PT1278534E

PT1278534E - Métodos e composições para prejudicar a multiplicação do hiv-1

Info

Publication number: PT1278534E
Application number: PT01927295T
Authority: PT
Inventors: Gideon Goldstein
Original assignee: Thymon Llc
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2007-02-28
Also published as: CN1426306A; CA2406746A1; NO20025153D0; JP4282934B2; US20050245454A1; AU2001253762B2; NO20025153L; DK1278534T3; ES2278741T3; PL363071A1; US6524582B2; NZ522824A; AU5376201A; EP1278534A1; DE60125751D1; US20020192232A1; AU2001253762B9; IL152507A0; JP2004514406A; WO2001082944A1

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA PREJUDICAR A MULTIPLICAÇÃO DO HIV-1"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se, de um modo geral, a composições e métodos úteis para inibir a multiplicação do vírus-1 da imunodeficiência humana (HIV-1) em doentes infectados, sintomáticos ou assintomáticos e para atenuar a multiplicação do HIV-1 após infecção primária em indivíduos anteriormente não infectados, minimizando, deste modo, a progressão da SIDA.

Antecedentes da Invenção Várias abordagens ao tratamento do virus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) concentraram-se no gene (tat) transactivante do HIV-1, que produz uma proteína (Tat) essencial para a transcrição do vírus. 0 gene tat e a sua proteína foram sequenciados e estudados para utilização em tratamentos propostos do HIV [ver, e. g., Patentes US N°. 5158877; 5238882; e 5110802; Pedidos Internacionais de Patente N°. WO92/07871, WO91/10453, WO91/09958 e WO87/02989, publicados, respectivamente, em 14 de Maio de 1992, 25 de Julho de 1991, 11 de Julho de 1991 e 21 de Maio de 1987] . A proteína Tat é libertada extracelularmente, tornando-a disponível para ser incorporada por outras células infectadas, para intensificar a 1

transcrição do HIV-1 nas células e por células não-infectadas, para alterar as activações de genes da célula hospedeira. A Tat torna as células susceptiveis à infecção pelo virus. A incorporação da Tat pelas células é muito forte e foi descrita como mediada por uma sequência básica curta da proteina [S. Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA 91: 664-668 (1994)]. A imunização com a proteina Tat do HIV-1 como uma potencial vacina contra a SIDA está sob investigação activa. A sequência HXB/LAV da Tat do HIV-1 foi utilizada como imunogénio em estudos descritos, sob a forma de uma proteina recombinante [A. Cafaro et al., Nat. Med., 5: 643-650 (1999)], de uma vacina de ADN [S.

Calarota et al., Lancet, 351: 1320-5 (1998)], de uma proteina inactivada (toxóide Tat) [S. S. Cohen et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA, 96 (19): 10842-10847 (1999); A. Gringeri et al., J.

Hum. Virol., 1: 293-8 (1998)] ou uma vacina de ADN expressando

Tat inactiva [E. Caselli et al., J. Immunol., 162:5631-5638 (1999)]. As imunizações com a sequência Tat completa induziram imunidade, tanto celular como humoral. Ver, também, M. C. Rhe et al., J. Acquir. ImmmuneDefic. Syndr. Hum. Virol. 10: 408-416 (1995); C. J. Li et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 8116-8120 (1997); e outros]. O Pedido de Patente Internacional N°. W092/14755, publicado a 3 de Setembro de 1992, refere-se à proteina Tat e ao receptor da integrina da superfície celular capaz de se ligar à proteína Tat. Estão identificadas duas sequências da Tat que se ligam à integrina: -Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg- [SEQ ID N°: 1], assim como -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro- [SEQ ID N°: 2]. Estas sequências são a região ou o domínio básico que constitui o local de ligação dominante para a integrina. Esta descrição demonstra que vários péptidos correspondentes a estas sequências 2 da Tat e as integrinas correspondentes bloqueiam, in vitro, a ligação de células a placas revestidas com Tat, como fazem os anticorpos às integrinas adequadas. No entanto, a descrição mostra, também, que estes reagentes não bloqueiam a incorporação de Tat funcional pelas células (ver o Exemplo 9, no documento W092/14755), anulando, deste modo, o mecanismo de acção proposto para utilização terapêutica na infecção com HIV. As sequências da Tat descritas neste pedido internacional são distintas dos imunogénios peptidicos da presente invenção.

Foram já produzidos anticorpos em animais contra a proteina Tat, tanto monoclonais, como policlonais, que demonstram bloquear a incorporação da proteina Tat in vitro [ver, e. g., D. Brake et al., J. Virol., 64: 962 (1990); D. Mann et al., EMBO J., 10: 1733 (1991); J. Abraham et al., citado acima; P. Auron et al., citado acima; M. Jaye et al., citado acima; G. Zauli et al., citado acima]. As descrições mais recentes mostraram, que a adição de anticorpos monoclonais ou policlonais, contra a proteina Tat, a meio de cultura de tecidos, atenuou a infecção com HIV-1 in vitro [L. Steinaa et al., Arch. Virol., 139: 263 (1994); M. Re et al., citado acima; e G. Zauli et al., J. Acq. Imm. Def. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 306 (1995)].

As próprias publicações do requerente [G. Goldstein, Nature Med., 2: 960 (1996); e Pedido de Patente Internacional N°. W095/31999, publicado a 30 de Novembro de 1995] reviu indícios sugerindo que a secreção da proteína Tat do HIV-1, a partir de células infectadas e a incorporação por células, tanto infectadas como não infectadas, era importante para o infectividade do HIV-1. Estudos anteriores demonstraram, também, que os anticorpos contra a proteína Tat bloqueavam a incorporação da Tat in vitro e inibiam a infectividade in vitro. 3

Foi sugerida a imunização activa de mamíferos, para induzir anticorpos contra a proteína Tat do HIV-1, como uma potencial vacina contra a SIDA. Ver, também, G. Goldstein et al., "Minimization of chronic plasma viremia in rhesus macaques immunized with synthetic HIV-1 Tat peptides and infected with a chimeric simian/human immunodeficiency virus (SHIV33)", Vaccine, 18:2789 (2000).

Outras publicações do requerente, o Pedido de Patente Internacional N°. WO99/02185, publicado a 21 de Janeiro de 1999 e a Patente U.S. N°. 5891994, concedida a 6 de Abril de 1999, divulgaram um novo conceito no tratamento e prevenção da infecção com HIV-1, que utilizava sequências da Tat que eram reconhecidas como epitopos pelo sistema imunitário do coelho. Ao contrário das divulgações anteriores discutidas acima, estas publicações referem-se a combinações terapêuticas e imunogénicas que requerem, pelo menos, dois e, de um modo preferido, a totalidade dos quatro péptidos ou polipéptidos da Tat, compreendendo as sequências do "Epitopo I" que se estendem dos resíduos de aminoácido 4 (ou 5) a 10 da Tat, como se segue: -Asp-Pro-X,-Leu-Glu-Pro- [SEQ ID N°: 3] ou R1-Val-Asp-Pro-X7~Leu-Glu-Pro-R2 [SEQ ID N°: 4], em que X7 é Arg, Lys, Ser ou Asn.

Essas composições induzem anticorpos que reagem com a maioria das proteínas Tat do HIV-1 e impedem a multiplicação do HIV-1. De acordo com esta publicação, podem ser adicionadas algumas outras sequências da Tat a esta composição, as quais compreendem um péptido ou polipéptido do "Epitopo II", que se estende pelos resíduos de aminoácido 41-50 da Tat, da fórmula R3-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 [SEQ ID N°: 5], em que X42 é seleccionado do grupo consistindo em Gly ou Ala.

Alternativamente, pode ser adicionado a esta composição um péptido ou polipéptido do "Epitopo III", que se estende pelos 4 resíduos de aminoácido 56-62 da Tat, da fórmula R5-Arg-Arg-X58- Z59-A60“Y6i_Ser-R6 [SEQ 1—1 U 3 0 6] , em que X58 é seleccionado do grupo consistindo em Ala, Pro, Ser e Gin; em que Yei é seleccionado do grupo consistindo em Asp, Asn, Gly e Ser; em que Z59 é seleccionado do grupo consistindo em Pro e His; em que A6o é seleccionado do grupo consistindo em Gin e Pro. Ainda alternativamente, pode ser adicionado a esta composição um péptido ou polipéptido do "Epitopo IV", que se estende pelos resíduos de AA 62-73 da Tat da fórmula R7-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67_ Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SEQ ID N°: 7], em que X&4 é seleccionado do grupo consistindo em Asn e Thr; em que Y&i é seleccionado do grupo consistindo em Ala e Vai. A própria composição pode ser utilizada para induzir anticorpos contra um grande número de sequências da Tat, características de várias variantes do HIV-1. As composições ou os anticorpos produzidos são utilizados como vacina ou tratamentos profilácticos contra estas várias variantes.

Apesar do conhecimento crescente sobre a progressão da doença do HIV-1, persiste uma necessidade na técnica de desenvolvimento de composições e métodos para o tratamento do HIV-1, tanto profilaticamente como terapeuticamente, que sejam úteis para baixar os níveis virais do HIV-1, para o tratamento e possível prevenção da subsequente doença da SIDA, geralmente fatal.

Sumário da Invenção

Num aspecto, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo, pelo menos, duas variantes de um péptido ou polipéptido do Epitopo I da fórmula Rl-Asp-Pro-Yv-Leu-Xg-Pro-Trp- 5

Zi2-R2 [SEQ ID N°: 8], em que Y7 é seleccionado do grupo consistindo em Arg, Lys, Ser e Asn; em que X9 é seleccionado do grupo consistindo em Glu e Asp; em que Z12 é seleccionado do grupo consistindo em Lys e Asn; em que RI é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, alquilo inferior, alcanoilo inferior e uma sequência com entre 1, a cerca de, 5 aminoácidos, opcionalmente, substituída com um alquilo inferior ou alcanoilo inferior; em que R2 é seleccionado do grupo consistindo num hidroxilo livre, uma amida e numa sequência com um ou até, cerca de, 5 aminoácidos adicionais, opcionalmente, substituída com uma amida. Nesta composição, pelo menos, uma das duas variantes deve ter a fórmula em que Y7 é Arg e Z12 é Lys e, pelo menos, uma segunda das duas variantes deve ter a fórmula em que Y7 é Asn e Z12 é Asn. Cada péptido desta composição é reconhecido como um Epitopo I da Tat do HIV-1 pelo sistema imunitário de um primata. Esta fórmula permite a construção e a utilização de várias combinações peptídicas.

Num outro aspecto, a composição acima descrita contém ainda um ou mais péptidos ou polipéptidos adicionais, os quais representam outras sequências de aminoácidos que correspondem ao resíduos de aminoácidos 5 ao resíduo de aminoácido 12 da Tat do HIV-1. Estas sequências de aminoácidos opcionais são descritas detalhadamente abaixo. Estas sequências são, de um modo preferido, provenientes de uma estirpe de HIV-1 com uma variante da proteína Tat nessa localização.

Num outro aspecto, esta invenção proporciona uma composição descrita acima, que contém péptidos ou polipéptidos que compreendem, pelo menos, os dois péptidos do Epitopo I requeridos, reconhecidos por primatas (e, de um modo preferido, péptidos do Epitopo I adicionais), em combinação com um ou mais 6

Epitopos II, III e/ou IV da Tat do HIV-1. Os epitopos II, III e IV são as fórmulas peptídicas da Tat do HIV-1, descritas na Publicação Internacional de Patente N°. WO99/02185. Essas composições podem combinar péptidos da Tat do HIV-1 adequados, de forma a proporcionar uma composição que induz anticorpos reactivos com mais de, cerca de, 95% da totalidade das proteínas Tat do HIV-1 conhecidas.

Ainda num aspecto adicional a invenção proporciona uma composição de anticorpo compreendendo anticorpos, de um modo preferido, produzidos num primata, os quais se ligam, especificamente, a um péptido ou polipéptido da fórmula Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-trp-Zi2-R2 [SEQ ID N° : 8], em que Y7 é seleccionado do grupo consistindo em Arg, Lys, Ser e Asn; em que Xg é seleccionado do grupo consistindo em Glu e Asp; em que Zi2 é seleccionado do grupo consistindo em Lys e Asn; em que RI é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio , num alquilo inferior, num alcanoílo inferior e numa sequência com entre 1 a, cerca de, 5 aminoácidos, opcionalmente, substituída com um alquilo inferior ou alcanoílo inferior; em que R2 é seleccionado do grupo consistindo em hidroxilo livre, uma amida e uma sequência com um ou até cerca de 5 aminoácidos adicionais, opcionalmente, substituída com uma amida. Esta composição de anticorpo, compreende um anticorpo que se liga à variante do

Epitopo I em que Y7 é Arg e Z72 é Lys e, pelo menos, um segundo anticorpo que se liga a uma segunda variante do Epitopo I, em que Y7 é Asn e Zi2 é Asn. Podem ser, também, incluídos outros anticorpos dirigidos contra outras variantes, para além das duas variantes especificadas nesta composição. Estes anticorpos na composição ligam-se às sequências do Epitopo I reconhecidas pelo sistema imunitário do primata, em que o epitopo está presente sob a forma de várias variantes das proteínas Tat do HIV-1. 7

Estes anticorpos incluem várias construções de anticorpo, tais como anticorpos monoclonais, como descrito detalhadamente abaixo.

Ainda num aspecto adicional a invenção proporciona um gene sintético que codifica, sequencialmente, um péptido ou um polipéptido, que contém, pelo menos, duas variantes de um péptido ou polipéptido do Epitopo I da fórmula Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-Xg-Pro-Trp-Zi2-R2 [SEQ ID N°: 8], como definida acima. Neste gene sintético, pelo menos, uma das duas variantes deve ter a fórmula em que Y7 é Arg e Z12 é Lys e, pelo menos, uma segunda das duas variantes deve ter a fórmula na qual Y7 é Asn e Z72 é Asn. Opcionalmente, este gene sintético compreende um péptido do Epitopo II do terminal carboxilo, como reconhecido pelo sistema imunitário dos primatas. Alternativamente, o gene recombinante ou sintético contém as sete ou oito sequências de aminoácidos preferidas do Epitopo I, reconhecidas por primatas, identificadas abaixo. 0 gene sintético pode conter cada sequência de aminoácidos separada por uma sequência espaçadora ou pode expressar cada péptido/polipéptido numa grelha de leitura aberta com uma proteina veiculo. 0 gene sintético pode ser separado da proteina veiculo, através de um espaçador, se o espaçador se encontrar fundido com uma sequência do Epitopo I reconhecido por primatas, deixando uma sequência do Epitopo II no terminal carboxilo da proteina recombinante. As formas de realização adicionais incluem vários péptidos do Epitopo I, da fórmula acima, fundidos conjuntamente e com a proteina veiculo.

Ainda num aspecto adicional, a invenção proporciona uma molécula sintética, e. g., um vector, compreendendo o gene sintético acima descrito, ligado operativamente a sequências de ácido nucleico reguladoras que dirigem e controlam a expressão do produto do gene sintético numa célula hospedeira. É, também, aqui descrito um microrganismo recombinante, e. g.r um virus ou bactéria comensal, que contém o gene ou a molécula sintéticos, descritos acima. Este microrganismo é capaz de expressar várias cópias do produto do gene ou molécula num hospedeiro.

Ainda um outro aspecto da invenção, consiste numa composição farmacêutica útil para induzir anticorpos que reagem com um grande número de proteinas Tat do HTV-1 conhecidas, e. g., mais de 95% e, de um modo preferido, mais de 99%, das proteinas Tat conhecidas. Estes anticorpos induzidos podem impedir a multiplicação do HIV-1. A composição farmacêutica compreende, pelo menos, uma das composições de péptidos/polipéptidos recombinantes ou sintéticas descritas acima; ou o gene sintético/molécula descrito acima; ou o microrganismo recombinante descrito acima, num veiculo farmaceuticamente aceitável.

Ainda um aspecto adicional, da invenção consiste numa composição farmacêutica útil para prejudicar a multiplicação do HIV-1, contendo, esta composição, uma composição de anticorpo ou uma composição de anticorpo monoclonal acima descrita. É, também, divulgado um método para reduzir os níveis virais do HIV-1, que envolve a exposição de um humano ou outro primata a composições farmacêuticas que induzem anticorpos, descritas acima, induzindo activamente anticorpos que reagem com a maioria das proteínas Tat do HIV-1 e prejudicando a multiplicação do vírus in vivo. Este método é apropriado para um 9 indivíduo infectado com o HIV-1, com um sistema imunitário competente ou para um indivíduo não infectado ou cronicamente infectado, mas assintomático. 0 método induz anticorpos que reagem com as proteínas Tat do HIV-1, as quais reduzem a multiplicação virai durante qualquer infecção aguda inicial com o HIV-1 e as quais minimizam adicionalmente a viremia crónica que leva à SIDA. É, também, divulgado um método para reduzir os níveis virais do HIV-1, pela administração a um humano que é incapaz de estabelecer uma resposta imunitária eficaz ou rápida contra a infecção com o HIV-1, uma composição farmacêutica contendo as composições de anticorpo descritas acima. 0 método pode envolver a administração da composição de um modo crónico. São, também, divulgados métodos para produzir as composições descritas acima, assim como células hospedeiras transfectadas com essas composições. É, também, divulgado um kit útil para a medição e a detecção dos títulos e das especificidades dos anticorpos induzidos pela imunização com as composições descritas acima. 0 kit da invenção inclui, de um modo preferido, os dois péptidos do Epitopo I requeridos, descritos acima, assim como péptidos de adição do Epitopo I, reconhecido por primatas e, possivelmente, péptidos adicionais dos Epitopos II a IV e suportes sólidos revestidos, um reagente marcado para detectar a ligação de anticorpos a estes péptidos e diversos substratos e aparelhos para produzir ou detectar os sinais proporcionados pelas marcações, assim como aparelhos convencionais para recolher amostras de sangue, frascos apropriados e outros componentes de ensaio de diagnóstico. 10 É, também, divulgado um método para detectar os títulos e os padrões de reactividade de anticorpos em indivíduos imunizados com as composições desta invenção. 0 método inclui os passos de incubação de diluições do fluido biológico do indivíduo, e. g. soro, com placas ou esferas nas quais estão ligados um ou mais péptidos das sequências do Epitopo I desta invenção e, opcionalmente, os Epitopos II a IV, eliminando os materiais biológicos não-ligados, por lavagem e medindo qualquer anticorpo ligado aos péptidos, com o reagente marcado, e. g., uma anti-imunoglobulina humana à qual está associada uma enzima. Dependendo do tipo de marcação utilizada, o sinal produzido pela marcação pode ser produzido pela adição de mais substrato, o qual reage com a enzima, e. g., produzindo uma alteração da coloração. Podem ser, também, incorporadas outras marcações convencionais na concepção deste ensaio.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção são descritos adicionalmente na seguinte descrição detalhada das suas formas de realização preferidas.

Breve Descrição dos Desenhos A Fig. IA é um gráfico dos títulos de ELISA do antisoro de coelho contra péptidos do Epitopo I lineares maiores, em péptidos detectores truncados, expressos como uma percentagem da ligação máxima aos péptidos maiores. São apresentados os aminoácidos do terminal N ou C dos péptidos detectores correspondentes, em baixo de cada coluna, no código de uma letra. 11 A Fig. 1Β é um gráfico dos títulos de ELISA do antisoro de primata contra péptidos do Epitopo I lineares maiores, em péptidos detectores truncados, expressos como uma percentagem da ligação máxima aos péptidos maiores. São apresentados os aminoácidos do terminal N ou C dos péptidos detectores correspondentes, em baixo de cada coluna, no código de uma letra. A Fig. 2A é um gráfico dos títulos de ELISA do antisoro de coelho contra péptidos do Epitopo II lineares, em péptidos detectores truncados, expressos como uma percentagem da ligação máxima aos péptidos maiores. São apresentados os aminoácidos do terminal N ou C dos péptidos detectores correspondentes, em baixo de cada coluna, no código de uma letra. A Fig. 2B é um gráfico dos títulos de ELISA do antisoro de primata contra péptidos do Epitopo II lineares maiores, em péptidos detectores truncados, expressos como uma percentagem da ligação máxima aos péptidos maiores. São apresentados os aminoácidos do terminal N ou C dos péptidos detectores correspondentes, em baixo de cada coluna, no código de uma letra. A Fig. 3A ilustra a concepção de uma construção imunogénica de Epitopo I/Epitopo II da Tat do HIV-1, pentavalente, no código de aminoácidos de três letras [SEQ ID N°: 12]. A Fig. 3B ilustra a concepção de um Epitopo I universal octavalente, no código de aminoácidos de três letras [SEQ ID N°: 13]. 12 A Fig. 3C ilustra a concepção de uma construção do Epitopo II universal imunogénico, univalente, no código de aminoácidos de três letras [SEQ ID N°: 14].

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção proporciona uma solução para o problema apresentado acima, proporcionando composições adicionais que induzem anticorpos em indivíduos não infectados ou nas etapas iniciais da infecção com HIV-1, ainda capazes de estabelecer uma resposta imunitária a um imunogénio, reagindo, os anticorpos, com um grande número (i. e., superior a 95% e de um modo preferido, superior a 99%) de variantes conhecidas da proteína

Tat do HIV-1. 0 termo "variante da sequência (ou da proteína) Tat" designa um polipéptido ou péptido contendo resíduos de aminoácido da proteína Tat ou uma sequência de uma proteína Tat de outra estirpe do HIV-1, que é substancialmente semelhante à sequência de consenso da Tabela I [SEQ ID N°: 15]. Cada variante pode diferir da sequência de consenso e/ou de outra variante em, pelo menos, uma modificação de aminoácido dentro dos resíduos de interesse para os Epitopos I a IV. Esta modificação pode proporcionar a mesma ou outra especificidade antigénica contra esse Epitopo Tat particular, quando adicionada à composição da invenção.

Os anticorpos induzidos por composições desta invenção podem inibir a multiplicação do HIV-1, a qual previne a continuação da progressão da doença para SIDA. São, também, proporcionadas composições de anticorpo para utilização em humanos infectados ou não-infectados, que sejam incapazes de estabelecer uma resposta imunitária eficaz ou rápida contra a 13 infecção com HIV-1. Estas composições são capazes de reagir com um grande número de proteínas Tat reduzindo, deste modo, os níveis virais do HIV-1. Estes anticorpos são úteis, tanto em contextos terapêuticos, como profilácticos, para controlar o desenvolvimento da SIDA numa grande população, exposta ou infectada com estirpes de HIV-1 que produzem proteínas Tat imunologicamente distintas após a infecção.

As composições da presente invenção incluem péptidos ou proteínas, baseados em péptidos proporcionados por um epitopo da proteína Tat do HIV-1, contra a qual os primatas desenvolveram anticorpos ou sequências de ácido nucleico que codificam péptidos e polipéptidos que induzem anticorpos contra a Tat, em primatas. Estes anticorpos induzidos, por sua vez, impedem a multiplicação do HIV-1. A proteína Tat do HIV-1 é produzida a partir de dois exões: o Exão 1 codifica uma proteína com 72 aminoácidos (AA) que pode ser expressa sem excisão ou que pode ser excisada com os aproximadamente 15-32 aminoácidos codificados pelo Exão 2. A sequência do Exão 1 da Tat do HIV-1 encontra-se na Tabela I e é uma sequência de consenso baseada nas sequências da proteína Tat de 31 estirpes HIV-1 conhecidas, encontradas no subtipo B comum [base de dados NIH Los Alamos] . As posições de aminoácido nas quais aparecem variações encontram-se em letras minúsculas. Na Tabela I [SEQ ID N°: 15], o resíduo de aminoácido na posição 73 é a primeira Pro do Exão 2 da Tat do HIV-1. Uma vez que o produto com 72 aminoácidos do Exão 1, isolado, tem capacidade de incorporação e activação celular, é essencial que os anticorpos reajam e interditem o transporte intercelular do péptido com 72 aminoácidos. A Tat do HIV-1 contém uma região rica em cisteína entre as posições dos AA 22 e 37 do Exão 1 [SEQ ID N° : 15], com 14 uma ligação covalente simples entre CyS2i e Cyssi, produzindo uma estrutura terciária complexa. A literatura cientifica tem indicado que esta região não parece ser imunogénica. Os anticorpos predominantes contra a Tat, são contra a região linear do terminal N, rica em Pro (AA1-21) e a região linear básica (AA44-65), com um anticorpo adicional descrito, contra AA62-73. 0 requerente identificou anteriormente epitopos, i. e., regiões de ligação, reconhecidas por anticorpos de coelho (sequências antigénicas) na sequência linear 1-21 do terminal N (22 AA) do Exão 1 [SEQ ID N° : 15] de variantes da Tat e definiu quatro epitopos de célula B na Tat do HIV-1. Como anteriormente descrito na Publicação de Patente Internacional WO99/02185, as regiões imunogénicas desta sequência maior foram reconhecidas pelo sistema imunitário do coelho. Estas regiões estão identificadas na sequência de consenso do Exão 1 na Tabela I abaixo: o Epitopo I foi identificado por anticorpos de coelho como a sequência de nove aminoácidos das posições dos AA 2-10 do Exão 1. O Epitopo II foi identificado como a sequência com oito aminoácidos das posições dos AA 43-50 do Exão 1. O epitopo III foi identificado como a sequência de 7 aminoácidos das posições dos AA 56-62 do Exão 1. O epitopo IV foi identificado como a sequência de doze aminoácidos das posições dos AA 62-73 da Tat, incluindo a primeira Pro (AA 73) do Exão 2 e sobrepondo-se à Ser 62 do Epitopo III. 15

Tabela I - Sequência Tat de Consenso 1 10 20

Met glu Pro Vai aso oro arg Leu Glu Pro Trp Ivs His Pro Gly Ser Gin Pro lys thr 30 40 ala cys thr asn Cys Tyr Cys Lys lys Cys Cys phe his Cys gin vai Cys Phe ile thr 50 60

Lys glv Leu glv Ile Ser Tyr Glv Arg Lvs Lys Arg Arg Gin Arg arg arg ala pro gin 70 asp Ser gin thr his Gin vai ser Leu ser Lys gin [SEQID NO: 15].

No entanto, na presente invenção, o requerente detectou uma alteração surpreendente nas sequências de aminoácido, em particular do Epitopo I, reconhecido pelas células B em primatas. Na Tabela I, as sequências dos Epitopos I e II reconhecidas por primatas encontram-se sublinhadas. O Epitopo I reconhecido por primatas estende-se dos resíduos de aminoácido 5 a 12 da Tat. A sequência do Epitopo II reconhecida pelas células B em primatas estende-se pelos aminoácidos 41-50. Os epitopos III e IV são os mesmos epitopos reconhecidos em coelhos, como descrito no documento WO99/02185. A. Composições Imunogénicas do Epitopo I Reconhecido por Primatas

Numa forma de realização, a presente invenção proporciona uma composição contendo, pelo menos, duas variantes de um péptido ou polipéptido reconhecido pelo sistema imunitário dos primatas e promove uma resposta imunitária humoral específica (para o objectivo desta invenção) num primata exposto in vivo às sequências. Estas sequências de aminoácidos do Epitopo I reconhecido por primatas, correspondem aos resíduos de 16 aminoácido 5-12 da sequência de consenso da Tat [SEQ ID N°: 15] da Tabela I, derivadas de várias "variantes da sequência da Tat". O Epitopo I reconhecido por primatas define péptidos da fórmula geral: Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-Xg-Pro-Trp-Zi2-R2 [SEQ ID N°: 8], em que Y7 é Arg, Lys, Ser ou Asn; X9 é Glu ou a Asp; e Z12 é Lys ou Asn. Esta fórmula possibilita vários péptidos variantes do Epitopo I de mamífero. A composição desta invenção deve conter, pelo menos, uma variante peptídica em que Y7 é Arg e Z12 é Lys e, pelo menos, uma segunda variante peptídica, na qual Y7 é Asn e Z12 é Asn.

Os aminoácidos especificados que aparecem na fórmula do Epitopo I reconhecido por primatas acima é uma sequência reactiva do Epitopo I mínimo de primata. Cada imunogénio definido por essa fórmula que é utilizado em métodos desta invenção para desenvolver anticorpos contra a sequência do Epitopo I mínimo, pode ser uma sequência de aminoácidos maior. Por exemplo, os aminoácidos do Epitopo I mínimo são flanqueados por outros aminoácidos, de forma a que a totalidade da sequência imunogénica do Epitopo I tenha entre, cerca de, 8 e 25 aminoácidos de comprimento. A identidade dos aminoácidos flanqueadores não é essencial para a função biológica do Epitopo I imunogénico. Em particular, os aminoácidos adicionais no terminal N das sequências do Epitopo I reconhecidas por primatas, não afectam a imunogenicidade. Deste modo, para cada péptido do Epitopo I reconhecido por primatas, o RI do terminal N pode ser um hidrogénio livre, no aminoácido não modificado do terminal N ou um alquilo inferior (i. e., alquilo C1-C10) ou um alcanoílo C1-C10 inferior, tal como um grupo acetilo. 0 RI pode, também, incluir uma sequência com, entre 1 a, cerca de, 5 aminoácidos, opcionalmente, substituída com um alquilo inferior ou alcanoílo inferior. De um modo preferido, RI representa 2 17 aminoácidos. Numa forma de realização, RI é Vai, resultando na sequência Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Zi2 [SEQ ID N°: 37], em que Y7, X9 e Z12 são definidos como acima. Numa outra forma de realização, RI é -X2-Pro-Val-, resultando na sequência X2-Pro-Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12 [SEQ ID N° : 38], em que X2 é Glu ou a Asp e em que Y7, X9 e Z12 são definidos como acima. De um modo preferido, RI representa 3 aminoácidos.

Aminoácidos adicionais no terminal C da sequência do Epitopo I minimo reconhecido por primatas, podem intensificar o titulo do anticorpo. Embora o R2 do terminal C possa ser um grupo hidroxilo livre simples no aminoácido do terminal C, este pode ser, também, uma amida no terminal C. No entanto, para aumentar o titulo, R2 é, de um modo preferido, uma sequência com entre 1, a cerca de, 14, de um modo preferido, cerca de 4 aminoácidos adicionais amidados no terminal carboxilo. Numa forma de realização preferida, R2 é -His-Pro-Gly-Ser-amida, resultando na sequência Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Zi2-His-Pro-Gly-Ser [SEQ ID N°: 16], em que Y7, X9 e Ζχ2 são definidos como acima.

De um modo preferido, uma composição desta invenção inclui, para além dos dois péptidos requeridos, identificados acima, pelo menos, cinco ou seis sequências de aminoácidos diferentes da fórmula do Epitopo I reconhecido por primatas. De um modo mais preferido, a composição compreende sete ou oito sequências de aminoácidos variantes, identificadas imediatamente abaixo. A composição pode, também, conter outras sequências de péptido ou de polipéptido, contendo, cada uma, uma combinação diferente de Xg, Y7 e Zi2 ♦ Como demonstrado nos exemplos abaixo, com três locais de variabilidade antigénica no Epitopo I reconhecido por primatas, uma composição preferida desta invenção pode conter péptidos suficientes do Epitopo I reconhecido por primatas, para 18 compreender 95% da totalidade das variantes conhecidas da Tat do grupo B e grupo não-B do HIV-I, pela inclusão de dois péptidos "requeridos":

Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID N°: 17]; e

Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID N°: 18], assim como um a cinco dos péptidos do Epitopo I adicionais, seguintes:

Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID N°: 19];

Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID N°: 20];

Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID N°: 21];

Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID N°: 22]; e

Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID N°: 23]; assim como, ainda opcionalmente, a variante rara Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID N°: 24]. A composição da invenção do Epitopo I reconhecido por primatas, pode conter vários péptidos ou polipéptidos adicionais que contenham outras sequências que correspondam aos resíduos de aminoácido entre AA 5 a AA 12 da SEQ ID N°: 15, mas que sejam derivadas de outras variantes da Tat que não inter-reajam bem com anticorpos contra composições do Epitopo I reconhecido por primatas. As composições do Epitopo I desta invenção podem conter várias cópias de cinco ou mais péptidos do Epitopo I diferentes, sob qualquer ordem. Numa forma de realização estão 19 presentes, pelo menos, uma cópia de sete ou de todas as oito sequências de aminoácidos descritas acima [SEQ ID Nos: 17-24] .

Estes péptidos ou polipéptidos da invenção são produzidos sinteticamente ou de modo recombinante. Podem ser incluídos aminoácidos opcionais (e. g., -Gly-Ser-) ou outros espaçadores de aminoácidos ou de compostos químicos, nos terminais dos péptidos, com o objectivo de ligar os péptidos em conjunto ou a um veículo. Esta composição pode tomar a forma de um ou mais dos péptidos descritos acima, expressos como um péptido sintético ligado a uma proteína veículo. Alternativamente, uma composição pode conter vários péptidos do Epitopo I, cada um expresso como um péptido antigénico múltiplo, opcionalmente, ligado à proteína veículo. Alternativamente, os péptidos seleccionados podem ser ligados sequencialmente e expressos dentro de uma proteína produzida de modo recombinante. Como uma forma de realização, as oito sequências especificamente identificadas acima encontram-se ligadas em sequência, com e sem aminoácidos espaçadores entre estas, para formar uma proteína recombinante maior. Alternativamente, a proteína recombinante pode ser fundida com uma proteína veículo, na grelha de leitura correcta. Estas composições de Epitopo I de primata são concebidas para induzir anticorpos reactivos com mais de 95% das variantes conhecidas da proteína Tat do HIV-1, incluindo proteínas Tat dos grupos B e não-B do HIV-1.

As composições de Epitopo I reconhecido por primatas apresentam uma actividade biológica de indução num primata imunitariamente competente, imunizado, i. e., um humano não-infectado ou um humano infectado assintomático, uma resposta imunitária humoral activa (i. e., anticorpos) que é dirigida contra mais de 95% e, de um modo preferido, mais de 99%, das 20 variantes conhecidas de proteínas Tat do HIV-1. 0 resultado final desse tratamento é um impedimento da multiplicação do HIV-1 após uma infecção aguda. Este impedimento previne niveis do HIV-1 elevados no plasma, após seroconversão, associados com a progressão para a SIDA. A indução activa de anticorpos na fase assintomática da infecção com HIV pode reduzir a multiplicação virai, baixar a carga virai do plasma e reduzir a probabilidade da progressão para a SIDA. A composição contendo, pelo menos, os dois imunogénios do Epitopo I reconhecido por primatas requeridos e, de um modo preferido, sete ou oito dessas sequências do Epitopo I [e. g., SEQ ID N°: 17-24], pode promover uma resposta imunitária contra, cerca de, 95% das 294 sequências da Tat dos subtipos B comuns do HIV-1 conhecidas e contra as proteínas Tat da totalidade dos 56 subtipos não-B do HIV-1, que foram sequenciados [cortesia da Dra. Esther Guzman, base de dados do HIV Los Alamos NIAID; base de dados GenBank]. B. Composições Imunogénicas Contendo Epitopos Adicionais

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona outras composições que utilizam duas ou mais sequências do Epitopo I reconhecido por primatas combinadas com, pelo menos, uma sequência do Epitopo II e, opcionalmente, com um ou mais péptidos do Epitopo III ou IV. Estes Epitopos II, III e IV da Tat do HIV-1, como reconhecidos pelo sistema imunitário do coelho, são descritos em detalhe no Pedido de Patente Internacional N°. WO99/02185.

Descrito resumidamente, a sequência do Epitopo II promove uma resposta imunitária humoral especifica num primata exposto à sequência do Epitopo II in vivo. 0 epitopo II, como reconhecido 21 por primatas, define péptidos da fórmula R3-Lys-X42_Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 [SEQ ID N°: 5], em que X42 é Gly ou Ala. 0 epitopo minimo reconhecido pelo sistema imunitário dos primatas é o dos aminoácidos especificamente identificados com essa fórmula, i. e., -Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-(aminoácidos 41-50 da SEQ ID N°: 15). Esta é, também, a sequência do imunogénio para o Epitopo II presentemente preferido. Este imunogénio em que X42 é Gly induz anticorpos inter-reactivos com a sequência em que X42 é Ala. Este irá reagir/inter-reagir com mais de 95% das proteínas Tat do HIV-1 conhecidas. Esta sequência do epitopo II não tem qualquer variabilidade antigénica num grande número de variantes da Tat do HIV-1 conhecidas. O R3 do terminal N pode representar o hidrogénio no aminoácido Lys não modificado do terminal N ou R3 pode ser um alquilo inferior ou um alcanoílo inferior, tal como um grupo acetilo, substituinte na Lys. O R3 pode, também, incluir uma sequência com entre 1 a cerca de 5 aminoácidos, opcionalmente, substituída com um alquilo inferior ou alcanoílo inferior. O R4 do terminal C pode representar o hidroxilo livre do aminoácido do terminal C ou R4 pode ser uma amida nesse aminoácido do terminal C. O R4 pode incluir aminoácidos não-polares adicionais, tal como um espaçador. Pode ser utilizado um exemplo de espaçador, gly-ser-gly-ser, resultando na sequência Lys-X42_Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser [SEQ ID N°: 25], em que X42 é Gly ou Ala. No entanto, R4 não pode consistir nos aminoácidos básicos -Lys-Arg-Arg-, os quais ocorrem naturalmente na sequência Tat, após o último aminoácido na fórmula do Epitopo II. Esta sequência do Epitopo II encontrada em 294 variantes da Tat do grupo B, é reconhecida por primatas (Como descrito no documento WO99/02185, o sistema imunitário do coelho reconhece o epitopo AA43-50 da SEQ ID N°: 15) . 22 0 Epitopo II é fracamente imunogénico quando apresentado dentro de outras sequências. Deste modo, para uma imunogenicidade óptima, esta sequência é preparada como um péptido sintético fundido com ou ligado a, uma proteína veículo ou como um péptido antigénico múltiplo, opcionalmente, ligado à proteína veículo. Alternativamente, o Epitopo II pode ser expresso como a sequência do terminal C de uma proteína recombinante, a qual está, opcionalmente, fundida, na grelha de leitura correcta, com uma proteína veículo na sua sequência do terminal amino. Numa composição desta invenção, um péptido do Epitopo II é, de um modo preferido, apresentado isolado ou em combinação com um ou mais péptidos do Epitopo I reconhecido por primatas.

Descrito resumidamente, e como identificado no documento WO99/02185, o Epitopo III define péptidos da fórmula: R5-Arg-Arg-X58-Z59-A6o-Y6i-Ser-R6 [SEQ ID N° : 6], em que X58 pode ser Ala,

Pro, Ser ou Gin; Y6i pode ser Asp, Asn, Gly ou Ser; Z59 pode ser Pro ou His; e A6o pode ser Gin ou Pro. 0 epitopo IV define péptidos da fórmula: R7-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67_Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SEQ ID N°: 7], em que X64 pode ser Asn ou Thr; e ΥζΊ pode ser Ala ou Vai.

Deste modo, as composições desta invenção, í. e., os péptidos/polipéptidos contendo as sequências de aminoácidos acima identificadas, quando fornecidas a um indivíduo humano, são úteis na interdição imunológica das proteínas Tat extracelulares da maioria das estirpes do HIV-1. Estas composições funcionam para reduzir significativamente a multiplicação crónica do vírus e para permitir o controlo imunitário eficaz do vírus. 23

Os imunogénios para cada Epitopo são, de um modo preferido, concebidos para induzir anticorpos reactivos com maior proporção de variantes de ocorrência natural de cada epitopo. Para um epitopo, tal como o Epitopo I reconhecido por primatas, podem ser incorporadas várias cópias de um imunogénio, num imunogénio sintético ou recombinante, para intensificar a imunogenicidade e produzir anticorpos com titulos mais elevados. Para além disso, podem ser combinados imunogénios para dois ou mais epitopos, para ampliar a cobertura, uma vez que ocorrem independentemente variações na sequência de cada epitopo. Deste modo, como um exemplo, uma composição desta invenção contém os dois péptidos do Epitopo I reconhecido por primatas requeridos, assim como quatro ou cinco dos outros péptidos do Epitopo I, especificamente identificados acima, com um Cys no terminal, o qual está ligado à proteína veículo. Alternativamente, podem ser preparados péptidos antigénicos múltiplos, opcionalmente, ligados à proteína veículo e combinados para formar uma composição desta invenção. Alternativamente, podem ser utilizadas misturas de dois ou mais imunogénios.

Os imunogénios do Epitopo I reconhecidos por primatas, desta invenção, com ou sem qualquer Epitopo II, III ou IV ou outros imunogénios opcionais, podem ser preparados e utilizados em composições imunogénicas sob várias formas, por exemplo, sintetizados quimicamente ou como péptidos recombinantes, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusão ou péptidos de fusão. 24 1. Péptidos/Proteínas Recombinantes ou Sintéticos, Ligados a um Veículo

Como uma forma de realização, uma composição da presente invenção pode ser um péptido sintético ou produzido de modo recombinante, contendo, pelo menos, as duas sequências de aminoácidos imunogénicas do Epitopo I reconhecido por primatas requeridas (assim como outras sequências adicionais do Epitopo I) e contendo, também, uma ou mais sequências de aminoácidos imunogénicas do Epitopo II/III/IV, ligadas a uma proteína veículo seleccionada. Nesta forma de realização de uma composição desta invenção, podem ser combinadas várias seguências de aminoácidos do Epitopo I reconhecido por primatas acima descritas com ou sem seguências flanqueadoras, sequencialmente, num polipéptido e ligadas ao mesmo veículo. Alternativamente, os imunogénios do Epitopo I, II, III ou IV, podem ser ligados individualmente como péptidos, à mesma ou a diferentes proteínas veículo e as construções imunogénio-veículo resultantes podem ser misturadas em conjunto, para formar uma única composição. Essas sequências podem ser preparadas sinteticamente, por métodos convencionais de síntese química ou de um modo recombinante, por expressão numa célula hospedeira seleccionada, assim como por meios não-convencionais.

Para esta forma de realização, a proteína veículo é, desejavelmente, uma proteína ou outra molécula que possa intensificar a imunogenicidade do imunogénio seleccionado. Esse veículo pode ser uma molécula maior que tem um efeito de adjuvante. Os exemplos de proteína veículo convencionais incluem, sem limitação, proteína DnaK de E. coli, galactocinase (galK, a qual catalisa o primeiro passo do metabolismo da galactose em bactérias), ubiquitina, factor α de conjugação, 25 β-galactosidase e proteína NS-1 de influenza. Os toxóides (i. e., a sequência que codifica a toxina de ocorrência natural, com modificações suficientes para eliminar a sua actividade tóxica) tal como o toxóide da difteria e o toxóide do tétano podem ser, também, utilizados como veículos. De um modo semelhante, podem ser utilizadas várias proteínas de choque térmico bacterianas, e. g., hsp-70 micobacteriana. A redutase da glutationa (GST) é outro veículo útil. Um especialista na técnica pode seleccionar facilmente um veículo adequado.

Numa construção de imunogénio-proteína veículo particularmente desejável, os dois imunogénios do Epitopo I requeridos e três a seis imunogénios do Epitopo I reconhecido por primatas, adicionais e péptidos/polipéptidos imunogénicos opcionais, podem ser covalentemente ligados a uma proteína 70 de choque térmico (hsp70) micobacteriana de E. coli [K. Suzue et al., J. Immunol., 156: 873 (1996)]. Numa outra forma de realização pretendida, a composição é formada por ligação covalente das sequências do péptido ou do polipéptido contendo o imunogénio, com o toxóide da difteria. 2. Péptido Antigénico Múltiplo

Ainda numa outra forma de realização, os imunogénios de epitopos peptídicos ou polipeptídicos e quaisquer imunogénios opcionais seleccionados podem encontrar-se sob a forma de uma construção de péptido antigénico múltiplo ("MAP", também designado como péptido octamérico com núcleo de lisina). Essa construção pode ser concebida utilizando o sistema MAP descrito por Tam, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85: 5409-5413 (1988). Este sistema utiliza uma matriz nuclear de resíduos de lisina, no 26 qual são sintetizadas várias cópias do mesmo Epitopo I reconhecido por primatas, da invenção, como descrito [D. Posnettet ai., J. Biol. Chem., 263 (4): 1719-1725 (1988); J. Tam, "Chemically Defined Synthetic Immunogens and Vaccines by the Multiple Antigen Peptide Approach", Vaccine Research and Developments, Vol. 1, ed. W. Koff e H. Six, pp 51-87 (Mareei Deblau, Inc., Nova Iorque 1992)]. Cada MAP contém várias cópias de apenas um péptido. Consequentemente, uma composição contendo MAP irá conter, pelo menos, dois e, de um modo preferido, cerca de sete, MAP. Um MAP irá apresentar o primeiro imunogénio do Epitopo I peptidico ou polipeptídico requerido, ligado a cada núcleo de lisina; um segundo MAP irá ter o segundo imunogénio do Epitopo I peptidico ou polipeptidico requerido, ligado a cada núcleo de lisina. Podem, ainda, ser incluídos outros MAP, cada um com uma sequência de aminoácidos do Epitopo I reconhecido por primatas identificada acima, diferente. Podem ser utilizados vários MAP diferentes para obter qualquer combinação pretendida de sequências dos Epitopos I, II, III ou IV. De um modo preferido, estas construções de MAP estão associadas com outras sequências estimulantes de células T ou como composições farmacêuticas, administradas em conjunto com agentes estimulantes de células T, tal como adjuvantes conhecidos. 3. Espaçadores

Em qualquer das composições acima, e. g., como construções de péptido/polipéptido-veículo ou MAP, cada imunogénio peptídico/polipeptídico ou cada sequência de aminoácidos no imunogénio, pode ser, opcionalmente, separado por uma sequência de aminoácidos opcional designada como "espaçador". Os espaçadores são sequências com entre 1, a cerca de, 4 27 aminoácidos que são interpostas entre duas sequências, para permitir a ligação entre estas, sem afectar de um modo adverso a estrutura tridimensional do imunogénio. Os espaçadores podem, também, conter locais de quebra de endonucleases de restrição, para permitir a separação das sequências, quando pretendido. São conhecidos espaçadores ou adaptadores adequados e podem ser facilmente concebidos e seleccionados por um especialista na técnica. Os espaçadores preferidos são sequências contendo os aminoácidos Gly e/ou Ser. F. Composições de Ácido Nucleico da Invenção, incluindo um Gene Sintético ou Produzido Recombinantemente

Outras formas de realização desta invenção incluem sequências de ácido nucleico que codificam as composições de péptidos/polipéptidos do Epitopo I reconhecido por primatas acima descritas, incluindo os imunogénios peptidicos/polipeptidicos das composições descritas acima e incluindo os péptidos e polipéptidos fundidos com proteínas veiculo. As sequências de ácido nucleico podem, também, incluir sequências codificando as proteínas veiculo.

Deste modo, uma forma de realização preferida da invenção é um "gene sintético" que codifica sequencialmente para, pelo menos, os dois péptidos/polipéptidos imunogénicos do Epitopo I reconhecidos por primatas requeridos. Refira-se que embora o gene seja designado como "sintético", este pode ser concebido por sintese quimica ou por meios recombinantes, como pretendido. De um modo preferido, o gene sintético codifica sete ou a totalidade das oito sequências de aminoácidos do Epitopo I reconhecido por primatas, especificamente identificadas 28 [SEQ ID Nos: 17-24]. 0 gene sintético pode, também, codificar qualquer selecção de um imunogénio do Epitopo II ou III, contanto que o péptido do Epitopo II ou III esteja fundido com o terminal C da sequência do Epitopo I reconhecido por primatas e não adicionalmente modificado, no seu próprio terminal C. Este gene sintético pode codificar várias cópias das duas sequências de aminoácidos do Epitopo I requeridas ou cópias de vários imunogénios ou sequências de aminoácidos diferentes adicionais ou várias cópias de vários imunogénios ou sequências de aminoácidos diferentes. 0 gene sintético pode codificar as sequências de aminoácidos seleccionadas numa grelha de leitura aberta com, ou fundida com, uma sequência de ácidos nucleicos codificando uma proteina veiculo. Uma caracteristica adicional do gene sintético pode consistir neste codificar um espaçador entre cada sequência codificando um imunogénio e/ou entre a sequência codificando um imunogénio e a sequência codificando a proteina veiculo. 0 gene sintético da presente invenção pode, também, fazer parte de uma molécula sintética ou recombinante. A molécula sintética pode ser uma construção de ácidos nucleicos, tal como um vector ou plasmídeo que contém o gene sintético codificando a proteina, péptido, polipéptido, proteina de fusão ou péptido de fusão, sob o controlo operativo de sequências de ácido nucleico codificando elementos reguladores, tais como promotores, sinais de terminação e semelhantes. Essas moléculas sintéticas podem ser utilizadas para produzir as composições de imunogénio polipeptidico/peptidico de modo recombinante. 0 gene sintético ou a molécula sintética podem ser preparados pela utilização de métodos de sintese quimica ou, de um modo preferido, por técnicas recombinantes. Por exemplo, o gene ou a molécula 29 sintéticos podem conter determinada preferência de codões para as espécies da célula hospedeira indicada. 0 gene ou a molécula sintéticos, de um modo preferido, sob a forma de ADN, podem ser utilizados de vários modos. Por exemplo, estas sequências de ácido nucleico sintéticas podem ser utilizadas para expressar in vitro os péptidos/polipéptidos da invenção, numa cultura celular de hospedeiro. Os imunogénios expressos, após purificação adequada, podem então ser incorporados num reagente farmacêutico ou vacina. Alternativamente, o gene sintético ou a molécula sintética desta invenção podem ser administrados directamente num mamífero, de um modo preferido, um humano, sob a forma do denominado "ADN nu", de forma expressar o imunogénio proteico/peptídico in vivo num doente. Ver, e. g., J. Cohen, Science, 259: 1691-1692 (19 de Março de 1993) ; E. Fynan et al., Proc Natl Acad Sei USA, 90: 11478-11482 (Dez. 1993); e J. A. Wolff et al., Biotechniques, 11: 474-485(1991. A molécula sintética, e. g., um vector ou plasmídeo, pode ser utilizada na injecção directa no hospedeiro mamífero. Isto resulta na expressão da proteína pelas células hospedeiras e na subsequente apresentação ao sistema imunitário, para induzir a formação de anticorpos in vivo. G. Microrganismos Que Expressam o Gene Sintético

Ainda num outro aspecto, da presente invenção, os genes ou as moléculas sintéticos desta invenção podem ser incorporados num microrganismo não-patogénico. 0 microrganismo resultante, quando administrado a um hospedeiro mamífero, expressa e multiplica in vivo as composições expressas desta invenção, de forma a induzir a formação de anticorpos específicos. Por 30 exemplo, os vírus recombinantes não-patogénicos ou as bactérias comensais que contêm as composições ou genes sintéticos desta invenção e que são úteis para a administração a um doente mamífero, podem ser preparados por utilização de metodologia convencional e podem ser seleccionados de entre microrganismos não-patogénicos conhecidos.

Entre as bactérias comensais que podem ser úteis para a distribuição exógena da molécula sintética ao doente e/ou para transportar o gene sintético para o interior do doente, in vivo, incluem, sem limitação, várias estirpes de Streptococcus, e. g., S. gordonii ou E. coli, Bacillus, Streptomyces e Saccharomyces.

Os vírus não-patogénicos adequados que podem ser modificados para transportar o gene sintético para o interior das células do hospedeiro incluem poxvírus, tais como vaccinia, adenovírus, vírus adeno-associados, vírus da varíola do canário, retrovírus e semelhantes. São normalmente utilizados vários vírus não-patogénicos na terapia génica humana e como veículos de outros agentes de vacina e são conhecidos e selecionáveis por um especialista na técnica. H. Preparação ou Produção de Composições da Invenção

As composições da invenção e os polipéptidos/péptidos individuais contendo os imunogénios do Epitopo I reconhecido por primatas desta invenção e, opcionalmente, um ou mais de Epitopo II, III ou IV, genes sintéticos e moléculas sintéticas da invenção, podem ser preparadas de um modo convencional, por recurso a técnicas de síntese química conhecidas, tais como descritas por Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149-2154 31 (1963). Alternativamente, as composições desta invenção podem ser preparadas por técnicas de ADN recombinante conhecidas, por clonagem e expressão de um fragmento de ADN contendo uma sequência codificando um péptido/polipéptido contendo, pelo menos, as duas sequências do Epitopo I reconhecido por primatas requeridas, com outros imunogénios opcionais e proteinas veiculo opcionais, dentro de um microrganismo ou célula hospedeira. As sequências codificantes para imunogénios do Epitopo I e opcionais, podem ser preparadas sinteticamente [W. P. C. Stemmer et ai., Gene, 164: 49 (1995)] ou podem ser derivadas de ARN virai, através de técnicas conhecidas ou de plasmideos contendo ADNc disponiveis.

Podem ser utilizadas combinações destas técnicas. Por exemplo, pode ser utilizada a montagem de imunogénios sequenciais por técnicas de biologia molecular convencionais para a produção do gene sintético e pode ser utilizada mutagénese dirigida para um local, para proporcionar sequências de imunogénio pretendidas. 0 produto do gene sintético é, então, produzido de modo recombinante. Todas estas manipulações podem ser realizadas por metodologia convencional.

Os sistemas para clonagem e expressão das composições de péptidos/polipéptidos desta invenção, utilizando os genes ou moléculas sintéticos, incluem a utilização de vários microrganismos e células que são bem conhecidos na tecnologia recombinante. Estes incluem, por exemplo, várias estirpes de E. coli, Bacillus, Streptomyces e Saccharomyces, assim como células de mamiferos, leveduras e insectos. Para essa finalidade, são conhecidos vectores adequados e encontram-se disponiveis a partir de laboratórios privados e públicos e colecções e a partir de vendedores comerciais. Presentemente, os 32 hospedeiros mais preferidos são células de mamífero, tais como células de ovário de Hamster chinês (CHO) ou células COS-1. Estes hospedeiros podem ser utilizados em ligação com vectores poxvirais, tais como vaccinia ou varíola porcina. A selecção de outras células hospedeiras e métodos adequados, para transformação, cultura, amplificação, rastreio e produção e purificação do produto pode ser realizada por um especialista na técnica, a partir de técnicas conhecidas. Ver, e. g., Gething e Sambrook, Nature, 293: 620-625 (1981), entre outros. Outros sistemas preferidos incluem o sistema de expressão e de vectores de baculovírus.

Quando produzidas por meios recombinantes convencionais, as composições desta invenção, i. e., os polipéptidos/péptidos contendo as cópias indicadas de imunogénios do Epitopo I reconhecido por primatas e imunogénios opcionais, podem ser isoladas, quer a partir dos conteúdos celulares, por técnicas de lise convencionais ou a partir do meio celular, por métodos convencionais, tal como cromatografia. Ver, e. g., Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2 a Edi., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (1989) . Os plasmídeos e vectores virais adequados, utilizados para a produção dos componentes peptídicos/polipéptidos, como vacinas de ADN, são bem conhecidos dos especialistas na técnica e não constituem uma limitação da presente invenção. Ver, Sambrook et al., citado acima e as referências acima, para produção da proteína. Ver, também, o Pedido de Patente Internacional PCT WO94/01139, publicado a 20 de Janeiro de 1994. Resumidamente, o ADN codificando o péptido/polipéptido seleccionado, é inserido num vector ou plasmídeo que contém outras sequências flanqueadoras opcionais, um promotor, uma sequência líder de ARNm, um local de iniciação e outras sequências reguladoras capazes de controlar a 33 multiplicação e a expressão dessa sequência in vivo ou in vitro. Estes vectores permitem a infecção das células do doente e a expressão in vivo da sequência génica sintética ou a sua expressão in vitro sob a forma de proteína/péptido ou de proteina/péptido de fusão. A composição resultante pode ser formulada numa composição de Epitopo I reconhecido por primatas, com qualquer número de imunogénios opcionais e pode ser sujeita a rastreio para a eficácia, através de ensaios in vivo. Esses ensaios utilizam a imunização de um animal, e. g., um simio, com a composição e a avaliação dos titulos de anticorpo contra as proteinas Tat do HIV-1 ou contra péptidos detectores sintéticos correspondentes à sequências de variantes da Tat (como apresentado nos exemplos abaixo). I. Composições de Anticorpo da Invenção

Uma composição de anticorpo ou composição de ligação do ligando desta invenção abrange anticorpos que se ligam, especificamente, a um Epitopo I da fórmula -Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Zi2-[SEQ ID N°: 9], em que Y7 é seleccionado do grupo consistindo em Arg, Lys, Ser e Asn; em que X9 é seleccionado do grupo consistindo em Glu e Asp; e em que Z12 é seleccionado do grupo consistindo em Lys e Asn. De um modo preferido, essa composição de anticorpo inclui, pelo menos, dois ou mais anticorpos ou ligandos diferentes, os quais se ligam, especificamente, a, pelo menos, duas sequências do Epitopo I requeridas, como aqui definido. São produzidos anticorpos (ou outros ligandos de ligação) contra as duas sequências requeridas Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID N° : 17]; e Rl-Asp- 34

Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID N°: 18] do Epitopo 1. Deste modo, os anticorpos da composição ligam-se a uma proteína Tat do HIV, presente em várias variantes de proteínas Tat do HIV-1. São produzidos anticorpos ou ligandos adicionais contra outras sequências que estão incluídas na fórmula do Epitopo I acima.

Numa forma de realização, um anticorpo isolado dirigido, que se liga ao péptido ou polipéptido do Epitopo I da invenção, como descrito acima, constitui, também, um aspecto desta invenção. Essas composições de anticorpo policlonais são, tipicamente, produzidas por imunização de um mamífero, de um modo preferido, um primata, com uma composição peptídica/polipeptídica, contendo os dois imunogénios do Epitopo I requeridos, assim como uma variedade de outros imunogénios do Epitopo I reconhecido por primatas e imunogénios opcionais, como descrito acima. É particularmente desejável como imunogénio o imunogénio do Epitopo I reconhecido por primatas heptavalente (í. e., sem a variante rara) ou um imunogénio octavalente, tais como o gene sintético ou a proteína de fusão descrita no Exemplo 3 abaixo, e/ou um imunogénio do Epitopo II univalente (i. e., um único péptido do Epitopo II, opcionalmente ligado a um veículo). Para além de serem produzidos em primatas, esses anticorpos podem ser, também, produzidos em animais transgénicos, incluindo os denominados murganhos transgénicos "humanizados". No entanto, um hospedeiro desejável para produzir anticorpos policlonais contra uma composição desta invenção inclui humanos. O título desses anticorpos policlonais produzidos num mamífero exposto a composições do Epitopo I pode ser monitorizado por técnicas padrão, tal como com um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima. Se pretendido, as moléculas de anticorpo podem ser isoladas a partir do mamífero, e. g., a partir do sangue completo, plasma 35 ou soro e adicionalmente purificadas a partir do plasma ou soro do mamifero imunizado por técnicas convencionais. As técnicas de recolha convencionais podem incluir plasmaférese, cromatografia de proteína A, entre outras. Essas composições de anticorpo policlonal podem ser, em si, utilizadas como composições farmacêuticas desta invenção.

Alternativamente, as células produtoras de anticorpo podem ser obtidas a partir de mamíferos e utilizadas para preparar outras formas de anticorpos e ligandos, e. g., anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, ligandos produzidos por rastreio de apresentações por fagos, fragmentos de anticorpo e suas misturas e anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos totalmente humanos. As técnicas preparativas para a produção destes tipos de ligandos são conhecidas e os próprios ligandos podem ser produzidos, utilizando as sequências de aminoácidos do Epitopo I reconhecido por primatas e imunogénios opcionais, divulgados. Ver, e. g., Kohler e Milstein (1975) Nature, 256: 495497/ Kozbor et al, (1983) Immunol. Today, 4: 72; Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., PP- 77-96; Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988); Queen et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, 86: 10029-10032 (1989); Hodgson et al., Bio/Technology. 9: 421(1991) Pedido PCT Internacional PCT/GB91/01554, Publicação N°. WO92/04381 e Pedido PCT Internacional PCT/GB93/00725, Publicação N°. W093/20210].

Por exemplo, numa outra forma de realização, um anticorpo monoclonal liga-se, especificamente, à sequência do Epitopo I mínima definida por -Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Zi2- [SEQ ID N°: 9] 36 de uma proteína Tat do HIV, compreendendo qualquer imunogénio maior definido pelo fórmula do Epitopo I, com os aminoácidos variáveis e os grupos R como definidos acima. Como uma forma de realização, um anticorpo monoclonal liga-se especificamente à sequência de aminoácidos -Asp-Pro-Asn-Leu-Xg-Pro-Trp-Asn-[SEQ ID N°: 26], em que X9 é Glu ou Asp. São, ainda, parte desta invenção, outros anticorpos monoclonais que se ligam especificamente às sequências do Epitopo I mínimas, definidas pela fórmula acima.

Podem ser desenvolvidos outros anticorpos anti-Tat, para o rastreio de uma biblioteca combinatória de imunoglobulinas recombinante (e. g., apresentações de anticorpo por fagos) com epitopos da Tat do HIV-1 reconhecidos por primatas desta invenção, para isolar membros da biblioteca de imunoglobulinas que se ligam à Tat do HIV-1 [W. D. Huseet al., Science, 246: 1275-1281 (1988)]. Encontram-se comercialmente disponíveis kits para produzir e rastrear bibliotecas de apresentação por fagos, e. g., Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, N°. de Catálogo 27-9400-01/ Phage Display kits de Strategene, etc. Ver, e. g., Patente US N°., 5223409, Publicação Internacional N°. W092/09690, W090/02809, etc. Os anticorpos quiméricos podem ser desenvolvidos de um modo semelhante, utilizando técnicas conhecidas [Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad., Sei., USA, 81: 6851; Takeda et al., Nature, 313: 452 (1984), entre outros]. Os anticorpos quiméricos são moléculas nas quais porções diferentes derivam de espécies diferentes de animais. Podem ser, também, preparados anticorpos de cadeia simples por métodos convencionais [ver, e. g., Patentes US N°. 4946778 e 4704692], utilizando as porções variáveis dos anticorpos policlonais ou monoclonais, produzidos de acordo com esta invenção. Podem ser, também, utilizados fragmentos de anticorpo, 37 tais como os fragmentos Fab, F(ab')2 e Fv e suas bibliotecas, em vários aspectos desta invenção.

Estas composições de anticorpo/ligando ligam-se desejavelmente à maioria das variantes conhecidas da proteina Tat do HIV-1 (e. g., a mais de 95% e, de um modo preferido, a mais de 99% das variantes conhecidas da proteina Tat) e impedem as proteinas Tat de suportarem a multiplicação adicional do HIV-1. Essas composições podem incluir uma mistura de vários anticorpos diferentes que se ligam às sequências do epitopo da proteina Tat do HIV-1 de várias estirpes do HIV-1. Deste modo, estes anticorpos são úteis em métodos e formulações farmacêuticos descritos abaixo. J. Composições Farmacêuticas da Invenção

Como um outro aspecto desta invenção, uma composição farmacêutica útil para induzir anticorpos que reagem com a maioria (e. g., mais de 95%, de um modo preferido, mais de 99%) da proteinas Tat do HIV-1 conhecidas e para prejudicar a multiplicação do HIV-1, pode compreender, como seus agentes activos, pelo menos, os dois péptidos ou polipéptidos do Epitopo I reconhecido por primatas, requeridos, desta invenção e, de um modo preferido, péptidos do Epitopo I adicionais. Várias composições desejáveis incluem os seguintes componentes acima descritos: (a) um imunogénio peptidico/polipeptidico que contém, pelo menos, as duas sequências de aminoácidos do Epitopo I reconhecido por primatas requeridas e, de um modo mais preferido, pelo menos, sete. [SEQ ID N°s: 17-24]; 38 (b) um imunogénio peptídico/polipeptídico de (a) que contém, adicionalmente, qualquer uma da sequências de aminoácido do Epitopo II, III ou IV, de um modo preferido, um imunogénio do Epitopo II univalente; (c) um gene sintético ou produzido de modo recombinante, codificando as duas sequências do Epitopo I reconhecido por primatas, requeridas e, de um modo preferido, sete das sequências do Epitopo I [SEQ ID N°: 17-24] e sequências opcionais como descrito acima; (f) uma molécula sintética contendo o gene sintético de (c) ; (g) um virus recombinante contendo o gene ou molécula sintéticos descritos acima; e (h) um comensal bacteriano contendo o gene ou molécula sintéticos descritos acima. 0(s) componente (s) activo(s) seleccionado(s) está(ão) presente(s) num veiculo farmaceuticamente aceitável e a composição pode conter ingredientes adicionais. As formulações farmacêuticas contendo as composições desta invenção podem conter outros agentes activos, tais como agentes estimulantes de células T para os MAP, adjuvantes e citocinas imunoestimulantes, tais como IL-12 e outras citocinas bem conhecidas, para as composições de proteina/péptido. Todas estas composições farmacêuticas podem funcionar para baixar os niveis virais de um mamifero. 39

Como composições farmacêuticas, as composições compreendendo sequências peptidicas ou de ácido nucleico do Epitopo I reconhecido por primatas e as sequências de imunogénio opcionais são misturadas com um veiculo farmaceuticamente aceitável adequado para a administração a mamíferos, para a profilaxia ou tratamento de infecções virais. As proteinas/péptidos podem ser combinadas numa única preparação farmacêutica, para a administração. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados, para utilização numa composição proteica imunogénica da invenção, são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Esses veículos incluem, por exemplo, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, um adjuvante seleccionado, tais como suspensões aquosas de hidróxido de alumínio e magnésio, lipossomas, emulsões de óleo em água e outros. Os adjuvantes adequados podem ser, também, utilizados nas composições contendo proteína desta invenção. Os veículos adequados para a administração directa de ADN, ácido nucleico plasmídico ou de vector recombinante incluem, sem limitação, soro fisiológico ou sacarose, protamina, polibreno, polilisina, policatiões, proteínas, CaP04 ou espermidina. Ver e. g., o pedido PCT WO94/01139 e as referências citadas acima. As composições de péptido/polipéptido e os genes ou as moléculas sintéticos são capazes de promover uma resposta imunitária in vivo capaz de interditar várias (e. g., mais de cerca de 95, a cerca de 99%) variantes extracelulares conhecidas da proteína Tat do HIV-1 e, deste modo, baixar os níveis virais, num mamífero hospedeiro imunizado, e. g., um humano.

Ainda uma outra composição farmacêutica, útil para prejudicar a multiplicação do HIV-1 compreende uma composição de anticorpo contendo um ou mais dos anticorpos descritos detalhadamente acima. Numa composição farmacêutica, os 40 anticorpos podem ser transportados numa solução de soro fisiológico ou em outro veiculo adequado. As composições de anticorpo são capazes de proporcionar uma interdição da Tat, imediata, fornecida exogenamente. A presente invenção não é limitada pela selecção dos adjuvantes, veiculos ou outros ingredientes, convencionais, fisiologicamente aceitáveis, úteis em preparações farmacêuticas dos tipos descritos acima. A preparação destas composições farmaceuticamente aceitáveis, a partir dos componentes acima descritos, tendo pH, isotonicidade, estabilidade e outras caracteristicas convencionais adequadas, encontra-se dentro da especialidade da técnica. K. Método da invenção - Impedimento da Multiplicação do HIV-1

De acordo com a presente invenção, um método para reduzir os niveis virais do HIV-1 envolve a exposição de um humano às composições farmacêuticas indutoras de anticorpos contra a Tat, descritas acima, induzindo activamente anticorpos que reagem com várias proteínas Tat do HIV-1 (e. g., mais de 95%, de um modo preferido, mais de 99% das conhecidas) e impedindo a multiplicação do virus in vivo. Este método é adequado para um indivíduo infectado com HIV-1 o com um sistema imunitário competente ou para a imunização activa de um indivíduo não infectado. 0 método induz anticorpos que reagem com proteínas Tat do HIV-1, reduzem a multiplicação virai durante uma infecção aguda inicial com HIV-1 e minimizam a viremia crónica que leva à SIDA. Este método baixa, também, a multiplicação virai crónica em indivíduos infectados, minimizando, novamente, a progressão 41 para a SIDA. A utilização destes métodos pode controlar a infecção crónica com HIV-1, proporcionando um novo mecanismo de tratamento não sujeito ao desenvolvimento de resistência. Os anticorpos contra a Tat inibem a replicação das quase-espécies do HIV-1, independentemente da Tat que eles estão a produzir, uma vez que a proteína Tat extracelular a não está associada com a parte replicante do virus. Deste modo, não existe qualquer mecanismo óbvio pelo qual os anticorpos contra a Tat possam produzir pressão selectiva para as variantes de fuga da Tat, não-reactivas.

De acordo com este método, as composições farmacêuticas, de um modo preferido, contêm as composições de péptidos/polipéptidos, os genes ou as moléculas sintéticos, o virus recombinante ou a bactéria recombinante comensal. De um modo preferido, as composições contêm um gene sintético ou proteina de fusão heptavalente (sem a variante rara do Epitopo I) ou o gene sintético ou proteina de fusão octavalente do Exemplo 3 e, opcionalmente, um péptido do Epitopo II univalente. Cada um destes componentes activos da composição farmacêutica, induz, activamente, no humano exposto, a formação de anticorpos anti-Tat que bloqueiam a transferência da Tat, de células infectadas para outras células infectadas ou não infectadas. Esta acção reduz a multiplicidade da infecção e bloqueia a explosão da expansão virai do HIV-1 e, deste modo, baixa os níveis virais. Em doentes já infectados, este método de redução dos níveis virais pode reduzir a viremia crónica e a progressão para SIDA. Em humanos não infectados, esta administração das composições da invenção pode reduzir a infecção aguda e, deste modo, minimizar a viremia crónica que leva à progressão para SIDA. 42

Ainda um outro aspecto da invenção, consiste num método para reduzir os niveis virais do HIV-1, por administração de uma composição farmacêutica contendo as composições de anticorpo descritas acima, a um humano incapaz de estabelecer uma resposta imunitária eficaz ou rápida contra a infecção com HIV-1. 0 método pode envolver a administração crónica da composição. Entre esses doentes, adequados para o tratamento com este método encontram-se os doentes infectados com HIV-1 que estão imunocomprometidos pela doença e incapazes de estabelecer uma resposta imunitária forte. Em etapas tardias da infecção com HIV, é menor a probabilidade de produzir títulos eficazes de anticorpos, devido ao enfraquecimento imunitário associado com a doença. Entre esses doentes encontram-se, também, mulheres grávidas infectadas com HIV-1, recém-nascidos de mães infectadas e doentes não imunizados com exposição putativa (e. g., um humano que foi inadvertidamente "picado" com uma agulha utilizada por um humano infectado com HIV-1).

Para esses doentes, o método da invenção utiliza, de um modo preferido, como composição farmacêutica, uma composição de anticorpo da invenção. A composição de anticorpo inclui uma composição de anticorpo policlonal preparada em outros mamíferos, de um modo preferido, humanos normais ou, alternativamente, as outras formas do anticorpo descrito acima, e. g., monoclonal, etc. Estas composições de anticorpo são administradas como imunoterapia passiva para inibir a multiplicação virai e baixar a carga virai. Os anticorpos exógenos que reagem com várias proteínas Tat do HIV-1 conhecidas proporcionam uma interdição imediata, no doente, da transferência da Tat, de células viralmente infectadas para outras células infectadas ou não infectadas. De acordo com este 43 método, o doente pode ser cronicamente tratado com a composição de anticorpo durante um regime de tratamento longo.

Em cada um dos métodos acima descritos, as composições da presente invenção são administradas por uma via adequada, e. g., pelas vias subcutânea, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, nasal ou inalação. A via de administração presentemente preferida é a intramuscular, para composições de imunização (indução activa) e intravenosa (i.v.), subcutânea (s.c.) ou intramuscular (i.m), para as composições de anticorpo (terapia passiva). De um modo preferido, é administrado um vector virai recombinante ou de ADN nu, intramuscularmente/ no entanto, podem ser distribuídas oralmente outros determinados vectores virais recombinantes e/ou bactérias comensais vivas. A quantidade de sequências de proteína, péptido ou ácido nucleico da presente invenção, em cada dose de vacina, é seleccionada tendo em consideração a idade, peso, sexo, condição física geral do doente e semelhantes. A quantidade do componente activo requerido para induzir uma resposta imunitária, de um modo preferido, uma resposta protectora ou produzir um efeito exógeno no doente, sem efeitos secundários adversos significativos, varia, dependendo da composição farmacêutica utilizada e da presença opcional de um adjuvante (para as composições contendo proteína).

Geralmente, para as composições contendo composição de proteína/péptido, proteína de fusão, MAP ou proteína ligada ou anticorpo, cada dose irá compreender entre cerca de 50 pg, a cerca de, 20 mg de imunogénios peptídicos/polipeptídicos por mL de uma solução estéril. Uma dosagem mais preferida pode consistir em, cerca de, 500 pg do imunogénio. Podem ser, também, 44 contempladas outras gamas de dosagem por um especialista na técnica. As doses iniciais podem ser, opcionalmente, seguidas por reforços repetidos, quando pretendido.

As composições de anticorpo da presente invenção podem ser utilizadas em tratamentos crónicos de indivíduos em risco de infecção aguda devido a infecção com agulhas ou materna. Uma frequência de dosagem para essas infecções "agudas" pode variar, de dosagens diárias, a uma ou duas vezes por semana, i.v., s.c. ou i.m., para uma duração de, cerca de, 6 semanas. As composições de anticorpo da presente invenção podem ser, também, utilizadas em tratamentos crónicos de doentes infectados ou doentes com HIV avançado. Em doentes infectados, a frequência da administração crónica pode variar de dosagens diárias a uma ou duas vezes por mês i.v., s.c. ou i.m. e pode depender da meia-vida do imunogénio (e. g., cerca de 7-21 dias) . No entanto, é previsto que a duração do tratamento crónico desses doentes infectados seja um período indefinido, mas prolongado.

Alternativamente, as composições desta invenção podem ser concebidas para a administração directa de genes sintéticos ou das moléculas desta invenção como "ADN nu". Tal como para as composições imunogénicas de proteína, as quantidades de componentes nas composições de ADN e de vector e o modo de administração, e. g., injecção ou intranasal, podem ser seleccionados e ajustados por um especialista na técnica. De um modo geral, cada dose irá compreender entre, cerca de 50 pg, a cerca de 1 mg do ADN codificante do imunogénio por mL de uma solução estéril. 45

Para vírus recombinantes contendo os genes ou moléculas sintéticos, as doses podem variar de cerca de 20, a cerca de 50 mL de solução de soro fisiológico, contendo concentrações de cerca de 1 x 107 a 1 x IO10 pfu/mL de vírus recombinante da presente invenção. Uma dosagem humana preferida consiste em, cerca de, 20 mL de solução de soro fisiológico nas concentrações acima. No entanto, é entendido gue um especialista na técnica pode alterar essas dosagens, dependendo da identidade do vírus recombinante e da constituição do imunogénio gue este está a distribuir ao hospedeiro.

As quantidades das bactérias comensais contendo o gene ou moléculas sintéticos a serem distribuídos ao doente, irão variar, geralmente, entre cerca de 103, a cerca de 1012 células/kg. Estas dosagens podem ser alteradas por um especialista na técnica, dependendo da bactéria que é utilizada e da composição particular contendo o Epitopo I e os imunogénios opcionais que são distribuídos pela bactéria viva.

Deste modo, as composições desta invenção são concebidas para retardar ou minimizar a infecção de um mamífero não infectado, e. g., humano, pelo vírus seleccionado. Essas composições têm, deste modo, utilidade como vacinas. Os anticorpos anti-proteína Tat não são reactivos com as proteínas do HIV-1 utilizadas em ensaios de diagnóstico, para detectar a seroconversão após a infecção. Deste modo, os indivíduos tratados com as composições desta invenção não seriam enganados com falsos testes positivos para a infecção com HIV-1 e continuaria a ser possível detectar a seroconversão se os indivíduos tratados ficassem infectados com o HIV-1. 46

Fornecer a um mamífero as composições desta invenção, quer sob a forma de uma composição contendo proteína/péptido, quer pela administração de uma nova sequência de ácido nucleico codificando o imunogénio, proporciona uma estratégia radicalmente diferente para a vacinação para a SIDA, uma vez que esta permite o abaixamento dos níveis virais, pela interdição biológica, de um modo desejado, de mais de cerca de 95% e, de um modo preferido, de mais de cerca de 99% das variantes conhecidas da proteína Tat do HIV-1, fazendo baixar a multiplicação do HIV-1. A utilização de composições contendo o imunogénio Tat, apresenta uma vantagem particularmente desejável, em contraste com outros tratamentos e métodos profilácticos, utilizados contra esses vírus. Uma vez que a interdição extracelular da proteína Tat inibe a multiplicação da totalidade das quase-espécies ou estirpes do HIV, indiscriminadamente, esta não cria uma pressão selectiva sobre o próprio vírus parental, para a selecção de variantes mutantes do vírus. Deste modo, o bloqueio da incorporação da proteína Tat pelas células do doente, não apenas reduz o nível da viremia, como o faz de uma forma que impede a selecção de "variantes de fuga".

Adicionalmente, a invenção compreende um método de tratar activamente indivíduos assintomáticos infectados com HIV-1, com viremia, uma vez que, durante o decurso da doença, a proteína Tat extracelular contribui, provavelmente, para a infecção persistente e anomalias imunitárias que estão presentes nesta etapa da infecção com o HIV-1. A interdição da proteína Tat extracelular por anticorpos induzidos pela imunização de acordo com esta invenção, pode reduzir a viremia com um controlo 47 imunitário mais eficaz e resultar no atraso ou na prevenção da progressão para a SIDA. 0 mecanismo da presente invenção como descrito acima é útil para prejudicar o decurso da infecção virai e produzir resultados clinicos desejáveis. Mais especificamente, as composições desta invenção são capazes de reduzir a viremia em doentes já infectados com o virus, bloqueando a incorporação adicional da proteina Tat por células não infectadas. É previsto que as composições da presente invenção, utilizadas isoladas ou em conjunto com outros regimes terapêuticos para doentes infectados com HIV, auxiliem na redução da viremia e na prevenção da decadência clinica.

Para essas utilizações terapêuticas, as formulações e os modos de administração são substancialmente idênticos aos descritos especificamente acima e podem ser administrados ao mesmo tempo ou simultaneamente com outras terapias convencionais para a infecção virai especifica. Para a utilização terapêutica ou utilização profiláctica, podem ser desejáveis dosagens repetidas das composições de imunização, tais como um reforço anual ou um reforço em outros intervalos. L. Kits de Diagnóstico desta Invenção

Os péptidos e os polipéptidos descritos acima podem ser, também, utilizados como reagentes de um kit útil para a medição e detecção de títulos e especificidade dos anticorpos induzidos pela vacinação com as composições descritas acima. O kit da invenção pode incluir, pelo menos, os dois péptidos do Epitopo I requeridos, identificados acima e, de um modo preferido, dois ou 48 mais dos imunogénios do Epitopo I reconhecidos por primatas e opcionais. Numa forma de realização, cada péptido tem no seu terminal N a proteina biotina e um espaçador, e. g., -Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID N°: 27]. Alternativamente, o péptido pode ter no seu terminal C um espaçador, e. g., -Gly-Ser-Gly-Ser [SEQ ID N°: 39] e a proteina biocitina. Estas formas de realização permitem aos péptidos serem ligados a um suporte sólido revestido com avidina, e. g., uma placa ou esferas. Podem ser, também, utilizados outros agentes de ligação conhecidos dos especialistas na técnica do ensaio de diagnóstico, para os mesmos objectivos. No kit, são, também, fornecidos reagentes marcados que detectam a ligação do anticorpo aos péptidos do Epitopo imobilizados, tais como uma imunoglobulina de cabra anti-humana ou semelhante. A marcação do reagente pode ser seleccionada de muitas marcações de diagnóstico conhecidas, tais como compostos radioactivos, compostos fluorescentes e proteínas, enzimas colorimétricas, etc. Deste modo, o kit contém, também, diversos reagentes e aparelhos para ler as marcações, e. g., determinados substratos que interagem com uma marcação enzimática, para produzir um sinal colorido, etc., aparelhos para recolher amostras de sangue, assim como frascos adequados e outros componentes do ensaio de diagnóstico. Um especialista na técnica pode, também, seleccionar facilmente outros componentes de diagnóstico convencionais para este kit.

Esses kits e reagentes podem ser utilizados num método para detectar os titulos e os padrões de reactividade de anticorpos em indivíduos vacinados com as composições desta invenção. Um método para determinar a presença e ou o título de anticorpos induzidos pela imunização com um imunogénio Tat, inclui os passos de fazer contactar uma amostra biológica de um indivíduo imunizado, e. g., um fluido corporal, de um modo preferido, 49 urina sangue, soro ou plasma, mas, também, possivelmente, saliva e outros fluidos ou tecidos, com uma ou mais das sequências de ligação do Epitopo I reconhecido por primatas e imunogénios opcionais, de um modo preferido, imobilizadas num suporte sólido, tal como uma placa ou esferas. 0 Epitopo I reconhecido por primatas e as sequências de ligação opcionais utilizadas neste método podem consistir nas regiões de ligação do epitopo minimo não modificado.

Logo que a amostra biológica é exposta aos péptidos imobilizados durante um tempo suficiente, o suporte é lavado para eliminar qualquer material da amostra biológica que não esteja ligado aos péptidos. Esses passos de lavagem são convencionais em ensaios de diagnóstico e são realizados com soro fisiológico. Se os anticorpos contra os imunogénios dos Epitopos I e opcionais ou uma sua combinação, foram induzidos no indivíduo pelo tratamento acima descrito, os péptidos imobilizados ligaram-se ao anticorpo da amostra biológica. Depois disso, é adicionado um reagente marcado ao material no suporte, para detectar a ligação entre os péptidos no suporte sólido e o anticorpo na referida amostra biológica. De um modo preferido, esse reagente é uma imunoglobulina anti-humana, tal como uma imunoglobulina de cabra anti-humana. A marcação é seleccionada de entre uma ampla gama de marcações de diagnóstico utilizadas convencionalmente, como discutido acima. Numa forma de realização, a marcação pode ser uma enzima colorimétrica, a qual, após contacto com um substrato, produz um sinal colorido detectável. A presença e/ou a intensidade da cor proporcionam indicios da indução do anticorpo no indivíduo tratado. Este ensaio pode ser utilizado para determinar a eficácia da imunização, assim como para monitorizar o estado imunitário de um doente. 50 A selecção de passos de ensaio particulares, assim como dos vários sistemas de marcação detectáveis, encontra-se bem dentro da especialidade da técnica. Essa selecção é de rotina e não limita a presente invenção. M. Vantagens da Invenção

Uma das vantagens das composições desta invenção consiste no pequeno número de imunogénios requeridos para a inclusão numa composição desta invenção para inter-reagir com mais de 95 a mais de 99% das variantes conhecidas da proteina Tat do HIV-1 do subtipo B comum. Como ilustrado nos exemplos abaixo, a composição imunogénica de Epitopo I reconhecido por primatas, contendo as duas sequências de aminoácidos do Epitopo I reconhecido por primatas, requeridas, assim como seis sequências adicionais do Epitopo I, inter-reagem com 95% das proteínas Tat do HIV-1 do subtipo B comum, assim como com a totalidade das 56 sequências da proteína Tat dos subtipos do HIV-1 não-B, menos frequentes. Deste modo, pode ser utilizada uma composição única, de um modo útil, na protecção contra ou no tratamento de infecção causada pela grande maioria das estirpes do HIV-1 que podem ser encontradas.

Para além disso, tendo sido identificados os epitopos precisos da Tat contra os quais é pretendida a ligação (i. e., AAS-12 da SEQ ID N°: 15), podem ser facilmente identificados e incluídos nas composições, novos imunogénios peptídicos da Tat, desejáveis, a partir de estirpes do HIV-1 de ocorrência recente ou estirpes recentemente descobertas, utilizando os métodos aqui descritos. Esta flexibilidade permite às composições desta 51 invenção serem profilaticamente úteis contra qualquer nova estirpe ou estirpes do HIV-1 identificadas no futuro. Tendo em perspectiva os presentes ensinamentos, é esperado que um especialista na técnica seja facilmente capaz de incorporar novas combinações de imunogénios da Tat (e as construções de ácido nucleico que as codificam) nas composições.

Por exemplo, a utilização de técnicas convencionais, tais como PCR e séries de oligonucleótidos de elevada densidade [M. J. Kozal et al., Nature Med., 2: 753 (1996)] permite que um especialista na técnica obtenha as sequências de aminoácidos de uma grande série de proteínas Tat do HIV-1, representando variantes de isolados clínicos de estirpes e subtipos do HIV-1. A utilização dessas técnicas permite a determinação de outras variantes do subtipo B do HIV-1 assim como de outros subtipos em países subdesenvolvidos, que não foram tão intensivamente estudados até à data. A determinação de novas sequências da Tat irá permitir a rápida inclusão dos péptidos correspondentes, como imunogénios em composições desta invenção, permitindo a indução de uma resposta de anticorpo contra outras proteínas Tat do HIV-1 raras.

Os estudos de inter-reactividade com anticorpos desenvolvidos contra péptidos sintéticos, correspondentes a cada variante da Tat, podem ser utilizados para eliminar a necessidade de imunização com variantes da Tat, nas quais as alterações da sequência são imunulogicamente silenciosas, pelo facto destes péptidos estarem fortemente ligados por anticorpos à sequência de consenso ou a outras variantes. Os exemplos seguintes ilustram métodos preferidos para preparar as composições da invenção e para utilizar estas composições para induzir anticorpos contra as proteínas Tat do vírus, num 52 hospedeiro imunizado. Estes exemplos são apenas ilustrativos e não limitam o âmbito da invenção, o qual é definido pelas reivindicações.

EXEMPLO 1 - ESTUDOS IMUNOLÓGICOS DE SEQUÊNCIAS DE

AMINOÁCIDOS MÍNIMAS DA PROTEÍNA TAT, NECESSÁRIAS PARA A LIGAÇÃO A UM ANTICORPO CONTRA 0 EPITOPO I RECONHECIDO PELOS PRIMATAS, EM VARIAÇÕES DA SEQUÊNCIA DA PROTEÍNA TAT DO HIV-1 E INTER-

REACTIVIPAPES IMUNOLÓGICAS DE ΑΝΤΙ-SOROS COM ESTAS SEQUÊNCIAS A. Péptido Sintético e Conjugados

Os péptidos sintéticos foram sintetizados por sintese em fase sólida em suportes de polietileno derivatizado [R. M. Valerio et al., Int. J. Peptide Res., 44: 158-165 (1994)]. Os péptidos imunizantes foram sintetizados, sendo incorporada uma Cys no terminal amino, para facilitar a ligação a uma proteína veiculo e com um terminal C amidado. Os péptidos detectores foram sintetizados com uma sequência biotina-Ser-Gly-Ser-Gly-[SEQ ID N°: 27] no terminal amino e uma função de ácido livre no terminal C, para utilização em ensaios de ELISA, para a detecção de reactividade e inter-reactividade. Os péptidos imunizantes, conjugados covalentemente com a proteína veículo do toxóide da difteria (DT), através da cadeia secundária do cisteínilo, com uma proporção péptido-veículo de 5-8 [A. C. J. Lee et al.,

Motec. Immunol., 17: 749 (1980)], foram purificados por cromatografia líquida de elevada pressão (HPLC), até uma pureza superior a 95% por HPLC analítico e espectrometria de massa, sendo utilizados péptidos detectores numa pureza superior a 50%. 53 B. Imunizações

Os conjugados de péptido foram retomados em água purificada e emulsionados 1:1 com o adjuvante de Freund completo (CFA) ou com o adjuvante de Freund incompleto (IFA) [ANTIBODIES-A LABORATORY MANUAL, Eds. E. Harlow e P. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1998)] . 0 volume total por primata foi de 1 mL e este continha 100 pg do péptido ligado ao DT.

Os macacos rhesus que participaram num estudo de desafio virai foram imunizados com o antigénio em IFA/CFA, como se segue. Foram utilizados vários primatas para o péptido imunizante, com a injecção intramuscular (IM), inicial, com conjugado em CFA e um reforço IM subsequente às 2 semanas, com conjugado em IFA. Foi realizada uma pré-recolha de sangue antes da primeira injecção e foram realizadas maiores recolhas de sangue, 3 e 5 semanas após a injecção de reforço. C. Títulos ELISA Os ensaios ELISA foram realizados como descrito por H.M. Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3998 (1983). 0 título de anticorpo foi o inverso da diluição de soro que resultou numa absorvência de 1,0 unidades de DO acima do fundo. Para cada resposta, foi calculado titulo médio geométrico (GMT) para 2-3 soros ou estavam apenas disponíveis soros únicos para algumas imunizações de macacos.

Os resultados de ELISA para este ensaio em coelhos vs. macacos são apresentados, respectivamente, nas Figs. IA e 1B. Os resultados de ELISA demonstraram que os anticorpos de primata 54 contra o imunogénio, incorporando o Epitopo I, estavam a reagir com a sequência -Asp-Pro-Arg7-Leu-Glu9-Pro-Trp-Lysi2- [AA5-12 da SEQ ID N°: 15]. Como discutido abaixo, as posições 7, 9 e 12 representam variantes comuns deste péptido do Epitopo I reconhecido por primatas. D. Análise da diversidade de sequências de aminoácido dentro dos epitopos

As sequências do primeiro exão da Tat do HIV 1 foram obtidas da base de dados GenBank e Los Alamos Human Retroviruses and AIDS [HUMAN RETROVIRUSES and AIDS 1996, publicado pelo Theoretical Biology and Biophysics Group of the Los Alamos National Laboratory, NM e as sequências adicionais foram gentilmente obtidas do GenBank por Esther Guzman do Los Alamos National Laboratory]. As sequências incompletas e as sequências com codões de terminação ou eliminações de bases originando um deslocamento da grelha de leitura foram eliminadas, assim como as sequências com repetições obviamente idênticas do mesmo isolamento. As variações de aminoácidos nas posições dentro dos epitopos foram registadas e colocadas em tabelas. E. Inter-Reactividades Antigénicas Entre Variantes

Os anti-soros contra a sequência de consenso do epitopo foram titulados por ELISA, contra a sequência de consenso e contra sequências com variantes de aminoácido comuns, para determinar os efeitos dos polimorfismos de aminoácido sobre antigenicidade. 55 F. Variações em sequências

As sequências de consenso do Epitopo I reconhecido por primatas foram avaliadas para frequência máxima e reconhecimento por anticorpos de primata. Foram avaliadas a conservação antigénica e de sequência nas proteínas Tat do HIV-I de 294 das proteínas Tat do HIV-1 de 294 vírus do grupo B (I) e de 56 vírus do grupo não-B (II), para os epitopos e os resultados foram colocados nas Tabelas II a VI, abaixo. A fila superior das Tabelas II e III indica a sequência de consenso para a frequência máxima. As filas intermédias contêm a incidência percentual de aminoácidos encontrados em mais de 5% das sequências em cada posição, se forem vários. A fila inferior de cada tabela corresponde à incidência total, incluindo aminoácidos que ocorrem em mais de 5% das sequências, se forem vários. Todas estas selecções na Tabela II e todas as selecções na Tabela III, excepto as entradas sob o aminoácido 4, criam epitopos antigenicamente distintos (inter-reactividade <25%).

Tabela II

Epitopo 1-294 grupos B Val4 Asps Pro6 Argv Leu8 GIU9 Proio Trpn Lys i2 Arg (73) Lys (96) Lys (12) Asn (2) Ser (11) Asn (4) 100% 98% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 56

Tabela III

Epitopo 1-56 Grupos não-B Val4 Asps Pro6 Asn7 Leu8 GlUg Proio Trpu Asni2 Vai (89) Asn (79) Glu (86) Asn (87) Ile (11) Lys (14) Asp (14) Lys (13) Ser (5) 100% 100% 100% 98% 96% 100% 98% 100% 100%

Como apresentado nas Tabelas II e III/ o Epitopo I reconhecido por primatas tem um polimorfismo antigénico potencial de 16 vezes, mas existe um antigénio principal para os grupos B e existe outro antigénio principal para os grupos não-B. Cinco outras variantes correspondem a mais de 95% das variantes da Tat conhecidas. Ver as Tabelas IV e V; as sequências indicadas com um asterisco estão representadas tanto nos grupos B como não-B.

Tabela VI - Grupos B (294 sequências)

Sequência do epitopo de primata SEQ ID Nos Incidência Incidência Percentual ValAspProArgLeuGluProTrpLys AA4-12 da SEQ ID N°: 15 220 75 ValAspProLysLeuGluProTrpLys* AA185-193 da SEQ ID N°: 12 35 12 ValAspProSerLeuGluProTrpLys AA120-127 da SEQ ID N°: 12 20 7 57 (continuação)

Sequência do epitopo de primata SEQ ID N°S Incidência Incidência Percentual ValAspProAsnLeuGluProTrpLys* AA55-63 da SEQ ID N°: 12 7 2 Total: 282 Total: 96 ValAspProArgLeuGluProTrpAsn 28 1 <1

Tabela V - Grupos não-B (56 sequências)

Sequência do epitopo de primata SEQ ID Nos Incidência Incidência Percentual ValAspProAsnLeuGluProTrpAsn AA227-235 da SEQ ID N°: 13 36 64 ValAspProLysLeuGluProTrpAsn AA344-352 da SEQ ID N°: 13 8 14 ValAspProAsnLeuAspProTrpAsn 29 6 11 ValAspProAsnLeuGluProTrpLys* AA55-63 da SEQ ID N°: 13 3 5 ValAspProLysLeuGluProTrpLys* AA185-193 da SEQ ID N°: 12 1 2 Total: 53 Total: 95 ValAspProSerLeuGluProTrpAsn AA279-287 da SEQ ID N°: 13 1 2 ValAspProSerLeuAspProTrpAsn 30 1 2 ValAspProAsnLeuAspProTrpLys 31 1 2 A Tabela VI mostra a baixa inter-reactividade antigénica das variantes da posição 7 do Epitopo I, a distinção antigénica das variantes da posição 9 e a extrema ausência de 58 anti-soros contra inter-reactividade de

GluProValAspProAsn7LeuGlU9ProTrpAsni2 [AA225-235 da SEQ ID N° : 13], com variantes contendo GluProValAspProArg7LeuGlu9ProTrpLysi2 [AA 2-12 de SEQ ID N°: 15], em ambas as posições 7 e 12. Esta mostra, também, a distinção antigénica das variantes Glu9 e Asp9.

Tabela VI - Reactividade por ELISA de anti-soros de macaco contra Imunogénios do Epitopo I sobre péptidos Detectores com Variações nas posições de aminoácido 7, 9 e 12 da Tat

Sequência do imunogénio do epitopo Titulo da sequência do epitopo do péptido detector (% de titulo do mesmo péptido) GluProVal GluProVal GluProVal GluProVal GluProVal AspProAsn7 AspProAsn-? AspProArg7 AspProLys7 AspProSer7 LeuGlugPro LeuGlugPro LeuGlugPro TrpLysi2 LeuGlugPro LeuGlugPro TrpLysi2 TrpLysi2 TrpLysi2 TrpLysij [AA53-63 da SEQ ID [AA53-63 da SEQ [AA2-12 da SEQ ID [AA183-193 da [AA105-115 da SEQ N°: 12] ID N°: 12] N°: 15] SEQ ID N°: 12] ID N°: 12] 119000 (100) 25000 (21) 24000 (20) 24000 (20) GluProVal GluProVal GluProVal GluProVal AspProAsn7 AspProAsn7 AspProAsn7 AspProArg7 LeuGlUgPro LeuGlugPro LeuGlugPro TrpLysi2 LeuGlu9Pro TrpAsni2 TrpAsni2 TrpLysi2 [AA225-235 da SEQ [AA225-235 da [AA53-63 da SEQ ID [AA2-12 da SEQ ID N°: 13] SEQ ID N°: 13] N°: 12] ID N°: 15] 157000 (100) 23000 (15) 2000 (1) GluProVal GluProVal GluProVal AspProAsn AspProAsn7 AspProAsn7 LeuGlUgPro LeuGlu9Pro LeuAspgPro TrpLysi2 TrpLySi2 TrpLysi2 [AA53-63 da SEQ ID [AA53-63 da SEQ [SEQ ID N°: 32] 53 0 I—1 NO ID N°: 12] 163000 (100) 6000 (4) 59

EXEMPLO 2 - ESTUDOS IMUNOLÓGICOS DAS SEQUÊNCIAS DE

AMINOÁCIDOS MÍNIMAS DA PROTEÍNA TAT, NECESSÁRIAS PARA LIGAÇÃO A

ANTICORPO CONTRA 0 EPITOPO II RECONHECIDO PELOS PRIMATAS NA PROTEÍNA TAT DO HIV-1. VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA. E INTER- REACTIVIDADES IMUNULÓGICAS DE ΑΝΤΙ-SOROS CONTRA ESTAS SEQUÊNCIAS (Comparativo)

Foi determinada a incidência da variação da sequência de aminoácido, para as 294 sequências do grupo B e 56 do grupo não-B, da Tat do HIV-1, dentro dos limites do Epitopo II da ligação de anticorpo em macacos, utilizando os mesmos procedimentos delineados no Exemplo 1. Os resultados são apresentados nas Tabelas VII e VIII. As filas superiores das tabelas contêm a sequência de consenso. As filas intermédias contêm a incidência percentual de aminoácidos encontrados em mais de 5% das sequências, em cada posição, se forem vários. A fila inferior mostra a incidência total, incluindo aminoácidos ocorrendo em mais de 5% das sequências, se forem vários. As variantes de aminoácido na posição 42 da Tat eram antigenicamente inter-reactivas.

Tabela VII

Epitopo II - 294 grupos B Lys4i Gly42 Leu43 Gly44 Ile45 Ser46 Tyr47 Gly48 Arg49 Lys5o Gly (72) Ala (28) 100% 100% 99% 99% 100% 98% 99% 100% 99% 100% 60

Tabela VIII

Epitopo II - 56 Grupos não-B Lys4i Gly42 Leu43 Gly44 Ile45 Ser46 Tyr47 Gly48 Arg49 Lys5o 100% 100% 100% 99% 100% 95% 100% 100% 98% 100%

Como divulgado nas Tabelas VII e VIII, o Epitopo II apresenta conservação antigénica guase completa.

Foi medida a reactividade por ELISA dos anti-soros de macaco com o imunogénio do Epitopo II em péptidos detectores com TatGly42 ou Ala42 (variante) , dentro das seguências detectoras, gue está descrita na Tabela IX abaixo. Ver as Figs. 2A e 2B para, respectivamente, uma comparação gráfica dos resultados em coelhos vs. macacos.

Tabela IX

Sequência do epitopo imunogénico Titulo da sequência do péptido Detector (% do titulo no mesmo péptido) LysGlyLeuGlylleSerTyrGlyArgLys [AA41-50 da SEQ ID N°: 15] LysGlyLeuGlylleSerTyrGlyArgLys [AA41-50 da SEQ ID N°: 15] 25000 (100%) LysAlaLeuGlylleSerTyrGlyArgLys [SEQ ID N°: 33] 19000 (76%) EXEMPLO 3 DESENVOLVIMENTO DE TRATAMENTO COM ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO PARA INFECÇÕES ASSINTOMÁTICAS COM HIV-1 São imunizados murganhos de anticorpos humanizados, comercialmente disponíveis, com uma guantidade adequada do imunogénio do Epitopo II: Cys-Gly-Ser-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser- 61

Tyr-Gly-Arg-Lys-amida [SEQ ID N°: 34] ligado à proteína veículo do toxóide de difteria. Os hibridomas são sujeitos a rastreio sobre biotina-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-OH [SEQ ID N°: 35] em placas revestidas com estreptavidina e é seleccionado um anticorpo monoclonal IgG com afinidade de ligação subnanomolar e sem ligação a receptores complementares. A especificidade é confirmada sobre a proteína Tat do HIV-lrecombinante.

Uma vez gue o anticorpo monoclonal é dirigido contra um antigénio não próprio, é previsível um ensaio pré-clínico convencional de produção, purificação e segurança. Os anticorpos monoclonais humanos têm uma meia-vida de 2 0 dias no homem vs. a meia-vida de 18 horas do OKT3, um anticorpo monoclonal de murganho gue é extensamente consumido em CD3 internas. Doses diárias de 5 mg de OKT3 mantêm níveis de declínio de cerca de 1 micrograma/mL no homem. Deste modo, é previsível gue uma dose bissemanal de 5 mg de anticorpo monoclonal anti-Tat seja suficiente para manter níveis de declínio semelhantes, um excesso molar cinquenta vezes superior, em relação aos níveis circulantes máximos previstos de até 1 ng/mL para a proteína Tat do HIV-1, em indivíduos infectados. O controlo das cargas virais do plasma é, presentemente, um critério aceite da eficácia do tratamento do HIV-1. A eficácia de um anticorpo monoclonal anti-Tat pode ser rapidamente determinada em indivíduos assintomáticos infectados com HIV-1, inicialmente com um período de tempo de quatro semanas de tratamento. Este protocolo é útil em doentes não tratados, em doentes que, por várias razões , não tiveram sucesso em protocolos de HAART ou em doentes controlados por terapia HAART, com a remoção desta terapia durante 4 semanas (aumento rápido 62 das cargas virais se a HAART for interrompida). Uma redução de 2 a 3 log das cargas virais do plasma, até abaixo do LOD (50 cópias de ARN viral/mL) suportam a monoterapia com o anticorpo monoclonal, a qual é avaliada ao longo de um maior periodo de tempo. A redução superior a um log (90%), mas não abaixo do LOD, sugere a utilização do anticorpo monoclonal como um componente em terapia.

EXEMPLO 4 - DESENVOLVIMENTO DE UMA VACINA UNIVERSAL PARA

IMPEDIR A PROGRESSÃO DA SIDA EM INDIVÍDUOS A. Construção de um Gene Sintético A Fig. 3A ilustra um gene sintético codificando quatro cópias de cada um dos quatro polimorfismos do Epitopo I, detectados para a resposta de anticorpo do coelho, mais quatro cópias do Epitopo II, expresso em E. coli como uma proteina de fusão linear com a DnaK (HSP70) de E. coli. Esta proteina expressa continha todos os epitopos antigénicos quando testada por ELISA, com anti-soros de coelho específicos para o epitopo. No entanto, quando utilizado para imunizar coelhos ou macacos, todas as variantes do Epitopo I eram imunogénicas, mas não as do Epitopo II. Deste modo, o Epitopo II é melhor utilizado como um péptido sintético conjugado ligado a uma proteína veículo adequada. A Fig. 3B ilustra um novo gene sintético octavalente construído para incorporar oito polimorfismos do Epitopo I reconhecido por primatas na grelha de leitura correcta, baseados no polimorfismo dentro dos limites do Epitopo I reconhecidos em primatas: 63 [SEQ ID N° [SEQ ID N° [SEQ ID N° [SEQ ID N° [SEQ ID N° [SEQ ID N° [SEQ ID N° [SEQ ID N° 17] 19] 22] 20] 24] 21] 18] e 23]

Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2

Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2

Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2

Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2

Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2

Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2

Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2

Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2

As sequências do Epitopo I são separadas por espaçadores dipeptídicos contendo resíduos de Gly e/ou Ser. O gene é montado como descrito em W.P.C. Stemmer et al., Gene, 164: 49 (1995). Resumidamente, são sintetizadas sobreposições de oligonucleótidos 60-meros (oligos) da cadeia superior e oligos da cadeia inferior com 20 nucleótidos (nt), juntamente com dois 50-meros na extremidade. Os 60-meros são incubados em conjunto, sob condições de hibridação e é utilizada a reacção em cadeia da polimerase (PCR) para preencher a sequência e amplificá-la. A extremidade com 50-meros é, então, adicionada e a montagem é concluída por PCR, com o isolamento da totalidade do gene em gel de agarose. O gene é sequenciado e confirmado que tem a sequência correcta dentro dos epitopos efectivos. Pode ser construído um gene heptavalente semelhante, eliminando a 64 variante rara [SEQ ID N°: 24].

Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 B. Expressão da Proteína de Fusão

Este gene descrito acima é, então, excisado com enzimas de restrição e inserido num vector de expressão adequado, contendo a sequência para o toxóide da difteria (HSP70), na grelha de leitura correcta. São transfectadas E. coli e são isoladas as colónias expressando a proteina. As colónias isoladas são cultivadas e é induzida a expressão. É identificada a proteina proveniente de colónias expressando a proteina de fusão. A proteina resultante é purificada utilizando métodos convencionais. A Fig. 3C ilustra um imunogénio do Epitopo II monovalente, opcionalmente preparado como um conjugado do péptido sintético com uma proteina veiculo tal como o toxóide da difteria, utilizando técnicas semelhantes. C Ensaios para Avaliar a Expressão dos Epitopos, Correctamente na Proteina de Fusão e a Eficácia na Indução de Anticorpos Anti-Tat São construídas quatro variantes de Epitopos I, em que Y7 é Arg, Asn, Lys ou Ser e X9 é Glu e Z12 é Lys e ambas as variantes do Epitopo II, num gene sintético e são expressas como uma proteina de fusão, como descrito nos parágrafos A e B, acima. Para determinar se cada epitopo é expresso na proteina de fusão, sob uma forma que pode ser reconhecida por anti-soros de 65 anti-soros de primata primata, são testados por ELISA, produzidos contra péptidos sintéticos correspondentes às sequências do Epitopo I, utilizando metodologia convencional. As placas são inicialmente directamente revestidas com a proteina de fusão e, seguidamente, expostas a 100 pg/mL de solução de anti-soros (e. g., anti-soros de coelho) que são conhecidos por serem reactivos com os Epitopos I e II. As sequências das variantes de epitopo são expressas numa conformação reconhecível por anticorpos contra os péptidos sintéticos correspondentes, como demonstrado por um título superior a 32000 para cada epitopo.

Para avaliar a imunogenicidade do imunogénio multivalente, os macacos foram imunizados com a proteína de fusão em IFA. Os anti-soros de macaco foram, então, avaliados para os péptidos sintéticos dos Epitopos I e II. Os títulos significativos desenvolvidos contra as variantes do Epitopo I, i. e., título de 28000 para o Epitopo I, quando Y7 é Arg e Z12 é Lys; título de 16000 para 0 Epitopo I quando Y7 é Asn e Z12 é Lys; título de 37000 para 0 Epitopo I, quando Y7 é Lys e Z12 é Lys; e título de 4000 para o Epitopo I , quando Y7 é Ser e Z12 é Lys. 0 título para o Epitopo II foi de 700, indicando que este epitopo é melhor apresentado para a imunização sob a forma de um péptido sintético ligado a um veículo.

EXEMPLO 5. MÉTODO E KITS PARA DETECTAR TÍTULOS E ESPECIFICIDADES DE ANTICORPOS INDUZIDOS POR VACINAÇÃO

Para seguir o título e as especificidades de anticorpos induzidos após a imunização com as vacinas desta invenção, pode ser utilizado um método de ensaio. Numa forma de realização 66 desse ensaio, são utilizados péptidos contendo sequências do Epitopo I reconhecido por primatas, descritas no Exemplo 1 (dependendo da composição da vacina de imunização), para desenvolver kits de medição dos títulos e dos padrões de reactividade dos anticorpos, em indivíduos vacinados.

Estes péptidos são sintetizados com Biotina-Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQID N° . 36] no terminal N. Cada péptido é revestido em placas separadas revestidas com avidina, com uma sequência -Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID N°: 27] servindo como um espaçador, para assegurar que a sequência peptídica relevante é exterior à bolsa de ligação à biotina da avidina. As placas são, então, incubadas com diluições do soro de teste, lavadas e a ligação do anticorpo é determinada com reagente contra a imunoglobulina humana, e. g., imunoglobulina de cabra anti-humana, directamente marcada com enzima. É utilizado um reagente para reagir com a enzima e produzir um sinal colorimétrico (inserções do kit R&D).

Na descrição identificada acima, estão incluídas numerosas modificações e variações da presente invenção e é esperado que sejam óbvias para um especialista na técnica. É considerado que estas modificações e alterações às composições e processos da presente invenção estejam abrangidas no âmbito das reivindicações incluídas em anexo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Thymon L.L.C. Goldstein, Gideon 67

<12Ο> Métodos e Composições para Prejudicar a Multiplicação do HIV-1 <130> GGP3APCT <150> US 09/561366 <151> 2000-04-28 <160> 39 <170> Patentln versão 3.0

<210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 1

Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 1 5

<210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <400> 2

Gly Arg Gly Asp Ser Pro 1 5 <210> 3 <211> 6 68

<212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Xaa pode ser Arg, Lys, Ser ou Asn <400> 3

Asp Pro Xaa Leu Glu Pro 1 5

<210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1) um <223> Vai pode estar, opcionalmente, modificado com alquilo ou alcanoílo inferior <22 0> <221> MOD_ RES <222> (4) . · (4) <223> XclcL pode ser Arg, Lys, Ser ou Asn <220> <221> MOD RES <222> (7) . · (7) <223> Pro está, opcionalmente, amidado 69 <4Ο0> 4

Vai Asp Pro Xaa Leu Glu Pro 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiêncm <22 0> <221> MO D RES <222> (D . · (D <223> Lys está, opcionalmente, alcanoilo inf er ior <22 0> <221> MO D RES <222> (2) . · (2) <223> Xaa pode ser Gly ou Ala <22 0> <221> MO D RES <222> (io: )..(10 ) <223> Lys está, opcionalmente, <4 0 0> 5 humana do tipo 1 amidado modificado com um alquilo ou

Lys Xaa Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 15 10 <210> 6 <211> 7 70

<212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MO D RES <222> (D . · (D <223> Arg está, opcionalmente, modificado alcanoílo inferior <22 0> <221> MO D RES <222> (3) • · (3) <223> Xaa pode ser Ala, Pro, Ser ou Gin <22 0> <221> MO D RES <222> (4) . · (4) <223> Xaa pode ser Pro ou His <22 0> <221> MO D RES <222> (5) . . (5) <223> Xaa pode ser Gin ou Pro <22 0> <221> MO D RES <222> (6) . · (6) <223> Xaa pode ser Asp, Asn, Gly ou Ser <22 0> <221>M0D : RES <222>(7). . (7) 71 <223>Ser pode estar, opcionalmente, amidado <400> 6

Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Ser está, opcionalmente, modificado com um alquilo ou alcanoílo inferior <22 0> <221> MOD RES <222> (3) . . (3) <223> Xaa pode ser Asn ou Thr <22 0> <221> MOD RES <222> (6) . . (6) <223> Xaa pode ser Ala ou Vai <22 0> <221> MOD RES <222> (12) . . (12) <223> Pro está, opcionalmente, amidado 72 <4Ο0> 7

Ser Gin Xaa His Gin Xaa Ser Leu Ser Lys Gin Pro 15 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alcanoílo inferior <22 0> <221> MOD RES <222> (3) . . (3) <223> Xaa pode ser Arg, Lys, Ser ou Asn <22 0> <221> MOD RES <222> (5) . . (5) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <22 0> <221> MOD RES <222> (8) . . (8) <223> Xaa pode ser Lys ou Asn e pode estar, opcionalmente, amidado 73 <4Ο0> 8 Αβρ Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa 1 5

<210>9 <211>8 <212>PRT <213>Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD_RES <222> (3) . . (3) <223> Xaa pode ser Arg, Lys, Ser ou Asn <22 0> <221> MOD_RES <222> (5) . . (5) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <22 0> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Xaa pode ser Lys ou Asn <400> 9

Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa 1 5 <210> 10 74 <211> 10 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana <22 0> <221> MOD RES <222> (2) . . (2) <223> Xaa pode ser Gly ou Ala <4 0 0> 10 Lys Xaa Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 1 5 10 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana <4 0 0> 11 Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 1 5 <210> 12 <211> 260 <212> PRT <213> Virus imunodeficiência humana do <22 0> <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Glu está ligado a DnaK (HSP70) do tipo do tipo tipo 1 1 1 75 <4 Ο 0> 12

Glu Pro Vai Asp Pro Arg Leu Glu 1 5 Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys 20 Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu 35 40 Trp Lys Gly Ser Glu Pro Vai Asp 50 55 Ser Glu Pro Vai Asp Pro Asn Leu 65 70 Vai Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp 85 Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser 100 Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Vai 115 120 Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Ser 130 135 Pro Vai Asp Pro Ser Leu Glu Pro 145 150 Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly 165 Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro 180 Lys Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro 195 200 Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 210 215 Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Ser 225 230 Tyr Gly Arg Lys Ser Gly Ser Lys

Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Vai 10 IS

Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Arg 25 30

Pro Vai Asp Pro Arg Leu Glu Pro 45

Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly 60

Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro 75 80

Lys Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro 90 95

Glu Pro Vai Asp Pro Ser Leu Glu 105 110

Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys 125

Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu 140

Trp Lys Gly Ser Glu Pro Vai Asp 155 160

Ser Glu Pro Vai Asp Pro Lys Leu 170 175

Vai Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp 185 190

Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser 205

Arg Lys Ser Gly Ser Lys Gly Leu 220

Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ile Ser 235 240

Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg 250 255

Lys Ser Gly Ser 260 76 245

<210> 13 <211> 380 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Glu está ligado a DnaK (HSP70) <4 0 0> 13

Glu Pro Vai Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val 1 5 10 15 Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Arg 20 25 30 Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro 35 40 45 Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly 50 55 60 Ser Glu Pro Val Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro 65 70 75 80 Vai Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro 85 90 95 Asn Leu Glu Pro Trp Lys Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu 115 120 125 Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys 130 135 140 Gly Ser Glu Pro Val Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu 145 150 155 160 77

Pro Vai Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys Gly Ser Glu Pro Vai Asp 165 170 175 Pro Asn Leu Ala Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Asn Leu 180 185 190 Ala Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Asn Leu Ala Pro Trp 195 200 205 Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Asn Leu Ala Pro Trp Asn Gly Ser 210 215 220 Glu Pro Vai Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai 225 230 235 240 Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Asn 245 250 255 Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Asn Leu Glu Pro 260 265 270 Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly 275 280 285 Ser Glu Pro Vai Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro 290 295 300 Vai Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro 305 310 315 320 Ser Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Lys Leu Glu 325 330 335 Pro i Trp Asn Gly Ser Glu Pro Vai Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn 340 345 350 Gly ’ Ser ’ Glu Pro Vai Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser Glu 355 360 365 Pro • Vai Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn Gly Ser 370 375 380

<210> 14 <211> 13 <212> PRT 78 <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Cys está conjugado com o toxóide da Difteria <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys está ligado a uma amida. <4 0 0> 14

Cys Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 15 10

<210> 15 <211> 72 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 15

Met Glu Pro Vai Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15 Gin Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30 His Cys Gin Vai Cys Phe Ile Thr Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 35 40 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Ala Pro Gin Asp Ser Gin Thr 50 55 60 His Gin Vai Ser Leu Ser Lys Gin 65 70 79 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo <22 0> <221> MOD RES <222> (3) . . (3) <223> Xaa pode ser Arg, Lys, Ser ou Asn <22 0> <221> MOD RES <222> (5) . . (5) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <22 0> <221> MOD RES <222> (8) . . (8) <223> Xaa pode ser Lys ou Asn <22 0> <221> MOD RES <222> (12) . . (12) <223> Ser está ligado a uma amida <4 0 0> 16 Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa His Pro Gly Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 8 80 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alcanoilo inferior <22 0> <221> HOD RES <222> (8) . . (8) <223> Lys está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 17 Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alquilo alquilo alcanoílo inferior ou ou <22 0><221> MOD_RES <222> (8)..(8) 81 <223> Asn está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 18

Asp Pro Asn Leu GXu Pro Trp Asn 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D .. (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alquilo ou alcanoílo inferior <22 0> <221> MOD RES <222> (8) . . (8) <223> Lys está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 19

Asp Pro Lys Leu Glu Pro Trp Lys 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> 82 <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alquilo ou alcanoílo inferior <22 0> <221> MOD RES <222> (8) . . (8) <223> Lys está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 20

Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D .. (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alquilo ou alcanoilo inferior <22 0> <221> MOD RES <222> (8) . . (8) <223> Lys está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 21

Asp Pro Asn Leu Glu Pro Trp Lys 1 5 83 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alquilo ou alcanoílo inferior <22 0> <221> MOD RES <222> (8) . . (8) <223> Asn está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 22 Αβρ Pro Lys Leu Glu Pro Trp Asn 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D . · (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado com um alquilo ou alcanoilo inferior 84 <22 0>

<221> MO D RES <222> (8) . . (8) <223> Asn está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 23 Aep Pro Asn Leu Asp Pro Trp Asn 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Virus da imunodeficiência humana do <22 0> <221> MO D RES <222> (D . . (D <223> Asp está, opcionalmente, modificado alcanoilo inferior <22 0> <221> MO D RES <222> (8) . . (8) <223> Asn está, opcionalmente, amidado <4 0 0> 24 Asp Pro Ser Leu Glu Pro Trp Asn 1 5 <210> 25 <211> 14 <212> PRT tipo 1 com um alquilo ou 85 <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0>

<221> MOD_RES <222> (1)..(1) um <223> Lys pode estar, opcionalmente, modificado com alquilo ou alcanoílo inferior <22 0> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa pode ser Gly ou Ala <400> 25

Lys Xaa Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Gly Ser Gly Ser 15 10

<210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> M0D_RES <222> (5)..(5) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <400> 26

Aep Pro Asn Leu Xaa Pro Trp Asn 1 5 <210> 27 86 <211> 4 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 27

Ser Gly Ser Gly 1 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 28

Vai Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Asn 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 29

Vai Asp Pro Asn Leu Asp Pro Trp Asn 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 30

Vai Asp Pro Ser Leu Asp Pro Trp Asn 1 5 87 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 31

Vai Αβρ Pro Asn Leu Asp Pro Trp Lys 1 5 <210> 32 <211> 11 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 32

Glu Pro Vai Asp Pro Asn Leu Asp Pro Trp Lys 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <4 0 0> 33

Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 88 <22 0> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys do terminal C está amidado <400> 34

Cys Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 15 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D .. (D <223> A biotina está ligada a Ser do terminal N <4 0 0> 35

Ser Gly Ser Gly Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys 15 10

<210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> M0D_RES <222> (1)..(1) <223> A biotina está ligada a Ser 89 <4Ο0> 36

Ser Gly Ser Gly 1 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (4) . . (4) <223> Xaa pode ser Arg, Lys, Ser ou Asn <22 0> <221> MOD RES <222> (6) . . (6) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <22 0> <221> MOD RES <222> (9) . . (9) <223> Xaa pode ser Lys ou Asn e pode estar, opcionalmente, amidado <4 0 0> 37 Vai Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa 1 5 <210> 38 <211> 11 90

<212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 <22 0> <221> MOD RES <222> (D ..(D <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <22 0> <221> MOD RES <222> (6) . . (6) <223> Xaa pode ser Arg, Lys, Ser ou Asn <22 0> <221> MOD RES <222> (8) . . (8) <223> Xaa pode ser Glu ou Asp <22 0> <221> MOD RES <222> (11) · · dl ) <223> Xaa pode ser Lys ou Asn e pode estar, opcionalmente, amidado <4 0 0> 38

Xaa Pro Vai Asp Pro Xaa Leu Xaa Pro Trp Xaa 15 10

<210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 91 <4Ο0> 39 61y Ser Gly Ser 1

Lisboa, 19 de Fevereiro de 2007 92

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo, pelo menos, duas variantes de um péptido ou polipéptido da fórmula RI-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Zi2-R2 SEQ ID N° : 8, em que Y7 é seleccionado do grupo consistindo em Asn, Arg, Lys e Ser; em que X9 é Glu ou a Asp; em que Zi2 é seleccionado do grupo consistindo em Lys e Asn; em que RI é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, um alquilo inferior, um alcanoilo inferior e uma sequência com entre 1, a cerca de, 5 aminoácidos, opcionalmente, substituída com um alquilo inferior ou alcanoilo inferior; e em que R2 é seleccionado do grupo consistindo num hidroxilo livre, numa amida e numa sequência com um ou até cerca de 5 aminoácidos adicionais, opcionalmente, substituída com uma amida; e em que em, pelo menos, uma das referidas variantes Y7 é Asn e Z12 é Asn e na outra Y7 é Arg e Zi2 é Lys.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que para qualquer variante, RI é Vai. 1
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que para qualquer variante, RI é X2-Pro-Val, em que X2 é seleccionado do grupo consistindo em Glu e Asp.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que para qualquer variante, R2 é -His-Pro-Gly-Ser, em que o referido terminal carboxilo está, opcionalmente, substituído com uma amida.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que, pelo menos, uma variante referida é Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID N°: 17, e a outra variante referida é Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID N°: 18 e compreendendo uma ou mais sequências adicionais seleccionadas do grupo consistindo em: Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID N°: 19 Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID N°: 22 Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID N°: 20 Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pm-Trp-Asn-R2 SEQ ID N°: 24 Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID N°: 23 e Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID N°: 21, 2 em que RI é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, um alquilo inferior, um alcanoilo inferior e uma sequência com entre 1, a cerca de, 5 aminoácidos, opcionalmente substituída com um alquilo inferior ou alcanoilo inferior; e em que R2 é seleccionado do grupo consistindo num hidroxilo livre, numa amida e numa sequência com um ou até cerca de 5 aminoácidos adicionais, opcionalmente, substituída com uma amida.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, compreendendo, adicionalmente, pelo menos, sete das referidas sequências de aminoácidos.
7. Composição de acordo com a reivindicação 1, compreendendo, adicionalmente, pelo menos, um péptido ou polipéptido da fórmula R3-Lys-X42_Leu-Gly-lle-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 SEQ ID N°: 5, em que X42 é seleccionado do grupo consistindo em Gly ou Ala; em que R3 é seleccionado do grupo consistindo em hidrogénio, um alquilo inferior, um alcanoilo inferior e uma sequência com entre 1, a cerca de, 5 aminoácidos, opcionalmente, substituída com um alquilo inferior ou alcanoilo inferior; em que R4 é seleccionado do grupo consistindo num hidroxilo livre, numa amida e numa sequência com um ou até cerca de 5 3 aminoácidos adicionais, excluindo os aminoácidos básicos -Lys-Arg-Arg-, opcionalmente, substituída com uma amida.
8. Composição de acordo a reivindicação 1, obtenível por vias sintéticas.
9. Composição de acordo a reivindicação 1, obtenível por vias recombinantes.
10. Composição de acordo a reivindicação 1, em que um ou mais dos referidos péptidos são expressos como um péptido sintético ligado a uma proteína veículo.
11. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que um ou mais dos referidos péptidos são expressos como péptido antigénico múltiplo, opcionalmente, ligado a uma proteína veículo.
12. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que um ou mais dos péptidos seleccionados são expressos dentro de uma proteína produzida recombinantemente, opcionalmente, fundida com uma proteína veículo, na grelha de leitura correcta.
13. Composição de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 12, em que a referida proteína veículo é seleccionada do grupo consistindo numa proteína DnaK de E. coli, numa proteína GST, numa proteína de choque térmico micobacteriana 70, num toxóide da difteria, num toxóide do tétano, numa galactocinase, numa ubiquitina, num factor α de conjugação, numa β-galactosidase e numa proteína de influenza NS-1. 4
14. Composição farmacêutica compreendendo uma composição de qualquer das reivindicações 1 a 13, um veiculo farmaceuticamente aceitável e um adjuvante opcional.
15. Utilização de uma composição de qualquer das reivindicações 1 a 15, na preparação de um medicamento para tratar o HIV-1 num mamifero.
16. Método in vitro para determinar a presença e ou o titulo de anticorpos induzidos pela imunização contra um imunogénio da Tat, compreendendo: (A) fazer contactar uma amostra biológica de um indivíduo imunizado, com uma composição de péptido ou polipéptido de qualquer das reivindicações 1 a 13, ligada a um suporte sólido; (B) lavagem do referido suporte para eliminar qualquer material da referida amostra biológica que não esteja ligado às referidas sequências; (C) fazer contactar o referido suporte com um reagente associado a uma marcação detectável, em que o referido reagente detecta a ligação entre as referidas sequências no referido suporte sólido e o anticorpo na referida amostra biológica e em que a referida marcação produz um sinal detectável.
17. Composição de anticorpo compreendendo anticorpos dirigidos contra os péptidos ou polipéptidos que formam as composições da reivindicação 1, compreendendo, a referida 5 composição, pelo menos, um primeiro anticorpo que se liga, especificamente, ao epitopo Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-X9_Pro-Trp-Zi2-R2 SEQ ID N°: 8, em que Y7 é Asn, Z72 é Asn e X9 é Glu ou Asp e um segundo anticorpo que se liga, especificamente, ao referido epitopo, no qual Y7 é Arg e Z72 é Lys.
18. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 17, compreendendo uma mistura de mais de dois dos referidos anticorpos, em que os referidos anticorpos se ligam a sequências do epitopo da proteínas Tat do HIV-1, de várias estirpes do HIV-1.
19. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 17 e 18, em que o referido anticorpo é seleccionado do grupo consistindo num anticorpo policlonal isolado, num anticorpo monoclonal, num anticorpo quimérico, num anticorpo humanizado, num anticorpo humano, num anticorpo produzido por rastreio de apresentação por fagos, um anticorpo de cadeia simples, um fragmento de anticorpo e suas misturas.
20. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 17, compreendendo um anticorpo que se liga, especificamente, à sequência de aminoácidos Asp-Pro-Asn-Leu-X9-Pro-Trp-Asn da SEQ ID N°: 26, em que o referido X9 é Glu ou Asp.
21. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 17, compreendendo um anticorpo que se liga, especificamente, à sequência de epitopo Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID N°: 17 e um anticorpo que se liga, especif icamente, à sequência de epitopo Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID N°: 18. 6
22. Composição de anticorpo de acordo com a reivindicação 17, compreendendo um anticorpo contra uma proteina Tat-1 do HIV, que se liga, especif icamente, à sequência de aminoácidos -Lys-Xi-Leu-Gly-lle-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- da SEQ ID N°: 10, em que o referido aminoácido Xi é Gly ou Ala.
23. Composição farmacêutica compreendendo uma composição de anticorpo de qualquer das reivindicações 17-22 e um veiculo farmaceuticamente aceitável.
24. Utilização de uma composição de anticorpo de qualquer das reivindicações 17 a 22, na preparação de um medicamento para tratar o HIV-1 pela redução dos niveis virais do HIV-1 num humano.
25. Gene sintético compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando, pelo menos, duas variantes de um péptido ou polipéptido, como definido na reivindicação 1.
26. Molécula sintética compreendendo o gene sintético da reivindicação 25, operativamente ligado a sequências de ácido nucleico reguladoras, que dirigem e controlam a expressão do produto do referido gene sintético, numa célula hospedeira.
27. Célula hospedeira de mamifero contendo um gene sintético da reivindicação 25.
28. Composição farmacêutica compreendendo um gene sintético da reivindicação 25 e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 19 de Fevereiro de 2007 7