PT115474B - Nanossistema magnético e método para produzir o nanossistema - Google Patents

Abstract

O PRESENTE PEDIDO DIVULGA UM NANOSSISTEMA MAGNÉTICO QUE COMPREENDE MAGNETOLIPOSSOMAS E UM MÉTODO PARA PRODUZIR OS MAGNETOLIPOSSOMAS. MAGNETOLIPOSSOMAS SÃO NANOTRANSPORTADORES BASEADOS EM LIPOSSOMAS QUE INTEGRAM NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS. ESTES CONSISTEM NUM NÚCLEO MAGNÉTICO INTERNO, QUER SEJA UM AGLOMERADO DE NANOPARTÍCULAS OU UM FLUIDO MAGNÉTICO, COBERTO POR UMA BICAMADA LIPÍDICA. OS MAGNETOLIPOSSOMAS PODEM SER CARREGADOS COM UM TIPO OU MAIS DE UM TIPO DE MOLÉCULAS, PARTICULARMENTE FÁRMACOS TERAPÊUTICOS QUE SERÃO LIBERTADOS DE ACORDO COM O ALVO ESPECÍFICO DA DOENÇA, PARTICULARMENTE UM CANCRO. NESTE SENTIDO, A COMPOSIÇÃO LIPÍDICA DA BICAMADA PODE SER MANIPULADA DE ACORDO COM O TIPO DE FAMÍLIA DO CANCRO A SER TRATADO E COM OS REQUISITOS ESPECÍFICOS DO MICROAMBIENTE.

Description

DESCRIÇÃO NANOSSISTEMA MAGNÉTICO E MÉTODO PARA PRODUZIR O

NANOSSISTEMA

Campo Técnico presente pedido refere-se a um nanossistema magnético e a um método para produzir o nanossistema.

Antecedentes da invenção

As palavras cancro, tumor e neoplasia são termos genéricos que definem uma ampla gama de doenças caracterizadas pela proliferação descontrolada de células de um determinado tecido ou órgão como resultado de alterações genéticas ou epigenéticas nas células somáticas. 0 cancro é uma das principais causas de morte no mundo, com uma estimativa de 7,6 milhões de mortes por ano e um aumento previsto para 13,1 milhões até 2030 (Singh, 2008) . Os principais obstáculos na luta contra o cancro incluem (i) a ausência de biomarcadores eficazes no diagnóstico e prognóstico; (ii) métodos invasivos de diagnóstico e tratamento; (iii) perfil epigenético reduzido; (iv) falta de tratamentos individualizados; (v) limitações associadas a agentes quimioterapêuticos existentes e (vi) a ocorrência de metástases.

Embora não exista um regime de tratamento padrão adotado, a maioria dos doentes geralmente é submetida a cirurgia, quimioterapia (QT) e radioterapia (RT) . Estes tratamentos não têm eficácia terapêutica suficiente e estão associados a efeitos secundários graves que podem diminuir a qualidade de vida do doente e, em alguns casos, levar à suspensão do tratamento. A maioria das moléculas de fármacos terapêuticos possui uma farmacocinética limitada e sem seletividade, que induz toxicidade em regiões não-alvo e causa efeitos secundários graves. Para superar alguns dos obstáculos dos tratamentos convencionais, foram exploradas novas abordagens que integram princípios biológicos em nanoescala. Os sistemas controlados de administração de fármacos para atingir locais específicos tornaram-se cada vez mais importantes como uma abordagem para superar a falta de especificidade dos agentes citotóxicos convencionais (Caban, 2014; Cho, 2008) . Tais sistemas podem melhorar as propriedades das moléculas de fármacos terapêuticos e a sua farmacocinética, aumentando o tempo meia-vida em circulação (agindo como nanotransportadores furtivos para o sistema imunológico) e superando certas barreiras biológicas, tais como a barreira hematoencefálica (Pradhan, 2010; Caban, 2014) . A aplicação destes nanomateriais no tratamento do cancro já demonstrou melhorar o comportamento dos fármacos. O primeiro sucesso na pesquisa em nanomedicina foi a aprovação da doxorrubicina lipossomal para uso clínico (Doxil®, aprovado em 1995). Desde então, vários produtos à base de lipossomas foram aprovados para terapia do cancro, tais como DaunoXome® aprovado em 1996, Depocyt® aprovado em 1999, Myocet® aprovado em 2000, Mepact® aprovado em 2004, Mepact® aprovado em 2004, Marqibo® aprovado em 2012 e Onivyde™ aprovado em 2015.

Embora os produtos à base de lipossomas tenham mostrado uma melhoria na farmacocinética das moléculas de fármacos terapêuticos, têm sido exploradas abordagens de direcionamento ativo para melhorar uma interação específica com células cancerígenas. Consequentemente, têm sido investigados ligandos específicos e porções de superfície para a internalização eficiente de nanotransportadores por direcionamento ativo, a saber, recetores de folato ou transferrina, glicoproteinas, EGFR (recetor do fator de crescimento epidérmico) e aptâmeros de ssADN ou ARN (oligonucleótidos de ácido nucleico monocatenário que se ligam aos seus alvos com alta especificidade e afinidade). No entanto, a validação clínica do direcionamento ativo é limitada e não é facilmente alcançável. Apesar da melhoria da biodistribuição e dos resultados terapêuticos dos lipossomas direcionados a ligandos, as suas vantagens não foram comprovadas em ensaios clínicos. Outro mecanismo para melhorar a eficácia dos lipossomas é a sensibilidade a estímulos específicos, com base nas diferenças fisiológicas entre os tecidos normal e tumoral. Por exemplo, hipoxia (privação de oxigénio), pH baixo, alta temperatura, potencial redox elevado e níveis regulados de proteína/enzima. A fim de melhorar a libertação de fármacos nos locais alvo, foi explorada uma nova geração de lipossomas focada em tecnologias que fazem uso de estímulos exógenos (como pulsos elétricos/radiação de alta energia, ultrassom e luz) . No entanto, todas apresentam limitações e nenhuma permite o controlo físico sobre a localização dos nanotransportadores. A localização das nanopartícuias magnéticas pode ser controlada pelo uso de um gradiente de campo magnético externo e, sob ação de um campo magnético alternado, permitem a geração de calor. Particularmente, nanopartícuias com comportamento superparamagnético são de maior interesse, pois só apresentam magnetização na presença de um campo magnético externo. 0 facto de não apresentarem magnetismo permanente mostra-se como uma mais valia, pois impede a sua agregação (na ausência de um campo magnético). Com base nisso, as nanopartícuias magnéticas são muito desejáveis para a entrega controlada de fármacos e hipertermia. A hipertermia por fluido magnético é uma abordagem terapêutica na qual o doente é submetido a ondas eletromagnéticas com frequências da ordem de 100 a 1000 kHz . Este estímulo incita a produção de calor pelas nanopartícuias e aumenta a temperatura do tecido tumoral (entre 43 °C e 46 °C), a fim de interromper os processos de regulação e crescimento das células tumorais. Nestas temperaturas, o calor causa danos estruturais nas células tumorais, levando-as à apoptose. Além dos danos diretos às células, a hipertermia pode induzir um efeito sinérgico com a quimioterapia e a radioterapia, na medida em que as células tumorais se tornam mais sensíveis a estes tratamentos.

Apesar de serem promissoras para o tratamento do cancro (entrega controlada de fármacos e hipertermia), as nanopartícuias magnéticas aprovadas pela EDA são principalmente para ressonância magnética (Feridex® e Lumirem®) e doença renal crónica (Venofer®, Ferrlecit®, INFeD® e Dexlron®). Mais recentemente, a terapia Nanotherm® foi a primeira terapia baseada em nanopartícuias magnéticas aprovada (2010) e utiliza nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro revestidas com aminosilano biocompatível para tratamento de glioblastoma. As nanopartícuias magnéticas apresentam algumas questões relacionadas com a sua acumulação, degradação e depuração. De facto, alguns dos produtos aprovados pela FDA (Feridex® e Lumirem®), ambos baseados em SPION (nanopartícuias superparamagnéticas de óxido de ferro) não estão mais disponíveis comercialmente. Estudos recentes demonstraram que estas nanopartícuias de óxido de ferro exibem atividade semelhante à peroxidase, levando à produção de espécies reativas de oxigénio (ROS, Reactive Oxygen Species) , mostrando assim alguma toxicidade.

A fim de superar os problemas dos lipossomas e das nanoparticuias magnéticas, foram propostos lipossomas magneto-sensiveis, que combinam as vantagens de ambos. Os magnetolipossomas são conhecidos pelo seu potencial no campo do diagnóstico e da terapia do cancro. Moléculas de fármacos terapêuticos podem ser encapsuladas em lipossomas por encpasulamento passivo ou ativo. No encapsulamento passivo, os fármacos são encapsulados durante a formação de lipossomas, nos quais os fármacos lipofilicos são presos na bicamada lipidica e os fármacos hidrofilicos no compartimento aquoso. No encapsulamento ativo, as moléculas de fármaco são carregadas nos lipossomas preformados. Este processo é conduzido por um potencial eletroquimico criado pelos gradientes de pH ou iões estabelecidos através da bicamada lipidica dos lipossomas, que são criados durante a preparação dos lipossomas usando um tampão de pH especificado e concentração de iões. Este nanossistema tem a capacidade de encapsular, transportar e libertar fármacos devido à sua capacidade de gerar calor (quando submetido a um campo magnético alternado) combinado com a termossensibilidade da composição da bicamada lipidica. Em comparação com lipossomas, os magnetolipossomas oferecem várias vantagens em oncologia, tais como capacidade de orientação (usando um campo magnético permanente) , libertação controlada por estímulo magnético e hipertermia. Portanto, os magnetolipossomas promovem uma melhoria na libertação do fármaco no tecido de interesse, oferecem a possibilidade de terapia combinada (quimioterapia e hipertermia) e penetração intracelular mais profunda de fármacos no ambiente do tumor. Atualmente, a principal desvantagem deste tipo de nanossistema permanece no comportamento magnético final dos magnetolipossomas. Isso acontece porque a proporção entre os componentes magnéticos e os não magnéticos diminui (após o encapsulamento das nanoparticuias magnéticas nos lipossomas), comprometendo o comportamento magnético geral dos nanossistemas magnéticos.

Em relação aos produtos de base magnética desenvolvidos (documentos US2003/0211045 Al, US 2008/0260648 Al, US 2013/0302408 Al, US 2017/0151174 Al), os mesmos compreendem lipossomas e nanoparticuias magnéticas. Os mencionados acima fornecem nanossistemas que contêm um núcleo magnético, tipicamente de óxidos metálicos, que é constituído por vários elementos de metal de transição. No entanto, as nanoparticuias de óxido de ferro mostraram atividade semelhante à peroxidase que pode causar danos graves aos componentes celulares e induzir respostas inflamatórias. Em comparação com os documentos citados, a solução atualmente descrita fornece nanoparticuias de óxido de ferro com base em elementos biocompatíveis. Este produto é baseado em nanoparticuias de ferrite e ferrite mista de metais alcalinoterrosos (berílio, magnésio, estrôncio de cálcio, bário e rádio), sendo candidatos fortes, altamente biocompatíveis devido à sua taxa de oxidação reduzida e, consequentemente, espécies menos produção de radicais de oxigénio (ROS).

Os métodos existentes para a síntese de magnetolipossomas não são simples ou rápidos e as insuficientes propriedades magnéticas resultantes comprometem a sua eficácia terapêutica. Novas abordagens, nas quais o revestimento ocorre somente após a síntese das nanoparticuias, foram concebidas para melhorar o magnetismo dos magnetolipossomas. No entanto, estas vias são demoradas ou complexas. Por exemplo, um procedimento de diálise pode levar até dois dias e não tem o controlo adequado dos diâmetros dos magnetolipossomas e da distribuição de tamanhos. A hidratação por filme fino tem sido um dos protocolos mais utilizados, no entanto, é relatado que pode formar estruturas multilamelares, exibir baixa eficiência de encapsulamento de fármacos e não pode controlar a distribuição de diâmetro e tamanho das estruturas sintetizadas. Nos primeiros métodos de síntese elaborados de magnetolipossomas, a síntese de nanopartícuias e a bicamada lipídica são formadas ao mesmo tempo. Como resultado, a etapa de calcinação (um procedimento adicional que melhora as propriedades magnéticas das nanopartícuias) não é permitida, uma vez que as altas temperaturas destroem a bicamada lipídica. Além disso, as nanopartícuias usadas neste tipo de nanossistema possuem tipicamente uma estrutura esférica. Estudos recentes demonstraram que estruturas não esféricas (por exemplo, prismas, hastes, cubos) aumentam as propriedades magnéticas totais devido ao aumento da anisotropia da forma da nanopartícuia.

A presente solução descreve uma via para a síntese de uma nova geração de magnetolipossomas para melhor efeito terapêutico. Aqui, as nanopartícuias magnéticas sintetizadas apresentam, de preferência, uma inerente anisotropia de forma superior, que se traduz numa melhor resposta magnética e capacidade de aquecimento. Além disso, como a etapa de calcinação é independente do encapsulamento das nanopartícuias nos lipossomas, o comportamento magnético geral dos nanossistemas é garantido por este procedimento adicional. Além disso, a presente solução para encapsulamento de nanopartícuias garante que o produto final possua uma morfologia e, distribuição de tamanho bem definidas e que o comportamento magnético seja semelhante às nanoparticulas em solução, aumentando a proporção entre os componentes magnéticos e não magnéticos da estrutura final. Sumário presente pedido de patente refere-se a um nanossistema magnético caracterizado por magnetolipossomas que compreendem:

uma bicamada lipidica que compreende lipidos de dipalmitoilfosfatidilcolina, que circunda um

- núcleo magnético interno; e

- moléculas de fármacos terapêuticos.

Numa forma de realização, os magnetolipossomas têm um tamanho entre 100 e 200 nm.

Numa forma de realização, o núcleo magnético interno compreende nanoparticulas superparamagnéticas com tamanhos de partícula entre 1 e 100 nm.

Noutra forma de realização, as nanoparticulas superparamagnéticas têm uma forma esférica, forma cúbica ou forma de flor.

Em ainda outra forma de realização, as nanoparticulas superparamagnéticas são feitas de óxido de metal composto por metais alcalinoterrosos.

Numa forma de realização, as nanoparticulas superparamagnéticas são partículas magnéticas de ferrite compostas pelos metais de magnésio e cálcio.

Noutra forma de realização, as nanoparticulas magnéticas de ferrite compreendem ainda metais alcalinoterrosos de berílio (Be) , estrôncio (Sr) e bário (Ba), isoladamente ou em combinação.

Ainda noutra forma de realização, a bicamada lipidica é composta por uma formulação lipidica com temperaturas de transição entre 40 e 45°C.

Numa forma de realização, a formulação de bicamada lipidica compreende ainda moléculas fosfolipidicas, tais como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatidico, fosfatidilinositol, esfingomielina, isoladamente ou em combinação.

Numa forma de realização, a formulação de bicamada lipidica compreende ainda colesterol.

Noutra forma de realização, a formulação de bicamada lipidica compreende ainda lipidos sensíveis ao pH, tais como hemisuccinato de colesterilo, N-(4-carboxibenzil)-N, Ndimetil-2,3-bis(oleoiloxi)propan-l-amínio, 1,2-dipalmitoilsn-glicero-3-succinato, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-succinato e N-palmitoil homocisteína.

Em ainda outra modalidade, a superfície da bicamada lipidica é funcionalizada com polietilenoglicol.

Numa forma de realização, a superfície da bicamada lipidica é ainda funcionalizada com ligandos indutores de permeabilidade, tais como bradicinina, fator de permeabilidade vascular/fator de crescimento endotelial, prostaglandinas, colagenase, peroxinitrito, fator de necrose tumoral a.

Numa forma de realização, as moléculas de fármaco terapêutico estão localizadas dentro da bicamada lipidica se as moléculas de fármaco forem hidrofóbicas.

Noutra forma de realização, as moléculas de fármaco terapêutico estão localizadas no compartimento hidrofilico do magnetolipossoma se as moléculas de fármaco forem hidrofilicas.

Numa forma de realização, a superfície da bicamada lipidica é funcionalizada com moléculas de direcionamento ativo.

O presente pedido de patente ainda se refere a um método de produção do nanossistema magnético, que compreende as seguintes etapas:

- Síntese das nanopartícuias superparamagnéticas;

- Encapsulamento das nanopartícuias em lipossomas, com as seguintes etapas:

- síntese de uma primeira camada lipidica pela preparação de:

um filme fino de um lípido e/ou tensioativo de concentração entre 0,01 mM e 2 mM sob fluxo de azoto; - um solvente não polar, pré-aquecido entre 43 e 46 °C, é adicionado ao filme fino e ultrassonicado durante um intervalo de tempo entre 15 e 60 minutos;

- as nanopartícuias superparamagnéticas são adicionadas à formulação lipidica;

- a solução é ultrassonicada durante um tempo entre 15 e 60 minutos;

- purificação da solução por decantação magnética;

- encapsulamento das moléculas de fármaco terapêutico pela adição de uma solução etanólica de uma concentração entre 1χ10~⁶ M e 5xl0~⁵ M;

- adição de uma segunda camada lipidica, preparada da mesma maneira que a primeira camada, à solução previamente preparada;

- os magnetolipossomas resultantes são lavados e purificados com água ultrapura por decantação magnética.

Numa forma de realização, as nanoparticuias superparamagnéticas são adicionadas à formulação lipidica numa concentração entre 5xl0~⁴ M e 2xl0~⁵ M com uma percentagem de água entre 0,005% e 1%.

Noutra forma de realização, as nanoparticuias superparamagnéticas são adicionadas à formulação lipidica numa concentração entre 5xl0~⁴ M e 2xl0~⁵ M com uma percentagem de água entre 1 e 5%.

Ainda noutra forma de realização, o tensioativo é selecionado de Triton X-100, AOT, SDS e CTAB.

Numa forma de realização, o solvente não polar é selecionado de hexano, heptano, octano, decano, dodecano, clorofórmio, ciclo-hexano, tolueno, benzeno.

Noutra forma de realização, a primeira formulação lipidica tem uma concentração entre 0,01 mg/mL e 10 mg/mL.

Ainda noutra forma de realização, a segunda formulação lipidica tem uma concentração entre 0,05 mM e 1,5 mM.

Numa forma de realização, colesterol e/ou moléculas de direcionamento ativo e/ou polietilenoglicol são adicionados às formulações lipidicas.

presente pedido de patente ainda se refere a um método para preparar nanoparticulas superparamagnéticas de forma cúbica do nanossistema, que compreende as seguintes etapas: - 50 mmol de octadecilamina são aquecidos até atingir o seu ponto de fusão;

- uma solução de 0,5 mmol de acetato de magnésio tetrahidratado, 0,5 mmol de acetato de cálcio hidratado, 2 mmol de mono-hidrato tribásico de citrato de ferro (III) e 3,1 mmol de ácido oleico são adicionados à solução de octadecilamina;

- a mistura é aquecida, a 10 °C por minuto, até atingir 200 °C e, em seguida, deixada 90 minutos nesta temperatura; - as nanoparticulas são lavadas com uma solução de etanol, por vários ciclos de centrifugação e redispersão aquosa;

- as nanoparticulas são calcinadas entre 300 °C e 800 °C durante um intervalo de tempo entre 1 h e 4 h.

O presente pedido de patente também se refere a um método para preparar nanoparticulas superparamagnéticas em forma de flor do nanossistema, que compreende as seguintes etapas: - uma solução contendo 0,05 mol de oxalato de potássio, 0,05 mol de hidróxido de sódio e 2,5 mmol de agarose é adicionada a 25 mL de água ultrapura sob fluxo de azoto e agitação magnética;

- uma solução contendo 2,5 mmol de mono-hidrato tribásico de citrato de ferro (III) é adicionada gota a gota à solução anterior;

- a mistura é aquecida a 90 °C durante um período de tempo entre 2 e 4 h;

- o produto final é lavado com uma solução básica de 1 M de hidróxido de sódio, por vários ciclos de centrifugação, redispersão aquosa e decantação magnética;

- as nanopartícuias são calcinadas, de preferência, entre 300 °C e 800 °C durante um intervalo de tempo entre lhe 4 h.

Descrição Geral

O presente pedido de patente refere-se a um nanossistema magnético que compreende:

- lipossomas que compreendem uma bicamada lipídica que pode ser sensível à temperatura, pH, entre outras propriedades, e um núcleo magnético interno que compreende nanopartícuias de ferrite mista de metal alcalinoterroso, composta por um fluido magnético ou um aglomerado de nanopartícuias;

e moléculas de fármaco terapêutico carregadas nos lipossomas por encapsulamento passivo ou ativo. Estas moléculas de fármaco terapêutico podem estar localizadas dentro da bicamada de fosfolípidos (se as moléculas de fármaco forem hidrofóbicas) ou no compartimento hidrofílico dos nanossistemas (se as moléculas de fármaco forem hidrofílicas).

Os magnetolipossomas são nanotransportadores baseados em lipossomas que capturam nanopartícuias magnéticas. Estes consistem numa parte interna de nanopartícuias magnéticas, quer seja um aglomerado de nanopartí cuias ou um fluido magnético, coberto por uma bicamada lipídica. A composição lipídica pode ser manipulada de acordo com o tipo de família do cancro e os requisitos específicos do microambiente.

Na presente tecnologia, são descritos magnetolipossomas aquosos (AML, Aqueous Magnetolíposomes), que consistem numa solução aquosa de nanopartícuias magnéticas aprisionada no compartimento hidrofílico dos lipossomas, que resulta da auto-organização, um comportamento inerente dos fosfolipidos quando em contato com soluções aquosas de nanoparticuias. Os AML são especialmente úteis para encapsular moléculas de fármacos hidrof1licas. Os AML são produzidos quando o núcleo interno dos magnetolipossomas é formado por nanoparticuias magnéticas e uma alta percentagem de água, entre 1% e 5%.

Além disso, também são descritos magnetolipossomas sólidos (SML, Solíd Magnetolíposomes), que consistem num aglomerado de nanoparticuias magnéticas cobertas por uma bicamada lipidica, como resultado da interação do grupo de cabeça polar dos fosfolipidos com o aglomerado de nanoparticuias magnéticas. Esta interação pode ser ligação covalente, atração eletrostática, interações de Van der Waals ou pelo equilíbrio entre as forças hidrofílicas e hidrofóbicas. Os SML apresentam um comportamento magnético pronunciado e um melhor efeito terapêutico. São mais fáceis de guiar, apresentam uma gama de temperatura mais alta, proporcionam maior libertação de fármacos e hipertermia. Os SML são produzidos quando o núcleo interno dos magnetolipossomas é formado por nanoparticuias magnéticas e uma percentagem reduzida de água, entre 0,005% e 1%, ou nenhuma presença de água.

Os magnetolipossomas podem ser carregados com um tipo ou mais de um tipo de moléculas, particularmente fármacos terapêuticos, incluindo, mas não limitado a fármacos quimioterápicos, pró-fármacos, ADN, proteínas, antibióticos, agentes anti-inflamatórios e inflamatórios, compostos de diagnóstico e teranóstico. Após a administração, o nanossistema tem a capacidade de proteger os fármacos encapsulados, preservando a sua bioação ativa. Além disso, melhora a sua farmacocinética e permite a orientação magnética para o local de interesse por meio de um gradiente de campo magnético (direcionamento ativo físico). Além disso, a superfície do nanossistema pode ser funcionalizada para o mascarar do sistema reticuloendotelial (RES) para aumentar o tempo de circulação e tornar o nanossistema sensível à libertação após estímulo externo. Depois de atingir a área alvo, o nanossistema interage com as células cancerígenas, por interação específica ligandorecetor, é internalizado através de endocitose ou fusão de membranas. Aqui, as condições fisiológicas do microambiente do tumor (tal como pH ácido) combinadas com a termossensibilidade dos nanossistemas desestabilizam a bicamada lipídica do nanossistema, levando à libertação controlada da carga útil, aumentando assim a concentração do fármaco no local alvo.

Breves descrições dos desenhos

Para uma compreensão mais fácil deste pedido de patente, são agregadas figuras no anexo que representam as formas preferidas de implementação que, no entanto, não se destinam a limitar a técnica aqui divulgada.

A Figura 1 ilustra quatro representações do nanossistema da presente tecnologia, em que os números de referência significam: A - Nanossistema magnético que compreende uma formulação lipídica, que encapsula uma molécula de fármaco terapêutico ;

B - Nanossistema magnético que compreende uma formulação lipídica contendo colesterol, que encapsula uma molécula de fármaco terapêutico;

C - Nanossistema magnético que compreende uma formulação lipídica com colesterol e conjugados PEG-lípido, que encapsula uma molécula de fármaco terapêutico e funcionalizada com um ligando alvo ativo;

D - Nanossistema magnético que compreende uma formulação lipidica com colesterol, que encapsula uma molécula de fármaco terapêutico e funcionalizada com um ligando alvo ativo;

em que os números de referência são: 1 - Núcleo magnético interno; 2 - Molécula de fármaco terapêutico; 3 - Lipido; 4 - Molécula de colesterol; 5 - Lipido sensível ao pH; 6 Molécula de direcionamento ativo; 7 - Conjugados PEG-lípido.

A Figura 2 ilustra um magnetolipossoma sólido com nanoparticulas semelhantes a flores.

A Figura 3 ilustra um magnetolipossoma sólido com nanoparticulas cúbicas.

Descrição detalhada presente pedido de patente descreve um nanossistema magnético baseado em nanoparticulas superparamagnéticas e o método para produzir os nanossistemas. As nanoparticulas superparamagnéticas de elevada forma anisotrópica, que são o componente magnético preferido dos nanossistemas magnéticos, têm uma resposta magnética melhorada e capacidade de aquecimento em comparação com as esféricas convencionais. Este método assegura que a incorporação de nanoparticulas superparamagnéticas não afeta o comportamento magnético geral dos nanossistemas, mantendo-o aproximadamente o mesmo que as nanoparticulas superparamagnéticas secas. Também garante a síntese de nanossistemas magnéticos com uma gama de tamanhos entre 100 e 200 nanómetros e um índice de polidispersividade reduzido. Considerando a terapia do cancro, os magnetolipossomas termossensíveis são um nanossistema multifuncional muito promissor. Além da capacidade de orientação magnética, a capacidade de aquecimento das nanopartícuias superparamagnéticas induz a libertação de fármacos e efeito citotóxico sinérgico em células cancerosas (quimioterapia e hipertermia combinadas).

De acordo com as Figuras 1, 2 e 3, o presente pedido de patente refere-se a um nanossistema que compreende:

- um núcleo magnético interno (1) , composto por um aglomerado de nanopartícuias superparamagnéticas, em relação aos SML, ou uma solução aquosa de nanopartícuias superparamagnéticas, em relação aos AML;

- uma bicamada lipídica termossensível (3), composta por uma formulação lipídica com temperaturas de transição entre 40 °C e 45 °C, de preferência entre 41 °C e 43 °C, que circunda o núcleo magnético tanto em AML quanto em SML;

a formulação de bicamada lipídica termossensível pode opcionalmente incluir lípidos sensíveis ao pH (5), a fim de tornar nanossistemas sensíveis ao pH que são estáveis em pH fisiológico, mas que são desestabilizados no microambiente ácido do cancro, induzindo a libertação de fármacos ín sítu; - moléculas de fármaco terapêutico encapsuladas (2), que podem estar localizadas dentro da bicamada lipídica (se as moléculas de fármaco forem hidrofóbicas) ou no componente hidrofílico do nanossistema (se as moléculas de fármaco forem hidrofilicas);

- opcionalmente, a superfície é funcionalizada com moléculas de direcionamento ativo (6);

- opcionalmente, a superfície é funcionalizada com moléculas de polietilenoglicol (PEG) num processo no qual as moléculas de PEG são covalentemente ligadas à superfície de magnetolipossomas preformados ou incluindo conjugados de

PEG-lípido (7) na mistura de lípides na preparação de magnetolipossomas.

termo carga útil significa o segmento de conteúdo localizado na bicamada lipidica do nanossistema. Aqui, os termos fármaco, composto designam um produto químico orgânico polimérico ou não polimérico, um ácido nucleico ou um oligonucleótido, um péptido ou um peptidomimético ou uma proteína, anticorpo, fragmento de crescimento ou um fragmento do mesmo que apresenta uma conformação linear ou cíclica ou um composto que não ocorre naturalmente. 0 termo ligando designa moléculas que são ligadas à superfície da bicamada lipidica a fim de promover o direcionamento ativo eficaz para um tecido celular de subconjunto específico. 0 termo tumor, cancro e neoplasia são termos genéricos que definem uma ampla gama de doenças caracterizadas pela proliferação descontrolada de células de um determinado tecido ou órgão como resultado de alterações genéticas ou epigenéticas nas células somáticas. Conforme usado neste documento, os termos nanossistema, nanotransportador e sistema de administração de fármaco representam a combinação dos componentes únicos (lipossomas e nanopartícuias superparamagnéticas) num todo integrado que pode interagir com o tecido alvo.

As capacidades de orientação intrínseca da presente tecnologia dependem do direcionamento físico ativo (magnético) devido à presença das nanopartícuias magnéticas e do direcionamento passivo devido ao efeito aumentado de retenção e permeabilidade (EPR). Portanto, a ausência de moléculas alvo químicas ativas não compromete as capacidades de orientação. No entanto, opcionalmente, estas moléculas de direcionamento ativo podem ser ligadas por ligação covalente à superfície da bicamada lipidica, a fim de melhorar o efeito terapêutico em microambientes específicos.

De acordo com o tipo específico de cancro, várias formulações lipídicas podem ser usadas, sozinhas ou em combinação, incluindo, mas não limitadas a, moléculas fosfolipídicas tais como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE) , fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (PI), esfingomielina (SPM). Os fosfolípidos podem ser sintéticos ou derivados de fontes naturais, tais como ovo ou soja.

Numa forma de realização preferida, as formulações de lipossomas compreendem dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), que tem uma temperatura de transição ideal para a libertação física do fármaco. Outros lípidos são adicionados à formulação de lipossomas para modular, por exemplo, a libertação do conteúdo, prolongar o tempo de circulação, etc.

Numa forma de realização, as formulações de lipossomas termossensíveis são originalmente compostas por dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e 1,2-distearoil-snglicero-3-fosfocololina (DSPC), numa proporção molar de 3:1.

Para modular a termossensibilidade do nanossistema magnético para aplicações terapêuticas, a formulação de bicamada lipidica é, de preferência, composta por um lípido ou mistura lipidica com uma temperatura de transição global da formulação lipidica entre 40 e 45 °C.

DPPC é usado como um componente lipídico importante em formulações de lipossomas termossensíveis. Como resultado, numa forma de realização preferida, a presença lipidica de DPPC é onipresente em todas as formulações possíveis de mistura lipidica, uma vez que a sua temperatura de transição está acima da temperatura corporal. Um aumento ligeiro na temperatura de transição dos lipossomas (que pode ser necessário para evitar vazamentos indesejados de fármaco à temperatura corporal) pode ser alcançado misturando pequenas percentagens de outros fosfolípidos com temperaturas de transição mais altas, uma vez que a temperatura de transição final da formulação depende da composição de fosfolípidos miscíveis.

Esta mistura pode incluir fosfolípidos tais como 1,2distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), 1tetradecanoil-2-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfocololina (MSPC), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfogliceroglicerol (DPPGOG), entre outros.

A escolha de DPPC para a constituição principal de formulações de magnetolipossomas é baseada no facto de que este lípido contém um grupo colina e os fosfolípidos que contêm grupos colina são a classe mais abundante nas células eucarióticas. Além disso, como o DPPC apresenta uma temperatura de transição a 41,3 °C, estando no estado de gel semelhante a sólido a uma temperatura entre 20 a 25 °C, quando a geração de aquecimento pelas nanopartícuias superparamagnéticas atinge temperaturas mais altas, acima de 41,3 °C, a DPPC encontra-se num estado cristalino líquido semelhante a fluido porque a interação hidrofóbica entre as cadeias lipídicas diminui. Para aplicação ín vivo, os nanotransportadores termossensíveis devem manter o fármaco à temperatura biológica, aproximadamente 37 °C, e liberta lo quando o ambiente tumoral aquecer a temperaturas entre 40-42 °C. Assim, ao escolher a composição lipidica dos magnetolipossomas, é possível modelar a temperatura de transição do próprio nanossistema e, como tal, modelar a sua permeabilidade.

Este recurso garante que os magnetolipossomas baseados em DPPC são nanossistemas termossensíveis e podem ser usados como sistemas de administração de fármacos termossensíveis, que é um processo dependente da temperatura de transição dos lípidos que compõem a formulação lipidica do nanossistema.

A suplementação de lipossomas baseados em DPPC com outros lípidos e moléculas tem um efeito na resposta dos nanossistemas magnéticos na quantidade e taxa de libertação do fármaco em microambientes específicos, condições de temperatura e biodisponibilidade das moléculas de fármaco.

A inclusão de moléculas como colesterol e polietilenoglicol na bicamada lipidica à base de DPPC, pode prolongar o tempo de circulação inerente aos nanossistemas e aumentar a libertação controlada de moléculas de fármaco após aquecimento.

A inclusão de colesterol (4), como mostrado nas Figuras 1 a 3, na formulação lipidica dos magnetolipossomas, melhora a resistência dos nanossistemas à agregação, torna-os mais rígidos ao diminuir a sua fluidez, protegendo os magnetolipossomas em condições de tensão superficial. Também reduz a permeabilidade da bicamada a solutos não eletrolíticos e eletrolíticos. Noutra forma de realização, a formulação é composta por DPPC e colesterol na proporção molar, de preferência entre 7:3 e 9:1, mais preferencialmente de 8:2, respetivamente.

Para superar a rápida eliminação dos nanossistemas magnéticos pelo sistema reticuloendotelial (RES), responsável pela diminuição da biodisponibilidade das moléculas de fármaco encapsuladas e prolongar a semivida da circulação aumentando a sua hidrofilicidade, é proposta a suplementação de lipossomas baseados em DPPC com PEG. As moléculas de PEG podem ser adicionadas por ligação covalente à superfície de magnetolipossomas preformados ou pela inclusão de lípidos ligando-PEG na mistura de lípidos na preparação de magnetolipossomas.

A superfície dos magnetolipossomas também pode ser funcionalizada com ligandos que visam o aumento da permeabilidade, incluindo, entre outros: bradicinina, fator de permeabilidade vascular/fator de crescimento endotelial (VPF/VEGF), prostaglandinas, colagenase, peroxinitrito, fator de necrose tumoral α (TNF).

Noutra forma de realização, a formulação é composta por DPPC, colesterol e 1,2,-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolaminapolietilenoglicol (DSPE-PEG) numa proporção molar de 55:15:2.

Além disso, os nanossistemas baseados em DPPC podem incluir lípidos sensíveis ao pH, resultando em sistemas de administração de fármaco que respondem ao pH com a combinação da resposta termossensível. Estas formulações são concebidas para desencadear a libertação de moléculas de fármaco no citoplasma das células, através da via endocitótica, como resposta à alteração do pH. As moléculas de fármaco são especificamente libertadas nos microambientes dos tumores, uma vez que a concentração de protões em condições patológicas é aumentada (pH ácido) comparativamente às condições fisiológicas normais, como resultado de maior processamento endossómico, isquemia, crescimento de tumores e inflamação.

Numa forma de realização, as formulações lipidicas incluem lipidos sensíveis ao pH, tais como hemisuccinato de colesterilo (CHEMS), N-(4-carboxibenzil)-N,N-dimetil-2,3bis (oleoiloxi)propan-l-amínio (DOBAQ), 1,2-dipalmitoil-snglicero-3-succinato (DGS 16:0), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3succinato (DGS 18:1) e N-palmitoil homocisteína (APS), permitem obter nanossistemas estáveis numa gama fisiológica de pH 7 a 9, como encontrado no sangue e no plasma. A desestabilização destes nanossistemas sensíveis ao pH e a consequente libertação de fármacos é induzida em condições acídicas, de preferência abaixo de pH 6, tais como as presentes no microambiente tumoral. Este tipo de magnetolipossomas sensíveis ao pH é uma via alternativa e/ou complementar para magnetolipossomas termossensíveis na libertação eficaz de moléculas de fármacos terapêuticos para atingir células específicas.

Noutra forma de realização, a formulação é composta por uma mistura de DPPC, CHEMS e DSPE-PEG numa proporção molar de 6:3:1, respetivamente. Mais preferencialmente, por uma mistura de DPPC colesterol e CHEMS na proporção molar de 6:3:1, respetivamente.

As nanoparticuias magnéticas (MNP) no presente nanossistema são nanoparticuias de óxido de metal compostas por metais alcalinoterrosos, localizadas no compartimento hidrofílico do lipossoma. Numa forma de realização, as nanopartícuias magnéticas de ferrite são compostas pelos metais de magnésio e cálcio (Ca_xMgi-_xFe2O4, em que x é, de preferência, entre 0,1 e 0,9, mais preferencialmente entre 0,3 e 0,7). Noutra forma de realização, as nanopartícuias magnéticas de ferrite podem compreender, isoladamente ou em combinação, outros metais alcalinoterrosos de berílio (Be), estrôncio (Sr) e bário (Ba) .

Se o tamanho da partícula diminuir além do tamanho crítico inerente ao tipo de nanopartícuias, será atingido um diâmetro em que os momentos magnéticos não se anulam. Este diâmetro é definido como diâmetro superparamagnético (Dspm) no qual partículas ferromagnéticas exibem comportamento superparamagnético. Neste estado, a magnetização das nanopartícuias é aproximada como um momento gigante, resultado da soma dos momentos magnéticos individuais (μ) de cada átomo constituinte que forma a nanopartícuia. Esta aproximação é chamada aproximação de macrospin e é responsável pelo forte momento magnético nas nanopartícuias superparamagnéticas.

O diâmetro ideal das nanopartícuias deve estar entre 1 e 100 nm, de preferência entre 5 e 70 nm e mais preferencialmente 10 e 50 nm, certificando-se de que sejam adequados para aplicações biomédicas e possuam comportamento superparamagnético.

As nanopartícuias usadas nas formulações de magnetolipossomas consistem numa estrutura de domínio único, consequentemente, a produção de calor por unidade de massa é muito maior do que partículas maiores de ferrite de múltiplos domínios de composição semelhante. Nas nanoparticulas superparamagnéticas, a magnetização desaparece quando o campo magnético externo é removido, evitando a aglomeração de partículas e, portanto, a possível embolização dos vasos capilares. Também exibem propriedades de aquecimento magnético notáveis que podem ser afinadas com precisão, ajustando a composição, tamanho médio, estrutura e anisotropia magnética. Os mecanismos de aquecimento de nanoparticulas superparamagnéticas são baseados na relaxação de Neél e Browniana. Baixas amplitudes de campos magnéticos alternados, quase transparentes para o corpo humano, estão a ser extremamente úteis nos métodos de tratamento para hipertermia. As nanoparticulas superparamagnéticas devem exibir alta taxa de absorção específica (SAR) a fim de atingir temperaturas com efeito terapêutico com concentração mínima de partículas. Os valores de SAR são altamente dependentes do tamanho médio das partículas, da amplitude do campo magnético alternado (H_max) e da frequência (f), magnetização de saturação (M_s) e anisotropia magnética (K). A anisotropia magnética pode ser controlada pela alteração da forma das nanoparticulas. As nanoparticulas cúbicas possuem maior desempenho em hipertermia como resultado da maior anisotropia magnética da superfície e da tendência facilitada à agregação em nano-cadeias pela forma cúbica. As arquiteturas de nanoparticulas semelhantes a flores estão associadas a valores mais altos de SAR, uma vez que estas magnetoestruturas de partículas são compostas por nanocristais altamente ordenados que não se comportam como grãos isolados.

Em menor intensidade de campo, as pequenas MNP devem produzir mais calor do que as maiores, já que o desencadeamento das perdas magnéticas de partículas grandes requer uma amplitude do campo mais forte que o seu campo de coercividade. A geração de calor é ideal nos intervalos de frequência de 100 e 1000 kHz e nos campos de 100 e 1000 Oe. Para um tratamento seguro, as experiências mostraram que o produto da amplitude e frequência do campo deve ser inferior a 5 χ 10⁹ AnrV¹.

A fisiopatologia associada ao microambiente tumoral permite explorar estratégias de direcionamento passivo. Esta abordagem permite que nanotransportadores como lipossomas, magnetolipossomas e nanoesferas se acumulem no local alvo, sem necessariamente interagir a um nível celular. O processo que permite a bioacumulação passiva de nanossistemas de fármacos em tumores sólidos é conhecido como efeito EPR. Este efeito resulta da angiogénese acelerada associada aos tumores, à medida que atingem cerca de 2 a 3 mm como resultado do aumento da necessidade nutricional e de oxigénio. A vasculatura recém-gerada apresenta forma irregular e com amplas fenestrações, tornando-a permeável a macromoléculas e sistemas nanométricos, tais como lipossomas, magnetolipossomas e micelas poliméricas. A permeabilidade aumentada no tumor é o resultado da ausência de uma drenagem linfática eficiente que permite a retenção destes nanossistemas no tumor.

Embora o efeito EPR seja atualmente a base clínica do funcionamento do nanossistema e da administração de fármacos existentes, apresenta limitações que precisam ser repensadas ao serem formuladas novas abordagens. A pressão intersticial associada ao tumor, a extensão da infiltração de macrófagos no tumor e a heterogeneidade nas dimensões dos poros da vasculatura, altamente dependentes do tipo, tamanho e localização do tumor, são fatores que podem levar à acumulação de fármacos no espaço intersticial do tumor. Considerando que o diâmetro dos poros da vasculatura do tumor varia entre 100 e 1200 nm e sendo o diâmetro dos magnetolipossomas em torno de 100-200 nm, é possível acumular preferencialmente estes nanossistemas nos tecidos tumorais sem afetar os tecidos saudáveis pelo efeito EPR (direcionamento passivo).

Além disso, a geração de calor por nanoparticulas pode ser utilizada para aumentar a permeabilidade da vasculatura do tumor.

A duração e a respetiva bioacumulação de magnetolipossomas no tumor podem ser aumentadas pelo uso de um gradiente de campo magnético externo, num processo conhecido como direcionamento físico ativo.

Dado que existem diferenças na expressão de recetores na superfície celular entre células saudáveis e tumorais, é possível funcionalizar a superfície dos magnetolipossomas com moléculas de direcionamento ativo específicas para recetores de superfície de células cancerosas, incluídas, mas não limitadas a, recetores de folato, transferrina e EGFR.

Após direcionar e reter os magnetolipossomas no microambiente do tumor, é explorada a termossensibilidade dos magnetolipossomas. Sob a ação de um campo magnético alternado externo, são gerados gradientes de temperatura e a bicamada lipídica termossensível é desestabilizada, tornando-se mais permeável à libertação de moléculas de fármaco terapêutico.

De acordo com a estrutura química apresentada pelos quimioterápicos e a sua interação com outros tipos de fármacos, os mesmos podem ser classificados em diferentes tipos, incluindo, entre outros, agentes alquilantes, antimetabólitos, antibióticos antitumorais, inibidores da topoisomerase, inibidores mitóticos e corticosteroides. Alguns exemplos de fármacos quimioterápicos disponíveis, que podem ser encapsulados em magnetolipossomas, incluem, mas não se limitam a: Revlimid®, Avastin®, Herceptin®, Rituxan®, Opdivo®, Gleevec®, Imbruvica®, Velcade®, Zytiga®, Xtandi ®, Alimta®, Gardasil®, Ibrance®, Perjeta®, Tasigna®, Xgeva®, Afinitor®, Jakafi®, Tarceva®, Keytruda®, Sutent®, Yervoy®, Cytoxan®, Gemzar, Nexavar®, Zoladex®, Zoladex®, Erbitux®, Darzalex®, Xeloda®, Gazyva®, Venclexta® e Tecentriq®. A via de administração dos magnetolipossomas depende do uso pretendido. Para administração terapêutica, a administração dos sistemas pode ser realizada de várias maneiras (por via intravascular, intralinfática, parentérica, subcutânea, intramuscular, intranasal, intrarretal, intraperitoneal, intersticial, nas vias aéreas através de nebulizador, por via hiperbárica, oral, tópica ou intratumoral), usando diferentes dosagens. A via de administração preferida é a via intravascular, em que o sistema de administração é geralmente injetado por via intravenosa, mas também pode ser injetado por via intra-arterial. Os magnetolipossomas também podem ser injetados por via intersticial ou em qualquer cavidade do corpo.

Preparação de magnetolipossomas

Uma nova via para a síntese de magnetolipossomas com melhores propriedades magnéticas é apresentada neste documento. Este método foi desenvolvido levando em consideração os problemas que comprometem o efeito terapêutico dos magnetolipossomas desenvolvidos anteriormente, que incluem: (i) biocompatibilidade de nanoparticuias; (ii) comportamento magnético das nanoparticuias e eficiência de aquecimento;

(iii) eficiência de encapsulamento de fármacos e nanopartícuias; (iv) comportamento magnético dos magnetolipossomas e eficiência de aquecimento; e (v) índice de polidispersividade do tamanho de magnetolipossomas. Cada etapa da síntese de nanopartícuias superparamagnéticas foi concebida e testada para alcançar as melhores propriedades estruturais e magnéticas, uma vez que o componente magnético é um fator-chave funcional (para o direcionamento, libertação controlada de fármacos e hipertermia). As características intrínsecas como tamanho, anisotropia de forma e composição química foram adaptadas para superar as dificuldades atuais em aplicações biológicas, garantindo o melhor comportamento dos magnetolipossomas e das suas capacidades de aquecimento em condições fisiológicas. Neste contexto, concentramo-nos na preparação de nanopartícuias superparamagnéticas com forma anisotrópica e com melhor biocompatibilidade. A abordagem para o encapsulamento das nanopartícuias nos lipossomas foi cuidadosamente pensada para manter quase as mesmas propriedades magnéticas das nanopartícuias secas, uma das principais desvantagens das atuais soluções de nanossistemas baseados em nanopartícuias magnéticas. Também foi investigada uma nova abordagem que garante tamanho e distribuição de tamanho ideais. Além disso, o componente lipossómico dos magnetolipossomas foi concebido para garantir uma composição sensível que suporta um encapsulamento e transporte seguros dos fármacos encapsulados com uma libertação controlada após estímulo no local alvo.

As MNP da presente tecnologia apresentam uma forma esférica, uma forma cúbica, como representada na Figura 2, semelhante a uma flor, como representada na Figura 3, e uma combinação entre elas. Numa forma de realização preferida, as nanoparticulas magnéticas da presente tecnologia são anisotrópicas em forma, tal como em forma cúbica ou em forma de flor.

Numa forma de realização, podem ser preparadas nanoparticulas esféricas de ferrite mista pelo método de coprecipitação. Primeiro, uma solução aquosa contendo 50 mmol de precursores de metais alcalinoterrosos, 53 mmol de hepta-hidrato de sulfato de ferro (II) e uma solução de ácido sulfúrico a 10% é aquecida a 75 °C, com agitação magnética, até que uma solução límpida seja obtida. Em seguida, 55 mmol de oxalato de potássio mono-hidratado são dissolvidos em água desionizada tépida. As duas soluções são então misturadas, com agitação vigorosa, a 90 °C. Após 15 minutos, a solução é arrefecida a uma temperatura entre 20 e 25 °C. As nanoparticulas precipitadas são lavadas por vários ciclos de centrifugação e redispersão em água. Finalmente, as nanoparticulas são calcinadas, de preferência entre 300 °C e 800 °C, mais preferencialmente entre 400 °C e 600 °C durante um intervalo de tempo entre 1 h e 4 h.

Numa forma de realização, nanoparticulas superparamagnéticas de forma anisotrópica cúbicas de ferrites mistas de magnésio e cálcio podem ser sintetizadas pelo método de coprecipitação. 50 mmol de octadecilamina são aquecidos até atingir o seu ponto de fusão (50-52 °C) com agitação magnética contínua. Em seguida, uma solução contendo 0,5 mmol de acetato de magnésio tetra-hidratado, 0,5 mmol de acetato de cálcio hidratado, 2 mmol de tribo de citrato de ferro (III) mono-hidratado e 3,1 mmol de ácido oleico é adicionada à solução pré-aquecida de 50 mmol de octadecilamina. A mistura é aquecida (10 °C por minuto) até atingir 200 °C e depois é deixada 90 minutos a esta temperatura. As nanopartícuias resultantes são lavadas com uma solução de etanol, por vários ciclos de centrifugação e redispersão aquosa. Finalmente, as nanopartícuias são calcinadas, de preferência entre 300 °C e 800 °C, mais preferencialmente entre 400 °C e 600 °C durante um intervalo de tempo entre 1 h e 4 h.

A fim de criar nanopartícuias com uma anisotropia de forma mais alta, também foram sintetizadas nanopartícuias superparamagnéticas semelhantes a flores. Numa forma de realização, uma solução (solução A) contendo 0,05 mol de oxalato de potássio, 0,05 mol de hidróxido de sódio e 2,5 mmol de agarose é adicionada a 25 mL de água ultrapura (grau Milli-Q) sob fluxo de azoto e com agitação magnética. Uma solução contendo 2,5 mmol de tribásico de citrato de ferro (III) mono-hidratado é adicionada gota a gota à solução A.

A mistura é aquecida a 90 °C durante um intervalo de tempo entre 2 e 4 h, resultando na precipitação de Fe (OH) 2. O produto final é lavado com uma solução básica de hidróxido de sódio (1 M), por vários ciclos de centrifugação, redispersão aquosa e decantação magnética. Finalmente, as nanopartícuias são calcinadas, de preferência entre 300 °C e 800 °C, mais preferencialmente entre 400 °C e 600 °C durante um intervalo de tempo entre 1 h e 4 h.

Encapsulamento das nanoparticulas em lipossomas magnetolipossomas

O encapsulamento das nanoparticulas sintetizadas nos lipossomas foi efetuado com recurso a micelas de àgua em óleo. Para isso, um filme fino (para a síntese da primeira camada lipidica) de um lípido e/ou tensioativo incluiu, mas não limitou, os lípidos DPPC, DOPG, DPPE, Egg-PC, lecitina de soja e os tensioativos Triton X-100, aerossol-OT (AOT) , dodecilsulfato de sódio (SDS) e brometo de cetil trimetilamónio (CTAB), com concentração acima da concentração micelar crítica, de preferência entre 0,01 mM e 2 mM e idealmente entre 0,05 mM e 1,5 mM, foram preparados sob fluxo de azoto.

Um solvente não polar, tal como, mas sem limitação, hexano, heptano, octano, decano, dodecano, clorofórmio, ciclohexano, tolueno, benzeno, foi pré-aquecido a 41 °C e 48 °C, de preferência entre 43 °C e 46 °C, adicionado ao filme fino e ultrassonicado numa gama de potência entre 180 W e 220 W, de preferência entre 185 W e 200 W, durante um intervalo de tempo entre 15 min e 60 min, de preferência entre 25 min e 45 min.

Em seguida, as nanopartícuias superparamagnéticas são adicionadas à formulação lipídica preparada previamente numa concentração lipídica total de preferência de 0,01 mM e 2 mM e idealmente entre 0,05 mM e 1,5 mM. Para a síntese de AML, numa forma de realização, a concentração de nanopartículas magnéticas é adicionada em solução aquosa numa concentração molar entre 5xl0~⁴ M e 2xl0~⁵ M, e idealmente entre lxl0~⁴ e 1χ10~⁵ M, com uma percentagem de água entre l%-5% (v/v). Para SML, noutra forma de realização, a concentração de nanopartículas magnéticas é adicionada em solução aquosa numa concentração molar entre 5xl0~⁴ M e 2xl0~⁵ M, e idealmente entre 1χ10~⁴ M e 1χ10~⁵ M, com uma percentagem de água entre 0,005% -1% (v/v).

Em seguida, a solução é ultrassonicada num intervalo de potência entre 180 W e 220 W, de preferência entre 185 W e 200 W, durante um intervalo de tempo entre 15 min e 60 min, de preferência entre 25 min e 45 min. A decantação magnética foi utilizada para purificar a solução contendo as micelas reversas com as nanoparticulas magnéticas.

Em seguida, uma segunda camada lipídica é preparada de acordo com as mesmas etapas para a primeira camada lipídica, numa concentração lipídica total de preferência de 0,01 mM e 2 mM e idealmente entre 0,05 mM e 1,5 mM, e é adicionada à solução aquosa preparada anteriormente que está num intervalo de temperatura entre 41 °C e 48 °C, de preferência entre 43 °C e 46 °C.

Numa forma de realização, nesta etapa, a formulação lipídica total de DPPC pode incluir colesterol numa proporção molar DPPC:colesterol de 8:2, respetivamente.

Numa forma de realização para a formulação lipídica contendo DPPC:CHEMS:PEG, conjugados de CHEM-lípido e conjugados PEGlípido são incluídos na concentração lipídica total numa proporção molar de 6:3:1, respetivamente.

Noutra forma de realização para a formulação lipídica contendo DPPC:Gol:CHEMS, colesterol e conjugados CHEM-lípido são incluídos na concentração lipídica total numa proporção molar de 6:3:1, respetivamente, para injeção coetanólica.

A funcionalização de magnetolipossomas com moléculas específicas para direcionamento ativo é feita pela incorporação de um ligando, por exemplo, conjugado lípidoligando na etapa de formulação do lipossoma, numa proporção molar ligando/lípido total variando entre 1:1000 e 1:100.

Encapsulamento das moléculas de fármaco terapêutico

Imediatamente antes da adição da segunda camada lipidica, as moléculas de fármaco terapêutico são adicionadas a uma solução etanólica para encapsulamento passivo nos magnetolipossomas, numa concentração preferencial entre lxl0~⁶ M e 5xl0~⁵ M.

Os magnetolipossomas resultantes são então lavados e purificados com água ultrapura por decantação magnética.

Exemplo:

De preferência, os magnetolipossomas compreendem uma bicamada lipidica de DPPC e colesterol, numa proporção molar de 8:2, o encapsulamento de moléculas de fármaco de metotrexato como agente quimioterapêutico para terapêutica de cancro. 0 componente magnético é composto por ferrites mistas de magnésio e cálcio com alta forma anisotrópica cúbica (Cao,5Mgo,sFe204) .

Claims (25)

1. Referências

   Caban, S., Aytekin, E., Sahin, A., Capan, Y., Nanosystems for drug delivery, Drug Design and Delivery, 2014, vol. 2, p. 1-7.

   1. Cho, K., Wang, X., Nie, S., Chen, Z., Shin, D. M., Therapeutic nanoparticles for drug delivery in câncer, Clinicai Câncer Research, 2008, vol. 14, pp. 1310-1316.
2. 2. Pradhan, P., Giri, J., Rieken, F., Koch, C., Mykhaylyk, O., Dõblinger, M., Banerjee, R., Bahadur, D., Plank, C., Targeted temperature sensitive magnetic liposomes for thermochemotherapy, Journal of Controlled Release, 2010, vol. 142, pp. 108-12
3. 3. Cardoso, B. D., Rio, I. S. R., Rodrigues, A.R. O., Fernandes, F. C. T., Almeida, B. G., Pires, A., Pereira, A. M., Araújo, J. P., Castanheira, E. M. S., Coutinho, P.

   5. J. G., Magnetoliposomes containing magnesium ferrite nanoparticles as nanocarriers for the model drug curcumin Royal Society Open Science, 2019 vol. 5, pp. 181017-181032.

   Lisboa, 27 de Abril de 2020

   REIVINDICAÇÕES

   1. Nanossistema magnético caracterizado por magnetolipossomas que compreendem:

   uma bicamada lipidica que compreende lipidos de dipalmitoilfosfatidilcolina, que circunda um

   - núcleo magnético interno compreendendo nanoparticulas superparamagnéticas com forma anisotrópica selecionada de entre forma cúbica ou forma de flor; e

   - moléculas de fármacos terapêuticos.

   2. Nanossistema magnético de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por os magnetolipossomas terem um tamanho entre 100 e 200 nm.

   3. Nanossistema magnético de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as nanoparticulas superparamagnéticas compreenderem tamanhos de partícula entre 1 e 100 nm.
4. 4. Nanossistema magnético de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as nanoparticulas superparamagnéticas serem feitas de óxidos metálicos compostos por metais alcalinoterrosos.
5. 5. Nanossistema magnético de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as nanoparticulas superparamagnéticas serem partículas magnéticas de ferrite compostas pelos metais de magnésio e cálcio.
6. 6. Nanossistema magnético de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por as nanoparticulas magnéticas de ferrite compreenderem ainda metais alcalinoterrosos de berílio (Be), estrôncio (Sr) e bário (Ba), isoladamente ou em combinação.
7. 7. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a bicamada lipidica ser composta por uma formulação lipidica com temperaturas de transição entre 40 e 45 °C.
8. 8. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a formulação de bicamada lipidica compreender ainda moléculas fosfolipídicas, tais como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidilinositol, esfingomielina, isoladamente ou em combinação.
9. 9. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a formulação de bicamada lipidica compreender ainda colesterol.
10. 10. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a formulação de bicamada lipidica compreender ainda lípidos sensíveis ao pH, tais como hemisuccinato de colesterilo, N-(4-carboxibenzil)-N,N-dimetil-2,3-bis (oleoiloxi)propano-l-amínio, 1,2-dipalmitoil-sn- glicero-3-succinato, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3succinato e N-palmitoil homocisteína.
11. 11. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a superfície da bicamada lipidica ser funcionalizada com polietilenoglicol.
12. 12. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a superfície da bicamada lipidica ser ainda funcionalizada com ligandos indutores de permeabilidade, tais como bradicinina, fator de permeabilidade vascular/fator de crescimento endotelial, Prostaglandinas, Colagenase, Peroxinitrito, Fator de necrose tumoral a.
13. 13. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as moléculas de fármaco terapêutico estarem localizadas dentro da bicamada lipidica se as moléculas de fármaco forem hidrofóbicas.
14. 14. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por as moléculas de fármaco terapêutico estarem localizadas no compartimento hidrofílico do magnetolipossoma se as moléculas de fármaco forem hidrofílicas.
15. 15. Nanossistema magnético, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a superfície da bicamada lipidica ser funcionalizada com moléculas de direcionamento ativo.
16. 16. Método para produzir o nanossistema magnético descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

    - Síntese das nanoparticulas superparamagnéticas de modo a produzir nanoparticulas com forma anisotrópica selecionada de entre forma cúbica ou forma de flor;

    - Encapsulamento das nanoparticuias em lipossomas, com as seguintes etapas:

    síntese de uma primeira camada lipidica pela preparação de:

    - um filme fino de um lípido e/ou tensioativo de concentração entre 0,01 mM e 2 mM sob fluxo de azoto;

    - um solvente não polar, pré-aquecido entre 43 e 46 °C, é adicionado ao filme fino e ultrassonicado durante um intervalo de tempo entre 15 e 60 minutos; - as nanoparticuias superparamagnéticas são adicionadas à formulação lipidica;

    - a solução é ultrassonicada durante um tempo entre 15 e 60 minutos;

    - purificação da solução por decantação magnética;

    - encapsulamento das moléculas de fármaco terapêutico pela adição de uma solução etanólica de uma concentração entre 1χ10~⁶ M e 5xl0~⁵ M;

    - adição de uma segunda camada lipidica, preparada da mesma maneira que a primeira camada, à solução previamente preparada;

    os magnetolipossomas resultantes são lavados e purificados com água ultrapura por decantação magnética.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por as nanoparticuias superparamagnéticas serem adicionadas à formulação lipidica numa concentração entre 5xl0~⁴ M e 2xl0~⁵ M com uma percentagem de água entre 0,005% e 1%.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por as nanoparticuias superparamagnéticas serem adicionadas à formulação lipidica numa concentração entre 5xl0~⁴ M e 2xl0~⁵ M com uma percentagem de água entre 1 e 5%.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado por o tensioativo ser selecionado de Triton X-100, AOT, SDS e CTAB.
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado por o solvente não polar ser selecionado de hexano, heptano, octano, decano, dodecano, clorofórmio, ciclo-hexano, tolueno, benzeno.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizado por a primeira formulação lipidica ter uma concentração entre 0,01 mg/mL e 10 mg/mL.
22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizado por a segunda formulação lipidica ter uma concentração entre 0,05 mM e 1,5 mM.
23. 23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizado por colesterol e/ou moléculas de direcionamento ativo e/ou polietilenoglicol serem adicionados às formulações lipidicas.
24. 24. Método para preparar nanopartícuias superparamagnéticas de forma cúbica do nanossistema descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

    - 50 mmol de octadecilamina são aquecidos até atingir o seu ponto de fusão;

    - uma solução de 0,5 mmol de acetato de magnésio tetrahidratado, 0,5 mmol de acetato de cálcio hidratado, 2 mmol de mono-hidrato tribásico de citrato de ferro (III) e 3,1 mmol de ácido oleico são adicionados à solução de octadecilamina;

    - a mistura é aquecida a 10 °C por minuto até atingir 200 °C e, em seguida, é deixada 90 minutos nesta temperatura;

    as nanoparticuias são lavadas com uma solução de etanol, por vários ciclos de centrifugação e redispersão aquosa;

    - as nanoparticuias são calcinadas entre 300 °C e 800 °C durante um intervalo de tempo entre 1 h e 4 h.
25. 25. Método para preparar nanoparticuias superparamagnéticas em forma de flor do nanossistema descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender as seguintes etapas:

    - uma solução contendo 0,05 mol de oxalato de potássio, 0,05 mol de hidróxido de sódio e 2,5 mmol de agarose é adicionada a 25 mL de água ultrapura sob fluxo de azoto e agitação magnética;

    - uma solução contendo 2,5 mmol de mono-hidrato tribásico de citrato de ferro (III) é adicionada gota a gota à solução anterior;

    - a mistura é aquecida a 90 °C durante um período de tempo entre 2 e 4 h;

    - o produto final é lavado com uma solução básica de 1 M de hidróxido de sódio, por vários ciclos de centrifugação, redispersão aquosa e decantação magnética;

    as nanoparticuias são calcinadas, de preferência, entre 300 °C e 800 °C durante um intervalo de tempo entre 1 h e 4 h.