JP6158714B2 - ナノ粒子デリバリーシステム、その製造および使用 - Google Patents

Description

本願は、健康部門、特にヒトの健康において用いることができる、制御放出を可能にするナノ粒子デリバリーシステム、特にT_m(ゲル−液晶相転移温度)またはT_m以上で破壊される熱感受性リポソームに関する。
本発明の熱感受性リポソームは、生理学的ｐHの水性媒質中で測定した時に、表面静電気が好都合には−20mV以下または＋20mV以上であるナノ粒子を封入する熱感受性脂質膜を含む。該封入されたナノ粒子は治療薬または診断薬として用いることができる。
本発明は、先に記載のナノ粒子デリバリーシステムを含む医薬組成物および診断用組成物、およびその使用にも関する。

治療薬または診断薬を用いる伝統的医学的治療の限界は特異性がないことである。特に、ほとんどの場合、治療薬または診断薬の投与した用量のほんの一部だけが目的とする部位に達するが、残りの薬剤は身体全体に分散する。健康な器官と組織へのこの避けられない分散は、患者に投与することができる薬剤量を制限し、この薬剤が可能な治療または診断効果をあげるのを妨げる。
目的部位に達する薬剤量を増加し、身体の他の健康な部分に送達される量も減少させる部位特異的薬剤送達ビークルの必要性が、特に毒性化学療法剤について永きにわたり認識されてきた。副作用を減少させるかまたは排除することができるそのようなビークルは、該治療を著しくより低毒性かつより有効にするだろう。リポソームは、治療薬または診断薬のためのナノスケールの送達ビークルとして10年におよび臨床的存在であった。
あらゆる薬剤送達ビークルが直面する最大の問題は、疾患部位に特異的に制御可能な速度で該ビークルからの封入した薬剤の完全な放出を可能にすることである。

さらに、ナノ粒子のための送達ビークルとしてのリポソームの使用は、特に外部活性型ナノ粒子との関連で、まだ前臨床開発段階である(Al−Jamal W.T. et al. Nanomedicine、2007；2：85−98)。

エンドソーム膜の不安定化を促進し、量子ドット(QD)細胞質放出に有利に作用する融合性またはpH感受性脂質を含むPEG−脂質を用いて構築するリポソームの製造はin vitroで記載されている(Sigot et al. Bioconjugate Chem. 2010；21：1465−1472)。リポソームからのPEG−脂質の解離は、リポソームからの二重層への数分間以内での移動を促進する短アシル鎖を有する融合性PEG−脂質を組み込むことにより促進することができる。あるいはまた、PEG−脂質は、ある種のエンドソームコンパートメントの酸性環境に暴露するとポリマー部分がリポソーム表面から開裂される、開裂可能なpH感受性PEG類似体を加えることにより細胞内に放出可能である。そのような「自発的」放出は、局所環境にのみ依存するので、（特に遠隔転移の治療に）好都合でありうるが、リポソーム内容の放出は、依然遅くなり得るし、環境が最適でなければ全く起きないかもしれない。したがって、リポソーム内容の放出の正確な制御はそのようなリポソームでは不可能である。

光感作物質を含むリポソームの製造がさらに記載されている(US 2010/0233224)。光感作物質は、脂質鎖の過酸化を介して光および酸素に暴露するとリポソーム膜の不飽和リン脂質を酸化させることができる。リポソームの光酸化は、オンデマンドで外部光刺激を介して急速にその充填物の放出を引き起こすことができる。酸化は、リポソーム膜不全およびそれに続くリポソーム内容の放出に関与する。しかしながら、そのような光供給源は、標的組織が表面的に接近可能な場合にのみ用いることができる。より深い組織に取り込まれたリポソームは、光で刺激することができない。したがって、光感作物質を含むリポソームは、人体の深部器官または構造にナノ粒子を送達するのに用いることができない。

レーザー活性型中空金属ナノ構造物も、過去に、それが薬剤の選択的放出を可能にするために封入されたリポソーム膜の透過化を引き起こす手段として用いられた(WO 2009/097480)。

US 2009004258は、常磁性酸化鉄ナノ粒子および薬剤封入熱感受性リポソームを開示しており、この常磁性酸化鉄ナノ粒子は交番磁場による活性下、標的環境中の薬剤の特異的または選択的放出を可能にする。

本発明者らは、対象にナノ粒子の安全なin vivo送達、および制御された効率的放出を可能にする好都合な系を提供する。
特に、これらの系は、人体の深部構造中で外部活性型ナノ粒子の送達および放出を可能にする。診断および/または治療的手段として用いることができる効率的活性型ナノ粒子の例は、WO2007/118884、WO2009/147214、およびWO2011/003999に本発明者らが記載した。

（発明の要約）
本発明者らは、T_mまたはT_m以上で破壊される熱感受性リポソームであって、該リポソームがナノ粒子を封入する熱感受性脂質膜を含み、生理学的pH(6〜8)の水性溶媒中で測定したときにナノ粒子の「表面静電気」(本明細書では「荷電」または「表面荷電」ともいう)が−20mV以下または＋20mV以上であり、該ナノ粒子が治療薬または診断薬として用いることができる、該リポソームを提供する。

さらに、本発明者らは、本発明の熱感受性リポソームおよび医薬的に許容される担体を含む治療用および診断用組成物を提供する。

別の局面において、本発明は、本明細書に記載の生成物のいずれか一つまたはそれ以上、すなわち、熱感受性リポソームおよび組成物を、該生成物を用いるための指示を与える注意書きラベルと共に含むキットを提供する。

本発明の熱感受性リポソームは、生理学的環境、特に、本明細書において細網内皮系(RES)ともいう単核食細胞系による早期捕捉またはオプソニン化からナノ粒子を好都合に保護することができる。

したがって、本発明のリポソームは、熱活性化により完全なナノ粒子を送達および放出することができる（熱活性化は、温度の生理学的増加によるか、または例えば、電離放射線または高密度焦点式超音波を用いる外部活性化により達成することができる。)。目的部位で放出されると、該ナノ粒子は、さらに下記で説明するように、所望により外部活性化を介して治療薬または診断薬として機能することができる。

本明細書に記載の熱感受性リポソームは、さらに、血管経路を介して対象の身体の目的部位、特に深部部位または構造にナノ粒子を好都合に送達することができる。
ナノ粒子放出の正確で効率的な制御も（送達に加えて）今や可能である。本明細書に記載の熱感受性リポソームからのナノ粒子の放出は、T_mと等しいかまたはT_m以上の温度T_rで本発明者らにより証明された。リポソーム膜破壊(膜の物理的崩壊、断裂、または破壊)の原因となるナノ粒子と脂質二重層の相互作用は、この驚くべき結果を説明しうる（図4E、黒矢印参照）。

ホスファチジルコリン分子の模式的構造。グリセロールバックボーン周辺のリン脂質分子構造を示し、sn−1およびsn−2鎖は、アシル基上で長炭化水素鎖により置換されており(R1およびR2は少なくとも９炭素原子を含む)、sn−3鎖は、コリン基(N(CH₃)₃ ⁺)およびホスフェート基(PO₄ ⁻)を有し、該分子に両性イオン特性をもたらす極性頭部を含む。 酸化鉄ナノ粒子の透過型電子顕微鏡(TEM)画像。 ２Ａ．5nmサイズの酸化鉄ナノ粒子のTEM観察を示す(実施例１参照)(スケールバー＝200nm)。 ２Ｂ．30nmサイズの酸化鉄ナノ粒子TEM観察を示す(実施例2)(スケールバー＝200nm)。 酸化鉄含有リポソームについて得られた典型的溶出プロフィール。第一鉄イオンとフェナントロリンの比色反応を介する紫外・可視分光法(Cary 100 Varian分光計)による磁気ナノ粒子の定量により測定した酸化鉄含有リポソームの溶出プロフィールを示す。リポソーム含有分画を回収する。リポソーム中の酸化鉄濃度は1〜2.5g/Lの範囲である。 ナノ粒子含有リポソームの低温TEM観察。 矢印１は、低温TEMグリッドホールの制限を示す。 矢印２および３は、それぞれリポソーム膜および酸化鉄ナノ粒子を示す。 ４Ａは、室温熟成した酸化鉄ナノ粒子充填非熱感受性リポソームを示す(実施例4.2)。 ４Ｂは、60℃で熟成した酸化鉄ナノ粒子充填非熱感受性リポソームを示す(実施例4.2)。 ４Ｃは、室温熟成した酸化鉄ナノ粒子充填熱感受性リポソームを示す(実施例4.1)。 ４Ｄは、43℃(T_m)で熟成後の熱感受性リポソームから放出された酸化鉄ナノ粒子を示す(実施例4.1)。 ４Ｅは、48℃(T_m以上)で熟成後の熱感受性リポソームから放出された酸化鉄ナノ粒子を示す(実施例4.1)。 ４Ｆは、室温熟成した酸化鉄ナノ粒子充填熱感受性リポソームを示す(実施例4.3)。 ４Ｇは、43℃(T_m)熟成した酸化鉄ナノ粒子充填熱感受性リポソームを示す(実施例4.3)。

（本発明の詳細な説明）
本明細書において本発明者らは、T_m(ゲル−液晶相転移温度)またはT_m以上で破壊される熱感受性リポソームを提供する。このリポソームは、対象に治療薬または診断薬として用いることができるナノ粒子を封入する熱感受性脂質膜を含む。

本発明者らは、驚くべきことに、生理学的pH（典型的にはpH6〜pH8）の水性媒質中で測定したときにナノ粒子の表面静電気が−20mV以下または＋20mV以上のとき、T_mまたはT_m以上で熱感受性リポソームの破壊が観察した。このリポソーム膜の破壊は、封入された荷電ナノ粒子の放出を可能にする。

本明細書で用いている用語「対象」は、あらゆる生物を意味する。該用語は、対象の一例であるヒトを排他的に表わす必要はなく、動物、特に温血脊椎動物、典型的には哺乳動物、およびさらに細胞培養も表しうる。

リポソーム
用語「リポソーム」は、小胞内媒質を外部媒質から分離する膜を形成する両親媒性分子の少なくとも１の二重層からなる球状小胞を表す。小胞内媒質は、該リポソームの内部水性コアを構成する。親水性分子または成分は、当業者に知られ、さらに本明細書で以下に記載の能動封入法を介してリポソームの内部水性コア内に封入することができる。疎水性分子または成分は、該膜の内側に取り込むことができる。
該二重層を構成する両親媒性分子は、脂質、より具体的にはリン脂質である。リン脂質分子の両親媒性特性は、リン酸基およびグリセロール基で構成される親水性頭部と１または２の脂肪酸で構成される疎水性尾部の存在による（図１参照）。

水性媒質において、リン脂質は、脂肪アシル鎖と水の接触を最小限にするために自己会合（self−assemble）する傾向があり、その化学構造にしたがって種々のタイプの会合体（ミセル、ラメラ相など）をとる傾向がある。より具体的には、ホスファチジルコリンは、「自発」屈曲を受け、最終的に小胞を形成する積層二重層からなるラメラ相を形成することが知られている(Lasic D.D. et al. Adv. Colloid. Interf. Sci. 2001；89−90：337−349)。リン脂質ラメラ相は、サーモトロピック液晶を構成する。これは、両親媒性分子の秩序化（ordering）度は、温度に依存することを意味する。実際に、リン脂質二重層は、「ゲル様」ラメラ相L_βから「液状」ラメラ相L_αへの遷移に対応する主相遷移温度T_m(「融解」温度)を示す。「ゲル」相において、脂肪酸の炭酸鎖間の強い疎水性相互作用がリン脂質分子の結晶秩序化を引き起こし、該二重層は小イオンに対してのみ透過性である。「液」相において、疎水性尾部は、リン脂質分子の秩序化の損失を引き起こし、「液晶」相をもたらす熱運動により移動し、該二重層は薬剤などの分子に対して透過性になる。

「ゲル−液晶」相遷移温度T_mは、リン脂質分子の化学構造：炭化水素鎖長、不飽和、不斉、および脂肪酸の分岐、鎖−グリセロール結合の種類（エステル、エーテル、アミド）、グリセロールバックボーンに対する鎖の結合位置(1,2−対1,3−)、および頭部基修飾に依存する。

ホスファチジルコリンの場合は、脂肪アシル鎖の構造および立体配座は特に関連がある(Koynova et al.、Biochim. Biophys. Acta 1998；1376：91-145)。
脂肪酸の鎖長の増加は、主相遷移温度を増加させる。例えば、炭素数９〜２４の範囲の鎖長を有する飽和ジアシルホスファチジルコリンについては、T_mは、1/n（ｎは、脂肪アシル鎖中の炭素原子数である）に直線的に依存し、T_mは、n=16の41℃からn=24の80℃に増加する。

主ゲル−液晶相転移温度に対する不飽和の影響は、立体配座(cisまたはtrans型)、脂肪アシル鎖中の位置、および二重結合数に依存する。例えば、18個の炭素を含むホスファチジルコリンのsn−2鎖のみおよび両方の鎖にcis型の単一不飽和部位を導入することで、鎖の融解遷移温度をそれぞれ50℃(54.5℃から3.8℃に)および75℃(54.5℃から−21℃に)低下させる効果がありうる。対照的に、二重鎖がtrans型である場合は、該効果は、かなり小さくなる。さらに、T_mは、cis−二重結合の位置に決定的に依存する。具体的には、T_mは、二重結合が炭化水素鎖の幾何学的中心近くに位置する時に最小化し、二重結合が該鎖のいずれかの末端に向かって移動するにつれて次第に増加する。これらの依存性は、二重結合がホスファチジルコリンのsn−2鎖のみまたは両方の鎖に存在する場合に当てはまる。二重結合数の影響に関して、cis−不飽和数の増加によりT_mが低下することが示された。例えば、２または３個のcis−不飽和部位を18個の炭素を含むホスファチジルコリンの両アシル鎖に導入すると、該鎖の融解遷移温度は、それぞれ109℃(54.5℃から−55.1℃に)および116℃(54.5℃から−61.5℃に)大きく低下する(Koynova et al.、Biochim. Biophys. Acta 1998；1376：91-145)。

混合鎖ホスファチジルコリンは、sn−1およびsn−2位に異なる炭化水素鎖長が存在する。経験式は、特定構造の関連ホスファチジルコリンの遷移温度の正確な予測を可能にするよう導き出した。正規化鎖−長非等価性パラメータΔC/CLが記載された（ここで、ΔC(=|n₁−n₂+1.5|)は有効鎖−長差であり、n₁およびn₂は、それぞれグリセロールバックボーンのsn−1およびsn−2位における炭素数である。CLは、２本の鎖の長い方の有効長である。２本の鎖を構成する総炭素原子が同数であること(n₁＋n₂＝一定)を示すホスファチジルコリンについては、鎖の融解温度は、鎖長非等価性パラメータΔC/CLが約0.4に増加するとモノティカルに（monotically）低下する。ΔC/CLが約0.4以上になると、アシル鎖のメチル末端によって生じるパッキング変動(perturbation)は、不斉ホスファチジルコリン分子が混合指状構造（interdigitation）と呼ばれる新パッキング配置をとるように圧倒するようになる。この再配置により鎖長は非対称となり、T_mは増加する。

薬剤送達のために、ステロール成分は、該リポソームに適切な物理化学的および生物学的挙動をもたらすために含まれうる。そのようなステロール成分は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、エルゴステロールまたはコレステロールヘミスクシネートから選ぶことができるが、コレステロールが好ましい。

コレステロールは、リポソームの脂質製剤に用いられることが多いが、それは、一般的には、コレステロールの存在は、その透過性を低下させ、血漿または血清タンパク質の不安定化効果からリポソームを保護すると一般的に認識されているからである。

コレステロール分子は、以下の３つの充分区別される領域を含む：小極性ヒドロキシル基、剛性板状ステロイド環、およびアルキル鎖尾部。コレステロールが膜中に挿入されると、その極性ヒドロキシル基はホスファチジルコリン分子のグリセロールバックボーン領域の中間近くに位置した(Kepczynski M. et al.、Chemistry and Physics of Lipids、2008；155：7−15)。修飾因子のコレステロールとしての脂質二重層への取り込みは、リボソーム膜の構造または物理特性、例えば、その統合、自由体積、厚さ、流動性（粘性）、および極性（疎水性）を大きく変化させる。

二重層の粘性は、膜の自由体積に影響する該二重層内のコレステロールの位置および温度に依存する。該二重層の微小粘度に対するコレステロールの影響はかなり複雑である。コレステロールが液相にある膜の見かけの微小粘度を増加させることはよく知られている(Cournia et al.、J.Phys.Chem.B、2007；111：1786−1801)。

Papahadjopoulos et al.は、リポソームに対するコレステロールの保護作用が、血清または血漿と接触したときの脂質膜の物理的状態、すなわち、「ゲル」または「液体」に依存することを示した。ゲル状態では、コレステロールの存在は、該二重層内のリン脂質アシル鎖の秩序化パラメータに影響を及ぼし、取り込まれた分子の放出を増強する。液体状態では、コレステロールは、リポソームを安定化し、取り込まれた物質の漏出を防ぐ(Papahadjopoulos et al.、Pharm. Research、1995；12(10)：1407−1416)。25モルパーセンテージ（mol％）以上の濃度でコレステロールを加えると、ゲル−液晶脂質−相遷移に顕著な影響がある。液不秩序（液）相と固体秩序（ゲル）相が共存する新規熱力学的安定領域が開示されている：液秩序相(Cournia et al.、J. Phys. Chem. B、2007；111：1786−1801；Polozov et al.、Biophysical Journal、2006；90：2051−2061)。この新規相は、純粋な脂質により形成されるゲル相の流動性と液相の流動性の中間の流動性を特徴とする。近年、コレステロールが飽和高融点脂質、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)およびスフィンゴミエリンと結合すると、液秩序相が形成され、モデル膜、いわゆる「脂質−ラフト」における動的複合体が生成されることが提唱された。コレステロールは、モデル膜における相分離を促進し、高コレステロールおよび低コレステロールミクロドメインが形成される(Radhakrishnan et al. Proc. Natl. Acad. Sci.、2000；97：12422−12427；Mc Connell et al. Biochim. Biophys. Acta、2003；1610：159−173)。実際に、Gaber et al.(Pharm. Research、1995；12(10)：1407−1416)は、33 mol％のコレステロールジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、およびコレステロールをそれぞれ100：50：75および50：50：50のモル比で含む２つの脂質製剤が、示差走査熱量測定法により30℃〜65℃の相遷移温度を示さないことを示した。そのような製剤のリポソームは「非熱感受性」リポソームと呼ばれる。

本発明の文脈において用いることができる典型的「熱感受性」リポソーム(すなわち、典型的には39℃〜55℃、好ましくは39℃〜50℃、さらにより好ましくは39℃〜45℃を含む主相遷移温度T_mを有するリポソーム)は、少なくともホスファチジルコリンを含む。
該ホスファチジルコリンは、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアリルホスファチジルコリン(DSPC)、水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、モノパルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、モノステアリルホスファチジルコリン(MSPC)、およびそのあらゆる混合物から選ぶことができる。

好ましい態様において、熱感受性リポソームは、さらにジステアリル−ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)−メトキシポリエチレングリコール(PEG)(DSPE−PEG)を含む。
好ましい態様において、コレステロールは、25 mol％より少ないモル比で加える。

好ましい熱感受性脂質膜は、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール、およびジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)−メトキシポリエチレングリコール(PEG)、例えばPEG2000(DSPE−PEG2000)を含む。
特定の態様において、前記化合物のモル比は、好ましくは100：50：30：6または100：33：27：7である。

別の好ましい熱感受性脂質膜は、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、モノパルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、およびジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)−メトキシポリエチレングリコール(PEG)、例えばメトキシポリエチレングリコール−2000(DSPE−PEG2000)を含む。
特定の態様において、前記化合物のモル比は、好ましくは100：12：5である。

別の好ましい熱感受性脂質膜は、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、モノステアリルホスファチジルコリン(MSPC)、およびジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)−メトキシポリエチレングリコール(PEG)、例えばメトキシポリエチレングリコール−2000(DSPE−PEG2000)を含む。
特定の態様において、前記化合物のモル比は、好ましくは100：12：5である。

製造方法に応じて、該小胞のサイズおよびラメラ度の程度を調整することができる。単層脂質小胞を製造する種々の方法、例えば、逆相蒸発(Szoka et al.、PNAS、1978；75(9)：4191−4198)、エタノール注射(Pons et al.、International Journal of Pharmaceutics、1993；95(1−3)：51−56)、加熱法(Mozafari et al.、Journal of Biotechnology、2007；129：604−613)が文献に記載されているが、最も簡単なのは脂質フィルム水和法(Bangham et al.、J. Mol. Bio.、1965；13：238−252)である。簡単には、脂質フィルム水和法において、脂質をクロロホルムなどの有機溶媒に可溶化する。該溶液をホモゲナイズした後、有機溶媒を窒素流下で蒸発させる。次に、得られた乾燥脂質フィルムを主相遷移温度T_m以上の温度で水性媒質により水和して100〜800nmのサイズの多層小胞を形成させる(Mills J.K. et al. Methods in Enzymology 2004；387：82−113)。それぞれ溶液を凍結（液体窒素中で）および解凍（T_m以上の温度で）することによる脱水および再水和の周期は、単層小胞を形成することにより水性内部容量の増加をもたらす。次に、小胞サイズの較正方法を適用して均質なサイズ分布を得る。超音波処理により20〜50nmのサイズ範囲の小単層小胞(SUV)を得、フィルター膜による抽出法では、フィルターポアのサイズに応じて50〜500nmのサイズ範囲の大単層小胞(LUV)を得た。超音波処理および抽出法の両方法は、T_m以上の温度で行う必要がある。

本発明の熱感受性リポソームの最大サイズは、典型的には50〜500nm、好ましくは50〜250nm、例えば約50nm〜約150nmを含む。

本発明に用いる熱感受性リポソームは、好ましくは、その生体適合性と特異的生体内分布を保証または改善するための生体適合性コーティングを含む。該生体適合性コーティングは、生体適合性サスペンジョン、例えば生理液（血液、血漿、血清など）、あらゆる等張媒質、または生理媒質、例えば医薬の投与に必要なグルコース(5％)および/またはNaCl(0.9％)を含む媒質中のリポソーム安定性を可能にするか、またはそれに有利に働く。
そのような生体適合性コーティングは、リポソームを表面処理剤で処理することにより得られる。

安定性は、生体適合性サスペンジョン中のリポソームの動的光散乱測定により確認することができる。
該コーティングは、好都合にはin vivoでのリポソームの完全性を維持し、その任意の機能化を促進する（例えばスペーサー分子、生体適合性ポリマー、ターゲッティング剤、タンパク質などによる）。

該コーティングは、非生分解性または生分解性でありうる。両選択肢を本発明の文脈で用いることができる。
非生分解性コーティングの例には、糖（例えばアガロース）、飽和炭素ポリマー（例えばポリエチレンオキシド）（網状または非網状、修飾または非修飾（例えばポリメタクリレートまたはポリスチレン））、およびその組み合わせからなる群から選ばれる１またはそれ以上の物質もしくは表面処理剤がある。

生分解性コーティングの例には、例えば生体分子（修飾または非修飾、天然または非天然）、および生体ポリマー（修飾または非修飾、天然形または非天然形）からなる群から選ばれる１またはそれ以上の物質または表面処理剤がある。生体ポリマーは、糖類、オリゴ糖類、または多糖類（ポリ硫酸化または非ポリ硫酸化、例えばデキストラン）でありうる。

前記物質、化合物、または表面処理剤は、単独または組み合わせて、混合物または会合体、複合物または非複合物、共有（結合）または非共有で（所望により他の化合物と組み合わせて）用いることができる。

本発明の熱感受性リポソームは、さらに、生物組織または細胞の特異的ターゲッティングを可能にする表面成分を含むことができる。そのような表面成分は、好ましくは、標的生物構造上に存在する認識エレメントとのリポソームの相互作用を可能にするターゲッティング剤である。

そのようなターゲッティング剤は、リポソームが腫瘍中に蓄積される時にのみ作用しうる。
ターゲッティング剤の立体配座はその標的との相互作用に関与するので、該ターゲッティング剤の密度は、当業者に知られた方法で注意深く調節すべきである。実際に、それが高密度であれば、ターゲッティング剤の立体配座を混乱させ、その結果、標的細胞による認識を混乱させうる（例えば、J A Reddy et al. Gene therapy 2002；9：1542；Ketan B. Ghaghada et al. Journal of Controlled Release 2005；104：113参照)。さらに、高標的剤密度は、血管系を循環中に細網内皮系（RES）によるリポソームクリアランスに有利に働きうる。

該コーティングは、あらゆる目的分子をリポソーム表面に結合させる種々の官能基（またはリンカー部分）、例えば生物組織または細胞の特異的ターゲッティングを可能にする表面抗原も含み得る。

ナノ粒子
本発明の生成物および組成物は、多くの分野、特にヒトの医療および獣医学に用いることができる。
封入ナノ粒子は、熱感受性リポソームから放出されると治療薬または診断薬として用いることができ、その構造はその意図する機能に直接依存するだろう。

用語「ナノ粒子」は、コア（中心コア）およびコーティングを含み、該コアの最大寸法が約100nm以下である、粒子または粒子の凝集物を表す。典型的には、ナノ粒子のコアの最大寸法は、丸または球形のナノ粒子の直径、または卵または楕円形のナノ粒子の最大長である。

本明細書で用いている用語「ナノ粒子のサイズ」および「ナノ粒子の最大サイズ」は、「ナノ粒子のコアの最大寸法」を表す。
「コア」は、単一粒子（クリスタルまたは晶子）または粒子の凝集物（クリスタルまたは晶子の凝集物）を表しうる。

透過型電子顕微鏡（TEM）または低温TEMは、特に該コアが単一粒子からなる場合にナノ粒子のコアのサイズを測定するのに好都合に用いることができる（図２参照）。同様に、動的光散乱（DLS）は、コアが粒子または粒子の凝集物からなる場合に溶液中のナノ粒子のコアの流体力学的直径を測定するのに用いることができる。これら２つの方法は、さらに互いのサイズ測定値を比較し、該サイズを確認するために用いることができる。

ナノ粒子の中心コアは、典型的には、治療的または診断的物質、好ましくは活性型または興奮性物質から製造される。該物質は、無機物質、有機物質、またはその混合物でありうる。該物質は、好ましくは無機物質である。

ナノ粒子の電子表面荷電が、ナノ粒子をpH6〜8の水性媒質に懸濁させた0.2〜8g/Lの異なる濃度のナノ粒子サスペンジョンを用いてゼータ電位測定により測定したときに、-15mV以下または＋15mV以上、例えば−15mV〜−20mV、または＋15mV〜＋20mV、典型的には−20mV以下または＋20mV以上であるかぎり、あらゆる種類のナノ粒子を本発明の熱感受性リポソームに封入することができる。

ナノ粒子の形状は、例えば丸、平面、細長、球状、卵形、または楕円形などでありうる。該形状は、製造方法により決定または調節し、目的とする適用に応じて当業者が適合させることができる。
粒子の形状は標的部位に送達されるとその「生体適合性」が影響をうけうるので、全く均質な形状を有する粒子が好ましい。薬物動態的理由により、本質的に球状、丸、または卵形のナノ粒子が好ましい。球状または丸形が特に好ましい。

ナノ粒子の最大サイズ、すなわち、本発明の文脈において用いるナノ粒子のコアの最大寸法は典型的には1〜100nmに含まれる。
ナノ粒子を治療薬として用いる場合は、該サイズは、約5nm〜約100nm、例えば約5nm〜80nm、例えば約10nm〜約80nm、好都合には約10nmまたは20nm〜約70nm、好ましくは約15〜約60nm、または約10nmまたは15nm〜約50nmに含まれる。
ナノ粒子を診断薬として用いる場合は、該サイズは、好都合には、約2nm〜約10nm、例えば約4nm〜約8nmに含まれる。

本発明の文脈で用いるナノ粒子は、コアおよびコーティングを含み、該コーティングは、生理学的pHの水性媒質中で測定したときに-20mV以下または＋20mV以上の表面静電気の存在に関与する。

静電コーティングは、好都合には「フルコーティング」（完全単層）である。これは、ナノ粒子の全表面上に適切な荷電を生じる非常に高密度の生体適合性分子の存在を意味する。そのようなフルコーティングは、T_mまたはT_m以上で熱感受性リポソームの膜を破壊するのに好都合であろう。

コアを構成する無機物質は、磁性物質であり得る。
磁性物質には、例えば、好ましくはオキシド、ヒドロキシド、または金属の形の、鉄、ニッケル、コバルト、ガドリニウム、サマリウム、ネオジミウム、およびそのあらゆる混合物が含まれる。
具体例において、コアを形成する物質は、酸化第一鉄および酸化第二鉄からなる群から選ばれる。本発明の好ましい態様において、オキシドナノ粒子は磁鉄鉱または磁赤鉄鉱でできている。
混合物質を用いて磁場とナノ粒子の相互作用を最適化することもできる。固体溶液形（種々の物質の無作為混合物として当業者に周知である）、例えばCoFe₂O₄を混合物質として用いることができる。さらに、分離（demixed）相の固体溶液、例えばFe₂O₃/Coを用いることができる。磁性物質を治療用物質として用いる場合は、強磁性物質が好ましい。
磁性物質を診断用物質として用いる場合は、超常磁性物質が好ましい。

コアを構成する無機物質は、少なくとも50、好ましくは少なくとも60または61、より好ましくは少なくとも65、66、67、または68の原子番号（Z）を有する金属元素により構成される高電子密度物質でありうる。
原子番号（陽子数としても知られる）は、原子核中にみられる陽子の数である。原子番号は、伝統的に記号Zにより表される。原子番号は、化学元素を一意的に同定する。中性荷電の原子において、原子番号は電子数に等しい。
Zは、ナノ粒子の流入放射線吸収能に関与する。

コアを構成する無機物質は、以下からなる酸化物でありうる：酸化セリウム(IV)(CeO₂)、酸化ネオジニウム(III)(Nd₂O₃)、酸化サマリウム(III)(Sm₂O₃)、酸化ユーロピウム(III)(Eu₂O₃)、酸化ガドリニウム(III)(Gd₂O₃)、酸化テルビウム(III)(Tb₂O₃)、酸化ジスプロシウム(III)(Dy₂O₃)、酸化ホルミウム(Ho₂O₃)、酸化エルビウム(Er₂O₃)、酸化ツリウム(III)(T_m2O₃)、酸化イッテルビウム(Yb₂O₃)、酸化ルテチウム(lu₂O₃)、酸化ハフニウム(IV)(HfO₂)、酸化タンタルム(V)(Ta₂O₅)、酸化レニウム(IV)(ReO₂)。
本発明の文脈において、無機酸化物の混合物も可能である。

コアを構成する無機物質は、好ましくは原子数（Z）が少なくとも40または50、好ましくは少なくとも60または70の金属でありうる。
該金属は、以下から選ばれうる：金(Au − Z＝79)、銀(Ag − Z＝47)、プラチナ(Pt − Z＝78)、パラジウム(Pd − Z＝46)、スズ(Sn − Z＝50)、タンタルム(Ta − Z＝73)、イッテルビウム(Yb − Z＝70)、ジルコニウム(Zr − Z＝40)、ハフニウム(Hf − Z＝72)、テルビウム(Tb − Z＝65)、ツリウム(T_m − Z＝69)、セリウム(Ce − Z＝58)、ジスプロシウム(Dy − Z＝66)、エルビウム(Er − Z＝68)、ユーロピウム(Eu − Z＝63)、ホルミウム(Ho − Z＝67)、ランタヌム(La − Z＝57)、ネオニジウム(Nd − Z＝60)、プラセオジニウム(Pr − Z＝59)、およびそのあらゆる混合物。

本発明の好ましい態様において、ナノ粒子のコアは金で構成される。
本発明の文脈において、ナノ粒子のコアは、無機酸化物および金属の混合物で構成されうる。
生理学的pHの水性媒質中で測定したときに、ナノ粒子の-20mV以下または＋20mV以上の表面静電気の存在に関与するコーティングは、無機または有機表面コーティングでありうる。

無機の場合、該コーティングは、オキシド、ヒドロキシド、およびオキシヒドロキシドからなる群から選ばれうる。無機コーティングは、例えばシリシウム、アルミニウム、カルシウム、および/またはマグネシウムを含みうる。
例えば、マグネシウムおよびカルシウムからなる群から選ばれる無機物質は、pH７のナノ粒子表面に正荷電（＋20mV以上）をもたらすだろう。
別の態様において、シリシウム基は、pH７のナノ粒子表面に負荷電（−20mV以下）をもたらすのに用いることができる。

有機の場合、該コーティングは、ナノ粒子表面と共有結合または静電結合により相互作用することができ、該ナノ粒子に表面特性を与えることができる分子を用いて調製される。
表面をコーティングする有機分子は、２つの基RおよびXを有する。Xの機能は、ナノ粒子表面と相互作用することであり、Rの機能はナノ粒子表面にその特異的特性を与えることである。
Xは、例えば、カルボキシレート(R−COO⁻)、シラン(R−Si(OR)₃)、ホスホニック(R−PO(OH)₂)、ホスホリック(R−O−PO(OH)₂)、ホスフェート(R−PO₄ ³⁻)、およびチオール(R−SH)基から選ぶことができる。
Rは、生理学的pHの水性サスペンジョン中のナノ粒子に少なくとも電子表面荷電をもたらす。
Rがナノ粒子表面に正荷電をもたらす場合は、Rはアミン(NH₂−X)でありうる。Rがナノ粒子表面に負荷電をもたらす場合は、Rはホスフェート(PO₄ ³⁻−X)またはカルボキシレート(COO⁻−X)でありうる。

ナノ粒子表面に正荷電（＋20mV以上）をもたらす有機コーティングは、例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリリシン、または2-アミノエタンチオールから選ばれうる。
ナノ粒子表面に負荷電（−20mV以下）をもたらす有機コーティングは、例えば、ポリホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートなどからか、または、例えば、クエン酸またはジカルボン酸（特にコハク酸）から選ばれうる。
また、静電コーティングは好都合に「フルコーティング」である。

さらに、この静電コーティング、特にアミノまたはカルボン酸部分を用いて、ナノ粒子表面上のあらゆる基を結合させることができる。例えば、静電コーティングを用いて、例えばカルボジイミドのようなリンカーを用いてナノ粒子表面上に本明細書に記載のターゲッティング基またはカップリング基を結合することができる。

所望により、ナノ粒子表面は、ナノ粒子が熱感受性リポソームから放出されて、それと共有結合を形成する場合は、タンパク質と直接相互作用することができる基（「カップリング基」）を用いて機能化することができる。
Rは、タンパク質上に存在するアミン、カルボキシル、またはチオール基と共有結合的に相互作用することができる反応基、例えば、スクシンイミジルエステル基(アミン基と反応する)および/またはマレイミド基(カルボキシル基と反応する)でありうる。

所望により、ナノ粒子表面は、特定の生物組織または細胞をターゲッティングすることができる基（「ターゲッティング基」）を用いて機能化することができる。該ターゲッティング基は、人体または動物体に存在する分子に対する親和性を示すあらゆる生物学的構造または化学構造でありうる。
そのようなターゲッティング基は、典型的には、ナノ粒子が標的部位に蓄積し、T_mまたはT_m以上の温度で熱活性化するとリポソームから放出されると作用する。

ターゲッティング基は、抗原、スペーサー分子、生体適合性ポリマーから選ぶことができる。ターゲッティング基は、人体または動物体に存在する分子に対して親和性を示すあらゆる生物学的構造または化学構造でありうる。例えば、該ターゲッティング基は、ペプチド、オリゴペプチドもしくはポリペプチド、タンパク質、核酸(DNA、RNA、SiRNA、tRNA、miRNA、etc.)、ホルモン、ビタミン、酵素など、および一般的には、分子のあらゆるリガンド（例えばレセプター、マーカー、抗原など）でありうる。病的細胞により発現される分子のリガンド、特に腫瘍抗原のリガンド、ホルモンレセプター、サイトカインレセプター、または成長因子レセプター。該標的とされる基は、LHRH、EGF、葉酸塩（folate）、抗B−FN抗体、E−セレクチン/P−セレクチン、抗IL−2Rα抗体、GHRHなどからなる群から選ぶことができる。

本明細書に記載の静電コーティングおよび/またはカップリング基を用いて、ナノ粒子表面上のあらゆる基を結合することができる。例えば、該基は、ナノ粒子表面にターゲッティング基を移植するためのリンカーとして用いることができる。

本明細書に記載の具体的目的は、-20mV以下または＋20mV以上の表面静電気の存在に関与する物質で共有結合的または静電気的にコートされたナノ粒子封入熱感受性リポソームである。この物質は、好ましくは、２つの基RおよびX（ここで、Rは、アミン、ホスフェート、およびカルボキシレートから選ばれ、Xは、カルボキシレート、シラン、ホスホニック、ホスホリック、およびチオールから選ばれる）を有する有機分子である。
ナノ粒子は、さらに、スクシンイミジルエステルおよびマレイミド基から選ばれるカップリング基、および/またはペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ホルモン、ビタミン、酵素、腫瘍抗原のリガンド、ホルモンレセプター、サイトカインレセプター、および成長因子レセプターから選ばれるターゲッティング基を含むことができる。

所望により、ナノ粒子表面は、立体保護基を用いて機能化することができる。そのような基は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド(ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド))、ポリカルバミド、生体高分子、またはポリサッカライド、例えばデキストラン、キシラン、セルロース、コラーゲン、および両性イオン化合物、例えば、ポリスルホベタインなどから選ぶことができる。

この立体保護基は、生体適合性サスペンジョン、例えば生理液（血液、血漿、血清など）、あらゆる等張媒質または生理学的媒質、例えばグルコース(5％)および/またはNaCl(0.9％)を含む媒質中のナノ粒子安定性を増大させる。

本発明の開示から、当業者は、本発明の精神から逸脱することなくナノ粒子を修飾することができると認識するだろう。

本発明の文脈において用いることができるナノ粒子またはナノ粒子凝集物の典型的製造方法は、例えば、WO2007/118884、WO2009/147214、US 6,514,481 B1、WO2011/003999、およびLiu et al.、Journal of Magnetism and Magnetic Materials 270(2004) 1-6 「Preparation and characterization of amino-silane modified superparamagnetic silica nanospheres」に記載されている。

治療的使用
ナノ粒子が標的細胞に取り込まれるかまたは接触すると、治療的ナノ粒子の効率は増大する。この目的を達成するために、典型的には、ナノ粒子表面特性を、標的細胞と相互作用するのに有利に働くように修飾する。例えば、ナノ粒子表面の電子荷電を修飾するか、または該表面を本明細書に記載のターゲッティング基またはターゲッティング剤と結合させることができる。

特異的結合相互作用は、ナノ粒子が細胞膜上の相補的分子またはレセプターと特異的に相互作用するのを可能にする表面リガンド（本明細書ではターゲッティング基という）の相互作用である。この相互作用は、レセプター介在エンドサイトーシスを誘導する。ナノ粒子の表面に結合したターゲッティングリガンドは、レセプター、膜タンパク質、標的細胞上に発現した表面抗原を認識して結合し、エンドサイトーシスおよび細胞内送達を引き起こすことができる。

細胞接触および粒子取り込みを促進する非特異的引力は、固有のナノ粒子特性、例えば表面荷電から生じる。
しかしながら、ほとんどの場合、そのような修飾は、ナノ粒子の生体内分布に有害である。

本明細書に記載の熱感受性リポソームは、この問題を克服し、先に記載のごとく、対象の身体における治療的ナノ粒子の効率的生体内分布(送達)および制御放出を可能にする。該リポソームは、標的部位上の、ナノ粒子、特に修飾表面特性を示すナノ粒子の濃度に遊離に働く。

ナノ粒子の制御（空間的および時間的）放出が今や可能であり、該ナノ粒子は、その治療的活性がその細胞との相互作用（ナノ粒子は細胞と接触し、および/または細胞内に取り込まれる）に依存する場合に、それが必要とされる場所および時に送達される。

ナノ粒子を治療的手段として用いる場合は、そのコアは、外部活性型物質、例えば外部エネルギー供給源により活性化することができる物質でありうる治療的物質を用いて製造される。特定の態様において、治療的物質は、標的細胞、組織、または器官を機能的に阻害し、変化させ、または破壊することができる。

治療的物質は、先に記載の高電子密度物質および磁性物質から選ぶことができる。

活性供給源は、コアが高電子密度物質、例えばHfO₂またはAuを用いて製造されるナノ粒子のための電離放射線供給源でありうる。
電離放射線は、典型的には5KeV〜約25000KeV、具体的には約5KeV〜約6000KeV(LINAC供給源)、または約5KeV〜約1500KeV(例えばコバルト60供給源)でありうる。X線供給源を用いる特に好ましい電離放射線は、典型的には約50KeV〜約12000KeV、例えば約50KeV〜約6000KeVである。

電離放射線の必要線量は、in vitro適用では、好ましくは、約0.05Gray（グレイ）〜約16Gray、好ましくは約0.05Gray〜約6Grayを含む線量である。
線量は、特に局所、ex vivoまたはin vivo適用では、約0.05Gray以上および約16もしくは30Gray以下を含む。
総電離放射線は、現在の慣例に従ってヒトにおいて、約1.5Grayから約85Gray以下である。約40Grayのさらなる照射ブーストを現在の慣例に従ってヒトに与えることもできる。

供給される放射線の総線量は、種々のスケジュール、例えば単回線量、分割線量、超分割（hyperfractionated）線量などに従って与えることができる。

一般的におよび非制限的方法で、以下のX線をナノ粒子を活性化するための種々の場合に適用することができる：
−表面標的組織に対して特に有効な50〜150keVのX線；
−6cmの組織圧を透過することができる200〜500keVのX線（慣用電圧）；
−1000keV〜25,000keVのX線（メガボルト）。例えば、前立腺癌治療のためのナノ粒子の電離（イオン化）は、エネルギー15,000keVの5焦点X線により行うことができる。

あるいはまた、放射性同位元素を電離放射線供給源として用いることができる（キュリー療法または小線源治療という）。特に、ヨウ素I¹²⁵(t^1/2=60.1日間)、パラジウムPd¹⁰³(t^1/2＝17日間)、セシウムCs¹³⁷、およびイリジウムIr¹⁹²を好都合に用いることができる。

免疫放射核種（または免疫放射標識リガンド）は、放射免疫療法の文脈で電離放射線供給源として用いることもできる。放射免疫療法に適した放射核種は、例えば¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁷⁷Lu、または⁹⁰Yから選ぶことができる。

荷電粒子、例えば陽子線、イオン線、例えば炭素、特に高エネルギーイオン線も電離放射線供給源として用いることができる。

電子線も、4MeV〜25Mevを含むエネルギーの電離放射線供給源として用いることができる。

特異的単色照射供給源を、ナノ粒子の原子の望むX線吸収エッジに近いかまたはそれに対応するエネルギーのX線を選択的に生じるために用いることができた。

優先的に、電離放射線の供給源は、線型粒子加速装置(LINAC)、コバルト60、および小線源治療供給源から選ぶことができる。

量（総照射線量の範囲）およびスケジュール（単回線量、または分割もしくは超分割プロトコールなどの文脈における照射の計画および送達）は、あらゆる疾患/解剖学的部位/病期、患者の状況/患者の年齢（子供、成人、老齢患者）について定義され、あらゆる特定の状況に対する治療の標準を構成する。該照射は、放射線療法の現在利用可能なあらゆる系を用いて、１回またはそれ以上、ナノ粒子の放出後いつでも適用することができる。

特定の態様において、治療的物質は、磁性酸化物(磁鉄鉱または磁赤鉄鉱)、特に強磁性物質であり、活性供給源は磁場供給源である。

好ましくは非振動または安定である磁場を、あらゆる磁場供給源を用いることにより、１回またはそれ以上、ナノ粒子の放出後絶えず適用することができる。磁場供給源は、好ましくは均一および一方向磁場供給源であり、あらゆる天然磁石、電気磁石、および磁気共鳴画像法(MRI)装置から選ぶことができる。
適切な非振動または安定磁場は、典型的には0.5〜5Teslaの範囲の磁場を有する標準的MRI装置において利用可能である。
磁場に暴露する場合は、暴露の持続時間に応じて、磁性ナノ粒子は、細胞または組織破壊を可能にする（持続時間：数分間、例えば2または5分間〜120分間）。

本発明のナノ粒子またはナノ粒子凝集物および組成物は、磁場にかけると癌細胞または癌細胞であろうと疑われる細胞を溶解させるために好都合に用いることができる。

本明細書において本発明者らは、必要とする対象を治療するための医薬組成物を製造するための、本明細書に記載のナノ粒子、または本明細書に記載の同じまたは異なるナノ粒子のポピュレーションの使用を開示する。

用語「治療（処置）」は、異常な機能を正し、疾患を予防し、病的兆候を改善し、例えば特に異常組織、特に腫瘍のサイズまたは増殖の減少；異常細胞または組織のサイズもしくは増殖の制御、抑制、または破壊；疾患進行の鈍化；癌進行の遅延による疾患の安定化；転移形成の減少；疾患の退行；または完全寛解（例えば癌の文脈において）などを行うためのあらゆる行為を表す。

医薬組成物は、標的細胞を活性供給源に暴露すると、必要とする対象における標的細胞を障害し、阻害し、変化させ、または破壊するための組成物でありうる。

本発明の目的は、標的細胞を活性供給源に暴露すると、標的細胞を障害し、阻害し、変化させ、または破壊するための、例えば本明細書で先に記載し、および/または本明細書に記載の方法により得ることができる熱感受性リポソームである。

本発明の具体的熱感受性リポソームは、対象の癌を予防または治療し、または癌の症状を軽減するためのリポソームである。

本明細書に記載の具体的方法は、以下を含む対象の細胞の障害、溶解、アポトーシス、または破壊を誘導し、または生じる方法である：a)対象にナノ粒子を含む熱感受性リポソーム（本明細書で先に記載の）を投与し、b)ナノ粒子を局所的に放出させ、次いで細胞、特に標的細胞と相互作用させるために熱感受性リポソームをT_mまたはT_m以上に加熱し、次いで所望により、c)該細胞を活性供給源、典型的には例えば本明細書に記載の外部活性供給源に暴露し、該暴露がナノ粒子を活性化し、次いで細胞の障害、溶解、アポトーシス、または破壊を誘導し、または引き起こす。

本発明の熱感受性リポソームは、種々の経路、例えば局所（例えば腫瘍内（IT））、皮下、静脈内（IV）、皮内、動脈内、気道（吸入）、腹腔内、筋肉内、および経口経路（経口）により投与することができる。本発明の熱感受性リポソームは、さらに、腫瘍摘出術後の腫瘍ベッドの仮想空洞（virtual cavity）に投与することができる。好ましい投与経路は静脈内経路である。

熱感受性リポソームを静脈内経路で注射して一定時間後の、透過および保持増強（「EPR」）効果は、腫瘍塊中に熱感受性リポソームが受動的に蓄積するのに関与する。実際に、腫瘍の血管は、正常毛細血管とは全く異なり、その血管の「血管漏出」が正常組織では通常ではないリポソームの選択的血管外遊出を促すことが観察された。有効な腫瘍リンパ廃液の欠如は、浸透リポソームのクリアランスを防ぎ、その蓄積を促す。

すなわち、本発明のナノ粒子は、静脈内投与した熱感受性リポソームから放出されると原発腫瘍および転移腫瘍を有効にターゲッティングすることができる。

標的細胞は、あらゆる病的細胞、すなわち、病的メカニズムが関与する細胞、例えば増殖性細胞、例えば腫瘍細胞、狭窄（stenosing）細胞（繊維芽細胞/平滑筋細胞）、または免疫系細胞（病的細胞クローン）でありうる。好ましい適用は、悪性細胞または組織の治療（例えば破壊または機能的変化）に基づく。

本発明の別の目的は、以下を含む、対象または患者における、疾患、特に癌の予防または治療方法、または疾患の症状の軽減方法に関する：a)疾患に罹患した患者に熱感受性リポソーム、または例えば熱感受性リポソームを含む本明細書に記載の組成物を投与し、b)ナノ粒子を局所放出させ、次いで細胞、特に標的細胞と相互作用させるために熱感受性リポソームをT_mまたはT_m以上に加熱し、c)次いで、本明細書に記載の活性供給源に対象を暴露することにより対象を治療し、該暴露が患者の異常細胞の変化、障害、または機能的破壊をもたらすことにより、該疾患を予防または治療する。

伝統的癌管理は、系統的に、集学的治療（例えば放射線療法および化学療法の組み合わせ）の共同作用を意味する。

例えば、放射線療法の文脈において、活性供給源に暴露した本明細書に記載のナノ粒子は、種々の癌療法プロトコールと組み合わせて用いることができる。そのようなプロトコールは、外科、放射線外科、化学療法、細胞増殖抑制剤、細胞毒性薬の投与を含む治療、ターゲッティング療法、ワクチン、および癌を治療するためのあらゆる他の生物学的または無機生成物からなる群から選ぶことができる。本発明の熱感受性リポソームは、本明細書に記載のナノ粒子と共に、目的とするあらゆる治療的分子、特に癌を治療するためのあらゆる既知の生物学的または無機生成物を封入することができる。

本明細書に記載のナノ粒子は、さらに放射線療法のみの文脈で用いることができる。観察された治療効果の増大は、一部、本発明の熱感受性リポソームによるその輸送、次いでその放出制御によって可能となる標的部位上の有効なナノ粒子の濃度の増加による。

本発明を用いて、あらゆる種類の悪性腫瘍、例えば血液学的腫瘍もしくは悪性腫瘍、および特に上皮、神経外胚葉、もしくは間葉起源の固形腫瘍を治療することができる。さらに、本明細書に記載のリポソームを用いて、放射線療法が伝統的に使用および/または適用される前癌状態の病変または特定の良性疾患を治療することができる。

該腫瘍または癌は、放射線療法が伝統的治療である癌でありうる。そのような癌は、特に皮膚癌（AIDS関連悪性新生物、メラノーマを含む）；中枢神経系腫瘍（脳、幹脳、小脳、下垂体、脊柱管、眼、および眼窩を含む）；頭部および頸部腫瘍；肺癌；乳癌；消化管腫瘍、例えば肝癌および肝胆道癌、結腸癌、直腸癌、および肛門癌、胃癌、膵臓癌、食道癌；男性の泌尿生殖器腫瘍、例えば、前立腺癌、精巣癌、陰茎癌、および尿道癌；婦人科の癌、例えば、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、卵管癌、膣癌、および外陰癌；副腎腫瘍および後腹膜膿瘍；局在性に関わらず骨および軟部組織の肉腫；リンパ腫；骨髄腫；白血病；および小児腫瘍、例えばウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、中枢神経系腫瘍、ユーイング肉腫などからなる群から選ばれうる。

本発明は、治療の文脈において、原発腫瘍もしくは二次的侵襲、局所もしくは遠隔転移に、また、予防の文脈において、二次的悪性中枢神経系合併症、例えばメラノーマ、肺癌、腎臓癌、乳癌などから観察される侵襲（転移）を避けるために適用することができる。

熱感受性リポソームは、抗癌治療期間を通していつでも用いることができる。熱感受性リポソームは、例えば、ネオアジュバント（癌を切除するための外科的介入前）またはアジュバント（外科手術後）として投与することができる。
熱感受性リポソームは、外科的に除去することができない進行腫瘍に用いることもできる。

熱感受性リポソームの反復注射または投与は適宜行うことができる。

診断的使用
ナノ粒子の制御送達は、in vivo画像化および/または診断目的にも望ましく、今や該ナノ粒子を本発明にしたがって熱感受性リポソームに封入することにより可能である。

本明細書において本発明者らは、好ましくは対象をエネルギーの外部供給源に暴露したときに、対象中の異常組織もしくは細胞、特に腫瘍細胞の存在を検出するための診断用組成物を製造するための、本発明の熱感受性リポソーム、特に本明細書に記載のナノ粒子または本明細書に記載の同じまたは異なるナノ粒子のポピュレーションを含む熱感受性リポソームの使用を開示する。

本発明の目的は、対象をエネルギーの外部供給源に暴露したときに、対象の異常細胞を検出または可視化するための、例えば本明細書に記載のおよび/または本明細書に記載の方法により得ることができる熱感受性リポソームである。

診断用物質は、先に記載の高電子密度物質および磁性物質から選ぶことができる。
ナノ粒子を異常組織または細胞を検出または可視化するための診断薬として用いる場合は、そのコアは好都合には画像化物質からなる。
そのような画像化物質は、好都合には、あらゆる磁性物質、例えば先に記載の酸化第一鉄および酸化第二鉄から選ぶことができる。例えば、本発明に用いるナノ粒子は、MRIで可視的なγ−Fe₂O₃(磁赤鉄鉱)またはFe₃O₄(磁鉄鉱)でできたコアを有する。
画像化物質も、断層像影装置（CTスキャナー）下で可視的なあらゆる高電子密度物質、例えばHfO₂またはAuから選ぶことができる。

画像化目的では、先に記載のターゲッティング基のナノ粒子への付加が好ましい。

本発明の別の目的は、以下を含む、対象または疾患に罹っていることが疑われる患者において標的細胞を検出または可視化する方法（疾患、特に癌の診断を可能にする）に関する：a)疾患に罹患した患者に熱感受性リポソームまたは該熱感受性リポソームを含む例えば本明細書に記載の組成物を投与し、b)ナノ粒子を局所放出させ、次いで細胞、特に標的細胞との相互作用を可能にするために、目的とする領域をT_mまたはT_m以上に加熱し、c）次いで、該対象を、本明細書に記載の活性化供給源に暴露し、該暴露は、患者の標的細胞の検出または可視化を可能にする。

特定の態様において、本明細書に記載の熱感受性リポソームは、細網内皮系（RES）により認識されるのを避けながら、血流中に標的ナノ粒子（特に、腫瘍細胞を特異的に認識することができるナノ粒子）を輸送することができる。

腫瘍塊が存在する場合は、T_mまたはT_m以上で熱感受性リポソームから放出されたナノ粒子は、腫瘍に入り、標的癌細胞と相互作用する。ナノ粒子の蓄積は、磁性ナノ粒子についてMRIで可視的なシグナル変動（perturbation）を引き起こすか、または高密度ナノ粒子を用いるとCTスキャナーシグナルが増加する。
腫瘍塊がなければ、ナノ粒子は、腎臓を介して血流から排除され、シグナル増加や変動は検出または可視化されないだろう。

さらに本明細書において本発明者らは、対象の標的部位、特に腫瘍およびその微小環境から標的部位の表現型検査に用いることができるタンパク質を回収するための診断用組成物を製造するための、本発明の熱感受性リポソーム、特に、本明細書に記載のナノ粒子または本明細書に記載の同じまたは異なるナノ粒子のポピュレーションを含む熱感受性リポソームの使用を開示する。

本発明の別の目的は、以下を含む、対象または患者における標的部位から（特に該標的部位の表現型検査を可能にする）タンパク質を回収する方法に関する：a)疾患に罹っている患者に熱感受性リポソームまたは該熱感受性リポソームを含む例えば本明細書に記載の組成物を投与し、b)標的部位でのナノ粒子の放出、次いで該標的部位とその相互作用を可能にするために熱感受性リポソームをT_mまたはT_m以上に加熱し、c)次いで、該標的部位のタンパク質で被われたナノ粒子を回収する。

先の方法は、さらに、血中へのナノ粒子の放出を可能にするために熱感受性リポソームをT_mまたはT_m以上に加熱する工程、および血液タンパク質と標的部位由来のタンパク質を比較するために血液タンパク質で被われたナノ粒子を回収する工程を含むことができる。
このアプローチは、伝統的バイオプシーに比べて好都合な非侵襲性技術を構成する。

本明細書に記載の熱感受性リポソームは、特定患者の癌病期に関する情報を提供し、癌専門医が、この患者のための最も適切な治療を選択し、特定の治療の効果を追跡するのを助けることができるので、個別療法に用いることができる診断手段である。
本明細書に記載の熱感受性リポソームは、さらに、特定の治療に対する腫瘍の反応を評価し、患者の臨床的結果（進行無しの生存）を予測する情報を提供することができる。

この特定の適用のために、上記のあらゆるナノ粒子を用いることができる。ナノ粒子は、優先的に先に記載の磁性コア(例えばFe₂O₃またはFe₃O₄)でできている。

腫瘍を表現型検査するには、カップリング基とともにコーティングを含むナノ粒子を用いるのが好ましい。そのようなカップリング基は、スクシンイミジルエステル、マレイミド、およびそのあらゆる混合物から好都合に選ぶことができる。この基は、タンパク質上に通常存在するアミノ基およびカルボキシル基と共有結合を生じるだろう。

具体的態様において、本明細書に記載の熱感受性リポソームは、細網内皮系(RES)による認識を避けながら、血液循環中にカップリング基と共にコーティングを含むナノ粒子を輸送することができる。
T_mまたはT_m以上で熱感受性リポソームから放出されるナノ粒子は、標的部位のタンパク質と相互作用する。該タンパク質のポピュレーションで被われたナノ粒子は、尿中に回収することができる。次に、尿試料を処理してナノ粒子を濃縮し、次いで、タンパク質の酵素的消化およびペプチド断片の分析後に例えば質量分析を用いてタンパク質ポピュレーションを分析することができる。あるいはまた、磁性ナノ粒子を例えば磁気回収装置を用いて標的部位から回収することができる。

本発明の別の目的は、例えば本明細書で先に記載の、および/または本明細書に記載の方法によりうることができる熱感受性リポソームを、好ましくは医薬的に許容される賦形剤、ビークル、または担体と共に含む治療用または診断用組成物である。

診断用組成物は、特に診断と治療を同時に行う場合は、医薬組成物と組み合わせるか、または医薬組成物と同化させることができる。後者の状況では、一般的に、同じナノ粒子を治療薬および診断薬として用いる。

該組成物は、液体（サスペンジョン中の粒子）、ゲル、ペーストなどの形でありうる。好ましい組成物は、好ましくは液体形の注射可能製剤の形である。

用いる賦形剤、ビークル、または担体は、この種の適用のためのあらゆる伝統的支持体、例えば生理食塩水、等張、無菌緩衝溶液などでありうる。組成物は、安定化剤、甘味料、界面活性剤なども含むことができる。組成物は、既知の医薬製剤技術を用いて、例えば、アンプル、ボトル、フラスコとして製剤化することができる。

本発明の組成物中のナノ粒子の濃度は、特に、意図する用途、患者対象、標的細胞の性質、および選択した投与経路に応じて当業者が容易に調整するだろう。

医薬組成物は、さらに、疾患、例えば癌を治療することも意図したさらなる治療的化合物（本明細書に記載のナノ粒子またはナノ粒子のポピュレーションと異なる）を含むことができる。このさらなる治療的化合物は、ナノ粒子とともにリポソームに封入することができる。

本発明は、さらに、あらゆる１またはそれ以上の本明細書に記載の熱感受性リポソームまたは組成物を含むキットを提供する。典型的には、該キットは、本発明の少なくとも１の熱感受性リポソームまたは熱感受性リポソームのポピュレーションを含む。一般的には、該キットは、本発明の医薬用または診断用組成物の１またはそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器も含む。そのような容器に付随して、該生成物を用いるための指示を与える注意書きラベルを、本発明の方法に従って熱感受性リポソーム、熱感受性リポソームのポピュレーション、または組成物を用いるために提供することができる。

本発明の他の局面および利点は、例示目的であって限定のためではない下記実施例において明らかになるだろう。

実施例1：5nmサイズのナノ粒子の製造
中心サイズ分布が5nmの酸化鉄ナノ粒子を、第一鉄および第二鉄イオンの共沈殿により合成する(出典：US4329241；Bacri et al.、J. Magn. Magn. Mat.、1986；62：36−46)。
簡単には、イオン強度が制御された反応媒質は、pH12に維持した硝酸ナトリウム3Mの溶液からなる。Fe(III)/Fe(II)のモル比が2に等しい第一鉄および第二鉄イオンの３M硝酸ナトリウム溶液を調製し、混合下で反応媒質に徐々に加えると、急速に黒色になる。次に、全溶液を混合下、周囲温度で一夜熟成させる。

次に、フェライトナノ粒子を磁石上で沈殿させ、反応媒質を排除するために上清を除去する。次に、ナノ粒子表面のペプチゼーション（酸性化）および酸化を、活発な混合下、室温で硝酸HNO₃ 2M溶液中でペレットを希釈することにより行う。

ナノ粒子のコアの酸化は、活発な混合下、上昇した温度（＞90℃）で硝酸第二鉄の溶液中で該ペレットをインキュベーションすることにより行う。次に、ナノ粒子を遠心分離して洗浄する。

酸化鉄が150g/Lの濃度に達するように、ペレットを最終的に酸性水で希釈する。該溶液を超音波処理してホモゲナイズし、次いでpHをpH₂に調整する。

ナノ粒子の形態（サイズおよび形状）を透過型電子顕微鏡で観察した（図2A）。酸化鉄ナノ粒子の結晶構造をX線回折分析により確認した。
実施例2：30nmサイズの酸化鉄ナノ粒子の製造

中心サイズ分布が30nmの酸化鉄ナノ粒子を、第一鉄イオンの沈殿、次いで沈殿物の酸化により合成する。

水性反応媒質を、窒素流の連続的バブリング下、pH8で維持した。塩化第一鉄溶液と水酸化ナトリウム溶液を調製し、反応媒質に同時に加えた。該溶液は緑色になり、顕著に混濁（「白濁」）した。

酸化工程をH₂O₂溶液を加えて行った。該溶液は黒色になり、フェライト物質の形成を示した。H₂O₂添加完結後、窒素流を除去した。次に、フェライトナノ粒子を攪拌下、2時間熟成させた。
フェライトナノ粒子を磁石で沈殿させ、上清を除去した。ナノ粒子表面の過塩素酸(HClO₄)によるペプチゼーションは、HClO₄ 1M溶液でペレットを希釈することにより行った。

最終的に、ペプチゼーションしたナノ粒子を蒸留水に懸濁し、180g/LおよびpH2の磁性液を得た。

得られた酸化鉄ナノ粒子のサイズと形状を透過型電子顕微鏡で観察した（図2B）。酸化鉄ナノ粒子の結晶構造をX線回折分析で確認した。
実施例3：ナノ粒子の表面処理

3.1 ヘキサメタリン酸ナトリウム(HMP)によるナノ粒子の機能化
ヘキサメタリン酸ナトリウムのサスペンジョンを実施例１から得られる酸化鉄ナノ粒子のサスペンジョンに加え（加えたヘキサメタリン酸ナトリウムの量はLD50/5以下である）、該サスペンジョンのpHを6〜8を含むpHに調整する。電子表面荷電（＜−20mV)を、6〜8を含むpHの水性媒質中にナノ粒子を懸濁した0.2〜2g/Lの濃度のナノ粒子サスペンジョンを用い、633nm HeNeレーザーを用いるZetasizer NanoZS(Malvern Instruments)によるゼータ電位測定により測定する。

3.2 シリカによるナノ粒子の機能化
第一シリカ飽和（注入）を粒子溶液にケイ酸ナトリウムを加えて行う（240mL蒸留水中、実施例２由来の粒子１gを780μL)。残ったケイ酸ナトリウムを水に対して遠心分離して除去する。粒子125mgを、0.6mモルのテトラオルトシリケートを含む水/エタノール(1/4)溶液に分散させる。シリカ前駆体の加水分解および凝縮をバルクにアンモニウム溶液を加えて促進する。溶液を一夜インキュベーションし、次いで粒子を蒸留水中で遠心分離して洗浄する。コートした粒子を水中に保つ（pHを約7.4に調整する）。
電子表面荷電（＜−20mV)を6〜8を含むpHの水性媒質中にナノ粒子を懸濁した0.2〜2g/Lの濃度のナノ粒子サスペンジョンを用い、633nm HeNeレーザーを用いるZetasizer NanoZS(Malvern Instruments)によるゼータ電位測定により測定する。

3.3 2−[メトキシ(ポリエチレンオキシ)プロピル]トリメトキシシラン；90％ 6−9 PE−単位(PEO−シラン)によるナノ粒子の機能化
酸性媒質中で触媒された加水分解−縮合プロセスの結果、PEO−シランを、酸化鉄ナノ粒子表面（実施例１のナノ粒子）上に共有結合グラフトさせる。PEO−シランのサスペンジョンを、実施例１で得られる酸化鉄ナノ粒子に加える。典型的には、PEO−シラン(92％wt)溶液246μLを、酸化鉄、75g/Lのナノ粒子溶液2mLに加える。次に、該溶液のpHを6〜8を含むpHに調整する。
電子表面荷電(＋8mV)を6〜8を含むpHの水性媒質中にナノ粒子を懸濁した0.2〜2g/Lの濃度のナノ粒子サスペンジョンを用い、633nm HeNeレーザーを用いるZetasizer NanoZS(Malvern Instruments)によるゼータ電位測定により測定する。
実施例4：ナノ粒子を含むリポソームの製造

4.1 荷電が−20mV以下であるナノ粒子を含む「熱感受性リポソーム」(TSL)
ナノ粒子含有リポソームを、脂質フィルム再水和法を用いて製造する(Bangham et al.、J. Mol. Bio.、1965；13：238−252；Martina et al.、J. Am. Chem. Soc.、2005；127：10676−10685)：
a) 脂質をクロロホルム中で可溶化する。最後にクロロホルムを窒素流下で蒸発させる。脂質フィルムの再水和を実施例3.1に記載の酸化鉄溶液2mLを用いて55℃で行い、脂質濃度を50mMとする。
以下の脂質組成物を用いる：ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール(Chol)、およびペグ化ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE−PEG2000)（モル比100：33：27：7(DPPC：HSPC：Chol：DSPE−PEG2000)）。
b) 試料を液体窒素および55℃に調節した水浴に連続的に入れることにより凍結−解凍サイクルを20回行う。
c) サーモバレル押出機（thermobarrel extruder）(LIPEX（登録商標）Extruder、Northern Lipids)を用いて、制御温度および圧下でナノ粒子含有リポソームのサイズを較正した。すべての場合で、押出は、2〜20barの範囲の圧下、55℃で行った。
d) 非封入粒子の分離は、Sephacryl S1000ろ過ゲルを用いるサイズ排除クロマトグラフィにより行う。
e) 溶出プロフィールは、第一鉄イオン/フェナントロリン比色反応（出典：Che et al.、Journal of Chromatography B、1995；669：45−51、およびNigo et al.、Talanta、1981；28：669−674）を介するUV可視分光法(Cary 100 Varian分光計)により磁性ナノ粒子を定量することにより決定する。リポソーム含有分画を回収する(図3、第一ピーク)。リポソーム中の酸化鉄濃度は1〜2.5g/Lの範囲である。
そのような組成物のT_mは43℃である。

4.2 荷電が−20mV以下であるナノ粒子を含む「非熱感受性リポソーム」(NTSL)
工程a)で以下の脂質組成物を用いる以外は先に記載の方法に従った：水素添加ダイズホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール(Chol)、およびペグ化ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE−PEG2000)（モル比100：65：7(HSPC：Chol：DSPE−PEG2000)）。
工程a)、b)、およびc)において、脂質フィルムの再水和、解凍サイクル、および押出プロセスは62℃で行う。

4.3 荷電が15mV以下のナノ粒子を含む「熱感受性リポソーム」(TSL)
実施例3.3から得られるナノ粒子を用いる以外は先に実施例4.1に記載の方法に従った。
実施例5：ナノ粒子の放出

リポソームに封入されたナノ粒子の放出を可視化するため、実施例4.1および4.2で製造したナノ粒子含有リポソームの溶液30μLを水浴中で加熱した。

次に、低温TEM観察のため、5μLの各溶液を穴開き炭素コーティング銅グリッド上に沈着させ；過剰な液を濾紙で吸い取り、グリッドを液体窒素で冷却した液体エタン浴中に入れた。試料を約−170℃の温度に維持し、観察した。

図4Aおよび4Bは、水浴中で60℃に加熱する前と加熱後の、球状で230nmサイズの酸化鉄ナノ粒子含有「非熱感受性」リポソーム(NTSL)を示す。

図4Cおよび4Dは、水浴中で43℃(T_m)に加熱する前と加熱後の、球状で200nmサイズの酸化鉄ナノ粒子含有「熱感受性」リポソーム(TSL)を示す。

図4Eは、水浴中で48℃(T_m以上)に加熱後の、球状で200nmサイズの酸化鉄ナノ粒子含有「熱感受性」リポソーム(TSL)を示す。

図4Fは、室温で熟成後の酸化鉄ナノ粒子(実施例4.3)充填熱感受性リポソームを示す。

図4Gは、43℃(T_m)で熟成後の酸化鉄ナノ粒子(実施例4.3)充填熱感受性リポソームを示す。

「非熱感受性」リポソーム(NTSL)では、加熱前後の両方に完全な230nmサイズのリポソームがみられる（図4Aおよび4B)。

「熱感受性」リポソーム(TSL)では、図4Cの加熱前に完全な200nmサイズのリポソームがみられる。

それに対して、図4DのT_r=43℃および図4EのT_r=48℃で加熱後、200nmサイズのリポソームは、修飾された形状(図4E、白矢印)、および二重層の破壊を示し；脂質二重層のいくらかの断片もみることができる。いくつかの写真は、加熱後にもはや完全な脂質膜がみられない小胞を示し、酸化鉄ナノ粒子は脂質小胞周囲に局在している（図4D)。遊離酸化鉄ナノ粒子は、しばしばグリッド上にみられる。ナノ粒子の放出は、温度T_r＝T_m＝43℃または温度T_m以上(48℃)でみられる。荷電ナノ粒子と脂質二重層の相互作用(図4E、黒矢印)は、この驚くべき結果を説明することができた。

Claims (14)

1. ゲル−液晶相転移温度(T_m)またはT_m以上で破壊される熱感受性リポソームであって、該リポソームが少なくともホスファチジルコリンを含む熱感受性脂質膜を含み、該熱感受性脂質膜がナノ粒子を封入し、該ナノ粒子が治療薬または診断薬として用いることができ、
   各ナノ粒子が、i)最大寸法が100nm未満の無機コアを含み、ii)該ナノ粒子の表面に−20mV以下または＋20mV以上の静電気が存在する原因となる物質で完全にコートされており、該物質が、ヘキサメタリン酸ナトリウムまたはシリカであり、該静電気が、サスペンジョン中のナノ粒子の濃度が0.2〜8g/Lである場合にpH6〜8の水性媒質中でゼータ電位測定により測定される、熱感受性リポソーム。
2. 該熱感受性脂質膜がさらにコレステロールを含む請求項１記載の熱感受性リポソーム。
3. 該熱感受性脂質膜が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、水素添加ダイズホスファチジルコリン、コレステロール、およびジステアリルホスファチジルエタノールアミン−メトキシポリエチレングリコールを含む請求項１または２に記載の熱感受性リポソーム。
4. 該熱感受性脂質膜が、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアリルホスファチジルエタノールアミン−メトキシポリエチレングリコール、およびモノパルミトイルホスファチジルコリンもしくはモノステアリルホスファチジルコリンを含む、請求項１記載の熱感受性リポソーム。
5. 該ナノ粒子が、さらにスクシンイミジルエステルおよびマレイミド基から選ばれるカップリング基を含む請求項１記載の熱感受性リポソーム。
6. 該ナノ粒子が、さらに、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ホルモン、ビタミン、酵素、腫瘍抗原のリガンド、ホルモンレセプター、サイトカインレセプター、および成長因子レセプターから選ばれるターゲッティング基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の熱感受性リポソーム。
7. 該リポソームの最大サイズが50〜500nmである、請求項１〜６のいずれかに記載の熱感受性リポソーム。
8. 該リポソームの最大サイズが50〜250nmである、請求項７に記載の熱感受性リポソーム。
9. 該リポソームの破壊が該荷電ナノ粒子の放出をもたらす、請求項１〜８のいずれかに記載の熱感受性リポソーム。
10. T_mが39℃〜45℃である、請求項１〜９のいずれかに記載の熱感受性リポソーム。
11. ナノ粒子を治療薬として用いるときの、各ナノ粒子のコアの最大寸法が5nm〜100nmである、請求項１〜１０のいずれかに記載の熱感受性リポソーム。
12. ナノ粒子を治療薬として用いるときの、各ナノ粒子のコアの最大寸法が10nm〜50nmである、請求項１１に記載の熱感受性リポソーム。
13. ナノ粒子を診断薬として用いるときの、各ナノ粒子のコアの最大寸法が2nm〜10nmである、請求項１〜１２のいずれかに記載の熱感受性リポソーム。
14. 請求項１〜１３のいずれかに記載の熱感受性リポソームおよび医薬的に許容される担体を含む治療または診断用組成物。

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