MXPA02010632A - Metodos y composiciones para deteriorar la multiplicacion de vih-1. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una composicion que induce anticuerpos contra la mayor parte (por ejemplo, mas de 95%) de las variantes conocidas de la proteina Tat de VIH-1 tanto en las cubiertas B como las que no son B que contienen por lo menos dos variantes de un peptido o polipeptido de la formula: R1-Asp-Pro-Y7,-Leu-X9,-Pro-Trp-Z12,-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 8]. De acuerdo con esta formula, Y7, es Arg, Lys, Ser o Asn; X9, es Glu o Asp; Z12, es Lys o Asn; R1 es hidrogeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior, o una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoacidos, opcionalmente sustituido con un alquilo inferior o alcanoilo inferior; y R2 es un hidroxilo libre, una amida o una secuencia de 1 hasta aproximadamente 5 aminoacidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida. En esta composicion, por lo menos una de las dos variantes contiene Arg en Y7, y Lys en Z12, y en por lo menos la segunda de las dos variantes, Y7, es Asn y Z12,, es Asn. Las composiciones de vacuna y farmaceuticas pueden contener uno o mas de tales peptidos asociados con proteinas portadoras, asociados en peptidos antigenicos multiples o como parte de proteinas recombinantes. La adicion a esta combinacion u otros inmunogenos opcionales puede proporcionar otras composiciones utiles para elucir anticuerpos contra Tat de primate los cuales dan reaccion cruzada con cepas multiples y variantes de la proteina Tat de VIH-1. Las composiciones de vacuna y farmaceuticas pueden contener los anticuerpos primates inducidos por las composiciones peptidicas para uso en tratamientos pasivos. Se describen composiciones de diagnostico asi como usos para determinar el estado inmunitario de pacientes vacunados.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA DETERIORAR LA MULTIPLICACIÓN DE VIH-1 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona de manera general con composiciones y métodos útiles para inhibir la multiplicación del virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) en pacientes infectados, sintomáticos o asintomáticos, y para atenuar la multiplicación de VIH-1 después de la infección primaria en sujetos previamente no infectados, y de esta manera minimizar el avance al SIDA.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Muchos enfoques para el tratamiento contra el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) se han enfocado en el gen transactivante { Tat) de VIH-1, el cual produce una proteína (Tat) esencial para la transcripción del virus. El gen tat y su proteína se han secuenciado y examinado para determinar su relación en los tratamientos propuestos de VIH, [véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Números 5,158,877; 5,238,882; y 5,110,802; las Solicitudes de Patentes Internacionales Números O92/07871, O91/10453, O91/09958 y O87/02989, publicadas el 14 de mayo de 1992, 25 - de julio de 1991, 11 de julio de 1991 y 21 de mayo de 1987, respectivamente] . La proteína tat es liberada extracelularmente, volviéndola disponible para ser captada por otras células infectadas para mejorar la transcripción de VIH-1 en las células y por células no infectadas, para alterar las activaciones de genes de la célula huésped. Tat vuelve a las células susceptibles a infección por el virus. La captación de Tat por las células es muy fuerte, y se ha reportado como mediada por una secuencia básica corta de la proteína [S. Fawell et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:664-668 (1994)] . La inmunización con proteína Tat de VIH-1 como una vacuna potencial contra el SIDA se encuentra bajo investigación activa. Se ha utilizado la secuencia de Tat VIH-1 HXB/LAV como el inmunógeno en estudios publicados, ya sea como una proteína recombinante [A. Cafaro et al, Na .

Med. , 5_.-643-650 (1999)], una vacuna de ADN [S. Calarota et al . , Lancet , 351:1320-5 (1998)], una proteína inactivada (toxoide Tat) [S. S. Cohén et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96(19) :10842-10847 (1999), A Gringeri et al, J. Hum.

Virol., JL:293-8 (1998)] o una vacuna de ADN que expresa Tat inactiva [E . Caselli et al , J. Immunol . , 162 : 5631-5638 (1999) ] . Las inmunizaciones con la secuencia Tat completa inducen inmunidad celular y humoral. Véase también M. C. Rhe et al, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Virol. 10 :408- - 416 (1995); C. J. Li et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:8116-8120 (1997); y otros] . La solicitud de patente internacional número W092/14755 publicada el 3 de septiembre de 1992, se relaciona con la proteína Tat y con el receptor de superficie celular de integrina capaz de unirse a la proteína Ta . Se han identificado dos secuencias Tat que unen integrina: -Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 1] , así como -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 2] . Estas secuencias son la región básica o dominio el cual es el sitio de unión dominante para la integrina. Esta especificación demuestra que el número de péptidos correspondiente a estas secuencias Tat y las integrinas correspondientes bloquean la unión celular in vitro a placas recubiertas con Tat, y hacen lo mismo anticuerpos para las integrinas apropiadas. Sin embargo, la especificación también muestra que estos reactivos no bloquean la captación de Tat funcional por las células (véase ejemplo 9 en W092/14755) , y de esta manera nulifican el mecanismo de acción propuesto para el beneficio terapéutico en infección por VIH. Las secuencias Tat descritas en esta solicitud internacional son diferentes de los inmunógenos peptídicos de la presente invención. Se han producido fácilmente anticuerpos monoclonales y policlonales contra la proteína Tat en animales, y se ha demostrado que bloquea la captación de proteína Tat in vitro (véase, por ejemplo, D. Brake et al, J. Virol., 64:962 (1990); D. Mann et al , EMBO J. , 10:1733 (1991) ; J. Abraham et al, mencionado antes; P. Auron et al , mencionado antes; M. Jaye et al , mencionado antes; G. Zauli et al, mencionado antes] . Informes más recientes muestran que los anticuerpos monoclonales o policlonales contra la proteína Tat agregados a medio de cultivo de tejido atenúan la infección por VIH-1 in vitro [L. Steinaa et al, Arch. Virol . , 139:263 (1994); M. Re et al, mencionado antes; y G. Zauli et al , J. Acq. Imm. Def. Syndr. Hum. Retrovirol . , 10:306 (1995) ] . Las publicaciones propias de los inventores [G. Goldstein, Nature Med. , 2^:960 (1996); y Solicitud de Patente Internacional Número 095/31999, publicada el 30 de noviembre de 1995] revisaron la evidencia que indica que la secreción de proteína Tat de VIH-1 de células infectadas y la captación tanto por células infectadas como no infectadas es importante para la infectividad de VIH-1. Estudios anteriores también han demostrado que los anticuerpos para la proteína Tat bloquean la captación de Tat in vitro e inhiben la infectividad in vitro. La inmunización activa de mamíferos se ha sugerido que induce anticuerpos contra la proteína Tat de VIH-1 como una vacuna potencial contra el SIDA. Véase también G. Goldstein et al , "Minimization of chronio plasma viremia in rhesus macaques immunized with synthetic VIH-1 Tat peptides and infected with a chimeric simian/human immunodeficiency virus (SHIV33)p, Vaccine, 18:2789 (2000). Otras publicaciones de los inventores, la Solicitud de Patente Internacional Número O99/02185, publicada el 21 de enero de 1999 y la Patente de los E.U.A. número 5,891,994, expedida el 6 de abril de 1999 (ambas incorporadas como referencia en la presente) , revelan un concepto nuevo en el tratamiento y para evitar infección por VIH-1 que utiliza secuencias Tat las cuales son reconocidas como epitopos por el sistema inmunitario del conejo. A diferencia de las descripciones anteriores discutidas antes, estas publicaciones se relacionan con combinaciones terapéuticas e inmunogénicas que requieren por lo menos dos, y preferiblemente la totalidad de los cuatro péptidos o polipéptidos Tat que comprenden a la secuencia del epitopo I" que abarca los residuos de aminoácidos Tat 4 (o 5) a 10, como sigue: -Asp-Pro-X7-Leu-Glu-Pro- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 3] o R1-Val-Asp-Pro-X7-Leu-Glu-Pro-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 4], en donde X7 es Arg, Lys, Ser o Asn. Tales composiciones inducen anticuerpos que reaccionan con la mayor parte de las proteínas Tat de VIH-1 y dañan la multiplicación de VIH-1. De acuerdo con esta publicación, algunas otras secuencias Tat, las cuales comprenden un péptido o polipéptido "epitopo II" que abarcan los residuos - de aminoácidos Tat 41-50 de la fórmula R3-Lys-X2-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5] , en donde X42 se selecciona del grupo que consiste de Gly o Ala, se pueden agregar a esta composición. Alternativamente, un péptido o polipéptido "epitopo III" que abarca los residuos de aminoácidos Tat 56-62 de la fórmula R5-Arg-Arg-X58-Z59-A6o-Y6i-Ser-R6 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 6], en donde X58 se selecciona del grupo que consiste de Ala, Pro, Ser y Gln; en donde Y6? se selecciona del grupo que consiste de Asp, Asn, Gly y Ser; en donde Z59 se selecciona del grupo que consiste de Pro e His; en donde A60 se selecciona del grupo que consiste de Gln y Pro, se pueden agregar a esta composición. Aún de manera alternativa, un péptido o polipéptido de "epitopo IV" que abarca los residuos de aminoácidos Tat 62 a 73 de la fórmula R7-Ser-Gln-X6 -His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 7] , en donde X6 se selecciona del grupo que consiste de Asn y Thr; en donde Y?7 se selecciona del grupo que consiste de Ala y Val se pueden agregar a esta composición. La composición misma se puede utilizar para inducir anticuerpos en una gran cantidad contra las secuencias Tat características de las variantes múltiples de VIH-1. Las composiciones o anticuerpos generados se utilizan como vacuna o tratamientos profilácticos contra estas variantes múltiples.

Pese al conocimiento cada vez mayor acerca del avance de la enfermedad por VIH-1 aún permanece la necesidad en la técnica en búsqueda de un desarrollo de composiciones y métodos para el tratamiento de VIH-1, tanto profiláctica como terapéuticamente, que sean útiles para disminuir los niveles virales de VIH-1 para el tratamiento y posiblemente para evitar la enfermedad subsecuente y generalmente mortal de SIDA.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende por lo menos dos variantes de un péptido o polipéptido de un epitopo I de fórmula Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8] , en donde Y7 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Ser y Asn, en donde X9 se selecciona del grupo que consiste de Glu y Asp; en donde Zi2 se selecciona del grupo que consiste de Lys y Asn; en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior y una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituido con un alquilo inferior o alcanoilo inferior; en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de un hidroxilo libre, una amida y una secuencia de 1 hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida. En esta composición, por lo menos una de las dos variantes debe tener la fórmula en la que Y7 es Arg y Z12 es Lys, y por lo menos la segunda de las dos variantes debe tener la fórmula en la cual Y7 es Asn y Zi2 es Asn. Cada péptido de esta composición es reconocido como un epitopo I de Tat de VIH-1 por un sistema inmunitario de primate. Esta fórmula permite la construcción y uso de diversas combinaciones de péptidos. En otro aspecto, la composición descrita en lo anterior contiene además uno o más péptidos o polipéptidos adicionales los cuales representan otras secuencias de aminoácidos las cuales corresponden a los 5 residuos aminoácidos de Tat de VIH-1 al residuo aminoácido 12. Estas secuencias opcionales de aminoácidos se describen con detalle en lo siguiente. Estas secuencias preferiblemente son de una cepa de VIH-1 con una variante de proteína Tat en el lugar. En otro aspecto, esta invención proporciona una composición descrita antes que contiene péptidos o polipéptidos los cuales comprenden por lo menos dos péptidos de epitopo I necesarios, reconocidos por primates (y preferiblemente péptidos del epitopo I adicional) , en combinación con uno o más de los epitopos II, III o IV de Tat de VIH-1. Los epitopos II, III, y IV son las fórmulas de péptido de Tat de VIH-1 descritas en la publicación de patente internacional número 099/02185, incorporada en la presente como referencia. Tales composiciones pueden combinar péptidos de Tat de VIH-1 apropiados, de manera que proporcione una composición que induce anticuerpos reactivos contra más de aproximadamente 95% de todas las proteínas Tat de VIH-1 conocidas. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición de anticuerpo que comprende por lo menos un anticuerpo, generado preferiblemente en un primate, el cual se une específicamente a un péptido o un polipéptido de la fórmula Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z?2-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8], en donde Y7 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Ser y Asn, en donde X9 se selecciona del grupo que consiste de Glu y Asp; en donde Z12 se selecciona del grupo que consiste de Lys y Asn; en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior y una secuencia de entre 1 a aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituido con un alquilo inferior o alcanoilo inferior; en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de un hidroxilo libre, una amida y una secuencia de 1 hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida. Esta composición de anticuerpo preferiblemente comprende por lo menos dos anticuerpos, es decir, un anticuerpo el cual se une a una variante de epitopo I en el cual Y7 es Arg y Z?2 es Lys, y por lo menos un segundo anticuerpo el cual se une a una segunda variante de epitopo I en la cual Y7 es Asn y Z12 es Asn. También se incluyen en esta composición otros anticuerpos dirigidos a otras variantes además de las dos variantes especificadas. Estos anticuerpos en la composición se unen a secuencias de epitopo I reconocidas por el sistema inmunitario del primate, epitopo el cual está presente en variantes múltiples de las proteínas Tat de VIH-1. Estos anticuerpos incluyen diversos plásmidos recombinantes de anticuerpo, tales como anticuerpos monoclonales, como se describe con detalle en lo siguiente. En otro aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal, el cual se une específicamente a un epitopo reconocido por primate de una proteína Tat de VIH-1, el epitopo comprende la secuencia de aminoácidos -Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z?2- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 9] , en donde Y7, X9 y Z12 son como se definen en lo anterior. En otro aspecto adicional, la invención proporciona una composición de anticuerpo que comprende por lo menos un anticuerpo que reconoce la secuencia del péptido de epitopo II -Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10] , en donde X42 es Gly o Ala, como un epitopo distinto de los anticuerpos descritos previamente los cuales reconocen al epitopo de -Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg- Lys- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11] . Preferiblemente, la composición comprende un anticuerpo que reconoce tanto al péptido en el cual X42 es Gly como al péptido en el cual X2 es Ala. Estos anticuerpos preferiblemente se generan en primates. Estos anticuerpos en la composición se unen a secuencias del epitopo II reconocidos por el sistema inmunitario del primate, epitopo el cual está presente en variantes múltiples de proteínas Tat de VIH-1. Estos anticuerpos incluyen una variedad de plásmidos recombinantes de anticuerpo, como se describe con detalle en lo siguiente. En otro aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, que reconoce la secuencia peptídica de epitopo II -Lys-X2-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10], en donde X2 es Gly o Ala, como un epitopo distinto del epitopo de -Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 11], reconocida por anticuerpos descritos previamente. En un aspecto adicional, la invención proporciona un gen recombinante o sintético el cual codifica secuencialmente para un péptido o polipéptido que contiene por lo menos dos variantes de un péptido o polipéptido de la fórmula del epitopo I Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8], como se define en lo anterior. En este gen sintético, por lo menos una de las dos variantes debe tener la fórmula en donde Y7 es Arg y Zi2 es Lys, y por lo menos la segunda de las dos variantes debe tener la fórmula en la cual Y7 es Asn y Z12 es Asn. Opcionalmente, este gen sintético comprende un péptido de epitopo II carboxi terminal, como se reconoce por el sistema inmunitario del primate. Alternativamente, el gen recombinante o sintético contiene las siete u ocho secuencias preferidas de aminoácidos de epitopo I reconocidas por primates identificadas en lo siguiente. El gen sintético puede contener cada secuencia de aminoácido separada por una secuencia separadora, o puede expresar cada péptido/polipéptido en un marco de lectura abierto con una proteína portadora. El gen sintético se puede separar de la proteína portadora por un separador si el separador se fusiona a la secuencia de epitopo I reconocida por primate, dejando una secuencia de epitopo II en la parte carboxi terminal de la proteína recombinan e. Las modalidades adicionales .incluyen péptidos de epitopo I múltiples de la fórmula anterior fusionados juntos y con la proteína portadora . En un aspecto adicional, la invención proporciona una molécula sintética, por ejemplo un vector, que comprende al gen sintético descrito en lo anterior, unido operativamente a secuencias reguladoras de ácido nucleico, las cuales dirigen y controlan la expresión del producto del gen sintético en una célula huésped. En otro aspecto, la invención proporciona un microorganismo recombinante, por ejemplo un virus o una bacteria comensal, la cual contiene el gen sintético descrito antes o la molécula sintética. Este microorganismo es capaz de expresar copias múltiples del producto del gen o la molécula en un huésped. En otro aspecto adicional de la presente invención se encuentra una composición farmacéutica útil para inducir anticuerpos que reaccionen con una gran cantidad de proteínas Tat de VIH-1 conocidas, por ejemplo más de 95%, y preferiblemente más de 99% de las proteínas Tat conocidas. Estos anticuerpos inducidos pueden deteriorar la multiplicación de VIH-1. La composición farmacéutica comprende por lo menos una de las composiciones de péptido/polipéptido recombinante o sintético descritas antes; o el gen/molécula sintético descrito antes; o el microorganismo recombinante descrito antes, en un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional de la invención se encuentra una composición farmacéutica útil para deteriorar la multiplicación de VIH-1, esta composición contiene una composición de anticuerpo descrita antes, o una composición de anticuerpo monoclonal.

En un aspecto adicional de la invención, un método para reducir las concentraciones virales de VIH-1 involucra exponer a un humano u otro primate a composiciones farmacéuticas inductoras de anticuerpo, descritas antes, que induzcan activamente anticuerpos que reaccionen con la mayor parte de las proteínas Tat de VIH-1 y que deterioren la multiplicación del virus in vivo. Este método es apropiado para un sujeto infectado con VIH-1 con un sistema inmunitario competente, o un sujeto no infectado o infectado crónicamente, pero asintomático. El método induce anticuerpos que reaccionan con las proteínas Tat de VIH-1 y las cuales reducen la multiplicación viral durante cualquier infección aguda inicial con VIH-1 y las cuales además minimizan la viremia crónica que lleva al SIDA. En otro aspecto adicional, la invención proporciona un método para reducir las concentraciones virales de VIH-1 al administrar a un humano, quien es incapaz de montar una respuesta inmunitaria eficaz o rápida a la infección por VIH-1, una composición farmacéutica que contiene las composiciones de anticuerpo descritas antes. El método puede involucrar administrar crónicamente la composición. Otros aspectos adicionales de la invención incluyen métodos para producir las composiciones descritas antes así como células huéspedes transfectadas con tales composiciones. Otro aspecto adicional de esta invención es un equipo útil para la medición y detección de los títulos y especificidades de anticuerpos inducidos por inmunización con las composiciones descritas antes. El equipo de la invención preferiblemente incluye los dos péptidos para epitopo I requeridos, descritos antes, así como los péptidos de adición del epitopo I, reconocido por primates y posiblemente péptidos adicionales de los epitopos II a IV, y soportes sólidos recubiertos, un reactivo marcado para detectar la unión de anticuerpos a estos péptidos, y sustratos y aparatos diversos para inducir o detectar las señales proporcionadas por las etiquetas, así como aparatos convencionales para tomar muestras de sangre, frascos apropiados y otros componentes de ensayo de diagnóstico. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para detectar los títulos y patrones de reactividad de anticuerpos en sujetos inmunizados con las composiciones de está invención. El método incluye las etapas de incubar diluciones del fluido biológico del sujeto, por ejemplo suero, con placas o esferas en las cuales se unen uno o más péptidos de las secuencias del epitopo I de esta invención, y opcionalmente los epitopos II a IV, eliminar por lavado materiales biológicos no unidos y medir cualquier unión de anticuerpo a los péptidos con el reactivo etiquetado, por ejemplo inmunoglobulina contra humano, a la cual está asociada una enzima. En base en el tipo de etiqueta utilizada, la señal producida por la etiqueta puede ser reducida al agregar adicionalmente un sustrato que reaccione con la enzima, por ejemplo produciendo un cambio de color. Otras etiquetas convencionales también se pueden incorporar en este diseño de ensayo. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen adicionalmente en la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la misma.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La figura ÍA es una gráfica de los títulos de ELISA de antisuero de conejo para los péptidos de epitopo I lineales más grandes sobre péptidos detectores truncados expresados como un porcentaje de la unión máxima a péptidos más grandes . Los aminoácidos en la partes N o C terminales de los péptidos detectores correspondientes se muestran debajo de cada columna en el código de una sola letra. La figura IB es una gráfica de los títulos de ELISA de antisuero de primate para los péptidos de epitopo I lineales más grandes sobre los péptidos detectores truncados, expresados como un porcentaje de la unión máxima a péptidos más grandes . Los aminoácidos de la parte N o C terminal de los péptidos detectores correspondientes se muestran debajo de cada columna en el código de una sola letra.

La figura 2A es una gráfica de los títulos de ELISA de antisuero de conejo para los péptidos del epitopo II lineales sobre péptidos detectores truncados, expresados como un porcentaje de la unión máxima a péptidos más grandes. Los aminoácidos terminales N o C de los péptidos detectores correspondientes se muestran debajo de cada columna con el código de una sola letra. La figura 2B es una gráfica de los títulos de ELISA de antisuero de primate para los péptidos de epitopo II lineales más grandes sobre péptidos detectores truncados, expresados como un porcentaje de unión máxima a péptidos más grandes. Los aminoácidos desde las partes terminales N o C de los péptidos detectores correspondientes se muestran en lo siguiente, en cada columna en código de una sola letra. La figura 3A ilustra el diseño de un plásmido recombinante inmunogénico de Tat de VIH-1 epitopo I-epitopo II pentavalente, en el código de aminoácidos de tres letras [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 12] . La figura 3B ilustra el diseño de un epitopo I universal octavalente en el código de aminoácidos de tres letras [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 13] . La figura 3C ilustra el diseño de un plásmido recombinante inmunogénico de epitopo II universal univalente en el código de aminoácidos de tres letras [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 14] .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una solución al problema indicado antes de proporcionar composiciones adicionales que induzcan anticuerpos en sujetos no infectados o infectados en una etapa temprana por VIH-1 pero que aún sean capaces de montar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno, los anticuerpos reaccionan con un número grande (es decir, más de 95%, y preferiblemente más de 99%) de las variantes de proteína Tat de VIH-1 conocidas. El término "variante" de secuencia (o proteína) Tat" significa un polipéptido o péptido que contiene los residuos de aminoácidos de proteína Tat o una secuencia de una proteína Tat de otra cepa de VIH-1 que sea sustancialmente similar a la secuencia de consenso de la tabla I [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15] . Cada variante puede diferir de la secuencia de consenso o de otra variante por al menos un cambio en un aminoácido dentro de los residuos de interés para los epitopos I a IV. Este cambio puede proporcionar una especificidad antigénica igual o diferente a ese epitopo Tat particular, cuando se agrega a la composición de la invención. Los anticuerpos inducidos por composiciones de esta invención pueden inhibir la multiplicación de VIH-1, lo que evita un progreso adicional de la enfermedad a SIDA. Las composiciones de anticuerpo también se proporcionan para uso en humanos infectados o no infectados, quienes son capaces de montar una respuesta inmunitaria eficaz o rápida a la infección por VIH-1. Estas composiciones son capaces de reaccionar con grandes cantidades de proteínas Tat y de esta manera se reducen las concentraciones virales de VIH-1. Estos anticuerpos son útiles en contextos terapéuticos y profilácticos para controlar el desarrollo de SIDA en una población grande expuesta a, o infectada por cepas de VIH-1, las cuales producen proteínas Tat inmunológicamente distintas ante la infección. Las composiciones de la presente invención incluyen péptidos o proteínas en base en péptidos proporcionados por un epitopo de proteína Tat de VIH-1 al cual los primates desarrollan anticuerpos, o secuencias de ácido nucleico las cuales codifican para los péptidos y polipéptidos que inducen anticuerpos para Tat en primates. Estos anticuerpos inducidos a su vez impiden la multiplicación de VIH-1. La proteína Tat de VIH-1 se produce de dos exones: El exón 1 codifica una proteína de 72 aminoácidos (aa) los cuales se pueden expresar sin maduración (corte y empalme) o los cuales pueden ser madurados con aproximadamente 15 a 32 aminoácidos codificados por el exón 2. La secuencia del exón I de Tat de VIH-1 aparece en la tabla I y es una secuencia de consenso en base en las secuencias de proteína Tat de 31 cepas conocidas de VIH-1 que se encuentran en el subtipo B común [base de datos NIH Los Alamos] . Las composiciones de aminoácidos en las cuales aparecen variaciones están con minúsculas. En la tabla I [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15] , el residuo aminoácido en la posición 73 es el primer Pro del exón 2 de Tat de VIH-1. Dado que el producto de 72 aminoácidos del exón 1 es capaz por si solo de captación y activación celular, es esencial que los anticuerpos reaccionen e impidan el transporte intercelular del péptido de 72 aminoácidos. Tat de VIH-1 contiene una región rica en cisteína entre las posiciones de aminoácidos 22 y 37 del exón 1 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15], con un solo enlace covalente entre Cys2? y Cys37, lo que produce una estructura terciaria compleja. La literatura científica ha indicado que esta región no parece ser inmunogénica. Los anticuerpos predominantes para Tat son para la región N terminal lineal rica en Pro (aminoácidos 1 a 21) y para la región básica lineal (aminoácidos 44 a 65) , con un anticuerpo adicional reportado para los aminoácidos 62 a 73. El inventor previamente ha identificado epitopos, es decir, regiones de unión, reconocidas por anticuerpos de conejo (secuencias antigénicas) en la secuencia N terminal lineal 1 a 21 (22 aminoácidos) del exón 1 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15] de variantes de Tat, y ha definido cuatro epitopos de linfocito B en Tat de VIH-1. Como se ha descrito previamente en la publicación de patente internacional O99/02185, las regiones inmunogénicas de esta secuencia más grande son reconocidas por el sistema inmunitario del conejo. Estas regiones se identifican en la secuencia de consenso del exón 1 en la tabla I siguiente: Se identificó el epitopo I por anticuerpos de conejo como la secuencia de 9 aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 2 a 10 del exón 1. El epitopo II se identificó como la secuencia de 8 aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 43 a 50 del exón 1. El epitopo III se identificó como la secuencia de siete aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 56 a 62 del exón 1. El epitopo IV se identificó como una secuencia de doce aminoácidos de las posiciones de aminoácidos 62 a 73 de Tat, incluyendo el primer Pro (aminoácido 73) del exón 2, y se superpone a Ser 62 del epitopo III.

Tabla I - Secuencia Tat de consenso 1 10 20 Met glu Pro Val asp pro arg Leu Glu Pro Trp Ivs His Pro Gly Ser Gln Pro lys thr 30 40 ala cys thr asn Cys Tyr Cys Lys lys Cys Cys phe his Cys gln val Cys Phe ile thr 50 60 Lvs glv Leu glv lie Ser Tyr Glv Arg Lvs Lys Arg Arg Gln Arg arg arg ala pro gln 70 asp Ser gln thr his Gln val ser Leu ser Lys gln [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15] .

Sin embargo, en la presente invención, el inventor ha detectado un desplazamiento sorprendente en las secuencias de aminoácidos de particularmente el epitopo I reconocido por linfocitos B en primates. En la tabla I, las secuencias de epitopo I y II reconocidas por primates están subrayadas. El epitopo I reconocido por primate abarca los residuos aminoácidos de Tat 5 a 12. La secuencia del epitopo II reconocido por linfocitos B en primates abarca los aminoácidos 41 a 50. Los epitopos III y IV son los mismos epitopos reconocidos por conejos, reportados en O99/02185, incorporados en la presente como referencia.

A. Composiciones inmunogénicas de epi topo I reconocidos por primate.

En una modalidad, la presente invención proporciona una composición que contiene por lo menos dos variantes de un péptido o polipéptido .reconocido por el sistema inmunitario de primates, y que induce una respuesta inmunitaria humoral específica (para el propósito de esta invención) en un primate expuesto a las secuencias in vivo . Estas secuencias de aminoácidos de epitopo I reconocidos por primate corresponden a los residuos aminoácidos 5 a 12 de la secuencia de consenso Tat [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15] de la tabla I, derivada de un número de "variantes de secuencias Tat" . El epitopo I reconocido por primates define péptidos de la fórmula general: Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO 8] , en donde Y7 es Arg, Lys, Ser o Asn; X9 es Glu o Asp; y Z12 es Lys o Asn. Esta fórmula permite una diversidad de variantes de péptidos de epitopo I de mamífero. La composición de esta invención debe contener por lo menos una variante peptídica en donde Y7 sea Arg y Z12 sea Lys, y por lo menos una segunda variante peptídica en la cual Y7 sea Asn, y Z?2 sea Asn. Los aminoácidos especificados que aparecen en la fórmula anterior de epitopo I reconocido por primates es una secuencia reactiva mínima de epitopo I de primates. Cada inmunógeno definido por esta fórmula el cual se emplea en métodos de esta invención para generar anticuerpos para la secuencia de epitopo I mínima debe ser una secuencia de aminoácidos más grande. Por ejemplo, los aminoácidos de epitopo I mínimos están flanqueados por otros aminoácidos, de manera que la totalidad de la secuencia inmunogénica de epitopo I está entre 8 y aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. La identidad de los aminoácidos flanqueantes no es esencial para la función biológica del inmunógeno de epitopo I. En particular, los aminoácidos adicionales en la parte N terminal de las secuencias de epitopo I reconocidas por primate no afectan la inmunogenicidad. De esta manera, para cada péptido de epitopo I reconocido por primate, el Rl en la parte N terminal puede ser un hidrógeno libre el aminoácido N terminal no modificado o un alquilo inferior (es decir, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono) o un alcanoilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono tal como un grupo acetilo. Rl también puede incluir una secuencia de entre 1 a aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituidos con un alquilo inferior o alcanoilo inferior. Preferiblemente Rl representa dos aminoácidos. En una modalidad, Rl es Val, lo que resulta en la secuencia Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z?2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 37], en donde Y7, X9 y ZX2 son como se define en lo anterior. En otras modalidades, Rl es -X2-Pro-Val- , lo que resulta en la secuencia X2-Pro-Val-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 38], en donde X2 es Glu o Asp, y en donde Y7, X9 y Z12 son como se define en lo anterior. Preferiblemente, Rl representa 3 aminoácidos. Los aminoácidos adicionales de la parte C terminal de la secuencia mínima de epitopo I reconocida por primate pueden mejorar el título de anticuerpos. Aunque el R2 en la parte C terminal puede ser un grupo hidroxilo libre simple en el aminoácido C terminal, también puede ser una amida C terminal. Sin embargo, para aumentar el título, R2 preferiblemente es una secuencia de entre 1 a aproximadamente 14, preferiblemente aproximadamente 4 aminoácidos adicionales amidados en la parte carboxilo terminal. En una modalidad preferida, R2 es -His-Pro-Gly-Ser-amida, lo que resulta en la secuencia Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z?2-His-Pro-Gly-Ser [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 16], en donde Y7, X9 y Zi2 son como se definen en lo anterior. Preferiblemente, una composición de esta invención incluye además de los dos péptidos requeridos identificados antes, por lo menos cinco o seis secuencias diferentes de aminoácidos de la fórmula de epitopo I reconocida por primates. De manera más preferible, la composición comprende siete u ocho variantes de secuencias de aminoácidos, identificadas inmediatamente en lo siguiente . La composición también puede contener otras secuencias peptídicas o polipeptídicas, cada una contiene una combinación diferente de X9, Y7 y ZX . Como se demuestra en los ejemplos que siguen, con tres sitios de variabilidad antigénica en el epitopo I reconocido por primates, una composición preferida de esta invención puede contener péptidos suficientes de epitopo I reconocidos por primate para comprender 95% de toda la cubierta B conocida y la cubierta no B de las variantes de Tat de VIH-1 al incluir los dos péptidos "requeridos": Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17]; y Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 18], así como uno a cinco de los siguientes péptidos de epitopo I adicionales: Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19] ; Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20] ; Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21] ; Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22]; y Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23] ; así como, opcionalmente y de manera adicional, la variante poco común Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24] . La composición de epitopo I reconocida por primate, de esta invención, puede contener muchos péptidos o polipéptidos adicionales que contengan otras secuencias que correspondan a los residuos aminoácidos entre aminoácido 5 a aminoácido 12 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15, pero que se deriven de otras variantes Tat las cuales no dan reacción cruzada bien con los anticuerpos para las composiciones de epitopo I reconocidas por primate. Las composiciones de epitopo I de esta invención pueden contener copias múltiples de cinco o más péptidos de epitopo I diferentes, en cualquier orden. En una modalidad, esta presente por lo menos una copia de siete o la totalidad de las ocho secuencias de aminoácidos descritas antes [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17 a 24] . Estos péptidos o polipéptidos de la invención se producen de manera sintética o recombinante. Los aminoácidos opcionales (por ejemplo -Gly-Ser-) u otros separadores de compuestos de aminoácidos o químicos pueden incluirse en la parte terminal de los péptidos con el propósito de unir los péptidos juntos o a un portador. Esta composición puede tomar la forma de uno o más péptidos descritos en lo anterior expresados como un péptido sintético acoplado a una proteína portadora. Alternativamente, una composición puede contener múltiples péptidos de epitopo I , cada uno expresado como un péptido antigénico múltiple, acoplado opcionalmente a proteína portadora. Alternativamente, los péptidos seleccionados se pueden unir secuencialmente y se pueden expresar dentro de una proteína producida recombinantemente. Como una modalidad, las ocho secuencias identificadas específicamente en lo anterior se unen secuencialmente, con o sin aminoácidos separadores entre las mismas, para formar una proteína recombinante más grande. Alternativamente, la proteína recombinante se puede fusionar en marco con una proteína portadora. Estas composiciones de epitopo I de primate se diseñan para inducir anticuerpos reactivos con más de 95% de las variantes conocidas de la proteína Tat de VIH-1 incluyendo proteínas Tat de VIH-1 de cubierta B y cubierta no B. Las composiciones de epitopo I reconocidas por primate demuestran una actividad biológica de inducir en un primate competente inmune, e inmunizado, es decir, un humano no infectado o bien un humano infectado asintomático, una respuesta inmunitaria humoral activa (es decir anticuerpos) que estén dirigidos contra más de 95%, y preferiblemente más de 99% de las variantes conocidas de proteínas Tat de VIH-1. El resultado final de tal tratamiento es un deterioro en la multiplicación de VIH-1 después de una infección aguda. Este deterioro evita las concentraciones de VIH-1 plasmáticas elevadas después de seroconversión relacionadas con el progreso a SIDA. La inducción activa de anticuerpos en la fase asintomática de infección por VIH puede reducir la multiplicación viral, disminuir la carga viral plasmática y reducir la probabilidad de progreso a SIDA. La composición la cual contiene por lo menos dos inmunógenos de epitopo I reconocidos por primates requeridos y preferiblemente siete u ocho de las secuencias de epitopo I [por ejemplo, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17 a 24] , pueden inducir una respuesta inmunitaria en aproximadamente 95% de 294 secuencias Tat conocidas de los subtipos B comunes de VIH-1 y con las de proteínas Tat de la totalidad de los 56 subtipos de VIH-1 no B que se han secuenciado [cortesía de la Dra. Esther Guzman, Los Alamos base de datos NIAID HIV, base de datos GenBank] .

B. Composiciones inmunogénicas que contienen epi topos adicionales En otra modalidad, la presente invención proporciona otras composiciones las cuales utilizan dos o más secuencias de epitopo I reconocidas por primate combinadas con por lo menos una secuencia de epitopo II y, opcionalmente, con uno o más péptidos de epitopo III o IV. Estos epitopos de Tat de VIH-1, II, III y IV, como se reconocen por el sistema inmunitario de conejo, como se describe con detalle en la solicitud de patente internacional número WO 99/02185, incorporada en la presente como referencia. Descrita brevemente, la secuencia del epitopo II induce una respuesta inmunitaria humoral específica en un primate expuesto a la secuencia de epitopo II in vivo. El epitopo II, como se reconoce por primates, define péptidos de la fórmula R3-Lys-X2-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gl?-Arg-Lys-R4 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5], en donde X42 es Gly o - Ala. El epitopo mínimo reconocido por el sistema inmunitario de primate es aquel de los aminoácidos identificados específicamente de esa fórmula, es decir, -Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- (aminoácidos 41 a 50 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15) . Esta también es la secuencia del inmunógeno actualmente preferido para epitopo II. Este inmunógeno, en el cual X42 es Gly, induce reacción cruzada de anticuerpos con la secuencia en la cual X42 es Ala. Esto generaría una reacción/reacción cruzada con más de 95% de las proteínas Tat de VIH-1 conocidas. Esta secuencia de epitopo II no tiene variabilidad antigénica en un número grande de variantes de Tat de VIH-1 conocidas. La parte N terminal de R3 puede representar el hidrogeno en la parte de N terminal no modificada del aminoácido Lys o R3 puede ser un alquilo inferior o un alcanoilo inferior, tal como un grupo acetilo, sustituyente en el Lys. R3 también puede incluir una secuencia de entre 1 a aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituidos con un alquilo inferior o alcanoilo inferior. El C terminal en R4 puede representar el hidroxilo libre del aminoácido C terminal, o R4 puede ser una amida en ese aminoácido C terminal . R4 puede incluir aminoácidos no polares adicionales, tal como un separador. Se puede utilizar un separador ejemplar, gly-ser-gly-ser, lo que resulta en la secuencia Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 25], en donde X42 es Gly o Ala. Sin embargo, R4 no puede ser los aminoácidos básicos -Lys-Arg-Arg- los cuales se presentan de manera natural en la secuencia Tat después del último aminoácido en la fórmula del epitopo II. Esta secuencia de epitopo II que se encuentra en las variantes Tat de cubierta B 294 son reconocidas por primates (como se reporta en WO99/02185, el sistema inmunitario de conejo reconoce el epitopo desde el aminoácido 43 a 50 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 15) . El epitopo II es poco inmunogénico cuando se presenta dentro de otras secuencias. De esta manera, para inmunogenicidad óptima, esta secuencia se prepara como un péptido sintético fusionado a, o acoplado a una proteína portadora o como un péptido antigénico múltiple, acoplado opcionalmente a la proteína portadora. Alternativamente, el epitopo II se puede expresar como la secuencia C terminal de una proteína recombinante, la cual se fusiona opcionalmente en marco a una proteína portadora en su secuencia amino terminal. En una composición de esta invención, un péptido de epitopo II preferiblemente se presenta solo o en combinación con uno o más péptidos de epitopo I reconocidos por primates. Brevemente se describe, y como se identifica en WO99/02185, el epitopo III define péptidos de la fórmula: R5- Arg-Arg-Xss-Zsg-Aeo-Yei-Ser-Rd [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 6] , en donde X58 puede ser Ala, Pro, Ser o Gln; Y61 puede ser Asp, Asn, Gly o Ser; Z59 puede ser Pro o His; y A60 puede ser Gln o Pro. El epitopo IV define péptidos de la fórmula: R7-Ser-Gln-X64-His-Gln-Y67-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 7], en donde X64 . puede ser Asn o Thr; e Y67 puede ser Ala o Val. Por lo tanto, las composiciones de esta invención, es decir, el péptido/polipéptidos que contienen las secuencias de aminoácidos identificadas en lo anterior, cuando se proporcionan a un sujeto humano, son útiles en la interdicción inmunogénica de proteínas Tat extracelulares de la mayor parte de las cepas de VIH-1. Estas composiciones funcionan para reducir críticamente la multiplicación crónica de virus y permitir un control inmunitario eficaz del virus . Los inmunógenos para cada epitopo preferiblemente se diseñan para inducir anticuerpos reactivos con la proporción más alta de las variantes que se presentan de manera natural de cada epitopo. Para un epitopo tal como el epitopo I reconocido por primates, se pueden incorporar copias múltiples de un inmunógeno en un inmunógeno sintético o recombinante para mejorar la inmunogenicidad y producir títulos de anticuerpos más altos. Además, los inmunógenos para dos o más epitopos pueden combinarse para extender la cobertura, dado que las variaciones en la secuencia de cada epitopo se producen independientemente. De esta manera, como un ejemplo, una composición de esta invención contiene los dos péptidos para epitopo I reconocidos por primates requeridos, así como cuatro o cinco de los otros péptidos de epitopo I identificados específicamente en lo anterior con un Cys en la parte terminal, el cual se acopla a una proteína portadora. Alternativamente, se pueden preparar péptidos antigénicos múltiples, acoplados opcionalmente a la proteína portadora, y combinados para formar una composición de esta invención. Alternativamente, se pueden utilizar mezclas de dos o más inmunógenos . Los inmunógenos de epitopo I reconocidos por primate, de esta invención, con o sin cualquiera de los epitopos II, III o IV, u otros inmunógenos opcionales, se pueden preparar y se pueden utilizar en composiciones inmunogénicas y en diversas formas, por ejemplo, sintetizados químicamente o como péptidos recombinantes, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión o péptidos fusionados. 1. Péptido/proteínas recombinantes o sintéticas acopladas a un portador Como una modalidad, una composición de la presente invención puede ser un péptido sintético o producido de maneras recombinante, que contenga por lo menos dos de las secuencias de aminoácidos inmunogénicos de epitopo I reconocidas por primate (así como las otras secuencias de - epitopo I adicionales) y que también contengan una o más secuencias de aminoácidos inmunogénicas de los epitopos II/III/IV acopladas a una proteína portadora seleccionada. En esta modalidad de una composición de esta invención, las secuencias de aminoácidos de epitopo I reconocidas por primates descritas antes, múltiples con o sin secuencias flanqueantes, se pueden combinar secuencialmente en un polipéptido y se pueden acoplar al mismo portador. Alternativamente, los inmunógenos de epitopo I, II, III o IV se pueden acoplar individualmente como péptidos para la misma proteína o para diferentes proteínas portadoras, y el montaje de inmunógeno-portador resultante se puede mezclar junto para formar una sola composición. Tales secuencias se pueden elaborar sintéticamente por métodos convencionales de síntesis química o de manera recombinante por expresión en una célula huésped seleccionada, o también por medios no convencionales . Para esta modalidad, la proteína portadora de manera deseable es una proteína u otra molécula la cual puede mejorar la inmunogenicidad del inmunógeno seleccionado. Tal portador puede ser una molécula más grande la cual tenga un efecto adyuvante. Los portadores de proteína convencionales ejemplares incluyen, sin limitación, la proteína DnaK de E. coli , galactocinasa (galK, que cataliza la primera etapa del metabolismo de galactosa en bacterias) , ubiquitina, factor a coincidente, galactosidasa ß y la proteína NS-1 de influenza. Los toxoides (es decir, una secuencia que codifica por una toxina que se presenta de manera natural, con modificaciones suficientes para eliminar su actividad tóxica) tal como el toxoide de difteria y el toxoide de tétanos, también se pueden utilizar como portadores. De manera similar, se pueden utilizar diversas proteínas de choque térmico bacteriano, por ejemplo hsp-70 micobacteriano. Otro portador útil es glutation reductasa (GST, por sus siglas en inglés) . Una persona experta en la técnica puede seleccionar fácilmente un portador apropiado. En un plásmido recombinante proteínico portador de inmunógeno, deseable particularmente, los dos inmunógenos de epitopo I requeridos y tres a seis inmunógenos de epitopo I reconocidos por primates adicionales así como los péptidos/polipéptidos inmunogénicos opcionales se pueden unir covalentemente a una proteína 70 de choque térmico de E. coli micobacteriana (hsp 70) [K. Suzue et al , J. Immunol . , 156 : 873 (1996)]. En otra modalidad deseable, la composición se forma por enlace covalente de secuencias peptídicas o polipeptídicas que contengan inmunógeno al toxoide de difteria.

Péptido Antigénico Múltiple - En otra modalidad adicional, los inmunógenos de epitopo peptídicos o polipeptídicos y cualquier inmunógeno opcional seleccionado puede estar en forma de un montaje de péptido antigénico múltiple ("MAP", por sus siglas en inglés, también denominado como un péptido con núcleo de lisina octamérico) . Tales montajes se pueden diseñar utilizando un sistema MAP descrito por Tam, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85:5409-5413 (1988) . Este sistema utiliza una matriz de núcleo de residuos lisina sobre los cuales se sintetizan, como se ha descrito, copias múltiples del mismo epitopo I reconocido por primates de la invención [D. Posnett et al , J. Biol. Chem., 263 (4) .1719-1725 (1988); J. Tam, "Chemically Defined Synthetic Immunogens and Vaccines by the Múltiple Antigen Peptide Approach" , Vaccine Research and Developments, Vol. 1, ed. W. Koff and H. Six, pp. 51-87 (Marcel Deblau, Inc., New York 1992)]. Cada MAP contiene copias múltiples de solo un péptido. Por lo tanto, una composición que contiene los MAP contendrá por lo menos dos, y preferiblemente aproximadamente siete MAP. Un MAP tendrá el primer inmunógeno de epitopo I peptídico o polipeptídico requerido unido a cada núcleo lisina; un segundo MAP tendrá un segundo inmunógeno de epitopo I peptídico o polipeptídico requerido unido a cada núcleo lisina. Se pueden incluir otros MAP adicionales, cada uno con una secuencia de aminoácidos de epitopo I reconocidos - - por primates diferente, identificada en lo anterior. Los MAP diferentes múltiples se pueden utilizar para obtener cualquier combinación deseada de secuencias de epitopo I, II, III o IV. Preferiblemente, estos montajes de MAP se asocian con otras secuencias estimuladoras de linfocitos T, o como composiciones farmacéuticas administradas junto con agentes estimuladores de linfocitos T, tales como adyuvantes conocidos . 3. Separadores En cualquiera de las composiciones anteriores, por ejemplo como los montajes de péptido/polipéptido-portador o los MAP, cada inmunógeno peptídico/polipeptídico, o cada secuencia de aminoácidos en el inmunógeno opcionalmente puede estar separada por una secuencia opcional de aminoácidos denominada un "separador". Los separadores son secuencias de entre 1 y aproximadamente 4 aminoácidos que se interponen entre dos secuencias para permitir la unión entre las mismas sin afectar de manera adversa la estructura tridimensional del inmunógeno. Los separadores también pueden contener sitios de separación por endonucleasa de restricción para permitir la separación de las secuencias cuando se desee. Los separadores o enlazantes adecuados se conocen y se pueden diseñar fácilmente y se pueden seleccionar por una persona experta en la técnica. Los separadores preferidos son secuencias que contienen los aminoácidos Gly o Ser.

F. Composiciones de Ácido Nucleico de la Invención, que incluyen un Gen Producido de Manera Sintética o Recombinante Otras modalidades de esta invención incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican para las composiciones peptídicas/polipeptídicas de epitopo I reconocidas por primate, descritas en lo anterior, que incluyen a los inmunógenos peptídicos y polipeptídicos de las composiciones descritas antes, y que incluyen aquellos péptidos y polipéptidos fusionados a proteínas portadoras. Las secuencias de ácido nucleico también pueden incluir secuencias que codifican para las proteínas portadoras. De esta manera, una modalidad preferida de la invención es un "gen sintético" que codifica secuencialmente para por lo menos dos de los péptidos/polipéptidos inmunogénicos de epitopo I reconocidos por primate, requeridos. Nótese que el gen se denomina como "sintético" se puede diseñar por síntesis química o medios recombinantes, según se desee. El gen sintético preferiblemente codifica para siete o la totalidad de las ocho secuencias de aminoácidos de epitopo I reconocidas por primate - - identificadas específicamente [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 17 a 24]. El gen sintético también puede codificar para cualquier selección de un inmunógeno de epitopo II o III, con la condición de que el péptido de epitopo II o III se fusione a la parte C terminal de la secuencia de epitopo I reconocida por primates y no se modifica adicionalmente en su propia parte C terminal. El gen sintético puede codificar para copias múltiples de las dos secuencias de aminoácidos de epitopo I requeridas, o copias de inmunógenos diferentes múltiples adicionales o secuencias de aminoácidos, o copias múltiples de diferentes inmunógenos múltiples o secuencias de aminoácidos. El gen sintético puede codificar para las secuencias seleccionadas de aminoácidos, en un marco de lectura abierta con, o fusionado a una secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína portadora. Una característica adicional del gen sintético puede ser que codifique para un separador entre cada secuencia que codifica para un inmunógeno o entre la secuencia que codifica para un inmundgeno y la secuencia que codifica para la proteína portadora. El gen sintético de la presente invención también puede ser parte de una molécula sintética o recombinante. La molécula sintética puede ser un plásmido recombinante de ácido nucleico, tal como un vector o un plásmido que contenga el gen sintético que codifica para la proteína, péptido, polipéptido, proteína de fusión o péptido de fusión bajo el control operativo de secuencias de aminoácidos que codifican para elementos reguladores tales como promotores, señales de terminación y similares. Tales moléculas sintéticas se pueden utilizar para producir las composiciones de inmunógeno polipeptídico/peptídico, de manera recombinante. El gen sintético o la molécula sintética se pueden preparar mediante el uso de métodos de síntesis química o, preferiblemente, por técnicas recombinantes. Por ejemplo, el gen o molécula sintéticos pueden contener ciertos codones de preferencia para las especies de la célula huésped indicada. El gen o molécula sintéticos, preferiblemente en forma de ADN, se pueden utilizar de diversas maneras. Por ejemplo, se pueden utilizar estas secuencias sintéticas de ácido nucleico para expresar al péptido/polipéptido de la invención in vi tro, en un cultivo de células huéspedes. Los inmunógenos expresados, después de purificación adecuada, se pueden incorporar en un reactivo o vacuna farmacéutica. Alternativamente, el gen sintético o molécula sintética de esta invención se puede administrar directamente al mamífero, preferiblemente un humano, como lo que se denomina "ADN desnudo" para expresar la proteína/péptido inmunogénico in vivo, en un paciente. Véase, por ejemplo, Cohén, Science, 259:1691-1692 (19 de marzo de 1993); E. Fynan et al . , Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 90:11478-11482 (diciembre de 1993); y J. A. Wolff et al . , Biotechniques, 11:474-485 (1991), todas incorporadas por referencia en la presente . La molécula sintética, por ejemplo, un vector o plásmido, se puede utilizar para dirigir la inyección en un huésped mamífero. Esto resulta en la expresión de la proteína por células huéspedes y presentación subsecuente al sistema inmunitario para inducir formación de anticuerpos in vivo.

G. Microorganismos que Expresan el Gen Sintético En otro aspecto adicional de la presente invención, los genes o moléculas sintéticos de esta invención se pueden incorporar en un microorganismo no patogénico. El microorganismo resultante, cuando se administra a un huésped mamífero, se expresa y multiplica las composiciones expresadas de esta invención in vivo para inducir la formación específica de anticuerpos. Por ejemplo, los virus recombinantes no patogénicos o las bacterias comensales las cuales presentan las composiciones de genes sintéticos de esta invención y son útiles para administración a un paciente mamífero se pueden preparar por el uso de metodología convencional y se pueden seleccionar de entre microorganismos no patogénicos conocidos . Entre las bacterias comensales las cuales pueden ser útiles para el suministro exógeno de la molécula - - sintética al paciente o para presentar el gen sintético en el paciente in vivo se incluyen, sin limitación, diversas cepas de Streptococcus, por ejemplo S. gordonii o E. coli , Bacillus, Streptomyces y Saccharomyces. Los virus no patogénicos adecuados los cuales pueden ser sometidos a ingeniería genética para transportar el gen sintético dentro de células del huésped incluye poxvirus tales como vacuna, adenovirus, virus adeno asociado, virus canarypox, retrovirus y similares. Muchos de tales virus no patogénicos comúnmente se utilizan para terapia de genes en humanos y como portadores para otros agentes de vacuna, y se conocen y son seleccionables por aquellos expertos en la técnica.

H. Preparación o Manufactura de Composiciones de la Invención Las composiciones de la invención, así como los polipéptidos/péptidos individuales que contengan a los inmunógenos de epitopo I reconocidos por primates, de esta invención, y opcionalmente uno o más de epitopo II, III o IV, los genes sintéticos y moléculas sintéticas de la invención, se pueden preparar convencionalmente por medio de técnicas de síntesis química conocidas, tales como las que se describen por Merrifield, J. Amer. Chem. Soc . , 8_5 :2149-2154 (1963) .

- Alternativamente, las composiciones de esta invención se pueden preparar por técnicas de ADN recombinante conocidas por clonación y expresión dentro de un microorganismo huésped o una célula de un fragmento de ADN que presenta una secuencia que codifica para el péptido/polipéptido que contiene por lo menos dos de las secuencias de epitopo I reconocidas por primate requeridas con otros inmunógenos opcionales y con proteínas portadoras opcionales. Las secuencias codificantes para el epitopo I y los inmunógenos opcionales se pueden preparar sintéticamente [W. P. C. Stemmer et al . , Gene, 164:49 (1995)] o bien se pueden derivar de ARN viral por técnicas conocidas, o a partir de plásmidos que contengan el ADNc disponible. Se pueden utilizar combinaciones de estas técnicas. Por ejemplo, el ensamblado de inmunógenos secuenciales por técnicas de biología molecular convencional se pueden utilizar para la producción del gen sintético y se puede utilizar la mutagénesis dirigida al sitio para proporcionar las secuencias deseadas de inmunógenos . El producto del gen sintético de esta manera se produce recombinantemente. La totalidad de estas manipulaciones se pueden realizar por metodología convencional . Los sistemas para clonación y expresión de las composiciones peptídica/polipeptídica de esta invención utilizando los genes o moléculas sintéticas incluyen el uso - - de varios microorganismos y células las cuales son bien conocidas en tecnología recombinante. Estas incluyen, por ejemplo, varias cepas de E. coli, . Bacillus, Streptomyces y Saccharomyces, así como células de mamífero, levadura e insecto. Los vectores adecuados para estos son conocidos y están disponibles a partir de laboratorios privados y públicos y de depositarios así como de vendedores comerciales. Actualmente, los huéspedes más preferidos son células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) o las células COS-1. Estos huéspedes se pueden utilizar en conexión con vectores de poxvirus, tales como vacuna o vacuna porcina. La selección de otras células huéspedes adecuadas así como métodos para transformación, cultivo, amplificación, cribado y producción y purificación de producto se pueden llevar a cabo por una persona habitualmente experta en la técnica con referencia a las técnicas conocidas. Véase, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature, 293 : 620-625 (1981), entre otros. Otro sistema preferido incluye los sistemas y vectores de expresión de baculovirus. Cuando se produce por un medio recombinante convencional, las composiciones de esta invención, es decir, el polipéptido/péptidos que contienen las copias indicadas de los inmunógenos de epitopo I reconocidos por primate y los inmunógenos opcionales se pueden aislar ya sea de los - - componentes celulares por técnicas de lisis convencionales o bien del medio celular por métodos convencionales, tales como cromatografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al . Molecular Cloning. A Laboratory Manual . , 2* Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) . Los vectores adecuados, plásmidos y virales, utilizados ya sea para la producción de los componentes peptídicos/polipeptídicos como vacunas de ADN son bien conocidos por los expertos en la técnica y no son una limitación de la presente invención. Véase Sambrook et al . , mencionado antes y las referencias anteriores para la producción de la proteína. Véase también la solicitud de patente internacional PCT WO 94/01139, publicada el 20 de enero de 1994. Brevemente, el ADN que codifica para el péptido/polipéptido seleccionado se inserta dentro de un vector o plásmido el cual contiene otras secuencias flanqueantes opcionales, un promotor, una secuencia líder de ARNm, un sitio de inicio y otras secuencias reguladoras capaces de dirigir la multiplicación y expresión de esa secuencia in vivo o in vi tro . Estos vectores permiten la infección de las células del paciente y la expresión de la secuencia del gen sintético in vivo, o la expresión del mismo como una proteína/péptido o bien como una proteína/péptido de fusión in vi tro. La composición resultante se puede formular en una composición de epitopo I reconocido por primate con cualquier cantidad de inmunógenos opcionales y se puede cribar para determinar su eficacia mediante ensayos in vivo. Tales ensayos utilizan la inmunización de un animal, por ejemplo un simio, con la composición, y la evaluación de títulos de anticuerpo con las proteínas Tat de VIH-1 o con péptidos de vectores sintéticos que corresponden a secuencias Tat variantes (como se muestra en los ejemplos que siguen) .

J. Composiciones de anticuerpo de la invención Una composición de anticuerpo o composición que une ligando, de esta invención, abarca por lo menos un anticuerpo el cual se une específicamente a un epitopo I de la fórmula -Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9] , en donde Y7 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Ser y Asn; en donde X9 se selecciona del grupo que consiste de Glu y Asp; y en donde Z12 se selecciona del grupo que consiste de Lys y Asn. Preferiblemente, tal composición de anticuerpo incluye dos o más anticuerpos o ligandos diferentes, los cuales se unen específicamente a por lo menos dos de las secuencias de epitopo I requeridas, como se define en la presente. Los anticuerpos (u otros lígandos de unión) se generan para las dos secuencias requeridas Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro--Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17]; y Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE - IDENTIFICACIÓN NO: 18] del epitopo I. Los anticuerpos de la composición de esta manera se unen a una proteína Tat de VIH presente en variantes múltiples de proteínas Tat de VIH-1. Los anticuerpos o ligandos adicionales se generan a otras secuencias que se encuentran dentro de la fórmula epitopo I anterior. En una modalidad, un anticuerpo aislado dirigido el cual une al péptido o polipéptido de epitopo I de la invención, como se describe en lo anterior, también es un aspecto de esta invención. Tales composiciones de anticuerpo policlonal típicamente se producen al inmunizar a un mamífero, preferiblemente un primate, con una composición peptídica/polipeptídica que contenga los dos inmunógenos requeridos de epitopo I, así como una clasificación de otros inmunógenos de epitopo I reconocidos por primate e inmunógenos opcionales, como se describe en lo anterior. Particularmente deseables como inmunógenos son el inmunógeno de epitopo I reconocido por primate heptavalente (es decir, sin la variante rara) o un inmunógeno octavalente, tal como el gen sintético o la proteína de fusión descrita en el ejemplo 3 abajo, o bien un inmunógeno para epitopo II univalente (es decir, un péptido de epitopo II único, unido opcionalmente a un portador) . Además de ser generados en primates, tales anticuerpos también pueden producirse en animales transgénicos, que incluyen a los denominados ratones - transgénicos "humanizados". Sin embargo, un huésped deseable para generar anticuerpos policlonales para una composición de esta invención incluye a los humanos. El título de tales anticuerpos policlonales generados en el mamífero expuesto a las composiciones del epitopo I se pueden vigilar por técnicas estándar, por ejemplo con un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima. Si se desea, se pueden aislar moléculas de anticuerpo del mamífero, por ejemplo, de la sangre completa, plasma o suero y se pueden purificar adicionalmente del plasma o suero del mamífero inmunizado, por técnicas convencionales . Las técnicas convencionales de recolección pueden incluir plasmaféresis, cromatografía en proteína A, entre otras. Tales composiciones de anticuerpos policlonales en sí mismas pueden ser utilizadas como composiciones farmacéuticas de esta invención. Alternativamente, se pueden obtener de los mamíferos células productoras de anticuerpos y se pueden utilizar para preparar otras formas de anticuerpos y ligandos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, ligandos producidos por cribado de exhibición de fago, fragmento de anticuerpos y mezclas de los mismos, así como anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos completamente humanos. Las técnicas de preparación para la - - generación de estos tipos de ligandos son conocidas y los ligandos mismos se pueden generar utilizando las secuencias descritas de aminoácidos del epitopo I reconocido por primate así como inmunógenos opcionales. Véase, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature, 256 :495-497;Kozbor et al, (1983) Immunol . Today, 4:72; Colé et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96;Harlow et al . , Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988); Queen et al . , Proc . Nat ' 1 Acad. Sci. E.U.A., 86:10029-10032 (1989); Hodgson et al . , Bio/Technology, 9 : 421 (1991); solicitud internacional PCT/GB91/01554, publicación No. WO92/04381 y solicitud PCT internacional PCT/GB93/00725, publicación No. WO93/20210] . Por ejemplo, en otra modalidad, un anticuerpo monoclonal se une específicamente a la secuencia mínima de epitopo I definida por -Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 9] de una proteína Tat de VIH que comprende cualquier inmunógeno más grande definido por la fórmula de epitopo I, con los aminoácidos variables y los grupos R como se definen en lo anterior. Como una modalidad, un anticuerpo monoclonal se une específicamente a la secuencia de aminoácidos -Asp-Pro-Asn-Leu-X9-Pro-Trp-Asn- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 26], en donde X9 es Glu o Asp. Otros anticuerpos monoclonales adicionales, los cuales se unen específicamente a las secuencias mínimas de epitopo I definidas por la fórmula anterior, son parte de esta invención. En otra modalidad de esta invención, un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una secuencia mínima de epitopo II que comprende la secuencia de aminoácidos -Lys-X42-Leu-Gly-Ile-SerTyr-Gly-Arg-Lys- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 10], en donde X42 es Gly o Ala, como un epitopo distinto del epitopo de -Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 11], reconocida por los anticuerpos descritos previamente. Preferiblemente, una composición de anticuerpo comprende un anticuerpo el cual genera reacción cruzada tanto con el péptido en el cual X42 es Gly, como con el péptido en el cual X2 es Ala. Estos anticuerpos preferiblemente son generados en primates . Otros anticuerpos monoclonales adicionales los cuales se unen específicamente a las secuencias mínimas de epitopo II definidas por la fórmula anterior, son parte de esta invención. Se pueden desarrollar otros anticuerpos contra Tat al cribar una biblioteca de inmunoglobulina combinatorial recombinante (por ejemplo exhibición de fagos de anticuerpo) con epitopo de Tat de VIH-1 reconocidos por primate de esta invención para aislar el evento de biblioteca de inmunoglobulina que se unan a Tat de VIH-1 [W. D. Huse et al . , Science, 246:1275-1281 (1988)]. Los equipos para generar y cribar bibliotecas de exhibición de fago están disponibles comercialmente, por ejemplo Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo No. 27-9400-01; Stratagene Phage Display kits, etc. Véanse, por ejemplo, las patentes de E.U.A. No. 5,223,409, publicación internacional No. WO92/09690, WO90/02809, etc. Similarmente, se pueden desarrollar anticuerpos quiméricos utilizando técnicas conocidas [Morrison et al , (1984) Proc. Nati . Acad. Sci . E. U.A. , £1:6851; Takeda et al , Nature, 313 :452 (1984), entre otros] . Los anticuerpos quiméricos son moléculas en las cuales se derivan porciones diferentes de diferentes especies animales. Los anticuerpos de cadena única también se pueden prepara por métodos convencionales [véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,946,778 y 4,704,692] utilizando las porciones variables de los anticuerpos policlonales o monoclonales producidas de acuerdo con esta invención. Los fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, F(ab')2 y Fv y las bibliotecas de los mismos también se pueden utilizar en diversos aspectos de esta invención. Estas composiciones de anticuerpo/ligando de manera deseable se unen a la mayor parte de las variantes de proteína Tat de VIH-1 conocidas (es decir, más de 95%, y preferiblemente más de 99% de las variantes de proteína Tat conocidas) , y evitan que las proteínas Tat soporten multiplicación adicional de VIH-1. Tales composiciones pueden - incluir una mezcla de anticuerpos diferentes múltiples, los cuales unen las secuencias de epitopo de proteína Tat de VIH-1 a partir de cepas múltiples de VIH-1. Por lo tanto, estos anticuerpos son útiles en métodos farmacéuticos y formulaciones que se describen en lo siguiente .

J". Composiciones farmacéuticas de la invención Como otro aspecto de esta invención, una composición farmacéutica útil para inducir anticuerpos que reaccionan con la mayor parte (por ejemplo, más de 95%, preferiblemente más de 99%) de las proteínas Tat de VIH-1 conocidas y que dañen la multiplicación de VIH-1 pueden comprender como sus agentes activos, por lo menos dos péptidos o polipéptidos de esta invención, de epitopo I reconocidos por primate, requeridos y preferiblemente los péptidos adicionales de epitopo I . Varias composiciones deseables incluyen los siguientes componentes, descritos antes : (a) un inmunógeno peptídico/polipeptídico el cual contiene por lo menos las dos secuencias requeridas y de manera más preferible por lo menos siete de las secuencias de aminoácidos para epitopo I reconocidos por primate [SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NOS: 17 a 24]; (b) un inmunógeno peptídico/polipeptídico del - inciso (a) el cual contiene además cualquiera de las secuencias de aminoácidos de epitopo II, III ó IV, preferiblemente un inmunógeno equivalente de epitopo II; (c) un gen sintético o producido recombinantemente que codifica para las dos secuencias requeridas de epitopo I reconocida en primates y preferiblemente 7 de las secuencias de epitopo I [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17-24] y secuencias opcionales, como se describe en lo anterior; (f) una molécula sintética que contiene el gen sintético de (c) ; (g) un virus recombinante que presenta el gen sintético o la molécula descrita antes, y (h) una bacteria comensal que presenta el gen sintético o molécula descrita antes. El o los componentes activos seleccionados están presentes en un portador farmacéuticamente aceptable, y la composición puede contener ingredientes adicionales . Las formulaciones farmacéuticas que contienen las composiciones de esta invención pueden contener otros agentes activos, tales como agentes estimuladores de linfocitos T para las MAP, adyuvantes y citocinas inmunoestimuladoras, tales como IL-12 y otras citocinas bien conocidas, para las composiciones proteínicas/peptídicas. La totalidad de estas composiciones farmacéuticas pueden funcionar para disminuir las concentraciones virales de un mamífero.

Como composiciones farmacéuticas, las composiciones comprenden al péptido de epitopo I reconocido por primates o secuencias de ácido nucleico y las secuencias opcionales de inmunógeno se mezclan con un vehículo farmacéuticamente aceptable, adecuado para administración a mamíferos para profilaxis o tratamiento de infecciones virales . Las proteínas/péptidos se pueden combinar en una preparación farmacéutica única para administración. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para uso en una composición proteinácea inmunogénica de la invención son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica. Tales portadores incluyen, por ejemplo, solución salina, solución salina amortiguada, un adyuvante seleccionado tal como suspensiones acuosas de hidróxidos de aluminio y magnesio, liposomas, emulsiones de aceite en agua y otros. Los adyuvantes adecuados también se pueden utilizar en composiciones que contienen proteínas de esta invención. Los vehículos adecuados para ADN directo, ácidos nucleicos plasmídicos o administración de vector recombinante incluyen, sin limitación, solución salina o sacarosa, protamina, polibreno, polilisina, policationes, proteínas, CaP04 o espermidina. Véase, por ejemplo, la publicación PCT WO94/01139 y las referencias mencionadas antes. Las composiciones peptídicas/polipeptídicas y los genes o moléculas sintéticas in vivo son capaces de inducir en un - - mamífero huésped inmunizado, por ejemplo un humano, una respuesta inmunitaria capaz de interdirigir variantes múltiples de proteínas Tat extracelular conocidas (por ejemplo más de aproximadamente 95 a aproximadamente 99%) de VIH-1 y de esta manera disminuir los niveles virales. Otra composición farmacéutica adicional útil para deteriorar la multiplicación de VIH-1 comprende una composición de anticuerpo que contiene uno o más anticuerpos descritos con detalle en lo anterior. En una composición farmacéutica, los anticuerpos pueden ser transportados en una solución salina u otro portador adecuado. Las composiciones de anticuerpos son capaces de proporcionar una interdicción inmediata proporcionada exogénamente de Tat . La presente invención no se limita por la selección de los portadores, adyuvantes u otros ingredientes útiles en preparaciones farmacéuticas de los tipos descritos antes fisiológicamente aceptables convencionales . La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables a partir de los componentes descritos en lo anterior, que tienen isotonicidad de pH apropiada, estabilidad y otras características convencionales, está dentro de las habilidades de la técnica.

K. Método de la invención Deterioro de la multiplicación de VIH-1 - - De acuerdo con la presente invención, un método para reducir las concentraciones virales de VIH-1 involucra exponer a un humano a las composiciones farmacéuticas inductoras de anticuerpo Tat descritas antes, inducir activamente anticuerpos que reaccionen con proteínas Tat de VIH múltiples (por ejemplo, más de 95%, preferiblemente más de 99% de las conocidas) , y deteriorar la multiplicación del virus in vivo. Este método es apropiado para un sujeto infectado con VIH-1 con un sistema inmunitario competente, o para la inmunización activa de un sujeto no infectado. El método induce anticuerpos los cuales reaccionan con proteínas Tat de VIH-1, reducen la multiplicación viral durante una infección aguda inicial con VIH-1 y minimizan viremia crónica que lleve SIDA. Este método también disminuye la multiplicación viral crónica en sujetos infectados y nuevamente minimiza el avance a SIDA. El uso de estos métodos puede controlar la infección crónica por VIH-1, proporcionar un mecanismo novedoso de tratamiento no sujeto al desarrollo de resistencia. Los anticuerpos para Tat inhiben la replicación de cuasiespecies de VIH-1 independientemente de la Tat que produzcan, dado que la proteína Tat extracelular no se asocia con la porción replicante del virus. Por lo tanto, no hay un mecanismo obvio mediante el cual los anticuerpos para Tat puedan generar presión selectiva para variantes de Tat de escape, no reactivas. De acuerdo con este método, las composiciones farmacéuticas preferiblemente contienen las composiciones peptídicas/polipeptídicas, los genes o moléculas sintéticas, el virus recombinante o la bacteria recombinante comensal . Preferiblemente, las composiciones contienen un gen sintético heptavalente o proteína de fusión (sin la variante rara de epitopo I) o un gen sintético octavalente o proteína de fusión del ejemplo 3 y opcionalmente un péptido de epitopo II univalente. Cada uno de estos componentes activos de la composición farmacéutica inducen activamente en el humano expuesto la formación de anticuerpos contra Tat que bloquean la transferencia de Tat desde células infectadas a otras células infectadas o no infectadas. Esta acción reduce la multiplicidad de infección y bloquea la descarga de expansión viral de VIH-1 y por lo tanto disminuye las concentraciones virales. En pacientes ya infectados, este método de reducción de niveles virales puede reducir la viremia crónica y el avance a SIDA. En humanos no infectados, esta administración de las composiciones de la invención puede reducir la infección aguda y por lo tanto minimizar la viremia crónica lo que lleva al progreso a SIDA. Otro aspecto adicional de la invención es un método para reducir las concentraciones virales de VIH-1 al administrar a un humano incapaz de montar una respuesta inmunitaria eficaz o rápida ante la infección con VIH-1, una composición farmacéutica que contiene las composiciones de anticuerpo descritas antes . El método puede involucrar administrar crónicamente la composición. Entre tales pacientes adecuados para tratamiento con este método están pacientes infectados con VIH-1 quienes están inmunocom rometidos por enfermedades y no son capaces de montar una respuesta inmunitaria fuerte . En las últimas etapas de infección por VIH, es menor la probabilidad de generar títulos eficaces de anticuerpos, debido al daño inmunitario relacionado con la enfermedad. Además, entre tales pacientes están mujeres embarazadas infectadas con VIH-1, neonatos de madres infectadas y pacientes no inmunizados con exposición putativa (por ejemplo, un humano quien inadvertidamente se ha "picado" con una aguja utilizada por un humano infectado con VIH-1) . Para tales pacientes, el método de la invención preferiblemente se utiliza como una composición farmacéutica de composición de anticuerpo de la invención. La composición de anticuerpo incluye una composición de anticuerpo policlonal preparada en otros mamíferos, preferiblemente no humanos, o alternativamente, las otras formas de anticuerpo descritas antes, por ejemplo monoclonales, etc. Estas composiciones de anticuerpo se administran como inmunoterapia pasiva para inhibir la multiplicación viral y disminuir la carga viral . Los anticuerpos de exógenos que reaccionan con proteínas Tat conocidas múltiples a partir de VIH-1 proporcionan en el paciente una interdicción inmediata de la transferencia de Tat a partir de células infectadas viralmente a otras células infectadas o no infectadas . De acuerdo con este método, el paciente puede ser tratado crónicamente con la composición de anticuerpo por un régimen de tratamiento prolongado. En cada uno de los métodos descritos en lo anterior, las composiciones de la presente invención se administran por una vía apropiada, por ejemplo, por vía subcutánea, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, nasal o por inhalación. La vía de administración preferida actualmente es intramuscular para las composiciones inmunizantes (inducción activa) e intravenosa (i.v.), subcutáneas (s.c.), o intramuscular (i.m.) para las composiciones de anticuerpo (terapia pasiva).

Un vector viral recombinante o ADN desnudo se administran, preferiblemente, por vía intramuscular; sin embargo se pueden suministrar por vía oral otros vectores virales recombinantes diferentes o bien por bacterias comensales vivas. La cantidad de la proteína, secuencias peptídicas o de ácido nucleico de la invención presentes en cada dosis de vacuna se seleccionan respecto a la consideración de la edad del paciente, peso, sexo, condición física general y similares. La cantidad de componente activo necesario para inducir una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta protectora, o para producir un efecto exógeno en el paciente, sin efectos colaterales adversos importantes, varía en base en la composición farmacéutica utilizada y la presencia opcional de un adyuvante (para las composiciones que contienen proteína) . Generalmente, para las composiciones que contienen proteína/péptido, proteína de fusión, MAP o proteína acoplada, o composición de anticuerpo, cada dosis estará constituida entre aproximadamente 50 µg y aproximadamente 20 mg del péptido/polipéptido inmunógenos por ml de una solución estéril. Una dosificación más preferida puede ser de aproximadamente 500 µg de inmunógeno. También se contemplan otros intervalos de dosificación por aquéllos expertos en la técnica. Las dosis iniciales opcionalmente pueden ser seguidas por refuerzos repetidos, cuando sea deseable. Las composiciones de anticuerpo de la presente invención se pueden utilizar en tratamientos crónicos para sujetos en riesgo de infección aguda, debido a piquetes de aguja o infección materna. Una frecuencia de dosificación para tales infecciones "agudas" pueden variar desde dosificaciones diarias a una vez o dos veces a la semana por vía i.v., s.c. o i.m., para una duración de aproximadamente 6 semanas. Las composiciones de anticuerpo de la presente invención también se pueden utilizar en tratamientos crónicos para pacientes infectados, o pacientes con infección avanzada por VIH. En pacientes infectados, la frecuencia de administración crónica puede variar desde dosificaciones diarias a una vez o dos por mes, por vía i.v., s.c., o i.m., y pueden depender de la vida media del inmunógeno (por ejemplo de aproximadamente 7-21 días) . Sin embargo, la duración del tratamiento crónico para tales pacientes infectados se anticipa que sea indefinida, pero por períodos prolongados . Alternativamente, las composiciones de esta invención se pueden diseñar para administración directa de genes o moléculas sintéticos de esta invención como "ADN desnudo" . Al igual que con las composiciones inmunogénicas proteínicas, las cantidades de componentes en el ADN y las composiciones de vector así como el modo de administración, por ejemplo inyección o por vía intranasal, se pueden seleccionar y ajustar por una persona habitualmente experta en la técnica. Generalmente, cada dosis comprenderá entre aproximadamente 50 µg y aproximadamente 1 mg de ADN que codifica para inmunógeno, por ml de una solución estéril. Para virus recombinantes que contienen los genes o moléculas sintéticos, las dosis pueden variar desde - aproximadamente 20 a aproximadamente 50 ml de solución salina que contiene concentraciones desde aproximadamente 1 x 107 hasta 1 x 1010 ufp/ml de virus recombinante de la presente invención. Una dosificación preferida en humanos es de aproximadamente 20 ml de solución salina en las concentraciones anteriores. Sin embargo, se entiende que una persona habitualmente experta en la técnica puede alterar tales dosificaciones, en base en la identidad del virus recombinante y la constitución del inmunógeno que se suministra al huésped. Las cantidades de bacterias comensales que presentan el gen o molécula sintéticos que se van a suministrar al paciente generalmente varían entre aproximadamente 103 a aproximadamente 1012 células/kg. Estas dosificaciones se pueden alterar por una persona experta en la técnica en base en las bacterias que es utilizada y la composición particular que contiene epitopo I e inmunógenos opcionales que se suministran por la bacteria viva. Por lo tanto, las composiciones de esta invención están diseñadas para retardar o minimizar la infección por el virus seleccionado de un mamífero no infectado, por ejemplo humano. Tales composiciones por lo tanto tienen utilidad como vacunas. Los anticuerpos de proteína contra Tat no son reactivos con proteínas de VIH-1 en ensayos diagnósticos para detectar seroconversión después de infección. Por lo tanto, los sujetos tratados con las composiciones de esta invención no pueden ser estigmatizados con pruebas de resultados positivos falsos para infección por VIH-1, y permanecerá posible detectar la seroconversión si los sujetos tratados se infectan con VIH-1. Al proporcionar un mamífero con las composiciones de esta invención, ya sea como una composición que contenga proteína/péptido o bien por administración de una secuencia novedosa de ácido nucleico que codifica para el inmunógeno, proporciona una estrategia radicalmente diferente para vacunación por SIDA, debido a que permite la disminución de concentraciones virales por interdicción biológica de, manera deseable, más de aproximadamente 95%, y preferiblemente más de aproximadamente 99% de variantes de proteína Tat conocidas de VIH-1, lo que disminuye la multiplicación de VIH-1. El uso de las composiciones que contienen inmunógeno Tat ha sido una ventaja particularmente deseable, en contraste con otros tratamientos y métodos profilácticos utilizados contra tales virus. Debido a que la interdicción de la proteína Tat extracelularmente inhibe la multiplicación de todas las cuasi especies de VIH o cepas de manera indiscriminada, no genera una presión selectiva en el virus original mismo para selección de las variantes de virus mutante. Por lo tanto, el bloqueo de la captación de la proteína Tat por las células del paciente no solo reduce la viremia, también lo hace de manera que impide la selección de "variantes de escape". Adicionalmente, la invención comprende un método para tratar activamente sujetos asintomáticos infectados con VIH-1, con viremia, dado que durante el desarrollo de la enfermedad, es probable que la proteína Tat extracelular contribuya a la infección persistente y anormalidades inmunitarias que están presentes en esta etapa de infección por VIH-1. La interdicción de proteína Tat extracelular por anticuerpos inducidos por inmunización de acuerdo con esta invención pueden reducir la viremia con un control inmunitario más eficaz y pueden resultar en retraso o en evitar el progreso a SIDA. El mecanismo de la presente invención, como se describe en lo anterior, es útil para impedir el desarrollo de infección viral y producir resultados clínicos deseables. Más específicamente, las composiciones de esta invención son capaces de reducir la viremia en pacientes ya infectados con el virus al bloquear la captación adicional de la proteína Tat por células no infectadas. Las composiciones de la presente invención, utilizadas solas o junto con otros regímenes terapéuticos para pacientes infectados con VIH, se espera que ayuden en la reducción de viremia y que eviten el deterioro clínico. Para tales usos terapéuticos, las formulaciones y modos de administración son sustancialmente idénticos a los descritos específicamente en lo anterior y se pueden administrar de manera concurrente o simultánea con otras sustancias terapéuticas convencionales para la infección viral específica. Para uso terapéutico o profiláctico, pueden ser deseables dosificaciones repetidas de las composiciones inmunizantes, tales como un refuerzo anual o bien un refuerzo en otros períodos .

L. Equipos de diagnóstico de esta invención Los péptidos y polipéptidos descritos en lo anterior también se pueden utilizar como reactivos de un equipo útil para la medición y detección de títulos y especificidades de anticuerpos inducidos por vacunación con las composiciones descritas antes. El equipo de la invención puede incluir por lo menos los dos péptidos de epitopo I requeridos, identificados antes y preferiblemente dos o más de los inmunógenos de epitopo I reconocidos por primates e inmunógenos opcionales. En una modalidad, cada péptido tiene en su parte N terminal la proteína biotina y un separador, por ejemplo -Ser-Gly-Ser-Gly- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 27] . Alternativamente, el péptido puede tener en su parte C terminal un separador, por ejemplo -Gly-Ser-Gly-Ser-[SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 39] , y la proteína - biocitina. Estas modalidades permiten que los péptidos se unan a un soporte sólido recubierto con avidina, por ejemplo una placa o esferas. También se pueden utilizar para los mismos propósitos otros agentes de unión conocidos por los expertos en la técnica de los ensayos de diagnóstico. En el kit también se proporcionan reactivos etiquetados que detectan la unión de anticuerpo a los péptidos de epitopo inmovilizados, tales como anticuerpos de chivo contra inmunoglobulina humana, o similares. La etiqueta en el reactivo se puede seleccionar de muchas etiquetas de diagnóstico conocidas, tales como compuestos radioactivos, compuestos fluorescentes y proteínas, enzimas colorimétricas, etc. De esta manera, el equipo también contiene reactivos y aparatos diversos para la lectura de las etiquetas, por ejemplo ciertos sustratos que interactúan con una etiqueta enzimática para producir una señal de color, etc., aparatos para tomar muestras de sangre, así como frascos apropiados y otros componentes de ensayo de diagnóstico. Una persona con habilidad en la técnica también podrá seleccionar con facilidad otros componentes de diagnóstico convencionales para este equipo. Tales equipos y reactivos se pueden utilizar en un método para detectar los títulos y patrones de reactividad de anticuerpos en sujetos vacunados con las composiciones de esta invención. Un método para determinar la presencia o el título de anticuerpos inducidos por inmunización a un inmunógeno Tat incluye las etapas de poner en contacto una muestra biológica de un sujeto inmunizado, por ejemplo, un fluido corporal, preferiblemente sangre, suero o plasma, pero también posiblemente orina, saliva u otros fluidos o tejido, con una o más de las secuencias de unión de inmunógenos de epitopo I reconocidos por primate e inmunógenos opcionales, preferiblemente inmovilizados en un soporte sólido, tal como una placa o esferas. El epitopo I reconocido por primates y las secuencias de unión opcionales utilizadas en este método pueden ser regiones de unión de epitopo mínimas no modificadas . Una vez que la muestra biológica se expone a los péptidos inmovilizados durante un tiempo suficiente, se lava el soporte para eliminar cualquier material de la muestra biológica que no se haya unido a los péptidos. Tales etapas de lavado son convencionales en los ensayos de diagnóstico y se realizan con solución salina. Si los anticuerpos para epitopos I e inmunógenos opcionales o una combinación de los mismos se inducen en el sujeto por el tratamiento descrito antes, los péptidos inmovilizados se han unido con anticuerpo a partir de la muestra biológica. Posteriormente, se agrega un reactivo marcado al material en el soporte para detectar la unión entre los péptidos en el soporte sólido y el anticuerpo en la muestra biológica. Preferiblemente, tal reactivo es un anticuerpo contra inmunoglobulina humana, tal como anticuerpo de chivo contra inmunoglobulina humana. La etiqueta se selecciona de entre una amplia variedad de etiquetas de diagnóstico utilizadas convencionalmente, como se discute en lo anterior. En una modalidad, la etiqueta puede ser una enzima colorimétrica, la cual, ante el contacto con un sustrato produce una señal de color detectable . La presencia o intensidad del color proporciona evidencia de la inducción del anticuerpo en el sujeto tratado. Se puede utilizar este ensayo para determinar la eficacia de inmunización, e igualmente para vigilar el estado inmunitario de un paciente . La selección de etapas de ensayo particulares, así como una diversidad de sistemas de etiqueta detectable, están dentro de las habilidades de una persona experta en la técnica. Tal selección es habitual y no limita la presente invención.

M. Ventajas de la invención Una de las ventajas de las composiciones de la invención es el número pequeño de inmunógenos necesarios para inclusión dentro de una composición de esta invención que dan reacción cruzada con más de 95% a más de 99% de las variantes de proteína Tat conocidas de VIH-1 del subtipo B común. Como se ilustra en los ejemplos que siguen, la composición ínmunogénica de epitopo I reconocida por primates que contiene las dos secuencias de aminoácido de epitopo I reconocidos por primate requeridas así como las seis secuencias de epitopo I adicionales que dan reacción cruzada con 95% de las proteínas Tat de VIH-1 del subtipo B común, así como con la totalidad de las 56 secuencias de proteína Tat de los subtipos no B menos frecuente de VIH-1. Por lo tanto, se puede emplear de manera útil una sola composición en proteger contra o tratar una infección, causada por la gran mayoría de cepas de VIH-1 que se puedan encontrar. Además, al identificar los epitopos precisos de Tat contra los cuales se desea unión (es decir, aminoácidos 5 a 12 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15), se pueden identificar fácilmente los nuevos inmunógenos para el péptido Tat deseables a partir de cepas nuevas de VIH-1 que se presenten o bien de cepas recién descubiertas utilizando los métodos que se describen aquí y que se incluyen en las composiciones. Esta flexibilidad permite que las composiciones de esta invención sean profilácticamente útiles contra cualquier cepa o cepas nuevas de VIH-1 que se identifiquen en el futuro. En vista de las enseñanzas en la presente, alguna persona experta en la técnica se espera que sea capaz, fácilmente, de incorporar combinaciones nuevas de inmunógenos Tat (y los plásmidos recombinantes de ácido - nucleico que los codifican) en las composiciones. Por ejemplo, el uso de técnicas convencionales tales com PCR y arreglos oligonucleotídicos de alta densidad [M. J. Kozal et al . , Nature Med. , 2^:753 (1996)] permite a una persona experta en la técnica obtener las secuencias de aminoácidos de un arreglo grande de proteínas Tat de VIH-1 que representan variantes de aislados clínicos de las cepas y subtipos de VIH-1. Utilizando tales técnicas se permite la determinación de otras variantes del subtipo B de VIH-1 así como de otros subtipos en países en vías de desarrollo, los cuales aún no han sido sometidos a un estudio intenso. La determinación de secuencias nuevas Tat permitirá una inclusión fácil de los péptidos correspondientes como inmunógenos en las composiciones de esta invención, lo que permite la inducción de una respuesta de anticuerpos contra otras proteínas Tat raras de VIH-1. Se pueden utilizar los estudios de reactividad cruzada con anticuerpos generados para péptidos sintéticos que correspondan a cada variante de Tat para eliminar la necesidad de inmunizar con variantes Tat en las cuales los cambios en las secuencias son imunológicamente imperceptibles y estos péptidos se unen fuertemente por anticuerpos a la secuencia de consenso u otras variantes . Los siguientes ejemplos ilustran métodos preferidos para preparar las composiciones de la invención y utilizar - - estas composiciones para inducir anticuerpos y contra proteínas Tat del virus en un huésped inmunizado. Estos ejemplos son solo ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

EJEMPLO ESTUDIOS INMUNOLOGICOS EN SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE PROTEINA TAT MÍNIMAS NECESARIAS PARA UNION A ANTICUERPO PARA EPITOPO I RECONOCIDO POR PRIMATE EN LA PROTEÍNA TAT DE VIH-1, VARIACIONES EN LA SECUENCIA Y REACTIVIDAD CRUZADA INMUNOLÓGICA DE ANTISUEROS CONTRA ESTAS SECUENCIAS A. Péptido sintético y conjugados Los péptidos sintéticos sintetizan por síntesis en fase sólida sobre soportes de polietileno derivatizados [R. M. Valerio et al . , Int. J. Peptide Res., 44: 158-165 (1994)]. Los péptidos inmunizados se sintetizan con un grupo Cys amino terminal que se incorpora para facilitar el acoplamiento a una proteína portadora y una parte C terminal amidada. Se sintetizan péptidos detectores con una secuencia amino terminal de biotina Ser-Gly-Ser-Gly- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 27] y una función de ácido libre en la parte C terminal para uso en ensayos de ELISA para detección de reactividad y reactividad cruzada. Los péptidos - inmunizantes, conjugados covalentemente a proteína portadora de toxoide de difteria (DT, por sus siglas en inglés) vía una cadena lateral cisteinilo, con una relación de péptido a portador de 5 a 8 [A. C. J. Lee et al . , Molec . Immunol . , 3/7:749 (1980)], se purifica por cromatografía líquida de alta presión (CLAR) hasta más de 95% de pureza mediante CLAR analítica y espectrometría de masas, con péptidos detectores utilizados con más de 50% de pureza.

Inmunizaciones Los conjugados peptídicos se captan en agua purificada y se emulsifican 1:1 con adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) o adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) [ANTIBODIES - A LABORATORY MANUAL, Eds . E. Harlow y P. Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1998)] . El volumen total por primates de 1 ml y este contiene 100 µg de péptido acoplado a DT. Se inmunizan con antígeno en IFA/CFA, como sigue, a monos macacos que son parte de un estudio de exposición viral. Se utilizan varios primates para el péptido inmunizante, con una inyección intramuscular iniciaj. (IM, por sus siglas en inglés) con conjugado en CFA y un refuerzo IM subsecuente a las 2 semanas con conjugado en IFA. Se extrae - - sangre antes de la primera inyección y se realizan extracciones más grandes a las 3 y 5 semanas después de la inyección de refuerzo.

C. Títulos de ELISA Se realizaron ensayos de ELISA como se describe por H.M. Geysen et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . E. U.A. , 81: 3998 (1983) . El título de anticuerpo es el inverso de la dilución sérica que resulta en una absorbancia de 1.0 unidades DO por encima del fondo. El título medio geométrico (GMT, por sus siglas en inglés) para 2-3 sueros se calcula para cada respuesta, o sueros solos únicamente cuando estaban disponibles para algunas inmunizaciones de mono. Los resultados de ELISA para este ensayo en conejos versus monos se muestran en las figuras ÍA y IB, respectivamente. Los resultados de ELISA demuestran que los anticuerpos de primate para el inmunógeno que incorporan el epitopo I reaccionan con la secuencia -Asp-Pro-Arg7-Leu-Glu9-Pro-Trp-Lys12- [aminoácidos 5-12 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15] . Como se discute en lo siguiente, las posiciones 7, 9 y 12 representan variantes comunes de este péptido de Epitopo I reconocido por primates.

D. Análisis de la diversidad en la secuencia de aminoácidos dentro de los epi topos Las primeras secuencias de exón de Tat de VIH-1 se recuperan de GenBank y de Los Alamos Human Retroviruses and AIDS databases [HUMAN RETROVIRUSES and AIDS 1996, publicada por Theoretical Biology and Biophysics Group of the Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM y secuencias adicionales obtenidas amablemente de GenBank por Esther Guzman de Los Alamos Laboratory] . Las secuencias incompletas y secuencias con codones de alto o supresiones de base que llevan a un desplazamiento de marco fueron suprimidas, pues eran evidentemente secuencias repetidas idénticas del mismo aislado. Las variaciones de aminoácidos en las posiciones dentro de los epitopos se registraron y tabularon.

E. Reactividad cruzada antigénica entre variantes Los antisueros para la secuencia de concenso de epitopo fueron tituladas por ELISA en la secuencia de concenso y en las secuencias con variantes de aminoácidos comunes para determinar los efectos de polimorfismos de aminoácidos en la antigenicidad.

Variaciones en las secuencias Las secuencias de consenso de epitopo I reconocidas por primate fueron evaluadas para determinar la frecuencia máxima y el reconocimiento por anticuerpos de primate. La conservación antigénica y de secuencia en proteínas Tat de VIH-1 a partir de 294 proteínas Tat de VIH-1 de los virus de la cubierta 294 B (I) y de los virus de la cubierta que no es B 56 (II) se evalúan para determinar los epitopos y los resultados se tabulan en las Tablas II a VI abajo. La hilera superior de las Tablas II y III indica la secuencia de consenso para la frecuencia máxima. Las hileras medias contienen el por ciento de incidencia de aminoácidos encontrados en más de 5% de secuencias en cada posición, si son múltiples. La hilera inferior de cada tabla es la incidencia total incluyendo los aminoácidos que se presentan en más de 5% de las secuencias, si son múltiples. La totalidad de estas selecciones en la Tabla II generan epitopos antigenicamente distintos (<25% de reactividad cruzada) ; y la totalidad de las selecciones en la Tabla III, excepto para las entradas bajo el aminoácido 4.

- - Tabla II Epitopol - cubiertas 294 B Tabla III Epitopo I- Cubiertas no B 56 - Como se muestra en las Tablas II y III, el epitopo I reconocido por primate tiene un polimorfismo antigénico 16 veces potencial, pero existe un antígeno principal para las cubiertas B y existe otro antígeno principal para las cubiertas que no son B. Otras cinco variantes constituyen más de 95% de las variantes Tat conocidas. Véanse las Tablas IV y V; las secuencias indicadas con un asterisco están representadas en las cubiertas B y las que no son B .

Tabla IV - Cubiertas B (294 secuencias) Tabla V - Cubiertas no B (56 secuencias) - - La tabla VI muestra una pobre reactividad cruzada - - antigénica de las variantes de una posición 7 del epitopo I, la distinción antigénica de las variantes en la posición 9 y la carencia extrema de la reactividad cruzada de los antisueros a GluProValAspProAsn7LeuGlu9ProTrpAsn12 [aminoácidos 225-235 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 13] con GluProValAspProArg7LeuGlu9ProTrpLys?2 [aminoácidos 2-12 de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 15] que contienen variantes en ambas posiciones, 7 y 12. Se demuestra además la distinción antigénica de las variantes Glu9 y Asp9.

Tabla VI - Reactividad en ELISA de antisueros de mono a los inmunógenos de epitopo I en péptidos detectores con el aminoácido Tat en variaciones de las posiciones 7, 9 y 12 - - EJEMPLO 2- ESTUDIOS INMUNOLOGICOS EN SECUENCIAS MÍNIMAS DE AMINOÁCIDO DE PROTEÍNA TAT NECESARIA PARA UNIÓN A ANTICUERPO PARA EPITOPO II RECONOCIDO POR PRIMATE EN PROTEÍNA TAT DE VIH-1, VARIACIONES EN LA SECUENCIA Y REACTIVIDAD CRUZADA INMUNOLÓGICA DE ANTISUEROS PARA ESTAS SECUENCIAS Utilizando los mismos procedimientos indicados en el Ejemplo 1, se determinó la incidencia de variación de secuencia de aminoácido para cubierta 294 B cubierta 56 no B de las secuencias Tat de VIH-1, dentro de los límites de epitopo II de unión de anticuerpo en monos. Los resultados se reportan en las Tablas VII y VIII. Las líneas superiores de las tablas contienen la secuencia de consenso. Las líneas medias contienen el por ciento de incidencia de aminoácidos encontrado con más de 5% de secuencias en cada posición, si es múltiple. La línea inferior muestra la incidencia total que incluye aminoácidos que se presentan en más de 5% de secuencias, si son múltiples. La variante de aminoácidos en la posición Tat 42 generan reacción cruzada antigénica.

Tabla VII Epitopo II - cubiertas 294 B - Tabla VIII Epitopo II - cubiertas 56 no B Como se muestra en las tablas VII y VIII, el epitopo II muestra una conservación antigénica casi completa. Se midió la reactividad por ELISA de antisueros de mono al inmunógeno epitopo II en péptidos detectores con Tat Gly42 o Ala42 (variante) dentro de las secuencias detectoras y se reporta en la Tabla IX a continuación. Véanse las figuras 2A y 2B para una comparación gráfica de los resultados en - - conejos versus monos, respectivamente.

Tabla IX Secuencia del epitopo Secuencia del epitopo del peptido detector irununógeno Título (% del título en el péptido propio) LysGlyLeuGlylleSerTyr LysGlyLeuGlylleSerTyr LysAlaLeuGlyüeSerTyr GlyArgLys GlyArgLys GlyArgLys [aminoácidos 41-50 de la [aminoácidos 41-50 de la [SECUENCIA DE SECUENCIA DE SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: IDENTIFICACIÓN NO: IDENTIFICACIÓN NO: 33] 15] 15] 19,000 (76%) 25,000 (100%) EJEMPLO 3 : DESARROLLO DE TRATAMIENTO DE ANTICUERPO MONOCLONAL HUMANO PARA INFECCIONES ASINTOM.TICAS DE VIH-1 Se inmunizan ratones con anticuerpos humanizados disponibles comercialmente, con una cantidad adecuada de inmunógeno de epitopo II: Cys-Gly-Ser-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-amida [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 34] acoplada a proteína portadora de toxoide de difteria. Se criban los hibridomas en biotina-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-OH [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 35] en placas recubiertas con estreptavidina, y se selecciona un anticuerpo monoclonal IgG con afinidad de unión subnanomolar y sin unión a receptores de complemento. La especificidad se confirma en la proteína Tat de VIH-1 recombinante. Dado que el anticuerpo monoclonal está dirigido a un antígeno no propio, se anticipa una producción preclínica convencional así como purificación y pruebas de seguridad. Los anticuerpos monoclonales humanos tienen una vida media de 20 días en el hombre versus 18 horas de vida media de 0KT3, un anticuerpo monoclonal de ratón el cual se consume ampliamente en CD3 interno. Dosis diarias de 5 mg de OKT3 mantendrán concentraciones mínimas de aproximadamente 1 microgramo/ml en el hombre. Por lo tanto, se anticipa que una dosis cada dos semanas de 5 mg de anticuerpo monoclonal contra Tat será suficiente para mantener concentraciones mínimas similares, un exceso mayor de 50 veces molar sobre las concentraciones circulantes máximas calculadas de hasta 1 ng/ml para la proteína Tat de VIH-1 en sujetos infectados. El control de las cargas virales plasmáticas ahora es un criterio aceptado de eficacia para el tratamiento de VIH-1. La eficacia de un anticurpo monoclonal contra Tat se puede determinar rápidamente en sujetos infectados con VIH-1 asintomáticos, inicialmente con un curso de tratamiento de cuatro semanas. Este protocolo es útil en pacientes no tratados, en pacientes que han fallado en los protocolos HAART por diversas razones, o en pacientes controlados por terapia HAART, con suspensión de esta terapia durante 4 semanas (las cargas virales aumentan rápidamente si se detiene HAART) . Una reducción de 2 a 3 unidades logarítmicas en las cargas virales plasmáticas por debajo de LOD (50 copias de ARN viral/ml) soportan la monoterapia con el anticuerpo monoclonal, el cual fue evaluado durante un intervalo de tiempo prolongado. Una reducción superior a una unidad logarítmica (90%) , pero no debajo de LOD sugiere el uso del anticuerpo monoclonal como un componente en la terapia.

EJEMPLO 4 - DESARROLLO DE UNA VACUNA UNIVERSAL PARA EVITAR EL AVANCE A SIDA EN SUJETOS Construcción de un gen sintético La figura 3A ilustra un gen sintético que codifica para cuatro copias, cada una de las cuatro formas polimórficas de epitopo I detectadas para la respuesta de anticuerpo en conejo, más cuatro copias de epitopo II, que se expresa en E. coli como una proteína de fusión lineal con DnaK de E. coli (HSP70) . Esta proteína expresada contiene todos los epitopos antigénicos cuando se prueban en ELISA, con antisueros de conejo específicos para epitopo. Sin embargo, cuando se utiliza para inmunización en conejos o monos, todas las variantes de epitopo I son inmunogénicas, pero no así las de epitopo II. Por lo tanto, el epitopo II se utiliza mejor como un conjugado peptídico sintético acoplado a una proteína portadora apropiada. La figura 3B ilustra un gen sintético octavalente novedoso construido para incorporar ocho formas polimórficas de epitopo I reconocidas por primate, en marco, en base en el polimorfismo dentro de los límites de epitopo I reconocido en primates : Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 17] Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 19] Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 22] Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 20] Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 24] Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 21] Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 18] y Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 23] Las secuencias del epitopo I se separan por separadores dipeptídicos que contienen residuos Gly o Ser. El gen se ensambla como se describe en .P.C. Stemmer et al . , Gene, 164 :49 (1995). Brevemente, se sintetizan oligonucleótidos (oligos) de 60 unidades de cadena superior y oligonucleótidos de cadena inferior con superposiciones de 20 nucleótidos (nt) junto con dos extremos de 50 unidades. Las 60 unidades se incuban juntas bajo condicioes de hibridación y se utiliza reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) para llenado de la secuencia y su amplificación. El extremo de 50 unidades después se agrega y el ensamble se completa por PCR, con aislamiento del gen de longitud completa sobre gel de agarosa. Se secuencia el gen y se encuentra que tiene la secuencia correcta dentro de los epitopos reales. Se puede construir un gen heptavalente similar al eliminar la variante rara Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 24] .

B. Expresión de la proteína de fusión Este gen, descrito antes, después se corta con enzimas de restricción y se inserta dentro de un vector de expresión adecuado que contiene, en marco, la secuencia para el toxoide de difteria (HSP70) . Se transfectan E. coli y se aislan las colonias que expresan la proteína. Las colonias aisladas se hacen crecer y se induce la expresión. Se identifica la proteína de las colonias que expresan la proteína de fusión. La proteína resultante se purifica utilizando métodos convencionales. La figura 3C ilustra el inmunógeno de epitopo II monovalente preparado opcionalmente como un conjugado de péptido sintético con una proteína portadora tal como toxoide de difteria, utilizando técnicas similares.

C. Ensayos para determinar la expresión de los epi topos correctamente en la proteína de fusión y eficacia en inducir anticuerpos contra Tat Se construyen las cuatro variantes de los epitopos I, en los cuales Y7 es cualquiera de Arg, Asn, Lys o Ser y X9 es Glu Z12 es Lys, y ambas variantes del epitopo II, en un gen sintético y se expresan como una proteína de fusión, como se describe en los párrafos A y B anteriores . Para determinar si cada epitopo se expresa en la proteína de fusión en una forma que pueda ser reconocida por antisuero de primate, se prueban por ELISA los antisueros de primate generados para péptidos sintéticos que corresponden a las secuencias del epitopo I, utilizando metodología convencional. Las placas inicialmente se recubren directamente con la proteína de fusión y después se expone a 100 µg/ml de solución de antisueros (por ejemplo - antisuero de conejo) los cuales se sabe son reactivos para los epitopos I y II. Las secuencias de epitopo variante se expresan en una conformación reconocible por anticuerpos a los péptidos sintéticos correspondientes, como se muestra por un título mayor de 32,000 para cada epitopo. Para evaluar la inmunogenicidad del inmunógeno multivalente, se inmuniza a monos con la proteína de fusión en IFA. Después se determinaron péptidos sintéticos de los epitopos I y II en antisueros de mono. Se desarrollan títulos importantes para las variantes de epitopo I, es decir, título de 28,000 al epitopo I cuando Y7 es Arg y Z12 es Lys; título de 16,000 para el epitopo I cuando Y7 es Asn y Z12 es Lys; título de 37,000 para el epitopo I cuando Y7 es Lys y Z12 es Lys; y título de 4,000 para el epitopo I cuando Y7 es Ser y Z12 es Lys. El título para el epitopo II es 700, lo que indica que este epitopo se presenta mejor para inmunización como un péptido sintético acoplado a un portador.

EJEMPLO MÉTODO Y EQUIPOS PARA DETECTAR TÍTULOS ESPECIFICIDADES DE ANTICUERPOS INDUCIDOS POR VACUNACIÓN Para seguimiento del título y especificidades de anticuerpos inducidos después de inmunización con las vacunas de esta invención, se puede utilizar un método de ensayo. En una modalidad de tal ensayo, se utilizan los péptidos que contienen las secuencias del epitopo I reconocido por primate reportadas en el Ejemplo 1 (que dependen de la composición de la vacuna inmunizante) para desarrollar equipos que miden los títulos y los patrones de reactividad de anticuerpos en sujetos vacunados. Estos péptidos se sintetizan con Biotina-Ser-Gly-Ser-Gly- [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 36] en la parte N terminal. Cada péptido se recubre sobre placas recubiertas con avidina separadas, con una secuencia -Ser-Gly-Ser-Gly-[SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 27] que sirve como un separador para asegurar que la secuencia peptídica pertinente esté en la parte externa al paquete de unión de biotina de la avidina. Las placas después se incuban con diluciones del suero de prueba, se lavan y la unión de anticuerpo determinada con el reactivo para inmunoglobulina humana, por ejemplo inmunoglobulina de chivo contra humano, se marca directamente con la enzima. Se utiliza un reactivo para que reaccione con la enzima y produzca una señal colorimétrica (insertos del equipo de investigación y desarrollo) . Se incluyen muchas modificaciones y variaciones de la presente invención en la especificación identificada en lo anterior y se espera que sean obvias para una persona experta en la técnica. Tales modificaciones y alteraciones a las composiciones y procesos de la presente invención se considera que están abarcados por el alcance de las - reivindicaciones anexas a la presente. Se hace constar que con relación a esta fecha, que el mejor método conocido por el solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (65)

REIVINDICACIONES

1. Una composición caracterizada porque comprende un péptido o polipéptido de la fórmula Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE

IDENTIFICACIÓN NUMERO: 23, en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior y una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituida con alquilo inferior o alcanoilo inferior; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de un hidroxilo libre, una amida y una secuencia de 1 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque Rl es Val, lo que resulta en la secuencia Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO : 23.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque Rl es X2-Pro-Val, en donde X2 se selecciona del grupo que consiste de Glu y Asp, lo que resulta en la secuencia X2-Pro-Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 38, opcionalmente sustituida con un alquilo inferior o alcanoilo inferior.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque R2 es -His-Pro-Gly-Ser-, lo que resulta en la secuencia Val-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-His-Pro-Gly-Ser SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 16, en donde el Ser carboxi terminal está opcionalmente sustituido con una amida.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además por lo menos dos variantes de un péptido o polipéptido de la fórmula que se selecciona del grupo que consiste de: Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-Glu-Pro-Trp-Z?2-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8, en donde Y7 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Ser y Asn; en donde Z?2 se selecciona del grupo que consiste de Lys y Asn; en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior y una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituida con alquilo inferior o alcanoilo inferior; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de un hidroxilo libre, una amida y una secuencia de 1 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida, y en donde por lo menos una variante es Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17, y la otra variante es Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 18.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además un péptido en el cual Rl es Val .

7. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además un péptido en el cual Rl es X2-Pro-Val, en donde X2 se selecciona del grupo que consiste de Glu y Asp, opcionalmente sustituido con un alquilo inferior o alcanoilo inferior.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende además un péptido en el que R2 es -His-Pro-Gly-Ser- , en donde el Ser en carboxi terminal está opcionalmente sustituido con una amida.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende una o más secuencias adicionales que se seleccionan del grupo que consiste de: Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19 Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 22 Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20 Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 y Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21 en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior y una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituida con alquilo inferior o alcanoilo inferior; y en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de un hidroxilo libre, una amida y una secuencia de 1 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende adicíonalmente por lo menos siete de las secuencias de aminoácidos.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los péptidos o polipéptidos se producen sintét-icamente .

12. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los péptidos o polipéptidos se producen de manera recombinante.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más de los péptidos se expresan como un péptido sintético acoplado a una proteína portadora.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más de los péptidos se expresan como un péptido antigénico múltiple, opcionalmente acoplado a una proteína portadora.

15. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque uno o más de los péptidos seleccionados se expresan dentro de una proteína producida recombinantemente, opcionalmente fusionada en marco con una proteína portadora.

16. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque la proteína portadora se selecciona del grupo que consiste de una proteína DnaK de E. coli, una proteína GST, una proteína 70 de choque térmico de micobacteria, un toxoide de difteria, un toxoide de tétanos, una galactocinasa, una ubiquitina, un factor coincidente a, una galactosidasa ß y una proteína NS-1 de influenza .

17. Una composición, que comprende: (a) un péptido o polipéptido de la fórmula Rl-Asp- Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2, SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23, en donde Rl se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior y una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituida con un alquilo inferior, un alcanoilo inferior; en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de un hidroxilo libre, una amida y una secuencia de 1 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida; y (b) por lo menos un péptido o polipéptido de la fórmula R3-Lys-X42-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 5, en donde X42 se selecciona del grupo que consiste de Gly o Ala; en donde R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, un alquilo inferior, un alcanoilo inferior, y una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituida con un alquilo inferior o alcanoilo inferior; en donde R4 se selecciona del grupo que consiste de un hidroxilo libre, una amida y una secuencia de 1 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales excluyendo los aminoácidos básicos -Lys-Arg-Arg- , opcionalmente sustituido con una amida.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque los péptidos o polipéptidos se producen sintéticamente.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque los péptidos o polipéptidos se producen de manera recombinante.

20. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque uno o más de los péptidos se expresan como un péptido sintético acoplado a una proteína portadora.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque uno o más de los péptidos se expresan como un péptido antigénico múltiple, acoplado opcionalmente a una proteína portadora.

22. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque uno o más de los péptidos seleccionados se expresa dentro de una proteína producida recombinantemente, fusionada opcionalmente en marco con una proteína portadora.

23. La composición de conformidad con la reivindicación 20, 21 o 22, caracterizada porque la proteína portadora se selecciona del grupo que consiste de una proteína Dna K de E. coli , una proteína GST, una proteína 70 de choque térmico de micobacteria, un toxoide de difteria, un toxoide de tétanos, una galactocinasa, una ubiquitina, un factor coincidente a, una galactosidasa ß y una proteína NS-1 de influenza.

24. La composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, un portador farmacéuticamente aceptable y un adyuvante opcional.

25. Un método para inducir anticuerpos contra Tat de VIH-1, el método está caracterizado porque comprende las etapas de : exponer a un sujeto a una cantidad eficaz de composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, composición la cual induce activamente anticuerpos que reaccionan con las proteínas Tat de VIH-1 de diferentes cepas o subtipos de VIH-1.

26. Un método para producir una composición útil para deteriorar la multiplicación de VIH-1 en un humano incompetente inmunitariamente, el método está caracterizado porque comprende : (a) inmunizar a un primate con una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, y (b) aislar y purificar el anticuerpo del mamífero inmunizado, en forma estéril, en donde el anticuerpo forma un componente de la composición.

27. Un método para determinar la presencia o el título de anticuerpos inducidos por inmunización a un inmunógeno Tat, caracterizado porque comprende: (A) poner en contacto una muestra biológica de un sujeto inmunizado, con una composición peptídica o polipeptídica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, unido a un soporte sólido; (B) lavar el soporte para eliminar cualquiera de las muestras biológicas la cual no está unida a las secuencias; (C) poner en contacto el soporte con un reactivo asociado con una etiqueta detectable, en donde el reactivo detecta la unión entre las secuencias en el soporte sólido y el anticuerpo en la muestra biológica, y en donde la etiqueta produce una señal detectable.

28. Un anticuerpo aislado para proteína Tat de VIH-1, que se une específicamente a un epitopo localizado dentro de la secuencia de aminoácidos -Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn- de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23.

29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque tiene un Val antes del amino terminal Asp de tal secuencia.

30. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal aislado, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo producido por cribado de exhibiciones de fago, un fragmento de anticuerpo y mezclas de los mismos.

31. Una composición de anticuerpo, caracterizada porque comprende : a) un anticuerpo para la proteína Tat de VIH-1, que se une específicamente a un epitopo que se localiza dentro de la secuencia de aminoácidos Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23 y b) por lo menos un anticuerpo adicional para la proteína Tat de VIH-1, la composición de anticuerpo reacciona con proteínas Tat de VIH-1 de diferentes cepas y subtipos de VIH-1.

32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de (a) tiene un Val antes del Asp amino terminal de la secuencia.

33. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el anticuerpo adicional comprende por lo menos un anticuerpo el cual se une específicamente a por lo menos dos variantes de un epitopo de una proteína Tat de VIH-1, el epitopo se localiza dentro de la secuencia de aminoácidos -Asp-Pro-Y7-Leu-Glu-Pro-Trp-Z12 de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8, en donde Y7 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Ser y Asn; y en donde Z12 se selecciona del grupo que consiste de Lys y Asn.

34. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque tiene un Val antes del Asp amino terminal de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8.

35. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque comprende una mezcla de uno a cuatro diferentes anticuerpos adicionales, la mezcla es capaz de unir tres variantes de Y diferentes del epitopo definido por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8.

36. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque comprende una mezcla de uno a cuatro diferentes anticuerpos adicionales, la mezcla es capaz de unir la totalidad de los cuatro variantes Y diferentes del epitopo definido por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8.

37. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el anticuerpo adicional comprende un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de epitopo -Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17, y un anticuerpo que se une específicamente a la secuencia de epitopo -Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn- SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 18.

38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque tiene un Val antes del Asp amino terminal de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17 o 18.

39. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el anticuerpo adicional comprende uno o más anticuerpos que se unen específicamente a por lo menos una secuencia de epitopo que se selecciona del grupo que consiste de: -Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys- SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19 -Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn- SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22 -Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys- SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20 -Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn- SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 y Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21.

40. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque tiene un Val antes del Asp amino terminal de cualquiera de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 19, 20, 21, 22 y 24.

41. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque los anticuerpos adicionales unen por lo menos siete de los epitopos de las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NÚMEROS: 17 a 22 y 2 .

42. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 41, caracterizada porque un anticuerpo adicional es un anticuerpo para la proteína Tat de VIH-1 que se une específicamente a un epitopo que se encuentra dentro de la secuencia de aminoácidos -Lys-Xa.-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 10, en donde el aminoácido Xi es Gly o Ala.

43. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 42, caracterizada porque cada anticuerpo en la composición se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal aislado, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo producido por cribado de exhibiciones de fago, y un fragmento de anticuerpo y mezclas de los mismos.

44. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo o composición de anticuerpo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 43, y un portador farmacéuticamente aceptable.

45. Un método para reducir las concentraciones virales de VIH-1, el método está caracterizado porque comprende las etapas de administrar a un humano un anticuerpo o composición de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 43.

46. Un gen sintético, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido o polipéptido de la fórmula: Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 23, en donde Rl es una secuencia opcional de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos; y en donde R2 es una secuencia opcional de 1 hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales. 47. El gen sintético, de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos un péptido o polipéptido adicional que se selecciona del grupo que consiste de: Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-Glu-Pro-Trp-Z?2-R2 SECUENCIA DE

IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8. en donde Y7 se selecciona del grupo que consiste de Arg, Lys, Ser y Asn; en donde Z?2 se selecciona del grupo que consiste de Lys y Asn; en donde Rl es una secuencia opcional de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos; en donde R2 es una secuencia opcional de 1 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales; y en donde por lo menos una variante es

Rl-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 17, y la otra variante es Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 18. 48. El gen sintético, de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porgue comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica para por lo menos un péptido o polipéptido adicional que se selecciona del grupo que consiste de: Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE

IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 19 Rl-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 22 Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 20 Rl-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 24 y Rl-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 21 en donde Rl es una secuencia opcional de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos; y en donde R2 es una secuencia opcional de 1 o hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales. 49. El gen sintético, de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende además por lo menos siete secuencias de aminoácidos .

50. El gen sintético, de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque los péptidos o polipéptidos se fusionan a una proteína portadora.

51. El gen sintético, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 50, caracterizado porque cada secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos está separada por una secuencia separadora .

52. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un gen sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 51 y un portador farmacéuticamente aceptable.

53. Un método para inducir anticuerpos contra Tat de VIH-1, el método está caracterizado porque comprende las etapas de : exponer a un sujeto a una cantidad eficaz de un gen sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 51, el cual induce activamente anticuerpos que reaccionan con proteínas Tat de VIH-1 de diferentes cepas o subtipos de VIH-1.

54. Un método para producir una composición útil para deteriorar la multiplicación de VIH-1 en un humano inmunitariamente incompetente, el método está caracterizado porque comprende: (a) inmunizar a un primate con un gen sintético de conformidad con las reivindicaciones 46 a 51; y (b) aislar y purificar el anticuerpo del primate inmunizado, en forma estéril, en donde el anticuerpo forma un componente de la composición.

55. Una molécula sintética, caracterizada porque comprende el gen sintético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 51 unido operativamente a secuencias reguladoras de ácido nucleico, las cuales dirigen y controlan la expresión del producto del gen sintético en una célula huésped.

56. La molécula de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque es un plásmido.

57. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una molécula sintética de conformidad con la reivindicación 55 y un portador farmacéuticamente aceptable.

58. Un método para inducir anticuerpos contra Tat de VIH-1, el método está caracterizado porque comprende las etapas de : exponer a un sujeto a una cantidad eficaz de una molécula sintética de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque induce activamente anticuerpos que reaccionan con proteínas Tat de VIH-1 de diferentes cepas o subtipos de VIH-1.

59. Un método para producir una composición útil para deteriorar la multiplicación de VIH-1 en un humano inmunitariamente incompetente, el método está caracterizado porque comprende : (a) inmunizar a un primate con una molécula de conformidad con la reivindicación 55; (b) aislar y purificar anticuerpo del primate inmunizado en forma estéril, en donde el anticuerpo forma un componente de la composición.

60. Un microorganismo, caracterizado porque comprende: (a) un primer gen sintético que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, el gen está opcionalmente fusionado a una proteína portadora; o (b) una molécula sintética que comprende el gen sintético del inciso (a) unido operativamente a secuencias reguladoras de ácido nucleico, las cuales dirigen y controlan la expresión del producto del gen sintético en una célula huésped.

61. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de un virus recombinante capaz de expresar copias múltiples del producto del gen en una célula huésped, en donde el virus es no patogénico para humanos y una bacteria comensal capaz de expresar copias múltiples del producto del gen en un huésped.

62. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un microorganismo de conformidad con la reivindicación 60 o 61 y un portador farmacéuticamente aceptable .

63. Un método para inducir anticuerpos contra Tat de VIH-1, el método está caracterizado porque comprende las etapas de : exponer a un sujeto a una cantidad eficaz de un microorganismo de conformidad con la reivindicación 60 o 61, el cual induce activamente anticuerpos que reaccionan con proteínas Tat de VIH-1 de diferentes cepas o subtipos de VIH-1.

64. Un método para producir una composición útil para deteriorar la multiplicación de VIH-1 en un humano inmunitariamente incompetente, el método está caracterizado porque comprende : (a) inmunizar a un mamífero con un microorganismo de conformidad con la reivindicación 60 o 61; (b) aislar y purificar el anticuerpo del mamífero inmunizado en forma estéril, en donde el anticuerpo forma un componente de la composición.

65. Una célula huésped de mamífero, caracterizada porque contiene un gen sintético, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 a 51. RESUMES! DE LA INVENCIÓN Se proporciona una composición que induce anticuerpos contra la mayor parte (por ejemplo, más de 95%) de las variantes conocidas de lá proteína Tat de VIH-1 tanto en las cubiertas B como las que no son B que contienen por lo menos dos variantes de un péptido o polipéptido de la fórmula: Rl-Asp-Pro-Y7-Leu-X9-Pro-Trp-Z12-R2 [SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 8] . De acuerdo con esta fórmula, Y7 es Arg, Lys, Ser o Asn; X9 es Glu o Asp; Z12 es Lys o Asn; Rl es hidrógeno, un alquilo inferior, un alcan ilo inferior, o una secuencia de entre 1 y aproximadamente 5 aminoácidos, opcionalmente sustituido con un alquilo inferior o alcanoilo inferior; y R2 es un hidroxilo libre, una amida o una secuencia de 1 hasta aproximadamente 5 aminoácidos adicionales, opcionalmente sustituidos con una amida. En esta composición, por lo menos una de las dos variantes contiene Arg en Y7 y Lys en Z12, y en por lo menos la segunda de las dos variantes, Y7 es Asn y Zl2 es Asn. Las composiciones de vacuna y farmacéuticas pueden contener uno o más de tales péptidos asociados con proteínas portadoras, asociados en péptidos antigénicos múltiples o como parte de proteínas recombinantes. La adición a esta combinación u otros inmunógenos opcionales puede proporcionar otras composiciones útiles para elucir anticuerpos contra Tat de primate los cuales dan reacción cruzada con cepas múltiples y variantes PA/a/ 2002 \ 1o £ 32 de la proteína Tat de VÍH-1. Las composiciones de vacuna y farmacéuticas pueden contener los anticuerpos primates inducidos por las composiciones peptídicas para uso en tratamientos pasivos. Se describen composiciones de diagnóstico así como usos para determinar el estado inmunitario de pacientes vacunados. PA/a/ 20 O2 \ i O d l