PT103450A - Vacina contra streptococcus agalactiae usando como antigénio alvo a proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapdh) produzida pela bactéria, na sua forma nativa ou recombinante - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO A UMA VACINA CONTRA A INFECÇÃO POR STREPTOCOCCUS AGALACTIAE (CAUSADOR DE MENINGITE EM RECÉM-NASCIDOS) E QUE É CONSTITUÍDA PELA PROTEÍNA GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE (GAPDH), OBTIDA A PARTIR DE SOBRENADANTES DE CULTURAS DA BACTÉRIA, OU PELA PROTEÍNA GAPDH RECOMBINANTE (RGAPDH), OBTIDA ATRAVÉS DA CLONAGEM E SEQUENCIAÇÃO DO GENE QUE CODIFICA APROTEÍNA GAPDH DE S. AGALACTIAE EXPRESSA NUM SISTEMA HETERÓLOGO. A VACINA ADMINISTRADA, CONTENDO DOSES SUBMITOGÉNICAS DE GAPDH OU RGAPDH, TORNA O HOSPEDEIRO CAPAZ DE DESENVOLVER URNA RESPOSTA IMUNE EFICAZ CONTRA A BACTÉRIA S. AGALACTIAE. A VACINA É UTILIZADA DE FORMA PREVENTIVA E ASUA APLICAÇÃO É FEITA POR VIA SÍSTÉMICA E/OU INTRADÉRMÍCA E/OU SUB-CUTÂNEA E/OU ATRAVÉS DE MUCOSAS. ASSIM SENDO, O CAMPO DO INVENTO INSERE-SE NA ÁREA DA INDÚSTRIA FARMACÊUTICA.

Description

DESCRIÇÃO

"VACINA CONTRA Streptococcus agalactiae USANDO COMO ANTIGÉNIO ALVO A PROTEÍNA GLICERALDEÍDO-3-FOSFATO DESIDROGENASE (GAPDH) PRODUZIDA PELA BACTÉRIA, NA SUA FORMA NATIVA OU RECOMBINANTE"

ams DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a uma vacina contra a infecção por Streptococcus agalactiae (causador de meningite em recém-nascidos) e que é constituída pela proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), obtida a partir de sobrenadantes de culturas da bactéria, ou pela proteína GAPDH recombinante (rGHPDH), obtida através da clonagem e sequenciação do gene que codifica a proteína GAPDH de S. agalactiae expressa num sistema heterólogo. A vacina administrada, contendo doses submitogénicas de GAPDH ou rGAPDH, torna o hospedeiro capaz de desenvolver uma resposta imune eficaz contra a bactéria S. agalactiae. A vacina é utilizada de forma preventiva e a sua aplicação é feita por via sistémica e/ou intra-dérmica e/ou sub-cutânea e/ou através de mucosas. Assim sendo, o campo do invento insere-se na área da indústria farmacêutica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A caracterização bioquímica da proteína Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da bactéria Streptococcus agalactiae já foi descrita (1) sendo referida a sua localização na superfície da bactéria e a sua actividade enzimática. Não se encontram descritos efeitos imunobiológicos desta proteína no hospedeiro assim como não existe qualquer referência acerca da possibilidade do seu uso como antigénio-alvo em vacinas contra este microrganismo.

As vacinas existentes contra a bactéria S. agalactiae são construídas usando polissacáridos capsulares (revisto em 2 e 3) conjugados com o toxóide do tétano (4), ou com a região N-terminal do antigénio épsilon ou com fragmentos alfa ou beta da proteína C (5, 6) . Contudo, estas vacinas são específicas para um determinado serotipo conferindo por isso imunidade só para esse serotipo. É sabido gue cinco serotipos de S. agalactiae podem causar meningite em recém nascidos. Assim, uma vacina capaz de induzir protecção contra estes cinco serotipos seria desejável. A proteína GAPDH sendo uma proteína ubígua estará presente em todos os serotipos.

Assim, ainda não existe uma vacina capaz de conferir protecção contra os diferentes serotipos de S. agalactiae. A proteína do presente invento, a GAPDH, permitirá ultrapassar este problema. A infecção por Streptococcus agalactiae, ou streptococcus do grupo B (GBS) segundo Lancefield, é a principal causa de meningite em recém-nascidos, sendo nestes também causa de pneumonias e septicemias. Apesar da possibilidade de ser feito o tratamento desta infecção com antibióticos, a taxa de mortalidade é mesmo assim bastante elevada e cerca de 25 a 50% dos recém-nascidos gue conseguem recuperar da meningite sofrem sequelas neurológicas permanentes (como atrasos cognitivos, cegueira ou surdez). GBS é também causa freguente de infecções em mulheres grávidas, idosas e adultos imunocomprometidos.

Apesar da taxa de infecção por S. agalactiae ter diminuído com o uso de antibióticos, o aumento da resistência a estes fármacos bem como o seu questionável uso em grávidas faz com que o desenvolvimento de uma vacina, terapêutica ou preventiva, contra GBS possa ser uma solução alternativa para combater esta infecção.

Em anteriores trabalhos, os presentes inventores demonstraram que vários microrganismos patogénicos libertam proteínas imunomoduladoras associadas a virulência (6-9). Em murganhos, a imuno-neutralização destas proteínas protegeu preventivamente o hospedeiro de infecções sistémicas causadas pelo fungo Candida albicans ou pela bactéria Streptococcus mutans (10,11). A vacinação preventiva contra a candidíase sistémica foi ainda conseguida, pela primeira vez, em primatas (marmosetes) através de imunização contra uma proteína imunomoduladora produzida pelo fungo (D. Tavares, resultados não publiqadbs-) * No mesmo âmbito, foi descrito que uma racemase excretada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (12), protege preventivamente o hospedeiro da infecção sistémica por este parasita (pedido de patente PCT/IB00/02008, do Institut Pasteur, e outros, apresentado em 4 de Dezembro de 2000). Mais recentemente, foi descrita uma vacina contra a cárie dentária constituída por proteínas extracelulares das bactérias cariogénicas Streptococcus sobrinus e S. mutans (Patente Portuguesa n°102907). A bactéria S. agalactiae excreta para o meio de cultura a proteína GAPDH, apresenta características imunobiológicas semelhantes a outras proteínas produzidas 1 Em estudos efectuados no Centro de Investigação em Primatas, em Rijswijk na Holanda por outros microrganismos (6-9) . Estas proteínas têm em comum as seguintes características: I) são mitogénicas, induzindo no hospedeiro uma activação linfocitária policlonal; II) quando injectadas por via intra-peritoneal, induzem no hospedeiro um rápido aumento da concentração no soro de IL-10, uma citocina anti-inflamatória; III) estão associadas com a virulência dos microrganismos que as produzem uma vez que existe uma relação directa entre a sua produção e a patogenicidade do microrganismo; IV) são importantes para a sobrevivência do microrganismo no hospedeiro, uma vez que o tratamento do hospedeiro com estas proteínas antes da infecção com o microrganismo que as produz, induz um aumento da carga parasitária no hospedeiro.

Assim, a produção destas proteínas imunomoduladoras parece constituir um mecanismo de evasão imune utilizado por vários patogénios. Ensaios de vacinação usando a GAPDH recombínante como antigénio alvo mostraram um aumento da resistência contra S. agalactiae em ratinhos BALB/c, após a imunização por via intraperitoneal como se pode observar na Figura 1.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO O presente invento tem como objecto uma vacina, contra a infecção pela bactéria S. agalactiae, um importante agente de meningite neonatal, constituída por uma proteína, a GAPDH, obtida a partir de sobrenadantes de culturas, daquela bactéria, na fase logarítmica.

Esta proteína GAPDH, com peso molecular estimado de 45 kDa, induz em murganhos a estimulação policlonal de linfócitos B e um rápido aumento dos níveis séricos da citocina anti- inflamatória IL-10. A referida proteína, facilitando a colonização pela bactéria que a produz, pode ser considerada um factor de virulência para o hospedeiro A vacina, contendo a GAPDH em doses submitogénicas, quando administrada intraperitonealmente protege murganhos da infecção por S. agalactiae. Esta vacina torna assim o hospedeiro capaz de eliminar a bactéria. A vacina contra a infecção causada por GBS, de acordo com o presente invento, é formulada para ser administrada por via sistémica e/ou intra-dérmica e/ou sub-cutânea e/ou através de mucosas, em mamíferos e em humanos em particular.

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Purificação das proteínas extracelulares de S. agalactiae S. agalactiae foi pre-cultivada em meio RPMI toda a noite a 37°C e em seguida cultivada durante 48h no mesmo meio. As culturas foram centrifugadas a 29,000g durante 30 min, e os sobrenadantes filtrados através de um filtro de porosidade e concentrados por diálise sob vácuo numa membrana Visking 100/8FT com 30,000 Da de cut-off para a retenção e posterior recolha das proteínas extracelulares (PE-Sa). De modo a excluir a presença de proteínas contaminantes nos sobrenadantes da cultura devido a lise bacteriana nas preparações de PE-Sa a presença da proteína citosólica Isocitrato Desidrogenase foi pesquisada nesses sobrenadantes usando o kit Diagnostics Isocitrate Dehydrogenase. As PE-Sa foram então fraccionadas por electroforese preparativa em gel de poliacrilamida), em condições não desnaturantes, e as fracções eluídas em PBS e concentradas por diálise sob vácuo. Antes de ser testada a actividade estimulatória de linfócitos B, todas as fracções foram passadas através de uma coluna de Polimixina B de modo a remover possíveis contaminações por endotoxina. Só as fracções que se revelaram negativas para endotoxina, pelo teste limulus, foram usadas. 0 conteúdo proteico foi determinado pelo método de Lowry e as fracções foram guardadas a -70°C até serem usadas.

Produção e purificação de GAPDH recombinante 0 gene gapC foi amplificado por PCR a partir do DNA cromossómico de S. agalactiae com "primers" que introduziram um sítio Ncol e um sítio Xhol no extremo do fragmento amplificado. 0 fragmento de PCR, foi clonado no plasmidio pET28a. Células de E. coli BL21(DE3) foram transformadas com o plasmídeo recombinante resultante (pET28agapdh) . Após 3 horas de indução da expressão da proteína de fusão com IPTG, as células foram lavadas por centrifugação e ressuspendidas em tampão fosfato contendo 10 mM de imidazole. As amostras foram incubadas em gelo durante 30 min na presença de 100 pg/ml de lisozima e 10% de Triton X-100. Após sonicação, o material insolúvel foi removido por centrifugação e os sobrenadantes filtrados através de um filtro de porosidade 0,45-μπι e aplicado numa coluna His-trap. A rGAPDH foi recolhida com imidazole sob condições nativas.

EXEMPLOS DE APLICAÇÃO

Ensaio de vacinação usando a proteína GAPDH recombinante (rGAPDH) como antigénio alvo

Protocolo das imunizações

Modelos animais: BALB/c fêmeas com 8-10 semanas de idade nascidos no Instituto Gulbenkian de Ciência, Oeiras, foram usados nos estudos de imunoprotecção.

Bactéria: Streptococcus agalactiae NEM316 pertence ao serotipo III capsular e foi isolado de uma cultura de sangue de um recém-nascido. I) Antigénios e adjuvante. A rGAPDH foi usada numa dose sub-mitogénica. Usou-se "Alum", hidróxido de alumínio, como adjuvante uma vez que já foi licenciado o seu uso em humanos. II) Imuni zações.

Ratinhos BALB/c foram injectados por via intraperitoneal (i.p.) duas vezes com um intervalo de 3 semanas com 25 μφ de rGAPDH em PBS/alum na proporção de 1:1. 0 grupo controlo recebeu PBS com alum na mesma proporção. Quatro semanas após a última imunização os ratinhos foram infectados por via i.p. com 5xl06 células de S. agalactiae.

Avaliação da colonização por S. agalactiae A carga bacteriana de S. agalactiae foi avaliada no fígado de todos os ratinhos 15 dias após a infecção. O fígado foi removido em condições assépticas, homogeneizado em PBS e diluído em diluições seriadas de 1:10 que foram semeadas em meio Todd e incubadas 48h a 37°C. O número de unidades formadoras de colónias (UFC) foi quantificado.

Exemplo AI com

sistémica por B&ItB/c após a GAPDH

Aumento da resistência contra a infecção Streptococcus agalactiae, de ratinhos imunização por via intraperitoneal recombinante.

As experiências foram feitas com o objectivo de avaliar o efeito da imunização de fêmeas BALB/c com doses sub- mitogénicas de rGAPDH, na protecção contra a infecção por S. agalactiae. Como se pode ver na Figura 1, em nenhum dos ratinhos imunizados se observou colonização no fígado por S. agalactiae 15 dias após a infecção, ao contrário dos animais controlo que apresentaram todos colonização por esta bactéria no fígado. Podemos então concluir que a imunização intraperitoneal com a rGAPDH protegeu as fêmeas BALB/c da infecção por S. agalactiae. Está descrito que o risco de infecção dos recém-nascidos por S. agalactiae é devido a transmissão pela mãe através da bactéria presente seu tracto genital. A principal via de infecção neonatal é pela aspiração do fluido amniótico infectado, pelo feto.

Após aceder aos pulmões, a bactéria pode colonizar e

infectar este órgão resultando em pneumonia. A transmigração subsequente de S. agalactiae através dos epitélios permitirá a bactéria atingir a corrente sanguínea i e, eventualmente, as meninges induzindo meningite. Deste modo, a protecção das mães, desta infecção, evitará assim a doença nos recém nascidos ao impedir a sua contaminação.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Lisboa, 13 MAR. 2006

Claims (4)

1> Proteína gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), obtida a partir de culturas da bactéria S. agalactiae ou recombinante obtida através da clonagem e sequênciação do gene que codifica a proteína GAPDH de S. agalactiae expressa num sistema heterólogo, caracterizada por ser utilizada na manufactura de uma vacina para a profilaxia de meningite, septicemia e pneumonia provocadas por Streptococcus agalactiae em doses submitogénicas (1-100 μς) na manufactura de uma vacina para a profilaxia das patologias referidas.

2. Proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada por ser utilizada na manufactura de uma vacina para a profilaxia de meningite, septicemia e pneumonia provocadas por Streptococcus agalactiae, formulada para administração por via sistémica e/ou intra-dérmica e/ou sub-cutânea e/ou através de mucosas.

3. Utilização da proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, nativa ou recombinante, obtida a partir de S. agalactiae, caracterizada por se destinar a produção de uma vacina para a profilaxia de meningite, septicemia e pneumonia provocadas por S. agalactiae em doses submitogénicas (1-100 μς) na manufactura de uma vacina para a profilaxia das patologias referidas.

4. Utilização da proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, de acordo com a reivindicação anterior,

caracterizada por ser utilizada na manufactura de uma vacina para a profilaxia de meningite, septicemia e pneumonia provocadas por Streptococcus agalactiae, formulada para administração por via sistémica e/ou intra-dérmica e/ou sub-cutânea e/ou através de mucosas. Lisboa, 8 de Agosto de 2008