ES2349856T3

ES2349856T3 - Estearoil-coa desaturasa para identificar agentes terapéuticos que reducen los trigliceridos.

Info

Publication number: ES2349856T3
Application number: ES01920143T
Authority: ES
Inventors: Mark P. Gray-Keller; Alan D. Attie; James M. Ntambi; Alison J. Brownlie; Makoto Miyazaki; Michael R. Hayden
Original assignee: Xenon Pharmaceuticals Inc; Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Xenon Pharmaceuticals Inc; Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 2000-02-24
Filing date: 2001-02-23
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2021-02-23

Abstract

Un método para identificar un agente de modulación de estearoil-CoA desaturasa (SCD1), que comprende: a) poner en contacto, en condiciones fisiológicas, a un agente químico y una fracción de membrana microsómico que tiene actividad de SCD1 o a dicho agente químico y una célula que tiene actividad de SCD1; b) detectar un cambio de dicha actividad de SCD1 debido a dicha puesta en contacto; c) ensayar dicho agente químico para seleccionar adicionalmente compuestos que no inhiban en un ser humano la actividad biológica de delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa, identificando de este modo un agente de modulación de SCD1.

Description

Estearoil-CoA desaturasa para identificar agentes terapéuticos que reducen los triglicéridos

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la estearoil-CoA desaturasa y su implicación en diversas enfermedades humanas. La estearoil-CoA desaturasa es útil para la identificación y el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de dichas enfermedades.

Antecedentes de la invención

Las enzimas acil desaturasas catalizan la formación de dobles enlaces en ácidos grasos obtenidos de fuentes alimenticias o de síntesis de novo en el hígado. Los mamíferos sintetizan cuatro desaturasas de diferente especificidad por la longitud de la cadena, que catalizan la adición de dobles enlaces en las posiciones \Delta9, \Delta6, \Delta5 y \Delta4. Las estearoil-CoA desaturasas (SCD) introducen un doble enlace en la posición \Delta9 de ácidos grasos saturados. Los sustratos preferidos son palmitoil-CoA (16:0) y estearoil-CoA (18:0), que se convierten en palmitoleoil-CoA (16:1) y oleoil-CoA (18:1), respectivamente. Los ácidos grasos monoinsaturados resultantes son sustratos para la incorporación en fosfolípidos, triglicéridos y ésteres de colesterol.

Se han clonado una serie de genes de SCD de mamífero. Por ejemplo, se han clonado dos genes de rata (SCD1, SCD2) y cuatro genes de SCD se han aislado de ratón (SCD1, 2, 3 y 4). Un único gen de SCD, SCD1, se ha caracterizado en seres humanos.

Aunque el papel bioquímico básico de SCD es conocido en ratas desde los años 70 (Jeffcoat R. y James, AT. 1984. Elsevier Science, 4: 85-112; de Antueno, RJ. 1993. Lipids 28 (4) 285-290), no se ha implicado, antes de esta invención, directamente en los procesos de enfermedades humanas. Los estudios en animales no humanos oscurecieron nuestra compresión del papel de SCD en seres humanos debido a las bien documentadas diferencias en los procesos bioquímicos en diferentes especies. En roedores, por ejemplo, el metabolismo de lípidos y del colesterol está particularmente oscurecido por la ausencia de la Proteína Transportadora de Ésteres de Colesterol (CETP) (véase Foger, B. et al. 1999. J. Biol. Chem. 274 (52) 36912).

Además, la existencia de múltiples genes de SCD en ratones y ratas añade complejidad adicional para determinar el papel específico de cada uno de estos genes en procesos de enfermedad. Las diferencias en perfiles de expresión tisular, especificidad por sustrato, regulación génica y estabilidad enzimática pueden ser importantes para aclarar qué gen de SCD desempeña el papel dominante en cada trastorno. La mayoría de los estudios de SCD previos evalúan la función del gen de SCD midiendo los niveles de ARNm o midiendo niveles de ácidos grasos monoinsaturados como medición indirecta de la actividad enzimática de SCD. En estos dos casos, este análisis puede conducir a error. En el último método ha sido particularmente inductor a errores y difícil de discernir la contribución relativa de SCD1 al índice de desaturación en plasma (la proporción de ácidos grasos monoinsaturados respecto a ácidos grasos saturados de una longitud de cadena específica) debido a que múltiples enzimas SCD pueden contribuir a la producción de ácidos grasos monoinsaturados. Anteriormente a esta invención, se desconocía las contribuciones relativas de las múltiples isoformas de SCD al índice de desaturación. En resumen, los estudios previos no diferenciaron qué isoformas de SCD desempeñan un papel principal en la actividad desaturasa total, según lo medido mediante el índice de desaturación.

Un reciente trabajo en cultivo celular de hepatocitos de pollo in vitro relaciona la actividad de delta-9 desaturasa con la secreción alterada de triacilglicerol (Legrand, P. y Hermier, D. (1992) Int. J. Obesity 16, 289-294; Legrand, P., Mallard, J., Bernard-Griffiths, M. A., Douaire, M., y Lemarchal, P. Comp. Biochem. Physio. 87B, 789-792; Legrand, P., Catheline, D., Fichot, M.-C., Lemarchal, P. (1997) J. Nutr. 127, 249-256). Este trabajo no distinguía entre las isoformas de delta-9 desaturasa que pueden existir en el pollo, no consiguiendo, una vez más, implicar directamente una enzima SCD específica que suponga un efecto biológico particular, en este caso, la secreción alterada de triglicéridos.

Este trabajo in vitro tampoco se correlaciona bien con seres humanos debido a que existen diferencias sustanciales entre el metabolismo de lipoproteínas de pollo y de ser humano in vivo. Dichas diferencias incluyen la presencia, en el pollo, de lipoproteínas completamente diferentes, tales como vitelogenina, y distintos procesos tales como la inducción masiva de síntesis de triglicéridos hepática durante la ovulación. Otras diferencias tales como el tipo de lipoproteínas usadas para el transporte de colesterol y el proceso de secreción de triglicéridos de la dieta en quilomicrones están bien documentados. Estas principales diferencias entre aves y mamíferos suponen que la extrapolación desde las aves a los mamíferos en el área del metabolismo de triglicéridos debe considerarse provisional y pendiente de la confirmación en seres humanos.

Otras dos áreas de la técnica antecedente forman una importante base para la presente invención. En primer lugar, esta invención se refiere al metabolismo del colesterol y de lípidos, que en seres humanos se ha estudiado de forma exhaustiva. Dado que el colesterol es altamente apolar, es transportado a través del torrente sanguíneo en forma de lipoproteínas constituidas esencialmente por un núcleo de moléculas apolares tales como éster de colesterol y triglicérido rodeado por una envuelta de lípidos anfipáticos, principalmente fosfolípidos. En seres humanos, aproximadamente el 66% del colesterol se transporta en partículas de lipoproteína de baja densidad (LDL), aproximadamente el 20% en partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL), y el resto en partículas de lipoproteína de muy baja densidad (VLDL). Una excelente referencia a la bioquímica básica del metabolismo del colesterol en seres humanos y otros organismos se encuentra en el documento Biology of Cholesterol. Ed. Yeagle, P. CRC Press, Boca Raton, Fla., 1988.

En segundo lugar, esta invención aprovecha los nuevos descubrimientos en el ratón Asebia (Gates, et al. (1965) Science. 148: 1471-3). Este ratón es un ratón con variante genética de origen natural que tiene un defecto bien conocido en las glándulas sebáceas, dando como resultado la pérdida de peso y piel escamosa. Recientemente se ha descubierto que el ratón Asebia tiene una deleción en SCD1 que da como resultado la formación de un sitio de terminación temprano en el exón 3 del gen de SCD1. Los animales homocigotos para esta mutación, o un alelo de deleción distinto que abarque los exones 1-4, no expresan cantidades detectables del transcrito de ARNm de SCD1 de tipo silvestre (Noviembre de 1999. Nature Genetics. 23: 268 y siguientes; y publicación de patente PCT WO 00/09754)]. Dado que se desconoce el alcance completo de esta deleción de origen natural, también se desconoce si otros genes colindantes a SCD1, o en algún otro lugar en el genoma, también podían estar implicados en el fenotipo de Asebia. Para estudiar específicamente la actividad de SCD1 en los procesos de enfermedad, se requiere un ratón específico knock-out para SCD1. El anterior trabajo sobre esta variante se centraba en el papel de esta mutación en trastornos cutáneos y no en el metabolismo de triglicéridos o VLDL.

El documento J. Biol. Chem. Vol. 251, Nº 23 págs. 7468 a 7473 se refiere a una investigación de oxigenasas microsómicas de procesos biosintéticos. El documento US 5.336.496 se refiere a un método para inhibir la delta 5-desaturasa en un animal. El documento J. Biol. Chem. Vol. 275, Nº 39 págs. 30132 a 30138, 2000 se refiere a la biosíntesis de ésteres de colesterol y triglicéridos hepáticos que está alterada en ratones con una alteración del gen para estearoil-CoA desaturasa 1.

Es un objeto de la presente invención identificar enfermedades y trastornos que estén vinculados específicamente a la actividad biológica de SCD1 en seres humanos y, en una realización preferida, enfermedades y trastornos del metabolismo de triglicéridos. Es un objeto adicional desarrollar ensayos de cribado para identificar y desarrollar fármacos para tratar esas enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas. Además, es un objeto de esta invención proporcionar composiciones para su uso en el tratamiento de estas enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas.

Breve sumario de la invención

Esta invención se refiere a un método para identificar un agente modulador de estearoil-CoA desaturasa (SCD1) de acuerdo con la reivindicación 1. En las reivindicaciones 2 a 10 se especifican realizaciones preferidas.

Esta invención describe, por primera vez, el papel de la estearoil-CoA desaturasa 1 humana ("hSCD1") en una amplia gama de enfermedades y trastornos humanos. En particular, la actividad biológica de SCD1 en seres humanos está relacionada directamente con los niveles en suero de triglicéridos y VLDL. Además, la actividad biológica de SCD1 también afecta a los niveles en suero de HDL, LDL y/o colesterol total, al transporte inverso de colesterol y a la producción de secreciones de membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera y/o similares.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un proceso o ensayo de cribado para identificar, a partir de una biblioteca de compuestos de ensayo, un agente terapéutico que module la actividad biológica de dicha estearoil-CoA desaturasa humana (hSCD1) y sea útil para tratar un trastorno o afección humana relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o VLDL. Preferentemente, el ensayo de cribado identifica inhibidores de hSCD1 que rebajan los niveles de triglicéridos en suero y proporcionan un importante beneficio cardioprotector para los seres humanos.

Es también un objeto de la presente invención proporcionar un proceso o ensayo de cribado para identificar, a partir de una biblioteca de compuestos de ensayo, un agente terapéutico que module la actividad biológica de dicha estearoil-CoA desaturasa humana (hSCD1) y sea útil para tratar un trastorno o afección humana relacionada con los niveles en suero de HDL, LDL y/o colesterol total, el transporte inverso de colesterol o la producción de secreciones a partir de membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera y/o similares.

En un aspecto, la presente invención utiliza vectores que comprenden genes y secuencias promotoras de estearoil-CoA desaturasa humana (hSCD1) y células eucariotas y líneas celulares recombinantes, preferentemente células de mamífero y de la forma más preferente células y líneas celulares humanas, transfectadas para comprender dichos vectores y/o dichos polinucleótidos y en las que dichas células expresan hSCD1. En este documento se describe la secuencia promotora de longitud completa para hSCD1, SEC ID Nº 1.

Es también un objeto de la presente invención proporcionar agentes capaces de modular la actividad y/o expresión de estearoil-CoA desaturasa 1 humana (hSCD1) como se describe en este documento, especialmente cuando dicha capacidad moduladora se determinó en primer lugar usando un ensayo que comprende actividad biológica de hSCD1 o un gen que codifica hSCD1. Se contemplan específicamente composiciones farmacéuticas que comprenden dichos agentes.

Es un objeto adicional más de la presente invención proporcionar agentes en los que dicho agente es útil para tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con la actividad biológica de hSCD1.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Generación de ratones knock-out para SCD1 (A) Estrategia de fijación como objetivo de SCD1. Se muestra un mapa parcial del locus genómico que rodea al locus de Scd1. La recombinación homóloga dio como resultado la sustitución de los exones 1-6 por el gen neo 7. Los eventos de fijación como objetivo de genes se comprobaron mediante análisis de transferencia de Southern usando EcoRl y la sonda A o B o mediante análisis por PCR. (B) Análisis por PCR que demuestra ratones SCD-/-. Al cruzar heterocigotos, nacieron heterocigotos y homocigotos de tipo silvestre de manera mendeliana (+/+:+/-:-/- = 21:43:20 x^{2} = 0,395). (C) Análisis de transferencia de Northern. 20 \mug de ARN total se aislaron del hígado y se sometieron a análisis por transferencia de Northern. Las transferencias se sondearon con una SCD1 de ratón y 2 fragmentos de ADNc. (D) El ensayo de inmunotransferencia del hígado mostró la ausencia de SCD inmunorreactiva en ratones SCD1-/-, mientras que la proteína SCD1 se detectó en tejido hepático tanto de ratones de tipo silvestre como heterocigotos de manera dependiente de la dosificación génica. (E) La actividad de SCD en el hígado se suprimía en ratones SCD-/-. Como se ha mencionado anteriormente, los heterocigotos presentan un fenotipo intermedio en comparación con los miembros de la camada de tipo silvestre y knock-out. La actividad enzimática se representa como nanomoles de sustrato desaturado por miligramo de proteína por minuto. Los datos se indican como la media \pm SD (n = 3).

Figura 2. Perfiles de lipoproteína en plasma en ratones macho Knock-out para SCD1 y Asebia. Los dos paneles superiores representan el contenido de triglicéridos de las fracciones de lipoproteína, los dos paneles inferiores representan el contenido de colesterol de las fracciones de lipoproteína.

Figura 3. Niveles de VLDL-triglicéridos en ratones Asebia (SCD1-/-) y SCD1+/-. Las lipoproteínas del plasma se separaron mediante cromatografía en fase líquida rápida y se midió la distribución de triglicéridos entre las lipoproteínas en las diversas fracciones de densidad del ratón (n = 3). SCD-/- (círculos vacíos), SCD1+/- (círculos llenos). Se indican los picos de lipoproteína para VLDL, LDL y HDL.

Figura 4. La proporción de ácido grasos monoinsaturados respecto a saturados en plasma de ratón (el índice de desaturación) disminuye de manera directamente proporcional al nivel de actividad de SCD1. Comparación de ratones knock-out para SCD1 y Asebia con sus respectivos controles.

Figura 5 muestra un análisis de regresión lineal usando una serie de datos humanos. La proporción de 18:1/18:0 mostraba una relación significativa con los niveles de TG (r^{2} = 0,39, p < 0,0001) (Panel A), así como correlaciones significativas con los niveles de HDL (r^{2} = 0,12, p = 0,0006) (Panel B). Los detalles experimentales se describen adicionalmente en el Ejemplo 2.

Figura 6 muestra un análisis de regresión lineal que indica que se observó una débil relación entre el nivel relativo de 16:1/16:0 con los niveles de TG en plasma (r^{2} = 0,05, p = 0,03). Los detalles experimentales se encuentran en el Ejemplo 2.

Figura 7 muestra un análisis de regresión lineal de aquellos individuos con un fenotipo alto de HDL (> 90º percentil). Estos individuos demostraron una relación significativa entre la proporción 18:1/18:0 y los niveles de TG (r^{2} = 0,40, p < 0,005).

Figura 8 muestra una relación observada entre 18:1/18:0 y los niveles de TG que se observó en una familia (HA-1) que segrega un fenotipo alto de HDL. Usando un análisis de regresión lineal, se observó una relación significativa entre 18:1/18:0 y TG (r^{2} = 0,36, p = 0,005 (Panel A)). El Panel B muestra una relación significativa entre la proporción 18:1/18:0 y los niveles de HDL en esta familia (r^{2} = 0,32, p = 0,009).

Figura 9 muestra la relación observada entre la proporción 18:1/18:0 y los niveles de TG (r^{2} = 0,49, p = 0,0009) cuando solamente se tienen en consideración personas con bajo HDL (< 5º percentil).

Figura 10 muestra un análisis de una familia (NL-001), que segregaba un fenotipo bajo de HDL de etiología genética desconocida y tendía hacia las relaciones observadas en las Figuras 5-9.

Figura 11 muestra un análisis de la familia NL-0020 que segregaba una mutación ABCA1 y tendía hacia las relaciones observadas en las Figuras 5-9.

Figura 12 es un análisis de ácidos grasos en plasma que muestra la relación entre la proporción 18:1/18:0 y los niveles de TG (r^{2} = 0,56, p = 0,02) (Panel A), los niveles de HDL (r^{2} = 0,64, p = 0,0095) (Panel B) y los niveles de colesterol total (r^{2} = 0,50, p = 0,03) en nueve personas con Hiperlipidemia Combinada Familiar (FCHL) (Panel C).

Figura 13 es un análisis de ácidos grasos en plasma que muestra una proporción significativamente elevada de 18:1/18:0 en ratones hiperlipidémicos (HcB-19) en comparación con controles no afectados de la cepa parental (C3H).

Figura 14. Ubicación de secuencias reguladoras y sitios de unión en la región homóloga de las regiones promotora y flanqueante en 5' de SCD1 de ratón y SCD1 humano. La escala superior indica la posición relativa con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Se indican importantes elementos de la secuencia promotora.

Figura 15. Células HepG2 humanas cultivadas y tratadas con una gama de dosis de ácido araquidónico, DHA o 10 \mug/ml de colesterol o EPA como se indica. El ARNm total se aisló y se cuantificó.

Figura 16. TLC de extractos de lípidos de la piel (A y B) y los párpados (C y D) de ratones de tipo silvestre, heterocigotos y SCD-/-. Los lípidos totales se extrajeron de los párpados de ratones de tipo silvestre, heterocigotos y SCD-/-. Los extractos de lípidos se reunieron y se analizaron mediante TLC de alto rendimiento (HPTLC, A y C; éter de hexano/éter/ácido acético = 90:25:1, B y D; Benceno:hexano; 65:35). Las mismas cantidades de extracto de lípido (a partir de 0,5 mg de párpado) se sometieron en cada pista. Cada pista representa lípidos de los párpados de dos ratones.

Figura 17 muestra un ensayo para la actividad de SCD1 desaturasa cuantificando la transferencia de ^{3}H de estearato a agua. La figura muestra una evolución temporal de la producción de ^{3}H-agua a temperatura ambiente. Se usaron microsomas de hígados de tipo silvestre para este experimento. Un número de recambio para la actividad de SCD1 en estas condiciones se estimó en 2 nmol/min/mg de proteína, que es aproximadamente la mitad del observado a 37ºC.

Figura 18 muestra la validación de que el ensayo monitoriza específicamente la desaturación de estearoil-CoA dependiente de SCD1. Los hígados se recogieron de ratones de tipo silvestre y knock-out para SCD1 después de 3 días con una dieta rica en carbohidratos y sin grasas (esto induce la expresión de SCD1 en el hígado en aproximadamente 50 veces), se homogeneizaron y se usó una porción para la purificación de microsomas. Se determinó la producción de ^{3}H-agua durante 15 minutos a RT (temperatura ambiente) en preparaciones tanto de homogenado como de microsoma a una concentración de proteínas equivalente, seguida por la interrupción de la reacción con ácido y usando carbón vegetal para separar el sustrato del producto. La inactivación de la muestra con ácido antes de la adición de sustrato ofrece un blanco, o control que contiene radiactividad de fondo sin ninguna reacción de desaturación. La figura muestra que la actividad de desaturación en los microsomas se enriquece enormemente en comparación con el homogenado para hígados de tipo silvestre, mientras que los microsomas para el animal knockout para -/-SCD1 tenían muy poca actividad. La "ventana", o desaturación dependiente de SCD1 en este ensayo, es una diferencia altamente visible y significativa de 160 veces entre los microsomas de tipo silvestre y de knock-out para SCD1.

Figura 19 muestra la inhibición de SCD1 con 3 inhibidores de ácidos grasos conocidos. Se usaron microsomas de ratones de tipo silvestre para ensayar la eficacia de tres inhibidores conocidos de SCD1: ácido linoleico conjugado (CLA), ácido 9-tia esteárico (9-thia) y ácido estercúlico (SA). El panel A muestra que cuando se añaden como ácido graso libre ninguno era eficaz para suprimir la actividad de SCD1. Sin embargo, el panel B muestra que si se conjugan previamente a CoA (realizado incubando los microsomas con CoA y ATP antes de la adición de 3H-estearoil-CoA) los tres inhibidores muestran inhibición graduada de SCD1 con el ácido estercúlico suprimiendo casi el 100% de la actividad para el estado de preincubación. Este experimento establece que la actividad de SCD1 puede inhibirse con inhibidores conocidos, pero parece que estos requieren conjugación con CoA. Un uso importante de este ensayo de cribado es descubrir moléculas pequeñas que sean potentes inhibidores de la actividad biológica de SCD1 sin conjugación a CoA.

Figura 20 (A) Demostración de que la masa de estearoil-CoA limita la cinética y la magnitud de la señal de producción de 3H que estamos tomando como medida de la desaturación dependiente de SCD1. Este experimento es esencialmente una repetición del mostrado en la figura 17 con la excepción de que a los 30 minutos se añadió una alícuota adicional de masa de estearoil-CoA/radiactividad, dando como resultado la segunda producción exponencial de señal de 3H. Esto muestra que la cantidad de estearoil-CoA limita la reacción como se esperaba para la desaturación catalizada por SCD1. (B) Demostración de que el experimento es adaptable a alto rendimiento. Todos los experimentos anteriores se realizaron con un volumen total de reacción de 1,1 ml (0,2 ml de tampón de reacción que contenía microsomas, 0,2 ml de PCA al 6% para interrumpir la reacción y 0,7 ml de solución de carbón vegetal al 10% para sedimentar el sustrato que no reaccionó). El experimento ilustrado en B se realizó con un volumen de reacción total de 0,31 ml (0,1 ml de tampón de reacción con microsomas, 0,01 ml de PCA al 60% para interrumpir y 0,2 ml de carbón vegetal al 10% para sedimentar).

Definiciones

"Aislado" en el contexto de la presente invención con respecto a polipéptidos o polinucleótidos significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si éste es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un organismo vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos podrían formar parte de un vector y/o dichos polinucleótidos o polipéptidos podrían formar parte de una composición, y seguir estando aislados, ya que dicho vector o composición no forma parte de su entorno natural. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferentemente en una forma aislada, y preferentemente están purificados hasta la homogeneidad.

Los ácidos nucleicos y productos de expresión de polipéptidos descritos de acuerdo con la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden estar en "forma enriquecida". Como se usa en este documento, el término "enriquecido" significa que la concentración del material es al menos aproximadamente 2, 5, 10, 100 ó 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), ventajosamente el 0,01% en peso, preferentemente al menos aproximadamente el 0,1% en peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de aproximadamente el 0,5%, 1%, 5%, 10% y el 20% en peso. Las secuencias, construcciones, vectores, clones y otros materiales que comprende la presente invención pueden estar ventajosamente en forma enriquecida o aislada.

Los polinucleótidos y polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente invención también pueden estar en forma "purificada". El término "purificada" no requiere una pureza absoluta; en vez de esto, se entiende como una definición relativa, y puede incluir preparaciones que están altamente purificadas o preparaciones que solamente están parcialmente purificadas, como entienden estos términos los expertos en la materia. Por ejemplo, clones individuales aislados a partir de una biblioteca de ADNc se han purificado convencionalmente hasta homogeneidad electroforética. La purificación del material de partida o material natural hasta al menos un orden de magnitud, preferentemente dos o tres órdenes, y más preferentemente cuatro o cinco órdenes de magnitud se contempla expresamente. Además, el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de preferentemente el 0,001%, o al menos el 0,01% o el 0,1%; e incluso deseablemente el 1% en peso o más, se contempla expresamente.

La expresión "región codificante" se refiere a esa parte de un gen que, de forma natural o normalmente, codifica el producto de expresión de ese gen en su entorno genómico natural, es decir la región que codifica in vivo el producto de expresión nativo del gen. La región codificante puede ser de un gen normal, mutado o alterado, o puede ser incluso de una secuencia de ADN, o gen, completamente sintetizado en el laboratorio usando métodos bien conocidos por los expertos en la materia de la síntesis de ADN.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere a un heterodímero de desoxirribonucleótidos (para ADN) o ribonucleótidos (para ARN). Generalmente, los segmentos de ADN que codifican las proteínas proporcionadas por esta invención se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y cortos enlazadores de oligonucleótidos, o a partir de una serie de oligonucleótidos, para proporcionar un gen sintético que es capaz de expresarse en una unidad transcripcional recombinante que comprende elementos reguladores obtenidos de un operón microbiano o viral.

La expresión "producto de expresión" significa ese polipéptido o proteína que es el producto de la traducción natural del gen y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y que, por lo tanto, codifican el(los) mismo(s) aminoácido(s).

El término "fragmento", cuando se refiere a una secuencia codificante, significa una porción de ADN que comprende menos que la región codificante completa cuyo producto de expresión conserva esencialmente la misma función o actividad biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.

El término "cebador" significa una corta secuencia de ácido nucleico que se empareja con una cadena de ADN y proporciona un extremo OH en 3' libre en el cual una ADN polimerasa comienza la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótido.

El término "promotor" significa una región de ADN implicada en la unión de ARN polimerasa para iniciar la transcripción, e incluye todos los nucleótidos cadena arriba (5') del sitio de inicio de transcripción.

Como se usa en este documento, la referencia a una secuencia de ADN incluye ADN tanto de cadena sencilla como de cadena doble. Por lo tanto, la secuencia específica, a no ser que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN de cadena sencilla de dicha secuencia, el emparejamiento de dicha secuencia con su complemento (ADN de cadena doble) y el complemento de dicha secuencia.

La presente invención se refiere además a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida, así como fragmentos, análogos y derivados de dicho polipéptido.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren al polipéptido, significan un polipéptido que conserva esencialmente la misma función o actividad biológica que dicho polipéptido. Por lo tanto, un análogo incluye una pro-proteína que puede activarse mediante escisión de la porción de pro-proteína para producir un polipéptido maduro activo. Dichos fragmentos, derivados y análogos deben tener la suficiente similitud con respecto al polipéptido de SCD1, de modo que esa actividad del polipéptido nativo se conserve.

El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, y es preferentemente un polipéptido recombinante.

El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de SCD1 puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos se sustituyen por un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un resto de aminoácido conservado) y dicho resto de aminoácido sustituido puede ser o no uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que el polipéptido maduro está fusionado a otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semi-vida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de pro-proteína. Se considera que dichos fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en la materia a partir de las enseñanzas de este documento.

Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a una estearoil-CoA desaturasa aislada codificada por el polinucleótido aislado de la invención.

Pueden emplearse fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis peptídica; por lo tanto, los fragmentos pueden emplearse como intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa. Pueden usarse fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención para sintetizar polinucleótidos de longitud completa de la presente invención.

Como se usa en este documento, los términos "porción", "segmento" y "fragmento", cuando se usan en relación con polipéptidos, se refieren a una secuencia continua de restos, tales como restos de aminoácidos, secuencia que forma un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se sometiera a tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas comunes, tales como tripsina o quimotripsina, los oligopéptidos que resultan de dicho tratamiento representarían porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido de partida. Cuando se usan con respecto a polinucleótidos, dichos términos se refieren a los productos producidos mediante el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas comunes.

Sumario detallado de la invención

La presente invención se refiere a la actividad de estearoil-CoA desaturasa 1 humana en procesos de enfermedad humana. De acuerdo con esto, los compuestos que modulan específicamente la actividad o el nivel de expresión de estearoil-CoA desaturasa 1 humana son útiles en el tratamiento de un trastorno o afección humana relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o VLDL, y proporcionan un importante beneficio cardioprotector cuando se administra a seres humanos. Los compuestos que modulan la actividad o expresión de hSCD1 también son útiles para modular los niveles en suero de HDL, LDL y/o colesterol total, y/o el transporte inverso de colesterol. Finalmente, los compuestos que modulan la actividad o expresión de hSCD1 también son útiles para modular la producción de secreciones de las membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera y similares.

El gen y la proteína de SCD1

La estearoil-CoA desaturasa 1 humana (también llamada SCD1, hSCD y hSCD1) ha sido identificada con la secuencia de ADNc de longitud completa hecha pública por primera vez en el GenBank como la entrada al GenBank Y13647 (también NM005063) con fecha del 6 de junio de 1997. Descripciones adicionales de SCD1, incluyendo secuencias promotoras parciales pueden encontrarse en el GenBank con los siguientes números de entrada: gblAF097514.1IAF097514; dbjlAB032261.1IAB032261; gb IAF116616.1 IAF116616; reflXM_005719.1I;
gbIAF113690.1IAF113690; y gblS70284.1IS70284.

En un aspecto, la presente invención se refiere a usos de un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido no genómico que tiene al menos el 90% de identidad, preferentemente el 95% de identidad, de la forma más preferente al menos un 98% de identidad con la secuencia de estearoil-CoA reductasa 1 humana, especialmente cuando dichas secuencias son iguales e incluyen cualquiera de los componentes de cualquiera de las anteriores.

La secuencia promotora completa de hSCD1 es la SEC ID Nº 1 y la figura 14 ilustra los elementos funcionales conservados entre las regiones promotoras de SCD1 de ratón y humana.

En un aspecto, la presente invención se refiere a usos de un polipéptido aislado que tiene al menos el 90% de identidad, preferentemente el 95% de identidad, de la forma más preferente al menos un 98% de identidad con estearoil-CoA reductasa 1 humana, especialmente cuando dichas secuencias son iguales. La secuencia del polipéptido se ha descrito previamente y puede encontrarse en las siguientes series de entradas de la base de datos SwissProtein: Nº de entrada 000767; PID g3023241; VERSION 000767 GI: 3023241; DBSOURCE: swissprot: locus ACOD_HUMAN, entrada 000767. Como alternativa, la secuencia del polipéptido puede determinarse a partir de las referencias de la secuencia de ADNc proporcionadas anteriormente.

SCD1 en Procesos de Enfermedad Humana

Como se describe en este documento, una serie de enfermedades y trastornos humanos son el resultado de actividad biológica de SCD1 aberrante y pueden mejorar mediante la modulación de la actividad biológica de SCD1 usando agentes terapéuticos.

La enseñanza más significativa de la presente descripción se refiere al papel de SCD1 en la modulación de los niveles en suero de triglicéridos y VLDL en seres humanos. En este documento, se establecen dos descubrimientos principales. En primer lugar, el Ejemplo 1 a continuación muestra que los perfiles de lipoproteína de ratones knock-out para SCD1 demuestran una reducción del 65% en los niveles de triglicéridos y VLDL en suero. Estos corresponden a los perfiles de lipoproteínas de ratones Asebia que también están incluidos en este documento. Los perfiles de lipoproteína tanto de los ratones Asebia como de los ratones knock-out para SCD1 no se conocían previamente pero debido a la naturaleza dirigida y específica de la mutación diseñada, la correlación de la actividad de SCD1 y los niveles de triglicéridos en suero puede extraerse con certidumbre. Aunque otras isoformas de SCD pueden desempeñar un papel en los niveles de triglicéridos, este dato indica que SCD1, específicamente, desempeña el papel principal en este proceso.

Existen diferencias significativas en el metabolismo de lipoproteínas entre el ratón y los seres humanos, y aunque los anteriores datos son convincentes en el ratón para un papel principal y específico para SCD1 en la modulación de los niveles de triglicéridos, sigue existiendo la necesidad de experimentos que lo confirmen en seres humanos. El segundo descubrimiento principal, por lo tanto, presentado en el Ejemplo 2, a continuación, demuestra una correlación significativa entre la actividad de SCD en seres humanos y los niveles de triglicéridos en el suero. Por lo tanto, se ha descubierto que la actividad biológica de SCD1 en seres humanos está relacionada directamente con los niveles de triglicéridos en el suero.

De acuerdo con la presente invención, el fenotipo del ratón Asebia (descrito en primer lugar por Gates, et al. (1965) Science 148: 1471-3) muestra una alteración principal y significativa en el perfil de lipoproteínas en el suero incluyendo una gran reducción de los niveles de triglicéridos y VLDL. Además, estos animales presentan un gran descenso del contenido de ésteres de colesterol en el hígado. De acuerdo con esto, la inhibición eficaz de la actividad de SCD1 conduciría a una reducción de los niveles de triglicéridos, debido a una menor disponibilidad de ácidos grasos monoinsaturados. Los ácidos grasos monoinsaturados son el sustrato preferido para la enzima responsable de la síntesis
de triglicéridos (TG) a partir de ácidos grasos y fosfato de glicerol (es decir, glicerolfosfato aciltransferasa (GPAT)).

También de acuerdo con la descripción en este documento, la esterificación aumentada de colesterol previene la acumulación tóxica de colesterol libre en el hígado, y el aumento de la disponibilidad de ésteres de colesterol y triglicéridos también facilita su secreción en forma de VLDL. La esterificación de colesterol aumentada en macrófagos también puede potenciar la formación de macrófagos espumosos y, de este modo, contribuir al desarrollo de una lesión aterosclerótica. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de SCD puede tener el efecto añadido de reducir el nivel de partículas de VLDL en el torrente sanguíneo e inhibir la aterosclerosis.

También de acuerdo con la presente invención, la inhibición de SCD1 también es ventajosa para aumentar la formación de HDL en los tejidos periféricos. En un individuo sano, el colesterol celular está de forma predominante en forma esterificada, con bajos niveles de colesterol libre. La Acil-CoA:colesterol aciltransferasa (ACAT) es la enzima responsable de esterificar colesterol usando acil-CoA graso monoinsaturado como sustrato preferido. La SCD genera los productos monoinsaturados, que están entonces disponibles para la esterificación de colesterol por la ACAT. Se piensa que el flujo aumentado de colesterol libre fuera de células y a través de HDL es terapéuticamente beneficioso dado que podría significar un aumento del "transporte inverso de colesterol" (RCT).

La inhibición de SCD1 también es útil para aumentar el transporte inverso de colesterol (RCT) sin elevar necesariamente el nivel de HDL en el suero. El nivel de HDL en el suero es un marcador sustituto para el proceso de RCT, que de hecho se mide preferentemente mediante el flujo global de colesterol desde los tejidos periféricos al hígado. La invención identifica moduladores de la actividad biológica de SCD1 como agentes terapéuticos eficaces para aumentar el RCT. El RCT puede medirse directamente, por ejemplo, inyectando éter de colesterol radiomarcado en partículas de HDL directamente en la sangre, y midiendo la velocidad de eliminación (la velocidad a la que es captada en el hígado de un organismo).

De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que la modulación de la actividad de SCD1 en el hígado y otros tejidos da como resultado un aumento de SR-B1, un receptor hepático que retira HDL de la circulación, aumentando de este modo el RCT con efectos menos obvios sobre los niveles de HDL en la sangre. El vínculo entre la actividad biológica de SCD1 y la expresión de ARNm de SR-B1 no se ha identificado previamente. Trabajos anteriores establecieron que los ratones que sobreexpresan SR-B1 están cardioprotegidos, demostrando una aterogénesis reducida y enfermedad cardiovascular reducida. Esta interpretación también sugiere por primera vez que algunos agentes terapéuticos, tales como inhibidores de la actividad biológica de SCD1, pueden aumentar el RCT sin ningún cambio obvio en los niveles de HDL. Esto se consigue obteniendo un aumento equilibrado tanto de la formación de HDL en tejidos periféricos como de la retirada de HDL por el hígado.

El experimento comparaba la expresión de ARNm de SR-B1 en el hígado de ratones +/+ frente a -/- para SCD1 (cepas como se describen en los Ejemplos a continuación). Cuando se expresaban con respecto al animal +/+ con una dieta a base de pienso, los resultados muestran lo siguiente para los cambios en los niveles de ARNm de ABCA1 y SR-B1:

1

Los cambios en ABC1 no son significativos mientras que aquellos mostrados para SR-B1 con una dieta a base de pienso si que lo son. Un aumento de la expresión de SR-B1 indica un mayor flujo, o RCT, de colesterol al hígado y puede explicar porqué no se observa HDL-C elevado en el plasma de los ratones -/- para SCD1. Un mayor RCT se confirma además por el descubrimiento de que los animales -/- con una dieta rica en colesterol tienen una vesícula biliar de aproximadamente 10 veces el tamaño de la de los animales +/+ y que están congestionados de bilis. Estas observaciones son coherentes con una mayor retirada de colesterol por parte del hígado y, por lo tanto, un mayor RCT. Además, el aumento aparentemente idéntico de SR-B1 en ratones +/+ y -/- puede no reflejar un fenotipo o proceso biológico idéntico en estos animales.

La inhibición de la expresión de SCD también puede afectar a la composición de ácidos grasos de los fosfolípidos de la membrana, así como a triglicéridos y ésteres de colesterol. La composición de ácidos grasos de los fosfolípidos determina finalmente la fluidez de la membrana, mientras que los efectos sobre la composición de triglicéridos y ésteres de colesterol pueden afectar al metabolismo de lipoproteínas y a la adiposidad.

La presente invención también se refiere a la implicación de SCD1 en otros trastornos o afecciones humanas relacionadas con los niveles en suero de HDL, LDL y colesterol total, así como al papel de SCD1 en otros trastornos o afecciones humanas relacionadas con la producción de secreciones de las membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera y similares. La invención abarca moduladores de SCD1 que son útiles para tratar estos trastornos.

Trabajos anteriores que no usan sujetos humanos han demostrado que la actividad biológica de SCD aberrante en esos organismos (pero sin especificar qué isoforma de SCD era responsable) puede estar implicada en diversas enfermedades cutáneas, así como diversas enfermedades tales como cáncer y esclerosis múltiple, diabetes mellitus no dependiente de insulina, hipertensión, enfermedades neurológicas, enfermedades cutáneas, enfermedades oculares, trastornos inmunes y cáncer. Los moduladores descubiertos usando los procesos de la presente invención también serían útiles, de este modo, en el tratamiento de esas enfermedades y trastornos en sujetos humanos.

En el Ejemplo 4, se identifican proteínas que regulan la transcripción de SCD1. Estas proteínas son dianas para compuestos que aumentan o reducen la expresión de SCD1 en las células, influyendo de este modo, positiva o negativamente, en la actividad biológica de SCD1 de las células. PPAR-gamma y SREBP son ejemplos. Los compuestos que se sabe que actúan mediante dichos reguladores de la transcripción pueden identificarse ahora como relevantes para tratar las enfermedades y trastornos relacionados con SCD1 identificados ahora en seres humanos.

Ensayos de cribado

La presente invención proporciona ensayos de cribado que emplean el gen y/o proteína de hSCD1 para su uso en la identificación de agentes terapéuticos para su uso en el tratamiento de un trastorno o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos, VLDL, HDL, LDL, colesterol total, transporte inverso de colesterol, la producción de secreciones de membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera y similares.

Actividad Biológica de SCD1

La "actividad biológica de SCD1" como se usa en este documento, especialmente en relación con ensayos de cribado, se interpreta ampliamente y contempla todas las actividades biológicas directa o indirectamente medibles del gen y la proteína de SCD1. En relación con la proteína de SCD1 purificada, la actividad biológica de SCD1 incluye, aunque sin limitarse a, todos aquellos procesos biológicos, interacciones, comportamiento de unión, relaciones de actividad de unión, pKa, pD, cinética enzimática, estabilidad y evaluaciones funcionales de la proteína. En relación con la actividad biológica de SCD1 en fracciones celulares, fracciones celulares reconstituidas o células completas, estas actividades incluyen, aunque no se limitan a, la velocidad con la que la SCD introduce un doble enlace en posición cis en sus sustratos palmitoil-CoA (16:0) y estearoil-CoA (18:0), que se convierten en palmitoleoil-CoA (16:1) y oleoil-CoA (18:1), respectivamente, y todas las consecuencias medibles de este efecto, tales como la síntesis de triglicéridos, colesterol u otros lípidos, composición y comportamiento de la membrana, crecimiento celular, desarrollo de comportamiento y otros efectos directos o indirectos de la actividad de SCD1. En relación con los genes de SCD1 y la transcripción, la actividad biológica de SCD1 incluye la velocidad, escala o alcance de la transcripción de ADN genómico para generar ARN; el efecto de proteínas reguladoras sobre dicha transcripción, el efecto de moduladores de dichas proteínas reguladoras sobre dicha transcripción; más la estabilidad y comportamiento de transcritos de ARNm, procesamiento post-transcripcional, cantidades y recambio de ARNm, y todas las mediciones de la traducción de ARNm en secuencias polipeptídicas. En relación con la actividad biológica de SCD1 en organismos, ésta incluye, aunque sin limitarse a, actividades biológicas que se identifican por su ausencia o deficiencia de procesos de enfermedad o trastornos causados por actividad biológica de SCD1 aberrante en esos organismos. En términos generales, la actividad biológica de SCD1 puede determinarse mediante todos estos y otros medios para analizar propiedades biológicas de proteínas y genes que se conocen en la técnica.

Los ensayos de cribado contemplados por la presente invención también pueden emplear isoformas de SCD de seres humanos u otros organismos que demuestren actividad biológica similar a hSCD1, siempre que consigan identificar con éxito agentes terapéuticos para enfermedades humanas. La equivalencia funcional de delta-9 desaturasas de vertebrados ha sido reconocida por los expertos en la materia. Por consiguiente, realizaciones específicas de la presente invención pueden emplear una o más enzimas delta-9 desaturasa funcionalmente equivalentes de otras especies de vertebrados para identificar agentes terapéuticos útiles para seres humanos. Las desaturasas funcionalmente equivalentes incluyen todas las SCD de ratón, rata, vaca, cerdo o pollo identificadas anteriormente, además de los genes identificados en el grupo UniGene Cluster Hs. 119597 SCD para Estearoil-CoA desaturasa (delta-9 desaturasa). Véase también LocusLink: 6319; OMIM: 604031 o HomoloGene:Hs. 119597. Otras delta-9 desaturasas conocidas incluyen cerdo: 002858 (swiss-prot); y vaca: AF188710 (NCBI, [6651449, Genbank])

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Similitudes de proteínas del organismo modelo seleccionado (organismo, referencia de proteína
y porcentaje de identidad y longitud de la región de aminoácidos (aa) alineada)

2

Diseño y desarrollo de ensayos de cribado de SCD

La presente descripción facilita el desarrollo de ensayos de cribado que pueden basarse en células, extractos celulares (es decir ensayos microsómicos), ensayos sin células (es decir transcripcionales), y ensayos de actividad de proteínas sustancialmente purificadas. Dichos ensayos se basan habitualmente en radiactividad o fluorescencia (es decir polarización por fluorescencia o transferencia de energía por resonancia de fluorescencia o FRET), o pueden medir el comportamiento celular (viabilidad, crecimiento, actividad, forma, fluidez de la membrana, sensibilidad a la temperatura, etc.). Los ensayos de cribado pueden ser ensayos manuales o de bajo rendimiento, o pueden ser cribados de alto rendimiento que están mejorados mecánica/robóticamente.

Los procesos mencionados anteriormente proporcionan la base para los procesos de cribado, incluyendo procesos de cribado de alto rendimiento, para determinar la eficacia de potenciales fármacos terapéuticos y de diagnóstico para tratar las enfermedades descritas en este documento, preferentemente enfermedades en las que una mayor o menor actividad o expresión de estearoil-CoA desaturasa (hSCD1 de la invención) desempeña un papel clave en la mediación de dicha enfermedad.

Como tal, esta invención se refiere a un método para identificar, tal como a partir de una biblioteca de compuestos de ensayo, un agente terapéutico que es útil en seres humanos para el tratamiento de un trastorno o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos VLDL, HDL, LDL, colesterol total o la producción de secreciones de las membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera y similares, que comprende

a): proporcionar un ensayo de cribado que tiene actividad biológica de SCD1;

b): poner en contacto a dicho ensayo de cribado con un compuesto de ensayo; y

c): posteriormente, medir dicha actividad biológica;

en el que un compuesto de ensayo que modula dicha actividad biológica se denomina agente terapéutico, o un análogo del mismo.

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En un aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para identificar, a partir de una biblioteca de compuestos de ensayo, un agente terapéutico que es útil en seres humanos para el tratamiento de un trastorno o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o lipoproteína de muy baja densidad (VLDL) que comprende

a): proporcionar un ensayo de cribado que tiene actividad biológica de estearoil-Coenzima A desaturasa de tipo 1 (SCD1) como componente del mismo;

b): poner en contacto a dicha actividad de SCD1 con un compuesto de ensayo;

c): administrar a un ser humano un compuesto que se haya descubierto que modula dicha actividad en (b); y

d): detectar un cambio en el nivel en suero de triglicéridos o VLDL en dicho ser humano después de dicha administración;

identificando de este modo un agente útil en el tratamiento de un trastorno o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL).

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En una realización, dicho agente es un antagonista o inhibidor de la actividad biológica de SCD1. En otra realización específica de la misma, dicho agente es un antagonista de la actividad biológica de SCD1.

En otra realización, en la que dicho modulador es un inhibidor, dicho inhibidor no inhibe la actividad biológica en un ser humano de una delta-5 desaturasa, delta-6 desaturasa o ácido graso sintetasa.

En una realización de la presente invención, el proceso de ensayo comprende además la etapa de ensayar dicho agente terapéutico para seleccionar adicionalmente compuestos que no inhiban en un ser humano la actividad de delta-5 desaturasa, delta-6 desaturasa o ácido graso sintetasa.

En realizaciones específicas, la presente invención también abarca un proceso en el que dicha actividad biológica de SCD1 se mide mediante un ensayo seleccionado entre:

a): afinidad de unión a polipéptido de SCD1;

b): actividad desaturasa de SCD1 en microsomas;

c): actividad desaturasa de SCD1 en un ensayo en célula completa

d): cuantificación del nivel de expresión génica de SCD1; y

e): cuantificación del nivel de proteínas de SCD1.

Las realizaciones específicas de dicho ensayo pueden emplear una célula recombinante como se describe en este documento.

La presente invención también se refiere a un proceso en el que el compuesto identificado se selecciona además entre aquellos compuestos que no inhiben en seres humanos la actividad biológica de delta-5 desaturasa, delta-6 desaturasa o ácido graso sintetasa.

En otras realizaciones específicas, la presente invención contempla emplear ácido nucleico de SCD1 como se describe en este documento y/o polipéptido de SCD1 como se describe en este documento para su uso en la identificación de compuestos útiles para el tratamiento de un trastorno o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o VLDL.

Los ensayos descritos en este documento requieren esencialmente la medición, directa o indirectamente, de una actividad biológica de SCD1. Los expertos en la materia pueden desarrollar dichos ensayos en base a modelos bien conocidos, y existen muchos ensayos potenciales. Para medir la actividad en células completas de SCD1 directamente, los métodos que pueden usarse para medir cuantitativamente la actividad de SCD incluyen por ejemplo, realizar mediciones de cromatografía en capa fina de productos de reacción de SCD a lo largo del tiempo. Este método y otros métodos adecuados para medir la actividad de SCD son bien conocidos (Henderson Henderson RJ, et al. 1992. Lipid Analysis: A Practical Approach. Hamilton S. Eds. Nueva York y Tokio, Oxford University Press. págs. 65-111.) La cromatografía de gases también es útil para distinguir a los monoinsaturados de los saturados, por ejemplo oleato (18:1) y estearato (18:0) pueden distinguirse usando este método. Una descripción de este método se da en los ejemplos a continuación. Estas técnicas pueden usarse para determinar si un compuesto de ensayo ha influido en la actividad biológica de SCD1, o la velocidad a la cual la SCD introduce un doble enlace en posición cis en su sustrato palmitato (16:0) o estearato (18:0) para producir palmitolieoil-CoA (16:1) u oleioil-CoA (18:1), respectivamente.

En una realización preferida, la invención emplea un ensayo microsómico que tiene una actividad biológica de SCD1 medible. Un ensayo adecuado puede tomarse modificando y aumentando a escala el ensayo microsómico de hígado de rata como fue descrito por Shimomura et al. (Shimomura, I., Shimano, H., Korn, B. S., Bashmakov, Y., y Horton, J. D. (1998). Los tejidos se homogeneizan en 10 volúmenes de tampón A (tampón de potasio 0,1 M, pH 7,4). Las fracciones de membrana microsómica (sedimento de 100.000 x g) se aíslan mediante centrifugado secuencial. Las reacciones se realizan a 37ºC durante 5 minutos con 100 \mug de homogenado de proteína y 60 \muM de [1^{-14}C]-estearoil-CoA (60.000 dpm), 2 mM de NADH, 0,1 M de tampón Tris/HCl (pH 7,2). Después de la reacción, se extraen los ácidos grasos y a continuación se metilan con cloruro acético/metanol al 10%. Los ésteres metílicos de ácido graso saturado y ácido graso monoinsaturado se separan mediante TLC impregnada con AgNO_{3} al 10% usando hexano/éter dietílico (9:1) como solución de desarrollo. Las placas se rocían con 2',7'-diclorofluoresceína al 0,2% en etanol al 95% y los lípidos se identifican en luz UV. Las fracciones se raspan para retirarlas de la placa, y la radiactividad se mide usando un contador de centelleo líquido.

Las realizaciones específicas de dicho ensayo de actividad biológica de SCD1 se aprovechan del hecho de que la reacción de SCD produce, además del producto de acil-CoA graso monoinsaturado, H_{2}O. Si se introduce ^{3}H en las posiciones C-9 y C-10 del sustrato graso acil-CoA, entonces algunos de los protones radiactivos de esta reacción terminarán en el agua. Por lo tanto, la medición de la actividad implicaría las mediciones de agua radiactiva. Para separar el agua marcada del estearato, los investigadores pueden emplear sustratos tales como carbón vegetal, perlas hidrófobas, o simplemente anticuados disolventes planos en pH ácido.

En una realización preferida, los ensayos de cribado miden la actividad biológica de SCD1 indirectamente. Los ensayos de cribado de alto rendimiento convencionales se centran en ensayos de ligando-receptor. Estos pueden estar basados en fluorescencia o basados en luminescencia o detección de radiomarcas. Los inmunoensayos enzimáticos pueden realizarse en una amplia variedad de formatos para identificar compuestos que interactúan con proteínas de SCD1. Estos ensayos pueden emplear inmunoensayos de fluorescencia súbita o fluorescencia resuelta en el tiempo que se conocen bien. El ATP marcado con P^{32}, se usa habitualmente para ensayos de proteína quinasa. Los productos fosforilados pueden separarse para contarlos mediante diversos métodos. La tecnología de ensayo de proximidad por centelleo es un método mejorado de ensayo con radiomarcas. Todos estos tipos de ensayo son particularmente apropiados para ensayos de compuestos que interactúan con proteína de SCD1 purificada o semi-purificada.

En una realización preferida, el ensayo utiliza 3H-estearoil CoA (con el 3H en los átomos de carbono 9 y 10), el sustrato para SCD1. Las desaturación mediante SCD1, produce oleoil CoA y moléculas de 3H-agua. La reacción se realiza a temperatura ambiente, se interrumpe con ácido y a continuación se usa carbón vegetal activado para separar el sustrato sin reaccionar del producto de agua radiactiva. El carbón vegetal se sedimenta y la cantidad de radiactividad en el sobrenadante se determina mediante recuento de centelleo líquido. Este ensayo es específico para la desaturación dependiente de SCD1, según se considera por la diferencia observada al comparar la actividad en tejidos de tipo silvestre y knock-out para SCD1. Además, el método se adapta fácilmente a alto rendimiento ya que está libre de células, se realiza a temperatura ambiente y es relativamente breve (periodo de tiempo de reacción de 1 hora frente al anterior periodo de 2 días). Este procedimiento se ilustra con más detalle en las figuras 17 a 20.

Aunque la presente descripción muestra una realización de trabajo eficaz de la invención, los expertos en la materia son capaces de optimizar el ensayo de diversas maneras, todas las cuales son abarcadas por la invención. Por ejemplo, el carbón vegetal es muy eficaz (> 98%) para retirar la parte no usada de estearoil-CoA pero presenta la desventaja de ser sucio y en algunas condiciones difícil de manejar con pipetas. Puede no ser necesario usar carbón vegetal si el complejo de estearoil-CoA se agrega lo suficiente cuando se acidifica y se centrifuga con una fuerza g moderada. Esto puede ensayarse midiendo la proporción de señal/ruido con y sin carbón vegetal después de una reacción de desaturación. También existen otros reactivos que sedimentarían eficazmente estearoil-CoA para separarla del producto de 3H-agua.

Como se muestra en la figura 20 (Panel A) la cantidad de estearoil-CoA limita la cinética y magnitud de la señal de ^{3}H-DPM monitorizada como actividad de desaturación dependiente de SCD1. Sin embargo, no toda la estearoil-CoA fue consumida por SCD1; > 90% permanece indisponible para SCD1 dado que otras enzimas presentes en los microsomas (por ejemplo, reacciones de acil transferasa) la utilizan como sustrato y compiten con SCD1 y/o estearoil-CoA es inestable en las condiciones del experimento. Estas posibilidades pueden examinarse monitorizando la incorporación de la marca en fosfolípidos o incluyendo una mezcla tampón (Mg++, ATP y CoA) que regeneraría la estearoil-CoA a partir de estearato y CoA.

Como se muestra en la figura 20 (Panel B) el ensayo puede realizarse en un pequeño volumen apropiado para cribado de alto rendimiento. Una realización preferida emplearía una microcentrífuga satisfactoria para centrifugar placas de 96 pocillos.

Los siguientes ensayos también son adecuados para medir la actividad biológica de SCD1 en presencia de potenciales agentes terapéuticos. Estos ensayos también son valiosos como cribas secundarias para seleccionar adicionalmente moduladores, inhibidores o agonistas específicos de SCD1 a partir de una biblioteca de potenciales agentes terapéuticos.

También pueden usarse ensayos de desaturación basados en células. Al rastrear la conversión de estearato en oleato en las células (se sabe que los adipocitos 3T3L1 tienen una alta expresión de SCD1 y captan fácilmente estearato cuando se compleja con BSA) podemos evaluar compuestos que se descubrió que eran inhibidores en el cribado primario para cantidades o características adicionales tales como si son permeables a las células, letales para las células, y/o competentes para inhibir la actividad de SCD1 en las células. Este ensayo basado en células puede emplear una línea celular recombinante que contiene una delta-9 desaturasa, preferentemente hSCD1 (SCD1 humana). El gen recombinante está opcionalmente bajo el control de un promotor inducible y la línea celular sobre-expresa preferentemente la proteína SCD1.

Podrían desarrollarse otros ensayos para rastrear otras isoformas de SCD. Por ejemplo, la SCD2 de rata y de ratón se expresa en el cerebro. En una realización preferida, se prepara una preparación de microsoma a partir del cerebro como se ha hecho anteriormente para SCD1 a partir del hígado. El objeto puede ser descubrir compuestos que serían específicos para SCD1. Esta criba podría comparar el efecto inhibidor del compuesto para SCD1 frente a SCD2.

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Aunque improbable, es posible que un compuesto "afectado" en el ensayo de SCD1 podría resultar de la estimulación de una enzima presente en la preparación de microsoma que utiliza de forma competitiva estearoil-CoA a expensas de aquella disponible para la desaturación dependiente de SCD1. Esto podría interpretarse erróneamente como inhibición de SCD1. Una posibilidad para examinar este problema sería la incorporación en fosfolípidos del lípido insaturado (estearato). Al determinar los efectos de los compuestos sobre la estimulación de la incorporación de estearato en los lípidos, los investigadores son capaces de evaluar esta posibilidad.

Pueden preferirse los ensayos basados en células, ya que dejan al gen de SCD1 en su formato nativo. Particularmente prometedores para el análisis de SCD1 en estos tipos de ensayo son los ensayos de polarización por fluorescencia. La medida en la que la luz permanece polarizada depende del grado en el cual la marca ha rotado en el intervalo de tiempo entre la excitación y la emisión. Dado que la medición es sensible a la tasa de pérdida de estabilidad de las moléculas, puede usarse para medir cambios de las características de fluidez de la membrana que son inducidos por la actividad de SCD1, concretamente la actividad de delta-9 desaturación de la célula. Un ensayo alternativo para SCD1 implica un ensayo FRET. Los ensayos FRET miden la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia que se produce entre un donador de molécula fluorescente y un aceptor, o inactivador. Dicho ensayo puede ser adecuado para medir cambios en las características de fluidez de la membrana o sensibilidad a la temperatura inducidos por la actividad biológica de SCD1.

Los ensayos de cribado de la invención pueden realizarse usando sistemas robóticos de alto rendimiento. En el futuro, los ensayos preferidos pueden incluir dispositivos de chip desarrollados por, entre otros, Caliper, Inc., ACLARA BioSciences, Cellomics, Inc., Aurora Biosciences Inc., y otros.

En otras realizaciones de la presente invención, la actividad biológica de SCD1 también puede medirse mediante un ensayo de flujo de salida de colesterol que mide la capacidad de las células para transferir colesterol a una molécula aceptora extracelular y depende de la función de ABCA1. Un ensayo de flujo de salida de colesterol convencional se muestra en Marcil et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19: 159-169, 1999, incorporado como referencia en este documento para cualquier fin.

Los ensayos preferidos se adaptan fácilmente al formato usado para el cribado de fármacos, que puede estar constituido por un formato de múltiples pocillos (por ejemplo 96 pocillos, 384 pocillos o 1536 pocillos o más). La modificación del ensayo para optimizarlo para el cribado de fármacos incluiría reducir a escala y racionalizar el procedimiento, modificar el método de marcado, alterar el tiempo de incubación, y cambiar el método de cálculo de la actividad biológica de SCD1 etc. En todos estos casos, el ensayo de actividad biológica de SCD1 sigue siendo conceptualmente el mismo, aunque pueden realizarse modificaciones experimentales.

Otro ensayo basado en células preferido es un ensayo de viabilidad celular para el aislamiento de inhibidores de SCD1. La sobre-expresión de SCD reduce la viabilidad celular. Este fenotipo puede aprovecharse para identificar compuestos inhibidores. Esta citotoxicidad puede deberse a la alteración de la composición de ácidos grasos de la membrana plasmática. En una realización preferida, el ADNc de SCD1 humana se pondría bajo el control de un promotor inducible, tal como el sistema de expresión génica inducible Tet-On Tet-Off (Clontech). Este sistema implica preparar una línea celular doble estable. La primera transfección introduce un plásmido regulador y la segunda introduciría la construcción de expresión de SCD inducible. La integración cromosómica de ambas construcciones en el genoma del huésped estaría favorecida al poner a las células transfectadas bajo presión selectiva en presencia del antibiótico apropiado. Una vez establecida la línea celular doble estable, se induciría la expresión de SCD1 usando tetraciclina o un derivado de tetraciclina (por ejemplo Doxiciclina). Una vez que se ha inducido la expresión de SCD1, las células se expondrían a una biblioteca de compuestos químicos para HTS (cribado de alto rendimiento) de inhibidores potenciales. Después de un periodo de tiempo definido, se mediría a continuación la viabilidad por medio de un tinte fluorescente u otro enfoque (por ejemplo turbidez del medio de cultivo tisular). Aquellas células expuestas a compuestos que actúan para inhibir la actividad de SCD1 mostrarían una mayor viabilidad, por encima de la supervivencia de fondo. Por lo tanto, dicho ensayo sería una selección positiva para inhibidores de la actividad de SCD1 en base a la expresión inducible de SCD1 y la medición de la viabilidad celular.

Un enfoque alternativo es interferir en el sistema de desaturasa. El sistema de desaturasa tiene tres proteínas principales: citocromo b_{5}, NADH (P)-citocromo b_{5} reductasa, y desaturasa terminal sensible al cianuro. La desaturasa terminal sensible al cianuro es el producto del gen de SCD. La actividad de SCD depende de la formación de un complejo estable entre los tres componentes mencionados anteriormente. Por lo tanto, cualquier agente que interfiera en la formación de este complejo o cualquier agente que interfiera en el apropiado funcionamiento de cualquiera de los tres componentes del complejo inhibiría eficazmente la actividad de SCD.

Otro tipo de modulador de la actividad de SCD1 implica un dominio de desestabilización de 33 aminoácidos situado en el extremo amino terminal de la proteína pre-SCD1 (Mziaut et al., PNAS 2000, 97: p 8883-8888). Es posible que este dominio pueda escindirse de la proteína de SCD1 mediante una proteasa como las ya conocidas. Esta supuesta actividad proteolítica actuaría, por lo tanto, para aumentar la estabilidad y la semi-vida de SCD1. La inhibición de la supuesta proteasa, por otro lado, provocaría una reducción de la estabilidad y semi-vida de SCD1. Los compuestos que bloquean o modulan la retirada del dominio de desestabilización conducirán, por lo tanto, a reducciones de los niveles de proteína de SCD1 en una célula. Por lo tanto, en algunas realizaciones de la invención, un ensayo de cribado empleará una medición de la actividad proteasa para identificar moduladores de la actividad proteasas de SCD1. La primera etapa es identificar la proteasa específica que es responsable de la escisión de SCD1. Esta proteasa puede integrarse a continuación en un ensayo de cribado. Los ensayos de proteasa convencionales se basan a menudo en el corte y empalme de un sitio de escisión de proteasa (es decir, un péptido que contiene la secuencia de escisión que pertenece al la proteasa en cuestión) en una proteína, que se desactiva después de la escisión. Para este fin puede usarse una proteína de flujo de salida de tetraciclina. Una quimera que contiene la secuencia insertada se expresa en E. coli. Una vez escindida la proteína, la resistencia a tetraciclina se pierde en la bacteria. Se han desarrollado ensayos in vitro en los que un péptido que contiene un sitio de escisión apropiado se inmoviliza en un extremo sobre una fase sólida. El otro extremo está marcado con un radioisótopo, fluoróforo, u otra marca. La pérdida de señal mediada por enzimas desde la fase sólida es paralela a la actividad de proteasa. Estas técnicas pueden usarse tanto para identificar a la proteasa responsable de generar la proteína de SCD1 madura, como para identificar moduladores de esta proteasa para su uso en la reducción de los niveles de SCD1 en una célula.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un proceso para determinar la capacidad de un agente para modular la actividad de una estearoil-CoA desaturasa humana, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto al agente en condiciones adecuadas con la estearoil-CoA desaturasa humana de la invención a un nivel predeterminado de dicho agente;

(b): determinar si la actividad de dicha estearoil-CoA desaturasa cambia después de dicho contacto,

determinando de este modo si dicho agente ha modulado dicha actividad.

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Dicho ensayo puede realizarse como un ensayo sin células empleando una fracción celular, tal como una fracción microsómica, obtenida mediante métodos convencionales de fraccionamiento celular diferencial, de la forma más habitual mediante métodos de ultracentrifugado. En realizaciones específicas, dicha modulación puede ser un aumento o reducción de la actividad de la desaturasa.

Estos resultados sugieren que los inhibidores de la actividad biológica de SCD, tal como hSCD1, en un ser humano, pueden presentar el efecto beneficioso de reducir los niveles de triglicéridos y/o aumentar los de HDL. Además, una mayor actividad de SCD también se asocia con un mayor índice de masa corporal. Este resultado identifica a hSCD1 como un objetivo útil para identificar agentes para modular la obesidad y afecciones relacionadas. En estos resultados de datos humanos, la actividad biológica de SCD se midió mediante el marcador sustituto de la proporción de ácidos grasos 18:1 respecto a 18:0 en la fracción de lípidos en plasma total. Este marcador mide indirectamente la actividad biológica de hSCD1.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un proceso para determinar la capacidad de un agente para modular la actividad de una estearoil-CoA desaturasa humana en células que expresan la estearoil-CoA desaturasa humana de la invención, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto al agente en condiciones adecuadas con una célula eucariota que expresa la estearoil-CoA desaturasa humana de la invención a un nivel predeterminado de dicho agente y en condiciones en las que dicho agente puede o no modular el nivel de expresión de dicha desaturasa;

determinando de este modo si dicho agente ha modulado dicho nivel de expresión.

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En realizaciones específicas de dichos procesos, la modulación puede ser un aumento o una reducción de la actividad de la desaturasa y las células útiles en estos procesos son preferentemente células de mamífero, de la forma más preferente células humanas, e incluyen cualquiera de las células recombinantes descritas en este documento.

Líneas celulares recombinantes de SCD1

En algunas realizaciones, la presente invención contempla el uso de un gen o proteína de SCD1 en una línea celular recombinante. Las líneas celulares recombinantes de SCD1 pueden generarse usando técnicas conocidas en la técnica, y aquellas mostradas más específicamente a continuación.

La presente invención también se refiere a vectores que contienen polinucleótidos de la presente invención, y células huésped que están manipuladas genéticamente con vectores de la invención, especialmente cuando dichas células dan como resultado una línea celular que puede usarse para el ensayo de la actividad de hSCD1, y la producción de polipéptidos de SCD1 mediante técnicas recombinantes.

Las células huésped son preferentemente células eucariotas, preferentemente células de insecto de la especie Spodoptera, de la forma más especial células SF9. Las células huésped se manipulan genéticamente (se transducen o transforman o transfectan) con los vectores, especialmente baculovirus) de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. Dichos vectores pueden incluir plásmidos, virus y similares. Las células huésped manipuladas se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la presente invención. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos mediante técnicas recombinantes. Por lo tanto, por ejemplo, el polinucleótido puede estar incluido en uno cualquiera de diversos vectores de expresión para expresar un polipéptido. Dichos vectores incluyen secuencias cromosómicas, no cromosómicas y de ADN sintético, por ejemplo derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmido de levadura; vectores obtenidos de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, ADN viral tal como de virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, y virus pseudorabies. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector, siempre que sea replicable y viable en el huésped.

La secuencia de ADN apropiada puede insertarse en el vector mediante diversos procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio(s) apropiado(s) de endonucleasa de restricción mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que dichos procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la materia.

La secuencia de ADN en el vector de expresión está unida de forma operativa a una secuencia(s) de control de la expresión apropiada(s) (promotor) para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de dichos promotores, pueden mencionarse: el promotor LTR o SV40, el promotor de E. coli. lac o trp, el promotor P_{L} de fago lambda y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferentemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas tal como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para el cultivo de células eucariotas, o tal como resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se ha descrito anteriormente en este documento, así como un promotor o secuencia de control apropiada, puede emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la proteína. Dicha transformación será permanente y, por lo tanto, dará origen a una línea celular que puede usarse para ensayos adicionales. Dichas líneas celulares usadas para ensayar serán habitualmente células de mamífero, especialmente células humanas.

Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse células de Spodoptera Sf9 (y otros sistemas de expresión en insecto) y animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales, en incluso células bacterianas, etc., todas las cuales son capaces de expresar los polinucleótidos descritos en este documento. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del conocimiento de los expertos en la materia en base a las enseñanzas de este documento. Para su uso en los métodos de ensayo descritos en este documento, se prefieren células de mamífero, especialmente células humanas.

Más particularmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las secuencias como se ha descrito de forma amplia anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, especialmente cuando se usa el sistema de expresión de Baculovirus/vector SF9, en el que se ha insertado una secuencia, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido de forma operativa a la secuencia. Gran cantidad de vectores y promotores adecuados son conocidos por los expertos en la materia, y están disponibles en el mercado. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo; Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pBluescript SK, pBSKS, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); pTRC99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido o vector, siempre que sean replicables y viables en el huésped.

Pueden seleccionarse regiones promotoras de cualquier gen deseado usando vectores de CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos nombrados particulares incluyen lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucariotas incluyen el inmediato temprano de CMV, HSV timidina quinasa, temprano y tardío de SV40, secuencias LTR de retrovirus, y metalotioneína-l de ratón. La selección del vector y promotor apropiado está dentro del nivel de especialización habitual en la técnica.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a células huésped que contienen las construcciones descritas anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede realizarse mediante transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-Dextrano, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Una realización preferida utiliza expresión a partir de células de insecto, especialmente células SF9 de Spodoptera frugiperda.

Las construcciones en células huésped pueden usarse de manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los polipéptidos de la invención pueden producirse sintéticamente mediante síntesis peptídica convencional.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el control de promotores apropiados. Los sistemas de traducción sin células también pueden emplearse para producir dichas proteínas usando ARN obtenidos de las construcciones de ADN de la presente invención. Vectores de clonación y expresión apropiados para su uso con huéspedes procariotas y eucariotas son descritos, por ejemplo, por Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Wu et al, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Nueva York, NY, 1997), Recombinant Gene Expression Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997) y Current Protocols in Molecular Biology, (Ausabel et al, Eds.,), John Wiley & Sons, NY (1994-1999), cuyas descripciones se incorporan por la presente como referencia en su totalidad.

La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por células eucariotas, especialmente células de mamífero, de la forma más especial células humanas, aumenta al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en posición cis, habitualmente aproximadamente de 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación pb 100 a 270, un potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo el gen de resistencia a ampicilina de E. coli y S. cerevisiae, gen Trp1, y un promotor obtenido de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Dichos promotores pueden obtenerse de operones que codifican enzimas glucolíticas tales como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de la traducción, y preferentemente, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de proteína traducida en el espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal o C-terminal que otorga características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado.

El uso de un sistema de expresión basado en Baculovirus es un método preferido y conveniente de formación de los recombinantes descritos en este documento. Los baculovirus representan una gran familia de virus de ADN que infectan en su mayoría a insectos. El prototipo es el virus de poliedrosis nuclear (AcMNPV) de Autographa californica, que infecta a una serie de especies de lepidópteros. Una ventaja del sistema de baculovirus es que los baculovirus recombinantes pueden producirse in vivo. Después de la cotransfección con un plásmido de transferencia, la mayor parte de la progenie tiende a ser de tipo silvestre y gran cantidad del procesamiento posterior implica el cribado. Para ayudar a identificar las placas, están disponibles sistemas especiales que utilizan mutantes de deleción. A modo de ejemplo no limitante, se ha descrito en la bibliografía un derivado de AcMNPV recombinante (llamado BacPAK6) que incluye sitios diana para la nucleasa de restricción Bsu36I cadena arriba del gen de polihedrina (y con el ORF (marco abierto de lectura) 1629) que codifica un gen de la cápsida (esencial para la viabilidad del virus). Bsf36I no se corta en ningún otro punto del genoma y la digestión del BacPAK6 deleciona una porción del ORF 1629, haciendo de este modo al virus no viable. Por lo tanto, con un protocolo que implica un sistema como ADN de BacPAK6 cortado con Bsu36I, la mayor parte de la progenie no es viable de modo que la única progenie obtenida después de la co-transfección del plásmido de transferencia y BacPAK6 digerido es la recombinante, dado que el plásmido de transferencia, que contiene el ADN exógeno, se inserta en el sitio Bsu36I, haciendo de este modo al recombinante resistente a la enzima. [véase Kitts y Possee, A method for producing baculovirus expression vectors at high frequency, BioTechniques, 14, 810-817 (1993). Para procedimientos generales, véase King y Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman y Hall, Nueva York (1992) y Recombinant Gene Expression Protocols, en Methods in Molecular Biology, Vol. 62, (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997), en el capítulo 19, págs 235-246.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención se refiere además a vectores que comprenden un polinucleótido de la invención y a células eucariotas recombinantes que expresan la estearoil-CoA desaturasa de la presente invención, preferentemente donde dicha célula es una célula de mamífero, de la forma más preferente una célula humana.

La presente invención se refiere además a procesos para usar los polinucleótidos, enzimas y células descritos en este documento en un proceso para determinar la capacidad de un agente para modular la expresión de dicha estearoil-CoA desaturasa humana en células que expresan dicha estearoil-CoA desaturasa humana de la invención, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto al agente en condiciones adecuadas con una célula eucariota que expresa la estearoil-CoA desaturasa humana de la invención a un nivel predeterminado de dicho agente;

(b): determinar si el nivel de expresión de dicha estearoil-CoA desaturasa cambia después de dicho contacto,

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Como alternativa, el ensayo de cribado puede emplear una construcción de vector que comprende la secuencia promotora de hSCD1 de la SEC ID Nº 3 unida de forma operativa a un gen informador. Dicho vector puede usarse para estudiar el efecto de potenciales proteínas reguladoras de la transcripción, y el efecto de compuestos que modulan el efecto de esas proteínas reguladoras, sobre la transcripción de SCD1. Un ejemplo de este tipo de vector es el plásmido pSCD-500 descrito en los ejemplos a continuación. Las construcciones de gen informador tales como ésta se usan habitualmente para indicar si un compuesto de ensayo ha tenido éxito en la activación de la transcripción de genes bajo el control de un promotor particular.

En realizaciones específicas, la presente invención contempla un proceso en el que dicha modulación es un aumento o reducción de dicho nivel de expresión y donde dicha célula puede ser una célula de mamífero, especialmente una célula humana, incluyendo cualquiera de las células recombinantes descritas en este documento. En una realización, el nivel de expresión se determina determinando el nivel de ARN mensajero producido después del contacto de dicha célula con dicho agente.

Los factores que pueden modular la expresión génica incluyen factores de transcripción tales como, aunque sin limitarse a, receptores X de retinoide (RXR), factores de transcripción del receptor activado por la proliferación de peroxisomas (PPAR), las proteínas de unión al elemento de respuesta a esteroides (SREBP-1 y SREBP-2), REV-ERB\alpha, ADD-1, EBP\alpha, proteína de unión a CREB, P300, HNF 4, RAR, LXR, y ROR\alpha, NF-Y, C/EBPalfa, PUFA-RE y proteínas y reguladores de la transcripción relacionados. Los ensayos de cribado diseñados para evaluar la capacidad de los compuestos de ensayo para modular la capacidad de estos factores de transcripción para transcribir SCD1 también son contemplados por esta invención.

Los beneficios fisiológicos de un aumento o reducción de la actividad o expresión de hSCD1 incluyen, aunque sin limitarse a, menos triglicéridos en plasma y/o más HDL en plasma que conduce a un beneficio cardioprotector, beneficio terapéutico en diabetes de tipo II, pérdida de peso, secreciones glandulares mejoradas, y una menor probabilidad de desarrollar tumores. Por lo tanto, la determinación de la capacidad de agentes de modular dicha actividad o expresión produce la oportunidad de descubrir agentes terapéuticos útiles que producen dichos efectos.

Además, las variaciones de la expresión génica, función, estabilidad, actividad catalítica y otras características de hSCD1 pueden deberse a variaciones alélicas en las secuencias de polinucleótidos que codifican dichas enzimas. Los procesos descritos de acuerdo con la presente invención pueden usarse, del mismo modo, para determinar dichos efectos genómicos sobre la expresión de hSCD1. Usando los procesos de la presente invención, dichas variaciones pueden determinarse a nivel de polimorfismo de ADN con el gen y/o secuencias promotoras de hSCD1. Dichos efectos conducen al esclarecimiento de asociaciones entre dichos polimorfismos y la predisposición al cáncer, enfermedad neurológica, enfermedad cutánea, obesidad, diabetes, función inmune y metabolismo de lípidos mediante análisis genéticos basados en la población y en la familia.

Finalmente, los expertos en la materia son capaces de confirmar la relevancia de hSCD1 para la salud humana mediante analogía con modelos animales. Modelos de enfermedad en animales bien conocidos pueden usarse para evaluar el efecto de un modulador de hSCD1 sobre el crecimiento, desarrollo, o proceso de enfermedad en estos animales. Adicionalmente, los modelos incluyen animales multicelulares modificados genéticamente, tales como ratones knock-out o knock-in (como se detalla en los ejemplos a continuación). En un aspecto general, la presente invención se refiere a un proceso para identificar un agente modulador de SCD1, que comprende:

a): poner en contacto en condiciones fisiológicas un agente químico y una molécula que tiene o induce actividad de SCD1;

b): detectar un cambio en la actividad de dicha molécula que tiene o induce actividad de SCD1 después de dicha puesta en contacto;

identificando de este modo un agente modulador de SCD1.

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En realizaciones específicas de la invención, dicha molécula que tiene o induce actividad de SCD1 es un polipéptido que tiene dicha actividad, o un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene dicha actividad, o un polipéptido que modula la actividad de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene dicha actividad.

En realizaciones específicas, dicho cambio de actividad es un aumento de la actividad o es una reducción de la actividad.

En procesos in vivo, dicho cambio de actividad de SCD1 en dicho animal es una reducción de la actividad, preferentemente donde dicho agente modulador de SCD1 no inhibe sustancialmente la actividad biológica de una delta-5 desaturasa, delta-6 desaturasa o ácido graso sintetasa.

En procesos tales como los que se acaban de describir, el cambio detectado de actividad de SCD1 se detecta detectando un cambio de cualquiera, algunas o todas de las siguientes:

a): afinidad de unión al polipéptido de SCD1;

b): actividad de SCD1 desaturasa en microsomas;

c): actividad de SCD1 desaturasa en una célula completa;

d): expresión génica de SCD1; o

e): nivel de proteínas de SCD1.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también utiliza una línea celular recombinante que comprende una proteína de SCD1 recombinante como se describe en este documento. En una realización semejante, la célula completa de (c) anteriormente se obtiene de dicha línea celular, preferentemente en la que dicho agente modulador de SCD1 no inhibe en seres humanos la actividad biológica de delta-5 desaturasa, delta-6 desaturasa o ácido graso sintetasa.

Una línea celular recombinante de la invención también puede comprender la secuencia de ácido nucleico promotora de SCD1 de la SEC ID Nº 1 unida de forma operativa a una construcción de gen informador. En una realización específica de la misma, la célula completa de (c) anteriormente se obtiene de una célula recombinante de dicha línea celular.

De acuerdo con la descripción de este documento, la presente invención también utiliza una estearoil-CoA desaturasa aislada codificada por la secuencia de polinucleótidos que comprende la SEC ID Nº [ADNc de SCD1] así como una construcción de gen informador que comprende la secuencia de ácido nucleico promotora de SCD1 de la SEC ID Nº 1 unida de forma operativa a un gen informador, que incluye ventajosamente vectores útiles que comprenden dichos ácidos nucleicos y construcciones de los mismos. Del mismo modo, la presente invención también contempla un polipéptido aislado que tiene actividad de estearoil-CoA reductasa y un proceso como se describe en este documento que identifica con éxito un agente químico que se une a, o interactúa con, dicho polipéptido, proceso que comprende:

a): poner en contacto a dicho un polipéptido, o una célula que expresa dicho polipéptido, con un agente químico; y

b): detectar la unión o interacción del agente químico con dicho polipéptido.

En realizaciones específicas de los procesos recién descritos, la unión del agente químico al polipéptido se detecta mediante un método seleccionado entre el grupo constituido por:

a): una detección directa de la unión de agente químico/polipéptido;

b): detección de la unión mediante un ensayo de unión competitiva; y

c): detección de la unión mediante un ensayo de la actividad biológica de SCD1.

En dichos procesos, la modulación de la actividad de dicho polipéptido se detecta mediante un proceso que comprende poner en contacto al polipéptido o una célula que expresa el polipéptido con un compuesto que se une al polipéptido en cantidad suficiente para modular la actividad del polipéptido. En realizaciones específicas de este proceso, la molécula que tiene o induce actividad de SCD1 se selecciona entre el grupo constituido por un ácido nucleico de SCD1 y/o un polipéptido de SCD1 como se describe en este documento.

Después de la identificación de agentes químicos que tienen la actividad moduladora deseada, estos pueden usarse en un proceso para tratar a un animal, especialmente un ser humano, tal como un paciente humano, aquejado de una enfermedad o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o VLDL que comprende inhibir la actividad de SCD1 en dicho ser humano. En una realización preferida, dicha inhibición de la actividad de SCD1 no está acompañada por la inhibición de la actividad de delta-5 desaturasa, delta-6 desaturasa o ácido graso sintetasa. Un paciente humano aquejado de un trastorno o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o VLDL puede tratarse administrando a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente cuya actividad terapéutica se identificó en primer lugar mediante el proceso de la invención.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a un modulador de la actividad de SCD1 y que es útil en seres humanos para el tratamiento de un trastorno o afección relacionada con los niveles en suero de triglicéridos o VLDL, donde dicha actividad se identificó en primer lugar por su capacidad para modular la actividad de SCD1, especialmente donde dicha modulación se detectó en primer lugar usando un proceso como se describe en este documento de acuerdo con la presente invención. En una realización preferida de la misma, dicho agente de modulación no inhibe la ácido graso sintetasa, delta-5 desaturasa o delta-6 desaturasa de seres humanos.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un proceso para identificar un agente de modulación de delta-9 estearoil-CoA desaturasa de vertebrado, que comprende:

a): poner en contacto en condiciones fisiológicas a un agente químico y una molécula que tiene o induce actividad de delta-9 estearoil-CoA desaturasa de vertebrado;

b): detectar un cambio en la actividad de dicha molécula que tiene o induce actividad de delta-9 estearoil-CoA desaturasa de vertebrado después de dicha puesta en contacto;

identificando de este modo un agente de modulación de delta-9 estearoil-CoA desaturasa de vertebrado.

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De acuerdo con lo anterior, el agente de modulación de SCD1 identificado mediante el método de la presente invención puede usarse en un proceso para tratar a un paciente humano aquejado de una enfermedad o trastorno relacionado con los niveles en suero de triglicéridos, VLDL, HDL, LDL, colesterol total, transporte inverso de colesterol o producción o secreción de las membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera, y parámetros similares, que comprende administrar a dicho paciente humano una cantidad eficaz terapéutica de un agente para el que dicha actividad terapéutica se identificó mediante un proceso como se describe en este documento de acuerdo con la invención.

En una realización preferida de dichos procesos, el agente de modulación no inhibe sustancialmente la ácido graso sintetasa, delta-5 desaturasa o delta-6 desaturasa de seres humanos.

Compuestos de ensayo/Moduladores/Fuentes de bibliotecas

De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se refiere a agentes terapéuticos y/o de diagnóstico, independientemente del tamaño o peso, eficaz para tratar y/o diagnosticar y/o prevenir cualquiera de las enfermedades descritas en este documento, preferentemente donde dichos agentes tienen la capacidad de modular la actividad y/o expresión de la hSCD1 descrita en este documento, y de la forma más preferente donde se ha determinado que dichos agentes tiene dicha actividad, mediante al menos uno de los ensayos de cribado descritos de acuerdo con la presente invención.

Los compuestos de ensayo se compilan generalmente en bibliotecas de dichos compuestos, y un objeto clave de los ensayos de cribado de la invención es seleccionar qué compuestos son relevantes a partir de bibliotecas que tienen cientos de miles, o millones de compuestos que tienen eficacia terapéutica desconocida.

Los expertos en el campo del descubrimiento y desarrollo de fármacos entenderán que la fuente precisa de extractos o compuestos de ensayo no es crítica para el(los) procedimiento(s) de cribado de la invención. Por consiguiente, puede cribarse virtualmente cualquier número de extractos o compuestos químicos usando los métodos ejemplares descritos en este documento. Los ejemplos de dichos extractos o compuestos incluyen, aunque sin limitarse a, extractos a base de plantas, hongos, procariotas o animales, caldos de fermentación, y compuestos sintéticos, así como la modificación de compuestos existentes. También están disponibles muchos métodos para generar síntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo semi-síntesis o síntesis total) de cualquier número de compuestos químicos, incluyendo, aunque sin limitarse a, compuestos a base de sacáridos, lípidos, péptidos y ácidos nucleicos. Hay bibliotecas de compuestos sintéticos disponibles en el mercado de Brandon Associates (Merrimack, NH) y Aldrich Chemical (Milwaukee, WI). Como alternativa, hay bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales disponibles en el mercado de una serie de fuentes, incluyendo Biotics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FL), y PharmaMar, EE.UU. (Cambridge, MA). Además, se producen bibliotecas producidas de forma natural y sintética, si se desea, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante métodos de extracción y fraccionamiento convencionales. Además, si se desea, cualquier biblioteca o compuesto se modifica fácilmente usando métodos químicos, físicos o bioquímicos convencionales.

Por lo tanto, en un aspecto la presente invención se refiere a agentes capaces de modular la actividad y/o expresión de estearoil-CoA desaturasa humana 1 (hSCD1) como se describe en este documento, especialmente donde dicha actividad de modulación se determinó en primer lugar usando un ensayo que comprende hSCD1 o un gen que codifica hSCD1, o un ensayo que mide la actividad de hSCD1. Como se usa en este documento, la expresión "capaz de modular" se refiere a la característica de dicho agente por la cual dicho agente tiene el efecto de cambiar la actividad biológica global de hSCD1, aumentando o reduciendo dicha actividad, en condiciones adecuadas de temperatura, presión, pH y similares para facilitar dicha modulación hasta un punto en que puede ser detectada cualitativa o cuantitativamente y donde dicha modulación puede ocurrir en un entorno in vitro o in vivo. Además, aunque el término "modulación" se usan en este documento para indicar un cambio de actividad, más específicamente un aumento o una reducción de dicha actividad, el término "actividad" no debe limitarse a actividad enzimática específica en solitario (por ejemplo, según se mide en unidades por miligramo o alguna otra unidad adecuada de actividad específica) sino que incluye otros efectos directos e indirectos de la proteína, incluyendo aumentos de la actividad enzimática debidos no a cambios de la actividad enzimática específica sino debidos a cambios (es decir, modulación) de la expresión de polinucleótidos que codifican y expresan dicha enzima hSCD1. La actividad de SCD1 humana también puede estar influida por agentes que se unen específicamente a sustratos de hSCD1. Por lo tanto, el término "modulación" como se usa en este documento significa un cambio de la actividad de hSCD1 independientemente del nivel genético molecular de dicha modulación, sea éste un efecto de la enzima per se o un efecto de los genes que codifican la enzima o sobre el ARN, especialmente ARNm, implicado en la expresión de los genes que codifican dicha enzima. Por lo tanto, la modulación por dichos agentes puede producirse a nivel del ADN, ARN o proteína enzimática y puede determinarse in vivo o ex vivo.

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En realizaciones específicas del mismo, dicho ensayo es cualquiera de los ensayos descritos en este documento de acuerdo con la invención. Además, el(los) agente(s) contemplado(s) por la presente descripción incluyen agentes de cualquier tamaño o carácter químico, moléculas grandes o pequeñas, incluyendo proteínas, tales como anticuerpos, ácidos nucleicos, ARN o ADN, y pequeñas estructuras químicas, tales como pequeñas moléculas orgánicas.

En otros aspectos, la presente invención contempla agentes en los que dicho agente es útil para tratar, prevenir y/o diagnosticar una enfermedad o afección que se identifica como relacionada con SCD1 de acuerdo con esta invención. Realizaciones específicas se refieren a situaciones en las que la enfermedad o afección incluye, aunque sin limitarse a, niveles en suero de triglicéridos, VLDL, HDL, LDL, colesterol total, transporte inverso de colesterol o producción de secreciones de membranas mucosas, ácidos grasos monoinsaturados, ésteres de cera, y similares, trastornos de colesterol, lipidemias, enfermedad cardiovascular, diabetes, obesidad, calvicie, enfermedades cutáneas, cáncer y esclerosis múltiple, especialmente donde la enfermedad es una enfermedad cardiovascular o una enfermedad cutánea o donde la afección es calvicie. En una realización preferida, dichos agentes aumentarán los niveles de HDL en un paciente y/o reducirán los niveles de triglicéridos en un paciente. Cualquiera o ambos efectos están asociados directamente con un riesgo reducido de enfermedad cardiovascular y enfermedad de arteria coronaria.

Algunos de los moduladores conocidos de la actividad de SCD1 incluyen ácido linoleico conjugado, especialmente el isómero trans-10, cis-12, y compuestos de tiazoladindiona tales como troglitazona.

Aunque está previsto que pueda usarse cualquier mecanismo adecuado para la inhibición o modulación de la actividad de SCD1, se prevén tres ejemplos específicos de clases de inhibidores. Una clase incluye aquellos inhibidores que inhiben eficazmente la expresión de SCD1, tal como compuestos de tiazoladindiona y ácidos grasos poliinsaturados. Una segunda clase incluye aquellos inhibidores que inhiben eficazmente la actividad enzimática de SCD1, tal como tia-ácidos grasos, ácidos grasos ciclopropenoides, y algunos isómeros de ácido linoleico conjugado. Finalmente, la tercera clase de inhibidores incluye aquellos agentes que son capaces de interferir en las proteínas esenciales para el sistema de desaturasa, tales como aquellos agentes que interfieren con citocromo b_{5}, NADH (P)-citocromo b_{5} reductasa, y desaturasa terminal sensible a cianuro.

Para inhibir eficazmente la expresión del gen de SCD1, se prevé que podría utilizarse cualquier agente capaz de alterar la transcripción del gen de SCD1. Dado que SCD1 está regulada por varios factores de transcripción conocidos (por ejemplo PPAR-\gamma, SREBP), puede usarse cualquier agente que afecte a la actividad de dichos factores de transcripción para alterar la expresión del gen de SCD1. Un grupo de dichos agentes incluye compuestos de tiazoladina que se sabe que activan PPAR-\gamma e inhiben la transcripción de SCD1. Estos compuestos incluyen Pioglitazona, Ciglitazona, Englitazona, Troglitazona, y BRL49653. Otros agentes inhibidores pueden incluir ácidos grasos poliinsaturados, tales como ácido linoleico, ácido araquidónico y ácido dodecahexanoico, que también inhiben la transcripción de SCD1.

Para inhibir eficazmente la actividad enzimática de la proteína SCD1, está previsto que podría utilizarse cualquier agente capaz de alterar la actividad de la proteína SCD1. Por ejemplo, algunos isómeros de ácido linoleico conjugado son inhibidores eficaces de la actividad de SCD1. Específicamente, se sabe que el ácido linoleico conjugado Cis-12, trans-10 inhibe eficazmente la actividad enzimática de SCD y reduce la abundancia de ARNm de SCD1, mientras que el ácido linoleico conjugado Cis-9, trans-11 no. También se sabe que los ácidos grasos ciclopropenoides, tales como los descubiertos en semillas de esterculia y algodón, inhiben la actividad de SCD. Por ejemplo, el ácido estercúlico (ácido 8-(2-octil-ciclopropenil)octanoico) y el ácido malválico (ácido 7-(2-octil-ciclopropenil)heptanoico) son derivados de C18 y C16 de ácidos grasos eterculoil y malvaloil, respectivamente, que tienen anillos de ciclopropeno en sus posición \Delta9. Estos agentes inhiben la actividad de SCD inhibiendo la desaturación de \Delta9. Otros agentes incluyen tia-ácido grasos, tales como ácido 9-tiaesteárico (también llamado ácido 8-noniltiooctanoico) y otros ácidos grasos con un resto sulfoxi.

Los moduladores conocidos de la actividad delta-9 desaturasa o no se sabe que sean útiles para tratar las enfermedades y trastornos vinculados a la actividad biológica de SCD1 como se reivindica en esta invención, o son por otra causa agentes terapéuticos insatisfactorios. Los tia-ácidos grasos, ácidos linoleicos conjugados y ácidos grasos de ciclopropeno (ácido malválico y ácido estercúlico) no son útiles a dosis fisiológicas razonables, ni son inhibidores específicos de la actividad biológica de SCD1, en su lugar demuestran inhibición cruzada de otras desaturasas, en particular las desaturasas delta-5 y delta-6 mediante los ácidos grasos de ciclopropeno. Estos compuestos pueden ser útiles para establecer moduladores de control o prueba de los ensayos de cribado de la invención, pero no están sometidos a las reivindicaciones de esta invención. Los moduladores de SCD1 preferidos de la invención no tienen ningún impacto significativo o sustancial sobre clases no relacionadas de proteínas. En algunos casos, ensayos específicos para otras proteínas, tales como actividad de delta-5 y delta-6, también deberán ensayarse para asegurar que los compuestos identificados de la invención no demuestran inhibición cruzada significativa o sustancial.

Los inhibidores no específicos conocidos de SCD1 pueden ser útiles en el diseño racional de un agente terapéutico adecuado para la inhibición de SCD1. Los tres inhibidores tienen diversas sustituciones entre los carbonos Nº 9 y Nº 10; adicionalmente requieren la conjugación a Co-A para ser eficaces; y están situados probablemente en un sitio activo relativamente hidrófobo. Esta información combinada con las coordenadas de rayos X conocidas para el sitio activo de SCD de vegetales (soluble) puede ayudar al proceso "simulado por ordenador" del diseño racional de fármacos para inhibidores terapéuticamente aceptables específicos para SCD1.

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Esta invención también proporciona un anticuerpo que se une específicamente a SCD1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en los números de entrada de SwissProt enumerados anteriormente, y que, de este modo, inhibe la actividad de SCD1. El presente anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a SCD de los mismos. En una realización, el anticuerpo está aislado, es decir es un anticuerpo libre de cualesquiera otros anticuerpos. Los métodos para preparar y aislar anticuerpos se conocen bien en la técnica (Harlow, et al. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor
Laboratory).

Esta invención también proporciona un oligonucleótido antisentido que se une específicamente a ARNm de SCD1 humana, y que, de este modo, reduce el nivel de transcripción génica de SCD1. Los métodos para preparar y usar moléculas antisentido contra genes diana conocidos se conocen en la técnica (Agarwal, S. (1996) Antisense Therapeutics. Totowa, NJ, Humana Press, Inc.)

Química Combinatoria y Medicinal

Típicamente, un ensayo de cribado, tal como un ensayo de cribado de alto rendimiento, identificará varios o incluso muchos compuestos que modulan la actividad de la proteína de ensayo. El compuesto identificado por el ensayo de cribado puede modificarse adicionalmente antes de usarlo en seres humanos como agente terapéutico. Típicamente, se realiza química combinatoria sobre el modulador, para identificar posibles variantes que tengan absorción, biodistribución, metabolismo y/o excreción mejoradas, u otros aspectos terapéuticos importantes. Lo invariable y esencial es que los compuestos mejorados comparten un grupo o grupos activos particulares que son necesarios para la modulación deseada de la proteína diana. Muchas técnicas de química combinatoria y química medicinal se conocen bien en la técnica. Cada una añade o retira uno o más restos constituyentes del compuesto para generar un análogo modificado, análogo que se somete a ensayo de nuevo para identificar compuestos de la invención. Por lo tanto, como se usa esta invención, los compuestos terapéuticos identificados usando un ensayo de barrido de SCD1 de la invención incluyen compuestos reales identificados de este modo, y cualesquiera análogos y modificaciones realizadas a un compuesto que se haya identificado de este modo que sean útiles para el tratamiento de los trastornos reivindicados en este documento.

Preparaciones Farmacéuticas y Dosificaciones

En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden los polinucleótidos, polipéptidos u otros agentes químicos, incluyendo agentes terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, tales como pequeñas moléculas orgánicas, descritas en este documento de acuerdo con la presente invención donde dichos polinucleótidos, polipéptidos u otros agentes se suspenden en un vehículo farmacéuticamente aceptable, vehículo que incluye cualquier diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitarse a, líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol, y similares, incluyendo vehículos útiles para formar pulverizadores para administración nasal y otra administración por el tracto respiratorio o para administración al sistema oftálmico. Una exhaustiva discusión de vehículos, diluyentes y otros excipientes farmacéuticamente aceptables se presenta en el documento REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. última edición).

Los inhibidores utilizados anteriormente pueden suministrarse a un sujeto usando cualquiera de los sistemas de administración utilizados habitualmente conocidos en la técnica, según sea apropiado para el inhibidor seleccionado. Los sistemas de administración preferidos incluyen inyección intravenosa o administración oral, dependiendo de la capacidad del inhibidor seleccionado de ser absorbido en el tracto digestivo. También puede usarse cualquier otro sistema de administración apropiado para la administración de pequeñas moléculas, tales como parches cutáneos, según sea apropiado.

Diagnóstico y Farmacogenómica

En la realización de los procedimientos de la presente invención, debe entenderse, por supuesto, que la referencia a tampones, medios, reactivos, células, condiciones de cultivo particulares y similares no pretenden ser limitantes, sino que deben leerse como incluyentes de todos los materiales relacionados que un experto en la materia reconocería como de interés o valor en el contexto particular en el que se presenta esa discusión. Por ejemplo, a menudo es posible sustituir un sistema tampón o medio de cultivo por otro y seguir obteniendo resultados similares, si no idénticos. Los expertos en la materia tendrán suficiente conocimiento de dichos sistemas y metodologías para ser capaces, sin excesiva experimentación, de realizar dichas sustituciones para que sirvan de forma óptima a sus propósitos para usar los métodos y procedimientos descritos en este documento.

Al aplicar la descripción, debe tenerse muy en cuenta que otras y diferentes realizaciones de los métodos descritos de acuerdo con la presente invención sin duda se les sugerirán por sí mismas a los expertos en la materia.

Ejemplo 1 La alteración del gen de Estearoil-CoA desaturasa 1 en ratones causa niveles de triglicéridos en plasma reducidos, así como otros defectos del metabolismo de lípidos

Este ejemplo identifica, por primera vez, actividades biológicas de SCD1 específicas en ratón caracterizando un ratón knock-out para un gen específico de SCD1.

Para investigar las funciones fisiológicas de SCD, generamos ratones knock-out para SCD1 (SCD1-/-). El perfil de lipoproteínas de los ratones knock-out para SCD1 (knock-out) demuestra una llamativa reducción de los niveles de triglicéridos (es decir, VLDL) mientras se mantienen niveles de HDL y LDL aproximadamente normales. Este resultado confirma que una mutación en SCD1 es una mutación causante de un perfil bajo de triglicéridos (TG) en ratones, y es distinto de otras isoformas de SCD en el ratón a este respecto. Debido a la severidad de este fenotipo, está claro que es improbable que otras isoformas de SCD afecten a los niveles de TG en una medida tan grande.

Alteración dirigida del gen de SCD1

La figura 1A muestra la estrategia usada para hacer knock-out al gen SCD1. El gen SCD1 de ratón incluye 6 exones. Los 6 primeros exones del gen se sustituyeron por una casete resistente a neomicina mediante recombinación homóloga, dando como resultado la sustitución de la región codificante completa del gen de SCD1 (figura 1A). El vector se sometió a electroporación en células madre embrionarias y los clones que integraban la casete neo se seleccionaron mediante crecimiento en geneticina. Se inyectaron clones ES dirigidos en blastocistos C57BI/6 produciendo cuatro líneas de ratones quiméricos que transmitían el alelo alterado a través de la línea germinal. Los ratones mutantes eran viables y fértiles y se multiplicaron con las distribuciones mendelianas predichas. Un cribado basado en PCR para evaluar la fijación como objetivo con éxito de genes del locus de SCD1 se muestra en la figura 1 B. Para determinar si la expresión del gen de SCD1 se había suprimido realizamos análisis de transferencia de Northern (figura 1C) el ARNm de SCD1 es indetectable en el hígado de ratones SCD1-/- y se reduce en aproximadamente el 50% en ratones SCD +/-. El ARNm de SCD2 se expresaba a niveles bajos tanto en ratones SCD1-/- como en ratones de tipo silvestre. De forma coherente con los resultados de la transferencia de Northern, el análisis de transferencia de Western no mostró ninguna proteína de SCD inmunorreactiva en el hígado de ratones SCD-/-, mientras que la proteína de SCD1 era detectable en el tejido hepático tanto de heterocigotos como de tipo silvestre de manera dependiente de la dosificación génica. La actividad enzimática de SCD en el hígado, según se mide mediante la velocidad de conversión de [1-^{14}C] estearoil-CoA en [1-^{14}C] oleato (figura 1E) que era alta en los ratones de tipo silvestre pero era indetectable en los extractos totales de hígados de los ratones SCD1-/-.

Análisis de lípidos

El análisis del éster de colesterol en el hígado (0,8 \pm 0,1 frente a 0,3 \pm 0,1 mg/g de hígado) y triglicéridos en el hígado (12,6 \pm 0,3 frente a 7,5 \pm 0,6 mg/g de hígado) mostraba que los animales KO para SCD1 tienen menores cantidades tanto de ésteres de colesterol como de triglicéridos que los controles de tipo silvestre. El análisis de lipoproteínas en plasma mostraba una reducción de los triglicéridos en plasma (120,6 \pm 6,8 frente a 45,4 \pm 3,8) en ratones SCD-/- en comparación con los controles normales. Estos descubrimientos son similares a los descubrimientos en ratones Asebia. La figura 2 registra el perfil de lipoproteínas en plasma obtenido usando cromatografía en fase líquida rápida. Los ratones Knock-Out para SCD1 mostraban una reducción del 65% de triglicéridos en la fracción de VLDL; pero poca o ninguna diferencia significativa en los niveles de LDL o HDL.

Los ratones Asebia se comparan con los ratones Knock-Out para SCD1 en la figura 2. Los descubrimientos son marcadamente similares. Las lipoproteínas en plasma de ratones Asebia se separaron mediante cromatografía en fase líquida rápida y se muestra la distribución de triglicéridos entre las lipoproteínas en las diversas fracciones de densidad de los ratones (n = 3). La figura 3 muestra un ejemplo adicional de un perfil de lipoproteínas de ratón Asebia. Estos perfiles mostraban una diferencia principal en la distribución de triglicéridos en la fracción de VLDL de los ratones SCD-/- y SCD-/+. Los niveles de triglicéridos en los SCD-/+ eran de 25 mg/dl en la VLDL, con niveles muy bajos en las fracciones de LDL y HDL. En contraste, los SCD-/- tenían niveles muy bajos de triglicéridos en las tres fracciones de lipoproteínas.

Análisis de ácidos grasos

También determinamos los niveles de ácidos grasos monoinsaturados en diversos tejidos. La Tabla 1 muestra la composición de ácidos grasos de varios tejidos en ratones de tipo silvestre y SCD-/-. Las cantidades relativas de palmitoleato (16:1n-7) en hígado y plasma de ratones SCD-/- se redujeron en un 55% y un 47% mientras que las de oleato (18:1n-9) se redujeron en un 35% y un 32%, respectivamente. La cantidad relativa de palmitoleato en el tejido adiposo blanco y en la piel de ratones SCD-/- se redujeron en más del 70%, mientras que la reducción de oleato en estos tejidos era inferior al 20% aunque la reducción era estadísticamente significativa. Estos cambios en los niveles de ácidos grasos monoinsaturados daban como resultado la reducción de los índices de desaturación indicando reducción de la actividad de desaturasa. En contraste con estos tejidos, el cerebro, que expresa de forma predominante la isoforma SCD2, tenía una composición de ácidos grasos similar y un índice de desaturación inalterado en ratones tanto de tipo silvestre como SCD-/-. Llegamos a la conclusión de que SCD1 desempeña un papel principal en la producción de ácidos grasos monoinsaturados en el hígado.

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La figura 4 (cuantificada en la Tabla 2) demuestra que SCD1 es un contribuyente principal a los índices de desaturación del plasma (proporción en plasma de 18:1/18:0 ó 16:1/16:0 en la fracción de lípidos total), según se considera mediante el análisis de ácidos grasos en plasma tanto de ratones KO para SCD1 como de Asebia. En ambos modelos animales, se observa una reducción de aproximadamente el 50% o más en los índices de desaturación en plasma. Esto demuestra que el índice de desaturación en plasma depende en gran medida de la función de SCD1

TABLA 2 Índices de desaturación de ácidos grasos en mutantes Asebia y heterocigotos

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Procedimientos experimentales para ratones knock-out Generación de los ratones knock-out para SCD1

El ADN genómico de ratón para el vector de dirección se clonó a partir de la biblioteca genómica 129/SV. La construcción de vector de dirección se generó mediante inserción de un fragmento Xba I/Sac I de 1,8 kb con homología en 3' como brazo corto y un fragmento Cla I/Hind III de 4,4 kb con homología en 5' clonado adyacente a la casete de expresión de neo. La construcción también contiene una casete de HSV timidina quinasa en posición 3' respecto al brazo de homología de 1,8 kb, permitiendo la selección positiva/negativa. El vector de dirección se linealizó mediante Not I y se electroporó en células madre embrionarias. Se realizó la selección con geneticina y ganciclovir. Los clones resistentes a geneticina y ganciclovir se analizaron mediante transferencia de Southern después de la digestión con enzima de restricción EcoRl e hibridaron con una sonda de 0,4 kb situada cadena debajo de las secuencias del vector. Para el genotipado por PCR, el ADN se amplificó con el cebador A

5'-GGGTGAGCATGGTGCTCAGTCCCT-3'

(SEC ID Nº 2)

que está ubicado en el exón 6, cebador B

5'-ATAGCAGGCATGCTGGGGAT-3'

(SEC ID Nº 3)

que está ubicado en el gen neo (producto de 425 pb, alelo fijado como objetivo), y cebador C

5'-CACACCATATCTGTCCCCGACAAATGTC-3'

(SEC ID Nº 4)

que está ubicado cadena abajo del gen de dirección (producto de 600 pb, alelo de tipo silvestre). Las condiciones de PCR eran 35 ciclos, cada uno de 45 segundos a 94ºC, 30 segundos a 62ºC y 1 minuto a 72ºC. Las células fijadas como objetivo se microinyectaron en blastocistos C57BI/6, y se cruzaron ratones quiméricos con hembras C57BL/6 o 129/SvEv de Taconic, y dieron una transmisión de la línea germinal. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12 h de oscuridad/luz y se alimentaron con una dieta a base de pienso normal, una dieta semi-purificada o una dieta que contenía el 50% (% de ácidos grasos totales) de trioleno, tripalmitoleina o trieicosenoina. La dieta semi-purificada se adquirió de Harlan Teklad (Madison, WI) y contenía: el 20% de caseína libre de vitaminas, el 5% de aceite de soja, el 0,3% de L-cistina, el 13,2% de Maltodextrina, el 51,7% de sacarosa, el 5% de celulosa, el 3,5% de mezcla de minerales (AIN-93G-MX), el 1,0% de mezcla de vitaminas (AIN-93-VX), y el 0,3% bitartrato de colina. La composición de ácidos grasos de las dietas experimentales se determinó mediante cromatografía de gas-líquido. La dieta de control contenía el 11% de ácido palmítico (16:0), el 23% de ácido oleico (18:1n-9), el 53% de ácido linoleico (18:2n-6) y el 8% de ácido linolénico (18:3n-3). La dieta rica en trioleno contenía el 7% de 16:0, el 50% de 18:1n-9, el 35% de 18:2n-6 y el 5% de 18:3n-3.

Materiales

Se obtuvo [-^{32}P] dCTP radiactivo (3000 Ci/mmol) de DuPont Corp. (Wilmington, DE). Las placas de cromatografía en capa fina (TLC Silica Gel G60) eran de (Darmstadt, Alemania). La [1-^{14}C]-estearoil-CoA se adquirió de American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St Louis, MO). Las membranas de transferencia Immobilon-P eran de Millipore (Danvers, MA). El kit de detección de transferencia de Western ECL era de Amersham-Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ). Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma (St Louis, MO).

Análisis de lípidos

Los lípidos totales se extrajeron del hígado y el plasma de acuerdo con el método de Bligh y Dyer (Bligh y Dyer, 1959), y los fosfolípidos, ésteres de cera, colesterol libre, triglicéridos y ésteres de colesterol se separaron mediante TLC de alto rendimiento en gel de sílice. Se usó Hexano de petróleo/éter dietílico/ácido acético (80:30:1) o benceno/hexano (65:35) como disolvente de desarrollo (Nicolaides y Santos, 1985). Las manchas se visualizaron mediante 2',7'-diclorofluoresceína al 0,2% en etanol al 95% o mediante sulfato cúprico al 10% en ácido fosfórico al 8%. Las manchas de triéster de cera, éster de colesterol y triglicérido se rasparon, se añadió 1 ml de HCl-metanol al 5% y se calentó a 100ºC durante 1 h (Miyazaki et al., 2000). Los ésteres metílicos se analizaron mediante cromatografía de gas-líquido usando heptadecanoato de colesterol, triheptadecanoato y ácido heptadecanoico como patrón interno. Los contenidos de colesterol libre, éster de colesterol y triglicéridos del párpado y el plasma se determinaron mediante ensayos enzimáticos (Sigma St Louis, MO y Wako Chemicals, Japón).

Aislamiento y Análisis de ARN

El ARN total se aisló de hígados usando el método de extracción ácida de guanidinio-fenol-cloroformo (Bernlohr et al., 1985). Veinte microgramos de ARN total se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,0%/formaldehído 2,2 M y se transfirieron a una membrana de nylon. La membrana se hibridó con sondas de SCD1 y SCD2 marcadas con 32P. La sonda pAL15 se usó como control para una carga igualitaria (Miyazaki, M., Kim, Y. C., Gray-Keller, M. P., Attie, A. D., y Ntambi, J. M. (2000). La biosíntesis de ésteres de colesterol y triglicéridos hepáticos está alterada en ratones con una alteración del gen para estearil CoA desaturasa 1. J Biol Chem 275, 30132-8).

Ensayo de la actividad de SCD

La actividad de estearoil-CoA desaturasa se midió en microsomas hepáticos esencialmente como describen Shimomura et al. (Shimomura, I., Shimano, H., Korn, B. S., Bashmakov, Y., y Horton, J. D. (1998). Las proteínas de unión al elemento regulador de esterol nuclear activan a genes responsables de todo el programa de biosíntesis de ácidos grasos insaturados en el hígado de ratón transgénico. J Biol Chem 273, 35299-306.). Los tejidos se homogeneizaron en 10 volúmenes de tampón A (tampón potasio 0,1 M, pH 7,4). Las fracciones de la membrana microsómica (sedimento de 100.000 x g) se aislaron mediante centrifugado secuencial. Las reacciones se realizaron a 37ºC durante 5 minutos con 100 \mug de homogenado de proteínas y 60 \muM de [1-^{14}C]-estearoil-CoA (60.000 dpm), 2 mM de NADH, 0,1 M de tampón Tris/HCl (pH 7,2). Después de la reacción, se extrajeron los ácidos grasos y a continuación se metilaron con cloruro acético/metanol al 10%. Los ésteres metílicos de ácidos grasos saturados y ácidos grasos monoinsaturados se separaron mediante TLC impregnada con AgNO_{3} al 10% usando hexano/éter dietílico (9:1) como solución de desarrollo. Las placas se pulverizaron con 2',7'-diclorofluoresceína al 0,2% en etanol al 95% y los lípidos se identificaron en luz UV. Las fracciones se retiraron raspando de la placa, y la radiactividad se midió usando un contador de centelleo líquido. La actividad enzimática se expresó como nmoles min^{-1} mg^{-1} de proteína.

Inmunotransferencia

Se prepararon membranas hepáticas reunidas de 3 ratones de cada grupo como se describe por Heinemann et al (Heinemann y Ozols, 1998). La misma cantidad de proteína (25 \mug) de cada fracción se sometió a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10% y se transfirió a membranas de transferencia Immobilon-P a 4ºC. Después del bloqueo con leche desnatada al 10% en tampón TBS (pH 8,0) más Tween a 4ºC durante una noche, la membrana se lavó y se incubó con SCD de conejo anti-rata como anticuerpo primario y conjugado de IgG-HRP de cabra anti-conejo como anticuerpo secundario. La visualización de la proteína de SCD se realizó con el kit de detección de transferencia de Western ECL.

Histología

Los tejidos se fijaron con formalina tamponada neutra, se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina.

Este trabajo estaba apoyado por una subvención de la American Heart Association-Wisconsin affiliate y en parte por la subvención nº DAMD17-99-9451 de DOD.

Procedimientos Experimentales para Ratones Asebia Animales y Dietas

Ratones Asebia homocigotos (ab J/ab J o -/-) y heterocigotos (+/ab J o +/-) se obtuvieron del laboratorio Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se criaron en las instalaciones University of Wisconsin Animal Care Facility. En este estudio, se realizan comparaciones entre los ratones homocigotos (-/-) y heterocigotos (+/-), dado que estos últimos son indistinguibles de los ratones normales. Los ratones se alojaron en una instalación barrera libre de patógenos que funcionaba con un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad. A las 3 semanas de edad, estos ratones se alimentaron ad libitum durante 2 semanas o 2 meses, con una dieta de pienso de laboratorio o con una dieta semi-purificada que contenía el 50% (% de ácidos grasos totales) de trioleno o tripalmitoleina. La dieta semipurificada se adquirió de Harlan Teklad (Madison, WI) y contenía: el 18% de caseína libre de vitaminas, el 5% de aceite de soja, el 33,55% de almidón de maíz, el 33,55% de sacarosa, el 5% de celulosa, el 0,3% de L metionina, el 0,1% de cloruro de colina, mezcla de sales (AIN-76A) y mezcla de vitaminas (AIN-76A). La composición ácidos grasos de las dietas experimentales se determinó mediante cromatografía de gas-líquido. La dieta de control contenía el 11% de palmítico (16:0), el 23% de ácido oleico (18:1n-9), el 53% de ácido linoleico (18:2n-6) y el 8% de ácido linoleico (18:3n-3). La dieta rica en trioleno contenía el 7% de 16:0, el 50% de 18:1n-9, el 35% de 18:2n-6 y el 5% de 18:3n-3. La dieta rica en tripalmitoleína contenía el 6% de 16:0, el 49% de ácido palmitoleico (16:1n-7), el 12% de 18:1n-9, el 27% de 18:2n-6 y el 4% de 18:3n-3.

Los animales se anestesiaron a aproximadamente las 10:00 a.m. mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (0,08 mg/g de peso corporal) Nembutal, Abbot, North Chicago, IL). El hígado se aisló inmediatamente, se pesó, y se guardó en nitrógeno líquido. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena abdominal.

Materiales

[\alpha-^{32}P] dCTP radiactivo (3000 Ci/mmol) se obtuvo de Dupont Corp. (Wilmington, DE). Las placas de cromatografía en capa fina (TLC Silica Gel G60) fueron de Merck (Darmstadt, Alemania). [1-^{14}C]-estearoil-CoA, [^{3}H] colesterol y [1-^{14}C] oleoil-CoA se adquirieron de American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St Louis, MO). Las membranas de transferencia Immobilon-P eran de Millipore (Danvers, MA). El kit de detección de transferencia de Western ECL era de Amersham-Pharmacia Biotech, Inc. (Piscataway, NJ). El reactivo de transfección LT-1 era de PanVera (Madison, WI). Todos los demás productos químicos se adquirieron de Sigma (St Louis, MO). El anticuerpo para microsoma hepático de rata de SCD fue suministrado por el Dr. Juris Ozols en el centro University of Connecticut Health Center. El vector de expresión de pcDNA3-1, SCD1 fue proporcionado por el Dr. Trabis Knight de la Iowa state university.

Análisis de Lípidos

Los lípidos totales se extrajeron del hígado y el plasma de acuerdo con el método de Bligh y Dyer (Bligh, E. G., y Dyer, W. J. (1959) Can J Biochem Physiol 37, 911-917.), y los fosfolípidos, colesterol libre, triglicéridos y ésteres de colesterol se separaron mediante TLC en gel de sílice. Se usó éter de petróleo/éter dietílico/ácido acético (80:30:1) como disolvente de desarrollo. Las manchas se visualizaron mediante 2',7'-diclorofluoresceína al 0,2% en etanol al 95% o mediante sulfato cúprico al 10% en ácido fosfórico al 8%. Las manchas de fosfolípidos, éster de colesterol y triglicérido se rasparon, se añadió 1 ml de HCl-metanol al 5% y se calentó a 100ºC durante 1 h. los ésteres metílicos se analizaron mediante cromatografía de gas-líquido usando heptadecanoato de colesterol como patrón interno (Lee, K. N., Pariza, M. W., y Ntambi, J. M. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 248, 817-821; Miyazaki, M., Huang, M. Z., Takemura, N., Watanabe, S., y Okuyama, H. (1998) Lipids 33, 655-61). Los contenidos de colesterol libre, éster de colesterol y triglicéridos del hígado y el plasma se determinaron mediante ensayos enzimáticos (Sigma St Louis, MO y Wako Chemicals, Japón).

Análisis de Lipoproteínas en Plasma

Los ratones se mantuvieron en ayunas un mínimo de 4 horas y se sacrificaron mediante asfixia con CO2 y/o dislocación cervical. Se recogió sangre de forma aséptica mediante punción cardiaca directa y se centrifugó (13.000 x g, 5 minutos, 4ºC) para recoger el plasma. Las lipoproteínas se fraccionaron en una columna de FPLC Superose 6HR 10/30 (Pharmacia). Las muestras de plasma se diluyeron a 1:1 con PBS, se filtraron (filtro de jeringa Cameo 3AS, 0,22 \mum) y se inyectaron en la columna que se había equilibrado con PBS que contenía EDTA 1 mM y NaN3 al 0,02%. El equivalente de 100 \mul de plasma se inyectó en la columna. El caudal se ajustó para hacerlo constante a 0,3 ml/min. Se recogieron fracciones de 500 \mul y se usaron para las mediciones de triglicéridos totales (Sigma). Los valores presentados son para la masa de triglicéridos total por fracción. Las identidades de las lipoproteínas se han confirmado utilizando inmunorreactividad anti-ApoB para LDL e inmunorreactividad Anti-Apo A1 para HDL (no se muestra).

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Ejemplo 2 Demostración de la correlación significativa entre la proporción de FFA (ácidos grasos libres) de 18:1/18:0 y los niveles de TG/HDL en seres humanos

Este ejemplo demuestra, por primera vez, que la actividad de delta-9 desaturasa en seres humanos se correlaciona directamente con los niveles en suero de triglicéridos (VLDL) e inversamente con el nivel de HDL en suero y el colesterol total en suero.

Diseño Experimental

El plasma de un total de 97 individuos se analizó en busca del contenido de ácidos grasos mediante cromatografía de gases (GC). El contenido de ácidos grasos libres (FFA) total se midió y las proporciones de oleato con respecto a estearato (18:1/18:0) y palmitoleato con respecto a palmitato (16:1/16:0) se computaron, definidas como los índices de desaturación, como anteriormente. Buscábamos descubrir una relación entre estas proporciones y tres indicadores clínicos; niveles de TG (triglicéridos) en plasma, niveles de HDL (lipoproteína de alta densidad) en plasma, y colesterol total en plasma.

Muestra del Paciente

La muestra del paciente se seleccionó para maximizar la diversidad fenotípica en términos de HDL. Dentro de nuestra cohorte, 21 individuos mostraban un fenotipo alto en HDL (> 90º percentil para edad y sexo), 12 individuos mostraban un fenotipo bajo en HDL de etiología desconocida (< 5º percentil para edad y sexo), mientras que seis mostraban un fenotipo bajo en HDL debido a mutaciones en el gen ABCA1. 33 individuos estaban dentro de parámetros para HDL normales (< 90º y > 5º percentil para edad y sexo).

También intentamos diversificar nuestra muestra en términos de niveles de TG, incluyendo 9 individuos con Hiperlipidemia Combinada Familiar (FCHL) que tienen alto nivel de TG y/o colesterol así como 16 individuos de control adicionales con niveles de TG normales.

En algunos casos, se ensayaron múltiples individuos de la misma familia. Cinco de los seis individuos con una mutación en ABCA1 forman parte de la misma familia (NL-020). También se ensayaron múltiples individuos de otros árboles genealógicos que segregaban un fenotipo bajo en HDL que no está vinculado genéticamente a ABCA1. En esta categoría, se ensayaron dos individuos afectados de NL-008, mientras que se ensayaron cuatro individuos afectados de NL-001. Los seis individuos restantes con un fenotipo bajo en HDL no están relacionados entre sí, y se seleccionaron de distintos árboles genealógicos. De esos individuos con alto HDL, siete de ellos no estaban relacionados entre sí. Aún no está claro si el alto HDL observado en estos individuos tiene una base genética clara en los miembros de la familia. Los 14 individuos restantes con un fenotipo alto en HDL, seis de los cuales son de la familia HA-1 y ocho de una familia distinta, HA-3. También se ensayaron individuos no afectados relacionados con esos, tanto con HDL bajo como alto.

Nuestra cohorte muestra una amplia variación en los niveles de TG y HDL. En general, los individuos con bajo HDL tienen altos niveles de TG y aquellos con altos niveles de TG tienden a tener bajos niveles de HDL. Esta relación entre TG y HDL se ha observado anteriormente en la bibliografía (Davis et al., 1980).

El análisis de los ésteres de ácidos grasos se determinó de la siguiente manera. Las células de muestras del paciente se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría y los lípidos celulares totales se extrajeron tres veces con CHCl3/MeOH (2:1 v/v). Las tres extracciones de lípidos se combinaron en un tubo de vidrio con tapón de rosca, se secaron en gas N2 a 40ºC en un bloque calentador, y se resuspendieron en tolueno. Se produjeron ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de BCl3/MeOH (Alltech, Deerfield IL), se extrajeron con hexano, se secaron y se resuspendieron en hexano. Los ésteres metílicos de ácidos grasos se identificaron usando un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 6890 equipado con un auto-inyector 7683 y una columna HP-5 (30 m' 0,25 mm, 0,25 \mum de grosor de película) conectado a un detector de ionización de llama ajustado a 275ºC. El inyector se mantuvo a 250ºC. La temperatura de la columna se mantuvo a 180ºC durante 2 minutos después de la inyección, se elevó a 200ºC a 8ºC/min, se mantuvo a 200ºC durante 15 minutos, y a continuación se elevó a 250ºC a 8ºC/min. En estas condiciones, los ésteres metílicos ?9? 16:1?, 16:0?, ?9?18:1 y 18:0 se eluyeron a 9,2 minutos, 9,7 minutos, 15,3 minutos, y 16,4 minutos, respectivamente. Véase Lee et al. (1998). Biochem. Biophys. Res. Commun. 248: 817-821; Miyazaki et al. (1998) Lipids 33: 655-661; y Miyazaki M, Kim YC, Gray-Keller MP, Attie AD, Ntambi JM. 2000. J Biol Chem. 275 (39): 30132-8.

Resultados

El análisis de regresión lineal se realizó usando todo el conjunto de datos en ser humano. La proporción de 18:1/18:0 mostraba una relación significativa con los niveles de TG (r^{2} = 0,39, p < 0,0001) (figura 5a), así como correlaciones significativas con los niveles de HDL (r^{2} = 0,12, p = 0,0006) (figura 5b).

La proporción en plasma de ácido grasos de 16:1/16:0 se midió de manera similar, aunque los resultados no eran tan llamativos. Se observó una relación débil entre el nivel relativo de 16:1/16:0 respecto a los niveles de TG en plasma (r^{2} = 0,05, p = 0,03) (figura 6), mientras que la relación entre la proporción de 16:1/16:0 y los niveles de HDL no alcanzó la significación (no se muestra). Al contrario que la proporción 18:1/18:0, la proporción 16:1/16:0 explicaba una parte de la varianza en los niveles de colesterol total (r^{2} = 0,06, p = 0,02) (no se muestra).

En conjunto, la proporción 18:1/18:0 suponía el 18% de la varianza del contenido de ácidos grasos en plasma total (p = 0,005) mientras que la proporción 16:1/16:0 suponía el 8% de la variación de este valor (p = 0,02), cuando los individuos con FCHL y sus controles asociados se excluyeron del análisis (no se muestra en la figura).

Finalmente, para la parte de nuestra muestra para la cual los valores de Índice de Masa Corporal (IMC) estaban disponibles, medimos una correlación positiva entre las proporciones de 18:1/18:0 y el IMC (r^{2} = 0,13, p = 0,00) (no se muestran los datos).

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La muestra se estratificó en base a los niveles de HDL para determinar si la relación entre la actividad de SCD (según lo medido mediante la proporción 18:1/18:0) y los niveles de TG era independiente de la causa primaria de la dislipidemia observada.

Se observó una correlación positiva entre 18:1/18:0 y los TG en personas con alto HDL.

El análisis de aquellos individuos con un fenotipo alto en HDL (> 90º percentil) demostró una relación significativa entre la proporción de 18:1/18:0 y los niveles de TG (r^{2} = 0,40, p < 0,005) (figura 7). La relación entre la proporción de 18:1/18:0 y los niveles de HDL en este grupo no alcanzó significación (no se muestran los datos). La proporción de 16:1/16:0 no suponía una proporción significativa de la varianza en el colesterol total, los niveles de TG o HDL en este subconjunto de nuestra cohorte.

Para determinar si una relación más fuerte entre el índice de 18:1/18:0 y los niveles de TG sería evidente en un trasfondo genéticamente homogéneo, las familias HA-1 y HA-3 se analizaron por separado. Se incluyeron miembros de las familias tanto afectados como no afectados en el análisis. En ambas familias, se observó una relación similar entre 18:1/18:0 y los niveles de TG (HA-1: r^{2} = 0,36, p = 0,005 (figura 8a), HA-3: r^{2} = 0,32, p = 0,009 (no se muestra en la figura)). La fuerza de estas relaciones era similar a la observada en toda la cohorte. Las proporciones de 18:1/18:0 también se correlacionaban con niveles de HDL en HA-1, aunque esta relación no alcanzó significación en HA-3 (HA-1: r^{2} = 0,32, p = 0,009 (figura 8b), HA-3: r^{2} = 0,10, p = 0,22 (no se muestra)).

También se observó una correlación positiva entre 18:1/18:0 y TG en aquellos con bajo HDL. Cuando todos los individuos con bajo HDL (< 5º percentil) se analizaron como un grupo, se observó una relación significativa entre la proporción de 18:1/18:0 y los niveles de TG (r^{2} = 0,49, p = 0,0009) (figura 9). Como se observó en nuestro análisis del subconjunto de pacientes con alto HDL, la relación entre la proporción de 18:1/18:0 y HDL no alcanzó la significación en el grupo de bajo HDL (no se muestran los datos). Además, no se observó ningún resultado significativo cuando la proporción 16:1/16:0 se sometía a regresión con valores de HDL, TG y colesterol total.

El análisis de la familia NL-001, que se segregaba en un fenotipo de bajo HDL de etiología genética desconocida, y la familia NL-0020, que segregaba una mutación ABCA1, tendía hacia las relaciones observadas anteriormente entre las proporciones de ácidos grasos y los parámetros lipídicos cuando se consideraban individuos afectados en cada familia. Sin embargo, estos resultados no alcanzaron significación estadística debido al pequeño número de individuos analizados en cada caso (NL-001: Figura 10 a, b y NL0020: Figura 11 a, b). Se observó una tendencia general hacia mayores proporciones de 18:1/18:0 en pacientes de enfermedad de Tangier de mayor edad. Esto podría ser un efecto independiente de la enfermedad, aunque no se observó un efecto dependiente de la edad en la proporción de 18:1/18:0 ni en las familias HA-1 y HA-3 ni en toda la cohorte (no se muestra en la figura 11).

La figura 12 muestra la relación entre la proporción de 18:1/18:0 y los niveles de TG (r^{2} = 0,56, p = 0,03) (figura 12a), los niveles de HDL (r^{2} = 0,64, p=0,009) (figura 12b) y los niveles de colesterol total (r^{2} = 0,50, p = 0,03) en personas con Hiperlipidemia Combinada Familiar (FCHL) (figura 12c).

Nuestro análisis es la primera demostración en seres humanos de que la función de SCD, según lo medido mediante los índices de desaturación de 16:1/16:0 y 18:1/18:0, se correlaciona positivamente con los niveles de TG en plasma e inversamente con el HDL en plasma. En gran medida, observamos esta correlación independientemente de la causa subyacente de hiper o hipo-trigliceridemia, sugiriendo que la relación entre la actividad de SCD y los niveles de TG es un efecto generalizado. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de SCD en seres humanos está vinculada a niveles de TG (o VLDL) en suero reducidos, niveles de colesterol total reducidos, niveles de HDL aumentados, y un índice de masa corporal reducido (IMC), independiente de la causa principal de la elevación de TG. En gran medida, los inhibidores de SCD1 podrían usarse como terapia de combinación en pacientes que también están siendo tratados para FCHL.

En resumen, cuando se toman conjuntamente, los Ejemplos 1 y 2 establecen por primera vez una correlación positiva entre la actividad de SCD1 y los niveles de TG en mamíferos, así como una correlación inversa entre la actividad de SCD1 y HDL en seres humanos. Nuestro análisis de los ratones Asebia y KO para SCD1 son definitivos en su implicación de SCD1 como el principal contribuyente al índice de desaturación. Hemos usado este índice como sustituto para la actividad de SCD1 en nuestros estudios en seres humanos. Por lo tanto, es probable que los inhibidores de la función de SCD1 en mamíferos, incluyendo seres humanos, rebajen los TG y eleven las HDL.

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Ejemplo 3 Análisis de ácidos grasos en plasma en un modelo de dislipidemia en ratón

Para confirmar la relación descrita anteriormente observada en seres humanos entre el índice de desaturación de 18:1/18:0 y los niveles de TG. También realizamos análisis de ácidos grasos en plasma en un modelo en ratón de la enfermedad humana FCHL. En la cepa de ratón hiperlipidémico ("hyplip") los niveles de TG son elevados en comparación con el tipo silvestre.

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El ratón hiperlipidémico HcB-19 mostraba un índice de desaturación de 18:1/18:0 elevado. Este modelo en ratón de hiperlipidemia combinada familiar (HcB-19) muestra niveles elevados de TG, colesterol, así como una mayor secreción de VLDL y apoB (Castellani et al, Mapping a gene for combined hyperlipidaemia in a mutant mouse strain. Nat Genet; 18 (4): 374-7 (1998).

Los análisis de ácidos grasos en plasma demostraron que estos animales tienen una proporción de 18:1/18:0 significativamente elevada en comparación con controles no afectados de la cepa parental (figura 13). Los animales HcB-19 no mostraron, sin embargo, una elevación significativa del índice 16:1/16:0 en comparación con los controles. Por lo tanto, observamos una correlación positiva entre el índice de desaturación de 18:1/18:0 y los niveles de TG en este modelo animal de FCHL.

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Ejemplo 4 Reguladores transcripcionales de SCD1 y su uso como dianas de cribado de fármacos

Este ejemplo presenta, por primera vez, la secuencia completa del promotor genómico de SCD1 humana. Este promotor es útil en este caso para identificar elementos reguladores que modulan y controlan la expresión de SCD1 en seres humanos, e identifica proteínas reguladoras que son dianas adecuadas para la intervención de moléculas pequeñas para modular la expresión de SCD1 en seres humanos.

La secuencia promotora de SCD1 humana se muestra en la SEC ID Nº 1. Esta secuencia no se ha anotado de forma precisa en el Genbank y se ha presentado como 5'UTR en una serie de registros.

La figura 14 ilustra la ubicación de secuencias reguladoras y sitios de unión en la región homóloga del promotor de SCD1 de ratón y SCD1 humana y las regiones flanqueantes 5'. La escala superior indica la posición con respecto al sitio de inicio de la transcripción. Se indican elementos importantes de la secuencia promotora.

La estructura del promotor de SCD1 humana es similar a la de la isoforma de SCD1 de ratón y contiene secuencias reguladoras conservadas para la unión de varios factores de transcripción, incluyendo la proteína de unión al elemento regulador de esterol (SREBP), proteína-alfa de unión al potenciador de CCAAT (C/EBPa) y factor nuclear-1 (NF-1) que han demostrado transactivar la transcripción del gen de SCD de ratón. El colesterol y los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) redujeron la actividad de luciferasa del promotor de SCD cuando se transfectaban transitoriamente en células HepG2. La reducción de la actividad promotora en la construcción informadora se correlacionaba con reducciones en los niveles de ARNm y proteínas de SCD endógena. La co-transfección transitoria en células HepG2 de la construcción gen de luciferasa-promotor de SCD humana junto con el vector de expresión para SREBP mostraba que SREBP trans-activa al promotor de SCD humana. Nuestros estudios indican que, al igual que el gen de SCD1 de ratón, el gen de SCD humano está regulado por ácidos grasos poliinsaturados y colesterol a nivel de la transcripción génica y que SREBP desempeña un papel en la activación transcripcional de este gen.

Construcción del plásmido quimérico de promotor y luciferasa

Una biblioteca genómica de placenta humana en bacterias-fago I EMBL3 se cribó con un inserto de Pstl de 2,0 kb del ADNc de pC3 de ratón (Ntambi, J. M., Buhrow, S. A., Kaestner, K. H., Christy, R. J., Sibley, E., Kelly, T. J. Jr., y M. D. Lane. 1988. Differentiation-induced gene expression in 3T3-L1 preadipocytes: Characterization of a differentially expressed gene encoding stearoyl-CoA desaturase. J. Biol. Chem. 263: 17291-17300), como sonda radiactiva y se aislaron siete placas. Dos de estas placas se purificaron hasta homogeneidad, el ADN se aisló y se designó HSCD1 y HSCD3. Un cebador de ADN basado en la secuencia correspondiente al primer exón del ADNc del gen de estearoil-CoA desaturasa humana publicado (Zhang, L., G. E. Lan, S. Parimoo, K. Stenn y S. M. Proutey. 1999. Human stearyl CoA desaturase: alternative transcripts generated from a single gene by usage of tandem polyadenylation sites. Biochem. J. 340: 255-264) se sintetizó y se usó para secuenciar los dos clones del fago mediante el método de terminación de la cadena con un didesoxinucleótido. Se generó una secuencia preliminar y se diseñaron cebadores cadena arriba

5' NNNNGGTACCTTNNGAAAAGAACAGCGCCC 3'

SEC ID Nº 5

y cadena abajo:

5' NNNNAGATCTGTGCGTGGAGGTCCCCG 3'

SEC ID Nº 6

para amplificar aproximadamente 540 bases de la región promotora cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción: Estos cebadores contienen sitios de enzima de restricción insertados (subrayados), Kpn1 para cadena arriba, y BglII para cadena abajo, con una región colgante de 4 bases para permitir la digestión con enzimas de restricción. A continuación se realizó una PCR en los clones del fago y el fragmento de 500 pb amplificado se aisló a partir de un gel de agarosa al 1%.

El fragmento amplificado se digirió con Kpn1 y BglII y a continuación se clonaron en los sitios de Kpn1 y BglII del vector básico de pGL3 (Promega) que contiene el gen informador de luciferasa y se transformaron en células de E. coli DH5 competentes. El ADN plasmídico se purificó en columnas Qiagen y se secuenció mediante el método de terminación de la cadena con un didesoxinucleótido usando como cebadores correspondientes a secuencias de ADN en el sitio de clonación múltiple pero flanqueando el ADN insertado. La construcción génica de luciferasa-promotor de SCD que se generó se designó como pSCD-500.

Aislamiento y Análisis de ARN

El ARN total se aisló a partir de células HepG2 usando el método de extracción con guanidinio ácido-fenol-cloroformo. Se separaron veinte microgramos de ARN total mediante electroforesis en gel con agarosa al 0,8%/formaldehído 2,2 M y se transfirieron a una membrana de nylon. La membrana se hibridó con una sonda de ADNc de SCD humana marcada con ^{32}P generada mediante PCR de la siguiente manera: la sonda pAL15 se usó como control para una carga igualitaria.

Inmunotransferencia

Se prepararon extractos celulares a partir de células HepG2 que se habían tratado con los diversos ácidos grasos o colesterol como se describe por Heinemann et al (17). La misma cantidad de proteína (60 \mug) de cada fracción se sometió a electroforesis en gel de SDS al 10%-poliacrilamida y se transfirieron a membranas de transferencia Immobilon-P a 4ºC. Después del bloqueo con leche desnatada al 10% en tampón TBS (pH 8,0) más Tween al 0,5% a 4ºC durante una noche, la membrana se lavó y se incubó con SCD de conejo anti-rata como anticuerpo primario (17) y conjugado IgG-HRP de cabra anti-conejo como anticuerpo secundario. La visualización de la proteína SCD se realizó con el kit de detección de transferencia de Western ECL.

Efecto del colesterol, ácidos grasos poliinsaturados y ácido araquidónico sobre la expresión de hSCD1 Cultivo celular y transfecciones de ADN

Se cultivaron células HepG2, en medio DMEM bajo en glucosa suplementado con Suero Fetal Bovino al 10% y solución de Penicilina/estreptomicina al 1% y se mantuvo a 37ºC, CO_{2} al 5% en una incubadora humidificada. Las células se pasaron a placas de 6 cm para dar el 40-70% de confluencia en aproximadamente 12-16 horas. Las células se transfectaron a continuación con 5 \mug de ADN plasmídico por placa de pSCD-500 o el informador Basic PGL3 así como el pRL-TK, controles internos (Promega) usando el reactivo de transfección LT-1 (Pan Vera). Después de 48 horas, las células se aclararon con PBS y a continuación se trataron en medio E de Williams, un medio libre de ácidos grasos, que contiene insulina, dexametasona, y concentraciones apropiadas de ácidos grasos conjugados a albúmina según se indica en las figuras y las leyendas. Las células también se trataron con etanol en solitario (como control) o colesterol (10 \mug/ml) y 25-OH colesterol (11 \mug/ml) disuelto en etanol. Después de 24 h adicionales, se prepararon extractos y se ensayó su actividad de luciferasa. Se usaron células no transfectadas como blanco y se usó luciferasa de Renilla como control interno. Se ensayaron los extractos celulares en busca de la presencia de proteínas de acuerdo con Lowry, y todos los resultados se normalizaron con la concentración de proteínas así como con recuentos de luciferasa de Renilla. Cada experimento se repitió al menos tres veces, y todos los datos se expresan como medias + SEM.

Resultados

La secuencia de la región promotora amplificada del gen de SCD1 se muestra en la SEC ID Nº 1.

En comparación con la secuencia promotora de SCD1 de ratón, se descubrió que varias secuencias reguladoras funcionales identificadas en el promotor de SCD1 de ratón se conservan absolutamente a nivel de nucleótidos y también con respecto a su separación dentro de los promotores proximales de los dos genes (figura 14). Tanto la homología de TTAATA, como C/EBPa y NF-1 están en las mismas ubicaciones en los promotores de SCD1 de ratón y humano. Además cadena arriba el elemento regulador de esterol (SRE) y los motivos de la secuencia CCAAT que se descubren en el elemento sensible al ácido graso poliinsaturado (PUFA-RE) de los promotores SCD1 y SCD2 de ratón. La separación de estos elementos se conserva en los tres promotores.

Ensayamos si la expresión génica de SCD humana también se reprimía mediante colesterol y ácidos grasos poliinsaturados. Las células HepG2 humanas se cultivaron y a continuación se trataron con ácido araquidónico 100 \muM, DHA o 10 \mug/ml de colesterol y 1 \mug/ml de 25-hidroxicolesterol colesterol como hemos descrito anteriormente. El ARNm total se aisló y se sometió a análisis de transferencia de Northern usando una sonda correspondiente al ADNc humano y generada mediante el método de PCR usando cebadores basados en la secuencia publicada de ADNc de SCD humana. La figura 15 muestra que AA, DHA y el colesterol redujeron la expresión de ARNm de SCD humana de manera dependiente de la dosis. La transferencia de western de los extractos de proteína de las células tratadas con PUFA y colesterol muestra que las PUFA y el colesterol reducían los niveles de la proteína de SCD también (no se muestran los datos).

Para evaluar el posible efecto de unión a SREBP sobre la actividad del promotor de SCD humana, la construcción del promotor de luciferasa humana se cotransfectó en células HepG2 junto con un vector de expresión que contiene SREBP1a. Después de 72 h, se evaluó la actividad de luciferasa de las células transfectadas. Los datos se normalizaron con el extracto celular que expresaba la luciferasa de Renilla como control interno. Como se muestra en la figura, la SREBP transactiva al promotor de manera dependiente de la dosis dando origen a un aumento de hasta 40 veces. Este experimento muestra que SREBP desempeña un papel en la regulación del gen de SCD humana.

Los informes publicados indicaron que la forma madura de SREBP, además de activar los genes lipogénicos, también media en la represión por PUFA y colesterol de genes lipogénicos, incluyendo SCD1 de ratón. Para observar los efectos reguladores de SREBP-1a madura y PUFA sobre la actividad de promotores de SCD, se co-transfectaron transitoriamente células hepáticas HepG2 con 20 ng (por placa de 6 cm) de ADN plasmídico que contiene el promotor de SCD humana como se ha descrito anteriormente, pero esta vez las transfecciones se realizaron en presencia de colesterol para inhibir la maduración del SREBP endógena y asegurar, de este modo, que había poca forma madura del SREBP endógena presente en las células. Después de la transfección, las células se trataron a continuación con, con ácido araquidónico, EPA y DHA como complejos con albúmina, y la actividad de luciferasa se evaluó a continuación usando un luminómetro. Si SREBP media la represión por PUFA del gen de SCD humana, la actividad del promotor de SCD no disminuiría después del tratamiento de las células transfectadas con PUFA. Sin embargo, la adición de AA, EPA o DHA seguía reprimiendo la actividad del promotor de SCD con solamente una ligera atenuación (no se muestran los datos). Por lo tanto, la maduración de SREBP no parece mostrar la selectividad requerida para explicar el control por PUFA de la transcripción génica de SCD, lo que sugiere que PUFA puede utilizar una proteína diferente además de la SREBP para reprimir la transcripción génica de SCD humana.

Estos resultados establecen que hSCD1 está regulada transcripcionalmente por SREBP, NF-Y, C/EBPalfa, PUFA-RE y proteínas alternativas y reguladores de la transcripción. Cada una de estas proteínas será, por lo tanto, una atractiva diana para el cribado de fármacos para identificar compuestos que modulan la expresión de SCD1 en una célula; siendo de este modo útiles parta tratar las enfermedades, trastornos y afecciones humanas que enseña la presente invención.

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Ejemplo 5 Los ratones knock-out para SCD1 muestran anormalidades cutáneas y oculares

Para investigar las funciones fisiológicas de SCD, generamos ratones knock-out para SCD1 (SCD1-/-). Descubrimos que los niveles de C16:1 se reducen drásticamente en los tejidos de ratones SCD1-/- mientras que se observó una drástica reducción en C18:1 solamente en el hígado donde normalmente se expresa SCD1 en solitario y no SCD2. En tejidos tales como el del párpado, adiposo y la piel donde tanto SCD1 como SCD2 se expresan, 18:1 solamente se reducía ligeramente. Los niveles de ácidos grasos monoinsaturados del cerebro y el globo ocular que no expresan SCD1 permanecían sin cambios. El hígado y la piel de los ratones SCD-/- eran deficientes en ésteres de colesterol y triglicéridos mientras que el párpado además era deficiente en ésteres de cera específicos del párpado de ácidos grasos monoinsaturados de cadena larga principalmente C20:1. Además, el párpado de los ratones SCD-/- tenía niveles más altos de colesterol libre. Los ratones SCD-/- mostraban anormalidades cutáneas con glándula sebácea atrófica y fisura ocular estrecha con glándulas de meibomio atróficas que es similar al síndrome de ojo seco en seres humanos. Estos resultados indican que la deficiencia de SCD1 puede afectar a la síntesis no solamente de ácidos grasos monoinsaturados como componentes del éster de colesterol y triglicéridos tisulares sino a otros lípidos tales como ésteres de cera del párpado.

Patología macroscópica y examen histológico de ratones Knock-Out para SCD-/-

Los ratones SCD-/- estaban sanos y eran fértiles, pero presentaban anormalidades cutáneas. Estas anormalidades comenzaron aproximadamente a la edad del destete (3-4 semanas) con piel seca, finas escamas epidérmicas, y pérdida de pelo que se volvió más grave con la edad. Además, los ratones mostraban estrechas fisuras oculares. El examen patológico de la piel y los párpados mostró que los ratones de tipo silvestre tenían unas glándulas sebáceas y de meibomio prominentes y bien diferenciadas (no se muestran los datos). Por otro lado, en la piel y el parpado de los SCD-/- aparecían células acinares atróficas en las glándulas sebácea y de meibomio (no se muestran los datos). No se descubrieron anormalidades en la córnea ni en la retina (no se muestran los datos).

Los ratones SCD-/- tienen niveles bajos de lípidos neutros en el párpado y la piel

Medimos los contenidos de colesterol libre (FC) y éster de colesterol (CE), triglicéridos y éster de cera en el párpado. La cromatografía en capa fina (TLC) de lípidos extraídos del párpado de ratones SCD1-/- demostró niveles marcadamente reducidos de éster de colesterol y triglicéridos en comparación con los lípidos extraídos del párpado de ratones de tipo silvestre (figura 16A). La Tabla 3 compara el contenido de lípidos del párpado entre ratones SCD-/- y de tipo silvestre.

TABLA 3

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Como se muestra en la Tabla 3, y muestra que el contenido de éster de colesterol en el párpado y en la piel de ratones SCD1-/- se redujo en un 74%, mientras que el colesterol libre aumentaba 1,75 veces. Había una reducción del nivel de CE y triglicéridos en el hígado de los SCD-/- también, pero no había ninguna diferencia en el contenido de colesterol libre en el hígado (no se muestran los datos). El contenido de triglicéridos y éster de cera en el párpado de los ratones SCD-/- se redujo en un 60% y un 75%, respectivamente.

La figura 16B muestra el uso de un disolvente diferente de acuerdo con Nicolaids et al (Nicolaides, N., y Santos, E. C. (1985). The di-and triesters of the lipids of steer and human meibomian glands. Lipids 20, 454-67) constituido por hexano/benceno (45:65) que se usó para resolver los diferentes ésteres de cera muestra que el triéster es el principal éster de cera. Estos triésteres así como los diésteres se redujeron en un 72% en los ratones SCD-/-. El contenido de triéster de cera del párpado se redujo en un 72% en los ratones SCD-/-. De forma similar al párpado, el contenido de éster de colesterol y triglicéridos en la piel de ratones SCD-/- se redujo en un 43% y un 53%, respectivamente mientras que el colesterol libre aumentaba en 1,9 veces (Tabla 3, y figuras 16A y B). Finalmente, el contenido absoluto de ácidos grasos monoinsaturados en cada fracción se redujo drásticamente en los ratones SCD1-/- con aumentos correspondientes de los ácidos grasos saturados (no se muestran los datos).

El 18:1 dietético no restauró las anormalidades de la piel y el párpado en ratones SCD-/-

El oleato es uno de los ácidos grasos más abundantes en la dieta. Los ácidos grasos monoinsaturados celulares usados para la síntesis de éster de colesterol y triglicéridos, podrían sintetizarse de novo mediante la ácido graso sintasa y SCD o mediante incorporación de oleato exógeno indirectamente de la dieta. Para determinar si el oleato de la dieta podía sustituirse por el oleato sintetizado de forma endógena y restaurar las anormalidades capilares, cutáneas y oculares de los ratones SCD-/-, suplementamos a las dietas semi-purificadas de los ratones con altos niveles de 18:1n-9 (50% de la grasa total) como trioleno, y a continuación se dieron esas dietas a ratones SCD-/- durante 2 semanas. Sin embargo, estas anormalidades no se restauraban con estas dietas que contenían muchos ácidos grasos monoinsaturados. Esto sugiere que los inhibidores específicos de SCD1 actuarían para reducir los niveles de TG independientemente de la dieta. En su lugar, los niveles de éster de colesterol, éster de cera y triglicéridos en los párpados de ratones SCD-/- alimentados con una dieta rica en 18:1n-9 seguían siendo más bajos que los de ratones SCD +/+ (no se muestran los datos), lo que sugería que se requieren ácidos grasos monoinsaturados sintetizados de forma endógena para la síntesis de los ésteres de colesterol triglicéridos y ésteres de ceras de mebo.

En el presente estudio, hemos establecido ratones knock-out para SCD1 y hemos mostrado que la deficiencia de SCD causaba expresión selectiva de sustrato y selectiva de tejido. El nivel de palmitoleato en ratones SCD-/- se reduce en más de un 50% en todos los tejidos incluyendo el hígado, que expresaba SCD1 en ratones de tipo silvestre. Por otro lado, las alteraciones del nivel de oleato eran específicas del tejido.

De forma similar a ratones Asebia que tienen una mutación espontánea de SCD1, los ratones SCD-/- mostraban anormalidades del crecimiento capilar, piel, y el ojo con penetrancia completa. Estos fenotipos eran percibibles desde la edad del destete. El examen histológico de la piel y el párpado mostraba que la glándula sebácea atrófica en la piel y la glándula de meibomio en el borde del párpado donde SCD1 se expresa de forma abundante, carecían de lípidos sebáceos y de meibomio secretados, los llamados, sebo y mebo, respectivamente. De hecho, descubrimos los lípidos neutros incluyendo triglicéridos, varios tipos de ésteres de cera y éster de colesterol que se sabe que son componentes del sebo y mebo, estaban marcadamente reducidos en el párpado y también en la epidermis (no se muestran los datos) de los ratones SCD-/-.

La blefaritis crónica similar a las anormalidades del párpado que hemos descrito en los ratones SCD-/-, es una de las enfermedades frustrantes más comunes en seres humanos. Shine y McCulley (Shine, W. E., y McCulley, J. P. (1998). Keratoconjunctivitis sicca associated with meibomian secretion polar lipid abnormality. Arch Ophthalmol 116, 849-52) describieron que la blefaritis crónica puede deberse a anormalidades lipídicas en el mebo. La naturaleza de estas anormalidades lipídicas no se caracterizaron en detalle. Descubrieron sin embargo, que el mebo de pacientes con queratoconjuntivitis de meibomio tiene niveles reducidos de ácido oleico, un producto principal de SCD mientras que el de pacientes con seborrea de meibomio tiene niveles aumentados de 18:1. Estas observaciones, junto con nuestro presente estudio, sugieren que la alteración de la actividad de SCD puede estar implicada en blefaritis crónica. Por lo tanto, la SCD puede convertirse en una potencial diana para el desarrollo de fármacos terapéuticos y preventivos para el tratamiento de enfermedades oculares.

Secuencia Promotora de estearoil-CoA desaturasa humana 1

SEC ID Nº 1

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<120> Métodos y Composiciones que Usan Estearoil CoA Desaturasa para Identificar Agentes Terapéuticos que Reducen Triglicéridos

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<130> 760050-7

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<140>

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<141>

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<150> U.S. 60/184.526

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<151> 24-02-2000

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<150> U.S. 60/221.697

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<151> 31-07-2000

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<150> U.S. 60/255.771

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<151> 15-12-2000

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<160>

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 617

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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8

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<210> 2

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<230> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR para el Exón 6.

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<400> 2

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gggtgagcat ggtgctcagt ccct

\hfill

24

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<210> 3

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<230> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de PCR para el gen neo.

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<400> 3

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atagcaggca tgctggggat

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<230> Descripción de la secuencia artificial: Cebador de amplificación por PCR.

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cacaccatat ctgtccccga caaatgtc

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<230> Descripción de la secuencia artificial: Cebador cadena arriba de amplificación por PCR.

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<400> 5

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nnnnggtacc ttnngaaaag aacagcgccc

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<230> Descripción de la secuencia artificial: Cebador cadena abajo de amplificación por PCR.

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<400> 6

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nnnnagatct gtgcgtggag gtccccg

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Claims

1. Un método para identificar un agente de modulación de estearoil-CoA desaturasa (SCD1), que comprende:

a): poner en contacto, en condiciones fisiológicas, a un agente químico y una fracción de membrana microsómico que tiene actividad de SCD1 o a dicho agente químico y una célula que tiene actividad de SCD1;

b): detectar un cambio de dicha actividad de SCD1 debido a dicha puesta en contacto;

c): ensayar dicho agente químico para seleccionar adicionalmente compuestos que no inhiban en un ser humano la actividad biológica de delta-5-desaturasa o delta-6-desaturasa,

identificando de este modo un agente de modulación de SCD1.

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2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha fracción de membrana microsómica o célula que tiene actividad de SCD1 comprende un polipéptido de SCD1.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho cambio de la actividad de SCD1 es un aumento de la actividad de SCD1.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho cambio de la actividad de SCD1 es una reducción de la actividad de SCD1.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la actividad de SCD1 en dicha fracción de membrana microsómica o célula se determina usando un sustrato radiomarcado.

6. El método de la reivindicación 5, en el que dicha radiomarca es tritio.

7. El método de la reivindicación 5, en el que dicha actividad de SCD1 hace que el sustrato radiomarcado produzca agua radiomarcada.

8. El método de la reivindicación 7, en el que dicha agua radiomarcada es agua marcada con tritio.

9. El método de la reivindicación 5, en el que dicho sustrato radiomarcado es estearoil-CoA radiomarcada.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho sustrato radiomarcado es estearoil-CoA que comprende un átomo de tritio solamente en C9 y C10.