PT116915B

PT116915B - Método para a extração de colagénio purificado de matrizes biológicas

Info

Publication number: PT116915B
Application number: PT116915A
Authority: PT
Inventors: Patrícia Marques Ventura Sónia; Margarida Ferreira Martins Ana; Manuel Da Costa E Araújo Pereira Coutinho João; Bisht Meena
Original assignee: Univ Aveiro
Priority date: 2020-12-03
Filing date: 2020-12-03
Publication date: 2023-05-05
Also published as: PT116915A

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE UM MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE COLAGÉNIO TIPO I DE MATRIZES BIOLÓGICAS. ESTE MÉTODO COMPREENDE ESSENCIALMENTE TRÊS ETAPAS PRINCIPAIS: PREPARAÇÃO E REMOÇÃO DE CONTAMINANTES DA BIOMASSA; EXTRAÇÃO DO COLAGÉNIO; E RECUPERAÇÃO DO COLAGÉNIO PURIFICADO NA SUA FORMA SÓLIDA. A PRIMEIRA ETAPA DESCREVE A PREPARAÇÃO DE BIOMASSA COM A SUA MOAGEM POR PROCESSO MECÂNICO, REMOÇÃO DAS PROTEÍNAS NÃO-COLAGÉNICAS E REMOÇÃO DE GORDURAS RECORRENDO AO USO DE UMA SOLUÇÃO ALCALINA E UMA SOLUÇÃO ALCOÓLICA, RESPETIVAMENTE, PARA OBTENÇÃO DE UMA MATRIZ MAIS PURA EM COLAGÉNIO TIPO I. A SEGUNDA ETAPA COMPREENDE A EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO DO TEOR DO COLAGÉNIO DA MATRIZ COM O USO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA DE UM SOLVENTE EUTÉCTICO PROFUNDO DE PH ÁCIDO. POR FIM, O TEOR DE COLAGÉNIO É RECUPERADO COM A AÇÃO DE UM AGENTE PRECIPITANTE, DIÁLISE E SECAGEM. O COLAGÉNIO OBTIDO COM APLICAÇÃO NAS ÁREAS ALIMENTAR, FARMACÊUTICA, MÉDICA, COSMÉTICA, BIOMÉDICA E NA ENGENHARIA DE TECIDOS.

Description

Método para a extração de colagénio purificado de matrizes biológicas

Domínio técnico da invenção

A presente invenção descreve um novo método para a obtenção de colagénio tipo I de matrizes biológicas.

Este método compreende essencialmente três etapas principais: preparação e remoção de contaminantes da biomassa; extração do colagénio; e recuperação do colagénio purificado na sua forma sólida. A primeira etapa descreve a preparação de biomassa com a sua moagem por processo mecânico, remoção das proteínas não-colagénicas e remoção de gorduras recorrendo ao uso de uma solução alcalina e uma solução alcoólica, respetivamente, para obtenção de uma matriz mais pura em colagénio tipo I. A segunda etapa compreende a extração sólido-líquido do teor do colagénio da matriz com o uso de uma solução aquosa de um solvente eutéctico profundo de pH ácido. Por fim, o teor de colagénio é recuperado com a ação de um agente precipitante, diálise e secagem. 0 colagénio obtido com aplicação nas áreas alimentar, farmacêutica, médica, cosmética, biomédica, tem sido igualmente reconhecido de elevado interesse mais especificamente na engenharia de tecidos.

Desta forma, a presente invenção insere-se no domínio técnico dos processos químicos de extração de proteínas fibrosas, nomeadamente de resíduos da indústria do peixe em particular de resíduos da indústria do bacalhau.

Antecedentes da invenção colagénio é uma proteína fibrosa conhecida como a mais importante proteína do tecido conjuntivo. Esta representa cerca de 25% do teor total de proteínas em vertebrados e, até hoje, já são conhecidos pelos menos 29 tipos diferentes de colagénio.¹ Os diferentes tipos de colagénio distinguemse entre si pela sua composição em aminoácidos e estrutura molecular. Entre estes, é o colagénio tipo I que se encontra presente em maior quantidade em matrizes extracelulares. Este é especialmente caracterizado pela sua estrutura em tripla hélice contendo duas cadeias idênticas (al e a2) .¹ colagénio já foi reportado pela sua biocompatibilidade, biodegradabilidade, baixa imunogenicidade, não toxicidade e baixa antigenicidade, o que potência a sua aplicação em diferentes áreas como a alimentar, nutracêutica e cosmética.²Contudo é em setores de atividade relacionados com a saúde onde o seu valor é potenciado, nomeadamente na farmacêutica, engenharia de tecidos, ortopedia e no fabrico de dispositivos médicos.¹ colagénio é habitualmente isolado de peles de animais mamíferos como vacas e porcos, o que acarreta preocupações acrescidas em relação ao surgimento de problemas de saúde associados a estes animais, mas também questões éticas de foro religioso, na sua utilização.³ Assim sendo, surge uma necessidade de procura de novas fontes de colagénio onde a indústria do peixe se pode apresentar como alternativa. Os resíduos da indústria do peixe em forma de pele, espinhas, cabeça, vísceras e escamas, representam cerca de 75% em massa do conteúdo do peixe e que são descartados.⁴

A literatura revê e descreve diferentes metodologias para obtenção de colagénio com diferentes origens. A preparação das matrizes é o primeiro passo e envolve normalmente a separação e lavagem dos tecidos, redução do tamanho por corte ou trituração, e tratamentos químicos iniciais para remover impurezas como proteínas não-colagénicas e gorduras.⁴ Os métodos mais comuns usados para extrair colagénio incluem tratamentos ácidos e enzimáticos.^5-7 Aqui, um conjunto de parâmetros, como a temperatura, tempo de extração, pH, razão sólido-líquido, solvente e tempo de agitação podem resultar na obtenção de diferentes rendimentos de extração. Por fim, é incluído um passo de recuperação do colagénio onde normalmente o colagénio é precipitado usando uma solução de NaCl.⁴

Diferentes métodos foram já reportados para a obtenção de colagénio, nomeadamente, o colagénio obtido de resíduos da indústria do peixe. No entanto, o passo descrito para a sua extração recorre maioritariamente ao uso de soluções de ácidos, como ácido acético, cítrico e/ou lático³'^7-9 ou a enzimas, como a papaína, pepsina ou tripsina.^10-13 Contudo, estes são descritos como tendo:

a) Rendimentos de extração baixos, ou;

b) Desnaturação irreversível do colagénio na forma de gelatina;

c) Pureza baixa (baixa seletividade na extração);

d) Elevados custos associados ao processo, nomeadamente pelo uso de tratamentos enzimáticos.

Existem ainda metodologias descritas que fazem uso de técnicas mecânicas de extração como a extração assistida por ultrassons¹⁴ ou ainda usando técnicas de alta pressão de dióxido de carbono-água acidificada.¹⁵ Contudo, estes tornam o escalonamento mais complicado e exigem equipamentos específicos. Além disso, estão normalmente associados à aplicação de temperaturas de processamento muito elevadas, que, para além do consumo energético elevado que representam, no caso de colagénio obtido de fontes marinhas podem representar a sua desnaturação.¹⁶

Estudos mais recentes apontaram ainda o uso de líquidos iónicos¹⁷'¹8 ou misturas de solventes eutécticos¹⁹ como solventes alternativos na extração do colagénio. Contudo, também estes processos aplicam temperaturas de processamento muito elevadas, provocando perdas consideráveis de colagénio promovidas pela sua degradação térmica.¹⁶

A presente invenção pretende colmatar as falhas existentes nos processos já descritos, nomeadamente pelo aumento do rendimento de extração e aumento de pureza através do uso de metodologias simples, rentáveis, que não usam equipamentos específicos nem recorrem ao uso de temperaturas muito elevadas, evitando assim a degradação do colagénio.

Neste sentido, neste processo inventivo solventes eutécticos são usados na etapa de extração num processo que decorre inteiramente a 4°C, para garantir a estabilidade e manutenção da bioatividade do colagénio sem abdicar de elevados rendimentos de extração e pureza.

Sumário da invenção

Este método compreende essencialmente três etapas principais: preparação e remoção de contaminantes da biomassa; extração do colagénio; e recuperação do colagénio purificado na sua forma sólida. A primeira etapa descreve a preparação de biomassa com a sua moagem feita por processo mecânico, remoção das proteínas não-colagénicas e remoção de gorduras recorrendo ao uso de uma solução alcalina e uma solução alcoólica, respetivamente, para obtenção de uma matriz mais pura em colagénio tipo I. A segunda etapa compreende a extração sólido-líquido do teor do colagénio da biomassa com o uso de uma solução aquosa de um solvente eutéctico profundo de pH ácido. Por fim, o teor de colagénio é recuperado com a ação de um agente precipitante, diálise e secagem. 0 colagénio obtido com aplicação nas áreas alimentar, farmacêutica, médica, cosmética, biomédica, tem sido igualmente reconhecido de elevado interesse mais especificamente na engenharia de tecidos.

Desta forma, a presente invenção insere-se no domínio técnico dos processos químicos de extração de proteínas fibrosas, nomeadamente de resíduos da indústria do peixe e em particular, de resíduos da indústria do bacalhau.

Descrição geral da invenção

Este método compreende essencialmente três etapas principais: preparação e remoção de contaminantes da biomassa; extração do colagénio; e recuperação do colagénio purificado na sua forma sólida. A primeira descreve a preparação de biomassa com a sua moagem por processo mecânico, remoção das proteínas não-colagénicas e remoção de gorduras recorrendo ao uso de uma solução alcalina e uma solução alcoólica, respetivamente, para obtenção de uma matriz mais pura em colagénio tipo I. A segunda etapa compreende a extração sólido-líquido do teor do colagénio da biomassa com o uso de uma solução aquosa de um solvente eutéctico profundo de pH ácido. Por fim, o teor de colagénio é recuperado por precipitação com sal em solução tampão, diálise para remoção do sal e secagem para remoção da água.

Descrição das Figuras

Figura 1: Diagrama de blocos em representação do processo inventivo onde se descreve a obtenção de colagénio purificado de matrizes biológicas.

Figura 2: Dados de (A) Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR), e (B) eletroforese em gel de poliacrilamida em dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) do colagénio tipo I obtido, sem formação de produtos de degradação.

Figura 3: Dicroismo circular (CD) do colagénio tipo I obtido, com manutenção da integridade estrutural.

Descrição detalhada da invenção presente processo inventivo descreve um método para a extração de colagénio tipo I purificado de matrizes biológicas.

A Figura 1 descreve este processo inventivo onde se identificam três etapas principais, que incluem:

Etapa 1) Preparação da biomassa, que envolve a lavagem e trituração/moagem da biomassa, e remoção de contaminantes da biomassa, nomeadamente, remoção de proteínas não-colagénicas e gordura;

Etapa 2) Extração do colagénio para solução aquosa de solvente eutéctico profundo de pH ácido usando a matriz obtida da etapa 1);

Etapa 3) Precipitação do colagénio presente no extrato obtido na etapa 2) e recuperação do colagénio purificado na sua forma sólida depois de sujeito a diálise para eliminação dos sais usados no processo de precipitação, em água desionizada, preferencialmente por 72 horas e secagem da água.

Após análise detalhada da amostra de colagénio obtida no final da etapa 3), e comparando com uma amostra obtida de uma metodologia convencional usando como solvente de extração uma solução aquosa de ácido acético, comprovou-se:

a) a presença de colagénio tipo I (Figura 2A) ,

b) menor teor de produtos de degradação e um maior grau de pureza (Figura 2B), c) maior rendimento de extração, e d) preservação da integridade da estrutura secundária da amostra de colagénio, contrariamente ao que acontece com o produto obtido usando o processo convencional, i.e. usando apenas ácido acético como solvente de extração.

Este processo inventivo pode ser aplicado no processamento de qualquer matriz biológica com elevado teor de colagénio nomeadamente, pele, espinhas e/ou ossos. Preferencialmente são usadas peles, mais preferencialmente de bacalhau (filo Gadus morbua).

A biomassa pode ser usada fresca ou seca, mas preferencialmente biomassa fresca, pois facilita a trituração/moagem dos tecidos, que por sua vez, aumentam a área de contacto solvente/biomassa, levando ao aumento do rendimento de extração.

1. Preparação e remoção de contaminantes da biomassa - Etapa (D

A biomassa selecionada, em seco ou em fresco, preferencialmente em fresco, é processada imediatamente após recolha ou é acondicionada congelada a -20°C depois de lavada com água corrente e destilada, sendo posteriormente utilizada na Etapa (1) após descongelamento.

Na Etapa (1) a biomassa é triturada, preferencialmente fresca, para aumentar a área de contacto entre o solvente e a biomassa.

As proteínas não-colagénicas e gorduras, consideradas como contaminantes, são removidas.

Para a remoção das proteínas não-colagénicas é adicionada uma solução alcalina forte numa concentração entre 0,05 e 0,5 M, numa razão sólido-líquido entre 0,1 e 0,01 (m/v) em sistema de agitação.

As soluções alcalinas adequadas para serem usadas no passo de remoção de proteínas não-colagénicas são, por exemplo, hidróxido de sódio (NaOH) ou hidróxido de potássio (KOH), preferencialmente NaOH, devendo esta ser renovada a cada 56 horas.

A remoção das proteínas não-colagénicas decorre durante 12 a 60 horas, preferencialmente 48 horas, a uma temperatura de 4°C.

A biomassa é separada, por centrifugação ou filtração, e lavada com água fria, promovendo um abaixamento do pH.

Após a remoção das proteínas não-colagénicas, segue-se a remoção do teor de gordura da amostra.

Para a remoção do teor de gordura da biomassa é adicionada uma solução alcoólica numa concentração entre 5 e 15% (v/v), numa razão sólido-líquido entre 0,1 e 0,01 (m/v) em sistema de agitação.

As soluções alcoólicas adequadas para serem usadas no passo de remoção do teor de gordura da biomassa são, por exemplo, butanol ou isopropanol, preferencialmente butanol, devendo esta ser renovada a cada 5-6 horas.

A remoção do teor de gordura decorre durante 12 a 60 horas, preferencialmente 48 horas, a uma temperatura de 4°C.

Preferencialmente, e durante toda a manipulação até obtenção do produto final, o ambiente deve ser controlado, pela manutenção da temperatura entre 1°C e os 6°C, evitando a degradação do colagénio.

A biomassa é novamente separada por centrifugação ou filtração, e lavada com água fria.

2. Extração sólido-líquido do colagénio - Etapa (2)

A Etapa (2) é realizada a partir da matriz resultante da Etapa (1), onde é promovido o contacto entre a biomassa desengordurada e uma solução aquosa de solvente eutéctico profundo de pH ácido.

As soluções aquosas de solvente eutéctico profundo adequadas para serem usadas no passo de extração sólido-líquido têm, preferencialmente, pH ácido, sendo compostas por combinações de betaína ou ureia como aceitadores de pontes de hidrogénio e ácido lático, ácido propiónico ou ácido acético como dadores de pontes de hidrogénio, entre outros, em proporções molares entre 1:1 e 1:5, isto é, razão molar entre o composto aceitador e dador de pontes de hidrogénio.

As soluções aquosas de solvente eutéctico profundo adequadas devem estar numa concentração entre 0,15 e 1,0 M, ocorrendo a extração numa razão sólido-líquido entre 0,1 e 0,01 (m/v) num sistema em agitação entre as 50 e 300 rotações/minuto.

A extração sólido-líquido decorre durante 12 a 60 horas, preferencialmente 48 horas, a uma temperatura de 4°C.

Após o período de extração sólido-líquido, é separado, por filtração ou centrifugação, todo o teor não solúvel no solvente. A fração líquida, que contém o colagénio, segue para a Etapa (3).

3. Recuperação do colagénio purificado na sua forma sólida - Etapa (3)

À fração líquida obtida da Etapa (2), é adicionada uma quantidade de um agente precipitante, preferencialmente um sal, preferencialmente o cloreto de sódio (NaCl). A concentração final de agente precipitante usada é preferencialmente entre 1 e 3 M, preferencialmente 2 M, em solução tampão, a pH próximo a 7,5.

Como resultado deste processo, um sólido húmido de cor branca correspondente ao colagénio tipo I purificado, o qual é depois sujeito a diálise para remoção do sal remanescente e seco para remoção da água.

Este processo inventivo representa um processo de elevada eficiência no que diz respeito ao aumento do rendimento de extração, diminuição da degradação do colagénio obtido e aumento de pureza em relação aos processos ditos convencionais, como uma solução aquosa de ácido.

Por fim, este processo inventivo permite o aproveitamento e valorização de resíduos da indústria e consequentemente o seu desenvolvimento sustentável, nomeadamente da indústria do peixe, para a obtenção de um produto de valor acrescentado que pode ser aplicado nos setores alimentar, farmacêutico, saúde, cosmético, biomédico, com potencial relevante na engenharia de tecidos.

4. Recuperação dos solventes e compostos usados ao longo das etapas anteriores - Etapa (4)

Uma quarta etapa pode ser adicionada ao processo a patentear para reutilização dos solventes usados, contribuindo para a maior sustentabilidade e viabilidade económica do processo.

Exemplos

Exemplo 1. Preparação e remoção de contaminantes da biomassa

A Etapa (1) do processo inventivo foi realizada como se descreve.

Uma amostra de pele de bacalhau, já desprovida de carne e espinhas foi lavada com água corrente e, por fim, foi novamente lavada com água destilada. O excesso de água foi removido e as peles foram trituradas por alguns segundos numa picadora de carne até se obterem partículas com cerca de 3 mm de diâmetro.

gramas da biomassa triturada foram colocadas num Erlenmeyer. De forma a remover as proteínas não-colagénicas, 50 mL de uma solução de 0,1 M de NaOH foram adicionados, com agitação constante, a 4°C. A solução alcalina foi trocada a cada 5-6 h, num total de 48 h.

Após o período estabelecido, a biomassa foi separada da solução alcalina e lavada com água fria até obter um pH neutro.

Seguidamente, de forma a remover o teor de gordura da biomassa, 50 mL de uma solução de 10% (v/v) de butanol foram adicionados, sob agitação a 4°C, à biomassa obtida do passo anterior. A solução alcoólica foi trocada a cada 5-6 h, num total de 48 h.

A biomassa foi separada da solução alcoólica e lavada com água fria destilada.

Exemplo 2. Extração sólido-líquido do colagénio

A biomassa usada no Exemplo 1 foi usada no seguimento da extração sólido-líquido.

mL de uma solução de 0,75 M de ureia e ácido lático (U:LA) numa razão molar de 1:2 foram adicionados, com agitação constante de 100 rotações/minuto, a 4°C durante 48 h.

Posteriormente, a biomassa é separada do solvente (U:LA) por aplicação de métodos convencionais de separação.

nomeadamente por centrifugação a 4690 g, a 4°C por 30 minutos.

Exemplo 3. Recuperação do colagénio purificado

Ao extrato rico em colagénio, foi adicionado NaCl tamponizado em solução de Tris-HCl (pH 7,5 e 0,5M) até uma concentração final de 2 M, para precipitação do colagénio.

Após precipitação, para remoção do liofilizador) para o colagénio sólido sal remanescente remoção da água.

obtido foi dialisado e seco (estufa ou

Exemplo 4. Caracterização e análise do colagénio obtido

O rendimento de extração é calculado pela razão entre a massa de colagénio seco obtido no Exemplo 3 e a massa de pele de bacalhau seca usada na extração.

A análise da amostra de colagénio obtido na etapa de recuperação do colagénio purificado no Exemplo 3 foi feita por FTIR (Brucker Tensor 27) numa gama entre 4000-250 cm^-1pela a acumulação de 256 varrimentos e uma resolução de 4 cm¹, com subtração do respetivo branco.

A identificação do colagénio foi realizada com base na vibração específica das ligações químicas em determinados comprimentos de onda, em comparação com as ligações conhecidas e já descritas na literatura e em comparação com uma amostra de colagénio comercial.

A presença de colagénio e/ou outras proteínas foi confirmada por eletroforese SDS-PAGE (acúmulo: 4% e resolução: 20%) com um tampão de corrida (pH 8,3) que consiste em 25 mM de TrisHC1, 1,92 M de glicina e 1% de dodecilsulfato de sódio. A amostra de colagénio foi corada com 0,1% (m/v) de Coomassie Brilliant Blue G-250, 50% (v/v) de metanol, 7% (v/v) de ácido acético, e 42,9% (v/v) de água), num agitador orbital com uma agitação moderada (± 50 rotações/minuto), por 4 horas a temperatura ambiente. Os géis foram descoloridos numa solução contendo 7% (v/v) de ácido acético, 20% (v/v) de metanol e 73% (v/v) de água num agitador orbital por 12 horas em agitação moderada (± 60 rotações/minuto) à temperatura ambiente.

A identificação do colagénio, substâncias contaminantes e/ou produtos de degradação foi feita tendo em conta a massa molecular obtida e comparada com as proteínas padrão de massa molecular conhecida presente do padrão adicionado ao gel assim como com as bandas referentes às subunidades do colagénio (ai, «2 e β) da amostra de colagénio comercial.

As amostras secas obtidas no Exemplo 3, foram primeiramente ressuspendidas em 1% (v/v) de ácido acético numa concentração de 0,5 mg.mL^-1 e incubadas a 4°C por 6 h. A caracterização da estrutura secundária da amostra de colagénio foi realizada por dicroísmo circular num espetrofotómetro Jasco-1500 equipado com um sistema Peltier para controlo de temperatura a 2°C em cuvetes de dicroísmo circular pré-arrefecidas. Os espetros foram recolhidos entre 180 e 280 nm em cuvetes de 0,1 cm de percurso ótico. A linha de base correspondente ao branco foi subtraída, cada espetro correspondendo a três varrimentos. A largura de banda e o tempo de resposta foram de 1,0 nm e 1 s, respetivamente.

As análises por dicroismo circular permitem verificar a manutenção ou degradação da estrutura secundária. As comparações foram feitas segundo os espetros caracteristicos de cada tipo de estrutura secundária, já descrita na literatura, e com uma amostra de colagénio tipo I comercial. Referências (1) Silva, T. H. ; Moreira-Silva, J. ; Marques, A. L. P.; Domingues, A.; Bayon, Y.; Reis, R. L. Marine Origin Collagens and Its Potential Applications. Mar. Drugs 2014, 12, 5881-5901.

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Claims

1. Método para a extração de colagénio tipo I de matrizes biológicas contendo colagénio tipo I caracterizado por compreender as seguintes etapas:

- Etapa 1:lavagem, moagem por processo mecânico da biomassa contendo colagénio tipo I, remoção das proteínas nãocolagénicas, contaminantes e remoção de gorduras recorrendo ao uso de uma solução alcalina e uma solução alcoólica;

- Etapa 2:extração sólido-líquido do colagénio da matriz com o uso de uma solução aquosa de um solvente eutéctico profundo de pH ácido;

- Etapa 3: recuperação do colagénio tipo I puro, por ação de um agente precipitante, diálise e secagem;

e em que a biomassa compreendendo colagénio do tipo I é selecionada de resíduos de peixe, preferencialmente peles ou espinhas, mais preferencialmente peles, e ainda mais preferencialmente peles de bacalhau.

2. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela biomassa contendo colagénio do tipo I ser usada fresca ou seca, preferencialmente fresca.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura na Etapa 1 ser feito primeiramente com uma solução alcalina, preferencialmente hidróxido de sódio ou hidróxido de potássio, para a remoção de proteínas nãocolagénicas e de seguida com uma solução alcoólica para desengordurar a biomassa.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura na Etapa 1, serem feitas com uma solução de NaOH e butanol, respetivamente.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura feita na Etapa 1, com soluções de concentrações entre 0,05 e 0,5 M de NaOH e entre 5 e 15% (v/v) de butanol.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura na Etapa 1, feita com soluções de concentrações de 0,1 M de NaOH e 10% (v/v) de butanol.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura feita na Etapa 1 estar numa razão sólido-líquido entre 0,01 e 0,1 (m/v).

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura na Etapa 1 estar numa razão sólidolíquido de 0,1 (m/v).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura na Etapa 1 decorrer durante 12 a 60 h, com mudança de solventes a cada 5-6 h, a uma temperatura entre 1°C e 6°C.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas não2 colagénicas e gordura na Etapa 1 decorrer durante 48 h, a uma temperatura de 4°C.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e gordura na Etapa 1 poder ser feita apenas com o uso de sistema de agitação.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a remoção de proteínas nãocolagénicas e remoção de gordura na Etapa 1 serem ambas concluídas, em separado, com lavagem com água fria, no final de cada passo, respetivamente.

13. Método, de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I da biomassa com recurso a uma solução aquosa de solvente eutéctico profundo composto por combinações de betaína ou ureia e ácido lático, ácido propiónico ou ácido acético.

14. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I da biomassa com recurso a uma solução aquosa de solvente eutéctico profundo composto por ureia (U) e ácido lático(LA), U:LA.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I da biomassa com recurso a uma solução aquosa de solvente eutéctico profundo em proporções molares de ureia e ácido lático o estar entre 1:1 e 1:5.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I da biomassa com recurso a uma solução aquosa de solvente eutéctico profundo em proporções molares de ureia e ácido lático ser de 1:2.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I da biomassa com recurso a uma solução aquosa de solvente eutéctico profundo numa concentração entre 0,15 e 1,0 M.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I da biomassa com recurso a uma solução aquosa de solvente eutéctico profundo numa concentração de 0,75 M.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I, ocorrendo a extração numa razão sólido-líquido entre 0,1 e 0,01 (m/v), preferencialmente 0,1 (m/v), num sistema em agitação entre 50 e 300 rotações/minuto, preferencialmente 100 rotações/minuto.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I, a qual decorre entre 12 a 60 horas, a uma temperatura entre 1°C e 6°C.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 2 ser a etapa de extração do colagénio tipo I, decorrendo esta durante 48 horas, a uma temperatura de 4°C.

22. Método de acordo com as reivindicações 1-12, caracterizado pela aplicação de uma centrifugação a 4690gr, temperatura de 4°C durante 30 minutos.

23. Método de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizado por a Etapa 3 ser a etapa de recuperação do colagénio tipo I por precipitação com um sal inorgânico tamponizado.

24. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por a Etapa 3 ser a etapa de recuperação do colagénio tipo I por precipitação com NaCl em tampão numa solução de Tris-HCl 0,5M e pH 7,5.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 3 ser a etapa de recuperação do colagénio tipo I por precipitação com NaCl em tampão numa concentração final entre 1 e 3 M.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 3 ser a etapa de recuperação do colagénio tipo I por precipitação com NaCl em tampão numa concentração final de 2 M.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 3 ser a etapa de recuperação do colagénio tipo I húmido em estado sólido sujeito a um processo de diálise para remoção do sal remanescente.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 3 ser a etapa de recuperação do colagénio tipo I húmido em estado sólido sujeito a um processo de diálise para remoção do sal remanescente em água desionizada, preferencialmente por 72 horas.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a Etapa 3 ser a etapa de recuperação do colagénio tipo I húmido em estado sólido seco após remoção da água por liofilização.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se realizar entre 1°C e 6°C.