PT1205489E - Polipéptido e ácidos nucleicos que os codificam - Google Patents

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PT1205489E
PT1205489E PT01127792T PT01127792T PT1205489E PT 1205489 E PT1205489 E PT 1205489E PT 01127792 T PT01127792 T PT 01127792T PT 01127792 T PT01127792 T PT 01127792T PT 1205489 E PT1205489 E PT 1205489E
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pro
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Diane Pennica
Jian Chen
Jean Yuan
William I Wood
Audrey Goddard
Austin L Gurney
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Genentech Inc
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Description

ΕΡ 1 205 489 /PT
DESCRIÇÃO "Polipéptido e ácidos nucleicos que os codificam"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se genericamente à identificação e isolamento de ADN e à produção recombinante de polipéptidos codificados por esse ADN.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
As proteínas extracelulares e ligadas à membrana desempenham importantes papéis na formação, diferenciação e manutenção de organismos multicelulares. O destino de muitas células individuais, e.g., proliferação, migração, diferenciação ou interacção com outras células, é tipicamente governado por informação recebida de outras células e/ou do ambiente imediato. Esta informação é frequentemente transmitida por polipéptidos segregados (por exemplo, factores mitogénicos, factores de sobrevivência, factores citotóxicos, factores de diferenciação, neuropéptidos e hormonas) que são, por sua vez, recebidos e interpretados por diversos receptores celulares ou proteínas ligadas à membrana. Estes polipéptidos ou moléculas de sinalização segregados normalmente passam através da via de secreção celular para atingir o seu local de acção no ambiente extracelular, usualmente numa proteína receptora ligada à membrana.
As proteínas segregadas têm várias aplicações industriais, incluindo a utilização como fármacos, produtos de diagnóstico, biossensores e biorreactores. De facto, a maior parte das drogas proteínicas disponíveis presentemente, tais como agentes trombolíticos, interferões, interleucinas, eritropoietinas, factores estimulantes de colónias e várias outras citoquinas, são proteínas secretórias. Os seus receptores, que são proteínas ligadas à membrana, têm também potencial como agentes terapêuticos ou de diagnóstico. As imunoadesinas receptoras, por exemplo, podem ser empregues como agentes terapêuticos para bloquear a interacção receptor-ligando. As proteínas ligadas à membrana podem também ser empregues para o rastreio de potenciais inibidores peptídicos ou de pequena molécula da relevante interacção receptor/ligando. Estas proteínas ligadas à membrana e 2 ΕΡ 1 205 489 /PT receptores celulares incluem, mas não se lhes limitam, receptores de citoquinas, quinases receptoras, fosfatases receptoras, receptores envolvidos em interacções célula-célula, e moléculas de adesina celular como selectinas e integrinas. A transdução de sinais que regula o crescimento e a diferenciação celulares é regulada em parte por fosforilação de várias proteínas celulares. As proteína-tirosina-quinases, enzimas que catalisam esse processo, podem também actuar como receptores para factores do crescimento. Os exemplos incluem o receptor do factor do crescimento de fibroblastos e o receptor do factor do crescimento dos nervos.
Estão a decorrer esforços, tanto industrial como academicamente, para identificar novas proteínas receptoras ligadas à membrana, segregadas e nativas. Muitos esforços estão focados no rastreio de bibliotecas de ADN recombinante de mamífero, para identificar as sequências de codificação para novas proteínas receptoras ligadas à membrana e segregadas. Exemplos de métodos e técnicas de rastreio estão descritos na literatura [veja-se, por exemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 93:7108-7113 (1996); Patente N°. U.S. 5 536 637)].
Descrevemos aqui a identificação e a caracterização de novos polipéptidos transmembranares e segregados e novos ácidos nucleicos que codificam esses polipéptidos. PRQ301 A ocorrência disseminada de cancro motivou a dedicação de recursos consideráveis e a determinação de novos tratamentos. Um método particular envolve a criação de anticorpos monoclonais (mAb) específicos de tumores ou de cancros que são específicos para antigénios de tumores. Estes mAb, que conseguem distinguir entre células normais e cancerosas, são úteis no diagnóstico, prognóstico e tratamento da doença. Sabe-se que antigénios particulares estão associados a doenças neoplásicas, tais como cancro colorrectal.
Um antigénio particular, o antigénio A33, é expresso em mais de 90% dos cancros do cólon primários ou metastáticos, assim como no epitélio do cólon normal. Como o cancro do cólon é uma doença amplamente disseminada, o diagnóstico e 3
ΕΡ 1 205 489 /PT tratamento precoces constituem um objectivo médico importante. O diagnóstico e o tratamento de cancro do cólon podem ser implementados utilizando anticorpos monoclonais (mAb) específicos para os mesmos possuindo marcadores fluorescentes, magnéticos nucleares ou radioactivos. Os mAb marcados com toxinas, drogas e/ou genes radioactivos, podem ser utilizados para o tratamento in situ com o mínimo de descrição do paciente. Os mAb podem igualmente ser utilizados para diagnosticar durante o diagnóstico e o tratamento de cancros do cólon. Por exemplo, quando os níveis séricos do antigénio A33 são elevados num paciente, uma queda dos níveis após cirurgia indicaria que a ressecção do tumor foi bem sucedida. Por outro lado, uma subsequente subida nos níveis de antigénio A33 no soro após cirurgia indicaria que poderão ter-se formado metástases do tumor original ou que poderão ter surgido novos tumores primários. Estes anticorpos monoclonais podem ser utilizados em vez de, ou em conjunto com, cirurgia e/ou quimioterapias. Por exemplo, U.S.P. 4 579 827 e U.S.S.N. 424 991 (EP 199 141) são dirigidos à administração terapêutica de anticorpos monoclonais, o último relacionando-se com a aplicação de mAb anti-A33.
Muitos cancros de origem epitelial possuem receptores de adenovírus. De facto, os vectores derivados de adenovírus foram propostos como um meio para inserir ácidos nucleicos anti-sentido em tumores (U.S.P. 5 518 885). Assim, a associação de receptores virais com tumores neoplásicos não é inesperada.
Descrevemos aqui a identificação e a caracterização de novos polipéptidos possuindo homologia com certos antigénios associados ao cancro, designados aqui por polipéptidos PRO301. SUMÁRIO DA INVENÇÃO PRQ301
Os requerentes identificaram um clone de ADNc (DNA40628-1216) que codifica um polipéptido, designado no presente pedido de patente como "PRO301".
Numa concretização, a invenção proporciona o polipéptido PRO301 isolado tal como definido nas reivindicações, para 4
ΕΡ 1 205 489 /PT utilização num método de tratamento médico. Em particular, a invenção proporciona polipéptido PRO301 de sequência nativa isolado, que, numa concretização, inclui uma sequência de aminoácidos compreendendo os resíduos 28 a 258 do domínio extracelular da Figura 2 (SEQ ID NO:2). Estão especificamente incluídos os polipéptidos PRO301 nativos com ou sem a sequência de sinal nativa (aminoácidos 1 a 27 da Figura 2 (SEQ ID NO: 2), e com ou sem a metionina de iniciação. Adicionalmente, as sequências da invenção podem também compreender o domínio transmembranar (resíduos 236 a cerca de 258 na Figura 2; SEQ ID NO:2) e/ou o domínio intracelular (cerca do resíduo 259 a 299 na Figura 2; SEQ ID NO:2) . Alternativamente, a invenção proporciona um polipéptido PRO301 codificado pelo ácido nucleico depositado com o número de acesso ATCC 209432, como definido nas reivindicações, para utilização num método de tratamento. A Figura 1 mostra uma sequência nucleotídica (SEQ ID NO:l) de uma sequência de ADNc nativa de PRO301, em que SEQ ID NO:l é um clone designado aqui por "UNQ264" e/ou "DNA40628-1216". A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) derivada da sequência de codificação de SEQ ID NO:l mostrada na Figura 1. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS I. Definições
Os termos "polipéptido PRO" e "PRO", tal como aqui se utilizam e quando imediatamente seguidos por uma designação numérica, referem-se a vários polipéptidos, em que a designação completa (i.e., PRO/número) se refere a sequências polipeptídicas específicas conforme aqui descritas. Os termos "polipéptido PRO/número" e "PRO/número", tal como aqui se utilizam, abrangem polipéptidos de sequência nativa e variantes polipeptídicas (que são adicionalmente aqui definidas). Os polipéptidos PRO aqui descritos podem ser isolados de várias fontes, tais como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparados por métodos recombinantes ou sintéticos. 5
ΕΡ 1 205 489 /PT
Um "polipéptido PRO de sequência nativa" compreende um polipéptido possuindo a mesma sequência de aminoácidos que o correspondente polipéptido PRO derivado da natureza. Estes polipéptidos PRO de sequência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. A expressão "polipéptido PRO de sequência nativa" abrange especificamente formas de ocorrência natural segregadas ou truncadas do polipéptido PRO especifico (e.g., uma sequência de dominio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (e.g., formas de splicing alternativo) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipéptido. Numa concretização da invenção, o PRO301 de sequência nativa é um PRO301 de sequência nativa maduro ou de comprimento completo compreendendo os aminoácidos 1 a 299 da Fig. 2 (SEQ ID NO:2), com ou sem a sequência nativa N-terminal, com ou sem a metionina de iniciação na posição 1, com ou sem o dominio transmembranar potencial na posição 236 a cerca de 258, e com ou sem o dominio intracelular a cerca da posição 259 a 299. "Variante de polipéptido PRO" significa um polipéptido PRO activo tal como definido atrás ou adiante possuindo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência do polipéptido PRO de comprimento completo de sequência nativa como aqui descrita. Estas variantes do polipéptido PRO incluem, por exemplo, polipéptidos PRO em que um ou mais residuos de aminoácido são adicionados, ou delecionados, no terminal N ou C da sequência de aminoácidos nativo de comprimento completo. Vulgarmente, uma variante de polipéptido PRO terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência de aminoácidos, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade de sequência de aminoácidos, com a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa de comprimento completo conforme aqui descrita. A "percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos" em relação às sequências de polipéptido PRO identificadas aqui define-se como a percentagem de residuos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos aos residuos de aminoácido na sequência de polipéptido PRO especifico, após alinhamento das sequências e introdução de 6 ΕΡ 1 205 489 /PT hiatos, se necessário, para se conseguir a máxima percentagem de identidade de sequências, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias maneiras fazem parte das qualificações do perito na especialidade, por exemplo, utilizando software de computadores disponível ao público tal com os programas BLAST, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). O programa de software de alinhamento preferido é o BLAST. Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para a medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências a comparar. A "percentagem (%) de identidade de sequência de ácido nucleico" em relação a sequências de ácido nucleico que codificam PRO aqui identificadas define-se como a percentagem de nucleótidos numa sequência candidata que são idênticos aos nucleótidos na sequência de ácido nucleico de PRO de interesse, após alinhamento das sequências e introdução de hiatos, se necessário, para conseguir a máxima percentagem de identidade de sequências. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de ácido nucleico pode ser conseguido de várias maneiras que fazem parte das qualificações do perito na especialidade, por exemplo, utilizando software de computador disponível ao público tal como o software BLAST, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os peritos na especialidade podem determinar parâmetros apropriados para a medição do alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o máximo alinhamento ao longo de todo o comprimento das sequências a comparar. "Isolado," quando utilizado para descrever os vários polipéptidos aqui descritos, significa que o polipéptido foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com as utilizações de diagnóstico ou terapêuticas destinadas ao polipéptido, e podem incluir enzimas, hormonas e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em concretizações 7 ΕΡ 1 205 489 /PT preferidas, o polipéptido será purificado (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna, utilizando um sequenciador de taça rotativa, ou (2) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando coloração com azul de Coomassie ou, preferivelmente, com prata. O polipéptido isolado inclui o polipéptido in situ no interior de células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do polipéptido PRO não estará presente. Normalmente, contudo, o polipéptido isolado será preparado através de pelo menos um passo de purificação.
Um ácido nucleico de um polipéptido PRO "isolado" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual está normalmente associada na fonte natural do ácido nucleico do polipéptido PRO. Uma molécula de ácido nucleico de polipéptido PRO isolada é outra que não a forma ou disposição em que se encontra na natureza. As moléculas de ácido nucleico de polipéptidos PRO isoladas distinguem-se portanto da molécula de ácido nucleico de polipéptido PRO específica pois existe em células naturais. Contudo, uma molécula de ácido nucleico de polipéptido PRO isolada inclui moléculas de ácido nucleico de polipéptido PRO contidas em células que normalmente expressam o polipéptido PRO onde, por exemplo, a molécula de ácido nucleico está numa localização cromossómica diferente da localização em células naturais. "Análise de Southern" ou "Southern blotting" é um método através do qual a presença de sequências de ADN num digerido por endonucleases de restrição de ADN ou uma composição contendo ADN, é confirmada através da hibridação com um fragmento de ADN ou oligonucleótido marcados, conhecidos. A análise de Southern tipicamente envolve separação electroforética de digeridos de ADN em géis de agarose, desnaturação do ADN após a separação electroforética, e transferência do ADN para nitrocelulose, nylon ou outro suporte de membrana adequado para análise com uma sonda radiomarcada, biotinilada ou marcada com uma enzima, como descrito nas secções 9.37-9.52 de Sambrook et al., Molecular Cloning: Ά Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 8
ΕΡ 1 205 489 /PT "Análise de Northern" ou "Northern blotting" é um método utilizado para identificar sequências de ARN que hibridam com uma sonda conhecida tal como um oligonucleótido, um fragmento de ADN, ADNc ou um seu fragmento, ou um fragmento de ARN. A sonda e marcada com um radioisotopo tal como P, ou por biotinilação, ou com uma enzima. O ARN a analisar é usualmente separado electroforeticamente num gel de agarose ou poliacrilamida, transferido para nitrocelulose, nylon ou outra membrana adequada, e hibridado com a sonda, utilizando técnicas Standard bem conhecidas na arte tais como as descritas nas secções 7.39-7.52 de Sambrook et ai., supra. A expressão "sequências de controlo" refere-se a sequências de ADN necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operativamente ligada num organismo hospedeiro particular. As sequências de controlo que são adequadas para procariotas, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência de operador, e um local de ligação ao ribossoma. Sabe-se que as células eucarióticas utilizam promotores, sinais de poliadenilação e potenciadores. 0 ácido nucleico está "operativamente ligado" quando está colocado numa relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, ADN para uma pré-sequência ou um comando de secreção está operativamente ligado a ADN para um polipéptido se for expresso na forma de uma pré-proteina que participa na secreção do polipéptido; um promotor ou um potenciador está operativamente ligado a uma sequência de codificação se afecta a transcrição da sequência; ou um local de ligação ao ribossoma está operativamente ligado a uma sequência de codificação se está posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de ADN a ligar são contíguas, e, no caso de um comando de secreção, contíguo e em fase de leitura. Contudo, os potenciadores não precisam de ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em locais de restrição convenientes. Se estes locais não existirem, são utilizados adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos de acordo com a prática convencional. 0 termo "anticorpo" é utilizado no seu sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais únicos anti- 9
ΕΡ 1 205 489 /PT polipéptido PRO (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes) e composições de anticorpos anti-polipéptido PRO com especificidade poliepitópica. A expressão "anticorpo monoclonal", tal como aqui se utiliza, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, i.e., os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em menores quantidades. "Activo" ou "actividade" para os presentes fins referem-se a forma(s) de polipéptido PRO que retêm as actividades biológicas e/ou imunológicas do polipéptido PRO específico nativo ou de ocorrência natural. A actividade de um polipéptido PR0332 preferivelmente envolve a regulação da matriz extracelular, cartilagem ou função óssea. "Tratamento" ou "tratar" referem-se tanto ao tratamento terapêutico e a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles que já têm a desordem assim como aqueles com propensão para ter a desordem ou aqueles em que a desordem se pretende evitar. "Mamífero", para os fins do tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoológico, desporto ou de estimação, tais como ovelhas, cães, cavalos, gatos, vacas e semelhantes. Preferivelmente, aqui o mamífero é um ser humano. "Transportadores", tal como aqui se utiliza, incluem transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicos para a célula ou para o mamífero que são a eles expostos nas dosagens e concentrações empregues. Frequentemente, o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de pH tamponado. Os exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipéptido de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos tais como 10 ΕΡ 1 205 489 /PT polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes guelantes tais como EDTA; aldóis tais como manitol ou sorbitol; contra-iões formadores de sais tais como sódio; e/ou tensioact ivos não iónicos tais como TWEEN™ , polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™. O termo "agonista" é utilizado para referir análogos peptídicos e não peptídicos dos polipéptidos PRO nativos (onde polipéptido PRO nativo se refere a pro-polipéptido PRO, pré-polipéptido PRO, prepro-polipéptido PRO ou polipéptido PRO maduro) da presente invenção e a anticorpos que se ligam especificamente a estes polipéptidos PRO nativos, desde que retenham pelo menos uma actividade biológica de um polipéptido PRO nativo. Preferivelmente, os agonistas da presente invenção retêm as propriedades de reconhecimento de ligação qualitativas e propriedades de activação de receptores do polipéptido PRO nativo. O termo "antagonista" é utilizado para referir uma molécula que inibe uma actividade biológica de um polipéptido PRO nativo da presente invenção em que polipéptido PRO nativo se refere a pro-polipéptido PRO, pré-polipéptido PRO, prepro-polipéptido PRO ou polipéptido PRO maduro. Preferivelmente, aqui os antagonistas inibem a ligação de um polipéptido PRO nativo da presente invenção. Um "antagonista" de polipéptido PRO é uma molécula que evita, ou interfere com, uma função efectora antagonista de PRO (e.g. uma molécula que evita ou interfere com a ligação e/ou a activação de um receptor de polipéptido PRO por polipéptido PRO) . Estas moléculas podem ser rastreadas pela sua capacidade para inibir competitivamente a activação de um receptor de polipéptido PRO através da monitoração da ligação do polipéptido PRO nativo na presença e na ausência da molécula do antagonista de teste, por exemplo. Um antagonista da invenção também abrange um polinucleótido anti-sentido contra o gene do polipéptido PRO, polinucleótido anti-sentido que bloqueia a transcrição ou a tradução do gene do polipéptido PRO, inibindo assim a sua expressão e actividade biológica. 11
ΕΡ 1 205 489 /PT "Condições rigorosas" significa (1) empregar baixa força iónica e elevada temperatura para lavagem, por exemplo, cloreto de sódio 0,015M/citrato de sódio 0,0015 M/ dodecilsulfato de sódio a 0,1%, a 50°C, ou (2) empregar durante a hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (vol/vol) com albumina sérica bovina a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 nM a pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C. Outro exemplo é a utilização de formamida a 50%, 5x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0, 075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6/8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5x solução de Denhardt, ADN de esperma de salmão tratado com ultra-sons (50 μρ/ιηΐ), SDS a 0,1%, e sulfato de dextrano a 10% a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2x SSC e SDS a 0,1%. Ainda outro exemplo é a hibridação utilizando um tampão de sulfato de dextrano a 10%, 2x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida a 50% a 55°C, seguida por uma lavagem de elevado rigor consistindo em 0,lx SSC contendo EDTA a 55°C. "Condições de rigor moderado" são descritas em Sambrook et al., supra, e incluem a utilização de uma solução de lavagem e condições de hibridação (e.g., temperatura, força iónica, e % de SDS) menos rigorosas do gue as atrás descritas. Um exemplo de condições de rigor moderado é uma condição tal como incubação durante a noite a 37°C numa solução compreendendo: formamida a 20%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trissódio 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e ADN de esperma de salmão desnaturado por forças de corte a 20 mg/mL, seguida por lavagem dos filtros com lx SSC a cerca de 37-50°C. O perito na especialidade saberá como ajustar a temperatura, a força iónica, etc., conforme necessário para acomodar factores tais como o comprimento da sonda e semelhantes. II Composições e Métodos da invenção
Polipéptidos PRQ301 de comprimento completo A presente invenção proporciona polipéptidos referidos no presente pedido de patente como PRO301 para utilização em métodos de tratamento médico. Em particular, os Requerentes 12 ΕΡ 1 205 489 /PT identificaram e isolaram ADNc que codifica um polipéptido PRO301, como discutido com mais detalhes adiante nos Exemplos. Utilizando os programas de computador para alinhamento de sequências BLAST e FastA, os Requerentes verificaram que um PRO301 de sequência nativa e comprimento completo (mostrado na Figura 2 e SEQ ID NO: 2) tem uma pontuação Blast de 246 correspondente a 30% de identidade de sequência de aminoácidos com o precursor de antigénio A33 humano. Deste modo, acredita-se presentemente que o PRO301 descrito no presente pedido é um membro pela primeira vez identificado da família da proteína antigénica A33 e pode ser expresso em doenças neoplásicas humanas tais como o cancro do cólon.
Variantes de Polipéptido PRO
Em adição aos polipéptidos PRO de sequência nativa de comprimento completo aqui descritos, está contemplado que possam ser preparadas variantes do polipéptido PRO. As variantes do polipéptido PRO podem ser preparadas por introdução de alterações apropriadas de nucleótidos no ADN do polipéptido PRO, ou por síntese do polipéptido PRO desejado. Os peritos na especialidade notarão que as alterações de aminoácidos podem alterar processos pós-tradução dos polipéptidos PRO, tais como alteração do número ou posição dos locais de glicosilação ou alteração das características de ancoragem à membrana.
As variações nos polipéptidos PRO de sequência nativa de comprimento completo ou em vários domínios dos polipéptidos PRO aqui descritos, podem ser feitas, por exemplo, utilizando quaisquer das técnicas e orientações para mutações conservativas e não conservativas, apresentadas, por exemplo, na Patente N°. U.S. 5 364 934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais codões que codificam o polipéptido PRO que resulte numa alteração na sequência de aminoácidos do polipéptido PRO em comparação com o polipéptido PRO de sequência nativa. Opcionalmente a variação é a substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido num ou mais dos domínios do polipéptido PRO. Uma orientação para a determinação de qual o resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou delecionado sem afectar adversamente a actividade desejada, 13
ΕΡ 1 205 489 /PT pode ser encontrada através da comparação da sequência do polipéptido PRO com a de moléculas de proteínas homólogas conhecidas e minimizando o número de alterações na sequência de aminoácidos feitas em regiões de alta homologia. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado da substituição de um aminoácido por outro aminoácido possuindo propriedades estruturais e/ou químicas similares, tais como a substituição de uma leucina por uma serina, i.e., substituições de aminoácidos conservativas. As inserções ou deleções podem opcionalmente estar na gama de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e testando as variantes resultantes quanto à actividade no ensaio in vitro descrito nos Exemplos adiante.
As variações podem ser realizadas utilizando métodos conhecidos na arte tais como mutagénese mediada por oligonucleótidos (dirigida ao local), varrimento de alaninas, e mutagénese por PCR. A mutagénese dirigida ao local [Cárter et al. , Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], a mutagénese por cassete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], a mutagénese de selecção por restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas, podem ser realizadas sobre o ADN clonado para produzir o ADN da variante desejada de polipéptido PRO. A análise de aminoácido por varrimento pode também ser empregue para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Entre os aminoácidos para varrimento preferidos estão os aminoácidos relativamente pequenos, neutros. Estes aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido preferido para o varrimento entre este grupo pois elimina a cadeia lateral para além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante. A alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Adicionalmente, encontra-se frequentemente em posições escondidas e expostas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman 6 Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Se a 14 ΕΡ 1 205 489 /PT substituição de alaninas nao origina quantidades adequadas de variante, pode-se utilizar um aminoácido isotérico.
Modificações de Polipéptidos PRO
As modificações covalentes de polipéptidos PRO estão incluídas no âmbito da presente invenção. Um tipo de modificação covalente inclui a reacção de resíduos de aminoácido alvo do polipéptido PRO com um agente de derivatização orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos N- ou C-terminais do polipéptido PRO. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticulação de um polipéptido PRO a uma matriz ou superfície de suporte insolúvel em água para utilização no método para a purificação de anticorpos anti-polipéptido PRO, e vice-versa. Os agentes de reticulação vulgarmente utilizados incluem, e.g., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissucinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, incluindo ésteres de dissucinimidilo tais como 3,3'-ditiobis(succinimidil-propionato), maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.
Outras modificações incluem desamidação de resíduos glutaminilo e asparaginilo nos correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxilo C-terminal.
Outro tipo de modificação covalente dos polipéptidos PRO incluído no âmbito da presente invenção compreende alterar o padrão de glicosilação nativo do polipéptido. "Alterar o padrão de glicosilação nativo" significa, para os presentes fins, a deleção de uma ou mais porções hidrato de carbono encontradas num polipéptido PRO de sequência nativa e/ou a 15 ΕΡ 1 205 489 /PT adição de um ou mais locais de glicosilaçao que não estão presentes no polipéptido PRO de sequência nativa. A adição de locais de glicosilaçao no polipéptido PRO pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos. A alteração pode ser feita, por exemplo, pela adição de, ou substituição por, um ou mais residuos serina ou treonina, no polipéptido PRO de sequência nativa (para locais de glicosilação ligada a O). A sequência de aminoácidos do polipéptido PRO pode opcionalmente ser alterada através de alterações ao nível do ADN, particularmente através de mutação do ADN que codifica o polipéptido PRO em bases pré-seleccionadas tal que sejam gerados codões que se irão traduzir nos aminoácidos desejados.
Outro meio para aumentar o número de porções hidrato de carbono no polipéptido PRO é através de acoplamento químico ou enzimático de glicósidos ao polipéptido. Estes métodos estão descritos na arte, e.g., em WO 87/05330 publicado em 11 de Setembro de 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981). A remoção de porções hidrato de carbono presentes no polipéptido PRO pode ser realizada química ou enzimaticamente ou por substituição mutacional de codões que codificam para resíduos de aminoácido que servem como alvos para glicosilação. As técnicas de desglicosilação química são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al. , Anal. Biochem., 118:131 (1981) . A clivagem enzimática de porções hidrato de carbono nos polipéptidos pode ser conseguida através da utilização de uma variedade de endo-e exo-glicosidases tal como descrito por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Outro tipo de modificação covalente de polipéptidos PRO da invenção compreende a ligação do polipéptido PRO a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, e.g., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxialquilenos, da maneira apresentada nas Patentes Nos. U.S. 4 640 835; 4 496 689; 4 301 144; 4 670 417; 4 791 192 ou 4 179 337. 16
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Os polipéptidos PRO da presente invenção podem também ser modificados de maneira a formar uma molécula quimérica compreendendo um polipéptido PRO fundido com outro polipéptido heterólogo ou sequência de aminoácidos. Numa concretização, esta molécula quimérica compreende uma fusão do polipéptido PRO com um polipéptido marcador que proporciona um epitopo ao qual um anticorpo anti-marcador se pode ligar selectivamente. 0 marcador epitópico é geralmente colocado no terminal amino ou carboxilo do polipéptido PRO. A presença destas formas marcadas com um epitopo do polipéptido PRO pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipéptido marcador. Do mesmo modo, proporcionar o marcador epitópico permite que o polipéptido PRO seja prontamente purificado por purificação de afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao marcador epitópico. Numa concretização alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão do polipéptido PRO com uma imunoglobulina ou uma região particular de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica, esta fusão pode ser à região Fc de uma molécula de IgG. Vários polipéptidos marcadores e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na arte. Os exemplos incluem os marcadores poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipéptido marcador flu HA e o seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 [Evan et al., Molecular and Celular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; e o marcador glicoproteina D (gD) do vírus Herpes Slmplex e o seu anticorpo [Paborsky et al., Protein Engineerlng, 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipéptidos marcadores incluem o péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; o péptido epitopo KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um péptido epitopo a-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o marcador peptídico de proteína do gene 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)] .
Preparação de Polipéptidos PRO A descrição que se segue refere-se primeiro à produção de polipéptidos PRO por cultura de células transformada ou 17
ΕΡ 1 205 489 /PT transfectadas com um vector contendo o ácido nucleico do polipéptido PRO desejado. Está evidentemente contemplado que possam ser empregues métodos alternativos, que são bem conhecidos na arte, para preparar o polipéptido PRO. Por exemplo, a sequência do polipéptido PRO, ou suas porções, podem ser produzidas através de síntese peptídica directa utilizando técnicas de fase sólida [veja-se, e.g., Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. A síntese in vitro de proteínas pode ser realizada utilizando técnicas manuais ou por automatização. As sínteses automatizadas podem ser realizadas, por exemplo, utilizando um Sintetizador de Péptidos da Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando as instruções do fabricante. Várias porções do polipéptido PRO desejado podem ser sintetizadas quimicamente em separado e combinadas utilizando métodos químicos ou enzimáticos para produzir o polipéptido PRO de comprimento completo.
A. Isolamento de ADN que codificam polipéptidos PRO
Os ADN que codificam polipéptidos PRO podem ser obtidos a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido que se crê possuir o ARNm do polipéptido PRO desejado e expressá-lo a um nível detectável. Assim, ADN de polipéptido PRO humano pode ser obtido, convenientemente, a partir de uma biblioteca de ADNc preparada a partir de tecido humano, tal como descrito nos Exemplos. O gene que codifica o polipéptido PRO pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genómica ou por síntese de oligonucleótidos.
As bibliotecas podem ser rastreadas com sondas (tais como anticorpos contra o polipéptido PRO desejado ou oligonucleótidos de pelo menos cerca de 20-80 bases) desenhadas para identificar o gene de interesse ou a proteína por ele codificada. O rastreio da biblioteca genómica ou de ADNc com a sonda seleccionada pode ser conduzido utilizando procedimentos Standard, tal como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Um meio alternativo para isolar o gene que codifica o polipéptido PRO desejado consiste em utilizar a metodologia PCR [Sambrook et al., supra; 18
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Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Os Exemplos que se seguem descrevem técnicas para o rastreio de uma biblioteca de ADNc. As sequências oligonucleotidicas seleccionadas como sondas deverão ter um comprimento suficiente e ser suficientemente não ambiguas de modo a minimizar os falso-positivos. O oligonucleótido é preferivelmente marcado de modo a que possa ser detectado após hibridação ao ADN na biblioteca que se está a rastrear. Os métodos de marcação são bem conhecidos na arte, e incluem a utilização de radiomarcadores tais como ATP marcado com 32P, biotinilação ou marcação enzimática. As condições de hibridação, incluindo condições de rigor moderado e elevado, são proporcionadas em Sambrook et al., supra.
As sequências identificadas com estes métodos de rastreio de bibliotecas podem ser comparados e alinhadas com outras sequências conhecidas depositadas e disponíveis em bases de dados públicas tais como a GenBank ou outras bases de dados de sequências particulares. A identidade de sequências (quer ao nível dos aminoácido quer ao dos nucleótidos) no interior de regiões definidas da molécula ou ao longo da sequência de comprimento completo, pode ser determinada através do alinhamento das sequências utilizando programas de software de computador tais como BLAST, ALIGN, DNAstar e INHERIT que empregam vários algoritmos para medir a homologia. O ácido nucleico possuindo a sequência de codificação da proteína pode ser obtido através do rastreio de bibliotecas de ADNc ou genómicas seleccionadas utilizando a sequência de aminoácidos deduzida aqui descrita pela primeira vez, e, se necessário, utilizando procedimentos de alongamento de iniciadores convencionais como descrito em Sambrook et al., supra, para detectar precursores, e processando os intermediários de ARNm que podem não ter sido transcritos de modo inverso em ADNc. B. Selecção e Transformação de Células Hospedeiras
As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vectores de expressão ou de clonagem descritos aqui para a produção de polipéptidos PRO e cultivadas em meios nutrientes 19
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convencionais modificados conforme apropriado para indução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas. As condições de cultura, tais como meios, temperatura, pH e similares, podem ser seleccionadas pelo perito na especialidade sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade das culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL
Press, 1991) e Sambrook et al., supra.
São conhecidos das pessoas competentes na matéria métodos de transfecção, por exemplo, CaPC>4 e electroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas Standard apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou a electroporação, são geralmente utilizados para procariotas ou outras células que contêm barreiras de parede celular substanciais. A infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para a transformação de certas células vegetais, como descrito por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) e WO 89/05859 publicado em 29 de Junho de 1989. Para células de mamífero sem estas paredes celulares, pode ser empregue o método de precipitação com fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Aspectos gerais de transformações de sistemas hospedeiros de células de mamífero foram descritos na Patente N°. U.S. 4 399 216. As transformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et ai., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl.
Acad. Sei. (USA), 76:3829 (1979). Contudo, podem também ser utilizados outros métodos para a introdução de ADN em células, tais como por micro-injecção nuclear, electroporação, fusão de protoplastos bacterianos com células intactas ou policatiões, e.g., polibreno, poliornitina. Para várias técnicas para a transformação de células de mamífero, veja-se Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al.,
Nature, 336:348-352 (1988).
As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do ADN nos vectores incluem aqui células de procariotas, de levedura ou de eucariotas superiores. Os 20
ΕΡ 1 205 489 /PT procariotas adequados incluem, mas não se lhes limitam, eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como E. coli. Várias estirpes de E. coli estão disponíveis ao público, tais como a estirpe MM294 de E. coli K12 (ATCC 31 446); E. coli X1776 (ATCC 31 537); a estirpe W3110 de E. coli (ATCC 27 325) e K5 772 (ATCC 53 635) . Outras células hospedeiras procarióticas adequadas incluem Enterobacteriaceae tais como Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhimurium, Serratia, e.g., Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheniformis (e.g., B. licheniformis 41P revelado em DD 266 710 publicado em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aeruginosa e Streptomyces. Várias estirpes de E. coli estão disponíveis ao público, tais como a estirpe MM294 de E. coli K12 (ATCC 31 446); E. coli X1776 (ATCC 31 537); a estirpe W3110 de E. coli (ATCC 27 325); e K5 772 (ATCC 53 635). Estes exemplos são ilustrativos e não limitantes. A estirpe W3110 é um hospedeiro ou hospedeiro progenitor particularmente preferido pois é uma estirpe hospedeira comum para fermentações de produtos de ADN recombinante. Preferivelmente, a célula hospedeira segrega quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a estirpe W3110 pode ser modificada para efectuar uma mutação genética nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, incluindo os exemplos destes hospedeiros a estirpe 1A2 de E. coli W3110, que possui o genótipo completo tonA; a estirpe de 9E4 de E. coli W3110, que possui o genótipo completo tonA ptr3; a estirpe 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55 244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan; a estirpe 37D6 de E. coli W3110, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan; a estirpe 40B4 de E. coli W3110, que é a estirpe 37D6 com uma mutação de deleção de degP não resistente a canamicina; e uma estirpe de E. coli possuindo protease periplasmática mutante descrita na Patente N° . U.S. 4 946 783 concedida em 7 de Agosto de 1990. Alternativamente, são adequados métodos de clonagem in vitro, e.g., PCR ou outras reacções com ácido nucleico-polimerase.
Em adição aos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros 21
ΕΡ 1 205 489 /PT adequados para clonagem ou expressão de vectores que codificam polipéptidos PRO. A Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucariótico inferior vulgarmente utilizado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139 383 publicado em 2 de
Maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente N°. U.S. 4 943 529; Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)) tal como, e.g., K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574;
Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K. thermotolerans e K. marxianus; Yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76: 5259-5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (EP 394 538 publicado em 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, e.g., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de Janeiro de 1991) e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Cominun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984] ) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985] ). As leveduras metilotrópicas são aqui adequadas e incluem, mas não se lhes limitam, leveduras capazes de crescer em metanol seleccionadas entre os géneros que consistem em Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma listagem de espécies especificas que são exemplificativas desta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Metilotrophs, 269 (1982) .
As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipéptidos PRO glicosilados são derivadas de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluem células de insecto tais como as de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e células COS. Exemplos mais específicos incluem a linha CV1 de rim de macaco transformada 22
ΕΡ 1 205 489 /PT com SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); a linha de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980));
células de Sertoli de ratinho (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); e de tumor mamário de ratinho (MMT 060562, ATCC CCL51) . A selecção da célula hospedeira apropriada é considerada como fazendo parte das qualificações do perito na especialidade. C. Selecção e Utilização de um Vector Replicável O ácido nucleico (e.g., ADNc ou ADN genómico) que codifica um polipéptido PRO desejado pode ser inserido num vector replicável para clonagem (amplificação do ADN) ou para expressão. Vários vectores estão disponíveis ao público. O vector pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula virai ou fago. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vector através de uma variedade de procedimentos. Em geral, o ADN é inserido num local ou locais para endonucleases de restrição apropriados utilizando técnicas conhecidas na arte. Os componentes do vector geralmente incluem, mas não se lhes limitam, uma ou mais entre uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição. A construção de vectores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas Standard de ligação que são conhecidas do perito na especialidade. O polipéptido PRO de interesse pode ser produzido recombinantemente não só directamente, mas também na forma de um polipéptido de fusão com um polipéptido heterólogo, que pode ser uma sequência de sinal ou outro polipéptido possuindo um local de clivagem específico no terminal N da proteína ou polipéptido maduros. Em geral, a sequência de sinal pode ser um componente do vector, ou pode ser uma parte do ADN do polipéptido PRO que é inserida no vector. A sequência de sinal pode ser uma sequência de sinal procariótica seleccionada, por exemplo, do grupo dos comandos da fosfatase alcalina, 23
ΕΡ 1 205 489 /PT penicilinase, lpp ou enterotoxina estável ao calor II. Para secreção em leveduras a sequência de sinal pode ser, e.g., o comendo da invertase de levedura, o comando do factor alfa (incluindo os comandos do factor oc de Saccharomyces e Kluyveromyces, este último descrito na Patente N°. U.S. 5 010 182), ou o comando de fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albicans (EP 362 179 publicado em 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito em WO 90/13646 publicado em 15 de Novembro de 1990. Na expressão em células de mamífero podem ser utilizadas sequências de sinal de mamífero para dirigir a secreção da proteína, tais como sequências de sinal de polipéptidos segregados da mesma espécie ou de espécies relacionadas, bem como comandos de secreção virais.
Tanto os vectores de expressão como os de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite ao vector replicar numa ou mais células hospedeiras seleccionadas. Estas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é adequada para leveduras, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vectores de clonagem em células de mamífero.
Os vectores de expressão e de clonagem tipicamente conterão um gene de selecção, também denominado um marcador seleccionável. Os genes de selecção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos, e.g., o gene que codifica a D-alanina-racemase para Bacilli.
Um exemplo de marcadores seleccionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para assimilar o ácido nucleico do polipéptido PRO, tais como DHFR ou timidina-quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando se emprega DHFR do tipo selvagem é a linha de células de CHO deficiente em actividade de DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4216 (1980). Um gene de 24
ΕΡ 1 205 489 /PT selecção adequado para utilização em leveduras é o gene trpl presente no plasmídeo de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979);
Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trpl proporciona um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura a que falta a capacidade para crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Os vectores de expressão e de clonagem usualmente contêm um promotor operativamente ligado à sequência de ácido nucleico do polipéptido PRO para dirigir a síntese de ARNm. Promotores reconhecidos por uma variedade de potenciais células hospedeiras são bem conhecidos. Promotores adequados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores da β-lactamase e da lactose [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor do triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36 776], e promotores híbridos tais como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)]. Os promotores para utilização em sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente ligada ao ADN que codifica o polipéptido PRO desejado.
Os exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfoglicerato-quinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland,
Biochemistry, 17:4900 (1978)], tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato- isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase e glucoquinase. ao
Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para a álcool-desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas 25
ΕΡ 1 205 489 /PT metabolismo do azoto, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vectores e promotores adequados para utilização em expressão em leveduras são ainda descritos em EP 73 657. A transcrição de polipéptido PRO a partir de vectores em células hospedeiras de mamífero é controlada, por exemplo, por promotores obtidos dos genomas de vírus tais como poliomavírus, vírus fowlpox (UK 2 211 504 publicado em 5 de Julho de 1989), adenovírus (tais como Adenovírus 2), papilomavírus bovino, vírus de sarcoma avícola, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamífero, e.g., o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, e de promotores de choque térmico, desde que estes promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira. A transcrição de um ADN que codifica o polipéptido PRO desejado por eucariotas superiores pode ser aumentada por inserção de uma sequência potenciadora no vector. Os potenciadores são elementos de ADN de actuação em cis, usualmente de cerca de 10 a 300 pb, que actuam sobre um promotor para aumentar a sua transcrição. Muitas sequências potenciadoras são presentemente conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, contudo, utilizar-se-á um potenciador de um vírus de células eucarióticas. Os exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação, e potenciadores de adenovírus. O potenciador pode ser inserido por splicing no vector numa posição a 5' ou 3' da sequência de codificação do polipéptido PRO, mas está preferivelmente localizado num local a 5' do promotor.
Os vectores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (de levedura, de fungos, de insecto, vegetais, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a 26
ΕΡ 1 205 489 /PT estabilização do ARNm. Estas sequências são normalmente disponíveis a partir de regiões não traduzidas a 5' e, ocasionalmente a 3', de ADN ou ADNc eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleótidos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do ARNm que codifica os polipéptidos PRO.
Ainda outros métodos, vectores e células hospedeiras adequados para adaptação à síntese de polipéptidos PRO em cultura de células recombinantes de vertebrado, estão descritos em Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117 060; e EP 117 058. D. Detecção de Amplificação/Expressão de Genes A amplificação e/ou expressão de genes pode ser medida numa amostra directamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda apropriadamente marcada, com base nas sequências aqui proporcionadas. Alternativamente, podem ser empregues anticorpos que podem reconhecer dúplices específicas, incluindo dúplices de ADN, dúplices de ARN, e dúplices híbridas de ADN-ARN ou dúplices de ADN-proteína. Os anticorpos por sua vez podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado quando a dúplice está ligada a uma superfície, de modo a que, por formação da dúplice na superfície, a presença de anticorpo ligado à dúplice possa ser detectada. A expressão dos genes, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tais como coloração imuno-histoquímica de células ou secções de tecidos e ensaio da cultura celular ou fluidos corporais, para quantificar directamente a expressão do produto do gene. Os anticorpos úteis para coloração imuno-histoquímica e/ou ensaio de fluidos de amostra podem ser monoclonais ou policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipéptido PRO de sequência nativa ou contra um péptido sintético baseado nas sequências de ADN aqui proporcionadas ou contra uma sequência 27
ΕΡ 1 205 489 /PT exógena fundida com ADN de um polipéptido PRO e que codifica um epitopo especifico do anticorpo. E. Purificação do Polipéptido
As formas de polipéptidos PRO podem ser recuperadas do meio de cultura ou de lisados da célula hospedeira. Se estiverem ligados à membrana, podem ser libertados da membrana utilizando uma solução detergente adequada (e.g. Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. As células empregues na expressão de polipéptidos PRO podem ser submetidas a ruptura por vários meios físicos ou químicos, tais como ciclos de congelação-descongelação, tratamentos com ultra-sons, ruptura mecânica ou agentes de lise celular.
Pode ser desejado purificar os polipéptidos PRO de proteínas ou polipéptidos celulares recombinantes. Os procedimentos seguintes são exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: por fraccionamento numa coluna de permuta iónica; precipitação com etanol; HPLC de fase inversa; cromatografia em sílica ou numa resina de permuta catiónica tal como DEAE; cromatofocagem; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amónio; filtração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de Sepharose-proteína A para remover contaminantes tais como IgG; e colunas quelantes de metais para ligar formas marcadas com epitopo ao polipéptido PRO. Vários métodos de purificação de proteínas podem ser empregues e estes métodos são conhecidos na arte e são descritos por exemplo em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990);
Scopes, Protein Purification: Principies and Practice,
Springer-Verlag, New York (1982). 0(s) passo(s) de purificação seleccionados dependerão, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do polipéptido PRO particular produzido.
Utilizações para os Polipéptidos PRO
As sequências nucleotídicas (ou seu complemento) que codificam os polipéptidos PRO da presente invenção têm várias aplicações na arte da biologia molecular, incluindo utilizações como sondas de hibridação, em mapeamento de cromossomas e genes e na produção de ADN e ARN anti-sentido. O 28 ΕΡ 1 205 489 /PT ácido nucleico que codifica o polipéptido PRO será também útil para a preparação de polipéptidos PRO através das técnicas recombinantes aqui descritas. O ácido nucleico que codifica o polipéptido PRO de sequência nativa de comprimento completo ou suas porções, pode ser utilizado como sondas de hibridação para uma biblioteca de ADNc para isolar o gene do polipéptido PRO de comprimento completo ou para isolar ainda outros genes (por exemplo, os que codificam variantes de ocorrência natural do polipéptido PRO ou polipéptidos PRO de outras espécies) que possuam uma identidade de sequências desejada com as sequências de ácido nucleico do polipéptido PRO. Opcionalmente, o comprimento das sondas será de cerca de 20 a cerca de 50 bases. As sondas de hibridação podem ser derivadas da sequência nucleotidica de qualquer das moléculas de ADN aqui descritas ou a partir de sequências genómicas incluindo promotores, elementos potenciadores e intrões de ADN que codifica o polipéptido PRO de sequência nativa. A titulo de exemplo, um método de rastreio compreenderá o isolamento da região de codificação do gene do polipéptido PRO utilizando a sequência de ADN conhecida para sintetizar uma sonda seleccionada de cerca de 40 bases. As sondas de hibridação podem ser marcadas através de uma variedade de marcadores, incluindo radionucleótidos tais como 32P ou 35S, ou marcadores enzimáticos tais como fosfatase alcalina acoplada à sonda através de sistemas de acoplamento avidina/biotina. As sondas marcadas possuindo uma sequência complementar à do gene do polipéptido PRO específico da presente invenção podem ser utilizadas para o rastreio de bibliotecas de ADNc, ADN genómico ou ARNm humanos para determinar que membros destas bibliotecas hibridam com a sonda. As técnicas de hibridação são descritas com mais detalhes nos Exemplos que se seguem.
Os EST revelados no presente pedido de patente podem de modo semelhante ser empregues como sondas, utilizando os métodos aqui revelados.
As sondas podem também ser empregues em técnicas de PCR para produzir um conjunto de sequências para identificação de sequências de polipéptidos PRO estreitamente relacionadas. 29
ΕΡ 1 205 489 /PT
As sequências nucleotídicas que codificam um polipéptido PRO podem também ser utilizadas para construir sondas de hibridação para mapeamento do gene que codifica esse polipéptido PRO e para a análise genética de indivíduos com desordens genéticas. As sequências nucleotídicas aqui proporcionadas podem ser mapeadas num cromossoma e regiões específicas de um cromossoma utilizando técnicas conhecidas, tais como hibridação in situ, análise de ligações contra marcadores cromossómicos conhecidos e rastreio de hibridação com bibliotecas. O polipéptido PRO pode ser utilizado em ensaios para identificar os seus ligandos. De modo semelhante, podem ser identificados inibidores da interacção de ligação receptor/ligando. As proteínas envolvidas nestas interacções de ligação podem também ser utilizadas para o rastreio de inibidores peptídicos ou de molécula pequena ou agonistas da interacção de ligação. Os ensaios de rastreio podem ser desenhados para encontrar compostos pivot que imitam a actividade biológica de um polipéptido PRO nativo ou um ligando para o polipéptido PRO. Estes ensaios de rastreio incluirão ensaios susceptíveis de rastreio de alto rendimento de bibliotecas químicas, tornando-os particularmente adequados para identificar pequenas moléculas de droga candidatas. As pequenas moléculas contempladas incluem compostos sintéticos, orgânicos ou inorgânicos. Os ensaios podem ser realizados numa variedade de formatos, incluindo ensaios de ligação proteína-proteína, ensaios de rastreio bioquímicos, imunoensaios e ensaios à base de células, que estão bem caracterizados na arte.
Os ácido nucleicos que codificam um polipéptido PRO ou suas formas modificadas podem também ser utilizados para gerar animais transgénicos ou animais "knock out" que, por sua vez, são úteis no desenvolvimento e rastreio de reagentes terapeuticamente úteis. Um animal transgénico (e.g., um ratinho ou um rato) é um animal possuindo células que contêm um transgene, transgene este que foi introduzido no animal ou num antecessor do animal numa etapa pré-natal, e.g., embrionária. Um transgene é um ADN que está integrado no genoma de uma células a partir da qual se desenvolve um animal transgénico. Numa concretização, o ADNc que codifica um 30
ΕΡ 1 205 489 /PT polipéptido PRO de interesse pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica o polipéptido PRO de acordo com técnicas estabelecidas e as sequências genómicas utilizadas para gerar animais transgénicos que contêm células que expressam ADN que codifica o polipéptido PRO. Os métodos para gerar animais transgénicos, particularmente animais tais como ratinhos ou ratos, tornaram-se convencionais na arte e estão descritos, por exemplo, nas Patentes Nos. U.S. 4 736 866 e 4 870 009. Tipicamente, células particulares seriam alvos para incorporação de transgenes do polipéptido PRO com potenciadores específicos do tecido. Os animais transgénicos que incluem uma cópia de um transgene que codifica um polipéptido PRO introduzido na linha germinal do animal numa etapa embrionária podem ser utilizados para examinar o efeito de expressão aumentada de ADN que codifica o polipéptido PRO. Estes animais podem ser utilizados como animais de teste para reagentes que se pensa conferirem protecção contra, por exemplo, condições patológicas associadas à sua super-expressão. De acordo com esta faceta da invenção, um animal é tratado com o reagente e uma incidência reduzida da condição patológica, em comparação com animais não tratados portadores do transgene, indicaria uma potencial intervenção terapêutica para a condição patológica.
Alternativamente, podem-se utilizar homólogos não humanos de polipéptidos PRO para construir um animal "knock out" num polipéptido PRO que possui um gene que codifica o polipéptido PRO de interesse defectivo ou alterado em resultado de recombinação homóloga entre o gene endógeno que codifica o polipéptido PRO e ADN genómico alterado que codifica o polipéptido PRO introduzido numa célula embrionária do animal. Por exemplo, ADNc que codifica um polipéptido PRO pode ser utilizado para clonar ADN genómico que codifica o polipéptido PRO de acordo com técnicas estabelecidas. Uma porção do ADN genómico que codifica um polipéptido PRO pode ser eliminada ou substituída por outro gene, tal como um gene que codifica um marcador seleccionável que pode ser utilizado para monitorar a integração. Tipicamente, são incluídas no vector vários quilobases de ADN flanqueador inalterado (tanto na extremidade 5' como na 3') [veja-se e.g., Thomas e Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para uma descrição de vectores de recombinação homóloga]. O vector é introduzido numa linha de células 31
ΕΡ 1 205 489 /PT estaminais embrionárias (e.g., por electroporação) e as células em que o ADN introduzido sofreu recombinação homóloga com o ADN endógeno são seleccionadas [veja-se e.g., Li et al., Cell, 62:915 (1992)]. As células seleccionadas são então injectadas num blastocisto de um animal (e.g., um ratinho ou um rato) para formar quimeras de agregação [veja-se e.g., Bradley, em Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Um embrião quimérico pode então ser implantado num animal hospedeiro fêmea pseudo-grávida adequado e o embrião é levado a termo para criar um animal "knock out". A progénie portadora do ADN fruto da recombinação homóloga nas suas células germinais pode ser identificada por técnicas Standard e utilizada para criar animais em que todas as células do animal contêm o ADN fruto da recombinação homóloga. Os animais knockout podem ser caracterizados por exemplo, pela sua capacidade de se defender contra certas condições patológicas e pelo desenvolvimento de condições patológicas devido à ausência do polipéptido PRO. 0 PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) tem uma pontuação Blast de 246 e 30% de homologia nos resíduos 24 a 282 da Figura 44, com A33_HUMAN, um precursor do antigénio A33. O precursor do antigénio A33, como explicado nos Antecedentes, é um antigénio específico de tumores e, como tal, é um reconhecido marcador e alvo terapêutico para o diagnóstico e tratamento de cancro do cólon. A expressão de antigénios específicos de tumores é frequentemente associada com a progressão de desordens de tecido neoplásico. 0 PRO301 nativo (SEQ ID N0:2) e o A33_HUMAN apresentam também uma pontuação Blast de 245 e 30% de homologia nos resíduos 21 a 282 da Fig. 44 com A33_HUMAN, sendo a variação dependente de como os espaços são inseridos nas sequências em comparação. O PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) tem também uma pontuação Blast de 165 e 29% de homologia nos resíduos 60 a 255 da Fig. 2 com HS46KDA_1, uma proteína receptora de adenovírus ou coxsackie humano, também conhecida como proteína da superfície celular HCAR. Esta região de PRO301 apresenta também uma pontuação Blast e homologia similares com HSU90716_1. A expressão destas proteínas está usualmente associada com infecção virai e podem desse modo ser concebidas terapêuticas para a prevenção dessa infecção. Como 32 ΕΡ 1 205 489 /PT mencionado nos Antecedentes, a expressão de receptores virais está frequentemente associada a tumores neoplásicos.
Anticorpos Anti-Polipéptido PRO A presente invenção proporciona ainda anticorpos anti-polipéptido PRO. Exemplos de anticorpos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecificos e heteroconjugados. A. Anticorpos policlonais
Os anticorpos anti-polipéptido PRO podem compreender anticorpos policlonais. Os métodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos dos peritos na especialidade. Os anticorpos policlonais podem ser criados num mamífero, por exemplo, através de uma ou mais injecções de um agente imunizante e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente imunizante e/ou adjuvante serão injectados no mamífero por múltiplas injecções subcutâneas ou intraperitoneais. O agente imunizante pode incluir o polipéptido PRO ou uma sua proteína de fusão. Pode ser útil conjugar o agente imunizante com uma proteína que sabe ser imunogénica no mamífero a imunizar. Os exemplos destas proteínas imunogénicas incluem, mas não se lhes limitam, hemocianina de lapa do género Fissurela, albumina sérica, tiroglobulina bovina e inibidor da tripsina de soja. Os exemplos de adjuvantes que podem ser empregues incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil-Lípido A, dicorinomicolato de trealose sintético). O protocolo de imunização pode ser seleccionado pelos peritos na especialidade sem experimentação indevida. B. Anticorpos monoclonais
Os anticorpos anti-polipéptido PRO podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando métodos de hibridomas, tais como os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975). Num método de hibridoma, um ratinho, um hamster ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com um agente imunizante para eliciar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos 33 ΕΡ 1 205 489 /PT que se irão ligar especificamente ao agente imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. O agente imunizante tipicamente incluirá o polipéptido PRO de interesse ou uma sua proteína de fusão. Geralmente, são utilizados linfócitos de sangue periférico ("PBL") se forem desejadas células de origem humana, ou células do baço ou células de nódulos linfáticos se forem desejadas fontes de mamífero não humano. Os linfócitos são então fundidos com uma linha de células imortalizada utilizando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. As linhas de células imortalizadas são usualmente transformadas em células de mamífero, particularmente células de mieloma de origem em roedor, bovinas e humanas. Usualmente, são empregues linhas de células de mieloma de rato ou ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas, não fundidas. Por exemplo, se as células progenitoras não possuírem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"), substâncias estas que evitam o crescimento de células deficientes em HGPRT.
As linhas de células imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam expressão estável e a nível elevado de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo seleccionadas, e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. As linhas de células imortalizadas mais preferidas são linhas de mieloma murino, que podem ser obtidas, por exemplo, no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia e na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. As linhas de células de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Mareei Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]. 34
ΕΡ 1 205 489 /PT Ο meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas pode ser então ensaiado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra o polipéptido PRO de interesse. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio imunoabsorvente com enzima ligada (ELISA). Estas técnicas e ensaios são conhecidos na arte. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchard de Munson e Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).
Depois de identificadas as células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitante e crescidos através de métodos Standard [Goding, supra] . Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas in vivo na forma de ascites num mamífero.
Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou do fluído ascítico por procedimentos de purificação de imunoglobulinas convencionais tais como, por exemplo, cromatografia em proteína A-Sepharose, hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.
Os anticorpos monoclonais podem também ser preparados por métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na Patente N° . U.S. 4 816 567. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (e.g., utilizando sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos de murino). As células de hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida deste ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras tais como células COS de símio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos 35
ΕΡ 1 205 489 /PT monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O ADN também pode ser modificado, por exemplo, substituindo a sequência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos em vez das sequências homóloqas de murino [Patente N°. U.S. 4 816 567; Morrison et al., supra] ou unindo covalentemente à sequência de codificação da imunoglobulina a totalidade ou parte da sequência de codificação para um polipéptido que não uma imunoglobulina. Este polipéptido que não uma imunoglobulina pode substituir os domínios constantes de um anticorpo da invenção, ou pode substituir os domínios variáveis de um local de combinação com o antigénio de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.
Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Os métodos para a preparação de anticorpos monovalentes são bem conhecidos na arte. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante de cadeia leve e cadeia pesada modificada de imunoglobulina. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto na região Fc de modo a prevenir a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisterna relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido ou são eliminados de modo a evitar a reticulação.
Os métodos in vitro são também adequados para a preparação de anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir os seus fragmentos, particularmente, fragmentos Fab, pode ser conseguida utilizando técnicas de rotina conhecidas na arte. C. Anticorpos humanizados
Os anticorpos anti-polipéptido PRO da invenção podem ainda compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. As formas humanizadas de anticorpos não humanos (e.g., murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação ao antigénio de anticorpos) que contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Os anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do 36
ΕΡ 1 205 489 /PT receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato ou coelho possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não se encontram nem no anticorpo receptor nem nas sequências CDR ou de estrutura importadas. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado optimamente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente a de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)] .
Os métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na arte. Geralmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácido nele introduzidos, de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácido não humanos são muitas vezes referidos como resíduos "importados", que são tipicamente tomados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], substituindo por CDR ou sequências de CDR de roedor as correspondentes sequências de um anticorpo humano. Assim, estes anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente N° . U.S. 4 816 567), em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos da CDR e possivelmente alguns resíduos da FR são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedor. 37
ΕΡ 1 205 489 /PT
Os anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na arte, incluindo bibliotecas de exibição em fagos [Hoogenboom e Winter, J. Mol.
Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J.
Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. D. Anticorpos biespecíficos
Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferivelmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois diferentes antigénios. No presente caso, uma das especificidades de ligação é para o polipéptido PRO, a outra é para qualquer outro antigénio, e preferivelmente para uma proteína da superfície celular ou um receptor ou uma subunidade de receptor.
Os métodos para preparar anticorpos biespecíficos são conhecidos na arte. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas possuem diferentes especificidades [Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Devido ao arranjo aleatório de cadeias pesadas e leves de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma potencial mistura de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correcta. A purificação da molécula correcta é usualmente realizada por passos de cromatografia de afinidade. Procedimentos semelhantes são revelados em WO 93/08829, publicado em 13 de Maio de 1993, e em Traunecker et al. , EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) .
Os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) podem ser fundidos com sequências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão é preferivelmente com um domínio constante de cadeia pesada de 38
ΕΡ 1 205 489 /PT imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões charneira, CH2 e CH3 regiões. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) contendo o local necessário para a ligação da cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os ADN gue codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados, e são co-transfectados para um organismo hospedeiro adeguado. Para mais detalhes quanto à produção de anticorpos biespecificos veja-se, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). E. Anticorpos Heteroconjugados
Os anticorpos heteroconjugados estão também no âmbito da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos unidos covalentemente. Estes anticorpos foram, por exemplo, propostos para direccionar células do sistema imunitário para células indesejadas [Patente N°. U.S. 4 676 980], e para o tratamento de infecção por HIV [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Está contemplado que os anticorpos possam ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química da síntese de proteínas, incluindo os que envolvem agentes de reticulação. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas utilizando uma reacção de permuta de dissulfureto ou formando uma ligação tioéter. Os exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e os discutidos, por exemplo, na Patente N°. U.S. 4 676 980.
Utilizações para Anticorpos Anti-Polipéptido Pro
Os anticorpos anti-polipéptido PRO da invenção têm várias utilidades. Por exemplo, os anticorpos anti-polipéptido PRO podem ser utilizados em ensaios de diagnóstico para um polipéptido PRO, e.g., detectando a sua expressão em células, tecidos ou soro específicos. Podem ser utilizadas várias técnicas de ensaio de diagnóstico conhecidas na arte, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche directos ou indirectos e ensaios de imunoprecipitação conduzidos quer em fase heterogénea quer em homogénea [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158]. Os anticorpos utilizados nos ensaios de 39
ΕΡ 1 205 489 /PT diagnóstico podem ser marcados com uma porção detectável. A porção detectável deverá ser capaz de produzir, quer directa quer indirectamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32 35 125 P, S ou I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceina, rodamina ou luciferina, ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de rábano. Qualquer método conhecido na arte para a conjugação do anticorpo à porção detectável pode ser empregue, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al. , Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al. , J. Immunol.
Meth., 40:219 (1981); e Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982) .
Os anticorpos anti-polipéptido PRO também são úteis para a purificação por afinidade do polipéptido PRO a partir de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes. Neste processo, os anticorpos contra o polipéptido PRO são imobilizados num suporte adequado, tal como resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na arte. O anticorpo imobilizado é depois colocado em contacto com uma amostra contendo o polipéptido PRO a purificar, e posteriormente o suporte é lavado com um solvente adequado que irá remover substancialmente todo o material na amostra excepto o polipéptido PRO, que está ligado ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado que irá libertar o polipéptido PRO do anticorpo. O PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) tem uma pontuação Blast de 246 e 30% de homologia nos resíduos 24 a 282 da Fig. 2 com A33_HUMAN, um precursor do antigénio A33. O precursor do antigénio A33, como explicado nos Antecedentes, é um antigénio específico de tumores e, como tal, é um reconhecido marcador e alvo terapêutico para o diagnóstico e tratamento de cancro do cólon. A expressão de antigénios específicos de tumores está frequentemente associada à progressão de desordens de tecido neoplásico. O PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) e o A33_HUMAN apresentam também uma pontuação Blast de 245 e 30% de homologia nos resíduos 21 a 282 da Fig. 2, com A33_HUMAN, sendo a variação dependente de como são inseridos espaços nas sequências em comparação. O PRO301 nativo (SEQ ID NO:2) tem 40
ΕΡ 1 205 489 /PT também uma pontuação Blast de 165 e 29% de homologia nos resíduos 60 a 255 da Fig. 2 com HS46KDA_1, uma proteína receptora de adenovírus e coxsackie humano, também conhecido como proteína da superfície celular HCAR. Esta região de PRO301 apresenta também uma pontuação Blast e homologia similares com HSU90716_1. A expressão destas proteínas está usualmente associada com infecção virai e deste modo podem ser concebidas terapêuticas para a prevenção desta infecção. Deste modo, anticorpos e receptores para os antigénios atrás identificados têm potencial terapêutico como técnicas de diagnóstico e de tratamento.
Antigénios específicos ou associados ao cancro permitem a criação de anticorpos monoclonais (mAb) específicos para um tumor ou um cancro que são específicos para esses antigénios tumorais. Estes mAb, que podem distinguir entre células normais e cancerosas são úteis no diagnóstico, prognóstico e tratamento da doença.
Os anticorpos monoclonais (mAb) específicos para um cancro que são específicos para antigénios tumorais. Estes mAb, que podem distinguir entre células normal e cancerosas são úteis no diagnóstico, prognóstico e tratamento da doença. Conhecem-se antigénios particulares associados a doenças neoplásicas, tais como cancro colorrectal e da mama. Como o cancro do cólon é uma doença muito disseminada, o diagnóstico e o tratamento precoces são importantes objectivos médicos. O diagnóstico e o tratamento do cancro podem ser implementados utilizando anticorpos monoclonais (mAb) para eles específicos possuindo marcadores fluorescentes, magnético-nucleares ou radioactivos. Os mAb marcados com genes radioactivos, toxinas e/ou drogas podem ser utilizados para o tratamento in situ com uma descrição mínima do paciente.
Os exemplos que se seguem são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção de nenhum modo.
EXEMPLOS
Os reagentes disponíveis no comércio referidos nos exemplos foram utilizados conforme as instruções do fabricante a menos que indicado de outro modo. A fonte das células 41
ΕΡ 1 205 489 /PT identificadas nos exemplos que se seguem, e em todo o fascículo, pelos números de acesso ATCC é a American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. EXEMPLO 1: Rastreio de homologia de domínios extracelulares para identificar novos polipéptidos e ADNc que os codifica
As sequências do domínio extracelular (ECD) (incluindo a sequência de sinal de secreção, se existir) de cerca de 950 proteínas segregadas conhecidas da base de dados pública Swiss-Prot, foram utilizadas para a pesquisa de bases de dados de EST. As bases de dados de EST incluíam bases de dados públicas (e.g., Dayhoff, GenBank), e bases de dados particulares (e.g. LIFESEQ™, Incyte Pharmaceuticals, Paio Alto, CA) . A pesquisa foi realizada utilizando o programa de computador BLAST ou BLAST2 (Altschul, e Gish, Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996); http://blast.wust1/edu/blast/README.html) na forma de uma comparação das sequências de proteínas ECD com uma tradução através de "6 frame translation" das sequências de EST. Estas comparações com uma pontuação Blast de 70 (ou em alguns casos de 90) ou mais que não codificavam proteínas conhecidas foram agrupadas e montadas em sequências de ADN de consenso com o programa "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; (http://bozeman.mbt.Washington.edu/phrap.does/phrap.html).
Utilizando este rastreio de homologia de domínios extracelulares, as sequências de ADN de consenso foram montadas relativamente às outras sequências EST identificadas. Em adição, as sequências de ADN de consenso obtidas foram muitas vezes (mas nem sempre) alongadas utilizando ciclos repetidos de BLAST e phrap para alongar a sequência de consenso tanto quanto possível utilizando as fontes de sequências EST atrás discutidas.
Com base nas sequências de consenso obtidas como descrito atrás, os oligonucleótidos foram então sintetizados e utilizados para identificar por PCR uma biblioteca de ADNc que continha a sequência de interesse e para utilização como sondas para isolar um clone da sequência de codificação de comprimento completo para um polipéptido PRO. Os iniciadores directo (.f) e inverso (.r) de PCR geralmente variam de 20 a 42
ΕΡ 1 205 489 /PT 30 nucleótidos e são muitas vezes desenhados para originar um produto de PCR de cerca de 100-1000 pb de comprimento. As sequências da sonda (.p) têm tipicamente 40-55 pb de comprimento. Em alguns casos, são sintetizados oligonucleótidos adicionais quando a sequência de consenso é superior a cerca de 1-1,5 kpb. De modo a efectuar o rastreio de várias bibliotecas quanto a um clone de comprimento completo, o ADN das bibliotecas foi rastreado por amplificação por PCR, seguindo Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, com o par de iniciadores de PCR. Foi então utilizada uma biblioteca positiva para isolar clones que codificam o gene de interesse utilizando a sonda oligonucleotídica e um dos pares de iniciadores.
As bibliotecas de ADNc utilizadas para isolar os clones de ADNc foram construídas por métodos Standard utilizando reagentes disponíveis no comércio tais como os da Invitrogen, San Diego, CA. O ADNc foi iniciado com oligo dT contendo um local NotI, ligado com extremidades lisas a adaptadores tratados com hemiquinase Sail, clivado com NotI, apropriadamente dimensionado por electroforese em gel, e clonado num orientação definida num vector de clonagem adequado (tal como pRKB ou pRKD; pRK5B é um precursor de pRK5D que não contêm o local Sfi I site; veja-se, Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) nos locais únicos Xhol e NotI. EXEMPLO 2: Isolamento de clones de ADNc que codificam PRQ301 humano A sequência de ADN de consenso designada por DNA35936 foi montada utilizando phrap como descrito no Exemplo 1 anterior. Com base nesta sequência de consenso sintetizaram-se oligonucleótidos: 1) para identificar por PCR uma biblioteca de ADNc que continha a sequência de interesse, e 2) para utilizar como sondas para isolar um clone da sequência de codificação de comprimento completo.
Para pesquisar várias bibliotecas quanto a uma fonte de um clone de comprimento completo, pesquisou-se o ADN das bibliotecas por amplificação por PCR com o par de iniciadores de PCR abaixo identificado. Utilizou-se depois uma biblioteca positiva para isolar clones que codificam o gene PRO301 43 ΕΡ 1 205 489 /PT utilizando o oligonucleótido sonda e um dos iniciadores de PCR. O ARN para a construção das bibliotecas de ADNc foi isolado de rim fetal humano.
Sequenciou-se um clone de ADNc na sua totalidade. A sequência de nucleótidos de comprimento completo da sequência nativa de PRO301 está apresentada na Figura 1 (SEQ ID NO:l). O clone DNA40628-1216 contém um único enquadramento de leitura aberto com um aparente local de iniciação da tradução nas posições de nucleótidos 52-54 (Fig. 1, SEQ ID N0:1). 0 precursor do polipéptido previsto tem 299 aminoácidos de comprimento com um peso molecular previsto de 32 583 daltons e um pi de 8,29. O clone DNA40628-1216 foi depositado na ATCC e foi-lhe atribuído o n°. de depósito ATCC 209432.
Com base numa análise de alinhamento de sequências BLAST e FastA da sequência de comprimento completo, o PRO301 apresenta identidade de sequência de aminoácidos com o precursor do antigénio A33 (33%) e a com proteína receptora de adenovírus e coxsackie (29%).
As sequências oligonucleotídicas utilizadas no procedimento anterior foram as seguintes: 5'-TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC-3' (SEQ ID NO:3.) OLI2162 (35936.fl) OLI2163 (35936.pl) 5'-TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT-3' (SEQ ID NO:4) OLI2164 (35936.f2) 5'-ACACCTGGTTCAAAGATGGG-3' (SEQ ID NO:5) OLI2165 (35936.rl) 5'-TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG-3' (SEQ ID NO:6) OLI2166 (35936.f3) 5'-TTGCC7TACTCAGGTGCTAC-3- (SEQ ID NO:7) OLI2167 C35936.r2) 5'-ACTCAGCAGTGGTKGGAAAG-3'(SEQ ID NO:8). EXEMPLO 3: Utilização de ácido nucleico que codifica polipéptido PRO como sondas de hibridação O método seguinte descreve a utilização de uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido PRO como uma sonda de hibridação. 44
ΕΡ 1 205 489 /PT ADN compreendendo a sequência de codificação de um polipéptido PRO de interesse conforme aqui descrito pode ser empregue como sonda ou utilizado como base a partir da qual se prepararam sondas para o rastreio de ADN homólogos (tais como os que codificam variantes de ocorrência natural do polipéptido PRO) em bibliotecas de ADNc de tecido humano ou bibliotecas genómicas de tecido humano. A hibridação e a lavagem de filtros contendo ADN das bibliotecas são realizadas sob as seguintes condições de elevado rigor. A hibridação da sonda derivada do ácido nucleico que codifica o polipéptido PRO radiomarcada aos filtros é realizada numa solução de formamida a 50%, 5x SSC, SDS a 0,1%, pirofosfato de sódio a 0,1%, fosfato de sódio 50 mM, pH 6,8, 2x Solução de Denhardt e sulfato de dextrano a 10%, a 42°C durante 20 horas. A lavagem dos filtros é realizada numa solução aquosa de 0,lx SSC e SDS a 0,1%, a 42 °C.
Os ADN possuindo uma identidade de sequências desejada com o ADN que codifica o polipéptido PRO de comprimento completo de sequência nativa podem então ser identificados utilizando técnicas Standard conhecidas na arte. EXEMPLO 4: Expressão de Polipéptidos PRO em E. coli
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma não glicosilada de um polipéptido PRO desejado por expressão recombinante em E. coli. A sequência de ADN que codifica o polipéptido PRO desejado é inicialmente amplificada utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores deverão conter locais para enzimas de restrição que correspondem aos locais para enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado. Pode ser empregue uma variedade de vectores de expressão. Um exemplo de um vector adequado é o pBR322 (derivado de E. coli; veja-se Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contém genes para resistência a ampicilina e a tetraciclina. O vector é digerido com enzimas de restrição e desfosforilado. As sequências amplificadas por PCR são então ligadas ao vector. O vector incluirá preferivelmente sequências que codificam para um gene 45 ΕΡ 1 205 489 /PT de resistência a antibiótico, um promotor trp, um comando poli-his (incluindo os primeiros seis codões de STII, a sequência poli-his e o local de clivagem para a enteroquinase), a região de codificação especifica do polipéptido PRO, o terminador de transcrição lambda e um gene argU. A mistura de ligação é então utilizada para transformar uma estirpe de E. coli seleccionada utilizando os métodos descritos em Sambrook et al., supra. Os transformantes são identificados pela sua capacidade para crescer em placas LB e as colónias resistentes ao antibiótico são então seleccionadas. O ADN plasmidico pode ser isolado e confirmado por análise de restrição e sequenciação do ADN.
Os clones seleccionados podem ser crescidos durante a noite em meio de cultura liquido tal como caldo LB suplementado com antibióticos. A cultura da noite pode subsequentemente ser utilizada para inocular uma cultura em maior escala. As células são então crescidas até uma densidade óptica desejada, durante o que o promotor de expressão é activada.
Após cultura das células durante mais várias horas, as células podem ser recolhidas por centrifugação. A pelete celular obtida na centrifugação pode ser solubilizada utilizando vários agentes conhecidos na arte, e o polipéptido PRO solubilizado pode então ser purificado utilizando uma coluna quelante de metais sob condições que permitam uma forte ligação da proteína. O PRO301 foi expresso com sucesso em E. coli numa forma marcada com poli-His utilizando o procedimento seguinte. O ADN que codifica PRO301 foi inicialmente amplificado utilizando iniciadores de PCR seleccionados. Os iniciadores continham locais para enzimas de restrição que correspondem aos locais para enzimas de restrição no vector de expressão seleccionado, e outras sequências úteis que proporcionam uma iniciação da tradução eficiente e fiável, purificação rápida numa coluna quelante de metais e remoção proteolítica com enteroquinase. As sequências marcadas com poli-His, amplificadas por PCR, foram então ligadas num vector de expressão, que se utilizou
ΕΡ 1 205 489 /PT 4 6 para transformar um hospedeiro E. coli baseado na estirpe 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq). Os transformantes foram primeiro crescidos em LB contendo carbenicilina a 50 mg/ml a 30°C com agitação até se atingir uma D.O. 600 de 3-5. As culturas foram então diluídas 50-100 vezes para meio CRAP (preparado misturando 3,57 g de (NH4) 2S04, 0,71 g de citrato de sódio*2H20, 1, 07 g de KC1, 5,36 g de extracto de levedura Difco, 5,36 g de hicase SF Sheffield em 500 mL de água, bem como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucose a 0,55% (p/v) e MgS04 7 mM) e crescidas durante aproximadamente 20-30 horas a 30 °C com agitação. Removeram-se as amostras para verificar a expressão por análise SDS-PAGE, e centrifugou-se a cultura em bruto numa pelete de células.
Congelaram-se as peletes de células até à purificação e redobragem. A pasta de E. coli das fermentações de 0,5 a 1 L (peletes de 6-10 g) foi ressuspensa em 10 volumes (p/v) em tampão de guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Adiciona-se sulfureto de sódio sólido e tetrationato de sódio para perfazer concentrações finais de 0,1 M e 0,02 M, respectivamente, e agitou-se a solução durante a noite a 4°C. Deste passo resulta uma proteína desnaturada com todos os resíduos cisteína bloqueados por sulfitolização. A solução foi centrifugada a 40 000 rpm numa Ultracentífuga Beckman durante 30 min. Diluiu-se o sobrenadante com 3-5 volumes de tampão da coluna de quelato de metal (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) e filtrou-se através de filtros de 0,22 micra para clarificar. Dependendo do extracto clarificado foi carregado numa coluna de quelato de metal Ni-NTA de 5 ml da Qiagen equilibrada com o tampão da coluna de quelato de metal. A coluna foi lavada com tampão adicional contendo imidazole 50 mM (Calbiochem, qualidade Utrol), pH 7,4. A proteína foi eluída com tampão contendo imidazole 250 mM. As fracções contendo a proteína desejada foram reunidas e armazenadas a 4°C. A concentração de proteína foi estimada pela sua absorvância a 280 nm utilizando o coeficiente de extinção calculado com base na sua sequência de aminoácidos.
As proteínas foram redobradas por diluição lenta da amostra com tampão de redobragem recentemente preparado consistindo em: Tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, ureia 2,5 M, 47
ΕΡ 1 205 489 /PT cisteína 5 mM, glicina 20 mM e EDTA 1 mM. Os volumes de redobragem foram escolhidos de modo a gue a concentração final de proteína estivesse entre 50 e 100 microgramas/ml. A solução de redobragem foi agitada suavemente a 4°C durante 12-36 horas. A reacção de redobragem foi extinta por adição de TFA até uma concentração final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes de mais purificação da proteína, a solução foi filtrada através de um filtro de 0,22 micra e foi adicionado acetonitrilo até uma concentração final de 2-10%. A proteína redobrada foi cromatografada numa coluna de fase inversa Poros Rl/H utilizando um tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição com um gradiente de acetonitrilo de 10 a 80%. Analisaram-se alíguotas de fracções com absorvância A280 em géis de SDS-poliacrilamida e as fracções contendo proteína redobrada homogénea foram reunidas. Geralmente, as espécies correctamente redobradas da maior parte das proteínas são eluídas com as concentrações mais baixas de acetonitrilo pois essas espécies são as mais compactas com os seus interiores hidrófobos escudados da interacção com a resina da fase inversa. As espécies agregadas são usualmente eluídas com concentrações de acetonitrilo superiores. Em adição à separação de formas mal dobradas das proteínas da forma desejada, o passo de fase inversa também remove endotoxina das amostras.
As fracções que contêm a proteína PRO301 dobrada, desejada, foram reunidas e o acetonitrilo foi removido utilizando uma corrente suave de azoto dirigida para a solução. As proteínas foram formuladas em Hepes 20 mM, pH 6,8 com cloreto de sódio 0,14 Me manitol a 4% por diálise ou por filtração em gel utilizando resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas com tampão de formulação e esterilizadas por filtração. EXEMPLO 5: Expressão de polipéptidos PRQ em células de mamífero
Este exemplo ilustra a preparação de uma forma glicosilada de um polipéptido PRO desejado por expressão recombinante em células de mamífero. 48
ΕΡ 1 205 489 /PT Ο vector, pRK5 (veja-se EP 307 247, publicado em 15 de Março de 1989), é empregue como vector de expressão. Opcionalmente, o ADN que codifica o polipéptido PRO é ligado a pRK5 com enzimas de restrição seleccionadas para permitir a inserção do ADN do polipéptido PRO utilizando métodos de ligação tal como descrito em Sambrook et al., supra. O vector resultante é denominado pRK5-polipéptido PRO.
Numa concretização, as células hospedeiras seleccionadas podem ser células 293. As células 293 humanas (ATCC CCL 1573) são crescidas até à confluência em placas de cultura de tecidos num meio tal como DMEM suplementado com soro de vitelo fetal e opcionalmente, componentes nutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 μρ de ADN de pRK5-polipéptido PRO são misturados com cerca de 1 μρ de ADN que codifica o gene VA ARN [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] e dissolvidos em 500 μι de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl2 0,227 Μ. A esta mistura adicionaram-se, gota a gota, 500 μΐ de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaP04 1,5 mM, e deixa-se o precipitado formar durante 10 minutos a 25°C. O precipitado é suspendo e adicionado às células 293 e deixa-se assentar durante cerca de quatro horas a 37°C. O meio de cultura é aspirado e adicionam-se 2 ml de glicerol a 20% em PBS durante 30 segundos. As células 293 são então lavadas com meio isento de soro, adiciona-se meio fresco e incubam-se as células durante cerca de 5 dias.
Aproximadamente 24 horas depois das transfecções, o meio de cultura é removido e substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio de cultura contendo 200 μθί/ιη1 de 35S-cisteína e 200 μθί/ml de 35S-metionina. Após uma incubação de 12 horas, o meio condicionado é recolhido, concentrado num filtro rotativo, e carregado sobre um gel de SDS a 15%. O gel processado pode ser seco e exposto a um filme durante um período de tempo seleccionado para revelar a presença de polipéptido PRO. As culturas contendo células transfectadas podem sofrer uma incubação adicional (em meio isento de soro) e o meio é testado em bioensaios seleccionados.
Numa técnica alternativa, o polipéptido PRO pode ser introduzido em células 293 transientemente utilizando o método do sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. 49
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Natl. Acad. Sei., 12:7575 (1981). As células 293 são crescidas até uma densidade máxima num balão rotativo e adicionaram-se 700 μg de ADN de pRK5-polipéptido PRO. As células são primeiro concentradas a partir do balão rotativo por centrifugação e lavadas com PBS. O precipitado de ADN-dextrano é incubado na pelete de células durante quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% durante 90 segundos, lavadas com meio de cultura de tecidos, e reintroduzidas no balão rotativo contendo o meio de cultura de tecidos, 5 μg/ml de insulina bovina e 0,1 μg/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatro dias, o meio condicionado é centrifugado e filtrado para remover as células e os detritos. A amostra contendo o polipéptido PRO expresso pode então ser concentrada e purificada por qualquer método seleccionado, tal como diálise e/ou cromatografia em coluna.
Noutra concretização, os polipéptidos PRO podem ser expressos em células CHO. O pRK5-polipéptido PRO pode ser transfectado para células CHO utilizando reagentes conhecidos tais como CaP04 ou DEAE-dextrano. Tal como atrás descrito, as culturas de células podem ser incubadas, e o meio substituído por meio de cultura (sozinho) ou meio contendo um marcador radioactivo tal como S-metionina. Após determinação da presença de polipéptido PRO, o meio de cultura pode ser substituído por meio isento de soro. Preferivelmente, as culturas são incubadas durante cerca de 6 dias, e depois o meio condicionado é recolhido. O meio contendo o polipéptido PRO expresso pode então ser concentrado e purificado por qualquer método seleccionado. O polipéptido PRO marcado com um epítopo pode também ser expresso em células hospedeiras CHO. O polipéptido PRO pode ser subclonado fora vector pRK5. A inserção do subclone pode sofrer PCR para fundir em enquadramento com um marcador epitópico seleccionado tal como um marcador poli-his num vector de expressão de baculovírus. A inserção de polipéptido PRO marcada com poli-his pode então ser subclonada num vector de SV40 contendo um marcador de selecção tal como DHFR para a selecção de clones estáveis. Finalmente, as células CHO podem ser transfectadas (como descrito atrás) com o vector de SV40. A marcação pode ser realizada, como descrito atrás, para verificar a expressão. O meio de cultura contendo o 50
ΕΡ 1 205 489 /PT polipéptido PRO marcado com poli-His expresso pode então ser concentrado e purificado por qualquer método seleccionado, tal como por cromatografia de afinidade em quelato de Ni2+. O PRO301 foi expresso com sucesso em células CHO através de procedimentos de expressão tanto transiente como um estável. A expressão estável em células CHO foi realizada utilizando o procedimento que se segue. As proteínas foram expressas na forma de uma construção de IgG (imunoadesina), em que as sequências de codificação para as formas solúveis (e.g. domínios extracelulares) das proteínas respectivas foram fundidas com uma sequência da região constante de IgGl contendo os domínios charneira, CH2 e CH3 e/ou é uma forma marcada com poli-His.
Após amplificação por PCR, os ADN respectivos foram subclonados num vector de expressão de CHO utilizando técnicas Standard como descrito em Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). Construíram-se vectores de expressão em CHO de modo a terem locais de restrição compatíveis a 5' e a 3' do ADN de interesse para permitir o conveniente vaivém dos ADNc. O vector utilizado para a expressão em células CHO é tal como descrito em Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9 (1774-1779 (1996), e utiliza o promotor/potenciador precoce de SV40 para conduzir a expressão do ADNc de interesse e de di-hidrofolato-redutase (DHFR). A expressão de DHFR permite a selecção da manutenção estável do plasmídeo após a transfecção.
Introduziram-se doze microgramas do ADN plasmídico desejado em aproximadamente 10 milhões de células CHO utilizando reagentes de transfecção disponíveis no comércio Superfect* (Quiagen), Dosper* ou Fugene* (Boehringer Mannheim) . As células foram crescidas e estão descritas em Lucas et al., supra. Congelam-se aproximadamente 3 x 1CT7 células numa ampola para posterior crescimento e produção como se descreve adiante.
As ampolas contendo o ADN plasmídico foram descongeladas colocando-as num banho de água e misturando com vórtice. 51
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Pipetou-se o conteúdo para um tubo de centrífuga contendo 10 ml de meio e centrifugou-se a 1000 rpm durante 5 minutos. O sobrenadante foi aspirado e as células foram ressuspensas em 10 mL de meio selectivo (PS20 filtrado num filtro de 0,2 μιη com 5% de soro fetal bovino diafiltrado num filtro de 0,2 μιη) . As células foram então divididas em alíquotas em balões rotativos de 100 mL contendo 90 mL de meio selectivo. Após 1-2 dias, as células foram transferidas para um balão rotativo de 250 mL cheio com 150 mL de meio de crescimento selectivo e incubaram-se a 37°C. Após mais 2-3 dias, semearam-se balões rotativos de 250 mL, 500 mL e 2000 mL com 3 x 105 células/mL. O meio das células foi trocado por meio fresco por centrifugação e ressuspensão em meio de produção. Embora possa ser empregue qualquer meio adequado para CHO, foi neste caso utilizado um meio de produção descrito na Patente N° . US 5 122 469, concedida em 16 de Junho, 1992. Um balão rotativo de produção de 3L é semeado com 1,2 x 106 células/mL. No dia 0, determinaram-se o número de células e o pH. No dia 1, o balão foi amostrado e iniciou-se a aspersão de ar filtrado. No dia 2, o balão foi amostrado, a temperatura desviada para 33°C, e 30 mL de glucose a 500 g/L e 0,6 mL de antiespuma a 10% (e.g., emulsão de polidimetilsiloxano a 35%, Dow Corning 365 Medicai Grade Emulsion) . Ao longo da produção, o pH foi ajustado conforme necessário para o manter em torno de 7,2. Após 10 dias, ou após a viabilidade cair abaixo de 70%, recolheu-se a cultura celular por centrifugação e filtração através de um filtro de 0,22 μπι. O filtrado foi armazenando a 4°C ou imediatamente carregado em colunas para purificação.
Para as construções marcadas com poli-His, as proteínas foram purificadas utilizando uma coluna de Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adicionou-se imidazole ao meio condicionado até uma concentração de 5 mM. O meio condicionado foi bombado para uma coluna de 6 ml de Ni-NTA equilibrada em tampão Hepes 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,3 M e imidazole 5 mM com um caudal de 4-5 ml/min. a 4°C. Após a carga, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína foi eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazole 0,25 Μ. A proteína altamente purificada foi subsequentemente dessalinizada para um tampão de armazenagem contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com 52
ΕΡ 1 205 489 /PT uma coluna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia) e armazenou-se a -80°C.
As construções de imunoadesina (contendo Fc) foram purificadas do meio condicionado como se segue. O meio condicionado foi bombado para uma coluna de Proteína A de 5 ml (Pharmacia) que tinha sido equilibrada com tampão de fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após a carga, a coluna foi lavada extensamente com tampão de equilíbrio antes da eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída foi imediatamente neutralizada por recolha de fracções de 1 ml para tubos contendo 275 μΐ de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada foi subsequentemente dessalinizada para tampão de armazenagem como descrito atrás para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade foi avaliada por géis de SDS-poliacrilamida e por sequenciação dos aminoácidos N-terminais por degradação de Edman. O PRO301 foi também expresso transientemente com sucesso em células COS. EXEMPLO 6: Expressão de polipéptidos PRO em levedura O método que se segue descreve a expressão recombinante de um polipéptido PRO desejado em levedura.
Primeiro, construiram-se vectores de expressão de levedura para a produção intracelular ou a secreção de polipéptidos PRO a partir do promotor de ADH2/GAPDH. ADN que codifica um polipéptido PRO desejado, um péptido de sinal seleccionado e o promotor, é inserido em locais para enzimas de restrição adequados no plasmídeo seleccionado para dirigir a expressão intracelular do polipéptido PRO. Para a secreção, o ADN que codifica o polipéptido PRO pode ser clonado no plasmídeo seleccionado, juntamente com ADN que codifica o promotor de ADH2/GAPDH, a sequência do sinal/comando de secreção do factor alfa de levedura, e sequências ligantes (se necessário) para a expressão do polipéptido PRO. Células de levedura, tal como levedura da estirpe AB110, podem então ser transformadas com os plasmídeos de expressão descritos atrás e cultivadas em meios de fermentação 53
ΕΡ 1 205 489 /PT seleccionados. Os sobrenadantes da levedura transformada podem ser analisados por precipitação com ácido tricloroacético a 10% e separação por SDS-PAGE, seguida de coloração dos géis com azul de Coomassie. O polipéptido PRO recombinante pode subseguentemente ser isolado e purificado por remoção das células de levedura do meio de fermentação por centrifugação e depois concentração do meio utilizando filtros de cartucho seleccionados. O concentrado contendo o polipéptido PRO pode ser ainda purificado utilizando resinas de cromatografia em coluna seleccionadas. EXEMPLO 7: Expressão de polipéptidos PRO em células de insecto infectadas com baculovirus
Segue-se um método gue descreve a expressão recombinante de polipéptidos PRO em células de insecto infectadas com Baculovirus. O polipéptido PRO desejado é fundido a montante de um marcador epitópico contido com um vector de expressão de baculovirus. Estes marcadores epitópicos incluem marcadores poli-his e marcadores imunoglobulina (como regiões Fc de IgG). Pode ser empregue uma variedade de plasmídeos, incluindo plasmideos derivados de plasmídeos disponíveis no comércio tais como pVL1393 (Novagen). Resumidamente, o polipéptido PRO ou a porção desejada do polipéptido PRO (tal como a seguência que codifica o domínio extracelular de uma proteína transmembranar) é amplificado por PCR com iniciadores complementares com as regiões 5' e 3'. O iniciador a 5' pode incorporar locais para enzimas de restrição flanqueadores (seleccionados). O produto é então digerido com essas enzimas de restrição seleccionadas e subclonado no vector de expressão. O baculovirus recombinante é gerado por co-transfecção do plasmideo anterior e ADN virai BaculoGold (Pharmmgen) em células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando lipofectina (disponíveis no comércio em GIBCO-BRL). Após 4-5 dias de incubação a 28°C, os vírus libertados são recolhidos e utilizados para mais amplificações. A infecção 54 ΕΡ 1 205 489 /PT virai e a expressão de proteínas são realizadas como descrito por 0'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) . O polipéptido PRO marcado com poli-his expresso pode então ser purificado, por exemplo, por cromatografia de afinidade em quelato de Ni2+, como se segue. Os extractos são preparados a partir de células Sf9 infectadas com vírus recombinantes como descrito por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Resumidamente, as células Sf9 são lavadas, ressuspensas em tampão para ultra-sons (25 mL de Hepes, pH 7,9; MgCl2 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; Glicerol a 10%; NP-40 a 0,1%; KC1 0,4 M) , e trataram-se com ultra-sons duas vezes durante 20 segundos em gelo. Os produtos do tratamento com ultra-sons são clarificados por centrifugação, e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, Glicerol a 10%, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 μκι. Prepara-se uma coluna de agarose Ni2+-NTA (disponível no comércio em Qiagen) com um volume de leito de 5 mL, lava-se com 25 mL de água e equilibra-se com 25 mL de tampão de carga. O extracto celular filtrado é carregado na coluna a 0,5 mL por minuto. A coluna é lavada até à linha de base a A2so com tampão de carga, ponto em que se inicia a recolha de fracções. Em seguida, a coluna é lavada com um tampão de lavagem secundário (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, Glicerol a 10%, pH 6,0), que elui de forma não específica a proteína ligada. Após atingir novamente a linha de base a A2qo, a coluna é desenvolvida com um gradiente de Imidazole de 0 a 500 mM no tampão de lavagem secundário. Recolhem-se fracções de 1 mL e analisam-se por SDS-PAGE e coloração com prata ou Western blot com Ni2+-NTA-conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). As fracções contendo o polipéptido PRO marcado com Hisio eluído são reunidas e dialisadas contra tampão de carga.
Alternativamente, a purificação do polipéptido PRO marcado com IgG (ou marcado com Fc) pode ser realizada utilizando técnicas de cromatografia conhecidas, incluindo por exemplo, cromatografia em coluna de Proteína A ou proteína G. O PRO301 foi expresso com sucesso em células de insecto Sf9 ou high5 infectadas com baculovirus. Embora a expressão fosse neste caso realizada numa escala de 0,5-2 L, pode ser 55 ΕΡ 1 205 489 /PT facilmente aumentada a escala para preparações maiores (e.g. 8 L). As proteínas foram expressas na forma de uma construção de IgG (imunoadesina), em que a região extracelular da proteína foi fundida com uma sequência da região constante de IgGl contendo os domínios charneira, CH2 e CH3 e/ou nas formas marcadas com poli-His.
Após amplificação por PCR, as sequências de codificação respectivas foram subclonadas num vector de expressão de baculovírus (pb.PH.IgG para fusões de IgG e pb.PH.His.c para proteínas marcadas com poli-His), e o vector e o ADN de baculovírus Baculogold® (Pharmingen) foram co-transfectados para 105 células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711), utilizando Lipofectina (Gibco BRL) . pb.PH.IgG e pb.PH.His são modificações do vector de expressão de baculovírus disponível no comércio pVL1393 (Pharmingen), com regiões poliligantes modificadas para incluir as sequências marcadoras His ou Fc. As células foram crescidas em meio TNM-FH de Hink suplementado com FBS a 10% (Hyclone) . As células foram incubadas durante 5 dias a 28°C. O sobrenadante foi recolhido e subsequentemente utilizado para a primeira amplificação virai infectando células Sf9 em meio TNM-FH de Hink suplementado com FBS a 10% a uma multiplicidade de infecção (MOI) aproximada de 10. As células foram incubadas durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante foi recolhido e a expressão das construções no vector de expressão de baculovírus foi determinada por ligação em descontínuo de 1 ml de sobrenadante a 25 mL de contas de Ni-NTA (QIAGEN) para proteínas marcadas com histidina ou contas de Proteína-A Sepharose CL-4B (Pharmacia) para proteínas marcadas com IgG, seguida por análise SDS-PAGE comparando com uma concentração conhecida de padrão de proteína por coloração com azul de Coomassie. O primeiro sobrenadante da amplificação virai foi utilizado para infectar uma cultura rotativa (500 ml) de células Sf9 crescidas em meio ESF-921 (Expression Systems LLC) a uma MOI aproximada de 0,1. Incubaram-se as células durante 3 dias a 28°C. O sobrenadante foi recolhido e filtrado. Repetiu-se a ligação descontínua e a análise SDS-PAGE, conforme necessário, até a expressão da cultura rotativa ser confirmada. 56
ΕΡ 1 205 489 /PT Ο meio condicionado das células transfectadas (0,5 a 3 L) foi recolhido por centrifugação para remover as células e filtrado através de filtros de 0,22 micra. Para as construções marcadas com poli-His, as construções de proteína foram purificadas utilizando uma coluna de Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, adicionou-se imidazole ao meio condicionado até uma concentração de 5 mM. O meio condicionado foi bombado para uma coluna de Ni-NTA de 6 ml equilibrada com tampão Hepes 20 mM, pH 7,4, contendo NaCl 0,3 Me imidazole 5 mM a um caudal de 4-5 ml/min. a 4°C. Após a carga, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio adicional e a proteína foi eluída com tampão de equilíbrio contendo imidazole 0,25 Μ. A proteína altamente purificada foi subsequentemente dessalinizada para tampão de armazenagem contendo Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna de 25 ml de G25 Superfine (Pharmacia) e armazenou-se a -80°C.
As construções de imunoadesina (contendo Fc) de proteínas foram purificadas a partir do meio condicionado como se segue. O meio condicionado foi bombado para uma coluna de 5 ml de
Proteína A (Pharmacia) que tinha sido equilibrada em tampão de fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Após a carga, a coluna foi lavada extensamente com tampão de equilíbrio antes da eluição com ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. A proteína eluída foi imediatamente neutralizada por recolha de fracções de 1 ml para tubos contendo 275 mL de tampão Tris 1 M, pH 9. A proteína altamente purificada foi subsequentemente dessalinizada para tampão de armazenagem como descrito atrás para as proteínas marcadas com poli-His. A homogeneidade das proteínas foi verificada por electroforese em gel de SDS poliacrilamida (PEG) e sequenciação dos aminoácidos N-terminais por degradação de Edman.
EXEMPLO 8; Preparação de anticorpos que se ligam a polipéptidos PRO
Este exemplo ilustra a preparação de anticorpos monoclonais que podem ligar-se especificamente a um polipéptido PRO.
As técnicas para a produção dos anticorpos monoclonais são conhecidas na arte e estão descritas, por exemplo, em 57
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Goding, supra. Os imunogénios que podem ser empregues incluem polipéptido PRO purificado, proteínas de fusão contendo o polipéptido PRO e células que expressam polipéptido PRO recombinante na superfície celular. A selecção do imunogénio pode ser feita por um perito na especialidade sem experimentação indevida.
Ratinhos, tais como Balb/c, são imunizados com o imunogénio polipéptido PRO emulsionado em adjuvante de Freund completo e injectado subcutaneamente ou intraperitonealmente numa quantidade de 1-100 microgramas. Alternativamente, o imunogénio é emulsionado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injectado nas almofadas das patas dos animais. Os ratinhos imunizados recebem então reforços 10 a 12 dias mais tarde com imunogénio adicional emulsionado no adjuvante seleccionado. Posteriormente, durante várias semanas, os ratinhos podem também receber reforços com injecções de imunização adicionais. Amostras de soro podem ser periodicamente obtidas dos ratinhos por sangria retro-orbital para teste em ensaios ELISA para detectar anticorpos anti-polipéptido PRO.
Após detectar um anticorpo adequado, os animais "positivos" para anticorpos pode ser injectados com uma injecção intravenosa final de polipéptido PRO. Três a quatro dias mais tarde, os ratinhos são sacrificados e as células do baço são recolhidas. As células do baço são então fundidas (utilizando polietilenoglicol a 35%) a uma linha celular de mieloma murino seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponível na ATCC, No. CRL 1597. As fusões geram células de hibridoma que podem então ser plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células do baço.
As células de hibridoma serão rastreadas num ELISA quanto à reactividade contra o polipéptido PRO. A determinação de células de hibridoma "positivas" que segregam os anticorpos monoclonais desejados contra o polipéptido PRO faz parte das qualificações do perito na especialidade. 58
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As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos Balb/c singeneicos para produzir ascites contendo os anticorpos monoclonais anti-polipéptido PRO. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas em balões de cultura de tecidos ou frascos rotativos. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nos ascites pode ser realizada utilizando precipitação com sulfato de amónio, seguida por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, pode ser empregue cromatografia de afinidade baseada na ligação de anticorpo a proteína A ou proteína G. EXEMPLO 9: Polipéptidos PRO quiméricos
Os polipéptidos PRO podem ser expressos na forma de proteínas quiméricas com um ou mais domínios polipeptídicos adicionais adicionados para facilitar a purificação da proteína. Estes domínios que facilitam a purificação incluem, mas não se lhes limitam, péptidos quelantes de metais tais como módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios proteína A que permitem a purificação em imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de purificação por alongamento/afinidade FLAGS™ (Immunex Corp., Seattle Wash.). A inclusão de uma sequência ligante clivável tal como Factor XA ou enteroquinase (Invitrogen, San Diego Calif.) entre o domínio de purificação e a sequência de polipéptido PRO pode ser útil para facilitar a expressão de ADN que codifica o polipéptido PRO. EXEMPLO 10: Purificação de polipéptidos PRO utilizando anticorpos específicos
Os polipéptidos PRO nativos ou recombinantes podem ser purificados através de uma variedade de técnicas Standard na arte da purificação de proteínas. Por exemplo, pro-polipéptido PRO, polipéptido PRO maduro ou pre-polipéptido PRO, são purificados por cromatografia de imunoafinidade utilizando anticorpos específicos para o polipéptido PRO de interesse. Em geral, uma coluna de imunoafinidade é construída por acoplamento covalente do anticorpo anti-polipéptido PRO a uma resina cromatográfica activada. 59
ΕΡ 1 205 489 /PT
As imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soros imunes por precipitação com sulfato de amónio ou por purificação em Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Do mesmo modo, os anticorpos monoclonais são preparados a partir de fluido ascítico de ratinho por precipitação com sulfato de amónio ou cromatografia em Proteína A imobilizada. A imunoglobulina parcialmente purificada é fixada covalentemente a uma resina cromatográfica tal como SEPHAROSE™ activada com CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo é acoplado à resina, a resina é bloqueada e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante.
Esta coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação de polipéptido PRO preparando uma fracção de células contendo polipéptido PRO numa forma solúvel. Esta preparação é derivada por solubilização da totalidade da célula ou de uma fracção subcelular obtida através de centrifugação diferencial por adição de detergente ou por outros métodos bem conhecidas na arte. Alternativamente, polipéptido PRO solúvel contendo uma sequência de sinal pode ser segregado em quantidades úteis para o meio no qual as células crescem.
Uma preparação contendo polipéptido PRO solúvel é passada ao longo da coluna de imunoafinidade, e a coluna é lavada sob condições que permitem a absorvância preferencial de polipéptido PRO (e.g., tampões de elevada força iónica na presença de detergente). Depois, a coluna é eluída sob condições que rompem a ligação anticorpo/polipéptido PRO (e.g., um tampão de baixo pH tal como aproximadamente pH 2-3, ou uma elevada concentração de um caotropo tal como ureia ou ião tiocianato), e recolhe-se o polipéptido PRO. EXEMPLO 11: Rastreio de drogas A presente invenção é particularmente útil para o rastreio de compostos utilizando polipéptidos PRO ou seus fragmentos de ligação em qualquer de uma variedade de técnicas de rastreio de drogas. O polipéptido PRO ou fragmento empregues neste teste podem estar livres em solução, fixados num suporte sólido, estar sobre a superfície de células ou 60 ΕΡ 1 205 489 /PT estar localizados intracelularmente. Um método de rastreio de drogas utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas que são transformadas de forma estável com ácidos nucleicos recombinantes que expressam o polipéptido PRO ou seu fragmento. As drogas são rastreadas contra estas células transformadas em ensaios de ligação competitiva. Estas células, quer na forma viável quer fixas, podem ser utilizadas para ensaios de ligação Standard. Pode-se medir, por exemplo, a formação de complexos entre o polipéptido PRO ou um seu fragmento e o agente a testar. Alternativamente, pode-se examinar a diminuição na formação do complexo entre o polipéptido PRO e as suas células alvo ou receptores alvo provocada pelo agente que está a ser testado.
Assim, a presente invenção proporciona métodos de rastreio para drogas ou quaisquer outros agentes que podem afectar uma doença ou desordem associada ao polipéptido PRO. Estes métodos compreendem o contacto de um tal agente com um polipéptido PRO ou um seu fragmento e o ensaio (I) quanto à presença de um complexo entre o agente e o polipéptido PRO ou fragmento, ou (ii) quanto à presença de um complexo entre o polipéptido PRO ou fragmento e a célula, por métodos bem conhecidos na arte. Nestes ensaios de ligação competitiva, o polipéptido PRO ou seu fragmento é tipicamente marcado. Após incubação adequada, o polipéptido PRO ou fragmento livres são separados dos que estão presentes na forma ligada, e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade do agente particular se ligar ao polipéptido PRO ou interferir com o complexo polipéptido PRO/célula.
Outra técnica para o rastreio de drogas proporciona um rastreio de alto rendimento de compostos possuindo afinidade de ligação adequada para um polipéptido e está descrita com detalhes em WO 84/03564, publicado em 13 de Setembro, 1984. Resumidamente, sintetizam-se grandes quantidades de diferentes compostos de teste peptídicos pequenos num substrato sólido, tal como pinos de plástico ou alguma outra superfície. Aplicado a um polipéptido PRO, os compostos de teste peptídicos são feitos reagir com polipéptido PRO e lavados. O polipéptido PRO ligado é detectado por métodos bem conhecidos na arte. O polipéptido PRO purificado pode também ser revestido directamente em placas para utilização nas técnicas 61 ΕΡ 1 205 489 /PT de rastreio de drogas supramencionadas. Em adição, podem ser utilizados anticorpos não neutralizantes para capturar o péptido e o imobilizar no suporte sólido. A presente invenção também contempla a utilização de ensaios de rastreio de drogas competitivos em que anticorpos neutralizantes capazes de se ligar ao polipéptido PRO competem especificamente com um composto de teste pela ligação ao polipéptido PRO ou seus fragmentos. Desta maneira, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de qualquer péptido que partilhe um ou mais determinantes antigénicos com o polipéptido PRO. EXEMPLO 12: Desenho racional de drogas O objectivo do desenho racional de drogas é produzir análogos estruturais do polipéptido de interesse biologicamente activo (i.e., um polipéptido PRO) ou de moléculas pequenas com as quais interactua, e.g., agonistas, antagonistas ou inibidores. Qualquer destes exemplos pode ser utilizado para o desenho de drogas que são formas mais activas ou estáveis do polipéptido PRO ou que melhoram ou interferem com a função do polipéptido PRO in vivo (c.f., Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)).
Numa abordagem, a estrutura tridimensional do polipéptido PRO, ou de um complexo inibidor do polipéptido PRO, é determinada por cristalografia de raios-x, por modelação em computador ou, mais tipicamente, através de uma combinação das duas abordagens. Tanto o formato como as cargas do polipéptido PRO têm que ser determinados para elucidar a estrutura e para determinar locais activos da molécula. Menos frequentemente, pode-se conseguir informação útil referente à estrutura do polipéptido PRO através de modelação com base na estrutura de proteínas homólogas. Em ambos os casos, a informação estrutural relevante é utilizada para desenhar moléculas análogas semelhantes ao polipéptido PRO ou para identificar inibidores eficientes. Os exemplos úteis de desenho racional de drogas podem incluir moléculas que possuem actividade ou estabilidade melhoradas como mostrado por Braxton e Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) ou que actuam como inibidores, agonistas ou antagonistas de péptidos 62 ΕΡ 1 205 489 /PT nativos como mostrado por Athauda et al., J. Biochem., 113:742-746 (1993) . É também possível isolar um anticorpo específico para um alvo, seleccionado por ensaio funcional, como descrito atrás, e depois resolver a sua estrutura cristalina. Esta abordagem, em princípio, origina um núcleo farmaceuticamente activo (pharmacore) com base no qual pode ser baseado um subsequente projecto de drogas. É possível circundar totalmente a cristalografia da proteína gerando anticorpos anti-idiotípicos (anti-id) para um anticorpo funcional, farmacologicamente activo. Tal como uma imagem num espelho de uma imagem de espelho, o local de ligação dos anti-id espera-se análogo ao do receptor original. O anti-id pode então ser utilizado para identificar e isolar péptidos de bancos de péptidos produzidos quimicamente ou biologicamente. Os péptidos isolados actuarão então como núcleos farmaceuticamente activos (pharmacore).
Em virtude da presente invenção, podem ser tornadas disponíveis quantidades suficientes do polipéptido PRO para realizar estudos analíticos como cristalografia de raios-x. Em adição, o conhecimento da sequência de aminoácidos do polipéptido PRO aqui proporcionada proporcionará orientação aos que empregam técnicas de modelação em computador em vez de, ou em adição a, cristalografia de raios-x. EXEMPLO 13: Capacidade dos polipéptidos PRO para inibir a proliferação estimulada por factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) do crescimento celular endotelial
Testou-se a capacidade de vários polipéptidos PRO para inibir a proliferação estimulada por VEGF de células endoteliais. Especificamente, plaquearam-se células endoteliais capilares corticais supra-renais de bovino (ACE) (da cultura primária, máximo de 12-14 passagens) em placas de microtítulo de 96 poços (Amersham Life Science) numa densidade de 500 células/poço por 100 pL em DMEM de baixo teor de glucose, soro de vitelo a 10%, glutamina 2 mM, lx pen/estrep e fungizona, suplementado com 3 ng/mL de VEGF. Plaquearam-se controlos da mesma maneira, mas alguns não incluíam VEGF. Adicionou-se uma amostra de teste do polipéptido PRO de interesse num volume de 100 pL de um volume final de 200 pL. 63
ΕΡ 1 205 489 /PT
As células foram incubadas durante 6-7 dias a 37°C. Os meios foram aspirados e as células foram lavadas lx com PBS. Adicionou-se uma mistura reaccional de fosfatase ácida (100 pL, acetato de sódio 0,1M, pH 5,5, Triton-100 a 0,1%, fosfato de p-nitrofenilo 10 mM). Após incubação durante 2 horas a 37°C, parou-se a reacção por adição de 10 μΐ de NaOH IN. A DO foi medida num leitor de placas de microtitulo a 405 nm. Os controlos eram, sem células, apenas células, células + FGF (5 ng/mL), células + VEGF (3 ng/mL), células + VEGF (3 ng/mL) + TGF-β (1 ng/mL) e células + VEGF (3 ng/mL) + LIF (5 ng/mL). (sabe-se que TGF-β a 1 ng/mL bloqueia 70-90% da proliferação celular estimulada por VEGF).
Os resultados foram avaliados calculando a percentagem de inibição da proliferação celular estimulada por VEGF (3 ng/ml), determinada medindo a actividade de fosfatase ácida a DO405 nm, (1) relativamente a células sem estimulação e (2) relativamente à inibição por TGF-β de referência de actividade estimulada por VEGF. Os resultados, como mostrado na Tabela 2 adiante, são indicativos da utilidade dos polipéptidos PRO na terapia do cancro e especialmente na inibição de angiogénese tumoral. Os valores numéricos (inibição relativa) mostrados na Tabela 2, são determinados calculando a percentagem de inibição, da proliferação estimulada por VEGF, pelo polipéptido PRO, relativamente a células sem estimulação e depois dividindo essa percentagem pela percentagem de inibição obtida por TGF-β a 1 mg/ml, que se sabe bloquear 70-90% da proliferação celular estimulada por VEGF.
Tabela 2
Nome de PRO Concentração de PRO Inibição Relativa PRO301 7,0 μΜ 1,02 PRO301 7 0 μΜ 0,88 PRO301 70 0 μΜ 0,44 PRO301 0, 01% 0,92 PRO301 0,1% 0,85 PRO301 1,0% 0,68
ΕΡ 1 205 489 /PT β 4 EXEMPLO 14; Inibição de células PDB12
Este exemplo demonstra que vários polipéptidos PRO possuem eficácia na inibição da produção de proteinas por células do dueto pancreático, PDB12.
As células do dueto pancreático PDB12 são plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com fibronectina a 1,5 x 103 células por poço em 100 μ1/180 μΐ de meio de crescimento. São então adicionados ao poço 100 μΐ de meio de crescimento com a amostra de teste de polipéptido PRO ou controlo negativo a que falta o polipéptido PRO, até um volume final de 200 μΐ. Os controlos contêm meio de crescimento contendo uma proteína que se mostrou inactiva neste ensaio. As células são incubadas durante 4 dias a 37°C. Adicionam-se então 20 μΐ de corante Alamar Blue Dye (AB) a cada poço e mede-se a leitura fluorescente 4 horas após a adição de AB, num leitor de placas de microtítulo a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão. O padrão empregue consiste em células sem extracto de pituitária de bovino (BPE) e com várias concentrações de ΒΡΕ. O tampão ou os controlos CM de desconhecidos são corridos 2 vezes em cada placa de 96 poços.
Os resultados destes ensaios estão apresentados na Tabela 6 que se segue em que a diminuição da percentagem de produção de proteína é calculada por comparação da concentração de proteína calculada por Alamar Blue Dye produzida pelas células tratadas com polipéptido PRO com a concentração de proteína calculada por Alamar Blue Dye produzida pelas células de controlo negativo. Uma diminuição da percentagem de produção de proteína superior ou igual a 25% em comparação com as células de controlo negativo é considerada positiva.
Tabela 6
Nome de PRO PRO301 PRO301 PRO301
Concentração Percentagem de diminuição de PRO de produção de proteína 2,0% 10% 50% 0,0% 59,8% 65,6% 65
ΕΡ 1 205 489 /PT EXEMPLO 15: Estimulação de hipertrofia cardíaca do adulto
Este ensaio é desenhado para medir a capacidade de vários polipéptidos PRO para estimular hipertrofia cardíaca do adulto.
Miócitos ventriculares recentemente isolados de ratos Sprague Dawley adultos (250 g) são plaqueados a 2000 células/poço num volume de 180 μΐ. As células são isoladas e plaqueadas no dia 1, as amostras de teste contendo polipéptido PRO ou meio de crescimento apenas (controlo negativo) (volume de 20 μΐ) são adicionados no dia 2 e as células são então fixadas e coradas no dia 5. Após coloração, é visualizado o tamanho das células, sendo que, às células que não apresentam melhoria do crescimento em comparação com células de controlo é dado um valor de 0,0, a células que apresentam melhoria pequena a moderada do crescimento em comparação com células de controlo é dado um valor de 1,0 e a células que apresentam uma grande melhoria do crescimento em comparação com as células de controlo é dado um valor de 2,0. Qualquer grau de melhoria do crescimento em comparação com as células de controlo negativo é considerado positivo no ensaio. Os resultados são apresentados na Tabela 7 que se segue.
Tabela 7
Nome de PRO Concentração Pontuação de melhoria do de PRO crescimento PRO3 01 20% I7Õ PRO301 20% 1,0 EXEMPLO 16: Proliferação celular de PDB12
Este exemplo demonstra que vários polipéptidos PRO têm eficácia na indução da proliferação de células do dueto pancreático PDB12.
As células do dueto pancreático PDB12 são plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com fibronectina a l,5xl03 células por poço em 100 180 pL de meios de crescimento. Adicionam-se então ao poço 100 pL de meios de crescimento com a amostra de teste de polipéptido PRO ou controlo negativo sem 66 ΕΡ 1 205 489 /PT ο polipéptido PRO, para obter um volume final de 200 pL. Os controlos contêm meio de crescimento contendo uma proteína que se mostrou ser inactiva neste ensaio. As células são incubadas durante 4 dias a 37°C. Adicionam-se então 20 pL de Alamar Blue Dye (AB) a cada poço e mede-se a leitura fluorescente 4 horas após a adição de AB, num leitor de placas de microtítulo a 530 nm de excitação e 590 nm de emissão. O padrão empregue é de células sem Extracto de Pituitária Bovina (BPE) e com várias concentrações de BPE. Os controlos de apenas tampão ou meio de crescimento de desconhecidos são corridos 2 vezes em cada placa de 96 poços.
Os resultados destes ensaios são apresentados na Tabela 8 adiante em que o aumento de percentagem na produção de proteína é calculado por comparação da concentração de proteína calculada por Alamar Blue Dye produzida pelas células tratadas com polipéptido PRO com a concentração de proteína calculada por Alamar Blue Dye produzida pelas células de controlo negativo. Um aumento de percentagem na produção de proteína superior ou igual a 25% em comparação com as células de controlo negativo é considerado positivo.
Tabela 8
Nome de Concentração Aumento de Percentagem PRO de PRO na Produção de Proteína PRO301 2,0% 44, 0% PRO301 10% 67, 4% PRO301 50% 185,8% EXEMPLO 17: Hibridação in situ A hibridação in situ é uma poderosa e versátil técnica para a detecção e localização de sequências de ácido nucleico no interior de células ou preparações de tecidos. Pode ser útil, por exemplo, para identificar locais de expressão de genes, analisar a distribuição nos tecidos de transcrição, identificar e localizar a infecção virai, seguir alterações na síntese de ARNm específico e auxiliar no mapeamento de cromossomas. 67
ΕΡ 1 205 489 /PT
Em ΕΡ 1027434 A (98946090.2), a hibridação in situ foi realizada seguindo uma versão optimizada do protocolo de Lu e Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando ribo-sondas marcadas com 32P e geradas por PCR. Resumidamente, tecidos humanos embebidos em parafina e fixados em formalina, foram seccionados, desparafinados, desproteinados em proteinase K (20 g/ml) durante 15 minutos a 37°C, e adicionalmente processados para hibridação in situ como descrito por Lu e Gillett, supra. Uma ribo-sonda anti-sentido marcada com [33-p]UTP foi gerada a partir de um produto de PCR e hibridada a 55°C durante a noite. As placas foram mergulhadas em emulsão de detecção nuclear Kodak NTB2 e expostas durante 4 semanas. Síntese de 33P-Ribo-sonda
Secaram-se 6,0 μΐ (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) num "speed vac". A cada tubo contendo 33P-UTP seco, adicionaram-se os seguintes ingredientes: 2.0 μΐ de 5x tampao de transcrição 1.0 μΐ de DTT (100 mM) 2.0 μΐ de mistura NTP (2,5 mM: 10μ; cada um 10 mM de GTP, CTP & ATP + 10 μΐ H20) 1.0 μΐ de UTP (50 μΜ) 1.0 μΐ de ARnasina 1.0 μΐ de molde de ADN (1 μρ) 1.0 μΐ de H20 1.0 μΐ de ARN-polimerase (para produtos de PCR T3 = AS, T7 = S, usualmente)
Os tubos foram incubados a 37°C durante uma hora. Adicionou-se 1,0 μΐ de ADNase RQ1, seguida por incubação a 37°C durante 15 minutos. Adicionaram-se 90 μΐ de TE (Tris 10 mM, pH 7,6/EDTA lmM, pH 8,0), e pipetou-se a mistura em papel DE81. A solução restante foi carregada numa unidade de ultrafiltração Microcon-50, e centrifugada utilizando o programa 10 (6 minutos) . A unidade de filtração foi invertida para um segundo tubo e centrifugada utilizando o programa 2 (3 minutos). Após a centrifugação de recuperação final, adicionaram-se 100 μΐ de TE. Pipetou-se 1 μΐ do produto final para papel DE81 e contou-se em 6 ml de Biofluor II. 68
ΕΡ 1 205 489 /PT A sonda foi corrida num gel de TBE/ureia. 1-3 μΐ da sonda ou 5 μΐ de ARN Mrk III foram adicionados a 3 μΐ de tampão de carga. Após aquecimento num bloco de calor a 95°C durante três minutos, colocou-se imediatamente o gel em gelo. Lavaram-se os poços do gel, carregou-se a amostra e correu-se a 180-250 volts durante 45 minutos. O gel foi envolvido em "saran wrap" e exposto a um filme XAR com um ecrã de intensificação num congelador a -70°C uma hora a uma noite. 33P-Hibridação A. Pré-tratamento de secções congeladas
As lâminas foram removidas do congelador, colocadas em tabuleiros de alumínio e descongeladas à temperatura ambiente durante 5 minutos. Os tabuleiros foram colocados numa incubadora a 55°C durante cinco minutos para reduzir a condensação. As lâminas foram fixas durante 10 minutos em paraformaldeído a 4% em gelo no exaustor de fumos, e lavadas com 0,5 x SSC durante 5 minutos, à temperatura ambiente (25 ml de 20x SSC + 975 ml de SQ H20) . Após desproteinação em proteínase K a 0,5 μρ/ιηΐ durante 10 minutos a 37°C (12,5 μΐ de solução de reserva a 10 mg/ml em 250 ml de tampão de ARNase isento de ARNase pré-aquecido), lavaram-se as secções com 0,5x SSC durante 10 minutos à temperatura ambiente. Desidrataram-se as secções em etanol a 70%, 95%, 100%, 2 minutos cada. B. Pré-tratamento de secções embebidas em parafina
As lâminas foram desparafinadas, colocadas em SQ H20, e enxaguadas duas vezes com 2x SSC à temperatura ambiente, durante 5 minutos de cada vez. As secções foram desproteinadas em proteínase K a 20 μρ/ml (500 μΐ de 10 mg/ml em 250 ml de tampão de ARNase isento de ARNase; 37°C, 15 minutos) - embrião humano, ou 8x proteínase K (100 μΐ em 250 ml de tampão de ARNase, 37°C, 30 minutos) - tecidos em formalina. Subsequentemente realizaram-se um enxaguamento com 0,5x SSC e desidratação como descrito atrás. 69
ΕΡ 1 205 489 /PT C. Pré-hibridaçao
Colocaram-se as lâminas numa caixa de plástica revestida com tampão Box (4x SSC, formamida a 50%) - papel de filtro saturado. O tecido foi coberto com 50 μΐ de tampão hibridação (3,75g de sulfato de dextrano + 6 ml de SQ H20) , submetido a vórtice e aquecido no microondas durante 2 minutos com a tampa solta. Após arrefecimento em gelo, adicionaram-se 18,75 ml de formamida, 3,75 ml de 20x SSC e 9 ml de SQ H20, o tecido foi submetido a vórtice extensamente e incubado a 42°C durante 1-4 horas. D. Hibridação
Aqueceram-se sonda 1,0 x 106 cpm e 1,0 μΐ de ARNt (solução de reserva a 50 mg/ml), por lâmina, a 95°C durante 3 minutos. Arrefeceram-se as lâminas em gelo e adicionaram-se 48 μΐ de tampão de hibridação por lâmina. Após a aplicaçao do vórtice, adicionaram-se 50 μΐ de mistura 33P a 50 μΐ de pré-hibridação na lâmina. Incubaram-se as lâminas durante a noite a 55°C. E. Lavagens
Realizaram-se lavagens, 2x 10 minutos, com 2x SSC, EDTA à temperatura ambiente (400 ml de 20x SSC + 16 ml de EDTA 0,25 M, Vf= 4L) , seguidos de tratamento com ARNase A a 37°C durante 30 minutos (500 μΐ de 10 mg/ml em 250 ml de tampão de ARNase = 20 μρ/ιηΐ) . Lavaram-se as lâminas 2x 10 minutos com 2x SSC, EDTA à temperatura ambiente. As condições de rigor na lavagem foram as seguintes: 2 horas a 55°C, 0,lx SSC, EDTA (20 ml 2Ox SSC + 16 ml EDTA, Vf= 4L) .
Depósito de Material
Depositaram-se os seguintes materiais na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EUA (ATCC):
Material Dep. no ATCC N°. Data do depósito DNA40628-1216 ATCC 209432 17 de Novembro, 1997 70
ΕΡ 1 205 489 /PT
Estes depósitos foram feitos segundo os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional de Depósito de Microorganismos para efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e seus Regulamentos (Tratado de Budapeste). Isto assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito durante 30 anos a partir da data de depósito. Os depósitos serão disponibilizados pela ATCC segundo os termos do Tratado de Budapeste, e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que assegura a disponibilidade permanente e não restrita da progénie da cultura do depósito ao público após concessão da patente norte-americana pertinente ou após disponíveis ao público quaisquer pedidos de patente norte-americanos ou estrangeiros, o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progénie a quem determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks com esse direito de acordo com 35 USC §& 122 e as regras do Commissioner daí decorrentes (incluindo 37 CFR §& 1.14 com particular referência para 886 OG 638). O cessionário do presente pedido de patente concordou em que, se uma cultura dos materiais depositados morrer ou se perder ou for destruída quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos após notificação por outros equivalentes. A disponibilidade do material depositado não deve ser entendida como uma licença para a prática da invenção em contravenção dos direitos concedidos pela autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis relativas a patentes. O fascículo aqui escrito é considerado suficiente para permitir que peritos na especialidade ponham em prática a invenção. A presente invenção não está limitada no seu âmbito pela construção depositada, pois a concretização depositada destina-se unicamente a ilustração de certos aspectos da invenção. O depósito de material aqui não constitui uma admissão de que a descrição aqui escrita é inadequada para permitir a prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o seu melhor modo, nem é construída como limitante do âmbito das reivindicações às ilustrações específicas que representa. Na realidade, várias modificações da invenção em adição às apresentadas e descritas aqui serão evidentes para os peritos 71
ΕΡ 1 205 489 /PT na especialidade a partir da descrição anterior e caiem no âmbito das reivindicações anexas.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Genentech, Inc. <120> Polipéptidos transmembranares e segregados e ácidos nucleicos que os codificam <1 30 > CMD/FPS963 020 <1 40 > EP 01 127 79 2.8 <1 41 > 2001- 11- 22 <1 50 > EP 9 8 946 09 0.2 <1 51 > 1998- 09- 16 <1 50 > PCT/US98 /1 9330 <1 51 > 1998- 09- 16 <1 50 > US 60 /06 6, 364 <1 51 > 1997- 11- 21 <1 60 > 8 <1 70 > Patent I n Ver. <2 10 > 1 <2 11 > 1842 <2 12 > ADN <2 13 > Homo sapiens <4 00 > 1 72
ΕΡ 1 205 489 /PT gtctgttccc aggagtcctt cggcggctgt aaggcgeaag tcgagaggaa actgttgtgc ctggcattgg gcagtgttac agtgcactct aatcctgtga agttgtcctg tgcctactcg tttgaecaag gagacaccac cagactcgtt gaggaccggg tgaccttctt gccaactggt actgggacat acacttgtat ggtctctgag gtcaagctca tcgtgcttgt gcctccatcc aecattggga accgggcagt gctgaoatgc tacacctggt tcaaagatgg gatagtgatg agcaactctt ccfcatgtcct gaatcccaca gcctctgata ctggagaata cagctgtgag tcaaatgctg tacgcatgga agctgtggag cttgtaaccc tgattctcct gggaatettg ggccactttg acagaacaaa gaaagggact agtgcccgaa gtgaaggaga attcaaacag gctcaccgcc tatcatctgc atttgcctta gtctgtagtt tcacaggatg ccttatttgt tcggatgtgt ttttaataat gtcagctatg tttcctacca otgctgagtg gcctggaact agggatcagg aaggaatcct gggtatgcca tggcgggggt cgcaggaatc tgcactcaac aggtatcttg agcttggttc tgggctcttt tctagagcgg gaattagagg ctagagcggc tccttccatc tctggggccc actctcttct ctctgceetg tcctcctgaa tacaagctga agctcttgtt gtggagagca tagtaaattt accgctgctc taaagaaaag aaaactggag cagaggctga ggeaggcgga tcacetgagg ggagaaaccc tactggaaat acaaagttag agctgcteag gagcctggca acaagagcaa <210> 2 <211> 299
<212> PRT <213> Homo sapiens tgtgtcagtg gcctgatcgc gatggggaca 60 ctettcatat tggcgatcct gttgtgctcc 120 tctgaacctg aagtcagaat tcctgagaat 180 ggcttttctt ctccccgtgt ggagtggaag 240 tgctataafca acaagatcac agcttcetat 300 atcaccttca agtccgtgac acgggaagac 360 gaaggcggca acagctatgg ggaggtcaag 420 aagcctacag ttaacatcce ctcctctgcc 480 tcagaacaag atggttcccc accttctgaa 540 cctacgaatc ccaaaagcac ccgtgccttc 600 acaggagagc tggtctttga tcccctgtca 660 gcacggaatg ggrtatgggac acccatgact 720 cggaatqtqg gggtcatcgt ggcagccgtc 780 gtttttggca tctggtttgc ctatagcega 840 tcgagtaaga aggtgattta cagccagcct 900 acctcgtcat tcctggtgtg agcctggtcg 960 ctcaggtgct accggactct ggcccctgat 1020 cttctacacc ccacagggcc ccctacttct 1080 tgccccatcc tccttcatgc cctccctccc 1140 tgtttaaagt gtttattccc catttctttg 1200 ttgacttccc ttctaagtag acagcaaaaa 1260 tgcccacctg gctggcaggg atctttgaat 1320 ccttgtgtac tgacgaccag ggccagctgt 1380 tgaaatggtt gtttggtgat gacactgggg 1440 gtcttcccat gggaagtgcc actgggatcc 1500 ctgacattga ctgtgtctgt ggaaaatggg ISSO tcagagaact tgaagccaaa aggatttaaa 1620 gctgggcgca gtggctcacg cctgtaat.cc 1680 tcgggagttc gggatcagcc tgaccaacat 1740 ccaggcatgg tggtgcatgc ctgtagtccc 1800 aactccagct ca 1842 <400> 2 73
ΕΡ 1 205 489 /PT
Met Gly Thr Lye Ala Gin Vai Glu 1 5 Leu Ala Xle Leu Leu Cys ser Leu 20 Ser Ser Glu Pro Glu Vai Are xle 35 40 Ser Cys Ala Tyr Ser Gly Phe Ser 50 55 Asp Gin Gly Asp Thr Thr Arg Leu 65 70 Ala Ser Tyr Glu Asp Arg Vai Thr 85 ... Lye Ser Vai Thr Arg Glu Asp Thr 100 Glu Glu Gly Gly Asn Ser Tyr Gly 115 120 Leu Vai Pro Pro Ser Lys Pro Thr 130 135 Ile Gly Asn Arg Ala Vai Leu Thr 145 150 Pro Ser Glu Tyr Thr Trp Phe Lys
Arg Lys Leu Leu Cys Leu Phe Ile 10 15
Ala Leu Gly Ser Vai Thr Vai Hle 25 30
Pr© Glu Asn Aso Pro Vai Lys Leu 45
Ser Pro Arg Vai Glu Trp Lys Phe 60
Vai Cys Tyr Asn Asn Lys Ile Thr 75 80
Phe Leu Pro Thr Gly Ile Thr Phe 90 95
Gly Thr Tyr Thr Cys Met Vai Ser 105 110
Glu Vai Lys Vai Lys Leu Ile Vai 125
Vai Asn Ile Pro Ser Ser Ala Thr 140
Cys Ser Glu Gin Asp Gly Ser Pro 155 160
Asp Gly Ile Vai Met Pro Thr Asn 165 170 175 74
ΕΡ 1 205 489 /PT
Pro Lys Ser Thr Arg Ala Phe Ser Aen Ser Ser Tyr Vai Leu Asn Pro 180 185 190
Thr Thr Gly Glu Leu Vai Phe Asp Pro Leu Ser Ala Ser Asp Thr Gly 195 200 205
Glu Tyr Ser Cye Glu Ala Arg Aen Gly Tyr Gly Thr Pro Hefc Thr Ser 210 215 220
Aen Ala Vai Arg Met Glu Ala Vai Glu Arg Aen Vai Gly Vai lie Vai 225 230 235 240
Ala Ala Vai Leu Vai Thr Leu Ile Leu Leu Gly Ile Leu Vai Phe Gly 245 250 255
Ile Trp Phe Ala Tyr Ser Arg Gly Kis Phe Asp Arg Thr Lye Lys Gly 260 265 270
Thr Ser Ser Lys Lys Vai Ile Tyr Ser Gin Pro Ser Ala Arg Ser Glu 275 280 285
Gly Glu Phe Lys Gin Thr Ser ser Phe Leu Vai 290 295
<210> 3 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sintética <400> 3 tcgcggagct gtgttctgtt tccc 24
<210> 4 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sintética <400> 4 tgatcgcgat ggggacaaag gcgcaagctc gagaggaaac tgttgtgcct 50
ΕΡ 1 205 489 /PT 75 <210> <211 > <212> <213> 5 20 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sintética <400> 5 acacctggtt caaagatggg 20 <210 > <211 > <212> <213> 6 24 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sintética <400> 6 taggaagagt tgctgaaggc acgg 24 <210 > <211> <212> <213> 7 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Sintética <400> 7 ttgccttact caggtgctac 20 <210 > <211 > <212> <213> 8 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Sintética <400> 8 actcagcagt ggtaggaaag 20
Lisboa

Claims (11)

  1. ΕΡ 1 205 489 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido isolado que: (a) possui a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2, com ou sem a sequência de sinal N-terminal nos resíduos 1-27, com ou sem a metionina de iniciação, com ou sem o domínio transmembranar nos resíduos 236 a cerca de 258 e com ou sem o domínio intracelular nos resíduos de cerca de 258 a 299; ou (b) é uma variante de (a) possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO:2) ou com a sequência de aminoácidos codificada pelo ADN (DNA40628-1216) depositado sob o número de acesso ATCC 209432, e é capaz de inibir a proliferação estimulada por VEGF de células endoteliais, em que o polipéptido se destina a utilização como medicamento.
  2. 2. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o nível de identidade é de pelo menos 90%.
  3. 3. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 2, em que o nível de identidade é de pelo menos 95%.
  4. 4. Polipéptido isolado de acordo com qualquer reivindicação anterior, compreendendo os resíduos 28-258 da Figura 2.
  5. 5. Polipéptido isolado de acordo com qualquer reivindicação anterior, para utilização no tratamento de cancro.
  6. 6. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 5, para utilização na inibição da angiogénese tumoral.
  7. 7. Utilização de um polipéptido na preparação de um medicamento para o tratamento de cancro, em que o polipéptido: (a) possui uma sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2, com ou sem a sequência de sinal N-terminal nos resíduos 1-27, com ou sem a metionina de iniciação, com ou sem o domínio ΕΡ 1 205 489 /PT 2/2 transmembranar nos resíduos 236 a cerca de 258 e com ou sem o domínio intracelular nos resíduos de cerca de 258 a 299; ou (b) é uma variante de (a) possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na Figura 2 (SEQ ID NO: 2) ou com a sequência de aminoácidos codificada pelo ADN (DNA40628-1216) depositado sob o número de acesso ATCC 209432, e é capaz de inibir a proliferação estimulada por VEGF de células endotelial.
  8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que o medicamento é para a inibição da angiogénese tumoral.
  9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 7 ou a reivindicação 8, em que o nível de identidade é de pelo menos 90%.
  10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o nível de identidade é de pelo menos 95%.
  11. 11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, em que o polipéptido compreende os resíduos 28-258 da Figura 2. Lisboa,
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