PT105176A - Bioreactor multi-funcional para a engenharia de tecidos - Google Patents

Abstract

O BIOREACTOR MULTI-FUNCIONAL PARA A ENGENHARIA DE TECIDOS REFERE-SE A UM EQUIPAMENTO QUE SE DESTINA À CULTURA DE CÉLULAS PARA A CONCEPÇÃO DE IMPLANTES. O BIOREACTOR BASEIA-SE NA APLICAÇÃO DE VÁRIOS ESTÍMULOS A CÉLULAS CONTIDAS EM MATRIZES DE SUPORTE BIDIMENSIONAIS (2D) E/OU TRIDIMENSIONAIS (3D). A VARIEDADE DE ESTÍMULOS PASSÍVEIS DE SEREM APLICADOS, EM SIMULTÂNEO, PERMITE MODELAR A PROLIFERAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE VÁRIOS TIPOS DE CÉLULAS. O EQUIPAMENTO É CONSTITUÍDO POR DIVERSOS SISTEMAS DE CULTURA CELULAR, NOMEADAMENTE, ESTÍMULOS DE ROTAÇÃO, OSCILAÇÃO, PERFUSÃO, ASSIM COMO, COMPRESSÃO E EXTENSÃO MECÂNICA. AS VARIÁVEIS AFECTAS AO PROCESSO DE CULTURA DE CÉLULAS SÃO MONITORIZADAS E CONTROLADAS EM TEMPO REAL ATRAVÉS DE UMA PLACA DE DESENVOLVIMENTO CONECTADA A UM LCD TOUCHSCREEN E, TAMBÉM À DISTÂNCIA, ATRAVÉS DE DISPOSITIVOS MÓVEIS (EX. TELEMÓVEIS, TABLETS). AS CARACTERÍSTICAS INOVADORAS DO EQUIPAMENTO INCLUEM A APLICAÇÃO DE UMA VARIEDADE DE ESTÍMULOS PARA A CULTURA CELULAR, A APLICAÇÃO DE ESTÍMULOS DE PERFUSÃO, COMPRESSÃO MECÂNICA E EXTENSÃO MECÂNICA, ATRAVÉS DE ÊMBOLOS MICROPERFURADOS, E A MONITORIZAÇÃO E CONTROLO REMOTO DAS VARIÁVEIS DO PROCESSO DE CULTURA CELULAR

Description

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DESCRIÇÃO

Bioreactor Mui ti-funcional para a Engenharia de Tecidos Dominio técnico da invenção A presente invenção encontra-se relacionada com a cultura de células em matrizes de suportes bidimensionais e/ou tridimensionais para aplicações em engenharia de tecidos num bioreactor muiti-funcional. 0 bioreactor foi desenvolvido para permitir modelar a proliferação e diferenciação de vários tipos de tecidos, nomeadamente, tecido ósseo, cartilagem ou pele, com o objectivo de permitir a sua aplicação clinica e consequente implantação em organismos biológicos.

Antecedentes da Invenção

Actualmente, a cultura celular em matrizes de suporte bidimensionais e/ou tridimensionais é ainda considerada uma tarefa complexa, devido à necessidade de controlo de diversos parâmetros de origem biológica e mecânica envolvidos na formação de tecidos in vitro. Considerando os vários tipos de células, vários modelos de bioreactores para engenharia de tecidos têm sido propostos ao longo do tempo. a não 0 método mais simples de efectuar a cultura celular é a cultura estática, na qual se destacam os Frascos T, Placas de 12 poços e as caixas de Petri [1], que representam os sistemas de cultura com maior facilidade de utilização, baixo custo e facilidade de esterilização. Contudo, a sua utilização apresenta algumas limitações, nomeadamente, o curto período de tempo de cultura celular, as quantidades celulares limitadas, a baixa reprodutibilidade, 2 uniformidade na distribuição dos nutrientes e a ausência de estimulos ao crescimento celular, sendo, portanto, pouco adequada à cultura celular tridimensional.

Os bioreactores dinâmicos surgem, então, na identificação da necessidade de implementar sistemas que visem a optimização de transferência de massas (nutrientes e gases de respiração celular) nas matrizes tridimensionais. Estes bioreactores pretendem reproduzir as condições de crescimento de tecidos em condições in vivo, tendo como principal finalidade a obtenção de tecidos tridimensionais com caracteristicas biológicas e mecânicas que permitam a sua implantação in vivo.

Os bioreactores dinâmicos podem ser classificados de acordo com o seu principio de funcionamento em sistemas de agitação, rotação, perfusão e estimulação mecânica.

Os sistemas de agitação consistem em sistemas evolutivos da cultura estática, nos quais o meio de cultura se encontra em agitação, originando um sistema hidrodinâmico caracterizado pelas elevadas transferências de massas na cultura tridimensional de células. Como exemplos deste tipo de bioreactores tem-se o vaso de movimento giratório (US 2009/0176301 Al), o bioreactor de paredes onduladas [2] e o vaso de agitação [3] . 0 principio de funcionamento destes equipamentos baseia-se na utilização de imanes ou lâminas em rotação constante, criando sistemas turbulentos do meio de cultura que atravessam continuamente a matriz de suporte e nutrem as células presentes na matriz. Contudo, estes sistemas, devido ao desenvolvimento de regimes turbulentos de fluidos, apresentam elevadas tensões de corte, o que pode comprometer a estabilidade e viabilidade das células contidas na matriz de suporte. Ainda sob esta categoria de bioreactores encontram-se os sistemas de oscilação simples, 3 que se caracterizam pela deslocação do meio de cultura num determinado plano (US 6,544,788 B2).

Os sistemas rotacionais uni ou biaxial de cultura celular têm demonstrado bons resultados na proliferação de células em matrizes de suporte bidimensionais e/ou tridimensionais, em consequência da criação de um ambiente de microgravidade e elevadas transferências de massas. Exemplos deste tipo de sistemas são o vaso de paredes rotativas da National Aeronautics and Space Administration (NASA) [4], o reactor de eixo rotativo [5] e o bioreactor de rotação biaxial [6]. 0 documento US 2006/0019388 AI divulga um equipamento de rotação uniaxial e biaxial com câmaras rotativas assembladas verticalmente. Porém, este equipamento não permite a conjugação de movimento uni ou biaxial com o movimento de oscilação executado pelo suporte que sustenta a câmara de cultura.

Os sistemas de perfusão consistem na passagem de meio de cultura de forma laminar constante ou pulsada, sobre a matriz de suporte bidimensional e/ou tridimensional. Estes sistemas permitem induzir uma orientação preferencial aos tecidos, à semelhança do que sucede em condições in vivo. O bioreactor de fibras ocas [7] é um exemplo de um bioreactor de perfusão, que consiste num feixe de fibras ocas distribuídas paralelamente ao eixo longitudinal da câmara.

Os documentos EP 2 151 419 A2 e US 2009/0280565 AI divulgam dois sistemas de perfusão uni e bidireccional multi-câmara com controlo das variáveis bioquímicas do processo de cultura celular. Contudo, contrariamente ao sistema desenvolvido, não permitem a cultura celular utilizando o sistema de perfusão e de compressão mecânica (constante ou alternada) em simultâneo. A combinação de estímulos hidrodinâmicos e de compressão visa o aumento das 4 propriedades mecânicas e biológicas em tecidos cartilaginosos. A estimulação por compressão mecânica contribui positivamente para o auxilio da proliferação, diferenciação e alinhamento celular, ideais para tecidos ósseo e cartilaginoso. A aplicação deste estimulo permite reproduzir as condições in vivo a que estes tecidos estão sujeitos, originando tecidos com propriedades mecânicas superiores.

Os sistemas evolutivos de estimulação mecânica combinado com perfusão foram propostos por Orr e Burg [8] . Os autores apresentam um sistema de compressão hidrostática de 30kPa e uma frequência de 0.5 Hz sobre um diafragma que comprime o volume de fluido na zona de cultura.

Com este invento pretende-se diminuir os custos associados ao processo de cultura celular, através da conjugação de uma multiplicidade de estímulos adaptáveis a várias linhas celulares, num só equipamento. O presente invento contempla ainda novos métodos de aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica, permitindo a obtenção de tecidos tridimensionais com propriedades semelhantes aos tecidos saudáveis que permitem a sua aplicação clínica. O presente invento introduz também uma nova abordagem para efectuar a monitorização e controlo das variáveis afectas ao processo de cultura de células.

Descrição geral da invenção A presente invenção refere-se a um bioreactor que se encontra integrado num sistema de cultura celular, permitindo a sua operação sob influência de condições ambientais e operacionais controladas e monitorizadas em tempo real. 5 0 equipamento desenvolvido caracteriza-se por actuar em condições estéreis, tendo sido especialmente concebido para suportar a cultura de diferentes tipos de células. Deste modo, o presente equipamento pode ser utilizado para a concepção de implantes destinados a diversos tipos de tecidos, nomeadamente, tecido ósseo, cartilagem ou pele. 0 bioreactor é capaz de aplicar, em simultâneo, uma vasta gama de estimulos às células, as quais se encontram imobilizadas em matrizes de suporte bidimensionais e/ou tridimensionais. 0 bioreactor é constituído por uma zona de cultura celular composta por um plataforma com uma geometria rectangular, que tem como finalidade suportar os diferentes sistemas de cultura de células que constituem o equipamento. Esta plataforma possui três unidades distintas de cultura celular. Em duas dessas unidades é efectuada a cultura de células sob a acção dos estímulos de rotação uniaxial (eixo "Y" ou "Z"), rotação biaxial e oscilação. A terceira unidade da plataforma de suporte destina-se à cultura de células sob acção dos estímulos de perfusão unidireccional e bidireccional, e também, de estimulação por compressão mecânica unidireccional e bidireccional.

As unidades destinadas à cultura de células sob aplicação dos estímulos de rotação e oscilação são constituídas por suportes com diferentes geometrias, os quais efectuam movimentos de rotação e oscilação através de motores eléctricos, regulados por computador. A unidade destinada à cultura de células sob aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica é constituída por um suporte amovível, no qual se encontram acopladas as várias câmaras de cultura assembladas a êmbolos movidos por motores eléctricos, igualmente controlados por computador. 6 A perfusão do meio de cultura é efectuada através de uma bomba peristáltica, que permite a circulação do meio de cultura desde o seu reservatório até ao reservatório de recolha de residuos, passando pelo interior das câmaras de cultura. 0 meio de cultura é transportado por tubos que podem ser impermeáveis ou semi-permeáveis a gases. 0 controlo dos gases no meio de cultura pode ser efectuado de duas formas distintas: através da injecção de uma mistura de gases com uma composição previamente determinada no interior do reservatório do meio de cultura, sendo então, utilizados tubos impermeáveis a gases para o transporte do meio de cultura; através do controlo sobre as concentrações dos gases no interior da incubadora, sendo desta forma utilizados tubos semi-permeáveis a trocas gasosas para o transporte de meio de cultura, permitindo trocas gasosas entre o meio de cultura e o ambiente no interior do bioreactor. 0 nivel de gases presentes no meio de cultura é controlado através de um computador, por intermédio de sensores específicos. De igual modo, a temperatura é controlada e monitorizada em duas zonas distintas: uma delas destinada aos reservatórios de meio de cultura e de recolha de resíduos, e a outra zona (de incubação) destinada à colocação dos sistemas de cultura celular, isto é, da base de suporte das unidades de cultura celular. 0 bioreactor opera num ambiente totalmente isolado do exterior, permitindo que a cultura celular se desenrole a temperatura constante e em condições estéreis. A esterilização no interior do bioreactor é efectuada por intermédio de lâmpadas de radiação ultra-violeta. 0 bioreactor permite, ainda, a introdução de sistemas auxiliares de determinação de parâmetros, como o pH ou a concentração de metabolitos, como a glucose. 7

Todos os componentes do bioreactor são constituídos por materiais inertes, biocompatíveis e autoclaváveis, permitindo a sua fácil esterilização. Os componentes são, também, de fácil montagem e desmontagem. 0 sistema de controlo do bioreactor permite a monitorização e o controlo , em tempo real, das variáveis envolvidas no processo de cultura celular (ex. temperatura, fluxo de perfusão do meio de cultura, velocidade de rotação, entre outros), via computador, localizado junto ao sistema, ou à distância, através de internet.

Descrição das Figuras

Figura 1: Representação esquemática do sistema mecânico da cultura celular. Na qual (1) representa a zona de cultura celular, (2) representa a base suporte das unidades de cultura, (3) representa uma unidade de cultura para aplicação de estímulos de rotação e oscilação, (4) representa outra unidade de cultura para aplicação de estímulos de rotação e oscilação, (5) representa a unidade de cultura para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica.

Figura 2: Representação esquemática de uma unidade de cultura para aplicação de estímulos de rotação e oscilação. Na qual (6) representa a base giratória, (7) representa as rodas de deslocação da base giratória, (8) representa uma plataforma em forma de "U", (9) representa uma câmara de cultura celular para aplicação de estímulos de rotação e oscilação, (10) representa a parte central da câmara de cultura para aplicação de estímulos de rotação e oscilação, (11) representa um encaixe redondo, (12) representa o bocal de entrada e saída de meio de cultura para a acoplagem de um 8 tubo de transporte de meio de cultura, (13) representa um encaixe redondo com perfil de roda dentada, (14) representa a roda dentada, (15) representa um motor eléctrico.

Figura 3: Representação esquemática de uma unidade de cultura para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica. Na qual (16) representa o suporte amovível, (17) representa um motor eléctrico, (18) representa uma câmara de cultura vertical para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica unidireccional, (19) representa uma câmara de cultura horizontal para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica bidireccional.

Figura 4: Representação esquemática de uma câmara de cultura para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica unidireccional. Na qual (20) representa parte central cilíndrica, (21) representa um orifício de saída de meio de cultura.

Figura 4A: Representação esquemática interna de uma câmara de cultura para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica unidireccional. Na qual (22) representa uma saliência de apoio para a matriz de suporte, (23) representa a matriz de suporte, (24) representa a matriz tampa circular, (25) representa o êmbolo oco.

Figura 5: Representação esquemática do êmbolo do sistema de cultura para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica. Na qual (26) representa o tubo oco, (27) representa um componente cónico, (28) representa a base micro-perfurada, (29) representa um anel com rosca, (30) representa um o-ring. 9

Figura 6: Representação esquemática de uma câmara de cultura para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica bidireccional. Na qual (31) representa parte central cilíndrica, (32) representa um tampa circular, (33) representa um êmbolo oco.

Figura 6A: Representação esquemática interna de uma câmara de cultura para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica bidireccional. Na qual (34) representa a matriz de suporte.

Figura 7: Representação esquemática do bioreactor fechado.

Figura 8: Representação esquemática do bioreactor aberto. Na qual (35) representa a zona de reservatórios, (36) representa a porta de acesso à zona de reservatórios, (37) representa a zona de incubação, (2) representa a base de suporte das unidades de cultura celular, (38) representa a porta externa do bioreactor, (39) representa a porta secundária para visualização do interior do bioreactor, (40) representa a lâmpada de UV, (41) representa o visor LCD.

Figura 9: Representação esquemática de ligações de tubos de transporte de meio de cultura e locais de monitorização das variáveis do processo de cultura celular. 10

Descrição detalhada da invenção A zona de cultura celular (1) apresentada é um sistema constituído por uma base com geometria rectangular (2), que compreende três unidades distintas de cultura celular (3,4 e 5) .

As unidades (3) e (4) destinam-se à cultura de células imobilizadas em matrizes de suporte bidimensionais e/ou tridimensionais, sob a acção de estímulos de rotação e oscilação, mais especificamente, estímulos de rotação uniaxial sobre os eixos "Y" ou "Z", rotação biaxial e oscilação sobre o eixo "X". Todos os estímulos podem ser aplicados na ausência ou presença de perfusão do meio de cultura. A unidade (5) destina-se à cultura de células imobilizadas em matrizes de suporte bidimensionais e/ou tridimensionais, sob a acção de estímulos de perfusão e estimulação por compressão mecânica, mais especificamente, estímulos de perfusão unidireccional (eixo "Z"), perfusão bidireccional (eixo "X"), estimulação por compressão mecânica unidireccional (eixo "Z") e estimulação por compressão mecânica bidireccional (eixo "X") . A estimulação por compressão mecânica pode ser efectuada com ou sem a perfusão do meio de cultura.

As unidades (3) e (4) são constituídas por uma base com geometria redonda (6) que possui rodas (7) na sua face interior. A base redonda (6) encontra-se conectada a um motor eléctrico que permite efectuar a sua rotação sobre o eixo "Z". Na face exterior da base redonda (6) encontra-se acoplado um suporte em forma de "U" (8), que efectua movimentos de oscilação sobre o eixo "X", por intermédio de um motor eléctrico. À plataforma em forma de "U" encontra-se 11 acoplada uma câmara de cultura (9), que pode apresentar uma geometria cilíndrica, elíptica ou elipsóide. A câmara de cultura (9) é constituída por três componentes principais: uma parte central (10), que pode apresentar uma geometria cilíndrica, elíptica ou elipsóide; um componente de geometria circular que possui um encaixe redondo (11) com um bocal de entrada e saída de meio de cultura (12) para a colocação de um tubo de transporte de meio de cultura, e tem como função, permitir a perfusão do meio de cultura no interior da câmara de cultura; um componente de geometria circular que possui um encaixe redondo para a colocação de um tubo de transporte de meio de cultura com um perfil de uma roda dentada (13) . A roda dentada encaixa numa outra roda dentada (14) presente na plataforma em forma de "U" que é accionada por um motor eléctrico (15) . Deste modo, a câmara de cultura (9) pode efectuar um movimento de rotação sobre o eixo "Y". A perfusão do meio de cultura é efectuada por intermédio de uma bomba peristáltica, que envia o fluido do reservatório de meio de cultura para o reservatório de recolha de resíduos, passando pelo interior da câmara de cultura. O meio de cultura é conduzido através de tubos impermeáveis ou semi-permeáveis aos gases. Um dos tubos faz a ligação entre o reservatório do meio de cultura e o componente de geometria circular da câmara de cultura (11), permitindo a entrada de meio de cultura na câmara de cultura; enquanto o outro tubo faz a ligação entre o componente de geometria circular da câmara de cultura (13) e o reservatório de recolha de resíduos, permitindo a saída de meio de cultura da câmara de cultura.

Caso se pretenda efectuar a cultura celular sob a acção dos estímulos de rotação ou oscilação na ausência da perfusão do meio de cultura, os componentes de geometria circular da 12 câmara de cultura (11) e (13) são substituídos por componentes sem encaixes para a conexão com os tubos de transporte de meio de cultura. Deste modo, o conteúdo da câmara de cultura não é renovado durante o decorrer do processo de cultura celular.

Os movimentos de rotação uniaxial no eixo "Z" e no eixo "Y" são independentes entre si, podendo assumir diferentes velocidades de rotação. A combinação de ambos os movimentos resulta no movimento de rotação biaxial, o qual permite obter distribuições mais homogéneas do fluido no interior da câmara de cultura e, consequentemente, uniformizar a proliferação e diferenciação das células na matriz de suporte. A unidade de cultura celular (5) é constituída por um suporte amovível (16) com capacidade para a colocação de seis câmaras de cultura com uma geometria cilíndrica. Nestas câmaras de cultura é possível efectuar a cultura de células sob a acção de estímulos de perfusão unidireccional e bidireccional, assim como de estimulação por compressão mecânica unidireccional e bidireccional, por acção de motores eléctricos (17). Os estímulos de compressão mecânica podem ser aplicados na presença ou ausência de perfusão do meio de cultura.

Das seis câmaras de cultura presentes na unidade (5), quatro câmaras de cultura verticais (18) destinam-se à cultura de células sob a acção de estímulos de perfusão e compressão mecânica unidireccional, enquanto as restantes duas câmaras de cultura horizontais (19) se destinam à cultura celular sob a acção de estímulos de perfusão e estimulação por compressão mecânica bidireccional.

As câmaras de cultura verticais para aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica unidireccional (18) encontram-se dispostas na vertical e são constituídas pelos 13 seguintes componentes: uma parte central de geometria cilindrica (20) que possui na extremidade inferior um orificio para a saida do meio de cultura (21) , possuindo também uma saliência no interior (22) para suportar as matrizes de suporte (23); uma tampa circular (24) e um êmbolo oco (25) . O êmbolo oco (25) é constituído por três componentes: um tubo oco para a passagem de meio de cultura (26) , que encaixa num componente oco de geometria cónica (27) , e que, por sua vez, encaixa numa base microperfurada (28) fixa por um anel que enrosca no componente cónico (27). A separação física dos componentes é feita por o-rings (30). A base microperfurada (28) permite efectuar uma perfusão homogénea em toda a superfície da matriz de suporte das células. O êmbolo oco (25) é accionado através de um motor eléctrico (17), podendo efectuar movimentos ascendentes e descendentes. 0 meio de cultura passa pelo interior do êmbolo oco (25) e, de seguida, é forçado a passar pelos poros da matriz de suporte (23) das células, saindo, posteriormente, pelo orifício da câmara de cultura (21). A perfusão unidireccional é efectuada através da introdução de meio de cultura na câmara de cultura, por intermédio de uma bomba peristáltica. É possível regular o fluxo de entrada do meio de cultura, assim como a distância máxima entre a base microperfurada (28) do êmbolo oco (25) e a matriz porosa de suporte das células (23). A estimulação por compressão mecânica unidireccional é efectuada por intermédio de movimentos ascendentes e descendentes do êmbolo oco (25) . Estes movimentos provocam tensões nas células, permitindo modelar a proliferação e diferenciação celular. Através de computador é possível controlar a frequência e força exercida pelo êmbolo sobre a matriz de suporte e, consequentemente, sobre as células. 14 A estimulação por compressão mecânica unidireccional pode ser aplicada em simultâneo com a perfusão continua do meio de cultura ou sem perfusão. Para a aplicação de estímulos de compressão mecânica unidireccional com perfusão, o êmbolo oco (25) efectua movimentos ascendentes e descendentes pré-determinados e, durante o processo, o meio de cultura é continuamente renovado no interior da câmara de cultura. Caso se pretenda efectuar a estimulação por compressão mecânica unidireccional sem a perfusão, a válvula presente no orifício da câmara de cultura é fechada e o meio de cultura não é renovado automaticamente ao longo do processo. As câmaras de cultura dispostas na horizontal (19) são constituídas pelos seguintes componentes: uma parte central (31), duas tampas circulares com um orifício, também ele circular no centro (32), e dois êmbolos ocos (33) similares aos êmbolos nos sistemas de perfusão e compressão mecânica unidireccionais (25). Para estes estímulos, os êmbolos ocos possuem uma válvula no local de entrada de meio de cultura. A válvula permite que o meio de cultura presente no interior da câmara de cultura não seja enviado para o exterior da mesma, por acção dos movimentos efectuados durante o processo de cultura celular. 0 movimento dos êmbolos ocos (33) é controlado através de um computador e accionado por intermédio de um motor eléctrico (17). Os êmbolos ocos (33) operam num movimento solidário, isto é, quando um dos êmbolos avança o outro recua. De salientar que as matrizes de suporte (34) para a cultura de células são imobilizadas no interior da câmara de cultura horizontais (19) por intermédio de o-rings.

Inicialmente, para efectuar a perfusão bidireccional é introduzido um determinado volume de meio de cultura no interior da câmara de cultura horizontal (19). Neste momento a válvula do êmbolo oco (33) que se encontra conectado ao 15 tubo que conduz o meio de cultura para o reservatório de residuos é fechada. Após o volume de meio de cultura se encontrar definido, inicia-se o movimento solidário dos êmbolos, sendo neste momento aberta a válvula. Neste instante do processo, o volume de meio de cultura que entra na câmara de cultura é igual ao volume que sai, mantendo-se um volume constante no interior da câmara de cultura horizontal (19). Através do movimento solidário dos êmbolos, o meio de cultura é forçado a passar de uma extremidade da matriz de suporte das células para a outra, efectuando o estimulo de perfusão bidireccional.

Para efectuar o estimulo de compressão mecânica bidireccional, os êmbolos ocos (33) dispostos na horizontal efectuam movimentos horizontais solidários, isto é, quando um êmbolo avança o outro recua. Durante o movimento dos êmbolos, as faces da matriz de suporte das células encontram-se sujeitas a estímulos de compressão mecânica, sendo possível regular a frequência e intensidade do estímulo aplicado. A estimulação por compressão mecânica bidireccional pode ser aplicada em simultâneo com a perfusão contínua do meio de cultura ou sem perfusão. Para a aplicação de estímulos de compressão mecânica bidireccional com perfusão, o êmbolo oco (33) avança e recua, segundo ciclos pré-estabelecidos e, durante o processo, o meio de cultura é continuamente renovado no interior da câmara de cultura horizontal (19). Caso se pretenda efectuar a estimulação por compressão mecânica bidireccional sem a perfusão, a válvula presente no êmbolo oco (33) é fechada e o meio de cultura não é renovado automaticamente ao longo do processo. 0 bioreactor encontra-se integrado num sistema de cultura de células constituído por uma zona de incubação (37) e um sistema de controlo. 16 0 bioreactor permite a colocação da base de suporte das unidades de cultura celular (2) no seu interior, facultando o desenrolar da cultura celular sob condições ambientais adequadas, estéreis, monitorizadas e controladas. 0 bioreactor possui também um local para a colocação de reservatórios de meio de cultura e reservatórios de recolha de resíduos (35). 0 local destinado à colocação de reservatórios de meio de cultura e reservatórios de recolha de resíduos (35) possui uma porta lateral (36) para permitir o fácil acesso ao local. Por sua vez, a zona de incubação (37) destinada à colocação da base de suporte das unidades de cultura celular (2) possui uma porta (38) que permite o acesso ao interior da incubadora, assim como uma porta secundária transparente (39) para permitir a visualização do processo, sem interferir com as condições ambientais no interior do bioreactor. 0 bioreactor é constituído por materiais biocompatíveis, inertes e esterilizáveis, possuindo um sistema integrado de esterilização constituído por quatro lâmpadas de ultra-violeta (40). O sistema de controlo do bioreactor e da incubadora é efectuado através de computador e permite a monitorização contínua e controlo de todas as variáveis envolvidas no processo de cultura celular (a temperatura, concentração de gases, velocidade de rotação da base com geometria redonda (6), velocidade de rotação da câmara de cultura (9), velocidade de oscilação do suporte em forma de "U" (8), frequência e intensidade do movimento dos êmbolos (25) e (33) e fluxo de perfusão) . A monitorização e controlo das variáveis inerentes à cultura celular podem ser efectuadas junto ao bioreactor através do visor LCD (41), no computador e, também, remotamente, através de internet. 17

As câmaras de cultura (9), (18) e (19) são constituídas por policarbonato, pelas suas excelentes propriedades mecânicas, biológicas, químicas e ópticas. Este material apresenta resistência a temperaturas elevadas, permitindo a sua esterilização através de autoclave, é muito resistente a solventes e é transparente, o que permite a monitorização da cultura celular.

Os tubos para o transporte de meio de cultura podem ser de vários tipos, consoante as necessidades. Caso não se pretendam trocas gasosas entre o meio ambiente no interior da incubadora e o meio de cultura, utilizam-se tubos impermeáveis a gases; caso se pretendam trocas gasosas entre o meio de cultura e atmosfera exterior utilizam-se tubos semi-permeáveis a gases (ex. tubos de silicone).

Todos os equipamentos adicionais para monitorizar e controlar as variáveis afectas ao processo de cultura celular podem ser adquiridos em separado e integrados no software de monitorização do sistema.

Exemplos de aplicação 0 presente invento é aplicável na concepção de estruturas tecidulares bidimensionais e tridimensionais (ex. osso, cartilagem, pele, entre outros), desde a fase de crescimento celular até à fase de formação total de tecidos fisiologicamente implantáveis, estudos mecanobiológicos sobre a influência das diferentes condições ambientais, químicas, biológicas e mecânicas, no âmbito de diversas áreas médicas, nomeadamente, citologia, biologia celular, biotecnologia e engenharia de tecidos.

Documentos Relevantes 18 [1] S. Kumar, C. Wittmann e E. Heinzle. Biotechnology Letters, Vol.26, N°.l, pp.1-10, (2004).

[2] H. C. Chen e Y. C. Hu. Biotechnology Letters, Vol.28, N° .18, pp.1415-1423, (2006).

[3] G. J. M.Cabrita, B. S. Ferreira, C. L. Silva, L.

Gonçalves, G. Almeida-Porada e J. M. S. Cabral. TRENDS in Biotechnology, Vol.21, N°.5, pp.233-240, (2003).

[4] B. J. Klement, Q. M. Young, B. J. George e M. Nokkaew. Bone, Vol.34, N°.3, pp.487-498, (2004).

[5] H.-C. Chen, H.-P. Lee, M.-L. Sung, C.-J. Liao e Y.-C. Hu. Biotechnology Progress, Vol.20, N°.6, pp.1802-1809, (2004).

[6] H.Singh, S. H. Teoh, Η. T. Low e D. W. Hutmacher.

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[7] Y. Martin e P. Vermette. Biomaterials, Vol.26, N°.35, pp.7481-7503, (2005).

[8] D. E. Orr e K. J. L. Burg. Annals of Biomedical

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Data: 14 de Junho de 2011

Claims (26)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Bioreactor multi-funcional para Engenharia de Tecidos, caracterizado por compreender duas unidades de cultura de células com aplicação de estímulos de rotação e de oscilação (3) e (4), e uma unidade de cultura de células com aplicação de estímulos de perfusão e compressão mecânica (5) , a uma vasta gama de células imobilizadas em matrizes de suporte bidimensionais e/ou tridimensionais.

2. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir uma zona de cultura celular (1) que consiste numa plataforma de suporte (2) que contém as três unidades distintas e independentes para a cultura de células (3), (4) e (5), em ambiente esterilizado e controlado.

3. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1, caracterizado por possuir, nas unidades (3) e (4), uma plataforma com geometria em forma de "U" conectada a uma base de geometria redonda (6) e ligada a um motor que promove oscilação no eixo "X" da câmara de cultura (9) .

4. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1, caracterizado por possuir, nas unidades (3) e (4), uma plataforma com geometria em forma de "U" conectada a uma base de geometria redonda (6) assistida por rodas de deslocação da base giratória (7) e movida por um motor eléctrico, e uma roda dentada (14) conectada a um motor eléctrico, onde se acopla a componente com geometria cilíndrica com perfil de roda dentada (13), promovendo a acção estímulos de rotação da câmara de 2 cultura (9), de forma independente, nos eixos "Z" e "Y", respectivamente.

5. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1, caracterizado por compreender, na unidade (5), câmaras de cultura verticais (18) e câmaras de cultura horizontais (19) assistidas por êmbolos ocos (25) e (33), respectivamente; ambas as câmaras de cultura (18) e (19) possuem a base microperfurada (28) para aplicação de estímulos de perfusão unidireccional e de perfusão bidireccional, respectivamente.

6. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1 e 5, caracterizado por compreender, na unidade (5), câmaras de cultura verticais (18) e câmaras de cultura horizontais (19) assistidas por êmbolos ocos (25) e (33) , respectivamente, ambos movidos por motores eléctricos para aplicação de estímulos de compressão mecânica unidireccional e de compressão mecânica bidireccional, respectivamente.

7. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por possuir nas unidades (3) e (4), uma base de geometria redonda (6) que efectua movimentos de rotação em torno do eixo "Z", um suporte em forma de "U" (8) conectado à base de geometria redonda (6) que efectua movimentos de oscilação sobre o eixo "X", e uma câmara de cultura (9) que se encontra conectada ao suporte em forma de "U" (8) e efectua movimentos de rotação sobre o eixo "Y".

8. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 e 6, caracterizado por permitir que as velocidades de rotação nos eixos "Y" e "Z" e de oscilação sejam 3 realizadas por intermédio de motores independentes eléctricos e controladas por computador.

9. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por possuir uma câmara de cultura (9), que pode apresentar uma geometria cilindrica, eliptica ou elipsóide e que é constituida por uma parte central (10), um componente com geometria circular (11) com um bocal de entrada e saida de meio de cultura (12) que permite a conexão de um tubo de transporte de meio de cultura que liga até ao reservatório de meio de cultura e um componente com geometria cilindrica com perfil de roda dentada (13) com um bocal de entrada e saida de meio de cultura (12) que permite a conexão de um tubo de transporte de meio de cultura até ao reservatório de resíduos.

10. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por possuir na unidade (5) , um suporte amovível (13), que contém seis câmaras para a cultura de células imobilizadas em matrizes de suporte bidimensionais e/ou tridimensionais.

11. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por possuir um suporte amovível (13) que permite a acoplagem de quatro câmaras verticais para a cultura de células com geometria circular (18) para aplicação de estímulos de perfusão unidireccional e de estímulos de compressão unidireccionais.

12. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por possuir um suporte amovível (13) que permite a acoplagem horizontal de duas câmaras horizontais para a cultura de células com geometria 4 circular (19) para aplicação de estímulos de perfusão bidireccional e de estímulos de compressão bidireccionais.

13. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 9 e 10, caracterizado por possuir uma câmara de cultura verticais (18) constituída por uma parte central (20) que contém um orifício (21) na extremidade inferior, uma saliência no interior (22) para suportar as matrizes de suporte (23), uma tampa circular (24) e um êmbolo oco (25).

14. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por possuir um êmbolo oco (25) , no interior da câmara de cultura vertical (18), constituído por um tubo oco para a passagem de meio de cultura (26) que encaixa num componente cónico também ele oco (27), onde encaixa uma base microperfurada (28) fixa, posteriormente, por um anel com rosca (29).

15. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 12 e 13, caracterizado por possuir um êmbolo oco (25), que pode efectuar movimentos ascendentes e descendentes por acção de um motor eléctrico, controlado por computador.

16. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 9 e 11, caracterizado por possuir uma câmara de cultura horizontal (19) constituída por uma parte central (31) conectada a duas tampas circulares (32) e dois êmbolos ocos (33) que possuem uma válvula para regular a passagem de meio de cultura.

17. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 9 e 15, caracterizados por possuir êmbolos ocos (33), no 5 interior da câmara de cultura horizontal (19), que podem efectuar movimentos solidários de avanço e recuo através de um motor eléctrico que é controlado por computador.

18. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por efectuar estímulos de perfusão do meio de cultura através de uma bomba peristáltica que envia o meio de cultura presente num reservatório, através de tubos de transporte de meio de cultura conectados aos bocais de entrada e saida de meio de cultura (12), até ao interior da câmara de cultura, saindo, posteriormente, para o reservatório de recolha de residuos e onde o fluxo de meio de cultura é regulável através de computador.

19. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por permitir o desenrolar da cultura de células com a perfusão continua do meio de cultura por intermédio de bombas peristálticas, conectadas por tubos de transporte de meio, às unidades de cultura de células através dos bocais de entrada e sarda de meio de cultura (12) e dos êmbolos ocos (33).

20. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser constituído por materiais biocompativeis, inertes, autoclaváveis e esterilizáveis.

21. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado por possuir tubos de transporte de meio de cultura que podem ser semi-permeáveis ou impermeáveis a gases presentes na atmosfera exterior. 6

22. Bioreactor, caracterizado por conter um sistema de cultura celular composto por uma zona de cultura celular (1) que se encontra no interior de uma zona de incubação (37) que permite o controlo das variáveis inerentes ao processo de cultura de células, nomeadamente, a temperatura, concentração de gases, velocidade de rotação da base com geometria redonda (6), velocidade de rotação da câmara de cultura (9), velocidade de oscilação do suporte em forma de "U" (8), frequência e carga aplicada pelo movimento dos êmbolos ocos (25 e 33) e fluxo de perfusão do meio de cultura.

23. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por conter uma zona de incubação (37) que permite a manutenção das condições ambientais adequadas para o desenrolar do processo de cultura celular sob condições assépticas, possuindo para tal, um sistema de esterilização constituído por quatro lâmpadas de radiação ultravioleta (40) .

24. Bioreactor, de acordo com as reivindicações 24 e 25, caracterizada por conter uma zona de incubação (37) constituída por materiais biocompatíveis, inertes, autoclaváveis e esterilizáveis.

25. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por conter um sistema de controlo que permite a integração de múltiplos sensores para a monitorização de parâmetros associados ao processo de cultura celular, nomeadamente, a concentração de glucose, o pH, o oxigénio dissolvido, entre outros em meio líquido. 7

26. Bioreactor, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por conter um sistema de controlo que permite a monitorização e controlo das variáveis inerentes ao processo de cultura de células: temperatura na zona de cultura celular (1) e na zona de reservatórios (35), fluxo de perfusão do meio de cultura, velocidade de rotação nos eixos "Y" e "Z" e de oscilação no eixo "Y", força de compressão e distância dos êmbolos ocos (25) e (33) em relação às matrizes de suporte bidimensionais/tridimensionais, concentração de gases (oxigénio e dióxido de carbono), pH, concentração de metabólitos, entre outros, através de um computador localizado junto ao bioreactor e, também, à distância através de internet. Data: 14 de Junho de 2011