PT106827A - Bioreator de estímulo para caracterização biomecânica de engenharia de tecidos - Google Patents

Abstract

BIOREATOR PARA CARACTERIZAÇÃO BIOMECÂNICA DE CONSTRUÇÕES CELULARES BIDIMENSIONAIS E TRIDIMENSIONAIS DE ENGENHARIA DOS TECIDOS SEM INTERRUPÇÃO DO CRESCIMENTO CELULAR, PERMITINDO ESTABELECER UMA CORRELAÇÃO ENTRE PROPRIEDADES MECÂNICAS, NOMEADAMENTE MÓDULO DE ELASTICIDADE À COMPRESSÃO/TRAÇÃO, MÓDULO DE RIGIDEZ AO CORTE, MÓDULO À FLEXÃO E PERMEABILIDADE, E PARÂMETROS QUÍMICOS DO MEIO DE CULTURA, NOMEADAMENTE PH E TENSÃO DE OXIGÉNIO, E DIFERENTES REGIMES E MODOS DE ESTÍMULO MECÂNICO E/OU ESTÍMULO ELÉTRICO E/OU ESTÍMULO MAGNÉTICO, NOMEADAMENTE COMPRESSÃO/TRAÇÃO AXIAL, CORTE POR TORÇÃO, FLEXÃO, PERFUSÃO E COMPRESSÃO HIDROSTÁTICA, POR FORMA A DESENVOLVER UM TECIDO ARTIFICIAL PLENAMENTE FUNCIONAL PARA IMPLANTAÇÃO IN-VIVO. OS MODOS E TIPOS DE ESTIMULAÇÃO SÃO MODIFICADOS AUTONOMAMENTE EM FUNÇÃO DAS PROPRIEDADES BIOMECÂNICAS DAS CONSTRUÇÕES CELULARES E DOS PARÂMETROS QUÍMICOS DO MEIO DE CULTURA ATRAVÉS DE UMA OU MAIS FUNÇÕES OBJETIVO. BIOREATOR COMPREENDE UMA CÂMARA DE CULTURA ESTANQUE DESLIZANTE (3) QUE COMPREENDE GARRAS (34, 35, 22, 21) PARA FIXAÇÃO DAS CONSTRUÇÕES CELULARES (27, 20) LIGADAS À CÉLULA DE CARGA (14) E ATUADOR (4) E UM SISTEMA DE CONTROLO (7).

Description

DESCRIÇÃO "BIOREATOR PARA ENGENHARIA DE TECIDOS"

Dominio técnico da invenção A presente invenção diz respeito a um bioreator para a caracterização biomecânica e bioquímica de construções bidimensionais e tridimensionais de engenharia dos tecidos em tempo real como função do estímulo mecânico, elétrico e magnético a que estas foram/estão submetidas.

Sumário da invenção É um dos principais objetivos da presente invenção um bioreator capaz de proceder à caracterização biomecânica de construções bidimensionais e tridimensionais de engenharia dos tecidos em tempo real sem intervenção na cultura, com a capacidade de geração de modos de estímulo mecânico incluindo compressão axial, tração axial, corte puro por torção, corte por efeito de perfusão, flexão e compressão hidrostática de uma forma isolada, continua ou intermitente e estímulo elétrico e/ou magnético através de sistemas de atuação. Os sensores instalados no bioreator controlam e agem simultaneamente sobre as condições de C02, temperatura e pressão hidrostática do meio de cultura através de um sistema de controlo. 0 bioreator é capaz de modificar os modos de estimulação mecânica, elétrica e/ou magnética incluindo o tipo de estímulo, a amplitude, a frequência, a duração e período de uma forma autónoma em tempo real adaptando o estímulo ao 1 estado biomecânico e químico das construções celulares através de uma ou mais funções objetivo previamente definidas no sistema de controlo do bioreator. 0 bioreator permite monitorizar a evolução da estrutura das construções celulares por técnicas de imagem incluindo raio-X, tomografia axial computorizada, ressonância magnética, sem interromper o crescimento da estrutura celular. 0 bioreator pode acomodar uma multiplicidade de tipos e geometrias de construções celulares, incluindo porções de cartilagem nativa, construções celulares tridimensionais com ou sem scaffolds e construções celulares em membrana bidimensional (cultura plana). A construção bidimensional pode ser realizada com a membrana na horizontal ou na vertical. 0 bioreator inclui uma câmara de cultura que pode conter, numa realização preferencial, duas construções celulares independentes que podem ser do tipo bidimensional ou tridimensional podendo, numa realização preferencial, uma delas ser sujeita a estímulo mecânico e ambas a estímulos elétricos e/ou magnéticos na fase de cultura. 0 bioreator é também constituído por um sistema duplo e independente de recirculação do meio de cultura em que este pode funcionar continuamente ou de forma interrompida a uma pressão e caudal pré estabelecidos que entregam o meio de cultura às construções celulares montadas na câmara de cultura. 0 bioreator inclui um sistema de geração de força e deslocamento axial (compressão e tração) e momento torsor e deslocamento angular que podem ser aplicados simultaneamente e na mesma face às construções celulares. 0 2 bioreator inclui um sistema de medição de força axial e binário a que a construção celular está submetida, assim como um conjunto de sensores de pressão, sensores de pH, sensores de tensão de oxigénio que comunicam com o meio cultura que atravessa as construções celulares. 0 bioreator é também constituído por um conjunto de portas que acedem ao meio de cultura que atravessa a construção celular afim que possam ser adicionados factores bioquímicos ao meio de cultura assim como permitem a recolha do meio de cultura para caracterização bioquímica do meio de cultura. 0 bioreator é também constituído por um sistema de controlo que permite a caracterização biomecânica da construção celular e dos parâmetros químicos do meio de cultura em tempo real, assim como permite uma adaptação das condições de estímulo mecânico, elétrico e magnético através de funções objetivo definidas no sistema de controlo em função das características biomecânicas e bioquímicas exibidas pela construção celular. A presente invenção é útil para uma avaliação em tempo real e comparativa das propriedades biomecânicas da construção estimulada bidimensional ou tridimensional e a do mesmo tipo não estimulada, sendo que o estímulo mecânico pode ser combinado com estímulos elétricos, magnéticos e bioquímicos (por exemplo fatores de crescimento), permitindo resultados diferenciais entre as propriedades mecânicas incluindo módulo de elasticidade à compressão, módulo de elasticidade à tração, módulo de rigidez ao corte, permeabilidade e densidade, bem como dos parâmetros químicos do meio de cultura tais como pH e tensão de oxigénio. 3 A presente invenção é útil para uma avaliação comparativa em tempo real das propriedades biomecânicas entre a construção bidimensional e tridimensional para a mesma família de células nas mesmas condições de cultura e meio ou meios de cultura diferentes sendo que o estímulo mecânico pode ser combinado com estímulos elétricos, magnéticos e bioquímicos, permitindo desta forma resultados diferenciais entre as propriedades mecânicas incluindo modulo de elasticidade à compressão, modulo de elasticidade à tração, modulo de rigidez ao corte e permeabilidade, bem como dos parâmetros químicos do meio de cultura tais como pH e tensão de oxigénio. A presente invenção é útil para o desenvolvimento de construções celulares funcionais compatíveis em termos dimensionais com a sua utilização clínica como tecido artificial.

Antecedentes da Invenção

Os tecidos humanos para os quais se deseja que a engenharia dos tecidos encontre um tecido artificial substituto têm funções mecânicas incluindo a pele, os vasos sanguíneos, o osso, os ligamentos e a cartilagem. Contudo as propriedades mecânicas dos tecidos artificiais cultivados em laboratório são inferiores às dos tecidos nativos. Estas conclusões conduzem a uma questão biomecânica chave. Qual é a relevância das propriedades mecânicas dos tecidos artificiais para o desenvolvimento das suas funções "in-vivo" e como se podem orientar essas propriedades? Para responder à questão, é necessário um conhecimento superior sobre os aspetos biomecânicos e bioquímicos dos tecidos nativos e artificiais. 4

As propriedades mecânicas de muitos destes tecidos ainda não foram precisamente definidas, e assim é pouco claro quais as propriedades que são importantes para utilizar como orientação na conceção dos tecidos artificiais. Há muito que é reconhecido que os sinais mecânicos e bioquímicos regulam o desenvolvimento dos tecidos "in-vivo", e muitos investiqadores têm vindo a trabalhar para delinear os mecanismos moleculares responsáveis pela resposta das células aos sinais mecânicos. Por exemplo, a compressão dinâmica a níveis de deformação moderada (2-10%) pode estimular a biossíntese do colagénio na cartilagem.

Estes estudos irão provavelmente definir regimes específicos de estimulação mecânica que otimizem a regulação da expressão do gene na cultura. A organização, composição, e função dos tecidos é modulada pela aplicação de regimes cíclicos de deformação permitindo igualmente um incremento da tensão limite de rutura destes tecidos artificiais, quando comparado com a cultura estática destes. Estes resultados são promissores, mas as propriedades destes tecidos artificiais continuam inferiores às dos tecidos nativos. Significativo trabalho adicional é claramente necessário para identificar os tipos de estimulação mecânica e bioquímica requerida para otimizar a formação de tecidos artificiais capazes.

Uma variedade de bioreatores para cultura na área da engenharia dos tecidos tem sido utilizada na tentativa de funcionalizar os tecidos artificiais (Donkelaar et al. Review on Patents for Mechanical Stimulation of Articular Cartilage Tissue Engineering. Recent Patents on Biomedical Engineering 2008, 1, 1-12). Estes sistemas têm em comum além da criação das condições de cultura essenciais 5 (oxigénio, pH, nutrientes, temperatura, etc) a aplicação de estimulo mecânico às células ou construção celular em cultura. As forças aplicadas às células são um pré-requisito para a produção de tecidos artificiais funcionais. Culturas celulares estáticas (sem aplicação de estímulo mecânico) demonstraram falta de resistência para a efetivação da implantação in-vivo.

Estímulo mecânico como compressão axial, compressão hidrostática, corte por perfusão e esforços de corte puro (torção) têm sido considerados importantes em engenharia de tecidos, pelo facto de reproduzirem os estímulos a que estes tecidos estarão sujeitos após implantação "in-vivo". Normalmente o estímulo mecânico é conseguido através de forças de perfusão induzidas na construção celular (bioreatores de parede rotativa) (a ver em "An OverView on Bioreactor Design, Prototyping and Process Control for Reproducible Three-Dimensional Tissue Culture", in: Drug Testing In Vitro: Breakthroughs and Trends in Cell Culture Technology, Chapter 2, Edited by Uwe Marx and Volker Sandig, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2007, ISBN: 978-3-527-31488-1), o uso de pressão hidrostática (Hansen, U., Schunke, M., Domm, C., loannidis, N. Hassenpflug, J., Gehrke, T., Short, B., Combination of reduced oxygen tension and intermittent hydrostatic pressure: a useful tool in articular cartilage tissue engineering. Journal of Biomechanics, 34 (2001) 941-949) e a aplicação directa de força na construção (compressão, alongamento, flexão, corte) (a ver em Seidel JO, Pei M, Gray ML, Langer, R., Freed, LE, Vunjak-Novakovic and, G., Long term culture of tissue engineered cartilage in a perfused chamber with mechanical stimulation Biorheology 41 (2004). 445-458). 6

Presentemente, a maioria do bioreatores com capacidade de estimulo mecânico resume-se a sistemas que permitem a aplicação isolada de um modo de estímulo mecânico sobre as culturas celulares tridimensionais. A geração simultânea dos diferentes modos de estímulo mecânico (esforços de corte puro, compressão axial, tração axial, perfusão, compressão hidrostática) neste bioreatores não é possível ou apenas parcialmente possível. Também na sua maioria não permitem aceder às diferentes propriedades mecânicas (modulo de elasticidade axial, modulo de rigidez, permeabilidade), e químicas (pH, tensão oxigénio, etc.) da construção celular em tempo real isto é sem interromper o crescimento celular, retirando a construção celular do bioreator para a sua caracterização biomecânica e bioquímica.

Grande parte destes não permite uma comparação direta e em tempo real das propriedades bioquímicas do meio de cultura das construções celulares estimuladas com as construções celulares estáticas nas mesmas condições ambientais. Esta limitação impossibilita identificar até que ponto apenas o estímulo mecânico isolado de todos os outros fatores da construção altera temporalmente as propriedades bioquímicas da construção celular. A maior parte dos sistemas de cultura de células bidimensional (em prato) é estático sem nenhum tipo de mistura do meio de cultura. Os sistemas estáticos têm limitações devido à sua natureza não homogénea. Sem mistura, gradientes de concentração, de pH, nutrientes, toxinas, gases e fatores de crescimento irão estar presentes no meio de cultura. 0 bioreator permite o fluxo do meio de cultura através da cultura celular 7 bidimensional, o que assegura uma renovação mais eficiente do meio de cultura e, consequentemente, eliminando as limitações dos sistemas estáticos.

Nos casos de bioreatores desenvolvidos especificamente para estimulo mecânico de construções bidimensionais (em prato) estes não acomodam ou são passíveis de ser utilizados com construções tridimensionais sendo o contrário também verdade. Este facto faz que não seja possível a comparação nas mesmas condições ambientais e temporais das propriedades bioquímicas para o mesmo tipo de células de uma construção tridimensional (com utilização de scaffold) estimulada com a construção bidimensional não estimulada ou o contrário.

Atualmente, os bioreatores com estímulo mecânico não permitem a avaliação em tempo real da evolução da construção celular bidimensional ou tridimensional por técnicas de imagem tais como imagem digital, raio-X, tomografia axial computorizada ou ressonância magnética. Para a realização dessa avaliação nos atuais conceitos de bioreatores é necessário proceder-se à remoção da construção do bioreator interrompendo o desenvolvimento da construção celular. A patente W02009/047045 divulga um bioreator com aptidão de geração de diferentes estímulos mecânicos tais como compressão direta, pressão hidrostática, tensão de corte por perfusão e combinação de tensão de corte por perfusão com pressão hidrostática sobre uma construção celular tridimensional. No entanto este bioreator está limitado em termos dos modos de estímulo mecânico pelo facto de não permitir realizar esforços de tração e esforço de corte puro (torção) sobre a construção celular. Também se encontra limitado pelo facto de não permitir uma caracterização em tempo real das propriedades mecânicas da construção celular sujeita ao estimulo mecânico, assim como não permite uma comparação dos efeitos do estimulo mecânico em termos de parâmetros químicos do meio de cultura com uma construção idêntica sem estímulo mecânico nas mesmas condições ambientais em tempo real. Este bioreator não permite igualmente a aplicação de estímulo a construções bidimensionais (em prato) para o mesmo tipo de células da construção tridimensional. A patente W02010/077289 divulga um bioreator com a aptidão de geração de estímulo mecânico de compressão direta e tração em 2 direções a construções tridimensionais, não permitindo a aplicação de outros estímulos mecânicos tais como corte puro, compressão hidrostática ou corte por perfusão. Este não permite uma caracterização em tempo real das características biomecânicas da construção celular e dos parâmetros químicos do meio de cultura assim como uma comparação direta com a mesma construção na condição de não estimulada. Este bioreator não permite igualmente a aplicação de estímulo a construções bidimensionais (em prato) para o mesmo tipo de células da construção tridimensional. A patente W02007/012071 divulga um bioreator com a capacidade de realização de estímulo mecânico sobre construções múltiplas tridimensionais com volumes de circulação do meio de cultura bastante pequenos. Este bioreator é capaz de aplicar estímulos mecânicos do tipo corte por perfusão, compressão hidrostática, compressão e tração axial por membrana. No entanto não permite a 9 aplicação de esforços de tração e corte puro (torção) sobre a construção tridimensional. Este permite a aplicação do estímulo mecânico a construções tridimensionais e bidimensionais apesar de a descrição da patente não mostrar como isso é possível. Este revela uma limitação em termos das dimensões das construções celulares limitando-se a ordem do milímetro não permitindo o desenvolvimento de construções funcionais em termos clínicos. Igualmente este bioreator não permite a avaliação do módulo de rigidez ao corte da estrutura em cultura assim como a sua evolução temporal. Além disso está limitado na capacidade da comparação das propriedades biomecânicas e bioguímicas entre a construção estimulada e uma construção não estimulada nas mesmas condições de meio de cultura e ambientais.

No entanto, a presente invenção apresenta um bioreator capaz de proceder à caracterização biomecânica de construções bidimensionais e tridimensionais de engenharia dos tecidos em tempo real sem intervenção na cultura, permitindo desta forma estabelecer uma correlação entre as propriedades mecânicas, incluindo o módulo de elasticidade à compressão, modulo de elasticidade à tração, módulo de rigidez ao corte, módulo à flexão e permeabilidade, os parâmetros químicos do meio de cultura, incluindo pH e tensão de oxigénio, e os diferentes regimes e modos de estímulo mecânico, incluindo compressão axial, tração axial, corte puro por torção, flexão, corte por efeito de perfusão, compressão hidrostática, estímulo elétrico e estímulo magnético a que a cultura está submetida por forma a criar um tecido artificial funcional para implantação in-vivo. 10

Descrição geral da invenção

Todos os termos técnicos e científicos utilizados nesta descrição são comummente compreensíveis por pessoas com conhecimentos na área desta invenção. Contudo, alguns dos termos usados são brevemente descritos de forma a facilitar a sua compreensão sem se pretender limitar o seu âmbito. 0 termo "bioreator" significa em sentido lato um dispositivo ou sistema capaz de suportar um ambiente biológico ativo. Este é constituído por um conjunto de dispositivos que de forma isolada ou agregada asseguram o ambiente biológico ativo. 0 termo "atuador" significa um dispositivo para movimentar ou controlar outro dispositivo capaz de gerar movimento mecânico linear e angular e também força e binário por conversão de outra fonte de energia. 0 termo "sistema de controlo" significa um dispositivo ou conjunto de dispositivos que regulam o comportamento de outros dispositivos. Pode ser um computador que automaticamente ou através de interfaces controla ou segue outros dispositivos via sinais eletrónicos. 0 termo "construção bidimensional" significa construções celulares onde as células crescem e se multiplicam sobre uma membrana (cultura plana) normalmente porosa que pode assumir qualquer orientação e/ou curvatura. 0 termo "construção tridimensional" significa em termo lato construções celulares onde as células vivem e desenvolvem a sua atividade metabólica sobre suportes tridimensionais 11 porosos designados por scaffolds podendo estes ser de diferentes materiais sintéticos ou biológicos e de diferentes dimensões, o termo também se pode aplicar a enxertos de tecidos nativos. 0 termo "câmara de cultura ou câmara de crescimento" significa o dispositivo que serve de suporte físico às construções celulares (bidimensionais ou tridimensionais), assegurando todas as condições à sobrevivência das células. 0 termo "estufa" significa o dispositivo que assegura as condições ambientais em termos de C02, temperatura e humidade ao bioreator e consequentemente à construção celular. Numa realização preferencial, o bioreator num sentido lato funciona no interior da estufa. 0 termo "enxerto" significa em termo lato um pedaço de material biológico, ou não, a ser implantado/transplantado durante um procedimento cirúrgico a um paciente. Estes podem ser entre outros do próprio paciente, designando-se por autógeno ou, sendo de outro paciente, por alógeno. 0 termo "célula de carga" em termo lato significa um dispositivo capaz de realizar a medição de força e binário em simultâneo, a que as construções celulares estão submetidas. 0 termo "meio de cultura" em termo lato significa preparações químicas que possuem na sua formulação, nutrientes necessários para que as células depositadas nas construções celulares possam sobreviver e eventualmente multiplicar-se permitindo o seu estudo e caracterização. 12

Esta invenção diz respeito a um bioreator capaz de quantificar em tempo real os parâmetros químicos do meio de cultura e as características biomecânicas das construções celulares bidimensionais e/ou tridimensionais como função do estímulo mecânico, elétrico, magnético ou bioquímico a que foram/estão submetidas durante o seu processo de crescimento, o qual é constituído por vários dispositivos entre os quais por uma câmara de cultura 3, um atuador 4, uma célula de carga 2, uma estufa 1, um sistema de recirculação de meio de cultura constituído por duas bombas 9 e 12, um dispositivo gerador de campo magnético 5 e um dispositivo gerador de sinais elétricos 6 que atuam de forma combinada com recurso a um sistema de controlo 7. A câmara de cultura 3 é caracterizada por ser uma estrutura autónoma e completamente amovível da estrutura principal do bioreator. A câmara de cultura 3 durante o processo de caracterização biomecânica das construções celulares e dos parâmetros químicos do meio de cultura fica solidária através de um sistema de bloqueio rápido 30 à estrutura principal do bioreator sendo ligado por sistema rápidos e expeditos 14 ao atuador 4 e à célula de carga 2. A câmara de cultura 3 é caracterizada por poder ser retirada da estrutura principal do bioreator e da estufa 1 onde este está inserido mantendo as construções celulares 20 e 27 no seu interior completamente isoladas do meio ambiente, bastando para isso o fecho das válvulas de entrada 28 e saída 15 e 16 do meio de cultura. A câmara de cultura 3 é caracterizada por permitir o suporte às construções celulares e pode ser configurada para suportar diferentes tipos de construções celulares 13 bidimensionais 20 e tridimensionais 27. A câmara de cultura permite que sejam suportadas, numa realização preferencial, até duas construções em duas posições independentes do mesmo tipo (bidimensional ou tridimensional) ou até duas construções de tipos diferentes simultaneamente ou seja durante o mesmo período de cultura, possibilitando assim uma avaliação comparativa das estruturas celulares. Uma destas posições permite, numa realização preferencial, que a construção celular seja sujeita a estímulo mecânico pelo atuador 4 enquanto na outra posição a construção celular não é sujeita a estímulo mecânico (estática), podendo ser ambas ou não sujeitas a estimulação elétrica e/ou magnética. Obviamente, outras disposições são possíveis nomeadamente mais que duas construções simultâneas, com parte ou totalidade das construções sujeitas a ação mecânica e/ou elétrica e/ou magnética. A câmara de cultura é caracterizada por permitir que a construção celular na posição de estímulo mecânico ou seja a que está alinhada com o eixo do atuador 4 possa ser permutada com a construção celular na posição de não estímulo mecânico (estática) e vice-versa de forma expedita apenas por translação horizontal da câmara de cultura 3 relativamente ao eixo do atuador 4 (ver Figura 2) sem colocar em causa a viabilidade celular ao longo do período de crescimento, e assim permitindo a caracterização mecânica de ambas as construções celulares. Este princípio pode-se adaptar facilmente a câmaras com mais que duas construções celulares.

Cada uma das construções 27 e 20 (estimulada mecanicamente e estática) da câmara de cultura 3 comporta garras 22 e 21 de fixação adaptáveis e amovíveis que permitem o suporte 14 das construções celulares bidimensionais ou tridimensionais em diferentes posições de acordo com o tipo de caracterização biomecânica ou bioquímica a realizar ou do tipo de estímulo mecânico a ser aplicado pelo atuador 4 à construção celular. A garra superior 22 liga-se mecanicamente à haste fixa 29 da câmara de cultura solidária com a célula de carga 2 através de um dispositivo de fixação rápida 14 e a garra inferior 21 liga-se mecanicamente à haste móvel 17 do atuador 4 através de um dispositivo de fixação rápida 14. A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por a haste móvel 17 e fixa 29 serem ocas de forma a permitirem a passagem do meio de cultura até às garras 22 e 21 de fixação da construção celular. No caso da construção celular 20 que se encontra na posição não estimulada as garras 22 superior e inferior 21 durante o período da cultura ficam solidariamente fixas à estrutura de suporte da câmara de cultura preferencialmente através de um sistema de bloqueamento radial 18. A câmara de cultura é caracterizada, numa realização preferencial, por permitir através da abertura e fecho das válvulas ligadas às hastes superiores 28 e inferiores 15 da câmara de cultura 3 que as construções celulares 27 na posição sujeita a estímulo mecânico e na posição estática 20 (não sujeita a estímulo mecânico) possam ser atravessadas de forma continua ou intermitente por o mesmo meio de cultura através do fluxo que vem do sistema de recirculação de meio constituído por duas bombas 9 e 12 ou também por comutação das válvulas 28 e 15 permite que as construções celulares 20 e 27 sejam atravessadas por meios de cultura completamente independentes, neste caso são 15 utilizadas duas bombas 9 e 12 de recirculação de meio de cultura e dois reservatórios independentes 10 e 11. A câmara de cultura é caracterizada, numa realização preferencial, por permitir através de válvulas situadas à entrada 28 das hastes superiores 29 e à saída 15 da hastes inferiores 17, estas últimas solidárias com as garras de fixação da construção celular 21 e 22, a retirada de amostras de meio de cultura antes e após a passagem pela construção celular, servindo estas amostras para caracterização bioquímica do meio de cultura. Estas mesmas válvulas 28 permitem a introdução/adição de fatores bioquímicos tais como fatores de crescimento ao meio de cultura durante o período de crescimento celular. A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por para cada posição da construção celular 20 e 27 (estimulada e estática) e de forma independente estar equipada com sensores de pressão antes 23 e depois da construção celular 19, um sensor de pH 25 e um sensor de tensão de oxigénio 24, permitindo, desta forma e através do sistema de controlo 7, a caracterização química do meio de cultura que atravessa cada construção celular em tempo real. A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por permitir com auxílio dos sistemas de recirculação do meio de cultura e respetivas bombas 9 e 12 a geração do efeito de perfusão sobre as construções celulares tridimensionais 20 e 27. As bombas 9 e 12 de recirculação do meio de cultura geram um caudal de meio de cultura a uma pressão pré estabelecida pelo sistema de controlo 7 que é conduzido até à haste 29 e garra superior 16 22, sendo esta ultima perfurada, fazendo com que o meio de cultura atravesse a construção celular tridimensional 27 até a garra inferior 21 perfurada que permite a saida do meio de cultura em direção ao reservatório 10 e/ou 11. Este efeito de perfusão do meio de cultura sobre a construção celular tridimensional 27 gera esforços de corte por perfusão quer na construção na posição de estimulo mecânico quer na posição estática, podendo ser o mesmo meio de cultura a atravessar as duas construções estimulada e estática ou meios de cultura totalmente independentes, dependendo simplesmente dos estado das válvulas 28 e 15. A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por limitar os volumes de meio de cultura em torno das construções celulares estimulada mecanicamente 27 e estática 20 a alguns centímetros cúbicos. A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por a sua estrutura que serve de suporte às construções celulares, estimulada mecanicamente e estática, servir de fixação ao dispositivo 5 que gera os campos magnéticos a que as construções celulares são submetidas sendo este controlado pelo sistema de controlo 7. O gerador de campos magnéticos é fixo à estrutura da câmara de cultura de uma forma rápida e sem intervir na cultura. A câmara de cultura é caracterizada, numa realização preferencial, por as hastes superiores 29 e inferiores 17 (da posição estimulada mecanicamente e estática) onde as garras de suporte das construções celulares 22 e 21 se fixam estarem ligadas eletricamente a um gerador de estímulo elétrico 6 sendo este por sua vez controlado através do sistema de controlo 7. 17 A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por possibilitar utilizar diferentes configurações geométricas das garras 22 e 21 de suporte das construções celulares. (i) As garras 38 e 39 podem, numa realização preferencial, ser configuradas de forma a suportar culturas bidimensionais em que a membrana da construção celular está na horizontal (ver figura 6) sendo neste caso o estimulo mecânico aplicado pela haste 17 inferior, através de uma garra especifica 39, à zona central da membrana sendo que a periferia da membrana, que pode ter diferentes geometrias, está solidária com a haste superior 29. Em função do deslocamento axial imposto à membrana pela haste inferior 17 solidária com o atuador 4 e em função da posição na membrana a construção celular 20 irá estar submetida a um estado específico de deformação. (ii) As garras 40 e 41 podem, numa realização preferencial, ser configuradas por forma a suportar culturas bidimensionais 20 em que a membrana da construção celular está na vertical (ver Figura 7) sendo neste caso o estímulo mecânico aplicado pela haste inferior 17 ao bordo inferior da membrana, sendo que o bordo superior da membrana está solidário com a haste superior 29. Em função do deslocamento axial e angular imposto à membrana pela haste inferior 17 solidária com o atuador 4 e em função da posição na membrana a construção celular irá estar submetida um estado específico de deformação. (iii) As garras 34 e 35 podem, numa realização preferencial, ser configuradas de forma a suportar culturas tridimensionais 27 em que a construção celular fica 18 posicionada e fixa pela sua face superior e inferior entre a garra superior 34 (fixa) e a garra inferior 35 (móvel) (ver Figura 4). Em função do deslocamento axial e/ou angular imposto pela haste inferior 17 solidária com o atuador 4 e em função da posição na construção celular esta irá estar submetida a um estado especifico de deformação. Nesta situação, a haste móvel 17 pode submeter de forma simultânea, ou não, a construção celular tridimensional 27 a compressão axial, tração axial e corte puro por torção gerando diferentes estados de deformação em função da localização na construção celular. (iv) As garras 32 e 33 podem, numa realização preferencial, ser configuradas de forma a suportar culturas tridimensionais 27 em que a construção celular está posicionada e fixa pelas faces verticais da construção celular estando uma das faces ligada à garra 32 solidária à haste superior 29 (fixa) e a face oposta ligada à garra 33 solidária à haste inferior 17 (móvel) (ver Figura 3) . Em função do deslocamento imposto pela haste inferior 17 solidária com o atuador 4 e em função da posição na construção celular esta irá estar submetida um estado especifico de deformação. Nesta configuração a haste móvel pode submeter a construção celular tridimensional a esforços de corte tangencial. (v) As garras 36 e 37 podem, numa realização preferencial, ser configuradas de forma a suportar culturas tridimensionais 27 em que a construção celular está apoiada junto às suas extremidades pela garra 36 solidária à haste fixa 29 sendo aplicado um deslocamento axial pela garra 37 solidária à haste móvel 17 posicionada a meio da distância entre os apoios da garra 36 fixa (ver Figura 5) . Esta 19 configuração é representativa do ensaio à flexão em 3 pontos. (vi) As garras podem, noutras várias realizações preferenciais, ser configuradas além dos moldes descritos anteriormente sendo que em sentido lato, da combinação da geometrias e orientações das garras de suporte da construção celular relativamente aos movimentos de translação linear e rotação da haste 17 inferior móvel da câmara de cultura 3 é possivel gerar todos os tipos de estados de deformação e tensão nas construções celulares. A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por ser construída essencialmente com materiais não metálicos que não reagem com a utilização de técnicas de imagem incluindo o raio-X, micro tomografia axial computorizada e ressonância magnética permitindo uma avaliação das construções celulares 20 e 27 sem interromper o seu crescimento. Para esta avaliação com estas técnicas é possível estes sistemas de imagem serem montados sobre a câmara de cultura ou então a câmara de cultura 3 pode ser retirada da estrutura principal do bioreator 26, mantendo o total isolamento das construções celulares do meio ambiente externo à estufa 1, sendo transportada ao sistema de imagem onde serão realizadas as analises de imagem, voltando novamente à estrutura principal do bioreator para a continuação do processo de caracterização biomecânica e bioquímica da construção celular sem interromper o seu desenvolvimento. A câmara de cultura 3 é caracterizada, numa realização preferencial, por ser construída com materiais essencialmente transparentes que permitem a visualização 20 integral das construções celulares bidimensionais 20 e tridimensionais 27. A câmara de cultura é caracterizada, numa realização preferencial, por permitir o desenvolvimento de construções celulares tridimensionais 27 compatíveis dimensionalmente com a sua utilização como enxerto a implantar em pacientes. Numa realização preferencial, as dimensões máximas das construções celulares tridimensionais 27 serão em todas as direções de 15mm. O atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por se encontrar solidário à estrutura principal 26 do bioreator sendo a sua conexão/desconexão à câmara de cultura realizada através de um sistema rápido 14 que une o veio do atuador 13 à haste inferior da câmara de cultura 17 . 0 atuador é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através de um único veio 13 a aplicação de deslocamentos lineares e angulares controláveis a partir do sistema de controlo 7 a um dos lados da construção celular 27, podendo estes deslocamentos ser controlados em termos de amplitudes, frequência e duração pelo sistema de controlo 7 . O atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através de um único veio a medição de deslocamentos lineares e angulares a que a construção celular 27 está submetida podendo esta medição ser registada no sistema de controlo 7. 21 0 atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através de um único veio a aplicação de força axial e binário, de forma independente ou em simultâneo, controláveis a partir do sistema de controlo 7 a um dos lados da construção celular 27. 0 atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através de um único veio a medição da força axial e binário a que a construção celular está submetida podendo esta medição ser registada no sistema de controlo 7. 0 atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir a aplicação de deslocamentos lineares e angulares de forma continua ou intermitente numa gama de frequências que vão dos 0,1Hz a 10Hz, sendo os períodos de funcionamento controláveis a partir do sistema de controlo 7 . 0 atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir a aplicação de forças axiais e binários de forma contínua ou intermitente numa gama de frequências que vão dos 0,1Hz a 10Hz sendo os períodos de funcionamento controláveis a partir do sistema de controlo 7. O atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por estar equipado de um sistema de refrigeração 31 que pode funcionar com ar ou com água que o mantém à temperatura ideal de funcionamento ao longo do período de crescimento da construção celular 27. O atuador 4 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir a receção de informação sobre posicionamento 22 linear e angular assim como de força axial e binário a aplicar à construção celular do sistema de controlo, enviando informação de posicionamento axial e angular assim como de força axial e binário a que a construção celular está submetida e que será registada e tratada no sistema de controlo 7 . A célula de carga 2 é caracterizada, numa realização preferencial, por se encontrar solidária à estrutura principal 26 do bioreator sendo a sua conexão/desconexão à câmara de cultura 3 realizada através de um sistema rápido 14 que une o veio da célula de carga 2 à haste superior 29 da câmara de cultura. A célula de carga 2 é caracterizada, numa realização preferencial, por permitir através de um único interface a medição das três componentes de força e das três componentes de binário a que a construção celular está submetida através da haste superior 29 da câmara de cultura 3. Estas medições são realizadas e enviadas em tempo real ao sistema de controlo 7 que faz o seu registo e tratamento. 0 sistema de recirculação 9,10,11,12,15 e 28 do meio de cultura é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir a alimentação das construções celulares por o meio de cultura através da haste superior 29 e inferior 17 da câmara de cultura associados a um conjunto de tubos e válvulas 28 e 15. Este sistema permite que as construções celulares sejam alimentadas com os nutrientes necessários ao seu crescimento e também fazer as trocas gasosas e de resíduos com o meio. 23 0 sistema de recirculação 9,10,11,12,15 do meio é caracterizado, numa realização preferencial, por através da manipulação das válvulas 28 à entrada das hastes superiores 29 e saída das hastes inferiores 17 que as construções celulares na posição de estímulo mecânico ou posição estática possam ser alimentadas pelo mesmo meio de cultura ou então alimentadas por meios de cultura independentes sendo neste caso necessário utilizar as duas bombas de recirculação 9 e 12 e os dois reservatórios do meio de cultura 10 e 11. O sistema de recirculação 9,10,11,12,15 do meio de cultura é caracterizado, numa realização preferencial, por poder alimentar as construções celulares de forma continua ou intermitente a diferentes caudais e diferentes pressões através das bombas 9 e 12 de recirculação controladas por o sistema de controlo 7. O sistema de recirculação 9,10,11,12,15 do meio de cultura é caracterizado, numa realização preferencial, por conter um conjunto de múltiplas aberturas e saídas que associados as válvulas antes 28 e após 15 à construção celular é possível por um lado a retirada de amostras de meio de cultura para caracterização bioquímica antes e após a sua passagem pela construção celular, estas podem ser retiradas simultaneamente e também as mesmas portas e válvulas 15 e 28 permitem a adição de fatores bioquímicos ao meio de cultura antes e após a sua passagem pela construção celular. O sistema de recirculação 9,10,11,12,15 do meio de cultura é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir gerar um efeito de perfusão nas construções celulares 24 tridimensionais 27, estando este efeito dependente do caudal de recirculação e da pressão do meio de cultura da câmara de cultura. 0 sistema de recirculação 9,10,11,12,15 do meio de cultura é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir gerar um efeito de pressão hidrostática nas construções celulares tridimensionais 27 e bidimensionais 20, estando este efeito apenas dependente da pressão exercida pelas bombas de recirculação 9 e 12 para um caudal de meio de cultura mínimo ou mesmo nulo. Esta pressão hidrostática é dirigida através do sistema de controlo 7. O sistema de recirculação 9,10,11,12,15 do meio de cultura é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir uma alimentação das construções celulares sem recurso às bombas de recirculação 9 e 12, replicando o processo de substituição manual de meio de cultura em culturas celulares em disco convencional. Neste caso as válvulas 15 situadas nas hastes inferiores 17 da câmara de cultura 3 permitem a retirada do meio de cultura da construção celular de uma forma manual, simultaneamente as aberturas e válvulas 28 situadas nas hastes superiores 29da câmara de cultura 3 permitem o enchimento do novo meio de cultura na construção celular bidimensional 20 ou tridimensional 27. Este processo permite trabalhar com volumes muito pequenos de meio de cultura podendo-se melhorar a caracterização bioquímica e tornando o processo menos dispendioso. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir uma troca de sinais eletrónicos e informação digital e analógica entre a unidade central composta por um computador 8 e o atuador 4, a célula de 25 carga 2, as bombas 9 e 12 do sistema de recirculação de meio de cultura, os sensores de pressão 19 e 23, os sensores de pH 25, os sensores de tensão de oxigénio 24, a unidade de geração de campo magnético 5, a unidade de geração de estímulo elétrico 6 e a estufa de cultural. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o comando do atuador 4 em termos das amplitudes e frequência dos deslocamentos lineares e angulares impostos à construção celular, assim como dos períodos de aplicação e repouso destes deslocamentos. A posição linear e angular do atuador é determinada pelo sistema de medição do próprio atuador 4 sendo esta informação registada e tratada pelo sistema de controlo. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o comando do atuador 4 em termos das amplitudes e frequência da força axial e binário aplicados à construção celular assim como dos períodos de aplicação e repouso destes cargas durante o período de crescimento celular. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o registo e tratamento de informação da posição linear e angular do atuador, que são determinadas pelo sistema de medição do próprio atuador 4. 0 atuador íntegra também um sistema de medição da força axial e binário aplicados à construção celular sendo esta informação registada e tratada pelos sistema de controlo 7. 26 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o registo e tratamento da informação das três componentes de força e três componentes de binários medidos pela célula de carga 2 solidária à haste superior 29 da câmara de cultura 3 durante a aplicação de um deslocamento linear ou angular à construção celular através da haste inferior 17 da câmara de cultura 3 solidária com o veio do atuador 13. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o registo e tratamento da informação das pressões do meio de cultura antes e após a construção celular, níveis de pH e tensão de oxigénio medidas nos sensores 19, 23, 24 e 25 instalados na câmara de cultura na posição da construção celular estimulada 27 e estática 20. O sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o registo e tratamento da informação dos níveis de C02 e humidade medidos pelos sensores na estufa 1 onde se encontra o bioreator. O sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o registo e tratamento da informação do caudal do meio de cultura que atravessa a construção celular e respetiva pressão medida com os sensores instalados nas bombas de recirculação 9 e 12. O sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do software e em tempo real a quantificação de uma mais das características 27 biomecânicas das construções celulares, utilizando os valores das forças axiais e/ou binários medidos pela célula de carga 2 ou pelo próprio atuador 4 aplicadas sobre a construção celular assim como dos deslocamentos lineares e angulares a que estas estão submetidas medidos pelo atuador 4 : (i) Módulo de elasticidade à compressão, da relação entre o deslocamento linear de encurtamento imposto pelo atuador 4 à construção celular e a força axial medida na célula de carga 2 ou no próprio atuador 4. (ii) Módulo de elasticidade à tração, da relação entre o deslocamento axial de alongamento imposto pelo atuador à construção celular 4 e a força axial medida na célula de carga 2 ou no próprio atuador 4. (iii) Módulo de rigidez ao corte (em torção), da relação entre o deslocamento angular imposto à construção celular pelo atuador 4 e o binário medido na célula de carga 2 ou no próprio atuador 4. (iv) Módulo de rigidez ao corte (por forças tangenciais) da relação entre a força axial aplicada por o atuador 4 à face vertical da construção celular 27 medido na célula de carga 2 ou no próprio atuador 4 e o deslocamento linear imposto a essa face pelo atuador 4. (v) Módulo à flexão em 3 pontos, da relação entre a força axial medida na célula de carga 2 ou pelo atuador 4 e o deslocamento axial medido no atuador 4. 28 (vi) Permeabilidade da construção celular, da relação entre a pressão do meio de cultura medida no sensor de pressão 23 antes da construção celular, da pressão do meio de cultura medida no sensor 19 após a construção celular e do caudal medido na bomba 9 e/ou 12 de recirculação do meio de cultura. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do software e em tempo real a quantificação das caracteristicas químicas do meio de cultura próximo da construção celular tais como o nivel de pH através do sensor 25, a tensão de oxigénio através do sensor 19 e outras através de sensores apropriados que podem ser adicionados à câmara de cultura 3. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o comando do gerador de campo magnético 5 em termos de intensidade de fluxo, frequência e duração deste. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do seu software o comando do gerador de campo elétrico 6 em termos de intensidade, tensão, frequência e duração. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através do computador 8 e software especifico a afixação de tabelas e gráficos onde se podem relacionar em tempo real as diferentes variáveis medidas em termos de caracteristicas biomecânicas versus caracteristicas químicas do meio de cultura e versus estímulo mecânico, elétrico e/ou magnético. 29 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir através da sua parametrização a programação de ensaios onde são definidos o tipo de solicitações em deslocamento linear/angular ou força/binário a aplicar à construção celular em termos de amplitude e frequência assim como os períodos de estimulação e os períodos de repouso, além dos caudais e pressão do meio de cultura. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir a programação de um conjunto de alertas visuais e sonoros em função de valores pré estabelecidos para as diferentes variáveis registadas pelo sistema de controlo. 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir alterar de forma autónoma os regimes de estimulação mecânica, elétrica e/ou magnética através de uma ou mais funções objetivo definidas no computador 8 e respetivo software específico. Estas funções objetivo podem ser definidas em função das variáveis registadas pelo sistema de controlo tais como pressão, pH, tensão de oxigénio, deslocamento linear, deslocamento angular, força axial, binário, caudal do meio de cultura, temperatura ou através das características biomecânicas computadas em função dos parâmetros de deslocamento e força/binário registados no sistema de controlo 7 tais como módulo de elasticidade à compressão, módulo de elasticidade à tração, módulo de rigidez ao corte por torção, módulo de rigidez ao corte por força tangencial, módulo à flexão e permeabilidade. 30 0 sistema de controlo 7 é caracterizado, numa realização preferencial, por permitir a visualização da evolução da construção celular em tempo real no ecrã do computador do sistema de controlo através de uma ou mais câmaras de alta resolução montadas sobre a câmara de cultura e ligadas aos sistemas de controlo.

Descrição das Figuras

Para uma mais fácil compreensão da invenção juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais do invento que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente invenção.

Figura 1: Representação esquemática do sistema que constitui o bioreator de acordo com a presente invenção

Figura 2: Representação esquemática do deslocamento horizontal da câmara de cultura relativamente ao eixo do atuador de modo a que as duas construções celulares no seu interior possam ser caracterizadas em termos biomecânicos.

Figura 3: Representação esquemática da configuração das garras para a geração de esforços de corte tangenciais na construção celular tridimensional por deslocamento linear do atuador.

Figura 4: Representação esquemática da configuração das garras para a geração de esforços de tração e/ou compressão e/ou corte por torção na construção celular tridimensional por deslocamento linear e/ou angular do atuador. 31

Figura 5: Representação esquemática da configuração das garras para a geração de esforços de flexão na construção celular tridimensional por deslocamento linear do atuador.

Figura 6: Representação esquemática da configuração das garras para a geração de esforços na construção celular bidimensional com membrana porosa na horizontal por deslocamento linear do atuador.

Figura 7: Representação esquemática da configuração das garras para a geração de esforços na construção celular bidimensional com membrana porosa na vertical por deslocamento linear do atuador.

Descrição detalhada da invenção

Numa realização preferencial, a presente invenção (o bioreator) pode ser utilizada na aplicação de estimulo mecânico, elétrico e/ou magnético a amostras biológicas tais como construções celulares tridimensionais com scaffolds, enxertos de tecido nativos e construções celulares bidimensionais, todos estes desenvolvidos para reparação de tecidos e/ou investigação das suas propriedades, podendo ser comparados os seus efeitos na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para o crescimento de construções celulares autógenas ou alógenas tridimensionais com scaffolds, e construções celulares bidimensionais. 32

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para investigação de questões fundamentais em termos comparativos ou absolutos tais como o efeito do estimulo mecânico e/ou elétrico e/ou magnético durante a fase de desenvolvimento da construção celular na diferenciação celular, na taxa de deposição da matriz extracelular, assim como nas interações célula-matriz, podendo ser comparado o efeito na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para investigação de questões fundamentais em termos comparativos ou absolutos tais como o efeito do estimulo mecânico e/ou elétrico e/ou magnético durante a fase de desenvolvimento da construção celular nas caracteristicas biomecânicas da própria construção celular em crescimento tais como o módulo de elasticidade à tração e/ou compressão, o módulo de rigidez ao corte, módulo à flexão e a permeabilidade de forma a aproximar estas propriedades das dos tecidos nativos os quais se pretendem substituir/reparar, podendo ser comparado o seu efeito na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para investigação de questões fundamentais em termos comparativos ou absolutos tais como o efeito do estimulo mecânico e/ou elétrico e/ou magnético durante a fase de desenvolvimento da construção celular na composição bioquímica da própria construção celular de forma a aproximar estas propriedades das dos tecidos nativos que se pretendem substituir/reparar, podendo ser comparado o seu 33 efeito na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para investigação de questões fundamentais em termos comparativos ou absolutos tais como o efeito do estímulo mecânico e/ou elétrico e/ou magnético durante a fase de desenvolvimento da construção celular na características químicas do meio da cultura tais como a tensão de oxigénio, o nível de pH, o teor de glicosaminoglicanos (no caso de tecido de cartilagem) entre outros, podendo ser comparado o seu efeito na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para investigação de questões fundamentais em termos comparativos ou absolutos tais como o efeito do estímulo mecânico e/ou elétrico e/ou magnético durante a fase de desenvolvimento da construção celular na distribuição espacial da matriz extracelular entre outros, podendo ser comparado o seu efeito na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para a produção industrial de construções celulares tridimensionais com base em scaffolds ou em culturas bidimensionais para rediferenciação de células previamente expandidas in-vitro para substituição ou reparação de tecidos em pacientes. 34 ser

Numa realização preferencial, o bioreator pode utilizado para investigação de questões fundamentais em termos comparativos ou absolutos tais como o efeito do estimulo mecânico e/ou elétrico e/ou magnético na degeneração dos tecidos nativos ou na contribuição destes para a progressão de determinadas patologias, podendo ser comparado o seu efeito na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

Numa realização preferencial, o bioreator pode ser utilizado para investigação de questões fundamentais em termos comparativos ou absolutos tais como o efeito de fármacos no crescimento das construções celulares ou o seu efeito sobre as propriedades biomecânicas e bioquímicas dos tecidos em desenvolvimento, podendo ser comparado o seu efeito na construção celular na posição estimulada mecanicamente com a construção celular na posição estática.

As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais da presente invenção.

Lisboa, 30 de Junho de 2014 35

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um bioreator para engenharia de tecidos caracterizado por compreender: uma estrutura principal (26); uma câmara de cultura (3) estanque e amovível que compreende duas garras (21, 22) para fixação de pelo menos uma construção celular (27), sendo as referidas garras acopladas no exterior da referida câmara de cultura (3) através de acoplamentos desacopláveis (14) a uma célula de carga (2) e a um atuador (4) linear e angular, sendo estes por sua vez acoplados à estrutura principal (26) do bioreator; um sistema de controlo ligado ao referido atuador (4) e célula de carga (2). 2. 0 bioreator de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por: a câmara de cultura (3) estar configurada para alojar duas construções celulares (20, 27); o atuador (4) para aplicação de deslocamentos e cargas estar acoplado direta ou indiretamente a uma ou ambas as construções celulares (20, 27) ; a célula de carga (2) estar acoplada para medição das cargas sobre uma ou ambas construções celulares; e por compreender uma estufa (1) de cultura que alberga o bioreator, um sistema de recirculação de meio de cultura, um sistema gerador de estimulo elétrico (6), um sistema gerador de estimulo magnético (5), um sistema de captura de imagem, uma estrutura principal de suporte (26) e um sistema de controlo (7) configurado para controlar e registar os diferentes parâmetros do bioreator quantificando as propriedades biomecânicas e das construções celulares e os parâmetros químicos do meio de cultura em tempo real de uma forma comparativa e não 1 invasiva como função do estimulo mecânico e/ou elétrico e/ou magnético aplicado às construções celulares. 3. 0 bioreator de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por a sua câmara de cultura (3) alojar duas construções celulares (20, 27) em posições distintas sendo uma das posições sujeita a estímulo mecânico através de uma haste (17) ligada ao atuador e a sendo a outra posição estática sem estimulo mecânico, sendo que as duas construções celulares (20, 27) podem ser comutadas da posição de estimulo mecânico para a posição estática por um deslizamento perpendicular da câmara de cultura (3) relativamente ao eixo de movimentação do atuador, permitindo assim a possibilidade de caracterização mecânica de ambas as construções celulares.
2. 4. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por as garras (21, 22) para fixação da câmara de cultura (3) serem garras (21, 22) especificas para tipos de construções celulares tridimensionais, como scaffolds ou enxertos, e/ou bidimensionais em membrana porosa horizontal ou vertical, possibilitando uma análise comparativa do mesmo tipo de construção celular com e sem estimulo mecânico, ou entre tipos de construções celulares.
3. 5. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a sua câmara de cultura (3) ser uma estrutura autónoma e amovível do bioreator e da estufa do bioreator, isolante das construções celulares no seu interior relativamente ao meio ambiente exterior, compreendendo 2 adicionalmente válvulas de fecho de entrada (28) e saldas (15, 16) do meio de cultura, sendo a câmara de cultura (3) fixa à estrutura principal (26) do bioreator, à célula de carga (2) e ao atuador (4) através de mecanismos de aperto rápidos. 6. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a sua câmara de cultura (3) estar configurada para submeter as construções celulares em ambas as posições, à mesma intensidade de estimulo elétrico e/ou magnético; compreendendo ligação elétrica às construções celulares (20, 27) através das suas hastes (29, 17) e garras (21, 22), que funcionam como elétrodos; e sendo o sistema de estimulo magnético (5) fixo sobre a câmara de cultura (3) a igual distância das duas posições das construções celulares.
4. 7. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a sua câmara de cultura (3) ser realizada com materiais não metálicos e transparentes para visualização das construções celulares (20, 27) por sistemas de captação de imagem colocados fora do bioreator ou estufa (1), incluindo o raio-X, micro tomografia axial computorizada, ressonância magnética.
5. 8. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por compreender uma fixação rotativa radial das hastes para posicionamento das construções celulares, tridimensionais ou bidimensionais, para serem montadas 3 na câmara de cultura (3) fora do bioreator ou estufa (D · 9. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por compreender um único atuador (4) para a aplicação e medição de deslocamentos axiais e angulares, força axial de tração/compressão e binário em continuo ou intermitente a uma só face da construção celular, na posição de estimulo mecânico na câmara de cultura (3).
6. 10. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o atuador (4) compreender um circuito de refrigeração a água para manter a temperatura de funcionamento. 11. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por compreender uma única célula de carga (2) para a medição das três componentes de força e das três componentes de binário a que a construção celular está submetida através da haste (29) e garra (22) da câmara de cultura (3) em contacto com uma das faces da construção celular na posição de estimulo mecânico. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a geometria especifica das garras (21, 22) de fixação das construções celulares (20, 27) serem combinadas com o tipo de deslocamento do atuador, para a geração de esforços de compressão/tração, torção e flexão sobre as construções celulares na posição de estimulo mecânico na câmara de cultura (3). 4 13. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por compreender sistema de recirculação do meio de cultura, através de válvulas à entrada (28) das hastes ocas superiores (22) e saída (15) das hastes ocas inferiores (21) da câmara de cultura (3), para que as construções celulares (27) na posição de estimulo mecânico ou na posição estática (20) possam ser atravessadas pelo mesmo meio de cultura ou por meios de cultura independentes, sendo no caso de meios de cultura independentes o bioreator compreende ainda duas bombas de recirculação (9, 12) e dois reservatórios (10, 11) do meio de cultura, podendo neste caso gerar efeitos de perfusão e compressão hidrostática diferenciados entre as construções celulares na posição de estimulo mecânico e estática.
7. 14. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por compreender válvulas (28, 15) instaladas na hastes superiores e inferiores da câmara de cultura (3) para a retirada de amostras ou adição de fatores bioquímicos ao meio de cultura antes e após a passagem do meio de cultura pela construção celular.
8. 15. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por compreender na sua câmara de cultura (3) possuir sensores de pressão à entrada e saída da construção celular, um sensor de pH e um sensor de tensão de oxigénio contíguos a cada posição da construção celular na câmara de cultura (3), permitindo desta forma e através do sistema de controlo a caracterização química 5 comparativa do meio de cultura e avaliação comparativa da permeabilidade das construções celulares. 16. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o seu sistema de controlo estar configurado para o comando e registo através de ligações digitais e analógicas entre o sistema de controlo e o atuador, a célula de carga (2) , o sistema de recirculação de meio de cultura, os sensores de pressão, os sensores de pH, os sensores de tensão de oxigénio, a unidade de geração de campo magnético (5) , a unidade de geração de estimulo elétrico, o sistema de captura de imagem e a estufa. 17. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o seu sistema de controlo (7) estar configurado para registar em tempo real a quantificação das caracteristicas biomecânicas das construções celulares (20, 27) na posição de estímulo mecânico em função do tempo, tais como o módulo de elasticidade à compressão e/ou o módulo de elasticidade à tração e/ou módulo de rigidez ao corte e/ou módulo de flexão, através das forças axiais e/ou binário medidos pela célula de carga (2) ou pelo próprio atuador (4) assim como dos deslocamentos axiais e angulares medidos pelo atuador.
9. 18. O bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o sistema de controlo (7) estar configurado para registar em tempo real a quantificação das caracteristicas químicas do meio de cultura da construção celular tais como o 6 nível de pH, a tensão de oxigénio e da permeabilidade da construção celular. 19. 0 bioreator de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores e 18 caracterizado por o sistema de controlo (7) estar configurado para definir os regimes de estimulação mecânica, elétrica e/ou magnética através de uma ou mais funções objetivo definidas em função das diferentes variáveis registadas pelo sistema de controlo incluindo pressão, deslocamento axial, deslocamento angular, força axial, binário, caudal do meio de cultura, e/ou através das características biomecânicas da construção celular, incluindo módulo de elasticidade à compressão/tração, módulo de rigidez ao corte, módulo à flexão e permeabilidade - e/ou químicas - pH, tensão de oxigénio. Lisboa, 30 de Junho de 2014 7