvo para o desenvolvimento de fármacos terapêuticos e preventivos para o tratamento de doenças do olho.

Sequência do Promotor da dessaturase da estearoil-CoA humana 1. SEQ ID N2 1 ggtccccgcc ccttccagag agaaagctcc cgacgcggga tgccgggcag aggcccagcg gcgggtggaa gagaagctga gaaggagaaa cagaggggag ggggagcgag gagctggcgg cagagggaac agcagattgc gccgagccaa tggcaacggc aggacgaggt ggcaccaaat 102 tcccttcggc caatgacgag ccggagttta cagaagcctc attagcattt ccccagaggc aggggcaggg gcagaggccg ggtggtgtgg tgtcggtgtc ggcagcatcc ccggcgccct gctgcggtcg ccgcgagcct cggcctctgt ctcctccccc tcccgccctt acctccacgc gggaccgccc gcgccagtca actcctcgca ctttgcccct gcttggcagc ggataaaagg gggctgagga aataccggac acggtcaccc gttgccagct ctagccttta aattcccggc tcggggacct ccacgcaccg cggctagcgc cgacaaccag ctagcgtgca aggcgccgcg gctcagcgcg taccggcggg cttcgaaacc gcagtcctcc ggcgaccccg aactccgctc cggagcctca gccccct

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Hayden, Michael R.

Brownlie, Alison J.

Ntambi, James M.

Miyazaki, Makoto Gray-Keller, Mark P.

Attie, Alan D. <120> Métodos e Composições Utilizando Dessaturase de Estearoíl-CoA para Identificar Agentes Terapêuticos que Reduzem Triglicéridos <130> 760050-7 <140> <141> <150> U.S. 60/184.526 107 <151> 2000-02-24 <150> U.S. 60/221.697 <151> 2000-07-31 <150> U.S. 60/255.771 <151> 2000-12-15 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 617 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 ggtccccgcc ccttccagag agaaagctcc gcgggtggaa gagaagctga gaaggagaaa cagagggaac agcagattgc gccgagccaa tcccttcggc caatgacgag ccggagttta aggggcaggg gcagaggccg ggtggtgtgg gctgcggtcg ccgcgagcct cggcctctgt gggaccgccc gcgccagtca actcctcgca gggctgagga aataccggac acggtcaccc tcggggacct ccacgcaccg cggctagcgc gctcagcgcg taccggcggg cttcgaaacc cggagcctca gccccct

<210> 2 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial cgacgoggga tgccgggcag aggcccagcg 60 cagaggggag ggggagcgag gagctggcgg 120 tggcaacggc aggacgaggt ggcaccaaat 180 cagaagcctc attagcattt ccccagaggc 240 tgtcggtgtc ggcagcatcc ccggcgccct 300 ctcctccccc tcccgccctt acctccacgc 360 ctttgcccct gcttggcagc ggataaaagg 420 gttgccagct ctagccttta aattcccggc 480 cgacaaccag ctagcgtgca aggcgccgcg 540 gcagtcctcc ggcgaccccg aactccgctc 600 617 108 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador de PCR para o Exão 6. <400> 2 gggtgagcat ggtgctcagt ccct 24

<210> 3 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador de PCR para o gene neo. <400> 3 atagcaggca tgctggggat 20

<210> 4 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador de amplificação por PCR. <400> 4 cacaccatat etgtccccga caaatgtc 28 <210> 5 <211> 30 109

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador de amplificação por PCR a Montante. <400> 5 nnnnggtacc ttnngaaaag aacagcgccc 30

<210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Iniciador de amplificação por PCR a Jusante. <400> 6 nnnnagatctgtgcgtggag gtccccg 27

Lisboa, 26 de Outubro de 2010 110

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificar um agente de modulação da estearoilo-CoA dessaturase (SCDl), compreendendo: a) o contacto, em condições fisiológicas, de um agente químico e uma fracção membranar microssómica possuindo actividade de SCDl ou um destes agentes químicos e uma célula possuindo actividade de SCDl; b) a detecção de uma alteração na referida actividade de SCDl devida ao referido contacto; c) o ensaio do referido agente químico para também seleccionar compostos que não inibem num humano a actividade biológica de delta-5-dessaturase ou delta-6 dessaturase, identificando, deste modo, um agente de modulação de SCDl.
2. 2. Método da reivindicação 1, em que a referida fracção membranar microssómica ou célula possuindo actividade de SCDl compreende um polipéptido de SCDl.
3. 3. Método da reivindicação 1, em que a referida alteração na actividade de SCDl é um aumento na actividade de SCDl.
4. 4. Método da reivindicação 1, em que a referida alteração na actividade de SCDl é uma diminuição na actividade de SCDl. 1
5. 5. Método da reivindicação 1, em que a actividade de SCDl na referida fracção membranar microssómica ou célula é determinada utilizando um substrato marcado radioactivamente.
6. 6. Método da reivindicação 5, em que a referida marcação radioactiva é tritio.
7. 7. Método da reivindicação 5, em que a referida actividade de SCDl faz com que o referido substrato marcado radioactivamente produza água marcada radioactivamente.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que a referida água marcada radioactivamente é água marcada com tritio.
9. 9. Método da reivindicação 5, em que o referido substrato marcado radioactivamente é estearoilo-CoA marcado radioactivamente.
10. 10. Método da reivindicação 9, em que o referido substrato marcado radioactivamente é estearoil-CoA compreendendo um átomo de tritio apenas em C9 e CIO. Lisboa, 26 de Outubro de 2010 2