PT1315518E - Vacina contra patogénios microbianos - Google Patents

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PT1315518E
PT1315518E PT01963230T PT01963230T PT1315518E PT 1315518 E PT1315518 E PT 1315518E PT 01963230 T PT01963230 T PT 01963230T PT 01963230 T PT01963230 T PT 01963230T PT 1315518 E PT1315518 E PT 1315518E
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Camilo Anthony Leo Selw Colaco
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Immunobiology Ltd
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Description

Descrição
VACINA CONTRA PATOGÉNIOS MICROBIANOS A presente invenção diz respeito a uma vacina e a um método para produzir uma vacina. Mais especificamente, é provida uma vacina que compreende um patogénio microbiano e um método para produzir o mesmo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Um componente importante de qualquer resposta imune humana é a apresentação de antigénios para células T através de células que apresentam antigénio (APCs) tais como os macrófagos, células B ou células dendriticas. Os fragmentos de péptido de antigénios estranhos são apresentados na superfície do macrófago na combinação com moléculas com complexo de histocompatibilidade major (MHC), em associação com moléculas auxiliares, tais como moléculas CD4 e CD8. Tais fragmentos de péptidos antigénicos apresentados desta forma são reconhecidos pelo receptor de células T. A interacção dos fragmentos de péptidos antigénicos com o receptor de células T resulta numa proliferação especifica de células T de antigénio e secreção de linfoquinas pelas células T. A natureza do fragmento de péptido antigénico apresentado pelos APCs é crítica no estabelecimento de imunidade.
As proteínas de choque térmico (hsps) formam uma família de proteínas altamente conservadas que são amplamente distribuídas por todo o reino vegetal e animal. Na base dos seus pesos moleculares, os hsps são agrupados em seis diferentes famílias: pequenos (hsp 20-30kDa); hsp40; hsp60; hsp70; hsp90; e hsplOO. Apesar de alguns hsps serem originalmente identificados em células sujeitas a stress térmico, foi descoberto estarem associadas com várias formas de stress, tais como infecções, e são deste modo comummente referidas como proteínas de stress (Sps).
Membros da família mamífera hsp90 incluem citosólicos hsp90 (hsp83) e os homólogos de retículo endoplasmático hsp90 (hsp83), hsp87, Grp94 (Erp99) e gp97, ver por exemplo Gething et al. (1992) Nature 355:33-45. Os membros da família hsp70 incluem citosólicos hsp70 (p73) e hsp70 (p72), o homólogo de retículo endoplasmático BiP (Grp78), e o homólogo mitocondrial hsp70 (Grp75). Os membros da família mamífera hsp60 foram apenas identificados na mitocôndria.
As proteínas de stress são ubiquamente expressas dentro das células. Um dos papéis das proteínas de stress é o de péptidos chaperone de um compartimento celular para outro e apresentar péptidos às moléculas MHC para a apresentação da superfície de célula ao sistema imune. No caso de células doentes, as proteínas de stress também acompanha os péptidos associados a vírus ou tumor à superfície de célula, ver Li and Sirivastave (1994) Behring Inst. Mitt, 94: 37-47 e Suzue et al. (1997) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94:13146-51. A função de chaperone de proteínas de stress é conseguida através da formação de complexos entre proteínas de stress e fragmentos de péptidos antigénicos e entre proteínas de stress e fragmentos de péptidos associados a vírus ou tumor, numa reacção dependente ATP. Os fragmentos de péptidos complexados com as proteínas de stress formam complexos antigénicos (hspCs) que são capturados pelos APCs para fornecer fragmentos de péptidos antigénicos. A associação complexa de proteínas de stress com fragmentos de péptidos também foi observada em tecidos normais, e não é por isso um fenómeno específico de tumor, ver Srivastava (1994) Experimentia 50: 1054-60. Pensa-se que a imunogenicidade dos membros da família hsp70, incluindo grp96, reflecte o seu papel normal no 'presentosome', o organito intracelular postulado que funciona na carga de moléculas MHC Classe I requeridas para a sua expressão de superfície de célula. Este passo é essencial para o seu reconhecimento MHC restrito pelas células T específicas de antigénio, ver Srivastava et al. (1998) Immunity, Singh-Jasuja et al. J.Exp.Med (2000) 191, 1957.
Até recentemente, não foi proposto usar complexos de péptidos hsp (hspCs) endógenos derivados de patogénios como vacinas, apesar do facto de que os hsps dos patogénios têm sido usados extensivamente como antigénios e adjuvantes. A Publicação PCT No WO 2001/013944 descreve o uso de hspCs endógenos derivados de patogénios e em particular hspCs induzidos por stress são mostrados para dar uma boa imunidade protectora em animais vacinados.
Os membros da família hsp microbianos incluem as famílias do Dna J e Dna K e as famílias Gro-EL e Gro-ES. Nos micróbios procarióticos parece que essas famílias são codificadas em operões, com o gene inicial no operão sendo um gene de controlo que suprime a expressão dos genes hsp contidos no operão.
Em Streptomyces e Helicobacter, a expressão do gene hspR suprime a expressão do Dna J e Dna K. Por conseguinte, a supressão do gene hspR resulta no micróbio geneticamente modificado que expressa constitutivamente o hsps, ver Bucca et al. (1997) Mol. Microbiol 15: 633-45. Foram identificados operões homólogos num número de micróbios recentemente sequenciados, incluindo outras estirpes de Streptomyces e Mycobacterium tuberculosis e a vacina da estirpe BCG relacionada, comummente usada.
Outros genes repressores podem também controlar a expressão dos membros da família do gene hsp e estes podem também ser criados geneticamente para fornecer micróbios modificados que constitutivamente expressam hspCs que podem ser utilizados para a produção de vacinas e vectores de vacina. Estes incluem, mas não são limitados ao sigma dos genes de controlo transcricional e rho e os genes MerR e HmrR de proteína de stress reguladora de genes. Também será apreciado que os micróbios modificados que contêm o hspCs constitutivos podem ser usados directamente como vacinas ou como uma fonte para o isolamento dos hspCs. Além disso, a expressão de gene(s) heterólogo(s) de outro(s) patogénio(s) nestes micróbios vai permitir o seu uso como vectores de vacina para a produção simplificada de vacinas baseadas em hspC para estes patogénios.
Enquanto se olha para o uso de complexos de péptido hsp microbianos endógenos induzidos pelo calor, os complexos de péptidos hsp extraídos foram comparados ao uso do próprio micróbio induzido por stress como uma vacina. Surpreendentemente, o uso do micróbio como uma vacina dá uma melhor e significativa imunidade nos animais vacinados, do que o uso dos complexos de péptidos hsp isolados. Resultados semelhantes foram obtidos usando micróbios geneticamente modificados que produzem constitutivamente hsps, indicando que os hspCs foram formados in situ com polipéptidos microbianos endógenos, incluindo genes heterogéneos expressos como proteínas recombinantes no micróbio. Os micróbios geneticamente modificados também podem ser usados como uma fonte eficiente para o isolamento de hspCs para o uso em vacinas de subunidades e multi-subunidades.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção, é provida uma vacina que compreende um patogénio bacteriano morto, seco ou atenuado como um determinante imunogénico, em que o patogénio bacteriano foi sujeito a um estímulo que induz o stress, em que este é a modificação genética do patogénio bacteriano, de tal forma que pelo menos um gene repressor para um gene de proteína de choque térmico está inactivo, permitindo deste modo a expressão constitutiva de um gene de proteína de choque térmico.
De preferência, a modificação genética resulta numa inactivação do gene repressor hspR.
Alternativamente, a modificação genética resulta numa inactivação dos genes MerR de proteína reguladora de gene de stress ou genes HmrR repressores, ou o sigma de genes de controlo transcricional e rho.
De preferência, o patogénio bacteriano é seleccionado do grupo que consiste em Micobactéria, Salmonella, Vibrio, Streptomyces, Helicobacter, Lactococcus e Listeria.
De preferência, a vacina compreende ainda um adjuvante.
De preferência, o adjuvante é seleccionado do grupo que consiste em adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ISCOMs e esqualeno.
De preferência, a vacina é adequada para administração por injecção.
Alternativamente, a vacina é adequada para a administração oral.
De preferência, a vacina é adequada para a administração através de um formato de administração sem agulha.
Um outro aspecto da presente invenção fornece uma composição de vacina, de acordo com a presente invenção, para o uso no tratamento de infecção com um patogénio bacteriano, o qual é fornecido como determinante imunogénico na composição de vacina.
De preferência, a vacina é administrada como uma vacina profiláctica.
De preferência, a vacina é administrada como uma vacina terapêutica.
De preferência, a composição da vacina é administrada por injecção.
Alternativamente, a composição da vacina é administrada através de administração sem agulha.
Alternativamente, a composição da vacina é administrada por via transdérmica, administração pulmonar ou oral.
Ainda um outro aspecto da presente invenção fornece um método de produção de uma composição de vacina, que compreende um determinante imunogénico, caracterizado pelo facto de que o dito método compreende os passos de: sujeitar os patogénios bacterianos ao estímulo que induz stress, em que este é a inactivação de um gene que reprime a expressão dos genes de choque térmico; e usando o patogénio bacteriano stressado na preparação da composição de vacina como o dito determinante imunogénico.
De preferência, o gene reprimido é o gene hspR.
Alternativamente, o gene reprimido é um gene MerR ou HmrR de proteína reguladora de gene de stress, ou sigma de genes de controlo transcricional e rho.
De preferência, as células de patogénio microbianos são mortas antes do uso na dita vacina.
De preferência, as células de patogénios microbianos são mortas antes do uso na dita vacina.
De preferência, a composição de vacina é uma composição aquosa.
Alternativamente, composição de vacina é uma composição seca ou uma composição liofilizada.
Ainda aqui descrito está o uso de um micróbio patogénico, o qual tem sido geneticamente modificado de tal forma que pelo menos um gene repressor para o gene de choque térmico é inactivo, permitindo deste modo uma expressão constitutiva de proteínas de choque térmico, como um vector de vacina, o qual permite ainda a expressão de um antigénio heterólogo.
De preferência, o micróbio patogénico é um organismo procariótico, o qual é adequado para o uso de um vector de vacina.
De preferência, o organismo procariótico é BCG e o fragmento de antigénio heterólogo é o fragmento C. de toxóide tetânico.
Alternativamente, o organismo procariótico é Salmonella ou Lactococcus, de tal modo que a vacina pode ser administrada oralmente.
Ainda aqui descrito está o uso de um micróbio patogénico, o qual tem sido geneticamente modificado de tal forma que pelo menos um gene repressor para o gene de choque térmico é inactivo, permitindo deste modo uma expressão constitutiva de proteínas de choque térmico, como uma fonte de proteína de choque térmico - complexos de péptidos para o uso em vacinas subunidades e multiunidades.
Por "patogénios microbianos" entende-se qualquer patogénio capaz de induzir uma doença infecciosa num animal, incluindo organismos particularmente bacterianos, protozoários, fungos ou parasíticos.
Por "estímulo que induz stress" entende-se qualquer estímulo que induz a produção de SPs e em particular hsps em patogénios microbianos, incluindo stress térmico ou osmótico. Tal estímulo que induz stress também inclui alterações genéticas desenhadas para tornar constitutiva a expressão de proteínas de stress e em particular hsps em patogénios microbianos. Estas alterações incluem a inactivação de genes repressores (supressores) que funcionam na supressão de proteínas de stress e em particular a supressão dos genes que expressam proteínas de choque térmico. Em particular, isto inclui a inactivação do gene supressor hspR, os genes MerR e HmrR de proteína reguladora de gene de stress, ou sigma de genes de controlo transcricional e rho.
Também será apreciado que tais alterações genéticas sejam prontamente atingidas por meios genéticos moleculares e inclui mutagénese insercional usando vectores bacteriófagos ou transposão, ver por exemplo Bucca et al. Mol.Microbiol. (1997) 17:633. Também será apreciado que a presença dos genes para os operões, genes supressores e SPs e hsps em patogénios microbianos possa ser simplesmente estabelecida por técnicas de ADN recombinante, ver "Current Techniques in Molecular Biology", (1999) Wiley Press.
Deste modo, deve ser apreciado que qualquer micróbio que expressa estes genes pode ser geneticamente modificado para fornecer uma vacina de acordo com esta invenção. Isto inclui organismos microbianos existentes usados como vacinas vivas ou mortas, tais como Micobactéria, Salmonella, Vibrio e Listeria e em particular variedades atenuadas destes patogénios. Em particular, os mutantes Micobactéria, os quais foram geneticamente modificados para eliminar o gene repressor de proteína de choque térmico podem ser usados numa vacina contra a tuberculose, enquanto os mutantes de Salmonella, os quais foram geneticamente modificados para eliminar os genes repressores de proteína de choque térmico podem ser usados numa vacina contra a tifoide. 0 uso de tais organismos como vectores de vacina para a expressão de genes heterólogo é ainda fornecido pela presente invenção. 0 termo "vacina" é aqui usado para denotar qualquer composição que contém um determinante imunoqénico que estimule o sistema imunitário, de tal forma que pode melhor responder a infecções subsequentes. Será apreciado que a vacina contenha normalmente um determinante imunoqénico e um adjuvante, o adjuvante servindo para aumentar não especificamente a resposta imune àquele determinante imunogénico. Adjuvantes adequados são prontamente aparentes para o especialista na técnica e inclui adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ISCOMs ou esqualeno.
Contudo, será apreciado que a vacina da presente invenção possa também ser eficaz sem um adjuvante.
Para a indução não genética de SPs, as condições óptimas para induzir os SPs podem realmente ser determinadas por simples ensaio e erro com o efeito de uma mudança de estimulo sendo estimada ao usar técnicas convencionais, tais como testes in vivo em animais, ou outras técnicas, por exemplo aquelas descritas em 'Current Protocols in Immunology', Wiley Interscience, 1997. Tais outras condições são descritas no Pedido PCT No GB00/03228 e citações aqui referidas.
Ainda aqui descrito está um método para expor um animal a uma vacina da invenção ao administrar uma quantidade farmacologicamente aceitável da vacina da invenção, opcionalmente em combinação com um adjuvante, suficiente para obter uma resposta imune no animal. 0 animal é normalmente um humano. Contudo, a invenção pode também ser aplicada ao tratamento de outros mamíferos tais como cavalos, gado, cabras, ovelhas ou porcos e ao tratamento de pássaros, nomeadamente aves domésticas tais como galinhas ou perus. De preferência, o patogénio microbiano seleccionado para uso numa vacina particular da presente invenção leva a uma doença ou infecção nas espécies do animal para a qual a vacina é administrada a, ou espécies relacionadas. As vacinas desta invenção podem ser usadas como vacinas profilácticas ou terapêuticas, embora será apreciado que sejam particularmente utilizadas como vacinas profilácticas devido à sua economia de produção.
As composições de vacina da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio adequado, tal como oralmente, por inalação, por via transdérmica ou através de injecção e em qualquer veiculo adequado. Contudo, é preferido administrar a vacina como uma composição aquosa por injecção, usando uma agulha qualquer adequada ou uma técnica sem agulha.
Será apreciado que a vacina da invenção possa ser aplicada como um tratamento inicial, seguido de um ou mais tratamentos "propulsores" subsequentes à mesma ou taxa de dosagem diferente, num intervalo de 1 a 26 semanas entre cada tratamento para fornecer uma imunização prolongada contra o patogénio. A presente invenção será agora descrita, como forma de exemplo, com referência aos desenhos em anexo, em que: A Figura 1 mostra a sequência nucleótida do gene hspR de M. tuberculosis, e A Figura 2 mostra uma lista de genes supressores identificados os quais têm homologia a hspR. EXEMPLO 1 Preparação de micróbios induzidos por calor. A estirpe M.vaccae NCTC11659 cresceu para saturação em meio Sauton, diluído num meio fresco e cresceu durante a noite para dar numa cultura de fase log que sofreu então um choque térmico a 42° C durante 3 horas ou a 39° C durante 5 horas e cultivado durante a noite. As células foram então lavadas num meio, seguido por uma lavagem em soro e liofilizadas em alíquotas de vacina individual ou usadas directamente para a imunização de testes em animais. Para comparação isolada endógena, os complexos de péptidos SP foram preparados como descrito na Publicação PCT No WO 2001/013944. Essencialmente, células induzidas por stress lavadas são então ressuspensas em homogeneização-tampão, tal como PBS com 0.5% Tween e células são então eliminadas através de ciclos congelação-descongelação ou usando um eliminador de células (por exemplo, batedor, prensa francesa). 0 lisato de célula é então tratado por centrifugação, normalmente 3-5000 g durante 5 minutos, para remover o núcleo e detritos de células, seguido por um passo de centrifugação a alta velocidade, normalmente 100.000 g durante 15-30 minutos. O sobrenadante deste modo obtido é processado para dar um complexo de fragmento de péptido antigénico/SP, adequado para uso numa vacina. Isto pode ser feito simplesmente por precipitação de sulfato de amónio, o qual usa um corte de 20-70% de sulfato de amónio. Especificamente, 20% (w/w) de sulfato de amónio é adicionado a 4o C, o precipitado é descartável, seguido pela adição de mais sulfato de amónio para trazer à concentração a 70% w/w. O precipitado de proteína é colhido por centrifugação e depois dialisado num tampão injectável e fisiológico adequado, tal como soro, para remover o sulfato de amónio antes de uso. Os complexos SP podem ser usados em qualquer concentração adequada para fornecer o determinante imunogénico na composição da vacina. É preferido que a quantidade do complexo de proteína-péptido induzido por stress esteja no intervalo de 10-600 yg, de preferência 10-100 pg, e mais preferencialmente 25 pg por kg de peso corporal animal.
Para conseguir determinar a imunogenicidade dos complexos SP, podem ser usados os testes de proliferação das células T. Testes adequados incluem a reacção linfocitária mista (MLR), testado por assimilação de timidina tritiada, e testes de citotoxicidade para determinar a libertação de 51Cr das células alvo, ver 'Current Protocols in Immunology', Wiley Interscience, 1997. Para Micobactéria, os MLRs podem também ser testados para a indução de produção de citoquina, tal como a produção de interferão-gamma usando o kit comercial (CSL Ltd). Alternativamente, a produção de anti-corpos pode ser examinada, usando imunoensaios Standard ou testes plaque lise, ou estimada por protecção intra-uterina de um feto, ver 'Current Protocols in Immunology'.
Ratos foram imunizados com organismos stressados por calor ou os complexos de péptido SP endógeno isolado dos organismos stressados por calor em soro tampão fosfato sem qualquer adjuvante adicionado, tanto nas vacinações primárias ou propulsor. A imunização com organismos induzidos por stress completo e em particular organismos liofilizados dão significativamente melhor imunidade do que quando induzidos por complexos de péptidos SP endógenos isolados, incluindo IFN-gamma aumentado e produção de anticorpos. EXEMPLO 2 Preparação e uso de mutantes hsp constitutivos.
Os micróbios que produzem hsp constitutivos podem ser construídos através de separação de genes supressores reguladores transcricionais tais como hspR, MerR (proteína reguladora de operão de resistência), HmrR (proteína reguladora de metal pesado) e os seus homólogos ou genes de controlo transcricional rho e sigma. Tais genes são prontamente identificados ao monitorizar as bases de dados de sequência de genoma como sequências de testes normais. Um exemplo de tal sequência de teste normal é o gene hspR de M. tuberculosis (mostrado na Figura 1). Um exemplo de uma lista de supressores identificados os quais têm homologia ao gene hspR, é mostrado na Figura 2.
As estirpes M. bovis que produzem constitutivamente hspCs foram construídas ao criar geneticamente a estirpe M. Bovis BCG para produzir os mutantes de eliminação para o gene hspR. 0 gene hspR foi eliminado por recombinação homóloga usando um vector suicida com um grande fragmento do gene hspR e um marcador de selecção canamicina. O fragmento de gene hspR foi clonado por PCR do ADN genómico BCG, usando primários derivados da sequência hspR M. tuberculosis mostrado na Figura 1.
Os mutantes de eliminação hspR BCG foram usados para produzir hspCs e a proteína produzida obtida destes foi comparada com aquela obtida das estirpes do tipo selvagem de choque térmico. Tal abordagem deve ser amplamente aplicável à produção de hspCs de qualquer procariota que transporta o gene supressor relevante. Estes irão fornecer uma fonte valiosa para o fabrico de vacinas baseadas e, hspC. Deste modo, os hspCs produzidos dos mutantes de eliminação hspR BCG induzem imunidade protectora contra a detecção de aerossol por M. tuberculosis comparável aqueles induzidos por hspCs obtidos das estirpes BCG do tipo selvagem de choque térmico.
Os mutantes de eliminação hspR BCG também podem ser usados como vectores de vacina para expressar antigénios heterólogos. Por exemplo, os ratos imunizados com mutante de eliminação hspR BCG que expressa o fragmento C de toxóide tetânica (TT), mostram a produção de anticorpos anti-TT como detectado por Western Blotting. Tal abordagem deve ser amplamente aplicável à produção de vectores similares para a expressão de antigénios de vacina heterólogos usando mutantes de qualquer procariota adequada para o uso como um vector de vacina. Por exemplo, o uso de mutantes Salmonella ou Lactococcus deve permitir a produção de vectores identificados para a administração na mucosa de vacinas. As vacinas desenvolvidas neste principio serão em particular vantajosas, visto elas poderem ser administradas oralmente.
Lisboa, 23 de Fevereiro de 2010
REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o EPO nega qualquer responsabilidade neste sentido.
Documentos de patente citados na descrição
♦ WO 2001013944 A · GB 0003228 W
Literatura não-patente citada na descrição • Gething et al. Nature, 1992, vol. 355, 33-45 •Li; Sirivastave. Behring Inst. Mitt, 1994, vol. 94, 37-47 • Suzue et al. Proc .Natl. Acad. Sei. USA, 1997, vol. 94, 13146-51 • Srivastava. Experimentia, 1994, vol. 50, 1054-60 • Srivastava et al. Immunity 1998 • Singh-Jasuja et al. J.Exp.Med, 2000, vol. 191, 1957 • Bucca et al. Mol.Microbiol, 1997, vol. 15, 633-45 • Bucca et al. Mol.Microbiol., 1997, vol. 17, 633 • Current Techniques in Molecular Biology. Wiley Press, 1999 • Current Protocols in Immunology. Wiley Interscience, 1997

Claims (23)

  1. Reivindicações 1. Uma vacina que compreende um patogénio bacteriano morto, seco ou atenuado como um determinante imunogénico, em que o patogénio bacteriano foi sujeito a um estimulo que induz o stress em que este é a modificação genética do patogénio bacteriano, de tal forma que pelo menos um gene repressor para um gene de proteína de choque térmico está inactivo, permitindo deste modo a expressão constitutiva de um gene de proteína de choque térmico.
  2. 2. Uma composição de vacina como reivindicado na reivindicação 1, em que a modificação genética resulta na inactivação do gene repressor hspR.
  3. 3. Uma composição de vacina como reivindicado na reivindicação 1, em que a modificação genética resulta na inactivação dos genes MerR ou HmrR de proteína reguladora do gene de stress.
  4. 4. Uma composição de vacina como reivindicado na reivindicação 1, em que a modificação genética resulta na inactivação dos genes de controlo de transcrição rho ou sigma.
  5. 5. Uma composição de vacina como reivindicado em qualquer reivindicação anterior em que o patogénio bacteriano é seleccionado do grupo que consiste em Micobactéria, Salmonella, Vibrio, histeria, Streptomyces, Helicobacter e Lactococcus. 1/4
  6. 6. Uma composição de vacina como reivindicado em qualquer reivindicação anterior, em que a vacina compreende ainda um adjuvante.
  7. 7. Uma composição de vacina como reivindicado na reivindicação 6, em que, o adjuvante é seleccionado do grupo que consiste de adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, Quil A, Detox, ISCOMs e esqualeno.
  8. 8. Uma composição de vacina como reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores, em que a vacina é adequada para administração por injecção.
  9. 9. Uma composição de vacina, como reivindicada nas reivindicações 1 a 8, em que a composição de vacina é adequada para a administração oral.
  10. 10. Uma composição de vacina, como reivindicada na reivindicação 9, em que a composição de vacina é adequada para administração através de um formato de administração sem agulha.
  11. 11. Uma composição de vacina, como reivindicada em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, para uso no tratamento de infecção com um patogénio bacteriano o qual é fornecido como um determinante imunogénico na composição de vacina.
  12. 12. Uma composição como reivindicado na reivindicação 11 em que a vacina é uma vacina profiláctica.
  13. 13. Uma composição como reivindicado na reivindicação 11 em que a vacina é uma vacina terapêutica. 2/4
  14. 14. Uma composição como reivindicado na reivindicação 11 em que a vacina é administrada por injecção.
  15. 15. Uma composição como reivindicado na reivindicação 11 em que a vacina é administrada por administração sem agulha.
  16. 16. Uma composição como reivindicado na reivindicação 11 em que a vacina é administrada por via transdérmica.
  17. 17. Uma composição como reivindicado na reivindicação 11 em que a vacina é administrada por administração pulmonar.
  18. 18. Uma composição como reivindicado na reivindicação 11 em que a vacina é administrada oralmente.
  19. 19. Um método para produzir uma composição de vacina que compreende um determinante imunogénico caracterizado pelo facto de que o dito método compreende os passos de: Sujeitar um patogénio bacteriano a um estimulo que induz ao stress, caracterizado pelo facto de que este é a inactivação de um gene o qual reprime a expressão de genes de proteína de choque térmico; e Usando o patogénio bacteriano stressados como um determinante imunogénico na composição de vacina.
  20. 20. Um método como reivindicado na reivindicação 19, caracterizado pelo facto de que o gene repressor é o gene hspR. 3/4
  21. 21. Um método como reivindicado na reivindicação 19, caracterizado pelo facto de que o gene repressor é o gene hspR.
  22. 22. Um método como reivindicado em qualquer reivindicação 19 a 21, em que as células patogénio bacterianas são mortas antes do uso na dita vacina.
  23. 23. Um método como reivindicado em qualquer reivindicação 19 a 21, em que as células patogénio bacterianas são mortas antes do uso na dita vacina. Lisboa, 23 de Fevereiro de 2010 4/4 Figura 1 hspR: 378 bp - M. tuberculosis - atggcgaagaacccaaaggacggggaatcccggacgtttttgatctcggtagccgccgagctag ccggcatgcatgcacagaccctgcgtacctacgatcgtcttgggttggtcagcccgcggcgcac ctccggtggcgggcgccgctattccGtgcatgacgtcgagttgctgcgceaggtgcagcacctc tcgcaggacgagggggtcaacttggccggcatcaagcgcattattgaactgaccagtcaggtcg aggcgctgcagtccaggttgcaagagatggctgaggagttggcggtgttgcgtgccaaccagcg ccgcgaggtcgcggtggtgccgaagagcaccgccctggtcgtctggaaaccgcgccgg Figura 2 GI PROTEIN DESCRIPTION 13094040 heat shock regulator [Mycobacterium leprae] 987631 heat shock protein [Streptomyces coelicolor] 1850936 HspR [Streptomyces albus] 6458658 transeriptional regulator, McrR family [Deinococcus radiodurans] 6968663 putative heat shock transeriptional regulator [Campylobaeter jejum] 2314167 putative heat shock protein (hspR) [Helicobacter pylori 26695] 4154930 putative TRANSCRJPTIONAL REGULATOR [Helicobacter pylori J99] 2983291 transeriptional regulator (MerR family) [Aquifex aeolicus] 216395 GlnRprotein [Bacillus subtilis] 80358 glutamine synthetase transcription repressor glnR [validatcd] - Bacillus subtilis 577593 For protein sequence: merR (Hg resistence) protems. [Myxococcus xanthus] 80075 hypothetical 15K protein (glnA 5' region) - Bacillus cereus 7635981 putative MerR-fanrily transeriptional regulator. [Streptomyces coelicolor A3(2)] 2120400 hypothetical protein 11 - Myxococcus xanthus (fragment) 15140739 putative protein, merR and LacI family [Sinorhizobium meliloti] m 2116754 YfinP [Bacillus subtilis] 1405480 scgR [Bacillus subtilis] 13476954 hypothetical protein (Mesorhizobium loti] 595259 NolA [Bradyrh^obium clkaniij 15156241AGR C 2207p [Àgrobacterium tumefaciens] 9657661 transeriptional regulator, putative [Vibrio cholerae] 1/2 Figura 2 Cont/... 1075010 merRhomolog ΗΙ0293 - Haemophilus influenzae (strain Rd KW20) 6093208 GlnR protein [Lactobacillusrhamnosus] 10174111 transcriptional regulator [Bacillus halodurans] 15073910 PUTATIVE TRANSCRIPTION REGULATOR PROTEIN [Sinorhizobium meliloti] 988279 NolA [Bradyrhizobium sp.] 12060165 0RF1 [Streptomyces coelicolor] 11493190 putative merR-family transcriptional regulator [Streptomyces coelicolor] 9950914 probable transcriptional regulator [Pseudomonas aeruginosa] 98171 hypothetical protein 1 (mer operon) - Bacillus sp 6562779 putative merR-family transciptional regulator [Streptomyces coelicolor] 3413184 regulatoiy protein [Exiguobactenum sp.] 4633809 heavy metal regulator HmrR [Rhizobium leguminosarum bv. viciae] 11071705 regulatory protein [Bacillus licheniformis] 1006583 merR [Synechocystis sp. PCC 6803] 577592 For protein sequence: merR (Hg resistence) proteins. [Myxococcus xanthus] 7321278 hypothetical protein SCD31.13c [Streptomyces coelicolor A3(2)] 7649594 hypothetical protein [Streptomyces coelicolor A3(2)] 11071711 regulatory protein [Bacillus macroides] 15156225 AGR_C_2183p [Agrobacterium tumefaciens] 98175 mercmic resistance operon regulatory protein - Bacillus sp 6179679 regulator of pmrA [Streptococcus pneumoniae] 12723097 transcriptional regulator [Lactococcus lactis subsp. lactis] 12642170 nodulation transcriptional activator protein NolA [Bradyrhizobium sp. WM9] 9657439 transcriptional regulator, MerR family [Vibrio cholerae] 4680351 heavy metal regulator HmrR [Sinorhizobium meliloti] 15140905 putative transcriptional regulator, merR family protein [Sinorhizobium meliloti] 6941979 putative MerR-family transcriptional regulator [Streptomyces coelicolor] 7688302 putative MerR-family transcriptional regulator. [Streptomyces coelicolor A3(2)] 2894244 hypothetical protein Rv3334 [Mycobacterium tuberculosis H37Rv] 48151 merR2 [Acidithiobacillus ferrooxidans] 2815330 SC10A5.22, unknown, [Streptomyces coelicolor A3(2)] 1074017 probable DNA-binding protein homolog - Haemophilus influenzae (strain Rd KW20) 13622897 putative transcriptional activator regulator protein [Streptococcus pyogenes Ml GAS] 12517921 putative transcriptional regulator [Escherichia coli 0157:H7 EDL933]
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